Vliv prostředí na růst a množení

mikrobiálních populací –

patogeny a kazící mikroflóra

Potraviny nejsou sterilní !!!!

Potraviny

Kontaminace člověkem

Vzduch, půda, voda

Nakládání a příprava

potravin konzumenty

Výroba, zpracování,

marketing

Výskyt mikroorganismů

• Půda

• Voda

• Atmosféra

• Rostliny

• Živé organismy (zvířata, lidé)

Faktory ovlivňující růst

mikroorganismů v potravinách

Vnitřní : živiny, pH, redox potenciál, vodní

aktivita,antimikrobiální aktivity

Vnější: vlhkost, teplota, atmosféra

Implicitní: specifická růstová rychlost,

synergismus, antagonismus,

komensalismus

Technologické: krájení, mytí, balení,

záření, pasteurizace

Vlivy na růst mikroorganismů • Teplota

• pH prostředí

• Vodní aktivita

• Oxidoredukční potenciál

• Povrchové napětí

• Záření

• Hydrostatický tlak

• Elektrický proud

• Ultrazvuk

• Záření

• Mechanické vlivy

• Působení antimikrobiálních látek

• Biologické vlivy

Vnitřní faktory

• Živiny – potraviny ideální zdroje

• pH

• Redox potenciál

• Vodní aktivita

• Antimikrobiální látky

Živiny

• Zdroj energie

• Materiál k tvorbě a obnově buněčných struktur

• C,O,N,S,P

• Fe, Mg, K, Ca, Na

• Stopové prvky – Zn, Cu, Co

• Speciální požadavky autotrofní, auxotrofní atd.

pH prostředí

• Pro bakterie a kvasinky je rozmezí

poměrně úzké, u většiny plísní podstatně

širší

• Bakterie ?

• Kvasinky?

• Plísně?

pH prostředí

min opt max

• B.subtilis 4,3 6,0-7,5 8,5

• S. cerevisiae 3,0- 3,8 4,2-5,0 7,3-7,5

• A.niger 1,2 3,0-8,0 11,0

pH prostředí

• Bakterie v trávicím traktu

• Kyselinotvorné bakterie

• Hnilobné velmi citlivé ůči nízkému pH

• Vnější pH ovlivňuje regulační procesy metabolismu v buňce

• Alkalické prostředí – tvorba glycerolu u kvasinek

• Neutralizací kyselin se zvyšuje tvorba kys. mléčné

• V koncentrovaných cukerných roztocích se tvoří kys. máselná na úkor acetonu a butanolu

• Odolnost vůči zvýšeným teplotám – spory pH 4,3

pH

Bakterie – slabě kyselé až slabě alkalické pH

Kvasinky – preferují kyselé prostředí

Plísně – tolerují velmi široké rozmezí

Oxidoredukční potenciál

• Oxidoredukční potenciál je dán přítomností oxidačních nebo redukčních činidel

• Oxid.čin.: kyslík, dusičnany, železité ionty, peroxidy, železnaté ionty, vodík, sloučeniny se sulfhydrylovou skupinou nebo s reaktivními dvojnými vazbami

• Redukční činidla : cystein, askorbová kyselina, CO2, vodík, thioglykolát sodný)

Oxidoredukční potenciál

• Oxidační redukční potenciál E H je rozdíl

potenciálu mezi platinovou elektrodu

umístěnou do daného prostředí a normální

vodíkovou elektrodou

• Silně oxidační látky – pozitivní

• Silně redukční – negativní

• Aerobní mikroorganismy – pozitivní

• Anaerobní mikroorgansimy - negativní

Redox potenciál - Eh

Vodní aktivita

• Potřeba vody je vyjádřena vodní aktivitou

prostředí, ve kterém se buňky mohou

rozmnožovat

• Vodní aktivita roztoku aH20 čili a w se

rovná poměru tlaku vodních par nad tímto

roztokem k tlaku vodních par nad

destilovanou vodou

Aktivita vody - aw

Snížení aktivity vody:

• odstranění využitelné vody sušením, uzením, odpařením, mražením

• zvýšení obsahu tuku

• zvýšení koncentrace rozpuštěných látek v prostředí (cukry - sacharosa, NaCl) zvýšení osmotického tlaku (hypertonické prostředí) difuze vody z buňky do prostředí zastavení metabolizmu až smrt buňky

Vodní aktivita

• Vztah vodní aktivity ke koncentraci rozpuštěné látky

N w

a w = ---------

N w + N s

• N w - počet molů vody

• N s – počet molů rozpuštěné látky

Vodní aktivita Vodní aktivita vody je 1

Bakterie 0,99 – 0,93

(0,65 – 0,63) halofilní 15%,halotolerantní 10%

NaCl (Micrococcus, Staphylococcus)

Kvasinky 0,91- 0,88

Osmotolerantní 0,73 (60% sacharosa)

Zygosaccharomyces rouxii , Z. bailii)

Plísně nižší než b. a kv., vyjímka vodní plísně

Osmofilní plísně 0,60 A. glaucus

Vodní aktivita

• Sušení

• Zvýšení koncentrace rozpuštěných látek

odpařováním

Sacharosa 50-70%

Chlorid sodný 10-15%

Vnitrobuněčný tlak 0,35 do 0,6 MPa

Osmofilní 30 MPA

Aktivita vody - aw

Působení antimikrobiálních látek

• Zastavení rozmnožování mikrobistatické

• Usmrcení mikrobicidní

• Bakteriostatické, bakteriocidní

• Fungistatické, fungicidní

• Nižší koncentrace - stimulační účinek

Působení antimikrobiálních látek Rozdělení :

1. Látky poškozující strukturu buňky nebo její funkci

penicilin, polyenová antibiotika (Streptomyces) – buněčná stěna

rozpuštědla tuků, anionaktivní tenzidy, polyenová antibiotika (Bacillus), fenoly, inhibitory transportu – cytoplasmatická membrána

formadehyd, silná oxidační činidla, silná redukční činidla –bílkoviny

chloramfenikol, erythromycin – ribozomy bakterií

cyklohexiimid – ribozomy kvasinek

2. Látky působící na mikrobiální enzymy

těžké kovy (Hg)

3. Látky reagující s DNA

alkylační činidla, deaminační činidla,cytostatika, mitomycin C

Antimikrobiální enzymy

Bakteriolytické

1. N-acetylhexosaminidázy katalyzují štěpení glukosidických vazeb

sacharidů peptidoglykanu

2. N-acetylmuramyl-L-alaninamidázy katalyzují štěpení mezi

sacharidovou a peptidovou částí peptidoglykanu

3. Endopeptidázy hydrolyzují peptidové vazby peptidoglykanu

4. Ostatní – chitinázy, ß-glukanázy

Antimikrobiální enzymy

Oxidoreduktázy

Glukozooxidázy jsou produkovány některými plísněmi,

podstata cytotoxicity spočívá v tvorbě peroxidu

vodíku (oxidace glukózy na kys. glukonovou a

H2O2)

Laktoperoxidázy se vyskytují např. ve slinách, mléce

(oxidace thiokyanátu na hyperthiokyanát)

Laktoferrin je glykoprotein tvořící komplexy s ionty

železa

Implicitní faktory

• Specifická růstová rychlost –

individuální vlastnost geneticky kódovaná

• Synergismus – spolupráce více druhů

• Antagonismus – negativní ovlivňování

různých typů mezi sebou

• Komensalismus -jedna populace využívá

jinou bez jejího poškozování - jeden má ze

vztahu prospěch zatímco druhý není ovlivněn

Biologické vlivy • Komensalismus – volné sdružení mikroorgansimů jež si ani

neprospívají ani neškodí

• Mikroflora úst, kůže

• Syntrofismus (synergismus) – určité mikroorganismy mohou žít v prostředí pouze v přítomnosti jiných

• Aerobní x anaerobní

• Kefírová kultura

• Symbiosa – vzájemné soužití mikroorganismů prospěšné pro oba

• Řasy a houby

• Antagonismus- jeden druh působí nepříznivě na ostatní

• BMK a hnilobné bakterie

• Producenti antibiotik a citlivé druhy - Streptomyces

• Parazitismus- jeden organismus využívá vnitrobuněčných intermediátu metabolismu jiného mikroorgansimu

• Plísně na na konidích Aspergillus niger

• Saprofytismus – růst na dumřeluých tělech rostlin nebo živočichů

• Metabiosa – produkty jedněch organismů jsou postupně využívány jinými

• Kvasinky-alkohol a octové bakterie - ocet

Vnější faktory

• relativní vlhkost

• teplota

• atmosféra

Relativní vlhkost prostředí

Vysoká relativní vlhkost ovlivňuje aw potraviny (význam balení)

Čím vyšší je teplota, tím nižší

musí být relativní vlhkost

prostředí a naopak

relativní vlhkost

• Relativní vlhkost vzduchu udává poměr mezi

okamžitým množstvím vodních par ve vzduchu a

množstvím par, které by měl vzduch o stejném

tlaku a teplotě při plném nasycení.

• Udává se v procentech (%). Relativní vlhkost se

též někdy označuje jako poměrná vlhkost.

Teplota

Tři základní body teploty:

• Minimální – nejnižší teplota, při níž se daný

druh rozmnožuje ještě zjistitelnou rychlostí

• Optimální –rozmnožuje se nejvyšší

rychlostí

• Maximální- nejvyšší teplota, při které je

daný druh ještě schopen se rozmnožovat

Teplota

Stanovení minimální teploty je poměrně

obtížné – postupně klesá

Optimální cca o 30 oC vyšší než minimální

Maximální o cca 5-10 oC vyšší než optimální

Teplotní šok – syntéza „heat shock proteins“

Optimální teplota růstu x optimální teplota pro

ostatní pochody v buňce

ts- mutanty – permisivní teplota

- restriktivní teplota

Teplota

• Psychrofilní – opt. tep. nižší než 20 oC a rostou při teplotách 0 – 5 oC

- psychrotrofní se rozmnožují dosti rychle při teplotách 0-10 oC bez ohledu na optimální teplotu Pseudomonas, Micrococcus, Flavobacterium

• Mesofilní – minimální teplota vyšší než 5 oC a optimální nižší než 45 oC

bakterie 37 oC, kvasinky 30 oC

Teplota

• Termofilní – opt. tepl.45 oC a vyšší 50 – 60 oC,

B. stearothermophilis 80 oC, archebakterie více

než 100 oC

• Nerozmnožují se při teplotách kolem 30 – 40 oC

rody:

Bacillus, Clostridium (C. thermosacharolyticum)

Lactobacillus (L.delbrueckii var. bulgaricus)

Thermoactinomyces, Thermomonospora

Teplota

• Termální smrtící teplota- nejkratší doba pro usmrcení mikroorganismu za dané teploty

• Vztah mezi letální teplotou a dobou potřebnou k usmrcení mikroorganismu je dána letalitní křivkou

• Technická sterilace nekyselých konzerv

• ( Bacillus coagulans, termofilní druhy)

• Kyselé konzervy?

Teplota

• Smrtící (letální) teplota – nejnižší teplota, při

které je mikroorganismus usmrcen během

určité doby (10 min.)

• Mesofilní: 60- 65 oC, po dobu 10 – 15 min.

• Sporotvorné: 120 oC, po dobu 10 – 15 min.

• Spory kvasinek a plísní : 60-70 oC, 10 min.

Phialospora, Paecilomyces, Byssochlamys

Teplota

• Chladový šok

• Staphylococcus aureus – poměrně odolný

• B. stearotermophilus na 20 oC – ztrácí životnost

• C. perfringens na 4 oC (95% buněk odumírá)

• Pomalé zmrazování

• Rychlé zmrazení

• Zmrazené potraviny!!!

Vliv teploty

• Arrheniův zákon, původně navržený k popisu závislosti specifické reakční konstanty chemických reakcí na teple, není zcela adekvátní pro popis účinku teploty na růst bakterií.

• Mikrobiologové se pokusili použít modifikovanou verzi tohoto zákona na růst bakterií tak, že nahradili konstantu reakční rychlosti, konstantou růstové rychlosti, ale takto upravené vztahy zcela nevystihují reálná data, neboť graf ukazující závislost logaritmu konstanty růstové rychlosti proti reciproké absolutní teplotě má jako výsledek křivku, a nikoli přímku.

Hodnota D

• Mnoho druhů mikroorganismů jsou patogeny, schopné vyvolávat onemocnění ostatních organismů. Proces sterilizace, jakým je tepelné působení je ničí.

• D-hodnota odpovídá délce času nutného k decimálnímu snížení počtu.

• Čas nutný za dané teploty k usmrcení 90% mikroorganismů.

• Je-li snížení množství organismů o jeden řád, pak zůstává živých pouze 10% z původní populace. Obecně, každý tepelně odolný organismus má svou jedinečnou D-hodnotu. Uvádíme-li D hodnoty je nutné vyznačit teplotu pro kterou byly naměřeny jako dolní index.

• Např. hypotetický organismus byl redukován o 90% po vystavení teplotě 62 stupňů Celsia po 2 minuty, tudíž tato D-hodnota by s měla psát jako D62C = 2 (minuty).

Závislost devitalizace na čase (pro jednu T)

výpočet hodnoty D

• dN/dt

dt

dN

dt

dN

dt

dN

Rychlost odumírání

dN/dt = cN počet živých buněk klesá

)log/(log)( 2112 NNttD )log/(log)( 2112 NNttD

D = (t2 – t1)/ logN1-logN2

N – počet živých buněk, c- konstanta

Z- hodnota • Z-hodnota organismu je teplota,ve stupních Fahrenheita nebo

Celsiuse, která je nutná ke změně počtu organismů o jeden log cyklus – 1 řád

• Je to reciproká hodnota logaritmu D hodnoty děleného teplotou, pro kterou byla D hodnota získaná.

• Také ji lze jednoduše definovat jako teplotu nutnou ke snížení D hodnoty o jeden řád (log).

• Zatímco D-hodnota udává čas nutný při určité teplotě k usmrcení organismu, z-hodnota vyjadřuje rezistenci organismu ke změně teploty.

• Z-hodnota umožňuje vypočítat tepelný proces, máme-li jednu D-hodnotu a z-hodnotu.

• Jestliže zvýšení o 10°F změní křivku o jeden řád (log), pak z-hodnota je 10. Máme li D-hodnotu 4.5 min při 150°F, můžeme vypočítat D-hodnotu pro 160°F dělením tohoto času deseti, snížením o 1 log. Nová D-hodnota pro 160°F je 0.45 minutes. To znamená, že každé zvýšení teploty o10°F bude snižovat D-hodnotu o1 log.

• Naopak, snížení o 10°F bude zvyšovat D-hodnotu o 1 log. Takže, D-hodnota pro teplotu 140°F bude 45 min.

Hodnota Z

Z = (T2 – T1)- (logD1 – logD2)

Hodnoty D pro E.sakazakii

Složení atmosféry

Skladování potravin v řízené atmosféře plynů má ochranný účinek

• Vakuově balené potraviny (v obalech nepropustných pro kyslík)

• CO2 brání růstu aerobní mikroflóry, používá se při skladování ovoce a zeleniny, nesmí se používat pro potraviny s vysokým obsahem tuku, protože má silné oxidační účinky a způsobuje žluknutí tuků

Složení atmosféry

Skladování potravin v řízené atmosféře plynů má ochranný účinek

• Vakuově balené potraviny (v obalech nepropustných pro kyslík)

• CO2 brání růstu aerobní mikroflóry, používá se při skladování ovoce a zeleniny, nesmí se používat pro potraviny s vysokým obsahem tuku, protože má silné oxidační účinky a způsobuje žluknutí tuků

Hydrostatický tlak

• Zvýšení tlaku 10 – 20 MPa – zpomalení růstu

• 30 – 40 MPa – rozmnožování se zastaví

• Působení tlaků zmírní teplota 30-40 oC

• moře - barofilní – barotolerantní 60 MPA

• negativní působení na syntézu buněčné stěny

• 5- 60 MPa anomalie v dělení buněk, replikace DNA, prodloužení lag fáze

• Usmrcení : 600-700 MPa (minuty až hodiny)

• spory Bacillus 1 700 MPa/hod

Faktory ovlivňující růst

mikroorganismů v potravinách

• Vnitřní faktory

• Implicitní faktory

• Vnější faktory

• Faktory související s konečným

zpracováním a úpravou

Faktory související s

konečným zpracováním a

úpravou • Krájení

• Mytí

• Balení

• Ozařování

• Pasterace

Povrchové napětí

• Povrchové napětí a špatná smáčelivost -

blanka (křís)

• Plísně

• Tenzidy:

• Anionaktivní tenzidy (mýdla)

• Kationaktivní tenzidy

• Neionogenní tenzidy (Tween)

Povrchové napětí

• Anionaktivní - ve vyšších koncentracích

poškozují cyt.m., denaturace bílkovin, alkyl

sulfáty, alkylsulfonáty

• Kationaktivní – ve velmi nízkých

koncentracích mají silné antimikrobiální

účinky, smáčecí účinnost poměrně malá,

kvarterní amoniové nebo pyridiniové soli

Záření

• Elektromagnetické záření o různých vlnových délek

• Infračervené záření a Hertzovy vlny- nejdelší vlnové délky nemají smrtící účinek na mikroorganismy, působí tepelnými účinky

• Viditelné světlo (380 – 760 nm)

• UV záření (210- 310 nm) letální účinek – 265 nm NK, malá pronikavost

Záření

• Roentgenovo záření, γ-záření, kosmické záření (kratší než 10 nm), silné mutagenní a letální účinky, působí na DNA, vyvolávají tvorbu volných radikálů a oxiranu)- indukují zlomy chromozomů

• Nejcitlivější jsou G- bakterie, kvasinky a plísně oddolnější, vysoká odolnost Deinococcus radiodurans, D. radiophilus, D. proteolyticus)

• Mikroorganismy odolnější než člověk (až 4x)

• Vliv přítomnosti kyslíku (-), zmrazení, vysušení

Elektrický proud

• Střídavý el.proud intensita 30 – 100 mA

nemá vliv

• Stejnosměrný el.proud nepřiznivě působí

elektrolytickými účinky

Ultrazvuk

• Zvukové vlny o frekvenci vyšší než 20 kHz, působí letálně jsou-li intenzivní (10 W/cm2) – tzv. Kavitační ultrazvuk- pulsace buněčných membrán a plasmy

• Nejcitlivější jsou dlouhé tyčinkové a vláknité mikroorganismy, koky a kvasinky poměrně odolné

• nemá 100% -ní letální účinek

Nekavitační ultrazvuk (1 MHz a s nízkým rozkmitem) se používá k lékařským účelům

Mechanické vlivy

Mechanické rozrušení buněk

• Abrazivní materiál

• Rozmrazování a rozmrazování

• zmrazení a protlačení úzskou štěrbinou za

pomoci vysokého tlaku- drcení 80-90%

buněk

Hydrostatický tlak

Většina mikroorganizmů se rozmnožuje za normálního atmosférického tlaku.

Zvýšení tlaku na 10-20 MPa rozmnožování zpomaluje a 30-40 MPa zcela zastavuje.

Některé bakterie se dobře rozmnožují i při tlaku 60 MPa – barofilní x barotolerantní (v hlubinách moří)

Technologie překážek

Kombinací různých faktorů vzniká řada překážek, které musí mikroorganizmy překonat.

I když jednotlivé faktory nejsou dostatečné k zabránění růstu MO, jejich kombinací dochází k zesílení účinku.

Čím nepříznivější překážka, tím vyšší úsilí musí mikroorganizmy vyvinout.

FAO/WHO definice probiotik

• Jsou to živé mikroorganismy, které ve vhodném množství přispívají ke zdravotnímu prospěch hostitele.

• [1] Bakterie mléčného kvašení BMK/LAB a bifidobakterie jsou nejčastější typy mikrobů užívaných jako probiotika; ale také některé kvasinky a bacily mohou pomáhat.

• Probiotika jsou obvykle konsumovány jako součást fermentovaných potravin obsahujících aktivní živé kultury; jako je jogurt nebo jako potravní doplňky.

Nejčastější probiotické kultury

• Pro obchodní účely jsou nejčastěji

používány následující rody:Lactobacillus a

Bifidobacterium. Probiotické kmeny

Lactobacillus sp. jsou L. acidophilus,

L.johnsonii, L.casei, L.rhamnosus,

L.gasseri, a L.reuteri.

• Kmeny Bifidobacterium sp. jsou hlavně

B.bifidum, B.longum, a B.infantis.

Ukázka působení prebiotik

Mikroorganismy ve vodě

• Psychrofilní a psychrotrofní druhy

Manipulační mikroflora

Enterobacteriaceae

Staphylococcus

Kontaminace sladké a mořské vody

Bakterie ve vzduchu

• Gram pozitivní tyčinky a koky Bacillus,

Micrococcus, Corynebacterium,

Streptomyces

• Kvantitativní stanovení

• Význam pigmentů

• Souvislosti s kažením potravin

Plísně ve vzduchu

• Penicillium, Aspergillus (nesmáčenlivé

spory)

• Fusarium (smáčenlivé spory)

• Cladosporium herbarum

Aktivní šíření spor

Mikroorganismy v půdě

• Nejbohatší výskyt všech typů

mikroorganismů

• bakterie, kvasinky, plísně, protozoa, řasy

• Clostridium, Bacillus, Enterobacter,

Escherichia, Micrococcus, Alcaligenes,

Pseudomonas, Actinomycetes,

Streptococcus, Leuconostoc,

Flavobacterium, Proteus

Mikroorganismy rostlin

• Běžně se vyskytující mikroorganismy:

• Cladosporium, Botrytis cinerea (plíseň), Aureobasidium pullulans („černá“ kvasinka)

• Sporobolomyces, Bullera, Kloeckera apiculata, Pichia membranofaciens

• G- tyčinky: Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Micrococcus

• G+bakterie: Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Bacillus

Člověk jako zdroj mikroorganismů

• Kůže

• Trávicí ústrojí - probiotické bakterie

• Výkaly