VPLIV PARAMETROV NA SINTEZO ZAMREŽENIH ENCIMSKIH · 2017. 11. 28. · 6 VPLIV PARAMETROV NA SINTEZO ZAMREŽENIH ENCIMSKIH SKUPKOV (CLEAs) IZ ENCIMA CELULAZA POVZETEK V diplomskem

Maša Petko

VPLIV PARAMETROV NA SINTEZO ZAMREŽENIH ENCIMSKIH

SKUPKOV (CLEAs) IZ ENCIMA CELULAZA

Diplomska naloga

Maribor, september 2015

2



Diplomska naloga univerzitetnega študijskega programa

Študent: Maša Petko

Študijski program: univerzitetni študijski program Kemijska tehnologija

Smer: biokemijska tehnika

Predvideni strokovni naslov: uni. dipl. inž. kem. tehn.

Mentor: red. prof. dr. Maja Leitgeb

Somentor: doc. dr. Mateja Primožič

Maribor, september 2015

3

4

IZJAVA

S temi besedami izjavljam, da sem diplomo izdelala sama in da so sposojeni prispevki

primerno označeni.

Maribor, september 2015 Maša Petko

5

ZAHVALA

Iskreno se zahvaljujem mentorici prof. dr. Maji Leitgeb

in somentorici doc. dr. Mateji Primožič, za nasvete in

pomoč pri izdelavi diplomskega dela. Zahvala gre tudi

mladi raziskovalki Gordani Hojnik Podrepšek in vsem

strokovnim sodelavcem Laboratorija za separacijske

procese in produktno tehniko za nesebično pomoč pri

izvedbi eksperimentalnega dela.

Zahvalila bi se rada babici, dedku in partnerju za vse

spodbudne besede in pomoč med šolanjem. Diploma je

posvečena staršema, katera sta mi omogočila študij in

mi z vso ljubeznijo in potrpljenjem stala ob strani.

Najlepša hvala vsem!

6



POVZETEK

V diplomskem delu je opisana sinteza encimskih skupkov ali agregatov iz encima celulaza,

katere na kratko imenujemo CLEAs (Crosslinked enzyme aggregates). Zamrežene encimske

skupke smo pripravili po že znanem postopku, ki je sestavljen iz dveh ključnih delov. Prvi del

predstavlja oboritev encima s pomočjo obarjalnega reagenta, ki je lahko organsko topilo ali

raztopina anorganske soli. Temu sledi zamreženje oborjenega encima s pomočjo

zamrežitvenega reagenta. Glutaraldehid je organska molekula in se najpogosteje uporablja kot

zamrežitveni reagent, predvsem zaradi enostavne uporabe in relativno nizke nabavne cene. Pri

sintezi CLEAs smo optimirali parametre z namenom izboljšanja relativne aktivnosti

encimskih agregatov. V fazi obarjanja smo ugotavljali, kateri so tisti obarjalni reagenti, ki

nam ne povzročijo ireverzibilne denaturacije, saj s tem deaktiviramo encim in izgubimo

nativno aktivnost encima. Na koncu smo določili tudi stabilnost sintetizirane CLEAs, s

poskusi ponovne uporabe imobiliziranega encima.

Z eksperimentalnim delom smo uspešno sintetizirali zamrežene encimske skupke iz encima

celulaze. Sintezo smo izvajali pri sobni temperaturi z uporabo pufra PBS (20 mM in pH = 7),

s koncentracijo albumina γalbumin = 17 mg/mL in z Vrazt. celulaze = 100 µL. Za obarjanje smo

uporabili 90 % delež topil, ki smo mu smo dodali 10 % delež encima celulaze. Uporabljeni

obarjalni reagenti so: metanol, etanol, propanol, 2-propanol, aceton, amonijev sulfat,

tetrahidrofuran, dimetilsulfoksid, polietilen glikol (PEG 1500, 6000, 20000), kloroform, n-

heptan, heksan, dimetileter, butanol, acetonitril in dekanol. V stopnji zamreženja smo

uporabili tiste obarjalne reagente, kjer je bilo obarjanje uspešno. Zamreženje je potekalo

3 ure. Ugotovili smo, da je bila najvišja aktivnost CLEAs pri uporabi obarjalnega reagenta

etanola in pri koncentraciji glutaraldehida ϕ = 0,0625 %. Končni produkt sinteze CLEAs je

bila motna suspenzija, kjer je bila povprečna velikost agregatov 43 µm. Kljub visoki

aktivnosti smo ugotovili, da CLEAs ni stabilna, saj dobimo razpolovno dobo encima že po 2.

ciklu. V začetni fazi raziskave smo sintetizirali CLEAs s sicer nižjo aktivnostjo, vendar so bili

dobljeni agregati stabilnejši. S tem smo ovrgli trditev, da je aktivnejša CLEAs tudi stabilnejša.

Ključne besede: zamreženi encimski skupki, CLEAs, celulaza, mrežni povezovalec,

7

glutaraldehid, obarjalni reagenti.

UDK: 577.151.5(043.2)

INFLUENCE OF PARAMETRS ON SYNTHESIS OF CROSS-LINKED AGGREGATES

(CLEAs) OF CELLULASE

ABSTRACT

In this work we described the synthesis of cross-linked aggregates of enzyme cellulase;

shortly CLEAs. We prepared cross-linked aggregates within two major steps: precipitation

and cross-linking. The first step is precipitation. As precipitating reagents we can use organic

solvents or solutions of an inorganic salts. The second step is cross-linking with cross-linking

reagent, which is usually glutaraldehyde. Glutaraldehyde is an organic molecule that is easy to

work with and it is relatively cheap. We changed parameters in synthesis of cross-linked

enzyme aggregates in the way of getting better results; higher activity of cross-linked enzyme

aggregates. In precipitation phase, we needed to find precipitating reagents, which didn't

cause irreversible reaction. The aim of this work is to find out how stable is synthesized

CLEAs, because stability is one of the most important advantage of immobilized enzyme.

We successfully synthesized CLEAs with enzyme cellulase. The parameters of synthesis

were: room temperature, albumin concentration γ=17 mg/mL, volume of enzyme solutio V=

100 µL and PBS buffer (20 mM, pH=7). As precipitating reagents we used many solvents and

in the phase of cross-linking we used those reagents with successfully precipitation. Cross-

linking of enzyme took 3 hours. We synthesized CLEAs with the highest activity with ethanol

as solvent and gluteraldehyde concentration ϕ= 0,0625 %. As result we got cloudy suspension

with 43 µm of average size of the aggregates. Despite high activity we showed that CLEAs

wasn't stable, because we got enzyme half-life after second cycle. During our research we

proved that CLEAs with the highest activity isn't necessary also the most stable, because we

synthesized CLEAs with lower activity and it was more stable than CLEAs with the highest

activity

Keywords: cross-linked aggregates, CLEAs, cellulase, cross-linking reagent, glutaraldehyde,

precipitating reagents.

UDK: 577.151.5(043.2)

8

KAZALO

1. UVOD ............................................................................................................................... 15

2. TEORETIČNI DEL........................................................................................................... 16

2.1. IMOBILIZACIJA ...................................................................................................... 16

2.2. METODE IMOBILIZACIJE ..................................................................................... 17

2.2.1. ADSORPCIJA .................................................................................................... 17

2.2.2. UJETJE ............................................................................................................... 18

2.2.3. INKAPSULACIJA ............................................................................................. 18

2.2.4. KOVALENTNA VEZAVA ............................................................................... 19

2.2.4.1. Metode imobilizacije z nosilcem................................................................. 19

2.2.4.2. Metode imobilizacije brez nosilca............................................................... 20

2.3. ENCIMI ..................................................................................................................... 23

2.4. CELULOZA .............................................................................................................. 26

2.5. CELULAZE ............................................................................................................... 27

2.6. MREŽNI POVEZOVALEC – GLUTARALDEHID ................................................ 28

2.7. OBARJANJE IN OBARJALNI AGENSI .................................................................. 31

3. REAGENTI IN METODE ................................................................................................ 35

4. EKSPERIMENTALNE METODE ................................................................................... 37

4.1. PRIPRAVA REAGENTOV ZA AKTIVNOSTNI TEST ......................................... 37

4.2. PRIPRAVA PROSTEGA ENCIMA IN SINTEZA ZAMREŽENIH ENCIMSKIH

SKUPKOV (CLEAs) ............................................................................................................ 39

4.3. DOLOČANJE UČINKOVITOSTI IMOBILIZACIJE .............................................. 41

4.4. DOLOČANJE SPECIFIČNE AKTIVNOSTI KATALIZATORJA .......................... 43

4.5. STABILNOST IMOBILIZIRANEGA ENCIMA ..................................................... 46

5. REZULTATI ........................................................................................................................ 47

5.1. VPLIV PUFRA NA AKTIVNOST ENCIMA CELULAZE ...................................... 47

5.2. UPORABA RAZLIČNIH OBARJALNIH REAGENTOV ....................................... 48

9

5.3. DOLOČANJE AKTIVNOSTI RESUSPENDIRANEGA ENCIMA PO OBARJANJU . 50

5.4. SINTEZA CLEAs Z UPORABO RAZLIČNIH OBARJALNIH REAGENTOV ...... 51

5.4.1. Vpliv uporabe različnih obarjalnih reagentov na učinkovitost imobilizacije in

aktivnost zamreženih encimskih skupkov ......................................................................... 51

5.4.2. Primerjava aktivnosti resuspendiranega encima z aktivnostjo zamreženih

encimskih skupkov ............................................................................................................ 52

5.4.3. Proučevanje vpliva večkratne uporabe CLEAs na njegovo preostalo aktivnost ob

uporabi različnih obarjalnih reagentov .............................................................................. 54

5.4.4. Opazovanje in primerjanje velikosti CLEAs z uporabo različnih obarjalnih

reagentov pod optičnim mikroskopom .............................................................................. 55

5.5. VPLIV KONCENTRACIJE MREŽNEGA POVEZOVALCA (GA) ........................ 59

5.5.1. Optimizacija koncentracije GA pri sintezi CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta

metanola ............................................................................................................................ 59


etanola ............................................................................................................................... 60


propanola ........................................................................................................................... 61

5.5.4. Optimizacija koncentracije GA pri sintezi CLEAs z uporabo obarjalenga reagenta

amonijevega sulfata ........................................................................................................... 62

5.6. STABILNOST CLEAs Z NAJVIŠJO AKTIVNOSTJO ........................................... 63

6. ZAKLJUČKI ..................................................................................................................... 64

7. PRILOGE .......................................................................................................................... 65

UMERITVENA KRIVULJA – BRADFORD .................................................................. 65

TABELE Z REZULTATI ................................................................................................. 66

8. LITERATURA .................................................................................................................. 71

10

KAZALO SLIK

Slika 1: Vrste imobilizacije ...................................................................................................... 17

Slika 2: a) Ujetje v matriksu, b) Ujetje v mikrokapsulah ......................................................... 18

Slika 3: Shematski prikaz inkapsulacije ................................................................................... 19

Slika 4: Imobilizacija encima brez nosilca ............................................................................... 20

Slika 5: Sinteza CLEAs ............................................................................................................ 22

Slika 6: Potek encimskih reakcij .............................................................................................. 23

Slika 7: Encimska hidroliza celuloze........................................................................................ 26

Slika 8: Povezava dveh molekul celuloze s prečnimi vodikovimi vezmi ................................ 27

Slika 9: Shematski prikaz celulaze ........................................................................................... 28

Slika 10: Sinteza GA ................................................................................................................ 29

Slika 11: Oblike GA v vodni raztopini ..................................................................................... 29

Slika 12: Potek obarjanja .......................................................................................................... 32

Slika 13: CLEAs z obarjalnim reagentom etanolom, spiranja in pufer PBS ............................ 40

Slika 14: Prikaz obarvanosti spiranj z Bradfordovim reagentom. Od leve proti desni si sledijo

slepi vzorec (PBS), supernatant in spiranja. ............................................................................. 42

Slika 15: Hidroliza celuloze ..................................................................................................... 43

Slika 16: Slika stresalnika......................................................................................................... 44

Slika 17: Vpliv pufra na aktivnost prostega encima ................................................................. 47

Slika 18: Prikaz pozitivnih reakcij obarjanja z različnimi obarjalnimi reagenti ...................... 48

Slika 19: Prikaz reakcij obarjanja, kjer celulaza v stiku z obarjalnim reagentom ni tvorila

oborine. ..................................................................................................................................... 49

Slika 20: Aktivnost resuspendiranega encima po obarjanju ..................................................... 50

Slika 21: Prikaz produkta sinteze CLEAs ob uporabi različnih obarjalnih reagentov ............. 51

Slika 22: Primerjava aktivnosti CLEAs in učinkovitosti imobilizacije z uporabo različnih

obarjalnih reagentov ................................................................................................................. 52

11

Slika 23: Primerjava aktivnosti resuspendiranega encima z aktivnostjo CLEAs ob uporabi

različnih obarjalnih reagentov .................................................................................................. 53

Slika 24: Vpliv večkratne uporabe CLEAs na preostalo aktivnost ob uporabi različnih

obarjalnih reagentov ................................................................................................................. 54

Slika 25: CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta amonijevega sulfata, kjer smo dobili velik in

sprijet agregat. .......................................................................................................................... 58

Slika 26: Primerjava aktivnosti CLEAs in učinkovitosti imobilizacije z obarjalnim reagentom

metanolom v odvisnosti od koncentracije GA ......................................................................... 59

Slika 27: Primerjava učinkovitosti imobilizacije in aktivnosti CLEAs z obarjalnim reagentom

etanolom v odvisnosti od koncentracije glutaraldehida ........................................................... 60


propanolom v odvisnosti od koncentracije glutaraldehida ....................................................... 61


amonijevim sulfatom v odvisnosti od koncentracije glutaraldehida ........................................ 62

Slika 30: Stabilnost CLEAs z najvišjo aktivnostjo ................................................................... 63

12

KAZALO TABEL

Tabela 1: Razdelitev encimov v skupine glede na tip reakcije: ............................................... 25

Tabela 2: Fizikalne lastnosti glutaraldehida ............................................................................. 30

Tabela 3: Uspešnost obarjalnih reakcij ..................................................................................... 49

Tabela 4: Aktivnost resuspendiranega encima po obarjanju .................................................... 50

Tabela 5: Razpolovna doba CLEAs z uporabo različnih obarjalnih reagentov ....................... 55

Tabela 6: CLEAs z uporabo različnih obarjalnih reagentov, gledana pod optičnim

mikroskopom ............................................................................................................................ 56

Tabela 7: Povprečna velikost delcev CLEAs pri uporabi različnih obarjalnih reagentov........ 57

13

UPORABLJENE KRATICE

KRATICA

CLEs zamreženi raztopljeni encim

CLEAs zamreženi encimski skupki

CLECs zamreženi encimski kristali

CSDEs zamreženi posušeni encim

PEG polietilenglikol

DMSO dimetil sulfoksid

PBS fosfatni pufer

HCl klorovodikova kislina

NaOH natrijev hidroksid

(NH4)2SO4 amonijeva sol/amonijev sulfat

MC mikrocentrifugirka

(C6H10O5)n celuloza

C6H12O6 glukoza

CH2(CH2CHO)2 glutaraldehid (GA)

Na2H2PO4* H2O natrijev dihidrogenfosfat monohidrat

CH3COONa natrijev acetat

C6H8O7 citratna kislina

PEHA

U/mL

ADP

ATP

β-NAD

β-NADH

G-6PDH

G-PH

pentaetilen heksamin

enote/mL encima

adenozin 5 -difosfat

adenozin 5 -trifosfat

β-nikotinamid adenin dinukleotid, oks. oblika

β-nikotinamid adenin dinukleotid, red. oblika

glokoza-6-fosfat dehidrogenaza

6-fosfo-D-glukonat

14

UPORABLJENI SIMBOLI

SIMBOL ENOTA

T temperatura ˚C

γ masna koncentracija mg/mL

t čas min, h

M molska masa g/mol

m masa mg, g

V volumen mL

IU aktivnost encima µmol/min

Φ prostorninski delež % (v/v)

pH pH raztopine /

c množinska koncentracija mmol/L, mol/L

Λ

λ

absorbanca

valovna dolžina

nm

nm

n hitrost stresanja rpm

ρ

df

gostota

faktor redčenja

g/mL

/

Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza

15

UVOD

Pri biokatalizi uporabljamo katalizatorje, s katerimi povzročimo kemijske pretvorbe v

organskih spojinah. Pri tem lahko uporabljamo encime, ki so izolirani iz celic, ali pa

uporabimo celico, ki vsebuje encim. V preteklosti so biokatalizatorje uporabljali v

prehrambeni industriji (sir, pivo, vino, kis, kvas), v zadnjem času pa se vedno bolj uporabljajo

tudi v kemični in farmacevtski industriji. Prednost biokatalizatorjev je neškodljivost okolju in

delovanje pri nižjih temperaturah. Na aktivnost encima vplivajo: temperatura, količina

substrata, inhibitorji in pH okolja, kjer reakcija poteka.1

Encimi so beljakovinske molekule, ki katalizirajo reakcije v živih celicah. Brez encimov bi

večina biokemijskih reakcij potekala tako počasi, da se v celicah ne bi mogli izvajati osnovni

življenjski procesi. Encimi so prav tako specifični katalizatorji, kar pomeni, da deluje

določen encim na določen substrat in ker se encimi v kemijskih reakcijah ne spremenijo, jih

lahko uporabimo večkrat. Prednosti imobilizacije encimov sta ponovna in večkratna uporaba

encima. Z imobilizacijo encima dosežemo tudi večjo stabilnost encimov.2

CLEAs so zamreženi encimski skupki, ki so oblika imobiliziranega encima, kjer ne

potrebujemo nosilca. Sinteza CLEAs je precej enostavna metoda imobilizacije, kjer lahko

spreminjamo več parametrov, s čimer želimo doseči optimalno aktivnost imobiliziranega

encima. Prednosti kovalentne imobilizacije brez nosilca so:

– preprostost izvedbe (gre za reakcijo v dveh stopnjah: obarjanje in zamreženje),

– čistost produkta,

– uporaba za širok spekter encimov,

– nizki stroški proizvodnje.3


16

1. TEORETIČNI DEL

2.1. IMOBILIZACIJA

Imobiliziran encim je encim, ki je lokaliziran oz. fizično zaprt, s čimer se mu ohranijo

katalitične lastnosti. Zgodovino imobilizacije lahko razdelimo v tri časovna obdobja. Začetek

prvega obdobja sega v 19. stoletje, ko so uporabljali encime pri čiščenju odpadne vode. Druga

prelomnica predstavlja leto 1960, ko se pojavi prva imobilizacija encima, in sicer proizvodnja

L-aminokislin (iz α-keto kislin v L-aminokisline s pomočjo L-aminokislinske dehidrogenaze)

in izomerizacija glukoze. Tretje obdobje predstavljata letnici 1985 in 1995, ko se je pojavila

multiencimska imobilizacija, ki je vključevala kofaktorje in celično imobilizacijo.4

Organizmi izločajo številne encime, ki nimajo ekonomičnega efekta, če se lahko v kemijskem

procesu uporabijo le enkrat. Imobilizacija encima nam omogoča, da lahko encim večkrat

uporabimo. To je vodilo v razvoj več tehnik imobilizacije.

Prednosti imobilizacije so: zaporedna večkratna uporaba encima, nižji stroški procesa, krajši

reakcijski čas, manj nečistoč v produktu, višja stabilnost procesa, večji nadzor nad procesom,

omogoča višje razmerje encim : substrat.4

Slabosti imobilizacije: morebitna izguba ali poslabšanje katalitičnih lastnosti po

imobilizaciji.4

Prednost imobiliziranega encima je ponovna uporaba biokatalizatorja in je najboljši pristop za

stabilizacijo encimov. Za imobilizacijo encimov obstaja več metod, kjer so metode v veliki

meri odvisne od nosilnega materiala, ki je lahko organski ali anorganski. Skozi razvoj tehnik

imobilizacije so znanstveniki ugotovili, da ni za nobeno metodo imobilizacije (adsorpcija,

ujetje, kovalentna vezava, inkapsulacija) določena specifična vrsta nosilnega materiala. Pri

izbiri metode imobilizacije in nosilca moramo upoštevati kemijske in fizikalne lastnosti

nosilnega materiala in encima. Prav tako pa moramo paziti na stabilnost, ekonomičnost in

reaktivnost nosilnega materiala in encima.5


17

1.2. METODE IMOBILIZACIJE

Slika 1 prikazuje shematski prikaz metod imobilizacije in njihovo delitev na kemijske ali

fizikalne metode.

Slika 1: Vrste imobilizacije6

1.2.1. ADSORPCIJA

Adsorpcija je najenostavnejša metoda imobilizacije encima. Encim se nekovalentno

imobilizira na površino netopnega nosilnega materiala ali pa se veže na mineralne delce, kot

sta aluminijev oksid in glina. Delci, kamor se encim veže, so lahko tudi organskega izvora,

kjer je najpogostejši predstavnik škrob.

Pri adsorpciji so prisotne nizkoenergijske Van der Waalsove interakcije. Pri imobilizaciji

encima na notranjo površino nosilnega materiala je encim zaščiten pred zunanjimi vplivi in se

tako lahko tvorijo bolj stabilne vezi. Vez med encimom in nosilnim materialom je lahko

ionska ali kovalentna, lahko pa je kombinacija obeh vrst vezi.

Prednosti adsorpcije: metoda je enostavna, poceni in predstavlja reverzibilen proces.

Slabosti adsorpcije: tvorba šibkih vezi, imobilizacija poteka počasi.7


18

1.2.2. UJETJE

Gre za fizikalno metodo imobilizacijo, kjer se encim ujame v polimerno matrico ali v

membrano nosilnega materiala. Velikost por matriksa je določena glede na posamezno vrsto

encima. Pri tej metodi imobilizacije poznamo dva načina ujetja encima: ujetje v gelu in ujetje

v mikrokapsulah. Ujetje encima se razlikuje od kovalentne vezave encima v tem, da se encim

pri ujetju ne veže v gel ali membrano. Nevezava encima v gel ali na membrano je prednost, ki

se kaže v širokem spektru uporabe te metode. Slika 2a predstavlja encim, ki se je ujel v

intersticijskih mestih polimera. Najpogostejša sintetična polimera, ki sta uporabljena za

imobilizacijo encima, sta poliakrilamid in polivinil alkohol, najpogosteje uporabljen naravni

polimer je škrob. Slika 2b nam predstavlja ujetje encima v »kapsulo polimera«, ki ima

polprepustno oziroma semipermeabilno membrano. Priprava mikrokapsul je nadzorovan

laboratorijski proces, ki zahteva stroge kemijske in fizikalne pogoje.8

Slika 2: a) Ujetje v matriksu, b) Ujetje v mikrokapsulah8

1.2.3. INKAPSULACIJA

Pri inkapsulaciji gre za postopno dodajanje raztopine encima skozi polprepustno membrano

kapsule. Kapsula je narejena iz celuloznega nitrata, najlona ali drugih materialov. Metoda

inkapsulacije je enostavna in poceni, uspešnost pa je odvisna od stabilnosti posameznega

encima. Katalizator se nahaja znotraj kapsule, kar lahko vidimo na sliki 3. Ta tehnika se

uporablja le v zdravstvene namene. Pri inkapsulaciji je mogoče imobilizirati velike količine

encima.9


19

Slika 3: Shematski prikaz inkapsulacije9

1.2.4. KOVALENTNA VEZAVA

Encim, ki je imobiliziran na nosilec ali pa je imobiliziran brez nosilca, opisujemo z dvema

parametroma: nekatalitični in katalitični parametri. Nekatalitični parametri predstavljajo

fizikalne in kemijske lastnosti encima: oblika in velikost, medtem ko katalitični parametri

predstavljajo aktivnosti in stabilnost encima.10

1.2.4.1. Metode imobilizacije z nosilcem

Kovalentna vez se ustvari med funkcionalnima skupinama encima in prenosnika. Kovalentne

vezave se lahko poslužujemo pri encimih v širokem spektru pH. Postopek imobilizacije se

prične s pritrditvijo pripajalnega agensa, ki mu sledi pripenjanje funkcionalne skupine in na

koncu sledi pripenjanje encima. Kot nosilce lahko uporabimo ogljikove hidrate, proteine ali

anorganske nosilce. Kovalentna vezava poteka na točno določeni skupini (aminska ali

hidroksilna skupina) na površini encima. Slabost kovalentne vezave je morebitna deaktivacija

encima zaradi sprememb v konformaciji molekule, ki lahko nastane med reakcijo na aktivnih

mestih encima. To lahko preprečimo z uporabo substrata ali kompetitivnega inhibitorja

oziroma proteaze. Najpogosteje uporabljani aktivirni polimeri so celulaze ali poliakrilamidi,

kjer so vključene -diazo in -azidne funkcionalne skupine.4, 10

Različne metode kovalentne imobilizacije so:

– tvorba peptidne vezi med amino ali karboksilno skupino nosilca in encima,

– polifunkcionalni reagenti, kjer uporabimo bifunkcionalni ali večnamenski reagent za

tvorbo vezi med amino skupinama prenosnika in encima.4


20

1.2.4.2. Metode imobilizacije brez nosilca

Imobilizacija encima na nosilec lahko povzroči izgubo encimske aktivnosti tudi do 50 %,

posebej še, če gre za velike količine prostega encima. Zato je veliko več zanimanja za

imobilizacijo encimov brez nosilca, kot so CLEs (ang. cross-linked dissolved enzyme),

CLECs (ang. cross-linked enzyme crystals) in CLEAs (ang. cross-linked enzyme aggregates).

Pri naštetih metodah lahko uporabljamo visoke koncentracije encima, stroški proizvodnje so

nizki, imobilizirani encimi imajo višjo stabilnost v primerjavi z imobilizacijo na nosilec.10

Na sliki 4 so predstavljene različne tehnike imobilizacije encima brez nosilnega materiala.

Postopki se med seboj razlikujejo v dodatku mrežnih povezovalcev, ki jih uporabljamo za

zamreženje encima.

Slika 4: Imobilizacija encima brez nosilca10


21

CLEs

Višjo termostabilnost lahko dosežemo z zamreženjem raztopljenega encima, pri čemer

potrebujemo dobro razmerje med količino zamrežitvenega agensa, temperaturo, pH in ionsko

močjo encima. Intramolekularno zamreženje raztopljenega encima ima slabosti, in sicer nizko

stabilnost in precej nižjo aktivnost imobiliziranega encima (aktivnost imobiliziranega encima

je po navadi pod 50 % aktivnosti prostega encima). Višjo stabilnost raztopljenega encima

dobimo z ujetjem CLEs ali z zamreženjem raztopljenega encima v gelu ali z adsorpcijo

encima na inertni nosilec ali membrano. Metoda CLEs se običajno ne uporablja zaradi slabih

mehanskih lastnosti, med katerimi je najpogostejša slaba aktivnost imobiliziranega encima.10,

13

CLECs

Zamreženi encimski kristali imajo precej višjo termo in mehansko stabilnost v primerjavi z

CLEs. CLECs so stabilni v širokem spektru pH. Dobljeni kristali so lahko različnih velikosti.

Dokazano je, da zmanjšanje velikosti kristalov privede do višje aktivnosti imobiliziranega

encima. Altus Biologics je v letu 1990 prvi raziskal industrijski pomen CLECs, saj so bili ti

kristali odpornejši na temperaturo in so imeli posledično nižjo stopnjo denaturacije

imobiliziranega encima v primerjavi s prostim encimom. Produkt imobilizacije so robustni

kristali z visoko aktivnostjo. Njihova velikost je 1–100 µm. Postopek imobilizacije zahteva

visoko čistost končnega produkta, kar pomeni visoke obratovalne stroške.10, 14

Tehnika CLECs temelji na zamreženju encimskih kristalov z bifunkcionalnim reagentom, ki

je običajno glutaraldehid. Kot produkt dobimo trde kristale, ki so netopni v organskih in

vodnih raztopinah. Ker so kristali netopni, jih lahko odstranimo s filtracijo ali z odlitjem

tekočega medija.13

CLSDs

Sušenje z razprševanjem encima je blaga in cenovno ugodna metoda imobilizacije, pri kateri

dobimo kot produkt posušen in razpršen encim. Uporablja se za stabilizacijo temperaturno

občutljivih snovi (encimi in probiotične bakterije). Čeprav je sušenje z razprševanjem encima

uveljavljena metoda, se v industriji raje poslužujejo sušenja encima z zmrzovanjem. Razlog

za to so optimalni pogoji sušenja, kjer se izognemo morebitnim toplotnim poškodbam encima,

ki lahko vodi do izgube aktivnosti encimov ali do zmanjšanega preživetja bakterij.15


22

ZAMREŽENJE ENCIMSKIH SKUPKOV ali »cross-linking«

Gre za kovalentno vezavo med različnimi molekulami encima s polifunkcionalnimi reagenti,

kot sta glutaraldehid ali diazonijeva sol. Tehnika je preprosta in poceni, ne moremo pa je

uporabljati pri uporabi čistih proteinov, saj dobimo le malo imobiliziranega encima, kateri

ima visoko aktivnost. Tehniko uporabljamo v komercialne namene. CLEAs so zamreženi

encimski skupki, ki jih dobimo z obarjanjem in zamreženjem proteinskih agregatov (slika 5).

Ta postopek omogoča čiščenje in imobilizacijo v eni stopnji. Skupki, ki nastanejo pri

imobilizaciji, so makromolekule, ki so povezane s kovalentnimi vezmi in se ponovno

suspendirajo ob dodatku vodne raztopine z ustreznim pH. Postopek v prvi fazi temelji na

obarjanju, hkrati pa je potrebno poiskati obarjalni reagent, ki ne bo povzročil ireverzibilne

denaturacije encima. Obarjanje je postopek, pri katerem želimo ločiti encim iz reakcijske

zmesi. Pri tem uporabljamo različna topila. Ko se encim obori, preide v netopno obliko. V tej

stopnji nastanejo skupki, ki se v naslednji fazi zamrežijo z ustreznimi zamrežitvenimi

reagenti.11

Slika 5: Sinteza CLEAs12


23

1.3. ENCIMI

Encimi pospešujejo biokemijske reakcije v živih organizmih, sami pa se pri reakcijah ne

spremenijo. Brez encimov večina reakcij ne bi mogla potekati, saj omogočajo pretvorbo

energije in metabolično razgradnjo ali sintezo. Tako poznamo katalizirane in nekatalizirane

reakcije. Potek encimskih reakcij je prikazan na sliki 6. Pri nekataliziranih reakcijah poteka

reakcija po shemi: (S – substrat, P – produkt), kjer imamo visoko aktivacijsko energijo

in nizko reakcijsko hitrost. Pri reakcijah, ki so katalizirane z encimom, pa poteka reakcija po

shemi: (E – encim, S – substrat, P – produkt), pri kateri imamo nizko

aktivacijsko energijo, vendar visoko reakcijsko hitrost. Reakcijski mehanizem poteka preko

intermediatov.16

Slika 6: Potek encimskih reakcij17

Encimska kataliza se vedno začne z vezavo substrata na encim. Velikost molekule substrata je

običajno manjša od velikosti molekule encima. Za vezavo substrata na encim obstaja na

encimu točno določeno mesto, ki ga imenujemo aktivno mesto. Aktivno mesto je vdolbina ali

žepek v molekuli encima, kjer poteka kataliza.16


24

Za aktivna mesta velja:

aktivno mesto je specifično, kar pomeni, da aktivno mesto prepozna točno določeno

molekulo substrata iz velike množice substratov. Obliki molekule substrata in

aktivnega mesta sta skoraj zrcalni sliki, kar pomeni, da se bo molekula substrata

ujemala z obliko aktivnega mesta na encimu;

aktivno mesto predstavlja le majhen tridimenzionalen prostor na molekuli encima;

substrat se v prvi fazi veže na molekulo encima s šibkimi nekovalentnimi

reverzibilnimi interakcijami, kot so hidrofobne interakcije, vodikove in ionske vezi.16

Predstavo o kompleksu ES je prvi razložil Emil Fischer, leta 1890. Ta princip je poimenoval

ključ : ključavnica. Aktivno mesto na encimu je bilo predstavljeno kot ključavnica, substrat

pa kot ključ. Ta model je predvideval, da je aktivno mesto neprilagodljivo. Leta 1958 je

Daniel Koshland izpopolnil obstoječi model ključ : ključavnica in predstavil model inducirane

prilagoditve. Znano je, da so encimi 3D-oblike in se zaradi njihove oblike lažje prilagajajo in

premikajo glede na aktivno mesto. Model inducirane prilagoditve pravi, da je aktivno mesto

na encimu pred vezavo substrata nedoločene oblike. Šele ob vezavi substrata na aktivno

mesto zavzame aktivno mesto na encimu dokončno obliko in zgradbo. Z rentgensko

kristalografijo je bilo dokazano, da se med nastankom kompleksa ES dogajajo konformacijske

spremembe na molekuli encima. Zadnji model vezave encima in substrata predstavlja model

analog prehodnega stanja, kjer se poudarja lastnost encimov kot katalizatorjev.16

Encimi so za lažje prepoznavanje in iskanje v bazi encimov definirani s štirimi številkami,

npr. EC 2.7.1.1 (ang. Enzyme Commission number), kjer nam prvo število pove, v katerega

izmed šestih razredov uvrščamo encim, drugo število je podrazred encima, tretje število

podpodrazred encima in četrto število je serijska številka encima v podpodrazredu. Encimi

imajo skupno končnico -aza (celulaza, hidrolaza, reduktaza ...).18

V tabeli 1 so prikazane

skupine encimov, ki jih delimo glede na tip reakcije.


25

Tabela 1: Razdelitev encimov v skupine glede na tip reakcije:

Encimi s svojo katalitično funkcijo niso omejeni le na reakcije v celicah. Uporabljamo jih v

prehrambeni, tekstilni in kemični industriji. Encimi se vedno bolj uporabljajo v zdravstvu in

za odstranjevanje odpadnih snovi. V zdravstvu uporabljajo encim deoksiribonukleazo za

zdravljenje cistične fibroze. V prehrambeni industriji uporabljajo amilazo, ki povzroča razpad

škroba. Ta lastnost se izkorišča pri proizvodnji nizkokaloričnega piva in za bistrenje sokov in

vina. Motnost sadnih sokov povzročata škrob in celuloza, ker so molekule zaradi svoje

velikosti delno topne v vodi. Encima amilaza in celulaza povzročita razpad škroba in celuloze.

Pri tem nastanejo vodotopni polisaharidi in glukoza. V kmetijstvu se poslužujejo encima

fitaze, katerega dodajajo krmi za živali. Fitaza povzroči sprostitev fosfata iz fitinske kisline in

zato je potrebno krmi dodati manj anorganskega fosfata kot sicer.16

Razred Opis reakcije Reakcijska shema

oksidoreduktaze EC1 prenos elektronov

transferaze EC2 prenos skupin iz ene

molekule na drugo

hidrolaze EC3 razcep vezi s hidrolizo

liaze EC4 adicija na dvojno vez

izomeraze EC5 premestitev skupine znotraj

molekule, da dobimo drugo

izomerno obliko

ligaze EC6 nastanek kovalentnih vezi


26

1.4. CELULOZA

Celuloza je snov, ki je brez vonja in okusa ter netopna v vodi in v večini organskih topil.

Celuloza je strukturni polisaharid in spada v skupino ogljikovih hidratov. Celuloza je

predstavljena s formulo (C6H10O5)n. Molekulo sestavlja linearna veriga 1,4-β-D-glukoznih

enot, ki so med seboj povezane v ekvatorialni verigi z –OH skupino na C1 in C4 ogljikovem

atomu. Molekula celuloze je kiralna molekula in ima širok spekter uporabnosti. Naravna

celuloza vsebuje tako kristalinična kot amorfna področja. Stopnja kristaliničnosti je odvisna

od vira celuloze in vsebnosti kristaliničnih regij, ker na teh delih težje poteče hidroliza.

Celulozni materiali so za industrijo zanimivi zaradi nizkih stroškov nabave. Znotraj molekule

obstajata dve vrsti vodikovih vezi: inter in intra vezi, ki vplivata na obliko molekule.

Intramolekularne vezi vplivajo na oblikovanost in togost glavne verige. Povprečna velikost

molekule celuloze ima 10 000 do 15 000 glukoznih ostankov. Celuloza je glavna komponenta

celične stene rastlin, rastline pa skupaj predstavljajo 33 % vse biomase. Biosinteza celuloze

poteka tudi v bakterijah in glivah.19

Na sliki 7 je prikazana shema encimske hidrolize

celuloze. Slika 8 nam prikazuje dve verigi celuloze, ki sta med seboj povezani s prečnimi

vodikovimi vezmi.

Slika 7: Encimska hidroliza celuloze19


27

Slika 8: Povezava dveh molekul celuloze s prečnimi vodikovimi vezmi16

1.5. CELULAZE

Celulaze spadajo v razred encimov, ki jih v glavnem proizvajajo glive, bakterije in protozoje,

prav tako pa tudi rastline in živali. Celulaze cepijo molekulo celuloze do osnovnih molekul

glukoze.

Celulaze lahko drugače poimenujemo tudi endoglukanaze, endo-1,4-β-glukanaze,

karboksimetil celulaze (ang. carboxymethyl cellulase; CMCase), endo-1,4-β-D-glukanaze, β-

1,4-glukanaze ali celudekstrinaze.

Obstaja več vrst celulaz, ki cepijo celulozo v β-glukozo:

Endoglukanaze (EC 3.2.1.21), eksoglukanaze (EC 3.2.1.74), celibiohidrolaze (EC 3.2.1.91) in

β-glukozidaze (EC 3.2.1.21):

– endo-β-1,4-glukonaze: cepijo vezi naključno in vlakna razdelijo v več delov;

– celobiohidrolaze: hidroliza celuloze poteka na koncih verige. Pri tem nastanejo

celobiozne enote;

– endo-β-1,4-glukozidaze: razgradijo celobiozne enote v glukozne molekule.19


28

Razgradnja celuloze je večstopenjski hidrolitičen proces. Celulaze (slika 9) se uporabljajo v

industriji in tekstilstvu. V industriji tekstilstva uporabljajo celulaze za odstranjevanje nečistoč,

obdelavo jeansa ali kot dodatek k detergentom za belilni učinek. Z encimi lahko delujemo na

barvana, viskozna ali regenerirana celulozna vlakna.20

Slika 9: Shematski prikaz celulaze21

1.6. MREŽNI POVEZOVALEC – GLUTARALDEHID

Glutaraldehid (GA, pentandial) s kemijsko formulo CH2(CH2CHO)2 je organska spojina, ki

smo jo uporabili pri zamrežitvi oborjenega encima in vsebuje aldehidni skupini. Nahaja se v

obliki prozorne oljnate tekočine z ostrim in sladkim vonjem. Prvo poročanje o molekuli

glutaraldehida je bilo s strani dveh znanstvenikov (C. Harries in L. Frank), ki sta sintetizirala

dialdehid iz ciklopentena, kjer sta dobila več produktov, med katerimi je bil tudi

glutaraldehid. Ker je do takrat molekula GA neraziskana, so se znanstveniki usmerili v

raziskovanje le-te. Danes uporabljamo GA kot fiksativ v elektronski mikroskopiji, kot mrežni

povezovalec za encime in kot razkužilo zdravstvene in zobozdravstvene opreme. GA

uporabljamo tudi kot konzervans, kjer je koncentracija raztopine med 0,1 % in 1,0 %. V

glavnem je na voljo kot vodna raztopina.22

Zamrežitvenih agensov je več, vendar se glutaraldehid uporablja v veliki večini zaradi

enostavne uporabe in nizke nabavne cene.


29

1.1 Sinteza glutaraldehida

Industrijska proizvodnja glutaraldehida, ki ga prikazuje slika 10, poteče v dveh fazah, kjer

pride do reakcije med akroleinom in vinil etil etrom, kjer nastane etoksi dihidropiran, ki v

reakciji z vodo razpade na glutaraldehid in etanol.

Slika 10: Sinteza GA22

GA, ki se uporablja v komercialne namene, se nahaja v obliki vodne raztopine. Z uporabo

magnetne resonance so ugotovili, da so v vodni raztopini prisotne enake količine hemiacetata,

dihidrata in cikličnega hemiacetala (slika 11).23

V tabeli 2 so napisane fizikalne lastnosti

glutaraldehida.

Slika 11: Oblike GA v vodni raztopini23


30

Tabela 2: Fizikalne lastnosti glutaraldehida24

Fizikalne lastnosti:

tališče –6 °C

vrelišče 189 °C pri tlaku 101,3 kPa

gostota 947 kg/m3

topnost voda, etanol, kloroform, ocetna kislina, eter

in druga organska topila

uporaba kot razkužilo in kot zamrežitveni reagent

nevarnosti močni hlapi, ki dražijo nos, oči in kožo

vnetljivost ne


31

2.7. OBARJANJE IN OBARJALNI AGENSI

Kemijsko obarjanje vključuje dodajanje snovi, katerim se v stiku dveh raztopin spremeni

fizikalna struktura raztopljenih in neraztopljenih snovi. Neraztopljene snovi se pri tem

posedejo na dno. Obarjanje proteinov je postopek, kjer ločujemo encim iz reakcijske zmesi s

pomočjo ustreznega topila, ki povzroči, da encim preide v netopno obliko (slika 12).

Vrste obarjanja:

– S solmi, kjer visoka koncentracija soli vpliva na vodne molekule, ki se nahajajo v okolici

proteinov. S tem se spremenijo elektrostatske sile, ki vplivajo na topnost encimov. Z

amonijevim sulfatom lahko učinkovito koncentriramo encim in zato je amonijev sulfat

najbolj uporabljen obarjalni reagent. Optimalno koncentracijo soli za obarjanje moramo

določiti eksperimentalno, vrednost koncentracije je lahko 20–80 % nasičenosti.

– Z organskimi topili nastane redukcija dielektrične konstante medija, pri katerem poteka

reakcija. Hidratacija vodnih molekul okoli encima se spremeni in posledično pride do

povečane interakcije s proteini. Kot topili se običajno uporabljata etanol ali aceton. Paziti

moramo le na koncentracijo topila in temperaturo, pri kateri reakcija poteka.

– S polimeri, pri katerih običajno uporabljamo polietilenimine in polietilenglikole z

različnimi molskimi masami. Način obarjanja je podoben obarjanju z organskimi topili,

razlikuje se le v hidrataciji vodnih molekul okoli encima.

– Obarjanje v izoelektrični točki. Proteini vsebujejo kislo in bazično skupino. Na topnost

proteinov izrazito vpliva pH okolja in zato je topnost najnižja v IP, kjer je neto naboj

enak 0.25


32

Slika 12: Potek obarjanja

2.7.1. OBARJALNI REAGENTI

Za obarjanje smo uporabili naslednje obarjalne reagente:

– metanol,

– etanol,

– propanol,

– 2-propanol,

– aceton,

– amonijev sulfat,

– tetrahidrofuran,

– DMSO,

– PEG 1500,

– PEG 6000,

– PEG 10000,

– PEG 20000,

– kloroform,

– n-heptan,

– heksan,


33

– dimetileter,

– butanol,

– acetonitril,

– dekanol.

Nadaljnje sledi opis obarjalnih reagentov, pri katerih je bilo obarjanje uspešno in z uporabo

katerih smo uspešno sintetizirali CLEAs.

METANOL:

– molekulska formula: CH30H;

– je najenostavnejši alkohol in je pri standardnih pogojih lahko hlapna, prozorna in hitro

vnetljiva tekočina, ki ima podoben vonj kot etanol. Metanol nastaja kot stranski

produkt anaerobnega metabolizma pri določenih vrstah bakterij;

– druga imena za metanol: metilni alkohol, hidroksimetan, lesni alkohol (nekoč so

metanol pridobivali z destilacijo lesa);

– uživanje metanola lahko povzroči pri ljudeh komo ali smrt, saj se le-ta v človeških

prebavilih spremeni v mravljično kislino in njene soli, ki so za osrednji živčni sistem

strupene;

– uporablja se kot topilo za ekstrakcijo.26

ETANOL:

– molekulska formula: C2H5OH;

– pri sobni temperaturi je prozorna, vnetljiva in lahko hlapna tekočina, značilnega vonja;

– etanol velikokrat imenujemo kar alkohol in se pojavlja v alkoholnih pijačah;

– uporabljamo ga kot topilo in razkužilo;

– majhne količine etanola znižujejo holesterol, preprečujejo infarkt in diabetes;

– etanol v večjih količinah deluje kot strup.26

PROPANOL:

– molekulska formula: C3H7OH;

– je prozorna, lahko vnetljiva in hitro hlapna tekočina;

– hlapi propanola so težji od zraka, zato se hlapi zbirajo pri tleh;

– uporablja se kot topilo v proizvodnji barv in kozmetike, kot tudi v črnilu (tiskarskem);


34

– uporabljajo ga v proizvodnji pesticidov;

– izpostavljenost propanolu lahko povzroči glavobol, zaspanost in vnetja oči, nosu ter

žrela.26

ACETON:

– molekulska formula: C3H6O;

– najenostavnejši keton;

– prozorna, lahko hlapna in lahko vnetljiva tekočina;

– tekočina, značilnega vonja;

– pomembno industrijsko in laboratorijsko topilo, saj se meša s skoraj vsemi organskimi

topili;

– v majhnih količinah ga najdemo v človeškem telesu, saj nastaja pri razgradnji maščob

in ogljikovih hidratov.26

AMONIJEV SULFAT:

– molekulska formula: (NH4)2SO4;

– nahaja se v trdnem stanju, v obliki majhnih belih granul in je vodotopen;

– čistost uporabljenega laboratorijskega amonijevega sulfata je 99,5 %;

– raztopino amonijevega sulfata smo si pripravljali sproti, saj je spojina higroskopna in

vpija vodo iz zraka.27


35

2. REAGENTI IN METODE

REAGENTI:

– aceton,

– butanol,

– 2-propanol,

– metanol,

– etanol,

– PEG 1500,

– PEG 6000,

– PEG 20000,

– DMSO,

– kloroform,

– n-heptan,

– heksan,

– acetonitril,

– dimetilster,

– tetrahidrofuran (THF),

– dekanol,

– albumin iz kokošjih jajc, Sigma,

– glutaraldehid, Sigma,

– PBS (fosfatni pufer),

– citratni pufer,

– acetatni pufer,

– encim celulaza,

– PEHA,

– NaBH3CN,

– acetatni pufer,

– Bradfordov reagent,

– Coomasie Brilliant Blue barvilo (Merck),

– glukoza,

– amonijev sulfat,


36

– miliQ voda,

– Sigmacell solution.

LABORATORIJSKA OPREMA:

– tehtnica, Rotamix 550 MMH,

– vorteks (Mikro+Polo),

– avtomatska pipeta (Transferpette),

– pH meter,

– UV-VIS spektrofotometer (Varian, Cary 50 Probe),

– centrifuga (Ependorf Centrifuge 5804R),

– stresalnik (Heidolph Unimax 1010),

– centrifugirka,

– epruveta,

– mikrocentrifugirka,

– termometer,

– merilni valj,

– ultrazvočna kopel,

– parafinska kopel.


37

3. EKSPERIMENTALNE METODE

4.1. PRIPRAVA REAGENTOV ZA AKTIVNOSTNI TEST

PRIPRAVA RAZTOPINE PEHA:

Ker je raztopina PEHA zelo viskozna tekočina, moramo biti pri pipetiranju zelo previdni.

Pripravili smo 0,1 M raztopino. V 40 mL miliQ vode smo odpipetirali 1,22 mL PEHA, dobro

premešali in z miliQ vodo dopolnili do 50 mL. Z 1 M HCl smo znižali pH na 6,4.

PRIPRAVA RAZTOPINE NaBH3CN:

Priprava NaBH3CN poteka v digestoriju z obvezno uporabo rokavic. Ker smo želeli 0,1 M

raztopino, smo zatehtali 0,3142 g NaBH3CN in ga raztopili v 50 mL miliQ.

PRIPRAVA REAGENTOV ZA AKTIVNOSTNI TEST:

REAGENT A: v čašo smo nalili 500 mL miliQ vode in dodali 50 mM natrijevega acetatnega

pufra. Najprej smo zatehtali 2,05 g brezvodnega natrijevega acetata, dodali 400 mL vode,

dodali magnetno mešalo in segreli na 37 °C. Nato smo umerili pH meter po standardnem

postopku in po kapljicah dodajali 1 M HCl do pH 5. Vsebino čaše smo prelili v bučko in

dopolnili z miliQ do končnega volumna 500 mL.

REAGENT B: V čašo smo zatehtali 10 g Sigmacell Solution (5 % v 200 mL) in ga razredčili

z reagentom A do oznake v 200-mL bučki.

REAGENT C: tekoča celulaza.

REAGENT D (glukoza): reagent (v prahu) smo raztopili v 20 mL miliQ vode.

RAZTOPINA AMONIJEVEGA SULFATA: uporabili smo 95 % raztopino amonijevega

sulfata. V 50 mL miliQ vode smo zatehtali 20,66 g (NH4)2SO4.


38

PRIPRAVA PUFROV:

Pufrne raztopine so pomembne, saj v organizmih uravnavajo pH okolje za encime. Mnogo

encimov je aktivnih le pod strogo določenimi pogoji. Če se pogoji delovanja encimov

spremenijo, lahko pride do upočasnjenih reakcij ali celo do denaturacije encima, kjer izgubi

encim vso svojo aktivnost. V večini bioloških poskusov uporabljamo pufer PBS pri pH =

7,4.28

Pri laboratorijskem delu smo uporabili tri vrste pufrov:

ACETATNI PUFER (50 mM, pH 5)

Pripravili smo acetatni pufer z množinsko koncentracijo 50 mM in pH 5. Za 500 mL raztopine

smo potrebovali 2,05 g natrijevega acetata (CH3COONa). V čašo smo nalili 400 ml miliQ

vode in dodali natrijev acetat. Nato smo dodali mešalo in segreli raztopino na 37 °C. pH

raztopine smo znižali z dodajanjem 1 M HCl do pH 5. Končno raztopino smo vlili v valj in

dodali miliQ vodo do oznake 500 ml.

CITRATNI PUFER (50mM, pH 4,8)

Pripravili smo citratni pufer s koncentracijo 50 mM in pH 4,8. Za 500 mL raztopine smo

potrebovali 4,8 g citronske (C6H8O7) kisline. V čašo smo nalili 400 mL miliQ vode, dodali

4,8 g citronske kisline in umerili pH na 4,8 z 1 M NaOH. Dobljeno raztopino smo prelili v

merilno bučko in jo dopolnili z miliQ vodo do 500 mL.

FOSFATNI/ PBS PUFER (20mM, pH 7)

Pripravili smo PBS pufer koncentracije 20 mM in pH 7. Za 500 mL raztopine smo potrebovali

1,38 g natrijevega dihidrogenfosfata-monohidrata (NaH2PO4 * H2O). V čašo smo nalili 400

mL miliQ vode, dodali 1,38 g NaH2PO4 * H2O in umerili pH na 7 z 1 M NaOH. Nato smo

prelili raztopino v merilno bučko in dopolnili z miliQ do 500 mL.


39

3.2. PRIPRAVA PROSTEGA ENCIMA IN SINTEZA ZAMREŽENIH

ENCIMSKIH SKUPKOV (CLEAs)

1) Priprava prostega encima

Uporabljali smo encimski preparat Cellusoft Cellulase (EC 3.2.1.4, Novozymes A/S Danska)

v tekoči obliki. Pri aktivnostnem in Bradfordovem testu smo iz encimske raztopine

odpipetirali 100 µL vzorca in ga razredčili z 900 µL pufra PBS. Od tako pripravljene

raztopine prostega encima smo za Bradfordov test odpipetirali 20 µL. V aktivnostnem testu

smo uporabljali 1 mL encimske raztopine (900 L pufra in 100 L encima).

2) Sinteza zamreženih encimskih skupkov

Pripravili smo zamrežene encimske skupke iz encima celulaze. Potek dela je bil sestavljen iz

obarjanja in zamreženja. Pri postopku obarjanja smo najprej zatehtali v mikrocentrifugirko 17

mg albumina in dodali 1 mL pufra PBS pH 7,0. Albumin (EA) je ogrodni protein in poviša

stabilnost –NH2 skupin na molekuli. Prazne MC smo postavili na stojalo in vanje odpipetirali

100 µL raztopine encima in 100 µL raztopljenega albumina. Na magnetnem mešalu smo

mešali 20 minut. Po 20 minutah smo dodali 200 µL raztopine PEHA in ponovno mešali 20

minut. PEHA je snov, ki poveča število prostih –NH2 skupin na encimu. V prazne MC smo

odpipetirali 900 µL obarjalnega reagenta (metanol, etanol, propanol, aceton in amonijev

sulfat) in vanje po kapljicah dodajali raztopino albumina, encima in PEHA. Dobljeno

suspenzijo smo mešali nadaljnjih 40 minut. Postopku obarjanja je sledil postopek zamreženja,

kjer smo oborjeni raztopini albumina, encima in PEHA dodali 57 µL (1 %) GA in mešali 3

ure. Po 3 urah smo dodali 100 µL raztopine NaBH3CN in mešali dodatnih 40 minut.

NaBH3CN je reagent, ki nam zaključi reakcijo zamreženja oborjenega encima in kjer se

stabilizirajo intermolekularne vezi v nastalih agregatih, da CLEAs po centrifugiranju ne

razpade. Po končanem mešanju smo MC centrifugirali 10 minut pri 12000 rpm, kjer so se

trdni delci posedli na dno MC. Supernatant smo odlili v prazno MC, oborino encimskih

skupkov pa suspendirali v 1mL pufra PBS pH 7,0 in ponovno centrifugirali 10 minut. Sledil

je Bradfordov test, kjer smo določili koncentracijo proteinov v supernatantu in spiranjih, ter

aktivnostni test, kjer smo izmerili aktivnost prostega encima in jo primerjali z aktivnostjo

resuspendiranega encima po zaključeni reakciji obarjanja.


40

CLEAs smo pripravili z različnimi začetnimi koncentracijami GA z namenom optimiranja

aktivnosti CLEAs. Potrebno koncentracijo GA smo izračunali po enačbi (1):

(1)

w … masni delež

0,25 … koncentracija glutaraldehida

1,3 … skupni volumen pred dodatkom glutaraldehida

x … količina glutaraldehida

Na sliki 13 so prikazane centrifugirke, v katerih smo imeli CLEAs z uporabo obarjalnega

reagenta etanola (skrajno levo), spiranja v sredini in pufer PBS (skrajno desno) za primerjavo.

Slika 13: CLEAs z obarjalnim reagentom etanolom, spiranja in pufer PBS


41

3.3. DOLOČANJE UČINKOVITOSTI IMOBILIZACIJE

Koncentracijo proteinov smo določili po Bradfordovi metodi v raztopini prostega encima,

supernatantu in obeh spiranjih. Bradfordova metoda temelji na dejstvu, da se barvilo

Comassie brilant modro G-250 specifično veže na protein. Rdeča barva barvila se spremeni v

modro, s tem pa se spremeni absorpcijski maksimum barvila s 465 nm na 595 nm.

Absorbance smo merili pri 595 nm na UV-VIS spektrofotometru, s programom Advanced

reads.

Pred začetkom prvih meritev smo pripravili umeritveno krivuljo za Bradfordov reagent. To

smo storili tako, da smo zatehtali 10 mg albumina in ga razredčili z 1 mL miliQ vode. V 6

praznih MC smo pripravili naslednje vzorce:

1. 1000 µL miliQ vode

2. 980 µL miliQ vode + 20 µL albumina





Nato smo v šest praznih MC odpipetirali 1 mL Bradfordovega reagenta (sobna temperatura)

in v vsako MC dodali 20 µL ustreznega vzorca. Vzorce smo dobro premešali in jim po 5

minutah izmerili absorbance. Na podlagi dobljenih vrednosti smo narisali umeritveno krivuljo

(PRILOGA).


42

IZRAČUN UČINKOVITOSTI IMOBILIZIRANEGA ENCIMA

Pripravili smo zamrežene encimske skupke. Po končani sintezi smo po centrifugiranju

vzorcev dobili supernatant, spiranje 1 in spiranje 2. S pomočjo Bradfordovega reagenta smo

izmerili absorbanco vzorcev (supernatant in spiranja), kjer smo v 1mL Bradfordovega

reagenta dodali 20 µL posameznega vzorca, počakali 5 minut in na UV-VIS spektrofotometru

izmerili absorbanco pri valovni dolžini 595 nm.

Sledili so izračuni, kjer smo posamezne absorbance delili s koeficientom naklona umeritvene

krivulje Bradfordovega reagenta in dobili pripadajočo koncentracijo. To koncentracijo smo

odšteli od koncentracije vzorca proste celulaze in dobili koncentracijo CLEAs. Koncentracijo

CLEAs smo delili s koncentracijo celulaze in dobili učinkovitost v % (enačba 2).

Postopek:

(2)

Slika 14 nam prikazuje, kako se je spremenila barva vzorcev glede na vsebnost proteinov v

posameznem vzorcu.

Slika 14: Prikaz obarvanosti spiranj z Bradfordovim reagentom. Od leve proti desni si sledijo

slepi vzorec (PBS), supernatant in spiranja.


43

3.4. DOLOČANJE SPECIFIČNE AKTIVNOSTI KATALIZATORJA

HIDROLIZA CELULOZE:

Slika 15: Hidroliza celuloze

Kjer je: ATP= adenozin-5 -trifosfat

ADP= adenozin-5 -difosfat

β-NAD= β.nikotinamid adenin dinukleotid, oksidirana oblika

β-NADH= β.nikotinamid adenin dinukleotid, reducirana oblika

G-6PDH= glukoza 6-fosfat dehidrogenaza

G-PG= 6-fosfo-D-glukanat

Slika 15 prikazuje hidrolizo celulaze, kjer celuloza razpade na D-glukozo, kjer pa ne moremo

direktno meriti nastale količine D-glukoze. D-glukozo merimo v reakcijah, kjer sodelujeta

heksokinaza in G-6PDH. Glukoza je fosfolizirana z adenozin trifosfatom v reakciji, ki jo

katalizira heksokinaza. D-glukoza 6-fosfat se oksidira v 6-PG v prisotnosti oksidiranega

NAD. Ta reakcija poteka v prisotnosti G-6PDH. Iz molekule NAD, nastane NADH. Pri

340nm pride do povišanje koncentracije NADH. Sama hidroliza celuloze temelji na dejstvu,

da več kot je v merjenem vzorcu prisotne D-glukoze, višja bo količina nastalega NADH in

posledično bo višja tudi izmerjena absorbanca. (Povzeto po Enzymatic Assay of Cellulase,

Sigma quality control test procedure)

Aktivnost prostega encima in CLEAs smo določali z merjenjem absorbanc na UV-VIS

spektrofotometru, s programom Kinetics pri valovni dolžini 340 nm. Aktivnostni test je bil

sestavljen iz dveh korakov. V prvem koraku smo v termostatirane centrifugirke (vodna kopel,

37 °C) odpipetirali 4 mL raztopine Sigmacella. V aktivnostnem testu smo merili tri vzorce:

CLEAs, raztopino prostega encima in slepi vzorec. V slepi vzorec smo odpipetirali 1 mL


44

pufrne raztopine PBS s pH 7.0, v drugi vzorec smo odpipetirali 1 mL raztopine prostega

encima, v zadnji vzorec pa smo odpipetirali 1 mL CLEAs. Centrifugirke smo vpeli na

stresalnik (slika 16), ki smo ga predhodno segreli na 37 °C. Stresanje je potekalo 2 uri pri 300

rpm. Po končanem stresanju smo centrifugirke dali takoj v ledeno kopel (ledena kopel

zaključi reakcijo) in jih centrifugirali 2-krat po 2 minuti pri 20 °C in 11000 rpm. Supernatant

smo prelili v epruveto. V drugem koraku aktivnostnega testa smo v prazne MC pripravili 750

µL reagenta D. Iz supernatanta, ki smo ga predhodno prelili v epruvete, smo odpipetirali 25

µL ter dodali k reagentu D. Vzorce smo premešali in izmerili absorbanco pri času 2,5 minute.

Slika 16: Slika stresalnika

Z izmerjeno absorbanco smo izračunali aktivnost encima po enačbi (3). Najpogosteje

uporabljena enota za izražanje aktivnosti encima je enota/mL encima (ang. U/mL enzyme;

IU – International Unit; enzyme unit). Enota/mL encima je definirana kot količina encima, ki

je potrebna za pretvorbo substrata v produkt in se meri v mikromolih encima na minuto. Pri

tej definiciji moramo opozoriti, da se enote encima nanašajo na količino transformiranega

substrata in ne na njegovo koncentracijo. Izraz specifična aktivnost uporabljamo pri

opisovanju čistosti in aktivnosti encima. Specifična aktivnost je definirana kot enota encima

na miligram proteina. Molekulska aktivnost encima pa je izražena kot enota encima na

mikromol encima. Če poznamo molekulsko maso encima in njegovo čistost, lahko

izračunamo molekulsko aktivnost s pomočjo specifične aktivnosti.29


45

(3)

Kjer je:

… absorbanca pri 340 nm

0,775 …. skupni volumen glukoze in vzorca pri merjenju aktivnosti

df … dilution factor ali faktor redčenja (v našem primeru 1)

6,22 … milimolarni koeficient β-NADH pri 340 nm

2 … faktor preračunavanja z 2 na 1 uro na enoto/ml encima

1 … volumen celulaze

0,025 …. volumen vzorca, ki smo ga merili pri aktivnostnem testu

IZRAČUN SPECIFIČNE AKTIVNOSTI CLEAs

Po končanem aktivnostnem testu smo izmerili absorbanco prostega encima in CLEAs pri

valovni dolžini 340 nm. Iz enačbe (4), kjer je delež raztopine prostega encima 100 %, smo

izračunali specifično aktivnost CLEAs v odstotkih.

(4)


46

3.5. STABILNOST IMOBILIZIRANEGA ENCIMA

Ugotavljali smo, ali lahko zamrežene encimske skupke v reakcijah večkrat uporabimo in

kolikokrat, da bo imobiliziran encim še vedno aktiven. Prednost imobilizacije je med drugim

večkratna uporaba imobiliziranega encima. Glede na to, da smo imeli več obarjalnih

reagentov, smo pripravili CLEAs z vsakim obarjalnim reagentom, kjer je v reakciji obarjanja

nastala oborina. Aktivnost encima smo merili v U/mL encima. Po aktivnostnem testu (2 h, 37

°C in 300 rpm) in centrifugiranju smo ves supernatant odstranili in tega nadomestili s 3,2 mL

acetatnega pufra. Količino acetatnega pufra smo predhodno določili tako, da smo v

centrifugirko odpipetirali 4 mL raztopine Sigmacell Solution, ga centrifugirali in odlili ves

supernatant. Prav tako pa smo dodali 1 mL PBS pufra, zaradi postopka priprave zamreženih

skupkov. Po dodatku obeh pufrov je ponovno sledil aktivnostni test (2 h, 37 °C in 300 rpm).

Vsak naslednji cikel je sledil enakemu postopku.


47

5. REZULTATI

5.1. VPLIV PUFRA NA AKTIVNOST ENCIMA CELULAZE

Zanimalo nas je, ali različni pufri vplivajo na aktivnost celulaze. Pri raziskovanju vpliva pufra

na aktivnost celulaze smo uporabili acetatni (50 mM, pH 5), citratni (50 mM, pH 4,8) in PBS

(20 mM, pH 7) pufer. Aktivnostni test smo izvedli na stresalniku, kjer je test potekal 2 h pri

37˚ C s hitrostjo stresanja 300 rpm. Poskus smo izvedli tako, da smo v 975 µL pufra

odpipetirali 25 µL celulaze. Dobljene vrednosti smo podali v U/mL encima.

Ugotovili smo, da so odstopanja med aktivnostjo celulaze v različnih pufrih zelo majhna,

vendar dosežemo najvišjo aktivnost celulaze pri uporabi PBS pufra. Na sliki 17 vidimo, da je

bila aktivnost encima z uporabo PBS pufra 6,74 U/mL encima, z uporabo acetatnega pufra

6,66 U/mL encima in z uporabo citratnega pufra 6,55 U/mL encima. Zato smo za nadaljnje

reakcije uporabljali pufer PBS.

Slika 17: Vpliv pufra na aktivnost prostega encima


48

5.2. UPORABA RAZLIČNIH OBARJALNIH REAGENTOV

Uporabili smo naslednje obarjalne reagente: aceton, metanol, etanol, propanol, 2-propanol,

butanol, raztopino amonijevega sulfata, DMSO, PEG 1500, PEG 6000, PEG 20000,

kloroform, n-heptan, heksan, dekanol, dimetileter, acetonitril in THF.

Rezultati obarjanja encima celulaze so prikazani v tabeli 3. Obarjanje je potekalo tako, da smo

v 900 µL obarjalnega reagenta odpipetirali 100 µL raztopine celulaze.

V tabeli smo kot rezultat obarjanja zabeležili da ali ne, kjer da pomeni tvorbo oborine (slika

18) in ne pomeni reakcijo, kjer ni prišlo do tvorbe oborine (slika 19). Tvorba oborine pomeni,

da smo po obarjanju dobili motno raztopino, kar smo videli pri uporabi obarjalnega reagenta

acetona, metanola, etanola, 2-propanola in amonijevega sulfata. Pri obarjanju celulaze v

kloroformu, n-heptanu, heksanu, dimetiletru in butanolu sta nastali dve ločeni fazi, ki se med

seboj nista mešali. Pri uporabi obarjalnih reagentov dimetil sulfoksida-DMSO, PEG 1500,

PEG 6000, PEG 20000 se je celulaza popolnoma raztopila in smo dobili eno˗fazni sistem. V

primeru uporabe obarjalnih reagentov acetonitrila in tetrahidrofurana-THF pa so nastali

sprijeti delci na dnu MC, katere je bilo težko ločiti.

Slika 18: Prikaz pozitivnih reakcij obarjanja z različnimi obarjalnimi reagenti


49

Slika 19: Prikaz reakcij obarjanja, kjer celulaza v stiku z obarjalnim reagentom ni tvorila

oborine.

Tabela 3: Uspešnost obarjalnih reakcij

OBARJALNI REAGENT TVORBA OBORINE (da, ne)

aceton da

metanol da

etanol da

propanol da

2- propanol da

butanol ne

amonijev sulfat da

DMSO ne

PEG 1500 ne

PEG 6000 ne

PEG 20000 ne

kloroform ne

n- heptan ne

heksan ne

dekanol ne

dimetileter ne

acetonitril ne

THF ne


50

5.3. DOLOČANJE AKTIVNOSTI RESUSPENDIRANEGA ENCIMA PO

OBARJANJU

Zanimala nas je aktivnost resuspendiranega encima po obarjanju. Uporabili smo tiste

obarjalne reagente, kjer smo dobili oborino v reakciji obarjanja. Eksperiment je potekal tako,

da smo k 900 µL obarjalnega reagenta odpipetirali 100 µL raztopine celulaze. Dobljeno

suspenzijo smo centrifugirali, pri čemer smo supernatant zavrgli, oborino pa dvakrat sprali z 1

mL pufra PBS. Po spiranjih smo dodali 1 mL pufra PBS in tako dobljeno suspenzijo uporabili

v aktivnostnem testu (2h, 37 °C, 300 rpm). V tabeli 4 in na sliki 20 so predstavljeni rezultati

določanja aktivnosti resuspendiranega encima po obarjanju.

Tabela 4: Aktivnost resuspendiranega encima po obarjanju

Obarjalni reagent Potek eksperimenta Aktivnost (%)

etanol 100 µL celulaze + 900 µL etanola 83,74

aceton 100 µL celulaze + 900 µL acetona 83,35

metanol 100 µL celulaze + 900 µL metanola 78,70

2-propanol 100 µL celulaze + 900 µL 2-propanola 82,68

Propanol 100 µL celulaze + 900 µL propanola 84,26

amonijev sulfat 100 µL celulaze + 900 µL amonijevega sulfata 79,25

Slika 20: Aktivnost resuspendiranega encima po obarjanju


51

S slike 20 je razvidno, da je bila aktivnost nezamrežene celulaze visoka. Najnižja aktivnost

resuspendiranega encima po obarjanju je bila pri uporabi obarjalnega reagenta metanola 78,7

% in amonijevega sulfata 79,3 %. Najvišja aktivnost resuspendiranega encima po obarjanju

je bila pri uporabi obarjalnega reagenta propanola 84,3 %. Aktivnost resuspendiranega encima

po obarjanju pri uporabi obarjalnega reagenta etanola je bila 83,7 %, pri uporabi acetona 83,4

% in pri uporabi obarjalnega reagenta 2-propanola 82,7 %

5.4. SINTEZA CLEAs Z UPORABO RAZLIČNIH OBARJALNIH

REAGENTOV

5.4.1. Vpliv uporabe različnih obarjalnih reagentov na učinkovitost imobilizacije in

aktivnost zamreženih encimskih skupkov

V prvem delu smo pripravili zamrežene encimske skupke z začetno koncentracijo GA 1 %,

pri čemer smo uporabili različne obarjalne reagente: metanol, aceton, propanol, 2-propanol,

etanol in amonijev sulfat (slika 21). Iz rezultatov učinkovitosti imobilizacije (slika 22)

vidimo, da se je največ encima zamrežilo pri uporabi obarjalnega reagenta etanola, in sicer

80,9 %. Najmanj encima se je zamrežilo pri uporabi obarjalnega reagenta amonijevega

sulfata, kjer je bila učinkovitost imobilizacije samo 36,5 %. Aktivnost zamreženih skupkov je

bila precej nizka, in sicer najvišja pri uporabi obarjalnega reagenta propanola (55,5 %) in

najnižja pri uporabi obarjalnega reagenta acetona (2,2 %).

Slika 21: Prikaz produkta sinteze CLEAs ob uporabi različnih obarjalnih reagentov


52

Slika 22: Primerjava aktivnosti CLEAs in učinkovitosti imobilizacije z uporabo različnih

obarjalnih reagentov

5.4.2. Primerjava aktivnosti resuspendiranega encima z aktivnostjo zamreženih

encimskih skupkov

V naslednjem koraku smo primerjali aktivnosti resuspendiranega encima in aktivnost

sintetizirane CLEAs (uporaba 1% GA, obarjalni reagenti: aceton, metanol, etanol, propanol,

2-propanol, amonijev sulfat). S slike 23 je razvidno, da so aktivnosti nezamreženega

resuspendiranega encima pri uporabi vseh obarjalnih reagentov višje, kot so aktivnosti

sintetiziranih CLEAs. Aktivnosti resuspendiranega encima po obarjanju so med 78 in 85 %,

medtem ko so aktivnosti CLEAs precej različne, od 2 do 55 %. CLEAs z najnižjo aktivnostjo

(2,2 %) smo sintetizirali z obarjalnim reagentom acetonom, CLEAs z najvišjo aktivnostjo

(55,5 %) pa z obarjalnim reagentom propanolom. Razlaga za tako veliko odstopanje

aktivnosti med resuspendiranim encimom in CLEAs je v tem, da so pri nezamreženem

encimu vsa prosta aktivna mesta lahko dostopna za reakcije, medtem ko se pri zamreženju

encima nekatera prosta aktivna mesta skrijejo v notranjost encimskih agregatov in zato ta

aktivna mesta ne morejo sodelovati v reakcijah.


53

Med reagenti, kjer smo dobili oborino v fazi obarjanja, imamo več spojin, ki sodijo v skupino

alkoholov. Zanimalo nas je, ali obstaja kakšna povezava med številom C-atomov v verigi

alkohola in aktivnostjo CLEAs. Ali je CLEAs z uporabo alkohola z več C-atomi aktivnejša

kot CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta alkohola z manj C-atomi? Pri primarnih alkoholih

vidimo, da aktivnost CLEAs upada od verige z več C-atomi do verige z manj C-atomi

(propanol > etanol > metanol). V primeru uporabe sekundarnega alkohola kot obarjalnega

reagenta je aktivnost CLEAs nižja kot pri uporabi primarnih alkoholov (slika 23).

Slika 23: Primerjava aktivnosti resuspendiranega encima z aktivnostjo CLEAs ob uporabi

različnih obarjalnih reagentov


54

5.4.3. Proučevanje vpliva večkratne uporabe CLEAs na njegovo preostalo aktivnost

ob uporabi različnih obarjalnih reagentov

Slika 24: Vpliv večkratne uporabe CLEAs na preostalo aktivnost ob uporabi različnih

obarjalnih reagentov

Na sliki 24 abscisa prikazuje število ponovitev reakcij, ordinata pa prikazuje preostalo

aktivnost CLEAs v U/mL encima. Na sliki 24 so prikazane preostale aktivnosti CLEAs, ki

smo jih pripravili z uporabo različnih obarjalnih reagentov, kjer je bila začetna koncentracija

GA 1%. Raztopino prostega encima smo pripravili tako, da smo v 900 µL odpipetirali 100 µL

raztopine celulaze.

Trdimo lahko, da so zamreženi encimski skupki z izbranimi obarjalnimi reagenti stabilni, saj

preostala aktivnost postopoma upada. Z uporabo obarjalnega reagenta propanola smo

sintetizirali CLEAs z najvišjo aktivnostjo, vendar ta CLEAs ni tako stabilna kot so CLEAs, ki

smo jih sintetizirali z ostalimi obarjalnimi reagenti, saj preostala aktivnost CLEAs z uporabo

propanola upada hitreje v primerjavi z drugimi CLEAs. Stabilnejši sta CLEAs z uporabo

metanola in etanola, kjer aktivnost CLEAs upada postopoma in ni tako velikih sprememb v

preostali aktivnosti CLEAs, kot pri CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta propanola.

Preostala aktivnost se je po več reakcijah najmanj spremenila pri uporabi obarjalnega reagenta

metanola, kjer je preostala aktivnost po 10. reakciji upadla iz 1,6 U/mL encima na 0,7 U/mL

encima.


55

V tabeli 5 so zapisane razpolovne dobe sintetiziranih CLEAs. Razpolovni čas oziroma

razpolovna doba je določanje postopnega razpadanja snovi. To je čas, v katerem se aktivnost

vzorca zniža za ½ začetne vrednosti.

Tabela 5: Razpolovna doba CLEAs z uporabo različnih obarjalnih reagentov

Obarjalni reagent Razpolovna doba

CLEAs etanol 8. cikel

CLEAs metanol 8. cikel

CLEAs propanol 7. cikel

CLEAs amonijev sulfat 6. cikel

5.4.4. Opazovanje in primerjanje velikosti CLEAs z uporabo različnih obarjalnih

reagentov pod optičnim mikroskopom

Po končanem postopku zamreženja encimskih skupkov smo ugotovili, da se CLEAs med

seboj razlikujejo po barvi in obliki skupkov. Odločili smo se, da CLEAs, pripravljene z

različnimi obarjalnimi reagenti, pogledamo pod optičnim mikroskopom (tabela 6) in jim

določimo povprečno velikost delcev.

Pri uporabi metanola kot obarjalnega agensa najdemo tako majhne kot velike agregate.

Večina agregatov meri približno 80 µm. CLEAs, sintetizirane z uporabo metanola kot

obarjalnega reagenta, so precej krhke in jih lahko brez problemov ločimo.

Pri CLEAs, kjer smo uporabili etanol kot obarjalni reagent, so dobljeni zamreženi skupki

približno enake velikosti in merijo v povprečju 43 µm. Po obliki in barvi sta CLEAs z

uporabo obarjalnih reagentov etanola in metanola precej podobni. CLEAs z uporabo

obarjalnega reagenta etanola je krhka in lahko skupke brez problema ločimo in zdrobimo.

Propanol je edini obarjalni reagent, kjer v povprečju opazimo enakomerno velikost agregatov.

Po obliki agregatov se CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta propanola razlikuje od vseh

ostalih po zvezdasti obliki delcev.

CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta 2-propanola ima tako kot CLEAs z uporabo

obarjalnega reagenta propanola bolj zvezdasto obliko delcev, vendar je razlika v tem, da so

pri CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta 2-propanola prisotni tudi večji agregati.


56

Zamreženi encimski skupki so pri CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta acetona krhki in jih

lahko zdrobimo in ločimo, medtem ko agregate pri CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta

amonijevega sulfata težko ločimo, zaradi njihove čvrstosti. Oblika delcev je pri uporabi

obarjalnega reagenta acetona bolj zaobljena kot pri uporabi obarjalnih reagentov propanola in

2-propanola.

Tabela 6: CLEAs z uporabo različnih obarjalnih reagentov, gledana pod optičnim

mikroskopom

OBARJALNI REAGENT: SLIKA: POVPREČNA DOLŽINA

DELCA (µm):

Metanol:

87

Etanol:

43

Propanol:

26

2-propanol:

161


57

V tabeli 7 so v vrstnem redu po velikosti zapisane povprečne velikosti CLEAs, ki smo jih

sintetizirali z uporabo več obarjalnih reagentov. Najmanjše agregate smo izmerili pri CLEAs

z uporabo obarjalnega reagenta propanola, največje delce pa smo izmerili pri CLEAs z

uporabo obarjalnega reagenta 2-propanola.

Tabela 7: Povprečna velikost delcev CLEAs pri uporabi različnih obarjalnih reagentov

Iz rezultatov v tabeli 7 lahko ugotovimo, da CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta etanola

in CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta acetona sestavljajo agregati približno enake

velikosti. Velikost skupkov CLEAs se pri omenjenima obarjalnima reagentoma zelo malo

razlikuje. Pri CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta propanola dobimo najmanjše in najbolj

enakomerne skupke. Pri CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta metanola in obarjalnega

reagenta 2-propanola pa najdemo agregate različnih velikosti. Iz tega bi lahko sklepali, da bo

imela CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta propanola najvišjo aktivnost, zaradi

enakomerne sestave agregatov.

Aceton:

46

propanol < etanol < aceton < metanol < 2-propanol

26µm < 43µm < 46µm < 87µm < 161µm


58

CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta amonijevega sulfata:

Pri CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta amonijevega sulfata nam ni uspelo določiti

velikosti posameznih delcev, ker smo dobili kot produkt en velik sprijet agregat (slika 25),

vendar smo kljub takšni strukturi določili z aktivnostnim testom dokaj visoko aktivnost

CLEAs.

Slika 25: CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta amonijevega sulfata, kjer smo dobili velik in

sprijet agregat.


59

5.5 . VPLIV KONCENTRACIJE MREŽNEGA POVEZOVALCA (GA)

Zanimal nas je vpliv koncentracije GA na učinkovitost imobilizacije in aktivnost CLEAs z

uporabo različnih obarjalnih reagentov. Uporabili smo naslednje obarjalne reagente: etanol,

metanol, propanol in amonijev sulfat. Za sintezo CLEAs smo potrebovali: pufer PBS, začetni

Vcelulaze = 100 µL, konc. albumina γ = 17 mg/mL, VPEHA = 200 µL, Vobar.reagenta = 900 µL,

VNaBH3CN = 100 µL, konc. GA pa smo spreminjali.


metanola

Pri CLEAs z obarjalnim reagentom metanolom smo uporabili naslednje začetne koncentracije

GA: 0,25 %, 0,375 %, 0,5 %, 1 % in 2 %. CLEAs z najvišjo aktivnostjo je bila pri začetni

koncentraciji GA 0,375 %, kjer je bila aktivnost CLEAs 62 %. Kljub najvišji aktivnosti

CLEAs je bila učinkovitost imobiliziranega encima le 69 %. Najvišjo učinkovitost

imobiliziranega encima 79 % smo dobili pri 2 % začetni koncentraciji GA. Kljub najvišji

učinkovitosti imobilizacije smo pri 2 % začetni koncentraciji GA sintetizirali CLEAs z

najnižjo aktivnostjo 10 %. Najnižja učinkovitost imobilizacije (66 %) je bila pri dodatku 0,25

% GA. Slika 26 nam prikazuje učinkovitost imobilizacije in aktivnost CLEAs v odvisnosti od

začetne koncentracije GA.

Slika 26: Primerjava aktivnosti CLEAs in učinkovitosti imobilizacije z obarjalnim reagentom

metanolom v odvisnosti od koncentracije GA


60


etanola

Aktivnost CLEAs z obarjalnim reagentom etanolom je bila najvišja pri uporabi začetne

koncentracije GA 0,0625 %, in sicer 94 %. CLEAs je bila prav tako zelo aktivna pri začetni

koncentraciji GA 0,125 %, kjer je bila aktivnost 91 %. Z višanjem koncentracije GA aktivnost

CLEAs upada. V primeru, kjer je bila koncentracija GA nižja kot 0,0625 % pade aktivnosti

CLEAs iz 94 % na 20 %, ker je bila v tem primeru prenizka koncentracija GA in ta

koncentracija GA ni zadostovala za zamreženje encima. Učinkovitost imobilizacije je najvišja

pri uporabi 0,0313 % GA, in sicer 86 % in najnižja pri uporabi 0,25 % GA, kjer je bila

učinkovitost imobilizacije 63 % (slika 27).


etanolom v odvisnosti od koncentracije glutaraldehida


61


propanola

CLEAs, ki smo jo sintetizirali z obarjalnim reagentom propanolom (slika 28) je bila najbolj

aktivna (84 %) pri koncentraciji GA 0,125 %. Aktivnost zamreženih encimskih skupkov je

upadala med 0,125 % in 2 % koncentracijo GA (aktivnosti CLEAs se gibajo med 35 % in 84

%). Pri koncentracijah 0,125 % in 0,0625 % GA smo opazili, da se je aktivnost CLEAs

znižala s 84 % na 20 %. Učinkovitost imobilizacije je bila najvišja (82 %) pri uporabi 0,0625

% GA, kjer je bila aktivnost CLEAs najnižja (20 %). Pri uporabi 0,25 % GA smo opazili, da

sta bili aktivnost CLEAs in učinkovitost imobilizacije enaki. Pri koncentraciji GA 0,125 %,

kjer je CLEAs najbolj aktivna (84 %), je bila učinkovitost imobilizacije 78 %. Najnižja

učinkovitost imobilizacije (66 %) je bila pri uporabi 1 % GA.


propanolom v odvisnosti od koncentracije glutaraldehida


62

5.5.4. Optimizacija koncentracije GA pri sintezi CLEAs z uporabo obarjalenga reagenta

amonijevega sulfata

Amonijev sulfat je edini izmed štirih obarjalnih reagentov, s katerimi smo sintetizirali

CLEAs, kateri spada med anorganske spojine. 95 % raztopino amonijevega sulfata smo

pripravljali pred vsako sintezo CLEAs. Pri uporabi 2,5 % GA smo sintetizirali najbolj aktivno

CLEAs, katere aktivnost je bila 55 %. Pri uporabi 3 % GA se je aktivnost CLEAs zniža s 55

% na 25 %. S slike 29 je razvidno da je aktivnost CLEAs z nižanjem koncentracije GA

upadala. Najnižja aktivnost CLEAs je bila pri dodatku 0,5 % GA, kjer je bila aktivnosti

CLEAs 7 %. Učinkovitost imobilizacije je bila najnižja pri dodatku 1 % GA in najvišja pri

dodatku 2,5 % GA.


amonijevim sulfatom v odvisnosti od koncentracije glutaraldehida


63

5.6. STABILNOST CLEAs Z NAJVIŠJO AKTIVNOSTJO

CLEAs z najvišjo aktivnostjo smo sintetizirali z uporabo obarjalnega reagenta etanola pri

dodatku 0,0625 % GA, kjer je bila aktivnost CLEAs 94 %. Želeli smo ugotoviti, kako stabilna

je CLEAs z najvišjo dobljeno aktivnostjo (94 %). Poskus stabilizacije smo izvedli tako, da

smo v enem dnevu izvedli čim več reakcij. Na sliki 30 vidimo, da se je preostala aktivnost

CLEAs najbolj znižala v 1. in 2. ciklu. Začetna aktivnost CLEAs je 94 % oziroma 8,92 U/mL

encima. Po 3. ciklu pade aktivnost na 2,542 U/mL encima, kar pomeni, da se je aktivnost

znižala za 71 %. S slike 30 prav tako razberemo, da se je znižala preostala aktivnost CLEAs iz

1. cikla (8,92 U/mL encima) v 6. cikel (1,273 U/mL encima) 86 %. Razpolovno dobo pri

CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta etanola smo dobili po 2. ciklu.

Slika 30: Stabilnost CLEAs z najvišjo aktivnostjo


64

6. ZAKLJUČKI

Namen diplomske naloge je bil sintetizirati CLEAs iz encima celulaza Cellusoft Cellulase

(EC 3.2.1.4, Novozymes A/S Danska), kjer smo spremljali vpliv reakcijskih parametrov

(vpliv koncentracije GA pri sintezi CLEAs in vpliv obarjalnih reagentov na celulazo). Ker je

sinteza CLEAs sestavljena iz obarjanja in zamreženja, smo v prvi fazi uporabili različne

obarjalne reagente, kjer smo spremljali, ali je nastala oborina ali ne. Pri obarjanju smo morali

paziti, da izbrani obarjalni reagenti niso povzročili ireverzibilne denaturacije, saj se s tem

izgubi aktivnost nativnega encima. Uporabljeni obarjalni reagenti so bili: metanol, etanol,

propanol, 2-propanol, aceton, amonijev sulfat, tetrahidrofuran, DMSO, PEG (1500, 6000,

20000), kloroform, n-heptan, heksan, dimetileter, butanol, acetonitril in dekanol. Kot

zamrežitveni reagent smo uporabili glutaraldehid.

Sintezo CLEAs smo začeli z uporabo 1 % GA. Zraven aktivnosti nas je tudi zanimala

stabilnost sintetizirane CLEAs. Ugotovili smo, da CLEAs z najvišjo aktivnostjo ni nujno

najstabilnejša, kot smo dokazali pri CLEAs (obarjalni reagent propanol in uporaba 1 % GA),

kjer je bila aktivnost CLEAs 55 %. Dokazali smo, da upada preostala aktivnost CLEAs iz

cikla v cikel. Preostala aktivnost CLEAs je upadla s 4,7 U/mL encima na 1,4 U/mL encima po

10 ciklih. Najbolj stabilna CLEAs je bila pri uporabi 1 % GA in z uporabo obarjalnega

reagenta metanola, kjer je bila CLEAs 19 %. Preostala aktivnost je po 10 ciklih upadla z 1,6

U/mL encima na 0,7 U/mL encima. Iz tega smo sklepali, da bi lahko CLEAs (metanol, ϕGA= 1

%) v reakcijah uporabili še večkrat.

Ker se s spreminjanjem koncentracije GA spreminja tudi relativna aktivnost CLEAs, smo se

odločili, da spreminjamo koncentracijo GA z namenom, da sintetiziramo CLEAs z najvišjo

aktivnostjo. CLEAs z najvišjo aktivnostjo (94 %) je bila sintetizirana z uporabo obarjalnega

reagenta etanola in pri začetni koncentraciji GA 0,0625 %. Pri testu stabilnosti smo ugotovili,

da preostala aktivnost CLEAs upade z 8,92 U/mL encima na 1,3 U/mL encima. Razpolovna

doba je po 2.ciklu, kjer opazimo upad preostale aktivnosti z 8,92 U/mL encima na 4,95 U/mL

encima, kar pomeni padec aktivnosti za 55,5 % že po drugi reakciji.

V nadaljnjih raziskavah bi lahko dodatno raziskali vpliv reakcijskih parametrov na stabilnost

encima, tako, da bi bila najaktivnejša CLEAs tudi stabilnejša.


65

7. PRILOGE

UMERITVENA KRIVULJA – BRADFORD


66

TABELE Z REZULTATI:

Vpliv pufra na encim celulazo

Absorbanca (340 nm) Enote/mL encima

PBS 0,541 5,741

acetatni pufer 0,536 6,673

citratni pufer 0,526 6,554

Aktivnost resuspendiranega encima po obarjanju

Obarjalni reagent Absorbanca (340 nm) Enote/mL encima Aktivnost (%)

metanol 0,750 9,345 78,78

etanol 0,798 9,943 83,74

2-propanol 0,788 9,818 82,68

propanol 0,803 10,005 84,26

aceton 0,794 9,897 83,35

amonijev sulfat 0,755 9,410 79,25


67

Vpliv uporabe različnih obarjalnih reagentov na učinkovitost imobilizacije in aktivnost

zamreženih encimskih skupkov

Obarjalni reagent Absorbanca

(340 nm)

Enote/mL encima Učinkovitost

(%)

Aktivnost

(%)

metanol 0,248 3,093 73,3 18,88

etanol 0,238 2,965 80,9 33,27

2-propanol 0,086 1,067 77,8 8,97

propanol 0,594 7,401 65,83 55,5

aceton 0,021 0,262 74,43 2,2

amonijev sulfat 0,184 2,291 36,5 31,59

Primerjava aktivnosti resuspendiranega encima z aktivnostjo zamreženih encimskih

skupkov

Obarjalni

reagent

Abs res.

enc

(340 nm)

Enote/mL

enc

Akt. res.

enc (%)

Abs CLEAs

(340 nm)

Enote/mL

enc

Akt.

CLEAs

(%)

metanol 0,750 9,345 78,78 0,248 3,093 18,88

etanol 0,798 9,943 83,74 0,238 2,965 33,27

2-propanol 0,788 9,818 82,68 0,086 1,067 8,97

propanol 0,803 10,005 84,26 0,594 7,401 55,5

aceton 0,794 9,897 83,35 0,021 0,262 2,2

amonijev

sulfat

0,755 9,410 79,25 0,184 2,291 31,59


68

Proučevanje vpliva večkratne uporabe CLEAs na njegovo preostalo aktivnost ob

uporabi različnih obarjalnih reagentov

Ponovitev: CLEAs z

etanolom

CLEAs z

metanolom

CLEAs s

propanolom

CLEAs z

amonijevim

sulfatom

1 Absorbanca

(340nm)

0,224 0,127 0,374 0,213

Enote/mL encima 2,795 1,586 4,663 2,650

2 Absorbanca

(340nm)

0,219 0,105 0,356 0,182

Enote/mL encima 2,726 1,308 4,436 2,268

3 Absorbanca

(340nm)

0,211 0,096 0,333 0,158

Enote/mL encima 2,629 1,198 4,143 1,966

4 Absorbanca

(340nm)

0,205 0,100 0,318 0,134

Enote/mL encima 2,548 1,249 3,957 1,669

5 Absorbanca

(340nm)

0,157 0,083 0,257 0,108

Enote/mL encima 1,960 1,028 3,202 1,341

6 Absorbanca

(340nm)

0,145 0,070 0,209 0,119

Enote/mL encima 1,800 0,870 2,610 1,480


69

7 Absorbanca

(340nm)

0,168 0,088 0,223 0,100

Enote/mL encima 2,098 1,009 2,772 1,248

8 Absorbanca

(340nm)

0,135 0,067 0,179 0,09

Enote/mL encima 1,683 0,834 2,234 1,121

9 Absorbanca

(340nm)

0,083 0,062 0,162 0,054

Enote/mL encima 1,032 0,773 2,02 0,673

10 Absorbanca

(340nm)

0,096 0,054 0,109 0,059

Enote/mL encima 1,19 0,677 1,367 0,731

Optimizacija koncentracije GA pri sintezi CLEAs z uporabo različnih obarjalnih

reagentov

Obarjalni

reagent

Koncentracija

GA (%)

Absorbanca

(340 nm)

Enote/mL

encima

Aktivnost

(%)

Učinkovitost

(%)

metanol 0,25 0,354 4,793 35,47 65,74

0,375 0,595 7,414 61,66 69,65

0,5 0,517 6,446 48,89 77,53

1 0,248 3,093 18,88 75,27

2 0,109 1,362 9,63 79,27

etanol 0,0313 0,195 2,430 20,21 86,75

0,0625 0,907 11,296 93,95 78,05


70

0,125 0,879 10,952 91,09 72,00

0,25 0,759 9,139 79,9 63,2

0,5 0,555 6,914 45,58 80,9

1 0,238 2,965 33,27 77,45

2 0,262 3,258 23,04 78,22

propanol 0,0625 0,195 2,425 20,2 81,85

0,125 0,810 10,292 83,94 77

0,25 0,752 9,135 77,87 78,21

0,5 0,745 9,029 74,45 71,41

1 0,594 7,401 55,50 60,50

2 0,394 4,903 34,67 75,81

amonijev sulfat 0,5 0,079 0,982 6,94 54,84

1 0,184 2,291 31,59 36,5

2 0,578 7,208 50,97 53,22

2,5 0,530 6,604 54,92 60,74

3 0,273 3,498 24,52 57,10

Stabilnost CLEAs z najvišjo aktivnstjo 94% (CLEAs z etanolom in ϕGA = 0,0625 %):

Cikel 1 2 3 4 5 6

Absorbanca

(340 nm)

0,7161 0,3961 0,2040 0,1633 0,1120 0,1022

Enote/mL

encima

8,920 4,935 2,542 2,035 1,396 1,273


71

8. LITERATURA

1 http://sl.wikipedia.org/wiki/Biotransformacija, dostopano 16. februar 2015

2

http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/IMMOB/whatis.htm, dostopano 16.

februar 2015

3

SHELDON, RA., Schoevaart R, Van Langen L., A novel method for enzyme

immobilization; Biocat. Biotrans, 2005

4 GUISAN Jose M, Immobilization of enzymes and cells, 2006, 2. izdaja

5

TISCHER Wilhelm, WEDEKIND Frank, Immobilized enzymes: Methodes and

apllications, 2000

6 http://www.hindawi.com/journals/er/2011/468292/fig1/, 1. marec 2015

7 ARORA Dilip K., Handbook of Fugal Biotechnology, 2004, 2. izdaja

8 http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/IMMOB/entrap.htm, 1. marec 2015

9

CAO Lingiu,Carrier-bound Immobilized Enzymes: Principles, Application and Design,

2005

10

CAO L., VAN LAGEN L., SHELDON R. A., Current Opinion in Biotechnology:

immobilised enzymes: carrier-bound or carrier-free?, 2003

11 http://www-06.all-portland.net/bst/035/1583/0351583.pdf, dostopano 1. marec 2015

12 http://pubs.rsc.org/services/images/RSCpubs.ePlatform.Service.FreeContent.ImageServic

e.svc/ImageService/Articleimage/2014/RA/c3ra45991h/c3ra45991h-f6_hi-res.gif, 1.

marec 2015

13

ILLANES A., Enzyme Biocatalysis, Principles and Applications, 2008

14 http://en.wikipedia.org/wiki/Cross-linked_enzyme_aggregate#cite_ref-2., dostopano

15 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924224412001100, dostopano 1.

marec 2015

16

BOYER, Rodney F., Temelji biokemije, Študentska založba 2005, 2. izdaja

17 http://mandevillehigh.stpsb.org/teachersites/laura_decker/enz_rxn_graphs_files/image002

.j pg., dostopano 1. marec 2015

18

http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/, dostopano 1. marec 2015

19 E. Adam Golan, Cellulase: Types and Action, Mechanism and Uses, 2011

20 TAVČAR Petra F., Celulaze: Osnovni postopki priprave tekstilij na plemenitenje, 2. del,

2001

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924224412001100

http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/


72

21 http://www.c2biotechnologies.com/C2B_images/cellulase_enzyme.png, 1. marec 2015

22 G.P.Ellis, G.B.West, Progress in medicinal chemistry 13, 1976

23 Earl B. Whipple, Michael Ruta., „Structure of Aqueous Glutaraldehyde“ J. Org. Chem,

let. 1974

24

PATNAIK Pradyot, A Comprehensive Guide to the Hazardous Properties of Chemical

Substances, 2007, 3. izdaja

25

AEHLE W., WEINHEIM, Enzymes in Industry: Production and Applications, 3. izdaja,

2007 26

http://sl.swewe.net/word_show.htm/, dostopano 3. marec 2015

27 http://wtt-pro.nist.gov/wtt-pro/index.html?cmp=ammonium_sulfate, dostopano 3. marec

2015

28

http://sl.wikipedia.org/wiki/Pufer, dostopano 1. marec 2015.

29 MEYERS A. R., Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk

Reference, 1995

Curriculum vitae

73

DELOVNE IZKUŠNJE

(marec – oktober) 2013

Raziskava za praktični del v okviru diplomske naloge

Univerza v Mariboru, FKKT, Smetanova ulica 17, 2000 MB

▪ Priprava CLEAs in potrebnih raztopin, določanje aktivnosti katalizatorja, učinkovitosti imobilizacije in stabilnosti CLEAs

IZOBRAŽEVANJE IN USPOSABLJANJE

2008- 2015 Univerzitetni diplomirani inženir kemijske tehnologije

Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Slovenija

▪ Osvojeno znanje s področij biokemije, mikrobiologije, encimske kinetike, anorganske, organske, analizne in fizikalne kemije.

2004- 2008 Gimnazijski maturant

Prva gimnazija Maribor, Slovenija

.

1996- 2004 Osnovna šola Borisa Kidriča

OŠ Borisa Kidriča, Maribor, Slovenija

KOMPETENCE

Računalniške kompetence

Dobro poznavanje Microsoft Office™: Microsoft PowerPoint™, Microsoft Word™, Microsoft Excel™ .

OSEBNI PODATKI MAŠA PETKO

Kardeljeva cesta 77, 2000 Maribor

02/ 33 14 771

[email protected]

Spol: ženski | Datum rojstva: 10.04.1989 | Državljanstvo: slovensko

(oktober – november) 2012

Dvomesečna strokovna praksa

Univerza v Mariboru, FKKT, Smetanova ulica 17, 2000 MB

▪ Naloga je bila spoznati se z delom v laboratoriju. Določali smo aktivnost katalizatorja in učinkovitost imobilizacije. Delali smo z visokotlačnim reaktorjem in SCCO2.

Materni jezik slovenski jezik

Drugi jeziki RAZUMEVANJE GOVORJENJE PISNO SPOROČANJE

Slušno razumevanje Bralno razumevanje Govorno

sporazumevanje Govorno sporočanje

angleški B2 B2 B2 B2 B2

Documents

VPLIV PARAMETROV NA SINTEZO ZAMREŽENIH ENCIMSKIH · 2017. 11. 28. · 6 VPLIV PARAMETROV NA SINTEZO ZAMREŽENIH ENCIMSKIH SKUPKOV (CLEAs) IZ ENCIMA CELULAZA POVZETEK V diplomskem