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VOIE RAS NORMALE & PATHOLOGIQUE
Hélène CavéUF de Biochimie et Biologie Moléculaire
D’après Karnoub & Weinberg Nat Review Mol Cell Biol, 2008
LES ETAPES CLE DANS LA CONNAISSANCE DE RAS
RAS (Rat Sarcoma Virus) homologue cellulaire de l’oncogène viral
associé au sarcome de Harvey (HRAS) et Kirsten (KRAS)
CANCER MALADIES DU DEVELOPPEMENT
19811981 19821982 19831983 19891989 19921992 19941994 19971997 20052005 20062006
Identification des gènes humains HRAS et KRAS
Les tumeurs humaines contiennent des protéines
RAS mutées constitutivement actives
Identification de NRAS
RAS n’est pas capable de transformer seul des cellules primaires
RAS estisoprénylé
RAS active les MAPK
RAS active la voie PI3K et RalGDS
KRAS est indispensable àl’embryogenèse
RAS active la
voie PLCεεεε
Syndrome de Costello : mutations de HRAS
Syndrome de Noonan et CFC : mutations de
KRAS
NRAS, cloné à partir de lignées de neuroblastome
Cycle de RAS
RAS GTPRAS GDP
Pi
RAS
GTP
GDP
RAS EST UN COMMUTATEUR MOLECULAIRERAS : sous-famille des petites protéines G
Ny
Myc, …
Vetter, Science 2001
REPRESENTATION SCHEMATIQUE DU COMMUTATEUR
Les changements de structure impliquent 2 segments : switch I et switch II
L’hydrolyse du phosphate modifie la conformation des 2 régions switch
Les régions switch sont impliquées dans les interactions en amont (GEF) et en aval (effecteurs, GAP)
ISOFORMES DE RAS
Schubbert et al., Nature Reviews Cancer 2007
3 gènes RAS codent 4 protéines de 21 kD à forte homologie
Région hypervariableRésidus spécifiant les modifications post- traductionnelles des protéines
Epissagealternatif
Domaine très conservé
UN RTK PEUT CONTENIR PLUSIEURS SITES DE LIAISONAUX SH2 ET ACTIVER PLUSIEURS EFFECTEURS
P
P
P
P
P
P
PDGFR
P
P
P
Domainecatalytique
Src kinase
GRB2
SHC
PI3K, Nck
Ras-GAP
PTP-iD, SHP-2
PLCγγγγ
Activation
PDGF : Platelet derived growth factor
ShcSosGrb2
RecepteurRecepteur
(RTK, gp130)(RTK, gp130)
PP
Cycle de RAS
Gab
RAS GTPRAS GDP
NF1
Pi
RAS
GTP
GDP
ACTIVATION/INACTIVATION DE RASFacteur
de croissance soluble
Guanine nucleotideExchange Factors (GEFs)
GTPase-activatingproteins (GAPs).
RAS : sous-famille des petites protéines G
NeurofibromineNeurofibromine
(NF1)(NF1)Ny
Myc, …
RAS INTERAGIT AVEC DE MULTIPLES EFFECTEURS
ShcSosGrb2
RecepteurRecepteur
(RTK, gp130)(RTK, gp130)
PP
ELK
Ny
Myc, …
MAPK
MAPKKK
MAPKKRAF
MEK
ERK
Gab
RAS GTPRAS GDP
NF1
Pi
RAS
GTP
GDP
RAS ACTIVE LA VOIE DES MAPK/ERKFacteur
de croissance soluble
Protéine
P
Protéine
Cascade des MAPK
NeurofibromineNeurofibromine
(NF1)(NF1)
ShcSosGrb2
RecepteurRecepteur
(RTK, gp130)(RTK, gp130)
PP
ELK
Ny
Myc, …
RAF
MEK
ERK
Gab
RAS GTPRAS GDP
NF1
Pi
RAS
GTP
GDP
RAS ACTIVE LA VOIE DES MAPK/ERKFacteur
de croissance soluble
Protéine
P
Protéine
NeurofibromineNeurofibromine
(NF1)(NF1)
� Voie complexe (familles de protéines)� Voie non linéaire (régulations fines)� Voie très régulée
ARAF, BRAF, CRAF
MEK1, MEK2
ERK1, ERK2
HRAS, NRAS, KRAS
ShcSosGrb2
RecepteurRecepteur
(RTK, gp130)(RTK, gp130)
PP
Cycle de RAS
Gab
RAS GTPRAS GDP
Pi
RAS
GTP
GDP
ACTIVATION DE RASVoies relayant le signalFacteur
de croissance soluble
MAPK
PI3K
RALGDS
Organisation Organisation
du cytosquelettedu cytosquelette
TrafficTraffic
de vde véésiculessicules
SurvieSurvie
ProlifProliféérationration
Signal Signal CaCa++++PLCεεεε
TIAM1
NeurofibromineNeurofibromine
(NF1)(NF1)
NeurofibromineNeurofibromine
(NF1)(NF1)
Mutations activatrices
SosGrb2PP
RAS
GTP
GDP
RAS GTPRAS GDP
Pi
Cycle de RAS
X
RAS EST MUTE DANS 30% DES CANCERS HUMAINS
KRAS>NRAS>HRAS
codon 12 (G12)
codon 13 (G13)
codon 61 (Q61)
NEUROFIBROMATOSE DE TYPE 1 (NF1)
Autosomique dominante1/3500 naissances
Haploinsuffisance
�Difficultés d’apprentisage fréquentes� Anomalies du squelette� Nodules de Lish
Inactivation bi-allelique
� Prédisposition aux tumeurs malignes(neurofibrosarcome, astrocytome, phaeochromocytome et LMMJ)
RAS
GTP
GDP
RAS GTPRAS GDP
Pi
Cycle de RAS
NeurofibromineNeurofibromine
(NF1)(NF1)
X
SYNDROME DE NOONANTransmission autosomique dominante
1/2000 naissances
� Retard de croissance (60-70%) (Taille adulte : M 162.5 cm - F 152.7 cm)
� Malformations cardiaques (66%)
� Retard psychomoteur de degré variable (30-50%)
� Dysmorphie caractéristique (100%)
� Prédisposition faible aux leucémies
� Prenatal : nuque épaisse, hygroma
SHP2 : Tyrosine phosphatase cytosoliquerégulée par les facteurs de croissance
Mutations de PTPN11 chez 40% des patients(Tartaglia et al., Nat Genet 2001)
Sténose de la valve pulmonaire
45%
Cœur normal
SYNDROME DE NOONAN
Anomalie cardiaques congénitales (75%)
Cardiomyopathie hypertrophique
10%
Le SN est la cause non-chomosomique la plus fréquente d’anomalie cardiaque congénitale
ShcSosGrb2
ReceptorReceptor
(RTK, gp130)(RTK, gp130)
PP
ELK
Ny
Myc, …
MAPK
MAPKKK
MAPKKRAF
MEK
ERK
FONCTION DE SHP-2
SHP-2
[-]
[+]
SHP-2 nécessaire à l’activation complètede la cascade MAPK/ERK par RAS
Gab
RAS GTPRAS GDP
NF1
Pi
RAS
GTP
GDP
Phosphatase régulée par les facteurs de croissance
Facteur de croissance
soluble
Protéine
P
Protéine
Neel, Trends in Biochem sciences 2003
STRUCTURE DE SHP-2
Phosphorylation de tyrosines
Neel, Trends in Biochem sciences 2003
REGULATION DE SHP-2
Inactive à l’état basal
Neel, Trends in Biochem sciences 2003
Activation par fixation à des pY
Récepteur TK activé
REGULATION DE SHP-2
PTP
C-SH2 N-SH2
Mutations by exon (n=248)
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
exons
mutations retrouvées précédentes séries
Mutations by functional domain
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
N-SH2 linker C-SH2/N-SH2
C-SH2 PTP queue COOH
Domains
mutations (Paris) LiteratureMUTATIONS (EXON)
MUTATIONS (DOMAINE FONCTIONNEL)
Robert Debré
Littérature
Mutations constitutionnelles
AA mutés : rouge/blancDomaine catalytique : rose
MUTATIONS DE PTPN11 (SHP-2)
Tartaglia & Gelb 2005
PTP
C-SH2 N-SH2
Keilhack, H. et al. J. Biol. Chem. 2005
Mutations constitutionnelles
AA mutés : rouge/vertDomaine catalytique : rose
MUTATIONS DE PTPN11 (SHP-2)
Activité PTP +/- p-Tyr dérivé d’IRS-1 [p1172]
Tartaglia & Gelb 2005
Keilhack, H. et al. J. Biol. Chem. 2005
PTP
C-SH2 N-SH2
Mutations constitutionnelles
AA mutés : rouge/vertDomaine catalytique : rose
MUTATIONS DE PTPN11 (SHP-2)
Activité PTP +/- p-Tyr dérivé d’IRS-1 [p1172]
Araki et al., Nat Med 2004
SOURIS KNOCK-IN POUR PTPN11 D61G
Une seule mutation gain de fonction de PTPN11 est suffisante pour induire un phénotype de syndrome de Noonan avec syndrome myéloprolifératif
SYNDROME DE NOONAN & SYNDROMES ASSOCIES
Syndrome Syndrome Syndromede Noonan cardio-facio-cutané de Costello
Troubles alimentaires (inconstants Modérés)
Retard statural
Cardiopathie (75%)- 45% sténose valve pulmonaire- 10% cardiomyopathie hypertrophique
Visage triangulaire
Peau normale ou sèche
Phanères normaux
Retard mental (15-35%, léger)
Troubles alimentaires (sévères)
Retard statural (78%)
Cardiopathie (75%)- 40% sténose valve pulmonaire- 40% cardiomyopathie hypertrophique
Visage large
Kératose folliculaire, ichtyose
Cheveux épars bouclés
Cils et sourcils rares ou absents
Retard mental (>90%)
Troubles alimentaires (très sévères)
Retard statural (96%)
Cardiopathie (63%)- 46% sténose valve pulmonaire- 45% cardiomyopathie hypertrophique- 30% arythmie
Traits épais
Papillome, plis profonds, peau lâche, hyperpigmentation Cheveux bouclés
Retard Mental 100%
Rhabdomyosarcome, cancer de la vessie (15%)
CBLCBL
P
P
P
P
P
P
ERK1 ERK2
Shc
Gab2
Grb2
RAFRAF--11
SOS1SOS1
SHP2SHP2
MEK1MEK1 MEK2MEK2
BRAFBRAF
SpredSpred--11
GDPGDP
NRASNRAS
GTPGTP
NRASNRAS
GDPGDP
KRASKRAS
GTPGTP
KRASKRAS
GDPGDP
HRASHRAS
GTPGTP
HRASHRAS
ARAF
Syndrome de Syndrome de LegiusLegiusSHOC2SHOC2
NSNS--likelike avec cheveux avec cheveux
anaganagèènes caducsnes caducs
E2
20092009
Prolifération cellulaireSurvie cellulaire
Syndrome de Noonan
Syndrome Syndrome
CardioCardio--FacioFacio--
CutanCutanéé
Syndrome Syndrome
de de CostelloCostello
NeurofibromineNeurofibromine NeurofibromatoseNeurofibromatose
NS-like avec multiples
lentigines (LEOPARD)
Aoki et al., Nature Genetics 2005
Syndrome de CostelloG12S (85%)G12A (10%)
HRAS EST MUTE CHEZ 85% DES PATIENTS ATTEINTS DU SYNDROME DE COSTELLO
Consequences des mutations:
Insensibilité euw protéines GAP � Activation consitutive
Modification d’affinité� déséquilibre en faveur de la forme -GTP
FREQUENCES DES MUTATIONS Pathologies définies sur des critères cliniques
Nava et al., 2007
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
SN CFC SC
PTPN11
SOS1
RAF1
HRAS
KRAS
BRAF
MEK1
MEK2
FREQUENCES DES MUTATIONS Pathologies re-définies sur des critères de génétique moléculaire
Risque de cancer
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
SN CFC SC
PTPN11
SOS1
RAF1
HRAS
KRAS
BRAF
MEK1
MEK2
TOTAL
A quoi sert le diagnostic génétique ?
Pour le patient atteint• Diagnostic clinique• Participation / organisation / supervision de la prise en
charge médicale et socio-éducative• Pronostic
Pour les grossesses futures• Fixer le risque de récurrence• Informer des possibilités et limites du diagnostic anténatal• Information génétique (« conseil génétique »)
Pour la famille• Dépistage des personnes à risque
THERAPEUTIQUES SPECIFIQUES
P
P
P
P
P
P
GDP
NRAS
GTP
NRAS
ERK1 ERK2
Shc
Gab2
Grb2
RAFRAF--11
SOS1SOS1
SHP2SHP2
GDPGDP
KRASKRAS
GTPGTP
KRASKRAS
MEK1MEK1 MEK2MEK2
BRAFBRAF
SpredSpred--11
Expression des gènesProgression du cycle cellulaireApoptose
GDP
HRAS
GTP
HRAS
NeurofibromineNeurofibromine
ARAF
Risque de
cancer ?
ONCOGENES & GENES SUPPRESSEURS DE TUMEUR
P
P
P
P
P
P
GDP
NRAS
GTP
NRAS
ERK1 ERK2
Shc
Gab2
Grb2
RAFRAF--11
SOS1SOS1
SHP2SHP2
GDPGDP
KRASKRAS
GTPGTP
KRASKRAS
MEK1MEK1 MEK2MEK2
BRAFBRAF
SpredSpred--11
Expression des gènesProgression du cycle cellulaireApoptose
GDP
HRAS
GTP
HRAS
NeurofibromineNeurofibromine
ARAF
RISQUE TUMORALsyndrome de Noonan
syndrome syndrome
CardioCardio--FacioFacio--
CutanCutanéé
Syndrome Syndrome
de de CostelloCostello
NeurofibromatoseNeurofibromatose
syndrome LEOPARD
Syndrome Syndrome NFNF--likelike
1-2%
1-2%
13%
?
?
L’EFFET SUPPRESSEUR DE TUMEUR DE RAS
D’après Karnoub & Weinberg Nat Review Mol Cell Biol, 2008
Pourquoi les mutations constitutionnelles de RAS n’induisent-elles pas plus de cancers?
La réponse normale d’une cellule « naïve » à l’activation exagérée de RAS est l’arrêt du cycle cellulaire et/ou la sénescence et pas la prolifération ou la transformation
Arrêt du cycle cellulaire / sénescence
RAS
RAFp38 PI3K
p53
p21WAF1p14ARFp16INK4A
Signal mitogène
David Kerr, Nature Reviews Cancer 2003 3, 615-622
LES MUTATIONS DE RAS PARTICIPENT A LA PROGRESSION TUMORALE
Normal Adénome précoce Adénome tardif Adénocarcinome
Apoptose
Adhésion
Angiogénèse
Facteurs de croissance
Signalisation
LES MUTATIONS SOMATIQUES ET CONSTITUTIONNELLES SONT DIFFERENTES
Schubbert et al., Nature Reviews Cancer 2007
Mutations constitutionelles(syndrome CFC )
Mutations somatiques
(Cancer : mélanome
cancer colo-rectal, du sein, et des poumons)
Exemple de BRAF
Données du « Catalogue of Somatic Mutations in Cancer » (COSMIC) of the Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK
RAS EST MUTE DANS 30% DES CANCERS HUMAINS
Tissus HRAS KRAS NRAS
Gros intestin 0% 32% 3%Intestin grèle 0% 20% 25%Hématopoïétique 0% 5% 12%Poumon 1% 17% 1%Tractus biliaire 0% 32% 1%Pancréas 0% 60% 2%Glande salivaire 16% 4% 0%Peau 5% 2% 19%Tractus urinaire 12% 4% 3%Sein 1% 5% 1%Ovaire 0% 15% 4%
MUTATIONS DE GENES DE LA VOIE RAS DANS LES TUMEURS
Roberts et Der, Oncogene 2007
sosGRB2
RAS
BRAF
MEK
ERK
EGFR
TGFαααα
EGFR : ErbB1 / HER1ErbB2 / HER2 / Neu
Surexpression d’EGFR• Cancer colorectal (27-77%)
• Cancer du pancréas (30-50%)• Cancer du poumon (40-80%)
Mutations de RAS• Cancer du pancréas (90%)
• Cancer de la thyroïde (60%)• Cancer du colon (50%)• Cancer du poumon (30%)
Mutations de BRAF• Mélanome (70%)
• Cancer de la thyroïde (50%)• Cancer du colon (10%)
Mutation d’EGFR• Glioblastome (30-50%)
• Cancer du poumon (10%)
MUTATIONS DE GENES DE LA VOIE RAS DANS LES TUMEURS
Roberts et Der, Oncogene 2007
Inhibiteurs de farnesyl transferaseBi-phosphonatesStatines
AZD6244ARRY142886UO126
SorafenibRaf265PLX4032
sosGRB2
RAS
BRAF
MEK
ERK
EGFR
TGFααααTrastuzumab(Herceptine™)Cetuximab(Erbitux™)
Inhibiteurs de TK
Erlotinib
Geftinib
CBLCBL
P
P
P
P
P
P
MPK
PI3K
AKT
mTOR
RHEB
TSC
S6K
IRS1
ERK1 ERK2
Shc
Gab2
Grb2
RAFRAF--11
SOS1SOS1
SHP2SHP2
MEK1MEK1 MEK2MEK2
BRAFBRAF
SpredSpred--11
Gene expressionCell cycle progressionCell death
NeurofibrominNeurofibromin
ARAF
SHOC2SHOC2
GDPGDP
NRASNRAS
GTPGTP
NRASNRAS
GDPGDP
KRASKRAS
GTPGTP
KRASKRAS
GDP
HRAS
GTP
HRAS
RASOPATHIESRASOPATHIES
RAPAMYCINE
STATINES
On commence par tester l’efficacité chez un animal
Il nous faut donc un animal malade… Qu’on va traiter pour voir si ça marche
Ca marche sur quoi?(à quelle dose, selon quel protocole?)Comment le prouver?
Il faut traiter combien de temps?Ca marche sur toutes les mutations?
Marin et al., J Clinical Invest 2010
Expression inductible de la mutation Y279C