VOLTAMETRIJSKO ODREĐIVANJE ASKORBINSKE KISELINE (VITAMINA C) U MULTIVITAMINSKIM

PRIPRAVCIMA Uvod

Voltametrija je zajednički naziv za niz elektrokemijskih tehnika koje se temelje na

mjerenju strujno-naponske karakteristike elektrokemijskog procesa koji se odvija na promatranoj (tzv. radnoj) elektrodi. Karakterističan oblik strujno-naponske krivulje (tzv.

voltamograma) za pojedinu voltametrijsku tehniku uvjetovan je oblikom naponske pobude narinute na radnu elektrodu te brzinom kojom se potencijal radne elektrode mijenja. Za

naponsku pobudu korištenu kod voltametrije s linearnom promjenom potencijala, odnosno kod cikličke voltametrije karakteristično je da se potencijal stepeničasto mijenja od neke

početne do krajnje vrijednosti, pri čemu je prosječna brzina promjene potencijala linearna funkcija vremena. Kod cikličke voltametrije smjer promjene potencijala mijenja se nakon što

narinuti potencijal dosegne konačnu vrijednost, rezultat čega je povratak narinutog potencijala prema početnoj vrijednosti. U tom povratnom ciklusu moguće je elektrokemijski oksidirati ili

reducirati produkte nastale u početnom ciklusu, zbog čega je ciklička voltametrija naročito prikladna za istraživanja mehanizama elektrokemijskih reakcija.

Ciklička voltametrija i voltametrija s linearnom promjenom potencijala umjereno su osjetljive elektroanalitičke tehnike. U optimalnim uvjetima granica detekcije obje metode

iznosi 10–5 – 10–6 mol/L. Prednost im je brzina i jednostavnost, pa se često upotrebljavaju za brza određivanja elektroaktivnih analita u uzorcima u kojima se oni nalaze u relativno velikoj

količini.

Princip određivanja

Askorbinska kiselina elektrokemijski se lako oksidira u dehidroaskorbinsku kiselinu prema jednadžbi:

OO

OHOH

OHOH

OO

OOH

OHOH

OH

+ H2O + 2 e- + 2 H+

pri čemu je struja uslijed oksidacije askorbinske kiseline proporcionalna njenoj koncentraciji.

Da bi se izbjegao utjecaj matrice na točnost određivanja (npr. visok sadržaj ugljikohidrata u uzorku može uzrokovati smanjenje visine voltametrijskog vala), određivanje se izvodi

metodom standardnog dodatka, tj. dodatkom određenog volumena standardne otopine askorbinske kiseline izravno u otopinu uzorka.

Mjerni uređaj

Mjerenje se izvodi pomoću troelektrodnog potenciostata ISKRA MA-5450 povezanog

s osobnim računalom (slika 1). Na potenciostat se iz generatora pobude dovodi željena

naponska pobuda, pri čemu potenciostat osigurava da razlika potencijala između radne i

referentne elektrode u svakom trenutku odgovara narinutoj pobudi. Struju koja teče između radne i pomoćne elektrode potenciostat pretvara u odgovarajući naponski signal, koji se zatim

prevodi u digitalni oblik i putem odgovarajućeg sučelja šalje u osobno računalo. Snimljeni voltamogram na računalu je moguće obrađivati i pohraniti.

Kao radna elektroda koristi se elektroda od spektroskopski čistog grafita u obliku diska promjera 3 mm. Kao referentna elektroda koristi se Ag/AgCl elektroda, a pomoćna

elektroda je platinska žica. Kao osnovni elektrolit služi vodena otopina natrijeva citrata koncentracije 0,1 mol/L, zakiseljena do pH = 5 s limunskom kiselinom.

Slika 1. Blok-shema mjernog uređaja.

Priprava standardne otopine askorbinske kiseline

Na preciznoj vagi odvagati otprilike 250 mg askorbinske kiseline i zapisati točnu odvagu. U čašu od 50 mL menzurom uliti 3 mL otopine H2SO4 koncentracije 0,1 mol/L i

razrijediti je sa 30 mL vode. Odvaganu askorbinsku kiselinu kvantitativno prenijeti u odmjernu tikvicu od 25 mL i otopiti u priređenoj razrijeđenoj otopini sumporne kiseline

(kiseli medij potreban je da bi se usporila oksidacija askorbinske kiseline s kisikom iz zraka, odnosno vode). Tako pripremljeni standard stabilan je oko 2 sata. Izračunati masenu

koncentraciju standardne otopine, γ(ask. kis.).

Izvedba mjerenja

Prije samog mjerenja potrebno je elektrokemijsku ćeliju i elektrode oprati destiliranom vodom (elektrode oprati mlazom iz boce štrcaljke ne skidajući ih s držača!). U

elektrokemijsku ćeliju potom uliti otprilike 10 mL otopine osnovnog elektrolita i ćeliju pričvrstiti na držač s elektrodama. Elektrode spojiti s potenciostatom (obratiti pozornost na

oznake na spojnim žicama!), te uključiti računalo i potenciostat. Program za upravljanje potenciostatom automatski se učitava odmah nakon podizanja operacijskog sustava računala.

Prije pokretanja snimanja voltamograma pozvati voditelja vježbi da provjeri ispravnost spojeva potenciostata s elektrodama.

Grafitnu radnu elektrodu potrebno je na početku mjerenja elektrokemijski

kondicionirati uzastopnom elektrokemijskom oksidacijom i redukcijom površine grafita. Na

ćelija

PC

I – E pretvornik

generator pobude

potenciostat

radna el.

referentna el.

pomoćna el.

taj se način na površini grafita stvaraju kisikove funkcionalne skupine koje doprinose bržem

prijelazu elektrona s elektrode na elektroaktivnu tvar u otopini. Kondicioniranje elektrode izvodi se cikliziranjem potencijala u katodnom i anodnom smjeru, najčešće do potencijala pri

kojima na elektrodi započinje razvijanje vodika, odnosno kisika. U program za upravljanje potenciostatom potrebno je najprije upisati parametre koji

određuju uvjete snimanja voltamograma. Pritiskom na dugme 'Odabir tehnike' (ili odabirom iz izbornika 'Kontrole' / 'Odabir tehnike') otvara se prozor u kojem je moguće izabrati željenu

voltametrijsku tehniku te unijeti uvjete snimanja voltamograma:

Na dnu prozora ispisane su voltametrijske tehnike: klasična polarografija (DCP), voltametrija s linearnom promjenom potencijala i ciklička voltametrija (LSV&CV), normalna

pulsna voltametrija (NPV), diferencijalna pulsna voltametrija (DPV), stripping voltametrija (Stripp) i amperometrija (Amp). Odabrati 'LSV&CV' i upisati tražene parametre:

Početni potencijal: –1000 mV

Konačni potencijal: 1250 mV

Čekanje na početnom pot.: 5 s

Broj ciklusa: 5

Nakon što su upisani potrebni parametri, kliknuti na OK. Prozor se zatvara i program je pripravan za mjerenje. Mjerenje se pokreće pritiskom na dugme 'Start' (ili odabirom iz

izbornika 'Kontrole' / 'Start'). Otvara se prozor u kojem treba odabrati strujno područje (pojačanje) podešeno na potenciostatu (odabrati 0.3 mA i provjeriti je li to isto područje

odabrano i na potenciostatu):

Pritiskom na OK prozor 'Pojačanje' se zatvara, otvara se prozor za prikaz voltamograma i započinje mjerenje. Kada se izvrši zadani broj ciklusa definiran uvjetima

snimanja voltamograma, program automatski prekida mjerenje, čime je završeno kondicioniranje elektrode.

Nakon kondicioniranja elektrode ponovo kliknuti na 'Odabir tehnike' i promijeniti

uvjete snimanja voltamograma kako slijedi:

Početni potencijal: –250 mV

Konačni potencijal: 500 mV

Čekanje na početnom pot.: 5 s

Broj ciklusa: 1

Kliknuti na 'Start', pojačanje na potenciostatu i u prozoru 'pojačanje' promijeniti na 0.1 mA i

snimiti struju u zadanom području potencijala. Mjerenje ponoviti tri puta, s obzirom da je nakon kondicioniranja elektrode potrebno neko vrijeme da se snimljeni voltamogrami

ustabile. Iz izbornika 'Podaci' odabrati opciju 'Spremi kao...' i pohraniti voltamogram dobiven trećim mjerenjem na tvrdi disk računala. Snimljeni voltamogram predstavlja tzv. osnovnu

struju – struju snimljenu u otopini osnovnog elektrolita bez analita, odnosno dodanog uzorka. Za uspješnu analizu poželjno je da u području u kojem se očekuje val analita osnovna struja

bude što manja, te da se u tom području ne javljaju valovi nečistoća eventualno prisutnih u osnovnom elektrolitu.

Nakon što je snimljena i pohranjena osnovna struja, u ćeliju dodati 250 µL standardne

otopine askorbinske kiseline i sadržaj ćelije promiješati. Pritiskom na 'Start' pokrenuti mjerenje. Nakon mjerenja dobiveni voltamogram pohraniti na tvrdi disk računala. Njegovom

analizom ustanovit ćete je li elektrokemijska oksidacija askorbinske kiseline reverzibilna,

kvazireverzibilna ili ireverzibilna. Nakon snimanja voltamograma ćeliju skinuti, elektrode isprati mlazom vode iz boce štrcaljke, sadržaj iz ćelije baciti i ćeliju više puta isprati s

destiliranom vodom.

Na preciznoj vagi odvagati otprilike 0,5 g uzorka multivitaminskog pripravka i zapisati točnu odvagu. Uzorak kvantitativno prenijeti u ćeliju i izravno u ćeliji otopiti u ne

više od 10 mL vode. Sadržaj ćelije miješati staklenim štapićem dok se ne otopi sva krutina (uzorak će ostati blago mutan zbog sitnih mjehurića CO2, te zbog sadržaja u vodi netopljivih

vitamina). U otopinu uzorka nije potrebno dodavati nikakav elektrolit jer otopina već sadrži natrijev citrat i natrijev hidrogenkarbonat u dovoljnoj koncentraciji da posluže kao osnovni

elektrolit prilikom mjerenja. Nakon što je uzorak otopljen, kliknuti na 'Odabir tehnike' i promijeniti uvjete snimanja

voltamograma kako slijedi:

Početni potencijal: –100 mV

Konačni potencijal: 600 mV

Čekanje na početnom pot.: 5 s

Broj ciklusa: 1/2 (LSV)

Pritiskom na 'Start' pokrenuti mjerenje i promotriti dobiveni voltamogram. Ako je vrh

voltametrijskog vala 'odrezan' (tj. ako je mjerena struja premašila odabrano strujno područje), voltamogram snimiti ponovo, uz veće strujno područje (npr. 0.3 mA). Dobiveni voltamogram

pohraniti na tvrdi disk računala. Nakon snimanja voltamograma radnu elektrodu lagano pomaknuti lijevo-desno u ćeliji (oko 5 mm na svaku stranu), kako bi se obnovila otopina uz

elektrodu. Snimanje voltamograma ponoviti i snimljeni voltamogram također pohraniti na disk. Iz izbornika 'Podaci' odabrati 'Dodaj' i učitati prethodno snimljeni voltamogram. Na taj

način na ekranu će se preklopiti oba voltamograma. Ako se visine valova na snimljenim voltamogramima razlikuju za više od 5 % snimiti i treći voltamogram, odn. snimanje

ponavljati sve dok se ne postigne zadovoljavajuća reprodukcija voltamograma (iza snimanja svakog voltamograma laganim pomicanjem radne elektrode obavezno promiješati otopinu uz

elektrodu!).

Nakon snimanja voltamograma uzorka u ćeliju dodati 100 µL standardne otopine askorbinske kiseline i sadržaj ćelije promiješati. Snimiti 2-3 voltamograma i provjeriti njihovu

reproducibilnost. Snimljene voltamograme pohraniti na tvrdi disk računala. Potom u ćeliju dodati još 100 µL standardne otopine askorbinske kiseline i postupak snimanja voltamograma

ponoviti. Dobivene tri serije voltamograma (uzorak, uzorak + prvi standardni dodatak, uzorak + drugi standardni dodatak) poslužit će za izračunavanje masenog udjela askorbinske kiseline

u uzorku.

Po završetku rada ćeliju skinuti, elektrode isprati destiliranom vodom, sadržaj ćelije baciti i ćeliju isprati s destiliranom vodom.

Učitavanjem i preklapanjem sva tri voltamograma (izbornik 'Podaci', opcija 'Otvori')

dobiva se slika kao na slici 2. Presnimiti datoteke s voltamogramima na disketu i obraditi ih na način opisan u sljedećem poglavlju.

Slika 2. Voltamogrami uzorka, te uzorka s dva dodatka standardne otopine askorbinske kiseline

Obrada voltamograma:

Voltamograme učitati u neki od tabličnih kalkulatora (Excel, Origin, Sigmaplot...), ili neki drugi program prikladan za matematičku obradu podataka (MatLab, MathCad,

Scientist...), ili voltamograme obraditi izravno u programu za upravljanje potenciostatom. Kroz ravan početni dio voltamograma ekstrapolirati osnovnu struju i oduzeti je od svakog

pojedinog voltamograma. Na svakom voltamogramu očitati visinu vala koji pripada askorbinskoj kiselini (val pri otprilike 380 mV). U programu u kojem ste snimali

voltamograme pravac možete povući odabirom opcije 'Pravac' iz izbornika 'Obrada'. Držeći pritisnutu lijevu tipku miša, pomicanjem miša crtate pravac. Visinu vala možete odrediti tako

da kursor namjestite na vrh vala i očitate njegovu poziciju (u donjem lijevom kutu prozora), te

od dobivene vrijednosti oduzmete vrijednost ekstrapolirane osnovne struje pri potencijalu na

kojem se javlja vrh vala (slika 3).

Primjerice, neka su za visine valova dobivene vrijednosti:

I0 = 9,51 µA I1 = 15,75 µA

I2 = 21,48 µA

Zatim izračunati masu askorbinske kiseline koja je dodana u ćeliju nakon prvog, odnosno drugog standardnog dodatka:

m1(ask. kis.) = γ(ask. kis.) · V(stand. dod.)

m2(ask. kis.) = 2 · γ(ask. kis.) · V(stand. dod.)

Dobivene vrijednosti unose se u koordinatni sustav na čijoj se x-osi nalazi masa askorbinske

kiseline, a y-osi izmjerena visina vala. Podaci se unose tako da se masi m = 0 pridruži vrijednost struje I0, masi m1 vrijednost I1 i masi m2 vrijednost struje I2 (slika 4). Kroz

dobivene točke linearnom se regresijom provuče pravac. Apsolutna vrijednost odsječka regresijskog pravca na negativnom dijelu apscise odgovara masi askorbinske kiseline u ćeliji,

tj. u izvaganoj masi uzorka. Za konkretni primjer, dobivena masa askorbinske kiseline u

uzorku iznosi: m(ask. kis.) = 1,58 mg

-2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

0

5

10

15

20

masa ask. kis.u uzorku

Ip / µA

m(ask.kis.) / mg

Slika 4. Izračunavanje mase askorbinske kiseline metodom standardnog dodatka.

Na temelju izračunate mase askorbinske kiseline u odvaganoj masi uzorka izračunati masu

askorbinske kiseline u 100 g uzorka.