vol21no4

18

งานวจย

Vol. 21 No. 4 October - December 2009 19Vol. 21 No. 4 October - December 2009

แถบทดสอบนำลายสนขสำหรบตรวจเชอไวรสโรคพษสนขบา

ทรงศร เกษมพมลพร 1)* วชราภรณ แสงสสม 1) สำเรง ฮวดสกล 1)

สนนทา เพมพนพานช 1) สรศกด เอกโสวรรณ 1) วศษฎ สตปรชา 1)

ผวจยไดพฒนาการตรวจหาแอนตเจนของเชอไวรสโรคพษสนขบาในนำลายสนข โดยใชวธอมมโน

โครมาโตกราฟฟทใชแอนตบอดตอเชอไวรสโรคพษสนขบาเคลอบบนอนภาคทองนาโน ซงจะแสดงผลการจบ

กนของแอนตเจนของเชอกบแอนตบอดนบนแถบทดสอบ แถบทดสอบในงานวจยนใชโพลโคลนลแอนตบอด

สองชนด การทดสอบทำไดงายและใหผลภายใน 10 นาท จากการทดสอบตวอยางนำลายจากสนขทตองสงสย

จำนวน 1,136 ตวดวยแถบทดสอบเทยบกบวธ reverse-transcription polymerase chain reaction พบวา

แถบทดสอบมความไวและความจำเพาะคดเปนรอยละ 91.4 และ 97.8 ตามลำดบ ระดบความเขมขนตำสด

ของเชอไวรสทสามารถตรวจไดดวยแถบทดสอบเทากบ 102.3 LD50/0.03 ml แถบทดสอบนเหมาะทจะนำไป

ใชในการสำรวจหรอคดกรองสนขในภาคสนาม เพราะไมตองใชอปกรณหรอเครองมอในหองปฏบตการ การเฝา

ระวงโรคพษสนขบาแบบเชงรกในสนขจะชวยลดการเสยชวตของคนจากโรคนและจะชวยลดการแพรระบาด

ของเชอจากสนขสสตวอนๆ ดวย

คำสำคญ: โรคพษสนขบา นำลายสนข วธอมมโนโครมาโตกราฟฟ

1) สถานเสาวภา (ศนยวจยรวมองคการอนามยโลกเกยวกบโรคพษสนขบา) สภากาชาดไทย 1871 ถนนพระราม 4 กรงเทพมหานคร 10330 * ผรบผดชอบบทความ: E-mail: [email protected]

โรคพษสนขบาเปนโรคตดเชอรายแรงทเกด

จากเชอไวรสเรบส (rabies virus) ในแตละปทวโลก

จะมผเสยชวตดวยโรคนราว 50,000 คน องคการอนามย

โลกจดใหโรคพษสนขบาเปนโรคตดเชอทมอตราตาย

สงสด (Knobel et al., 2005) ในประเทศไทยสนข

เปนพาหะทสำคญในการแพรเชอนสคนและสตวอน

โดยผานทางนำลายเขาสบาดแผลทกด กวารอยละ 90

ของผทเสยชวตดวยโรคนมประวตวาถกสนขกด (Kasem-

pimolporn et al., 2008) แมวาจำนวนผเสยชวตใน

แตละปมแนวโนมลดลง เชน ในป พ.ศ. 2549, 2550

และ 2551 มจำนวน 26, 20 และ 8 คนตามลำดบ

(Ministry of Public Health annual report 2008)

แตจำนวนผไดรบการฉดวคซน(และเซรม)ปองกน

หลงจากถกสตวกดมแนวโนมสงขน ปจจบนอยในราว

สามถงสแสนรายตอป คดเปนมลคาของคาใชจายใน

การปองกนโรคนบรอยลานบาท

การตรวจวนจฉยโรคพษสนขบาในสนข ทำ

โดยการตรวจหาเชอไวรสจากเนอสมองดวยเทคนค

fluorescent antibody test และยนยนผลลบซำดวย

เทคนค mouse inoculation test ทงสองวธเปนวธการ

มาตรฐานทมความแมนยำสง (Dean et al., 1996) แตม

ขอจำกดทใชตรวจสนขทตายแลวเทานน ปจจบนดวย

เทคนคทางอณชววทยา เชน วธ reverse - transcription

polymerase chain reaction (RT-PCR) ทำให

สามารถตรวจหาสารพนธกรรมของเชอไวรสไดจาก

clinical fluids เชน นำลายของสนขทตองสงสยขณะ

ยงมชวตได โอกาสพบเชอในนำลายสนขทเปนโรคม

ประมาณรอยละ 87 มากกวาในนำไขสนหลงทตรวจ

พบเพยงรอยละ 27 ของสนข (Saengseesom et al.,

2008) การตรวจจาก clinical fluids มขอจำกดในเรอง

ของปรมาณไวรสทอาจมนอยมากหรออาจยงไม

ปรากฏในตวอยางขณะตรวจจงอาจทำใหผลการ

ตรวจเปนลบ การยนยนผลดวยการเกบตวอยางโดย

เฉพาะนำลายทดสอบซำเปนระยะจงมความจำเปน

บทนำ และอาจตองทำควบคไปกบการสงเกตอาการของโรค

ดวย อยางไรกตามแมการตรวจดวยเทคนค RT-PCR

จะมความไวและความจำเพาะสง แตเปนวธทคอน

ขางยงยากเพราะตองตรวจในหองปฏบตการทม

อปกรณและเครองมอเฉพาะ มคาใชจายสง และตอง

ใชเจาหนาททมความชำนาญ จงเปนวธทมขอจำกด

ในการนำไปใชประโยชน ไดมการพฒนาเทคนคอนๆ

ขนสำหรบการตรวจหาเชอไวรสโรคพษสนขบาใน

นำลายสนข เชน วธ latex agglutination test (LAT)

(Kasempimolporn et al., 2000) และวธแถบทดสอบ

ทอาศยหลกการ immunochromatography (Kang

et al., 2007: Nishizono et al., 2008) ทงสองวธ

ทดสอบงาย ใหผลการตรวจรวดเรว ไมตองใชเครอง

มอหรออปกรณพเศษเฉพาะ สามารถนำไปใชนอกหอง

ปฏบตการ ซงในปพ.ศ. 2547 สำนกอนามย กรงเทพ-

มหานครไดนำวธ LAT ไปใชสำรวจหาเชอไวรสโรค

พษสนขบาในสนขจรจดในเขตกรงเทพมหานคร

(Kasempimolporn et al., 2007) สำหรบวธแถบ

ทดสอบปจจบนไดพฒนาเปนแบบสำเรจรปพรอมใช

แตตองสงซอจากตางประเทศจงมราคาคอนขางแพง

งานวจยนไดพฒนาวธการผลตแถบทดสอบขนเอง

เพอใชตรวจหาเชอไวรสโรคพษสนขบาในนำลาย

สนขโดยเปรยบเทยบผลการตรวจกบวธ RT-PCR

20

งานวจย


การเตรยมโพลโคลนลแอนตบอดในมา ทำการฉดกระตนภมคมกนมาดวยวคซน

ปองกนโรคพษสนขบา (Verorab®, France) เปนระยะๆ

ตามวธการของ Luekrajang et al (1996) หลงจาก

เจาะเลอดและปนแยกซรมแลว นำไปตกตะกอนโปรตน

โกลบลนและทดสอบระดบแอนตบอดตามแบบวธ

เตรยมแอนตบอดในกระตาย

การเตรยมแถบทดสอบ ทำการเตรยมชนสวนเมมเบรน 4 สวน ไดแก

sample pad, conjugate pad, detection pad และ

absorbent pad โดย sample pad และ conjugate

pad เปนเมมเบรนชนด glass fiber (Rapid 24TM,

Whatman) สวน detection pad เปน nitrocellulose

membrane (Prima 60TM, Whatman) และ absorbent

pad เปน cellulose membrane (CF4TM, Whatman)

นำ colloidal gold หรอ gold nanoparticles ขนาด

20 nm (Sigma) ไปจบกบแอนตบอดทเตรยมจาก

เลอดมา นำไปสเปรยทบบน conjugate pad ผง

ขามคนทตอบ 40°C สวนแอนตบอดทเตรยมจากเลอด

กระตายนำไปสเปรยบน detection pad ใหเปนเสน

แถบทหนง (test line) และสเปรยแอนตบอดตอโก

ลบลนมา (Rabbit anti-horse IgG, Sigma) เปนเสน

แถบทสอง (control line) นำแตละชนสวนไปประกอบ

เปนแถบทดสอบตามรปท 1 เกบแถบทดสอบทประกอบ

แลวใน desiccator

การตรวจเชอไวรสโรคพษสนขบาดวยวธ RT-nested PCR ทำการสกดอารเอนเอจากตวอยางนำลาย

สนขดวยนำยา TRIzol TM (Gibco) ใชอารเอนเอ 2 µg

ไปผสมในนำยาสำเรจรป AccessQuikTM ตามทผ

ผลตระบ (Promega) เปนการสงเคราะหเสนดเอนเอ

คสมจากอารเอนเอแมพมพ และเพมจำนวนดเอนเอ

ในขนตอนเดยว (one step RT-PCR) งานวจยนใช

primers 2 ค ซงเปนสวนของยน nucleoprotein ของ

เชอไวรสโรคพษสนขบา โดย outer forward (57-78)

และ outer reverse (1,508-1,529) primers ทใชใน

การเพมจำนวนดเอนเอรอบแรก คอ 5´-GTAACACC

CCTACAATGGATGC-3´ และ 5´-CAAAGATCT

TGCTCATGTTTGG-3´ ตามลำดบทำใหไดผลผลต

ดเอนเอมขนาด 1,473 คเบส หลงจากนนนำผลผลต

รอบแรกไปทำปฏกรยาเพมจำนวนดเอนเอรอบทสอง

ตอ (nested PCR) โดยใชนำยาสำเรจรป PhusionTM

(Finnzymes) สวน inner forward (319-337) และ

inner reverse (823-842) primers ทใช คอ 5´GACATGT

CCGGAAGACTGG-3´ และ 5´-GTATTGCCTCT

CTAGCGGTG-3´ ตามลำดบขนาดของผลผลตดเอนเอ

คอ 524 คเบสการทำปฏกรยาเพมจำนวนดเอนเอทำ

ในเครอง thermocycler จำนวน 35 cycles (denatu

ration: 30 วนาทท 94°C; annealing: 1 นาทท 60°C;

extension: 2 นาทท 72°C) ผลผลตดเอนเอทไดนำ

ไปตรวจสอบดวยการนำไปแยกผานกระแสไฟฟาบน

agarose gel และยอมดวย ethidium bromide

วสดและวธการ

ตวอยางนำลายสนข ตวอยางนำลายทใชในการทดสอบไดจาก

ซากสนขจำนวน 238 ตวทถกสงมาตรวจหาเชอไวรส

โรคพษสนขบาทสถานเสาวภา การเกบทำโดยการ

ใชไมพนฟองนำจมในหลอดทม phosphate buffer

saline (PBS) แลวนำไปซบบนลนและขางแกมของ

สนขประมาณ 15-20 วนาท นำไมไปจมในหลอด

บฟเฟอรแลวบบกบขางหลอดนำไปปนท 12,500 g เปน

เวลา 20 นาท เกบสวนใสใสหลอดใหมเกบทตเยน 4°C

รอการทดสอบ นอกจากนยงใชตวอยางนำลายสนขจรจด

ทไดจากฝายควบคมโรคพษสนขบา กองสตวแพทย

สาธารณสข กรงเทพมหานครอกจำนวน 898 ตวอยาง

ทเกบในชวงป พ.ศ. 2546-2547 มาทดสอบดวย

การเตรยมโพลโคลนลแอนตบอดในกระตาย ทำการฉดกระตนภมคมกนกระตายสายพนธ

White New Zealand ดวยวคซนปองกนโรคพษสนขบา

(Kaketsuken®,Japan) ทผสม Freund’s complete

adjuvant ในอตราสวน 1:1 โดยฉดเขากลาม และ

ฉดกระตนซำอกครงหางจากครงแรก 1 เดอนดวยวค

ซนเดมทผสม Freund’s incomplete adjuvant หลง

จากนนประมาณ 7-14 วนจงทำการเจาะเลอดและ

ปนแยกซรมนำไปทดสอบระดบแอนตบอดดวยวธ

rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT)

(Smith et al., 1973) นำแอนตบอดไปตกตะกอน

โปรตนโกลบลนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟต

(Hudson & Hay, 1980) หลงจาก dialyze ใน PBS

นำสวนหนงไปทดสอบระดบแอนตบอดดวยวธ RFFIT

และวธ indirect fluorescent antibody test (Larsh,1965)

โดยใชนำยาคอนจเกตทผลตโดยสภากาชาดไทย

(TRC®,Thailand) แอนตบอดทเหลอแบงใสขวดแชท

-20°C

การตรวจเชอไวรสโรคพษสนขบาดวยแถบทดสอบ หยดตวอยางนำลาย 100 µl ลงบนแถบทดสอบ

บรเวณ sample pad หากในตวอยางมแอนตเจนของ

เชอไวรสโรคพษสนขบาอยกจะไหลไปตาม diluent

ไปจบกบแอนตบอดทเคลอบบน colloidal gold แลว

พดพากนไปจนถงแถบเสนทหนงทมแอนตบอด

กระตายดกอย แอนตบอดกระตายจะตรงแอนตเจน

ทจบอยกบแอนตบอดมาทเคลอบอยบน colloidal gold

ใหอยกบทเหนเปนเสนแถบสมวงแดงซงเปนสของ

colloidal gold สวนประกอบอนๆ ทเหลอจะพดพา

กนตอไปยงเสนแถบทสองทเปนแอนตบอดทจำเพาะ

ตอโกลบลนมาซงจะตรงแอนตบอดมาทเคลอบอย

บน colloidal gold ใหอยกบทเหนเปนแถบสมวงแดง

เปนเสนแถบทสอง colloidal gold และตวอยางท

เหลอจะพดพาไปสดท absorbent pad ซงจะถกซบ

ไมใหเคลอนตอไป ถาตวอยางทตรวจมเชอไวรสโรค

พษสนขบาจะเหนแถบสขนสองแถบ (test line เปน

แถบทหนงและ control line เปนแถบทสอง) หาก

ตวอยางไมมเชอจะเหนเฉพาะเสนแถบทสองซงเปน

control line เทานน

ทำการทดสอบหาปรมาณเชอนอยทสดท

แถบทดสอบสามารถตรวจได (detection limit) โดย

ใชไวรสโรคพษสนขบาสายพนธ Challenge Virus

Standard (CVS) ทไดจากการเพาะเลยงใน baby

hamster kidney cells นำไวรสมาเจอจางในระดบ

ตางๆ แลวฉดเขาสมองหนทดลอง ตดตามผลหนท

ตายในแตละระดบความเจอจาง คำนวณหาคา 50%

lethal dose dilution (LD50/0.03 ml) (Aubert, 1996)

แลวจงนำ CVS ทรคา LD50 ไปทดสอบเพอหาระดบ

ไวรสเจอจางสงสดทสามารถตรวจไดดวยแถบทดสอบ

รปท 1 แสดงสวนประกอบของแถบทดสอบ (test strip)

22

งานวจย


งานวจยน ไดพฒนาวธการเตรยมแถบ

ทดสอบสำหรบตรวจแอนตเจนของเชอไวรสโรคพษ

สนขบา โดยใชแอนตบอดทเตรยมจากมาเปน detection

antibody เคลอบบน colloidal gold และใชแอนตบอด

จากกระตายเปน capture antibody ตรงอยบน nitrocel-

lulose เปน test line สวน control line ใช anti-detection

antibody คอแอนตบอดตอโกลบลนมา เมอประกอบ

ชนสวนตางๆเขากนแลวจะไดแถบทดสอบสำเรจรป

พรอมใช (รปท 1)

จากการทดสอบนำลายสนขจำนวน 1,136

ตวอยางดวยแถบทดสอบเทยบกบการตรวจดวยวธ

RT-PCR พบวาวธ RT-PCR ตรวจพบเชอไวรสโรค

พษสนขบาในตวอยางนำลาย 58 ตวอยาง และตรวจ

ไมพบเชอ 1,078 ตวอยาง (รปท 2) ขณะทวธใชแถบ

ทดสอบพบเชอจำนวน 77 ตวอยาง (เหนแถบส 2 แถบ)

และไมพบเชอจำนวน 1,054 ตวอยาง (เหนแถบส 1

แถบ) (รปท 3) แถบทดสอบมความไว ความจำเพาะ

คาทำนายผลบวกและคาทำนายผลลบเทยบกบวธ

RT-PCR คดเปนรอยละ 91.4, 97.8, 68.8 และ 99.5

ตามลำดบ (ตารางท 1) แถบทดสอบแสดงผลการ

ตรวจภายใน 10 นาทเมอเทยบกบวธ RT-PCR ทใช

เวลาทดสอบรอบทหนงประมาณ 3.5 ชวโมงและรอบ

ทสอง (nested PCR) อกประมาณ 3 ชวโมง อยางไร

กตามการตรวจดวยแถบทดสอบใหผลบวกเทยมคด

เปนรอยละ 2.2 และผลลบเทยมคดเปนรอยละ 8.6

โดยสรปวธแถบทดสอบมประสทธภาพของการ

ทดสอบคดเปนรอยละ 97.4 ของวธมาตรฐาน (RT-PCR)

คา LD50/0.03 ml ของไวรสโรคพษสนขบาท

ไดจากการเพาะเลยงททดสอบโดยการฉดเขาสมอง

หนทดลองเทากบ 104.7 LD50/0.03 ml เมอนำไวรส

ไปเจอจาง (two-fold serial dilutions) แลวตรวจดวย

แถบทดสอบ พบวาแถบทดสอบสามารถตรวจเชอได

ในระดบความเขมขนตำสดท 102.3 LD50/0.03 ml

(ขอมลไมไดแสดง) แสดงวาแถบทดสอบมประสทธภาพ

ผล ในการตรวจพบเชอไดถงระดบความเขมขนของเชอ

นอยกวาคา LD50/0.03 ml อย 256 เทา

รปท 2 การทดสอบนำลายสนขทมเชอ

ไวรสโรคพษสนขบาดวยวธ RT-PCR

แสดงผลดวยสายดเอนเอขนาด 524 คเบส

แสดงสวนประกอบของแถบทดสอบ

(test strip)

524 bp

DN

A La

dder

100

bp

+ ve

Con

trol

- ve

Con

trol

นำลา

ยสนข

รปท 3 แสดงผลการทดสอบนำลายสนข

ทมเชอไวรสโรคพษสนขบาดวยแถบ

ทดสอบ (ปรากฏแถบสสองแถบ) และ

นำลายทไมมเชอ(ปรากฏแถบสหนงแถบ)

Control Line

Test Line

ตารางท 1 ผลการทดสอบตวอยางนำลายสนขโดยใชแถบทดสอบเทยบกบวธ RT-PCR

โรคพษสนขบาเปนโรคตดเชออนตรายทไมม

ทางรกษา ในประเทศไทยสนขเปนพาหะสำคญของ

การแพรเชอนสคนและสตวอนๆ การแพรเชอของสนข

สวนใหญจะผานทางนำลายโดยการกด เชอไวรสสามารถ

ปรากฏในนำลายสนขกอนและระหวางแสดงอาการ

ของโรค สนขทปวยเมอเรมปลอยเชอออกมาในนำลายก

จะปลอยเชอเรอยไปจนกระทงตาย (Vaughn et al.,

1965) มรายงานพบสนขทอาการปกตแตปลอยเชอ

ไวรสโรคพษสนขบาออกมาทางนำลายเปนระยะ

(Fekadu, 1972) รวมทงสนขสามารถปลอยเชอออกมา

ทางนำลายไดนานถง 14 วนกอนแสดงอาการของโรค

(Fekadu and Shaddock, 1984) สนขสวนใหญท

ตดเชอจะแสดงอาการของโรค แตจะมอยประมาณ

รอยละ 18 ทตายโดยไมแสดงอาการ (Fekadu, 1988)

การตรวจวนจฉยหาเชอทางหองปฏบตการจงมความ

สำคญเพราะการสงเกตจากอาการโรคของสนขอยาง

เดยวอาจไมเพยงพอ

วจารณ การเฝาระวงโรคพษสนขบาแบบเชงรกในสนข

มความสำคญตอการควบคมและปองกนการแพร

ระบาดของโรค แตการตรวจหาเชอในสนขทยงมชวต

อยทำไดยาก เนองจากตองอาศยเทคนคการตรวจท

ตองใชผเชยวชาญและเครองมอพเศษเฉพาะในหอง

ปฏบตการ รวมทงคาใชจายในการตรวจทคอนขางสง

จงไดมการพฒนาเทคนคอนๆ ททำไดงายและใหผล

รวดเรว เชน เทคนค latex agglutination หรอเทคนค

ทใชหลกการของ immunochromatography ในรป

แถบทดสอบ ซงทงสองเทคนคทดสอบงาย ไมตองใช

เครองมอหรออปกรณทยงยาก โดยเฉพาะเทคนค

หลงทสามารถทำเปนแถบทดสอบสำเรจรปพรอม

ใชไดสะดวกกวา

การตรวจหาเชอไวรสโรคพษสนขบาดวย

แถบทดสอบสำเรจรปเปน rapid immunoassay ท

อานผลงายดวยตาเปลา (รปท 3) อยางไรกตามปรมาณ

ของแอนตเจนในตวอยางตองมมากพอทจะทำใหเกด

แถบสทเขมชด โดยทวไปการเตรยมแถบทดสอบจะ

ใชโมโนโคลนลแอนตบอด 2 ตวทจำเพาะตอแอนตเจน

คนละ epitope หรออาจใชโมโนโคลนล 1 ตวและโพ

ลโคลนลอก 1 ตวทำหนาทเปน detection antibody

24

งานวจย


เฉพาะผลลบเทยมไมสามารถยอมรบใหผดพลาดได

ในกรณใชเปนวธตรวจวนจฉย สนขทใหผลการตรวจ

นำลายเปนผลลบไมสามารถใชสรปแนนอนไดวา

สนขนนไมเปนโรคพษสนขบา เพราะปรมาณไวรส

อาจมนอยมาก (เกน detection limit) หรอไมปรากฏ

ในนำลายขณะตรวจ การตรวจเชอจากเนอสมองจง

ยงคงเปนวธทแนะนำสำหรบใชในการตรวจวนจฉย

เพราะปรมาณไวรสในสมองจะมากกวาในนำลาย

งานวจยขนตอไปไดเตรยมโมโนโคลนล

แอนตบอดจากเซลลหนโดยใชเทคนค hybridoma เพอ

ใชแทนโพลโคลนลแอนตบอดและจะประเมนผลการ

ทดสอบกบสนขในภาคสนามตอไป

แถบทดสอบสำหรบใชตรวจเชอไวรสโรคพษ

สนขบาในนำลายสนขทไดพฒนาในงานวจยนม

ประสทธภาพของการทดสอบ (test efficiency) เปน

รอยละ 97.4 ของวธ RT-PCR แถบทดสอบนใชงาย

สะดวก และใหผลรวดเรว สามารถนำไปใชประโยชน

เพอการสำรวจและคดกรองสนขทตดเชอในภาค

สนามได

งานวจยนไดรบทนสนบสนนการวจยประจำ

ป 2551 จากมลนธเวชดสตในพระอปถมภของ

สมเดจพระพนางเธอเจาฟากลยาณวฒนา กรมหลวง

นราธวาสราชนครนทร

กตตกรรมประกาศ

เอกสารอางอง Aubert, M.F.A., Methods for the calculation of titers. In: Meslin, F.X., Kaplan, M.M., Koprowski, H.(ed.), Laboratory Techniques in Rabies, 4th ed. World Health Organization. Geneva. pp. 445-459. Bureau of Epidemiology, Department of Disease Control. 2008. Annual epidemiological surveillance report. Ministry of Public Health. Nonthaburi. (in Thai) Dean, D.J., Abelseth, M.K., Atanasiu, P. 1996. The fluorescent antibody test. In: Laboratory Techniques in Rabies, 4th ed. World Health Organization. Geneva. pp. 88-95. Fekadu, M. 1972. Atypical rabies in dogs in Ethiopia. Ethiop. Med. J. 10: 79-86. Fekadu, M. 1988. Pathogenesis of rabies virus infection in dogs. Rev. Inf. Dis. 10 (suppl 4): s678-s683. Fekadu, M., Shaddock, J.H. 1984. Peripheral distribution of virus in dogs inoculated with two strains of rabies virus. Am. J. Vet. Res. 45: 724-729. Hudson, L., Hay, F.C.1980. Practical immunology, 2nded. Blackwell Scientific Publications. Oxford. pp.1-23. Kang, B.K., Oh, J.S., Lee, C.S., Park, B.K., Park, Y.N., Hong, K.S., Lee, K.G., Cho, B.K., Song, D.S. 2007. Evaluation of a rapid immunodiagnostic test kit for rabies virus. J. Virol. Methods. 145: 30-36. Kasempimolporn, S., Jitapunkul, S., Sitprija, V. 2008. Moving towards the elimination of rabies in Thailand. J. Med. Assoc. Thai. 91: 433-437. Kasempimolporn, S., Saengseesom, W., Lumlertdacha, B., Sitprija, V. 2000. Detection of rabies virus antigen in dog saliva using a latex agglutination test. J. Clin. Microbiol. 38: 3098-3099. Kasempimolporn, S., Sichanasai, B., Saengseesom, W., Puempumpanich, S., Chatraporn, S., Sitprija, V. 2007. Prevalence of rabies virus infection and rabies antibody in stray dogs: a survey in Bangkok, Thailand. Prev. Vet. Med. 78: 325-332.

Knobel, D.L., Cleaveland, S., Coleman, P.G., Fevere, E.M. 2005. Re-evaluating the burden of rabies in Africa and Asia. Bull. World Health Organ. 83: 1-11. Larsh, S.E. 1965. Indirect fluorescent antibody and serum neutralization response in pre- exposure prophylaxis against rabies. Ann. Intern. Med. 63: 955-964. Loza-Rubio, E., Rojas-Anaya, E., Banda-Ruiz, V.M., Nadin-Davis, S.A., Cortez-Garcia, B. 2005. Detection of multiple strains of rabies virus RNA using primers designed to target Mexican vampire bat variants. Epidemiol. Infect. 133: 927-934. Luekrajang, T., Wangsai, J., Phanuphak, P. 1996. Production of antirabies serum of equine origin. In: Meslin, F.X., Kaplan M.M., Koprowski, H., eds. Laboratory Techniques in Rabies. Geneva: World Health Organization, p. 401-404. Nishizono, A., Khawplod, P., Ahmed, K., Goto, K., Shiota, S., Mifune, K., Yasui, T., Takayama, K., Kobayashi, Y., Mannen, K.,Tepsumethanon, V. Mitmoonpitak, C., Inoue, S., Morimoto, Kinjiro. A simple and rapid immunochromatographic test kit for rabies diagnosis. Microbiol. Immunol. 52: 243-249. Posthuma-Trumpie • J. Korf, G.A., van Amerongen, A. 2009. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weakness, opportunities and threats. A literature survey. Anal. Bioanal. Chem. 393: 569-582. Saengseesom, W., Mitmoonpitak, C.,Kasempimolporn, S., Sitprija, V. 2007. Real-time PCR analysis of dog cerebrospinal fluid and saliva samples for ante-mortem diagnosis of rabies. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health. 38: 53-57. Smith, J.S., Yager, P.A., Baer, G.M. 1973. A rapid reproducible test for determining rabies neutralizing antibody. Bull. WHO. 48: 535-541. Vaughn, J.B., Gerhaardt, P., Newell, K.W. 1965. Excretion of street rabies virus in the saliva of dogs. JAMA 193: 363-368.

และ capture antibody ตามลำดบ (Posthuma-Trumpie

•J. Korf and van Amerongen, 2009) แตงาน

วจยนไดใชโพลโคลนลแอนตบอดทงสองตวเพยงแต

เตรยมจากสตวตาง species การเตรยมโพลโคลนล

แอนตบอดทำไดงายกวาการเตรยมโมโนโคลนล

แอนตบอด และผลของการใชโพลโคลนลแอนตบอด

กใหผลการทดสอบไมแตกตางจากแถบทดสอบทใช

โมโนโคลนลแอนตบอดทมความไวรอยละ 91.7 - 95.5

และมความจำเพาะรอยละ 88.9 - 100 (Kang et al.,

2007: Nishizono et al., 2008) โดยแถบทดสอบ

ของงานวจยนมความไวรอยละ 91.4 และความจำเพาะ

รอยละ 97.8 เมอเทยบกบวธ RT-PCR (ตารางท 1)

แถบทดสอบนสามารถตรวจเชอไดในระดบความเขม

ขนตำสดท 102.3 LD50/0.03 ml ซงตองใชปรมาณ

ไวรสในนำลายมากกวาการตรวจดวยวธ RT-PCR ท

สามารถตรวจเชอไดในระดบความเขมขนตำสดท

100.5 LD50/0.03 ml (Loza-Rubio et al., 2005;

Kang et al., 2007) อยางไรกตามจากผลการทดสอบ

แสดงใหเหนวาแถบทดสอบมประสทธภาพเพยง

พอทจะใชตรวจหาเชอไวรสโรคพษสนขบาในนำลาย

สนขได ตนทนในการผลตแถบทดสอบตอชนอยใน

ราว 100-150 บาท ทงนขนกบจำนวนการผลตในแตละ

ครงหากเทยบกบราคาทซอจากตางประเทศจะอยท

ประมาณ 400-500 บาท (Anigen®, Korea) แถบ

ทดสอบสามารถผลตไดทงแบบชนดหยดตวอยาง

นำลายลงไป ซงแถบทดสอบแบบนจะบรรจอยใน

ตลบปองกนการสมผส หรอแบบชนดจมลงในตวอยาง

นำลายทมลกษณะเปนแถบยาวสะดวกในการจบ

(dipstick) แถบทดสอบทงสองลกษณะบรรจในซอง

ปดทกนความชนจงสะดวกทจะนำไปใชในทตางๆ

เพอการเฝาระวงและปองกนการแพรระบาด เชน ใช

สำรวจหาสนขทตดเชอในพนท หรอใชตรวจคดกรอง

สนขกอนรบไวในสถานสงเคราะหสนข เปนตน สวน

การนำไปใชเพอการตรวจวนจฉยยงมขอจำกดเนอง

จากผลการตรวจมอตราการเกดผลบวกเทยมรอยละ

2.2 และผลลบเทยมรอยละ 8.6 (ตารางท 1) โดย

สรป

26

งานวจย


A test strip for detecting rabies virus in dog saliva

Songsri Kasempimolporn 1),# Wachiraporn Saengseesom 1) Sumreung Huadsakul 1)

Sununta Puermpunpanich 1) Surasak Akesowan 1) Visith Sitprija 1)

We describe the development of a new test for rapid detection of rabies virus antigen from dog

saliva samples. The test is based on immunochromatography using rabies specific antibodies cou-

pled to gold nanoparticles and displayed on a strip. The test, which employs two polyclonal anti-ra-

bies antibodies, is simply performed and the results obtained within 10 min. Saliva samples from

1,136 dogs suspected to have rabies were tested. The sensitivity and specificity of the strip test com-

pared with reverse-transcription polymerase chain reaction as the standard, were 91.4 and 97.8 %,

respectively. The detection limit of the strip test was 102.3 LD50/0.03 ml. As the strip test potentially

can be used outside the laboratory, it represents a powerful tool for epidemiological surveys and

disease control. The active surveillance for rabies virus infection in dogs would help to reduce the

human mortality associated with the disease and help to prevent its spread to other animal.

Keywords: rabies, dog saliva, immunochromatographic test

1) Queen Saovabha Memorial Institute (WHO Collaborating Center for Rabies), Thai Red Cross Society, 1871 Rama IV Road, Bangkok 10330# Corresponding author, E-mail: [email protected]

Abstract

34

บทความวชาการ


การศกษาเปรยบเทยบผลการตรวจระดบแอนตบอดตอโรคพษสนขบา โดยวธ enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) กบวธมาตรฐาน rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT) ในสนขไทย

วรดา วรยกจจา 1) ปยพร วฒนาภรมย 1) อมาพร พนธศร 1) และ สนนภา สรทตต 2)#

การศกษาครงนมวตถประสงคเพอเปรยบเทยบผลการตรวจและวเคราะหระดบแอนตบอดโดยวธ ELISA

กบระดบแอนตบอดทตรวจไดจากวธมาตรฐาน rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT) โดยใชตวอยาง

ซรมสนขจำนวน 60 ตวอยาง ทำการตรวจวดระดบแอนตบอดโดยวธ ELISA เปรยบเทยบกบวธ RFFIT ผลการ

ศกษาพบวา ผลจากการตรวจดวยวธ ELISA ใหผลสอดคลองกบวธ RFFIT จำนวน 43 ตวอยาง (71.67%) พบผล

ลบลวงจำนวน 17 ตวอยาง (28.33%) และไมพบผลบวกลวง คำนวณคาความไว (sensitivity) และความจำเพาะ

(specificity) ของวธ ELISA เปรยบเทยบกบวธมาตรฐาน RFFIT โดยคำนวณทคา cut-off 0.6 EU/ml ไดเทากบ

64% และ 100% ตามลำดบ โดยพบวาวธ ELISA จะใหผลการตรวจทม sensitivity ตำ ถาสนขม RFFIT titer ทตำ

กวา 5 IU/ml แมวาการตรวจดวยวธ ELISA จะมคาความไวตำกวาวธ RFFIT กตาม แตกเปนวธทสะดวก รวดเรว

และราคาไมสงนก และนาจะเปนทางเลอกหนงสำหรบใชในการศกษาระดบภมคมกนตอโรคพษสนขบาใน

ประชากรสตวจำนวนมากได

คำสำคญ: โรคพษสนขบา อไลซา แรฟฟต แอนตบอดตอโรคพษสนขบา

1) นสตชนปท 6 ปการศกษา 2550 คณะสตวแพทยศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย2) ภาควชาจลชววทยา คณะสตวแพทยศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย ปทมวน กรงเทพฯ 10330 #) ผรบผดชอบบทความ

โรคพษสนขบาเกดจากเชอไวรสโรคพษสนขบา

(rabies virus) เปน RNA virus จดอยใน Family

Rhabdoviridae โรคนเปนโรคตดตอจากสตวสคนท

เปนปญหาทสำคญทางสาธารณสขของประเทศไทย

สามารถตดตอไดหลายทางทสำคญคอการตดตอ

ทางบาดแผลทถกสตวทเปนโรคพษสนขบากด ใน

ประเทศไทยพบวาสตวเลยงทมรายงานการเกดโรค

สนขบามากทสดคอ สนข (94%) ซงเปนตวแพรโรคท

สำคญ รองลงมาคอ แมว (4.14%) (Puanghat and

Hunsoowan, 2005) ในปจจบนโรคพษสนขบาเปน

โรคทยงไมมวธรกษา การปองกนโรคโดยการใชวคซน

จงเปนสงสำคญ วคซนปองกนโรคพษสนขบาทใชใน

ประเทศไทยเปนวคซนเชอตาย (inactivated vaccine)

ตามพระราชบญญตปองกนโรคพษสนขบา พ.ศ. 2535

กำหนดใหนำสนขมารบการฉดวคซนปองกนโรคพษ

สนขบาครงแรก เมอสนขมอายตงแตสองเดอนขนไป

แตไมเกนสเดอน และไดรบการฉดวคซนครงตอไป

ตามระยะเวลาทกำหนดในใบรบรองการฉดวคซน

อยางไรกตามแมวาหนวยงานทงภาครฐและเอกชน

จะรณรงคใหมการทำวคซนใหกบสนขอยางตอเนอง

ทกป แตกพบวาอบตการณของโรคพษสนขบายงคง

เกดขนอยางตอเนอง และยงสามารถพบสนขทเปน

โรคพษสนขบาอยางตอเนองมาโดยตลอดจนถงปจจบน

(Puanghat and Hunsoowan, 2005; สถานเสาวภา,

2550)

การตรวจวดระดบภมคมกนจากซรมโดยการ

ตรวจหาระดบแอนตบอดทจำเพาะตอเชอพษสนขบา

สามารถทำไดหลายวธ เชน วธ rapid fluorescent

focus inhibition test (RFFIT), fluorescent antibody

virus neutralization (FAVN), indirect fluorescent

antibody technique (IFA), Enzyme-linked

immunosorbent assay (ELISA) เปนตน ในปจจบน

ประเทศไทยใชการตรวจ neutralizing titer โดยวธ

rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT)

(เลอสรวง, 2523) ซงเปนวธการตรวจมาตรฐานทได

รบการยอมรบจากองคการโรคระบาดสตวระหวาง

ประเทศ (Office International des Epizooties; OIE)

วธดงกลาวอาศยหลกในการตรวจวดระดบแอนตบอด

ทจำเพาะตอเชอพษสนขบาทอยในซรม โดยนำซรม

ตวอยางมาจบกบเชอพษสนขบาเพอยบยงการเขาส

เซลลเพาะเลยงของเชอพษสนขบา หลงจากนนตรวจ

หาเซลลทตดเชอโดยวธ IFA (Smith et al., 1973)

ถาระดบแอนตบอดทจำเพาะตอเชอพษสนขบามคา

มากกวาหรอเทากบ 0.5 IU/ml ถอวาใหผลบวก (OIE,

2004) ซงแสดงวาสนขมการตอบสนองทางภมคมกน

ตอการใหวคซนเพยงพอทจะสามารถปองกนโรคได

แตอยางไรกตามการตรวจดวย RFFIT ยงมขอจำกด

อยพอสมควร เชน จำเปนตองใชบคลากรทมความ

ชำนาญทางดานเซลลเพาะเลยง ตองทำการเพม

จำนวนเชอไวรสโรคพษสนขบาในหองปฏบตการ ม

ขนตอนการตรวจทซบซอน และใชเวลาในการตรวจ

อยางนอย 48 ชวโมง จงทำใหมตนทนคอนขางสง

และไมสามารถทำไดในหองปฏบตการทวไป นอกจาก

นการเกดภาวะเมดเลอดแดงแตก ในขนตอนการเกบ

ตวอยาง หรอการมไขมนในซรมในปรมาณสง (gross

lipemia) ยงอาจรบกวนการตรวจโดยวธ RFFIT ได

อกดวย ดวยเหตผลเหลานจงทำใหการตรวจวดการ

ตอบสนองทางภมคมกนตอเชอพษสนขบาไมเปนท

แพรหลายนก และเปนขอจำกดในการศกษาวจยท

เกยวของกบระดบภมคมกนและหรอประสทธภาพ

ของวคซนตอเชอพษสนขบาในชวงระยะเวลาทผานมา

ดงนนหากมวธการตรวจวดระดบภมคมกนทสะดวก

รวดเรว ราคาไมสงนก และมความแมนยำใกลเคยง

กบการตรวจดวยวธ RFFIT กจะทำใหสามารถเพม

ศกยภาพในการตรวจวดระดบแอนตบอดทจำเพาะ

ตอเชอพษสนขบาในหองปฏบตการอนไดมากขน ท

ผานมาในตางประเทศไดมการนำชดทดสอบทอาศย

หลกการของวธ ELISA มาใชในการตรวจวดระดบ

แอนตบอดตอโรคพษสนขบา (Cliquet et al., 1998;

Cliquet et al., 2003) โดยพบวาชดทดสอบมความ

บทนำ

36



ไว 79-93% ความจำเพาะ 97.3% เมอเปรยบเทยบ

กบวธมาตรฐาน (Cliquet et al., 2004) วธดงกลาว

อาศยการวดระดบความเขมของสทเกดจากการจบ

กนของแอนตเจน (เชอพษสนขบา) ทเคลอบอยกน

หลมกบแอนตบอดในซรมและแอนตบอดทยดดวย

เอนไซมจะทำปฏกรยากบ substrate ทใสลงไป จาก

นนอานผลดวยเครอง spectrophotometer (ราตร, 2533)

ถาระดบแอนตบอดทจำเพาะตอเชอพษสนขบามคา

มากกวาหรอเทากบ 0.6 EU/ml แสดงวาซรมใหผล

บวก (OIE, 2004) ทผานมาเคยมรายงานในตาง

ประเทศททำการศกษาเปรยบเทยบผลการตรวจวด

ระดบแอนตบอดตอโรคพษสนขบา โดยวธ ELISA

กบวธมาตรฐาน FAVN ซงเปนเปนวธทใชหลกการ

เดยวกนกบวธ RFFIT แตแตกตางกนทวธการอาน

ผล โดยพบวา วธ ELISA มความจำเพาะทใกลเคยง

กบการตรวจดวยวธ FAVN แมวาการตรวจดวยวธ

ELISA จะมความไวตอเชอนอยกวาวธ FAVN กตาม

(Cliquet et al., 2004) อยางไรกตามในประเทศไทย

ยงไมเคยมการศกษาเปรยบเทยบผลการตรวจวด

ระดบแอนตบอดตอโรคพษสนขบา โดยวธ ELISA

กบวธมาตรฐาน RFFIT ในสนข

การศกษานมวตถประสงคทจะทำการตรวจ

และวเคราะหระดบภมคมกนโดยวธ ELISA เพอ

เปรยบเทยบกบระดบภมคมกนทตรวจไดจากวธ

RFFIT โดยผลทไดจากการศกษานจะเปนขอมลพนฐาน

ทจะสามารถนำไปใชในการประเมนระดบภมคมตอ

โรคพษสนขบาอยางคราวๆ ได ซงจะชวยใหประหยด

คาใชจายและเวลาไดมากขน นอกจากนยงเปนจด

เรมตนของการศกษาวจยเพอประเมนประสทธภาพ

ของการใชโปรแกรมวคซนปองกนโรคพษสนขบาใน

อนาคตตอไป

สนขบา โดยวธ RFFIT ทกรมวทยาศาสตรการแพทย

กระทรวงสาธารณสข ขณะรอการตรวจจะเกบซรมทง 2

สวนไวทอณหภม -20๐C

4.การตรวจหาแอนตบอด ทจำเพาะตอโรค

พษสนขบาโดยวธ indirect enzyme-linked immuno-

sorbent assay (ELISA) ทำการตรวจหาแอนตบอด

ทจำเพาะตอโรคพษสนขบาโดยใชชดทดสอบสำเรจรป

(Serelisa™ Rebies Ab Mono Indirect, Synbiotics)

เพอตรวจหาแอนตบอดทมความจำเพาะตอเชอพษ

สนขบา (anti-rabies immunoglobulins) กบแอนตเจน

(inactivated Rabies virus) ท coat อยทกนหลม

ELISA plate จากนนทำการวดปรมาณของแอนตบอด

ทจำเพาะตอเชอพษสนขบาโดยการเตม protein A-

peroxidase conjugate และตามดวยการเตม substrate

วธดำเนนงาน

1.สนขทดลอง ทำการคดเลอกสนขทดลอง

2 กลม ไดแก กลมลกสนข (puppy) ซงเปนลกสนขท

ยงไมเคยไดรบวคซนปองกนโรคพษสนขบามากอน

จำนวน 10 ตว โดยมอายระหวาง 10-12 สปดาห ไม

จำกดพนธ เพศและลกษณะการดแล กลมสนขโต

(adult) เปนสนขทดลองทเคยไดรบวคซนปองกนโรค

พษสนขบามากอนหนาแลว จำนวน 20 ตว โดยม

อายระหวาง 1-7 ป ไมจำกดพนธ เพศและลกษณะ

การดแล และยงไมไดรบการกระตนวคซนปองกน

โรคพษสนขบามาเปนเวลาอยางนอย 1 ปทำการ

ตรวจและจดบนทกรายละเอยดของสนขแตละตว

ไดแก อาย เพศ ลกษณะภายนอก (สขน ลาย และ

ตำหนอนๆ) พรอมทงทำหมายเลข และระเบยนประวต

ประจำตวสนขแตละตว ทำการตรวจสขภาพเบองตน

และตรวจเลอด (CBC) กอนการฉดวคซนปองกนโรค

พษสนขบา

2.การฉดวคซนปองกนโรคพษสนขบา ฉด

วคซนปองกนโรคพษสนขบาชนดเชอตาย Nobivac lot

no. 74110D (Intervet) โดยฉดเขาชนใตผวหนง 1 ครง

ใหกบสนขทกกลมอาย ในวนทเรมการศกษา (wk 0)

3.การเกบตวอยางเลอด เกบตวอยางซรม

2 ครง ครงท 1 เกบกอนการฉดวคซนปองกนโรคพษ

สนขบา (wk 0) และ ครงท 2 เกบสปดาหท 4 หลง

การฉดวคซนปองกนโรคพษสนขบา (wk 4) โดยเจาะ

เกบเลอดจาก cephalic vein ของสนข เกบเลอดครง

ละ 5 มล. โดยใชหลอดเกบเลอดสญญากาศ (Vacuette,

Greiner bio-one) ตงไวทอณหภมหอง รอใหเลอด

แขงตวแลวจงทำการปนแยกซรม โดยปนทความเรว

1,500 รอบ/นาท อณหภม 20๐C 10 นาท แลวใช

ไมโครปเปตดดแยกซรมออกมา แบงเปน 2 สวน

สวนท 1 ปรมาตร 0.5 มล. เกบในหลอด eppendorf

เพอการทดสอบโดยวธ ELISA สวนท 2 ปรมาตร 2

มล. เกบในหลอด eppendorf ขนาดใหญ และ

ทำการสงเพอตรวจคาระดบแอนตบอดตอเชอพษ

(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine;TMB) เพอใหเกด

ปฏกรยาททำใหเกดส อานผลโดยใช spectrophoto-

meter ทความยาวคลน 450 nm และวเคราะหผล

ตามเอกสารแนะนำของบรษทผผลต โดยทกครงททำ

การตรวจตวอยาง จะทำการทดสอบตวอยางควบคมลบ

(negative serum control) และบวก (positive serum

control) ควบคไปดวย

5.การคำนวณหาความไว (sensitivity) และความจำเพาะ (specificity) ทำการคำนวณ

หาคาความไวและคาความจำเพาะของระดบ

แอนตบอดทจำเพาะตอโรคพษสนขบาจากวธ

ELISA เปรยบเทยบกบผลทไดจากวธ RFFIT โดย

แสดงผลในรปแบบตารางท 1

ตารางท 1 แสดงการคำนวนหา sensitivity และ specificity

หมายเหต RFFIT ; cut-off = 0.5 IU/ml และ ELISA ; cut-off = 0.6 EU/ml

38



1.ขอมลทางสขภาพทวไปของสนขทดลอง

จากการตรวจสขภาพทวไปของลกสนขพบสนขทม

คา body condition score นอยกวาปกตจำนวน 1 ตว

(10%) และพบสนขทมภาวะแหงนำ (ผวหนงและ

เยอเมอกแหง) จำนวน 2 ตว (20%) สนขกลม adult

สขภาพทวไปอยในเกณฑปกต ผลการตรวจเลอดของ

สนขทง 2 กลม พบสนขในกลม puppy จำนวน 2 ตว

มเชอ Hepatozoon spp. สวนคาผลเลอดโดยทวไป

ของสนขทง 2 กลมอยในเกณฑปกต

2.ผลการตรวจวดระดบแอนตบอดดวยวธ

RFFIT ผลการตรวจวดระดบแอนตบอดตอเชอพษ

สนขบา จากซรมของสนขกอนการใหวคซนโรคพษ

สนขบา (wk 0) จำนวน 30 ตวอยาง พบวา ซรมของ

สนขกลม puppy ใหผลบวก (1/10) นอยกวาสนขกลม

ผลการทดลอง adult (16/20) (ตารางท 2) โดยสนขในกลม puppy

มคาเฉลยของระดบแอนตบอดทจำเพาะตอเชอพษ

สนขบา 0.12±0.21 IU/ml ในขณะทสนขกลม adult

มคาเฉลยของระดบแอนตบอดทจำเพาะตอเชอพษ

สนขบา 1.20±1.09 IU/ml

ผลการตรวจวดระดบแอนตบอดจากซรม

ของสนขหลงการใหวคซนโรคพษสนขบา (wk 4)

จำนวน 30 ตวอยาง พบวา สนขทกตวใหผลบวกตอ

การตรวจวดระดบแอนตบอดดวยวธ RFFIT (ตารางท 3)

โดยสนขกลม puppy มคาเฉลยของระดบแอนตบอด

ทจำเพาะตอเชอพษสนขบา 5.28±3.50 IU/ml ในขณะ

ทสนขกลม adult มคาเฉลยของระดบแอนตบอดท

จำเพาะตอเชอพษสนขบา 58.85±38.90 IU/ml เมอทำ

การวเคราะหผลการตรวจทงหมด พบวาวธ RFFIT

ใหผลบวก จำนวน 47 ตวอยาง (78.33%) ใหผลลบ

จำนวน 13 ตวอยาง (21.67%)

3.ผลการตรวจวดระดบแอนตบอดดวยวธ

ELISAผลการตรวจวดระดบแอนตบอดตอเชอพษ

สนขบากอนการใหวคซนโรคพษสนขบา (wk 0) ดวย

วธ ELISA จำนวน 30 ตวอยาง พบวา ซรมของสนข

กลม puppy ใหผลลบทงหมด สวนสนขกลม adult

ใหผลบวกเพยง 1 ตวอยาง (ตารางท 4) สนขกลม

puppy มคาเฉลยของระดบแอนตบอดทจำเพาะตอ

เชอพษสนขบา 0.05±0.03 EU/ml ในขณะทสนขกลม

adult มคาเฉลยของระดบแอนตบอดทจำเพาะตอ

เชอพษสนขบา 0.20±0.50 EU/ml ผลการตรวจวด

ระดบแอนตบอดจากซรมของสนขหลงการใหวคซน

โรคพษสนขบา (wk 4) จำนวน 30 ตวอยาง พบวา

สนขในกลม puppy ใหผลบวก จำนวน 9 ตวอยาง

(90%) (ตารางท 5) โดยมคาเฉลยของระดบแอนตบอด

ทจำเพาะตอเชอพษสนขบา 1.80±1.04 EU/ml ในขณะท

สนขกลม adult ใหผลบวกทกตว โดยมคาเฉลยของ

ระดบแอนตบอดทจำเพาะตอเชอพษสนขบา 7.40

±2.74 EU/ml โดยเมอทำการรวมตวอยางทงหมด (60 ตว

อยาง) พบวาวธ ELISA ใหผลบวก จำนวน 30

ตวอยาง (50%) ใหผล negative จำนวน 30 ตวอยาง

(50%)

ตารางท 2 ผลการตรวจระดบแอนตบอดตอเชอพษสนขบา จากซรมของสนขทดลองกอนการใหวคซนโรคพษสนขบาโดยวธ RFFIT

a จำนวนตวอยางทใหผล positive ตอวธ RFFIT x 100 จำนวนตวอยางทงหมดของแตละกลม b จำนวนตวอยางทใหผล negative ตอวธ RFFIT x 100 จำนวนตวอยางทงหมดของแตละกลม

ตารางท 3 ผลการตรวจระดบแอนตบอดตอเชอพษสนขบาจากซรมของสนขทดลองในสปดาหท 4 หลงการใหวคซนโรคพษสนขบาโดยวธ RFFIT

a, b ดการคำนวณจากตารางท 2

ตารางท 4 ผลการตรวจระดบแอนตบอดตอเชอพษสนขบา จากซรมของสนขทดลองกอนการใหวคซนโรคพษสนขบาโดยวธ ELISA


ตารางท 5 ผลการตรวจระดบแอนตบอดตอเชอพษสนขบาจากซรมของสนขทดลองในสปดาหท 4 หลงการใหวคซนโรคพษสนขบาโดยวธ ELISA


40



ตารางท 6 ผลจากการตรวจโดยวธ ELISA เมอเปรยบเทยบกบวธ RFFIT

จากการวเคราะหแจกแจงคา RFFIT titer และ

% ผลลบลวง (false negative) ของการตรวจวด

ระดบแอนตบอดโดยวธ ELISA พบวา ชวงคา RFFIT

titer ทวธ ELISA ใหผล % ผลลบลวง สงสด (50%)

คอ ชวง RFFIT titer ท 0.00-2.50 รองลงมา คอ ชวง

RFFIT titer ท 2.50-5.00 แสดงไดวา เมอตวอยางม

ระดบแอนตบอดตำๆ อาจจะทำใหไดผลลบลวงสง

ขนเมอใชการตรวจดวยวธ ELISA (ตารางท 7) ผล

จากการศกษานจงสรปไดวาวธ ELISA จะมความไว

ตำกวาวธ RFFIT เมอใชตรวจตวอยางทมระดบ

แอนตบอดทนอยกวา 5 IU/ml

ตารางท 7 การแจกแจงระดบแอนตบอดทตรวจวดโดยวธ RFFIT และผล % ผลลบลวงทได จากการตรวจวดระดบแอนตบอดโดยวธ ELISA

a จำนวนตวอยางทใหผล positive ตอวธ RFFIT แตใหผล negative ตอวธ ELISA ในชวง RFFIT titer นน x 100 จำนวนตวอยาง ทงหมดในชวง RFFIT titer นน

ในปจจบนการตรวจวดระดบแอนตบอดตอ

โรคพษสนขบาโดยวธมาตรฐาน FAVN และวธ RFFIT

ทใชกนอยางแพรหลายยงมขอจำกดอยหลายดาน

จงไดมการพฒนาชดทดสอบทอาศยหลกการของวธ

ELISA มาใชในการตรวจวดระดบแอนตบอดตอโรค

พษสนขบา โดยชดทดสอบ ELISA ไดรบการยอมรบ

จาก OIE ใหเปนวธทใชตรวจระดบแอนตบอดตอโรค

พษสนขบาเพอการขนยายสตวขามประเทศ (OIE, 2004)

ซงจะทำใหมความสะดวก เนองจากไมตองทำการ

เลยงเชอไวรสโรคพษสนขบาในหองปฏบตการ ซงไม

สามารถทำไดในหองปฎบตการทวไป มความรวดเรว

โดยวธ ELISA ใชเวลาประมาณ 4 ชวโมง เมอเทยบ

กบวธ RFFIT ซงใชเวลามากกวา 48 ชวโมง อกทงวธ

ELISA ยงมคาใชจาย (300-500 บาท/ตวอยาง) ถก

กวาวธ RFFIT (1,500-2,000 บาท/ตวอยาง)

การศกษาครงนมวตถประสงคเพอทจะ

ศกษาความเปนไปไดของการนำเทคนค ELISA มา

ใชเพอการตรวจหาระดบแอนตบอดตอเชอพษสนข

บาในประชากรสนขในประเทศไทย โดยทำวเคราะห

ผลการตรวจหาระดบแอนตบอดโดยวธ ELISA

เปรยบเทยบกบระดบแอนตบอดทตรวจไดจากวธ

มาตรฐาน (RFFIT) แมวาระดบแอนตบอดตอโรคพษ

สนขบาทไดจากการตรวจโดยวธ ELISA ไมสามารถ

นำมาเทยบกบระดบแอนตบอดตอเชอพษสนขบาท

ไดจากการตรวจโดยวธมาตรฐาน RFFIT ไดโดยตรง

เนองจากวธ ELISA เปนการตรวจวดระดบแอนตบอด

ทจบกบแอนตเจนของเชอไวรสโรคพษสนขบา ในขณะ

ทวธ RFFIT เปนการตรวจวดระดบ neutralizing

antibody ทจำเพาะตอเชอไวรสโรคพษสนขบาทำให

ระดบแอนตบอดจากสองวธนมความแตกตางกนบาง

ซงสอดคลองกบผลการทดลองของ Simani (2006)

ทรายงานวา คาเฉลยของระดบแอนตบอดตอโรคพษ

สนขบาทไดจากการตรวจโดยวธ ELISA จะตำกวา

วธ RFFIT อยางมนยสำคญ

วจารณและสรป ผลจากงานวจยนพบวาผลการตรวจดวยวธ

ELISA และวธ RFFIT มความสอดคลองกน (concor-

dance) 71.67% (ตารางท 6) ซงตำกวารายงานเดม

ทรวบรวมผลการศกษาจากหองปฏบตการ 2 แหง ท

ใชชดทดสอบชนดเดยวกนเพอการตรวจวดระดบ

แอนตบอดทจำเพาะตอเชอพษสนขบาจากซรมของ

สนขและแมว 3 กลมตวอยาง จำนวนทงสน 2,360

ตวอยาง ซงใหคาความสอดคลองเฉลยเมอเทยบกบ

วธ FAVN 88.26% (Cliquet et a., 2004) คาความ

สอดคลองทคอนขางตำในการศกษาน นาจะมาจาก

จำนวนตวอยาง และลกษณะการกระจายตวของ

ระดบแอนตบอดในตวอยางทตางกนคอนขางมาก

ระหวางการศกษาในครงนเมอเทยบกบการศกษาใน

ตางประเทศ อยางไรกตามผลการศกษาในครงนพบ

วา วธ ELISA มความจำเพาะสงทเปนทนาพอใจ โดย

ไมพบผลบวกลวงในการศกษาครงน ซงเปนไปใน

ทศทางเดยวกนกบรายงานทผานมา ซงรายงานวาวธ

ELISAใหผลบวกลวงตำเฉลยเพยง 0.71% เมอเทยบ

กบวธ FAVN (Cliquet et al., 2004)

ผลจากการศกษาในครงนพบวาวธ ELISA ม

ความไวเมอเทยบกบ neutralization assay ทคอน

ขางตำ (64%) เมอเทยบกบการรายงานกอนหนาน

โดย Cliquet และคณะ (2004) (เฉลย 86%) ซงอาจ

เกดจากจำนวนตวอยางทนอยกวาในการศกษาน

หรออาจเกดจากวธมาตรฐานทใชในการเปรยบเทยบ

แตกตางกน คอ วธ RFFIT กบวธ FAVN โดยทผาน

มามรายงานวาวธ RFFIT มความไวมากกวาวธ FAVN

ทำใหผลการตรวจระดบแอนตบอดไดผลบวกมาก

กวา (Cliquet et al., 1998) ดงนนคา sensitivity ของ

วธ ELISA เปรยบเทยบกบวธ RFFIT จงมคานอยกวา

เมอเปรยบเทยบกบวธ FAVN อยางไรกตามการศกษา

ครงน พบวา วธ ELISA ใหผลลบลวงโดยรวมทสงถง

28.33% โดยจะมโอกาสการใหผลลบลวงสงมากในซ

รมทม RFFIT titer ตำกวา 5.00 IU/ml (ตารางท 7)

ซงสอดคลองกบการทดลองทผานมาของ Servat และ

Cliquet (2006) ททำการศกษาเพอประเมนการทดสอบ

42



เอกสารอางอง ราตร วงษวชรดำรง. 2533. Enzyme-linked immunosorbent assay. ปฏบตการไวรสวทยาทางสตวแพทย. หนวยไวรสวทยา ภาควชาพยาธวทยา คณะสตว แพทยศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย หนา167-180. เลอสรวง ชวนชย. 2523. การตรวจทางหองปฏบตการ. โรคพษสนขบา. บรรณาธการ: ประเสรฐ ทองเจรญ โรงพมพอกษรสมย กรงเทพฯ หนา 110-115. สถานเสาวภา. 2550. สถานะภาพสนขทเปน โรคพษสนขบา ทสถานเสาวภา. สถานเสาวภา เขตปทมวน กรงเทพฯ 10330. อญญารตน ชวงศเตม อญชล ชยธระยานนท ทองสข จนทะคาม รตนาภรณ พรหมาสา อภสทธ ปราการกมานนท คณศกด อรวระกล และผกามาศ ขาวปลอด. 2543. การศกษาภมคมกนตอโรคพษสนขบาทได รบถายทอดจากแมและการตอบสนองตอการทำ วคซนครงแรก. รายงานโครงการเสรมทกษะการวจย (Clinical conference) ปการศกษา 2543 คณะสตวแพทยศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย หนา 14. Cliquet, F., Aubert M. and Sagne, L. 1998. Development of a fluorescent antibody virus neutralisation test (FAVN test) for the quantitation of rabies- neutralising antibody. J. Immunol. Methods. 212 : 79-87.

วธ ELISA ในการตดตามผลการทำวคซนปองกนโรค

พษสนขบาในสนขและแมว ซงพบผลลบลวงมากทสด

ในชวง 0.5-1.0 IU/ml ในขณะทรายงานการทดลองของ

Cliquet และคณะ (2004) วเคราะหระดบแอนตบอด

ตอโรคพษสนขบาโดยวธ ELISA เปรยบเทยบกบวธ

FAVN และพบวาวธ ELISA จะมโอกาสใหคาผลลบ

ลวงสงขน ถาซรมมระดบแอนตบอดทจำเพาะตอเชอ

พษสนขบาตำกวา 2.85 IU/ml เนองจากในการศกษา

นทมการกำหนดวนทเกบเลอดหลงจากไดรบวคซน

โรคพษสนขบาทแนนอน ทำใหระดบ titer ทไดคอน

ขางเกาะกลมกน อกทงมจำนวนตวอยางทนอยกวา

จงทำใหจดแบงชวงการกระจายตวของ RFFIT titer

ไดนอยกวาการศกษาในตางประเทศ การศกษาศกยภาพ

ของวธ ELISA ในประเทศไทยในอนาคต จงควรใช

จำนวนตวอยางมากขน และใชตวอยางทมการกระจาย

ตวของระดบแอนตบอดไตเตอรทมชวงกวางและ

หลากลายกวาการศกษาในครงน

เนองจากวธ ELISA (Serelisa™ Rabies) ท

ใชในการศกษาน ใช inactivated rabies virus ใน

การ coat ลงบน ELISA plate ซงอาจประกอบไป

ดวยแอนตเจนหลากหลาย สามารถจบกบแอนตบอด

ทงชนด neutralizing และ non-neutralizing ปจจยน

จงอาจเปนขอจำกดของวธ ELISA (Serelisa™ Rabies)

เมอนำผลมาเปรยบเทยบกบวธ RFFIT ซงตรวจหา

neutralizing antibody เปนหลก ในชวงทผานมาจง

มการพฒนาชดตรวจสอบ ELISA (Platelia Rabies

II kit, Biorad) โดยใช purified glycoprotein G ของ

เชอพษสนขบา ซงเปนแอนตเจนหลกทการกระตน

การสราง anti-Rabies neutralizing antibody มาใช

coat ลงบน ELISA plate แทน โดยผลการศกษาท

ผานมาพบวา ชดทดสอบดงกลาวมประสทธภาพด

มากเมอนำมาใชตรวจหาแอนตบอดตอเชอพษสนขบา

ในซรมของสนข แมว และสนขจงจอก โดยพบวาม

ความไวและความจำเพาะทสงกวาชดทดสอบ Serelisa

ทรายงานโดย Cliquet และคณะ (2004) อกทงยงม

ความไวในการตรวจหาระดบแอนตบอดระดบตำๆ ท

ดกวาอกดวย แมวาจะยงคงใหผลลบลวงคอนขางสง

ในกรณทมระดบแอนตบอดตำกวา 2 IU/ml (Seryat

et al., 2007) นอกจากนชดทดสอบนยงใหผลเปนท

นาพอใจเมอนำมาใชตรวจหาระดบแอนตบอดท

จำเพาะตอเชอพษสนขบาในซรมมนษย (Feyssaquet

et al., 2007) ผลการศกษาเหลานชถงศกยภาพของ

การนำวธ ELISA มาใชเพอตรวจหาแอนตบอดตอ

เชอพษสนขบาไดเปนอยางด แตอยางไรกตามวธนยง

มขอจำกดเมอนำมาใชตรวจตวอยางทม ระดบ

แอนตบอดในระดบตำมากๆ

ผลจากการศกษานและจากรายงานทผานๆ มา

แสดงใหเหนวา ผลจากการตรวจโดยวธ ELISA มคา

ความจำเพาะ (specificity) ทสงมาก โดยมโอกาสใน

การเกดผลบวกลวงไดนอยมาก ทำใหผลบวกทไดม

ความนาเชอถอ ดงนนถงแมวาจะมโอกาสเกดผลลบ

ลวงอยบาง แตไมทำใหเกดความเสยงทางระบาดวทยา

ของโรคพษสนขบา เพราะเมอผลการตรวจเปนลบ

สามารถนำตวอยางดงกลาวไปตรวจซำอกครงดวยวธ

มาตรฐาน RFFIT หรอทำการฉดวคซนโรคพษสนขบา

เพอกระตนภมคมกนใหมได กลาวโดยสรปวธ ELISA

เปนวธทสะดวก รวดเรว และราคาไมสงนก และนา

จะเปนทาง เลอกหน งสำหรบการศกษาระดบ

ภมคมกนตอโรคพษสนขบาในประชากรสตวจำนวน

มากได

ผลจากการตรวจระดบแอนตบอดทจำเพาะ

ตอเชอพษสนขบาในกลมลกสนขอาย 10-12 สปดาห

กอนการใหวคซนพบวา ซรมของลกสนขสวนใหญให

ผลลบ และมคาเฉลยของแอนตบอดตอเชอพษสนข

บาตำกวา 0.5 IU/ml ซงชวาระดบภมคมกนถายทอด

จากแมในสนขทดลองกลมนไดลดตำลงจนไมนาจะม

ผลรบกวนตอใหวคซนเมออาย 10-12 สปดาห ซง

สอดคลองกบระดบภมคมกนทเพมสงขนภายหลง

การใหวคซน ผลการศกษานสอดคลองไปในทศทาง

เดยวกนกบรายงานกอนหนาน ซงทำการศกษาระดบ

ภมคมกนในลกสนขในวยกอนไดรบวคซนจำนวน 32 ตว

โดยตรวจไมพบแอนตบอดโดยวธ RFFIT (Kasempi-

molporn et al., 1996) อกทงทผานมาในอดตมรายงาน

ยนยนวาลกสนขไทยอาย 11-16 สปดาห สามารถ

ตอบสนองตอการใหวคซนพษสนขบาไดด โดยไมม

การรบกวนจากภมคมกนถายทอดจากแม (Songsri

et al., 1966) นอกจากนอญญารตน และคณะ (2543)

รายงานคาเฉลยระดบแอนตบอดตอเชอพษสนขบา

โดยวธ RFFIT ในลกสนขจำนวน 90 ตว อาย 1, 2

และ 3 เดอน เทากบ 0.63, 0.14 และ 0.04 ตาม

ลำดบ โดยลกสนขอาย 3 เดอน ทกตว ทมระดบ

RFFIT titer ระหวาง <0.03-0.25 IU/ml ในวนทไดรบ

วคซน สามารถตอบสนองตอการใหวคซนไดเปนอยางด

ผลการศกษาเหลานชวา โปรแกรมการใหวคซนปองกน

โรคพษสนขบาเขมแรกเมออาย 2.5-3 เดอน ยงถอ

เปนชวงเวลาทมความเหมาะสม อยางไรกตามเปนท

นาสงเกตจากการศกษาครงนวา ระดบแอนตบอดไต

เตอรเฉลยของลกสนข มคาตำกวาระดบแอนตบอด

เฉลยในกลมสนขโตอยางมาก ทงนนาจะมาจากการ

ทสนขโตเคยไดรบวคซนพษสนขบามากอนแลวใน

ชวงชวตทผานมา นอกจากนยงมรายงานวาลกสนข

อายตำกวา 1 ป อาจมการตอบสนองตอการใหวคซน

ทไมดเทาสนขทโตเตมไว (Kenedy et al., 2007) สง

ทพงระลกไวเสมอคอ โดยทวไปแลวระดบแอนตบอด

ทจำเพาะตอเชอพษสนขบาในสนขจะเพมสงขนภาย

หลงการไดรบวคซน โดยจะขนถงระดบสงสดประมาณ

1 เดอนภายหลงไดรบวคซน จากนนจะลดตำลงอยาง

รวดเรวโดยมระดบแอนตบอดตำกวา 0.5 IU/ml ภายใน

เวลา 6 เดอน (Tepsumethanon et al., 1991) ดงนน

การเกบตวอยางซรมสนขเพอประเมนสถานภาพทาง

ภมคมกนตอโรคพษสนขบาในกลมประชากรใดๆ จง

ควรมขอมลการไดรบวคซนครงลาสดประกอบดวยเสมอ

กตตกรรมประกาศ

ขอขอบคณทนโครงการเสรมทกษะการวจย

ของคณะสตวแพทยศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย

ป พ.ศ. 2550 และบรษท อนเตอรเวท (ประเทศไทย)

จำกด ทสนบสนนทนวจย ภาควชาสตศาสตรเธนเวช

วทยาและวทยาการสบพนธ ศนยฝกนสตคณะสตว

แพทยศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย จ.นครปฐม

และสถานกกกนสนขจรจด เขตประเวศ กรงเทพมหานคร

สพ.ญ.ปยะนช ประเสรฐเมฆ และสพ.ญ.ฐตรตน ไชยม

ทใหความอนเคราะหและชวยเหลอในการเกบตวอยาง

เลอดสนข และภาควชาจลชววทยา คณะสตวแพทยศาสตร

จฬาลงกรณมหาวทยาลย ทใหความเออเฟอเครอง

มอและอปกรณสำหรบการวจย

44



Comparison of the levels of anti-Rabies virus antibodies determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and rapid fluorescent focus inhibition test

(RFFIT) in Thai dogs.

Piyaporn Wattanapirom 1) Umaporn Pantsiri 1) Wirada Wiriyakitja 1) and Sanipa Suradhat 2) #

This study compared the levels of anti-Rabies virus antibodies determined by enzyme-linked im-

munosorbent assay (ELISA) and the gold standard test, rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT)

from 60 dog sera. The result revealed that the ELISA gave concordant results to those of the RFFIT

in 43 samples (71.67%) with no false-positive. However, the assay gave false-negative results in 17

samples (28.33%). The overall sensitivity and specificity of the ELISA in comparison with RFFIT were

64% and 100% respectively. The ELISA test yielded lower sensitivity for samples with RFFIT titers of

less than 5 IU/ml. Although the ELISA has a lower sensitivity than the RFFIT test, it is a convenient

and inexpensive tool and can be an alternative test for determining of the levels of anti-rabies anti-

body titers in large number of animals.

Keywords: Rabies, ELISA, RFFIT, anti-Rabies virus antibodies

1) Sixth year students, Academic year 2007, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University

2) Department of Veterinary Microbiology, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University

# Corresponding author

Abstract

Cliquet, F., Muller, T., Mutinelli, F., Geronutti, S., Brochier, B., Selhorst, T., Schereffer, J.L., Krafft, N., Burow, J., Schameitat, A., Schluter, H. and Aubert, M. 2003. Standardisation and establishment of a rabies ELISA test in European laboratories for assessing the efficacy of oral fox vaccination campaigns. Vaccine 21: 2986-2993. Cliquet, F., Mcelhinney, L.M., Servat, A., Boucher, J.M., Lowings, J.P., Goddard, T., Mansfield, K.L. and Fooks, A.R. 2004. Development of a qualitative indirect ELISA for the measurement of rabies virus-specific antibodies from vaccinated dogs and cats. J. Virol. Methods. 117: 1-8. Feyssaguet, M., Dacheux, L., Audry, L., Compoint, A., Morize, J.L., Blanchard, I. and Bourhy, H., 2007. Multicenter comparative study of a new ELISA, PLATELIA RABIES II, for the detection and titration of anti-rabies glycoprotein antibodies and comparison with the rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT) on human samples from vaccinated and non- vaccinated people. Vaccine 25: 2244-2251. Kasempimolporn, S., Mitmoonpitak, C., Chaiyabutr, N., Supakorn, K., Brahmasa, R. and Sitprija, V., 1996. Maternal antibodies against rabies in Thai puppies. A preliminary study. J. Med. Assoc. Thai. 79: 36-39. Kennedy, L.J., Lunt, M., Barnes, A., McElhinney, L., Fooks, A.R., Baxter, D.N., Ollier, W.E.R. 2007. Factors influencing the antibody response of dogs vaccinated against rabies. Vaccine. 25:8500-8507. OIE. 2004. Rabies. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. 5th ed. Paris: Office International des Epizooties. [Online]. Available: http://www.oie.int/eng/Normes/ mmanual/A_00044.htm Puanghat, A. and Hunsoowan, W. 2005. Rabies Situation in Thailand. J. Med. Assoc. Thai. 88:1319-1322. Servat, A. and Cliquet, F. 2006. Collaborative study to evaluate a new ELISA test to monitor the effectiveness of rabies vaccination in domestic carnivores. Virus Res. 120: 17–27.

Servat, A., Feyssaguet, M., Blanchard, I., Morize, J.L., Schereffer, J.L., Boue, F. and Cliquet, F., 2007. A quantitative indirect ELISA to monitor the effectiveness of rabies vaccination in domestic and wild carnivores. J. Immunol. Methods 318: 1-10. Simani, S. 2006. “Comparison of three serological tests for titration of rabies in immunized individuals”. WHO Collaborating Center for Reference and Research on Rabies, Pasteur Institute of Iran. [Online]. Available: http:// www.ams.ac.ir/AIM/9923/simani9923.html Smith, J.S., Yager, P.A. and Baer, G.M., 1973. A rapid reproducible test for determining rabies nutralising antibody. Bull. WHO. 48: 535-541. Songsri, K., Mitmoonpitak, C., Chaiyabutr, N., Supakorn, K., Brahmasa, R. and Sitprija, V. 1966. Maternal antibodies against rabies in Thai puppies. J. Med. Assoc. Thai. 79: 36-39. Tepsumethanon, W., Polsuwan, C., Lumlertdaecha, B., Khawplod, P., Hemachudha, T., Chutlvongse, S., Wilde, H., Chlewbamrungkmt, M. and Phanuphak, P. Immune response to rabies vaccine in Thai dogs: A preliminary report. Vaccine. 9:627-630.

50


Vol. 21 No. 3 July - September 2009 Vol. 21 No. 4 October - December 2009 51

ทบทวนเรองโรคพษสนขบาในสตวเลยง

ประวณา กตคณ 1) #

โรคพษสนขบาเปนโรคตดเชอทสงผลตอระบบประสาท มอนตรายรายแรงถงชวต สามารถกอโรคไดใน

สตวเลยงลกดวยนมทกชนด อกทงยงเปนโรคสตวสคนหรอสตวเลยงสคนทสำคญในประเทศ การทำวคซน

ปองกนโรคพษสนขบาในสตวเลยงอยางถกวธและอยางตอเนองรวมทงการเฝาระวงปองกนไมใหสตวเลยงไป

ถกกดโดยสนขหรอแมวจรจด เปนวธการปองกนและควบคมโรคพษสนขบาในสตวเลยงอยางไดผล ดงนน

สตวแพทยจงควรใหความรพนฐานดานอาการแสดงของโรค แหลงรงโรคและการตดตอของโรคแกเจาของสตวเลยง

เพอชวยในการเฝาระวงโรคในสตว รวมทงควรไดแนะนำใหเจาของไดตระหนกถงการทำวคซนในสตวเลยงของ

ตนอยางตอเนอง เพอเปนการปองกนอนตรายจากโรคทงในสตวเลยงเจาของเอง

คำสำคญ: โรคพษสนขบา สตวเลยง โรคสตวสคน การตดตอ

1) ภาควชาพยาธวทยา คณะสตวแพทยศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย

# ผรบผดชอบบทความ หมายเลขโทรศพท 02-218-9655 Email address: [email protected]

โรคพษสนขบา (Rabies) หรอเรยกอกชอหนง

วา โรคกลวนำ (Hydrophobia) เปนโรคทรจกกนมา

นานกวา 5,000 ป ถงแมวาวทยาการดานการแพทย

จะพฒนากาวหนาทำใหรจกเชอไวรสสาเหตของโรค

มากขน และมการผลตวคซนทใชไดผลเปนอยางดทง

ในคนและสตวเลยง แตกยงพบวาในปจจบนโรคพษ

สนขบายงคงคราชวตผคนประมาณ 50,000-55,000

คนตอปทวโลก และยงมคนจำนวนกวา 3 พนลาน

คนในกวา 100 ประเทศทยงจดเปนกลมทเสยงตอ

การตดเชอ พบวามากกวารอยละ 95 ของคนทตด

เชอพษสนขบาอยในทวปเอเชยและแอฟรกาและ

กลมอายของคนทตดเชอมกจะเปนเดกทถกสนขบากด

(Wunner and Briggs, 2010) เมอตนปพ.ศ. 2553

มขาวการเสยชวตของเจาของสนขทถกสนขของ

ตนเองกดแลวเปนโรคพษสนขบาในประเทศไทย

เจาของสนขเองกอนเสยชวตไดยนยนวาสนขไดรบ

วคซนปองกนโรคพษสนขบาแลวโดยตนเปนผทำ

วคซนใหเอง ดงนนในเวลาตอมาเมอสนขดงกลาว

รวมทงสนขตวอนๆ ในบานตายเจาของจงไมนกวา

โรคพษสนขบาจะเปนสาเหต จงไมไดปฏบตตนตาม

แนวทางการรกษากรณผปวยถกสตวทเปนโรคพษ

สนขบากดซงอาจทจะปองกนโรคแกตนเองไดทน

ทวงท เหตการณดงกลาวไดนำความตนตระหนกมา

สคนไทย ในขณะเดยวกนยงสะทอนใหเหนวาโรคพษ

สนขบายงคงมอยในประเทศ และการควบคมและ

ปองกนโรคนทงในสตวและคน ตองอาศยความรพน

ฐานเกยวกบเชอสาเหต การแพรกระจายของเชอ

บทความนจงมวตถประสงคทจะทบทวนความรพน

ฐานเกยวกบเชอสาเหตของโรคพษสนขบา ลกษณะ

อาการแสดงในสตวเลยง การตรวจวนจฉย และการ

ปองกนโรคในสตวเลยง เพอเปนความรในการวาง

มาตรการปองกนและเฝาระวงโรคในสตวเลยงเพอ

การจดการปองกนการตดเชอขามจากสตวสคน

สาเหตการแพรกระจายของเชอ โรคพษสนขบานนจะกอใหเกดการอกเสบ

ของเยอหมสมองและประสาทสวนกลางในสตวเลยง

ลกดวยนมทกชนด อกทงยงเปนโรคสตวสคน (zoonosis)

ทรายแรง การตดเชอมกเกดจากการถกสตวทเปนโรค

กด ขวน เลย หรอการทนำลายของสตวปวยเขาทาง

บาดแผลหรอเยอเมอกตา นอกจากนยงมรายงาน

การตดเชอในคนไขทไดรบการปลกถายอวยวะจาก

คนทตดเชอ (Kumar, 2009) สาเหตของโรคเกดจาก

เชอไวรส rabies เปน negative sense RNA virus

ซงอยใน genus Lyssavirus family Rhabdoviridae

มเปลอกหมไวรส และรปรางของเชอทเหนภายใต

กลองจลทรรศนอเลคตรอนเปน bullet shape สตว

หรอคนทตดเชอจะถงชวตอยางรวดเรวภายหลงเรม

แสดงอาการปวย ปจจบนยงไมสามารถรกษาโรคนได

แตสามารถปองกนอาการแสดงไดหากไดรบวคซน

ปองกนโรครวมกบอมมโนโกลบลน (Post exposure

prophylaxis) อยางทนทวงทกอนทเชอจะเขาสปลาย

ประสาท (peripheral nerves)

โดยสวนใหญคนมกทจะตดเชอพษสนขบา

จากสตวเลยงทเปนโรค เชน สนขและแมว ปจจบน

ประเทศทพฒนาแลว เชน อเมรกาเหนอ พบรายงาน

ของโรคพษสนขบาในสตวเลยงลดลงมากจนเหลอ

จำนวนไมกรอยรายตอป เนองจากการรณรงคการทำ

วคซนปองกนโรคพษสนขบาอยางจรงจงและไดผล

ในชวง ค.ศ. 1940-1950 สวนโรคพษสนขบาในสตว

เลยงในประเทศทพฒนาแลวมกจะไดรบเชอไวรส

จากสตวปา เชน สนขจงจอก สกงค และแรคคน ซง

ถอเปนแหลงรงโรคทสำคญ พบวาภายในชวงสอง

ทศวรรษทผานมารายงานโรคพษสนขบาในสตวปา

ของประเทศอเมรกาเหนอมประมาณ 7,000-8,000 ราย

(Blanton et al., 2007) และในปจจบนโรคพษสนข

บาในสตวปากยงคงเปนปญหาททำใหการกำจดโรค

นในประเทศอเมรกาเหนอไมเปนผลสำเรจ สำหรบ

ประเทศไทยถงแมวาจะพบการตดเชอพษสนขบาได

ในสตวหลายชนดเชน หน โค สกร แพะ หรอกระทง ชาง

บทนำ

52



การตดเชอจากสตวสคนกมกทจะเกดจากการถก

สตวเลยงเชนแมวและสนขโดยเฉพาะสนขจรจดกด

ดงนนจงถอไดวาสตวเหลานเปนแหลงรงโรคทสำคญ

ในประเทศ ซงทผานมาการสำรวจจำนวนสนขและ

สนขจรจดเฉพาะในเขตกรงเทพมหานครมจำนวน

มากถง 823,520 และ 130,000 ตวตามลำดบ (กรม

ปศสตว, 2550) ผลการสำรวจชนดสตวจากจำนวน

สตว 142 ตวทใหผลบวกตอเชอพษสนขบาในเขต

กรงเทพมหานครในปทผานมา พบวา 94.4% (134

ตว) เปนสนขและ 5.6% (8 ตว) เปนแมว นอกจากน

66.9% (95/142) เปนสตวมเจาของและทนาสงเกต

คอมเพยง 14.8% (21/142) ของจำนวนทงหมดทม

ประวตไดรบวคซนปองกนโรคพษสนขบา (กตภทท

และคณะ, 2552) รายงานสำนกระบาดวทยาชวงป

พ.ศ. 2549-2551 พบวาขอมลจำนวนผปวยและเสย

ชวตดวยโรคพษสนขบาในประเทศไทยมแนวโนมลดลง

คอจาก 26 รายในปพ.ศ. 2549 เปน 8 ราย ในป

พ.ศ. 2551 อยางไรกตามขอมลในชวงป พ.ศ. 2552

ทผานมาพบวามผปวยและเสยชวตดวยโรคพษสนข

บาถง 24 รายและในจำนวนนน 20 รายอยในภาคกลาง

(จงหวดกรงเทพมหานคร 8 ราย คดเปน 33.3% ของ

ทงหมด) นอกจากนตงแตเดอน มกราคม-มถนายน

พ.ศ. 2553 ทผานมาพบผปวยและเสยชวตดวย

โรคพษสนขบา 13 รายแลว ซง 6 รายอยในเขต

กรงเทพมหานคร และกวาครงหนงมประวตถกกดโดย

สนขทมเจาของ

อาการของโรค อาการแสดงของโรคพษสนขบาในสนข มสอง

รปแบบดวยกนคอ แบบดราย (excitatory หรอ furious)

และแบบซม (paralytic หรอ dumb) ภายหลงการ

ตดเชออาการแสดงจะแบงไดเปน 3 ระยะดวยกนคอ

prodromal, excitement และ paralytic ซงระยะ

ตางๆ ดงกลาวในสตวแตละตวอาจไมเทากน ระยะ

prodromal ประมาณ 2-3 วน สนขมกจะมพฤตกรรม

ทเปลยนไปจากเดมซงเจาของทเลยงอยางใกลชดจง

จะสงเกตเหนได สนขจะมไข มานตาตอบสนองตอ

แสงชากวาปกต และอาจมการกดแทะบรเวณรอย

แผลทถกกด ระยะ excitement บางครงอาจกนเวลา

ยาวนานถงหนงสปดาห แตบางกรณสตวบางตวอาจ

ขามจากระยะ prodromal ไปสระยะ paralysis ทนท

สตวทแสดงระยะทสองชดเจนจะมอาการหงดหงด

ดราย ไวแสง ไวเสยง เหาสงตางๆ กดสงของ วงชน

ซงเมออาการของโรคเขาสชวงทายคอชวง 2-4 วน

กอนตาย สตวจะแสดงอาการเจบขาโดยเฉพาะขา

ขางทถกกด จากนนจงเกรงทคอและหว นำลายไหล

ยดและเปนฟอง ขากรรไกรคาง ไมสามารถใชลนเลย

นำได ในทสดสนขทตดเชอจะเขาสภาวะซมและตาย

เนองจากระบบหายใจลมเหลว ทงสามชวงในสนข

มกจะใชเวลา 3-8 วน (Kumar, 2009) อาการแสดง

ของโรคพษสนขบาในแมวคลายคลงกบทพบในสนข

แตมกจะพบแบบดรายมากกวาในสนข และแมวท

เปนโรคมกจะชอบหลบซอนตว เนองจากแมวมกม

นสยทชอบออกทองเทยวนอกบาน และชอบลาสตว

ชนดตางๆ เปนอาหาร ดงนนในตางประเทศมกพบวา

โอกาสทแมวจะตดเชอจากสตวปาเชน แรคคนหรอ

คางคาวสงกวาสนข การสำรวจในตางประเทศพบวา

44% ของคนทมารบการรกษาแบบ post-exposure

ดวยอมมโนโกลบลนเนองจากถกแมวทสงสยวาตด

เชอพษสนขบากด (Gordon et al., 2004) อาการ

แสดงของโรคพษสนขบาในสตวเลกชนดอนๆ เชน

กระตาย คอ มไข เบออาหาร ขาออนแรง หวเอยง

และกระตกเลกนอย เยอตาขาวอกเสบ ขบฟน กระตาย

มกจะตายภายใน 3-4 วนหลงแสดงอาการปวย

การสงสตวตรวจชนสตร ถาเปนสตวขนาดเลก (แมว กระรอก กระตาย)

ใหสงทงตว ถาสตวขนาดใหญใหตดเฉพาะหวเพอนำสง

โดยผตดตองระมดระวงการกระเดนของเลอดและ

นำลายจากซาก นำถงพลาสตกครอบปากสตวกอน

ตด ในขณะทำตองสวมถงมอ นำซากใสถงพลาสตก

ผกใหแนนกนนำเขา แลวใสโฟมหรอภาชนะทเกบ

ความเยน โดยแชบนนำแขง นำสงหองชนสตรโดย

เรวทสด (ภายใน 24 ชวโมง) กรอกขอมลในแบบ

สงตวอยางใหละเอยด เชน ประวตการทำวคซน การ

กดคนหรอสตว รวมทงชอ ทอยและเบอรโทรศพท

ของผนำสงตดไวทตวอยางดวย ปจจบนหองปฏบต

การชนสตรโรคพษสนขบา ไดแก สถานเสาวภา

สภากาชาดไทย คณะแพทยศาสตร ศรราชพยาบาล

กรมวทยาศาสตรการแพทย นนทบร

การตรวจวนจฉยเชอพษสนขบา อาการแสดงของสตวจะเปนตวบงชถงการ

ตดเชอไดด ดงนนจงมกจะทำการกกขงสตวทสงสย

การตดเชอพษสนขบาเพอเฝาระวงอาการ (อยางนอย

10 วน) (Grill, 2009) อยางไรกตามวธการตรวจ

วนจฉยทใหผลไดแมนยำและรวดเรวมความจำเปน

อยางยง โดยเฉพาะเมอตองนำผลทไดมาใชประกอบ

การพจารณาในการใหการรกษาผปวย ในปจจบนวธ

การตรวจเชอพษสนขบามดวยกนหลายวธดงตอไปน

Direct fluorescent antibody assay (dFA)

เปนวธการทนยมใชมากทสดในการตรวจวนจฉยเชอ

พษสนขบา (WHO, 2007) ตวอยางทใชในการตรวจ

มกจะเปน brain smear หรอ brain imprint ของสตว

ทสงสยการตดเชอ แลวนำมายอมกบ fluorescein

isothiocyanate (FITC)-conjugated-anti-rabies N

antibodies เพอดการเรองแสงของตวอยางในกรณท

ตวอยางเปนบวก วธการนใหผลรวดเรว ราคาไมแพง

และทสำคญมความไวสง

Direct rapid immunohistochemistry test

(dRIT) เปนวธทพฒนาโดย Center of Disease Control

and Prevention (CDC) (Lembo et al., 2006) ซง

ใชตรวจตวอยางสมองของสตวทตดเชอ ตวอยางจะ

ถก fix ดวย 10% formalin (แทน acetone หรอ

methanol) จากนนจะยอมตวอยางดวย anti-rabies

N monoclonal antibody สามารถอานผลไดดวย

light microscope ความไวและความจำเพาะของ

การตรวจดวยวธนสงเชนเดยวกนกบวธ dFA ทกประการ

Virus Isolation เปนการเพาะแยกและเพม

จำนวนเชอไวรสโดยใชการนำ supernatant จากสมอง

บดของสตวทสงสยฉดเขาสมองหน จากนนสมองของ

หนทดลองจำนวน 2 ตวจะถกนำไปตรวจหาเชอพษ

สนขบาดวยวธ dFA ทกๆ 2 วนจนกระทงถง 20 วน

หลงการใหเชอ วธนเปนวธททาง WHO แนะนำใหเปน

วธ confirm การตดเชอพษสนขบาในกรณท dFA ให

ผลลบ (Webster et al., 1976) ปจจบนการเพาะ

แยกเชอสามารถทำได โดยใช เซลล เพาะเลยง

(neuroblastoma cells) ซงเปนวธทมความไวสงเชน

เดยวกนกบการฉดหนทดลอง แตระยะเวลาในการ

ใหผลบวกนอยกวาการฉดหน (Zanoni et al., 1990)

Reverse Transcriptase Polymerase Chain

Reaction (RT-PCR) เปนวธการทถกพฒนาขนมาไม

นานเหมาะ สำหรบการตรวจกรณทจำนวนตวอยาง

มจำกด เชน นำลาย นำไขสนหลง (WHO, 2007) วธน

รหสพนธกรรม ของเชอจะถกเพมจำนวนขนโดยการ

ใช primers ทจำเพาะตอ N ยนซงมความจำเพาะ

ตอเชอพษสนขบาสงทสด (highly conserved) วธ

การ RT-PCR มความรวดเรวเหมอน dFA และความ

ไวเชนเดยวกนกบการเพาะแยกเชอโดยการฉด

สมองหน RT-PCR เปนวธทใชกนอยางกวางขวางใน

การสำรวจทางระบาดวทยาของเชอโดยเฉพาะใน

กรณทเกดโรคระบาดขน สามารถนำทอนพนธกรรม

ทเพมจำนวนไดไปถอดรหสเพอทำการจดกลมเชอท

อยในทองทได ทำใหสามารถจดจำแนกสายพนธ

ของเชอในสตว

Histopathology and Immunohistochemistry

มกทำโดยการตรวจสมองสตวทสงสยการตดเชอ โดย

หารอยโรคทบงชถงการตดเชอ ซงไดแก lymphocytic

inflammation, perivascular cuffing, gliosis, และ

neurodegeneration ซงมกจะไมรนแรงนก และไมใช

รอยโรคทจำเพาะตอเชอพษสนขบา สวนการพบ Negri

bodies ซงเปน intracytoplasmic inclusions ทม

ลกษณะเปน ovid eosinophilic ถอเปน hall mark

ของรอยโรคพษสนขบา (Butts et al., 1984) อยางไร

กตามอาจไมพบ Negri bodies ในสมองสตวปวย

54



การตรวจภมคมกนตอการตดเชอพษสนขบา เนองจากสตวตองใชระยะเวลาในการสราง

ภมคมกนตอเชอพษสนขบา ดงนนการตรวจระดบ

แอนตบอดทจำเพาะตอเชอไวรสมกไมเปนทนยมใน

การตรวจวนจฉยการตดเชอในสตว การตรวจมกจะ

ทำเพอดการตอบสนองตอการทำวคซนปองกนโรค

พษสนขบามากกวา ปจจบนมดวยกนหลายวธ เชน

วธ Enzyme Link Immunosorbant Assay (ELISA)

ทตรวจวดระดบแอนตบอดทจำเพาะตอเชอพษสนขบา

(Mebatsion et al., 1989) หรอ Rapid fluorescent

focus inhibition test (RFFIT) ซงถอเปน gold

standard ในการตรวจวดระดบแอนตบอดทปองกน

การตดเชอ (neutralizing antibody) (Budzko et

al.,1983; Moore and Hanlon) ซงจากการทดลอง

ใหเชอพษในสตวเพอศกษาระดบภมคมกนทสามารถ

ปองกนการตดเชอในสตวพบวา คา cut off ทบงช

การ seroconvert ตอการทำวคซนทวดดวยวธ RFFIT

ควรเปน 0.1 IU/ml และ 0.2 IU/ml ในแมวและสนข

ตามลำดบ (Aubert, 1992) แตในกรณทจะนำเขา

สนขหรอแมวเขาประเทศทปลอดโรคพษสนขบาให

ใชคา 0.5 IU/ml เพอบงชถงการตอบสนองทไดผลตอ

วคซนปองกนโรคพษสนขบา (Briggs and Schweitzer,

2001)

การควบคมและปองกนโรคพษสนขบาในสตวเลยง การปองกนไมใหสตวเลยงถกกดโดยสนข

หรอแมวจรจด (หรอสตวปากรณอยตางประเทศ)

รวมกบการใหวคซนปองกนโรคพษสนขบาเปนวธ

การเดยวทสามารถควบคมและปองกนการเกดโรค

พษสนขบาในสตวเลยงอยางไดผล ดงแสดงในการ

ศกษาเปรยบเทยบอบตการณโรคพษสนขบาในกลม

จงหวดทไดทำวคซนปองกนโรคในสนขและแมวถง

80% ของเปาหมายทกรมปศสตวไดวางไว เปรยบ

เทยบกบจงหวดททำวคซนไดตำกวาเปาหมาย พบวา

กลมจงหวดททำวคซนไดถง 80% ของเปาหมาย

(80% ของจำนวนสตวทมในทองท) มอบตการณของ

โรคพษสนขบาตำกวากลมจงหวดทไมถงเปาอยางม

นยสำคญ (กลภาและวรพงศ, 2550) วคซนปองกน

โรคทมใชกนอยในปจจบนเปนชนดเชอตาย สำหรบ

สตวเลยงเชน สนขและแมวควรใหวคซนครงแรกท

อาย 3 เดอน และควรทำวคซนซำเมอครบอาย 1 ป

จากนนควรใหวคซนซำอยางตอเนองขนอยกบกฏ

หมายและชนดวคซนทมใชในแตละประเทศ สำหรบ

ประเทศไทยใหทำวคซนปองกนโรคพษสนขบาซำทก

ป (สนนภา, 2552) เนองจากโรคนเปนโรคทรายแรง

และสามารถตดสคนได ดงนนการรกษาสตวเลยงท

ถกกดโดยสตวทปวยดวยโรคพษสนขบาหรอสงสยวา

ตดเชอเปนสงทไมแนะนำเนองจากใหผลทไมแนนอน

อยางไรกตามมขอแนะนำวา หากสตวเลยงเคยทำ

วคซนปองกนโรคพษสนขบามากอน ใหทำวคซน

ปองกนโรคพษสนขบาซำแลวกกขงสตวเพอดอาการ

เปนเวลา 90 วน ในกรณทสตวเลยงไมเคยไดรบวค

ซนมากอนควรทำการณฆาตและนำสงตวอยาง

สมองเพอตรวจวนจฉยโรค หากเจาของไมยนยอมใน

การทำการณฆาตควรกกขงสตวเพอเฝาระวงอาการ

เปนระยะเวลา 6 เดอนและทำวคซนปองกนโรคพษ

สนขบา 1 เดอนกอนปลอยออกจากทกกขง (Lackay

et al., 2008)

Kumar, P.D. 2009. Rabies. Greenwood Press, Westport, Conn., xv, 172 p. Lackay, S.N., Kuang, Y., Fu, Z.F. 2008. Rabies in small animals. Vet. Clin. North Am. Small Anim. Pract. 38: 851-861, ix. Lembo, T., Niezgoda, M., Velasco-Villa, A., Cleaveland, S., Ernest, E., Rupprecht, C.E. 2006. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerg. Infect. Dis. 12: 310-313. Mebatsion, T., Frost, J.W., Krauss, H. 1989. Enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA) using staphylococcal protein A for the measurement of rabies antibody in various species. Zentralbl. Veterinarmed B. 36: 532-536. Moore, S.M., Hanlon, C.A. 2010. Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease. PLoS Negl. Trop. Dis. 4: e595. Webster, W.A., Casey, G.A., Charlton, K.M. 1976. The mouse inoculation test in rabies diagnosis: early diagnosis in mice during the incubation period. Can. J. Comp. Med. 40: 322-325. WHO. 2009. Europe, in Rabies Information System of the WHO Collaboration Centre for Rabies Surveillance and Research, [Online]. Available:http://www.who-rabies-bulletin.org/ Wunner, W.H., Briggs, D.J. 2010. Rabies in the 21 century. PLoS Negl. Trop. Dis. 4, e591. Zanoni, R., Hornlimann, B., Wandeler, A.I., Kappeler, A., Kipfer, R., Peterhans, E. 1990. [Rabies Tissue Culture Infection Test as an Alternative for the Mouse Inoculation Test]. ALTEX. 7: 15-23.

เอกสารอางอง กตภทท สจต ศรายทธ แกวกาหลง วระ เทพสเมธานนท เขมพรรษ บญโญ และ การณ ชนะชย 2552 “สถานการณโรคพษสนขบาในสตว และการ ประสานขอมลระหวางองคกร กรงเทพมหานคร พ.ศ. 2552” [Online]. Available: http://www.dld.go.th/dcontrol/th/images/ stories/research/rabi-desease.pdf กลภา พลรตน และ วรพงศ ธนพงษธรรม 2550 “การศกษา ขอมลของการฉดวคซนปองกนโรคพษสนขบาใน สนข-แมว และการฝกอบรมอาสาสมครชมชน ตอ โรคพษสนขบา” [Online]. Available: http://www.dld.go.th/dcontrol/th/index.php/ more-about-joomla/74-2010-03-02-07-21-27.html สนนภา สรทตต 2552 ขอแนะนำในการจดการโปรแกรมการ ใชวคซนสำหรบสนขและแมว โดย WSAVA 2007 วารสารผประกอบการบำบดโรคสตวแหงประเทศ ไทย ปท 20 ฉบบท 4 หนา 115-118 Aubert, M.F. 1992. Practical significance of rabies antibodies in cats and dogs. Rev. Sci. Tech. 11:735-760. Blanton, J.D., Hanlon, C.A., Rupprecht, C.E. 2007. Rabies surveillance in the United States during 2006. J. Am. Vet. Med. Assoc. 231:540-556. Briggs, D.J., Schweitzer, K. 2001. Importation of dogs and cats to rabies-free areas of the world. Vet. Clin. North Am. Small Anim. Pract. 31:573-583,viii. Budzko, D.B., Charamella, L.J., Jelinek, D., Anderson, G.R. 1983. Rapid test for detection of rabies antibodies in human serum. J. Clin. Microbiol. 17:481-484. Butts, J.D., Bouldin, T.W., Walker, D.H. 1984. Morphological characteristics of a unique intracytoplasmic neuronal inclusion body. Acta Neuropathol. 62: 345-347. Gordon, E.R., Curns, A.T., Krebs, J.W., Rupprecht, C.E., Real, L.A., Childs, J.E. 2004. Temporal dynamics of rabies in a wildlife host and the risk of cross-species transmission. Epidemiol. Infect.132:515-524. Grill, A.K. 2009. Approach to management of suspected rabies exposures: what primary care physicians need to know. Can. Fam. Physician.55:247-251.

56


Vol. 21 No. 3 July - September 2009

Review of rabies in pet animals

Pravina Kitikoon #

Rabies is an infectious neuropathic fatal disease of mammalian species including humans. In

addition, it is considered a serious zoonotic disease with a common pet-to-human route of transmis-

sion in Thailand. Prevention and control of rabies in pet animals can be highly achieved through

continue rabies vaccination and control of pets from being bitten by stray dogs and cats. Veterinar-

ians can contribute to the control of the disease in the community by providing basic knowledge to

the owners regarding the causative agent, route of transmission and susceptible species. Such

knowledge will help owners monitor for the disease and encouragement of rabies vaccination from

veterinarians will help sustain protection from the disease in both pet animals and owners them-

selves.

Keywords: Rabies, pet animals, zoonotic disease, transmission

# Corresponding author: Telephone 02-218-9655 Email address: [email protected]

Abstract

5.กรณสนขในบานถกแมวทเปนพษสนขบากด

ก. หากเคยทำวคซนมากอนใหทำซำ แลวกกขงด

อาการเปนเวลา 90 วน

ข. หากเคยทำวคซนมากอนไมตองทำวคซนซำแต

ตองกกขงดอาการเปนเวลา 90 วน

ค. ควรตองทำการณฆาตกรณเดยว

ง. ควรตองกกขงเพอดอาการเปนเวลา 6 เดอนจาก

นนจงทำวคซนซำกอนปลอย 1 เดอน

คำถามทายเรอง

1.โรคพษสนขบาเกดจากเชอ

ก. RNA virus, Lyssavirus family Orthomyxoviridae

ข. DNA virus Lyssavirus, family Orthomyxoviridae

ค. DNA virus Lyssavirus family Rhabdoviridae

ง. RNA virus Lyssavirus family Rhabdoviridae

2.โรคพษสนขบาสามารถตดไดในสตวชนดใด

บาง

ก. สตวทดลอง เชน หน กระตาย เฟอรเรต

ข. สตวเลยงขนาดเลก เชน สนข แมว

ค. คน

ง. ถกทกขอ

3.เชอพษสนขบากอรอยโรคอะไรทเปนรอย

โรคเฉพาะ

ก. Cytoplasmic inclusion body (Negri bodies)

ข. Perivascular cuffing

ค. Neurodenegeration

ง. Apoptosis of neurons

4.การปองกนโรคในสตวเลยง

ก. วคซนปองกนโรคพษสนขบามชนดเชอตายแต

ประสทธภาพไมดเทาวคซนเชอเปน

ข. วคซนปองกนโรคพษสนขบาชนดเชอตายใหผลด

โดยสตวควรรบวคซนครงแรกเมออาย 3 เดอนและ

ตองฉดซำเมอครบ 1 ป จากนนจงฉดทกๆ ป

ค. การกกกนไมใหสตวเลยงออกนอกบานเพอ

ปองกนการตดเชอจากสนขตวอนๆ กเพยงพอทจะ

ปองกนการเกดโรคไดแลว

ง. ไมควรทำวคซนเพราะจะทำใหสบสนในการตรวจ

วนจฉยโรค

62



การแยกเพศในนกสวยงาม

ชนาธป ธรรมการ 1 ) #

ปจจบนนกสวยงามเปนสตวเลยงทไดรบความนยมอยางกวางขวาง ในประเทศไทยนกทนยมเลยงแบงได

เปน 4 กลม ไดแก นกแกวหรอนกปากขอ (Psittaciformes) นกปากตรงขนาดเลกหรอนกเกาะคอน (Passeriformes)

เปดสวยงาม (Ornamental waterfowl) และสตวปกชนดอนๆนอกเหนอจาก 3 ชนดแรก การแยกเพศในนก

สวยงามถอเปนปจจยทสำคญอยางหนงในการเพาะขยายพนธ ซงวธการแยกเพศนนสามารถทำไดโดยวธการ

ดจากลกษณะภายนอก การคลำตรวจลกษณะทางกายวภาคของชองเชงกรานและทวารรวม การสงเกตพฤตกรรม

การสองตรวจอวยวะเพศโดยใชกลองผานทางชองทองการตรวจหาระดบสเตยรอยดฮอรโมนในพลาสมาหรอ

สงขบถาย การตรวจวเคราะหโครโมโซมและ การตรวจแยกเพศดวยการใชปฏกรยาลกโซ ปจจบนวธการตรวจ

แยกเพศนกทไดรบความนยมคอการใชกลองสองตรวจอวยวะเพศผานทางชองทอง ซงถอวาเปนวธทมความ

แมนยำสงทสด นอกจากนการพซอารทอาศยเทคนคการใชยน chd เปนเครองตรวจสอบกเปนทางเลอกทได

รบความนยมเชนกน

คำสำคญ: นกสวยงาม วธปฏกรยาลกโซ การแยกเพศ

1) สาขาวชาเทคโนโลยการผลตสตวและประมง คณะเทคโนโลยการเกษตร สถาบนเทคโนโลยพระจอมเกลาเจาคณทหารลาดกระบง กรงเทพฯ 10520# ผรบผดชอบบทความ

ปจจบนนกสวยงามถอเปนสตวเลยงทไดรบ

ความนยมมากชนดหนง มการเลยงอยางแพรหลาย

โดยไดรบความนยมทงทเลยงเพยงไมกตวเพอเปน

สตวเลยงภายในบาน หรอเลยงเปนจำนวนมากเพอ

วตถประสงคในเชงการคาในรปแบบของฟารมหรอ

สวนสตว มการพฒนาสายพนธ รปแบบการเลยง

และการจดการ ตลอดจนการตลาดซงมมลคาซอขาย

สงจนอาจถอไดวานกสวยงามเปนสตวเศรษฐกจทาง

เลอกชนดหนง ซงในอนาคตอาจมการพฒนาจนเปน

สตวเศรษฐกจทสำคญในอนาคต

สำหรบวธการเพาะขยายพนธนกสวยงามนน

ปจจบนพบวานกหลายชนดสามารถเพาะขยายพนธ

ไดภายในฟารมเพาะเลยง นกแตชนดจะมวธและ

เทคนคในการเพาะขยายพนธทแตกตางกนไป วธท

นยมใชในการเพาะขยายพนธคอการจบคผสมพนธ

โดยปกตแลวนกทอยตามธรรมชาตสามารถจบคผสม

พนธกนเองไดโดยอสระ แตเมอมการนำนกเหลานน

มาเลยงในพนทจำกดกจะสงผลใหนกเหลานไมม

โอกาสทจะเลอกจบคไดดวยตวเอง การจบคหรอเลอก

คผสมใหแกนกนนสวนใหญจะกระทำโดยเจาของนก

โดยทวไปแลวลกษณะทแสดงออกภายนอก

(phenotype) ของนกนนอาจบงบอกถงลกษณะเพศ

หรอไมกไดนดจะมลกษณะภายนอกทแตกตางกน

ระหวางเพศผและเพศเมย (sexual dimorphism) แตกม

นกจำนวนไมนอยทลกษณะภายนอกไมมความแตก

ตางกนระหวางเพศผและเพศเมย (sexual monomor-

phism) ซงการทไมสามารถแยกความแตกตางระหวาง

เพศผและเพศเมยนเองทำใหพบวาบอยครงทการจบ

คโดยเจาของนกเกดความผดพลาด นกในกรงเดยวกน

ทเจาของเปนคนเลอกคใหอาจเปนเพศเดยวกน ทำให

การเพาะและขยายพนธไมประสบความสำเรจ และ

บางครงอาจทำใหนกทนำมาเขาคกนนนบาดเจบจาก

การทำรายกนเอง อนเปนผลมาจากเปนเพศเดยวกน

และอยในวยเจรญพนธ นกหลายชนดโดยเฉพาะอยางยง

บทนำ นกปากขอขนาดใหญซงมมลคาสง ตองใชระยะเวลา

นานกวาจะถงวยเจรญพนธ โดยบางพนธอาจตอง

อาศยเวลาเกอบสบป หากมการจบคโดยเจาของ

ไมถกตองแลวกอาจทำใหเสยเวลาในการเพาะเลยง

โดยไมไดผลผลต ดงนนการตรวจแยกเพศนกเพอ

ทำการจบคและผสมพนธจงมความสำคญสำหรบ

เจาของนกเปนอยางมาก

นกสวยงามทนยมเลยงในประเทศไทยแบง

เปนกลมใหญๆ ได 4 ประเภท ดงน

1.นกแกวหรอนกปากขอ (psittaciformes)

เอกลกษณของนกชนดนคอมจงอยปากทคอนขาง

แขงแรง ปากดานบนใหญกวาดานลางและงมลงคลาย

ตะขอ นกในกลมนทไดรบความนยมมตงแตขนาดเลก

เชน นกหงสหยก (budgerigar; Melopsittacus

undulatus) นกเลฟเบรด (lovebird; Agapornis spp.)

นกคอกคาเทล (cockatiel; Nymphicus hollandicus)

นกแกวคอแหวน (ringnecked parakeet; Psittacula

krameri) หรอนกในกลมคอนวรตางๆ (conures) เปนตน

นกขนาดกลาง เชน อาฟรกนเกรย (African grey parrot;

Psittacus erithacus) นกแกวอเมซอน (Amazon parrot;

Amazona spp.) อเลคตส (Eclectus parrot; Eclectus

roratus) เปนตน หรอนกทมขนาดใหญซงเปนกลม

นกมาคอว (macaw) เชน บลโกลดมาคอว (blue

and gold macaw; Ara ararauna) กรนวงมอคอว

(green - winged macaw; Ara chloropterus) สการเลต

มาคอว (scarlet macaw; Ara macao) เปนตน

ปจจบนนกปากขอไดรบความนยมมากขน

เรอยๆ เนองจากเปนนกทมสสนสวยงามและมความ

ฉลาด หากนำมาเลยงตงแตอายยงนอย (ลกปอน)

มกจะแสดงพฤตกรรมคนเคยกบคนซงถอเปนเสนห

ดงดดใจผเลยงจนทำใหไดรบความนยมมากทสดเมอ

เทยบกบนกสวยงามกลมอนๆ

ประเภทของนกทนยมเลยงในประเทศไทย

64



รวมเพอตรวจดอวยวะเพศ แตสำหรบนกขนาดเลก

แลวอาจปฏบตไดยากและไมเปนทนยม ในสตวปกเพศผ

ในกลมเดยวกบไก (galliformes) หงส (anseriformes)

และ นกกระจอกเทศ (ratite) นนอาจสามารถมอง

เหนอวยวะเพศไดชดเจนโดยการตรวจทบรเวรทวารรวม

ในขณะทสตวปกเพศผในกลมของนกพราบ (colum-

biformes) และนกปากตรงขนาดเลกนนอาจพบเพยง

ตมขนาดเลกทบรเวณทวารรวม ซงหากทวารรวมไม

เปดกวางกอาจยากในการแยกเพศดวยวธน

วธการแยกเพศโดยการคลำตรวจลกษณะ

ทางกายวภาคนกระทำไดเฉพาะนกทมขนาดเลกซง

สามารถประคองไวในองมอไดเทานน อาจปฏบตได

ยากในนกทมขนาดใหญเพราะปญหาเรองการจบบงคบ

2.นกปากตรงขนาดเลกหรอนกเกาะคอน

(passeriformes) นกในกลมนไดรบความนยมใน

การเลยงมากเชนกน มลกษณะแตกตางจากกลมแรก

ชดเจนคอปากมขนาดเลกและตรง นกในกลมนทได

รบความนยม ไดแก นกฟนซเจดส หรอนกสายรง

(gouldian finch; rainbow finch; Erythrura gouldiae)

นกครบน (canary; Serinus canaria) เปนตน

3.เปดสวยงาม (ornamental waterfowl) สำหรบ

ประเทศไทยแลวแมวาสตวปกสวยงามในกลมนจะม

ไมมากเทาสองกลมแรก แตกนบไดวารบความนยม

พอสมควร โดยเปดสวยงามทนยมเลยง ไดแก เปด

แมนดารน (Mandarin duck; Aix galericulata) วดดก

(wood duck; Aix sponsa) และ หงสดำ (black

swan; Cygnus atratus) เปนตน

4.สตวปกชนดอนๆ นอกจากสตวปกชนดตางๆ

ทไดกลาวมาแลว ยงมสตวปกสวยงามอกหลายชนด

ทไดนำมาเลยงเพอความสวยงาม เชน นกกระจอกเทศ

(ostrich; Struthio camelus) ไกฟา (pheasant;

Phasianidae family) และนกชนดอนๆ นอกเหนอ

จากทกลาวมาแลวขางตน

วธการแยกเพศในนกสวยงาม สำหรบวธการแยกเพศในนกสวยงามนนใน

ปจจบนสามารถทำไดหลายวธดงน

1.การแยกเพศโดยดจากลกษณะภายนอก

(external appearance)

วธนใชไดกบนกบางประเภททมลกษณะ

ภายนอกแตกตางกนอยางชดเจนระหวางนกเพศผ

และเพศเมย เชน นกแกวอเลคตส ซงเพศผมขนตวสเขยว

ในขณะทเพศเมยมขนตวสแดง หรอ นกแกวเรดรม

(red - rumped parrot; Psephotus haematonotus)

ซงเพศผจะมขนสแดงบรเวณสะโพก ในขณะทเพศเมย

จะไมมสแดงทบรเวณดงกลาว เปนตน แตกมนก

จำนวนไมนอยทไมสามารถแยกเพศไดจากลกษณะ

ภายนอก นกบางชนดสามารถแยกความแตกตางได

จากลกษณะภายนอก แตตองอยในชวงอายทเหมาะ

สมจงจะสามารถแยกเพศไดเพราะจะแสดงลกษณะ

ทแตกตางกนออกมาใหเหน เชน นกแกวคอแหวนซง

ตวผจะมแถบรอบคอหรอทเรยกวาแหวน ซงจะพบ

ไดเมอนกเขาสวยเจรญพนธ นกหงสหยกซงเพศผเมอ

เขาสวยเจรญพนธบรเวณจมกจะมสฟา ในขณะท

เพศเมยจะมสนำตาลออน เปนตน จากการศกษาของ

Greij (1973) ซงทำการทดลองในนกเปดนำ blue –

winged teal (Anas discors) พบวาการเปลยนแปลง

ของสขนในนกนนอาจมอทธพลมาจากระดบของ

ฮอรโมนเอสโตรเจนและเทสโทสเตอรโรน

2.การคลำตรวจลกษณะทางกายวภาค

ของชองเชงกรานและทวารรวม (examination of

the pelvic girdle and cloaca)

เปนวธการททำไดโดยการจบคลำบรเวณอง

เชงกรานดานลางของนก ปกตแลวนกเปนสตวทม

องเชงกรานดานลางไมเชอมตดกน (Bone, 1988)

ซงตางกบสตวเลยงลกดวยนมทกระดกเชงกรานดานลาง

เชอมกนสนท ทงนเปนเพราะกระบวนการววฒนาการ

เพอการปรบตวทางกายวภาคของรางกายใหเหมาะสม

กบการวางไข นกเพศเมยจะมลกษณะขององเชงกราน

ทขยายกวางมากกวาเพศผ หากผปฏบตมความชำนาญ

มากพอกอาจจะแยกแยะความแตกตางระหวางนก

เพศผและเพศเมยไดจากการคลำตรวจบรเวณน

แตวธนมโอกาสผดพลาดสงพอสมควรขนอยกบ

ประสบการณของผปฏบต นอกจากนอายของนกก

มผลเปนอยางมากตอการตรวจแยกเพศดวยวธน

เนองจากนกทอายนอยองเชงกรานจะไมขยาย ทำให

การแยกแยะความแตกตางระหวางเพศผและเพศ

เมยกระทำไดยาก

ในสตวปกบางชนดสามารถแยกเพศไดจาก

การตรวจดอวยวะเพศ ซงเปนวธทสามารถกระทำได

ในนกทมขนาดเลกโดยการตรวจดอวยวะเพศบรเวณ

ทวารรวม (cloaca) โดยตรวจดการปรากฏของอวยวะ

เพศผ (phallus) วธนเปนวธทปฏบตโดยทวไปในการ

ดเพศลกไกหรอเปดซงกระทำโดยการบบชองทวาร

รวมเพอตรวจดอวยวะเพศ แตสำหรบนกขนาดเลก

รปท 1 ภาพบนแสดงความแตกตางระหวางนกแกวคอแหวนเพศผและเพศเมยซงเพศผจะพบ วงแหวนรอบคอ (ลกศร) ภาพลาง แสดงถงนกบลแอนโกลดมาคอวเพศผและเพศเมยซงมลกษณะภายนอกท คลายกนมากจนแยกความแตกตางไดยาก

นอกจากนจากการทดลองของ Boersma and Davies

(1987) พบวานกทไมไดอยในวยเจรญพนธนนการ

แยกเพศดวยวธนไมสามารถใชไดผล เนองจากนกท

ไมไดอยในวยเจรญพนธนนเพศเมยจะมขนาดของ

ชองทวารรวมใกลเคยงกบเพศผ

3.การสงเกตพฤตกรรม (behavioral obser-

vation)

วธนใชไดเมอนกอยในชวงวยเจรญพนธ โดย

นกอาจจะแสดงพฤตกรรมบางอยางทบงบอกลกษณะ

เพศ เชน นกคอกคาเทลเพศผมกจะมพฤตกรรมสง

เสยงรองบอยครงซงบางคนอาจเรยกวา “รองเพลง”

หรอในนกหลายๆ ชนดนกตวผอาจจะแสดงพฤตกรรม

การเกยวพาราส หรอขนผสมพนธ แตกอาจพบนกทม

พฤตกรรมเกยวพาราสหรอขนผสมพนธนกเพศเดยวกน

4.การสองตรวจอวยวะเพศโดยใชกลอง

ผานทางชองทอง (laparoscopy)

เปนวธทถอวามความแมนยำมากทสด

กระทำโดยใชกลองขนาดเลก (rigid endoscope)

สองผานเขาไปในชองทองเพอดอวยะเพศ วธนยงม

ขอดคอสามารถบอกไดวานกอยในระยะเจรญพนธ

หรอไม แตกมขอเสยคอกระทำไดเฉพาะในนกขนาด

ใหญเทานน เนองจากกลองมขนาดใหญพอสมควรและ

นกทจะตรวจดวยวธนตองอยภายใตภาวะสลบ

รปท 2 แสดงวธการแยกเพศนกดวยวธการคลำชองเชงกราน

66



5.การตรวจวดระดบสเตยรอยดฮอรโมน

ในพลาสมาหรอสงขบถาย (measurement of steroid

level in plasma or excrement)

การตรวจหาระดบของฮอรโมนเอสโตรเจน

และแอนโดรเจนในพลาสมาหรอสงขบถายนน

สามารถนำมาใชไดในนก แตปรมาณของสเตยรอยด

ฮอรโมนทถกผลตนนจะแปรผนไปตามอาย ฤดกาล

และกจกรรมทางเพศ ซงจากการศกษาระดบสเตยรอยด

ฮอรโมนจากอจจาระของหาน Greyleg geese (Anser

anser) โดย Hirschenhauser et al. (1999) พบวา

ระดบของสเตยรอยดฮอรโมนในอจจาระจะขนอยกบ

กจกรรมตางๆ ทางเพศ เชน ชวงการจบคหรอไมจบ

คผสมพนธ การฟกไขและเลยงลก เปนตน

จากความผนแปรของระดบฮอรโมนดงกลาว

ทำใหเกดความยงยากในการแปลผลอตราสวนของ

ระดบฮอรโมนเอสโตรเจนตอแอนโดรเจน นอกจากน

ยงเปนวธทใชเวลานานและมคาใชจายคอนขางสง

ทำใหปจจบนวธนไมไดรบความนยมในการใชแยก

เพศนก

6.การตรวจวเคราะหโครโมโซม (karyotype)

เปนการตรวจดลกษณะของโครโมโซมเพศ

ซงมความแตกตางกนระหวางนกเพศผและเพศเมย

โดยนกเพศผจะมลกษณะโครโมโซมเพศเปน ZZ ซงม

ลกษณะเหมอนกนของคโครโมโซม (homogametic sex)

ในขณะทนกเพศเมยจะมลกษณะโครโมโซมเพศเปน

ZW ซงมลกษณะทแตกตางกนของคโครโมโซม (hetero-

gametic sex) โดยจะพบวาโครโมโซม Z จะมขนาด

ใหญในขณะทโครโมโซม W จะมขนาดเลกกวา (Archa-

waranon,2004) เนองจากในกระบวนการววฒนาการ

นนโครโมโซม W จะมการสญเสยยนบางสวนไปสง

ผลใหโครโมโซม W มขนาดสนลง การแยกเพศนก

ดวยวธนคอนขางยงยากและใชเวลานานในการเตรยมตว

อยางโครโมโซม ปจจบนมกใชเฉพาะในงานวจยเทานน

7.การตรวจแยกเพศดวยการใชปฏกรยา

ลกโซ (Polymerase Chain Reaction: PCR method)

ไดมการนำเทคโนโลย PCR มาประยกตใช

ในการตรวจแยกเพศนกอยางกวางขวาง การตรวจเพศ

ดวยเทคนคทางอนชวโมเลกลมหลายวธ เชน Random

Amplification of Polymorphic DNA (RAPD),

Amplification Fragment Length Polymorphism

(AFLP) และ CHD (chromo-helicase-DNA-binding)

-based sex identification (Dubiec and Zagalska

-Neubauer, 2006) วธทไดรบความนยมมากทสดใน

ปจจบน คอ CHD - based sex identification

เพราะเปนวธทงาย มความแมนยำสง นกเจบตวนอย

และมคาใชจายในการตรวจไมสงมากนก การตรวจดวย

วธนตองการเลอดเพยงปรมาณเลกนอยเพอนำไปสกด

รปท 3 แสดง karyotype ของนกขนทอง (Hill mynah; Gracula religiosa) เพศผซงมโครโมโซมเพศเปน ZZ (รปบน) และ เพศเมยซงมโครโมโซมเพศเปน ZW (รปลาง) (Archawaranon, 2004)

ดเอนเอ โดยอาจใชเลอดทเกบในสารละลาย EDTA หรอ

อาจใชหยดเลอดเพยงเลกนอยทซบดวยกระดาษกรองก

สามารถใหปรมาณดเอนเอทมากพอเนองจากเมดเลอด

แดงของสตวปกจะมนวเคลยสซงเปนทอยของดเอนเอ

เทคนคนถกนำมาใชหลงจากท Griffiths and

Tiwari (1995) ไดพบยนทเกยวกบการสรางโปรตน

CHD บน W Chromosome ของนก ซงตอมาพบวา

มยนลกษณะเดยวกนนบน Z Chromosome เชนกน

(Griffiths and Korn, 1997) โดยพบวายนดงกลาวม

คณสมบตทดในการใชตรวจแยกเพศนก เนองจาก

เปนยนทมววฒนาการชา และแมจะเปนสตวปกตาง

ชนดกนกสามารถพบยนนไดยกเวนสตวปกในกลม

ratites ซงไดแก นกกระจอกเทศ และนกอม (emu;

Dromaius novaehollandiae) เปนตน

รปท 4 แสดงเสนเลอด wing vein (ลกศร) ซงเปนตำแหนงทงายทสดในการเกบเลอดนก (บน) และ เลอดนกทถกซบดวยกระดาษกรองและเกบไวในหลอดเกบเลอดเพอรอการตรวจ (ลาง)

ยน chd มสวนประกอบทเปนสวนทไมถก

ถอดรหส (intron) อยางนอย 2 สวน ซงเปนสวนทม

ววฒนาการไดรวดเรวและเปนสวนทมขนาดของเบส

ทตางกนระหวางโครโมโซม Z และ W ซงอยระหวาง

สวนทถกถอดรหส (exon) หลกการแยกเพศโดยอาศย

ยน chd นนอาศยหลกพนฐานของความยาวทแตก

ตางกนของความยาวของอนทรอนระหวางโครโมโซม

เพศทงสองชนดการออกแบบไพรเมอรทเหมาะสม

เพอสรางสายดเอนเอในตำแหนงทครอบคลมสวนอน

ทรอนของยน chd จะสงผลใหสามารถแยกความ

แตกตางของชนสวนของยน chd W และ chd Z ได

เมอนำไปผานกระบวนการ gel electrophoresis โดย

เพศผจะพบแบนของผลผลตพซอาร 1 แบน และเพศ

เมยพบ 2 แบน (รปท 5, 6) แตกอาจพบไดวาการใช

ไพรเมอรบางชดกบนกบางชนดอาจใหผล 1 แบน

เหมอนกนทงเพศผและเพศเมย แตจะมขนาดของ

ผลผลตพซอารทแตกตางกนในเพศผและเพศเมย

เหตทเปนเชนนเปนเพราะไพรเมอรมความชอบทจะ

ขยายชนสวนของยน chd W ซงมขนาดสนกวา สง

ผลใหในนกเพศเมยซงมทงยน chd W และ chd Z

นนไมมการขยายชนสวนของยน chd Z ขนมา แต

การใชไพรเมอรบางชดในนกเพศเมยกอาจพบวาไพร

เมอรอาจจะขยายชนสวนของยน chd Z แทนเนองจาก

มขนาดทสนกวา ซงในกรณนกอาจทำใหเขาใจผดคด

วาเปนเพศผทงทในความเปนจรงนกทตรวจเปนเพศเมย

ในนกบางสปชสการใชเจลชนด polyacrylamide

สามารถแยกความแตกตางของชนยนไดดกวาเจล

agarose ทงนเนองจากเจล polyacrylamide นนม

ความละเอยดของเนอเจลมากกวาเจล agarose ทำให

สามารถแยกความแตกตางของชนยนทมขนาดใกล

เคยงกนมากจากการใชไพรเมอรบางชดไดด (Dubiec

and Zagalska - Neubauer, 2006) แตในทาง

ปฏบตแลวการใชเจล polyacrylamide นนไมเปนท

นยมเนองจากมความยงยากในการเตรยม

แมวาการแยกเพศโดยอาศยยน chd จะม

ความสะดวก แตกมขอจำกดในนกบางชนด เชน นก

แรง (vulture; Gyps spp.) และนกชนดอนๆในแฟม

68



ล Accipitridae นนพบวาผลผลตพซอารของ chd W

และ chd Z นนมขนาดใกลเคยงกน สงผลใหไมสามารถ

แยกความแตกตางระวางเพศผและเพศเมยได จงได

มการพฒนาเทคนคในการตรวจโดยการใชเอนไซม

ตดจำเพาะ (restriction enzyme) มาใชรวมกบการ

ใชปฏกรยาลกโซ ทำใหสามารถแยกตางเพศผและ

เพศเมยไดเมอผานกระบวนการ gel electrophoresis

(Reddy et al., 2007)

สรป

รปท 5 แสดงหลกการการแสดงออกของผลผลต PCR ทแตกตางกนของนกเพศผและ เพศเมยทปรากฏบนเจล agarose อนเปนผลมาจากขนาดของนวคลโอไทดทตางกน ของนกเพศผและเพศเมย (Grant, 2001)

รปท 6 แสดงผลการตรวจแยกเพศดวยเทคนคพซอารดวยไพรเมอรทเมอแสดงผลบนเจล agarose ซงเรองแสงอลตราไวโอเลตแลวเพศผจะปรากฏเพยงแบนเดยว ในขณะทเพศเมยจะปรากฏสองแบน (M = marker DNA , m = เพศผ , f = เพศเมย) (ชนาธป และคณะ, 2550)

รปท 7 แสดงผลการตรวจแยกเพศดวยเทคนคพซอารดวยชดไพรเมอรบางชดทเมอ แสดงผลบนเจล agarose ทเรองแสงอลตราไวโอเลตแลวไดขนาดของชนสวนของ ยนทแตกตางกนนอยมากระหวางนกเพศผหรอเพศเมย (M = marker DNA, f = เพศเมย, m = เพศผ, GC = Green-cheeked conure; Pyrrhura molinae, SC = Sun conure; Aratinga solstitialis และ RN = Ringnecked) (Jirajaroenrat and Thammakarn, 2007)

แมวาปจจบนเจาของนกจะมความรในการ

เลยงและการจดการนกชนดตางๆ มากขนกวาในอดต

แตการแยกเพศในนกกยงถอเปนเรองสำคญททำให

ผเลยงประสบความสำเรจ โดยในระดบผเลยงการ

แยกเพศอาจทำไดโดยวธการดจากลกษณะภายนอก

การคลำตรวจลกษณะทางกายวภาคของชองเชง

กรานและทวารรวม และการสงเกตพฤตกรรม ซงเปน

วธทงายแตกมความผดพลาดสง สำหรบนกทมขนาด

ใหญโดยเฉพาะในกลมมาคอวนนนยมตรวจแยกเพศ

โดยการใชกลองสองตรวจอวยวะเพศผานทางชอง

ทองเน องจากเปนวธทมความแมนยำสงท สด

นอกจากนปจจบนมการประยกตใชเทคนคทางหอง

ปฏบตการตางๆ มาใชในการแยกเพศนก วธทไดรบ

ความนยมมากวธหนงคอการใชเทคโนโลยพซอาร

โดยเฉพาะเทคนคทอาศยยน chd เปนเครองตรวจสอบ

ซงนบเปนทางเลอกทไดรบความนยมเชนกน แตก

ยงพบวายงมความผดพลาดเกดขนไดบางอนอาจ

เปนผลมาจากการเลอกใชไพรเมอรทไมเหมาะสมกบ

ชนดของนก การเลอกใชปรมาณสารเคมและอณหภม

สำหรบปฏกรยาพซอาร รวมไปถงการแปลผลทได

ปจจบนยงคงมการคนควาวจยเพอหาเทคนคและวธ

การทเหมาะสมในการแยกเพศนก โดยมงเนนถง

ความแมนยำของผลทไดและความสะดวกรวดเรวใน

การตรวจ ซงจะชวยใหผเลยงมโอกาสประสบความ

สำเรจในการเลยงมากขน

เอกสารอางอง ชนาธป ธรรมการ อภชาต พนชกลาง กญญา จระเจรญรตน และ กนกรตน ศรกจเกษมวฒน. 2550. การจำแนกเพศนกแกวปากขอบางชนดดวยวธ ปฏกรยาลกโซพซอาร. สตวแพทยมหานครสาร 2 (2) : 30–34. Archawaranon, M. 2004. Rapid sexing Hill Mynah Gracula religiosa by sex chromosomes. Biotechnology. 3 (2): 160–164. Boersma, P.D. and Davies, E.M. 1987. Sexing Monomorphic Birds by Vent Measurements. The Auk. 104: 779-783. Bone, J.F. 1988. Animal Anatomy and Physiology. 3rd ed. New Jersey: Prentice-Hall Inc. 572. Dubiec, A. and Zagalska-Neubauer, M. 2006. Molecular techniques for sex identification in birds. Biological Lett. 43 (1): 3–12. Grant, A. 2001. DNA sexing of brown kiwi (Apteryx mantelli) from feather samples. DOC Science Internal Series 13. Wellington: Department of Conservation. 16. Greij, E.D. 1973. Effects of sex hormones on plumages of the blue-winged teal. The Auk. 90: 533-551. Griffiths, R. and Korn, R. 1997. A CHD1 gene is Z chromosome linked in the chicken Gallus domesticus. Gene. 197: 225-229. Griffiths, R. and Tiwari, B. 1995. Sex of the last wild spix’s macaw. Nature 375: 454. Hirschenhauser, K., Mostl, E. and Kotrschal, K. 1999. Seasonal Patterns of Sex Steroids Determined from Feces in Different Social Categories of Greylag Geese (Anser anser). General and Comparative Endocrinology. 114: 67–79. Jirajaroenrat, K. and Thammakarn, C. 2007. Sex identification of some pet birds by polymerase chain reaction-based methods. In: Proceeding of International Conference on Integration of Science and Technology for Sustainable Development. Bangkok. 376-379.

Reddy, A., Prakash, V. and Shivaji, S. 2007. A rapid, non–invasive, PCR–based method for identification of sex of the endangered old world vultures (White– backed and Long– billed vultures) –implications for captive breeding programmes. Current Science. 92 (5): 659–662.

70



Sex Identification in Pet Birds

Chanathip Thammakarn 1) #

Pet birds are favorite companion animals. In Thailand, pet birds can be divided in to 4 groups

composed of Psittaciformes, Passeriformes, ornamental waterfowl and miscellaneous birds. Sex

identification is very important issue. It is a key to successful in aviculture. There are many methods

to identify sex of bird consisting of external appearance, examination of the pelvic girdle and cloaca,

behavioral observation, laparoscopy, measurement of steroid level in plasma or excrement, karyo-

type and polymerase chain reaction method. Nowadays, laparoscopy is a favorite method, because

it gives the best accurate result. The PCR technology by using chd gene as DNA marker that is ad-

mirable method for sex identification in pet birds.

Keywords: pet birds, polymerase chain reaction method, sex identification

1) Division of Animal Production Technology and Fisheries, Faculty of Agricultural Technology King Mongkut ’s Institute of Technology Ladkrabang, Bangkok, Thailand. 10520# Corresponding author

Abstract

Documents

vol21no4