Upload
others
View
1
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERZA V MARIBORU
FAKULTETA ZA ZDRAVSTVENE VEDE
VPLIV RAZLIČNIH PROBIOTIKOV NA RAST
IN PREŽIVETJE BAKTERIJE
Escherichia coli V MLEKU
(Magistrsko delo)
Maribor, 2017 Dunja Šulc
UNIVERZA V MARIBORU
FAKULTETA ZA ZDRAVSTVENE VEDE
Mentor: izr. prof. dr. Sabina Fijan, univ. dipl. inž. kem. tehnol.
Somentor: viš. znanst. sod. dr. Andrej Steyer, univ. dipl.
mikrobiol.
iii
Zahvala
Zahvaljujem se mentorici, izr. prof. dr. Sabini Fijan in somentorju, viš. znanst. sod.
dr. Andreju Steyerju, za strokovno pomoč in usmerjanje pri raziskovalnem delu, za
neizmeren trud, vse nasvete in vzpodbudne besede.
Hvala vsem, ki ste verjeli vame.
iv
Izvleček
Izhodišča: Probiotiki so živi mikroorganizmi, ki dokazano pozitivno učinkujejo na
zdravje gostitelja, če jih zaužije v zadostnih količinah. Najpogostejše probiotične
bakterije so iz rodu Lactobacillus ter Bifidobacterium, uporabljajo pa se tudi
probiotični sevi drugih vrst bakterij in nekatere kvasovke. Univerzalni probiotik ne
obstaja, probiotični sevi imajo različne mehanizme delovanja in opravljajo specifične
naloge. Na trgu je dostopnih vedno več probiotičnih izdelkov, predvsem v obliki
prehranskih dopolnil. Zaradi potrošniške industrije moramo biti pozorni, da za
probiotike štejemo zgolj izdelke, ki so analizirani in vsebujejo probiotične seve,
katerih učinke potrjujejo klinične raziskave.
Metodologija: V magistrskem delu smo preverili vpliv različnih probiotikov na rast
in preživetje bakterije Escherichia coli v mleku. Vzorci so vsebovali 10 mL mleka,
različne seve bakterije E. coli ter 1 mL suspenzije različnih probiotikov. Pripravljene
vzorce smo inkubirali tri dni. Izvedli smo tudi metodo agar spot.
Rezultati: Ugotovili smo, da so probiotiki znižali koncentracije patogenih sevov E.
coli po treh dneh inkubacije v mleku v povprečju za 1 log10 stopnjo. Rezultati z
metodo agar spot kažejo drugače, saj ponekod nismo zasledili protimikrobnega
učinka. Najšibkejše inhibicije patogenih sevov E. coli ugotavljamo v primerih
probiotikov, ki vsebujejo monokulture probiotičnih sevov.
Sklep: Glede na rezultate lahko povzamemo, da so bili probiotiki pri učinkovanju z
določenimi patogenimi sevi različno učinkoviti. V nobenem primeru probiotik ni
popolnoma inhibiral rasti sevov E. coli po treh dneh inkubacije v mleku, temveč le
zmanjšal njihovo rast.
Ključne besede: probiotiki, pozitivni učinki probiotikov, Escherichia coli, klasične
gojitvene metode štetja mikroorganizmov, PCR, metoda agar spot.
v
Influence of various probiotics on the survival and growth of Escherichia coli in
milk.
Abstract
Introduction: Probiotics are live microorganisms with proven benefits for the host's
health when consumed in required amounts. The most common probiotic bacteria are
Lactobacillus and Bifidobacterium species, while probiotic strains of other types of
bacteria and some yeasts are also used. There is no universal probiotic, probiotic
strains have different function mechanisms and execute specific tasks. The market
offers ever more probiotic products, especially in the form of supplements. The
consumer industry can be treacherous, therefore, we must pay attention and consider
as probiotics only the products that have been analysed and contain probiotic strains
with clinically-proven effects.
Methodology: This master thesis investigates the influence of various probiotics on
the growth and survival of the bacteria Escherichia coli in milk. The samples
contained 10 mL of milk, different strains of E. coli and 1 mL suspension of various
probiotics. The samples were incubated for 3 days.
Results: The findings show that the probiotics lowered the concentration of the
pathogenic strains of E. coli after three days of incubation in milk on average by 1
log10 step. The results using the agar spot method gave different data, since there was
no antimicrobial effect in some probiotics containing the monocultures of probiotic
microorganisms.
Conclusion: Based on different data we can conclude that the probiotics showed to
have a different antagonistic effect against various pathogenic strains of E. coli.
None of the probiotics fully inhibited E. coli, but only decreased its growth.
Keywords: probiotics, the effects of probiotics, Escherichia coli, classical
incubating methods, PCR, agar spot test.
vi
KAZALO
IZVLEČEK ............................................................................................ IV
ABSTRACT ............................................................................................ V
KAZALO ............................................................................................... VI
SEZNAM TABEL ............................................................................. VIII
1 UVOD IN OPIS PROBLEMA ......................................................... 1
1.1 Namen magistrskega dela ............................................................. 4
1.2 Cilji magistrskega dela ................................................................. 4
2 TEORETIČNI DEL .......................................................................... 5
2.1 Črevesna mikrobiota ..................................................................... 5
2.1.1 Mikrobno ravnovesje .............................................................. 6
2.2 Probiotiki ...................................................................................... 7
2.2.1 Pozitivni učinki probiotikov ................................................... 8
2.2.2 Probiotiki in problem trga ................................................... 10
2.2.3 Mikrobiološke analize izdelkov ............................................ 13
2.3 Escherichia coli .......................................................................... 14
2.3.1 Različni sevi in patotipi E. coli ............................................ 16
3 EMPIRIČNI DEL ........................................................................... 20
3.1 Raziskovalna vprašanja .............................................................. 20
3.2 Metodologija ............................................................................... 20
3.2.1 Raziskovalne metode ............................................................ 20
3.2.2 Metoda agar spot ................................................................. 22
3.2.3 Inkubacija probiotikov in različnih sevov E. coli v mleku ... 22
3.2.4 Identifikacija DNA E. coli z molekularno metodo PCR ....... 23
3.3 Raziskovalni vzorec .................................................................... 25
3.4 Postopki zbiranja podatkov ........................................................ 26
4 REZULTATI VPLIVA PROBIOTIKOV NA RAST IN
PREŽIVETJE E. COLI ........................................................................ 27
4.1 Antimikrobni učinek probiotikov z metodo agar spot ............... 27
vii
4.2 Štetje E. coli po tridnevni inkubaciji v mleku, z ali brez
dodanega probiotika............................................................................. 29
4.3 Identifikacija DNA E. coli s pomočjo molekularne metode PCR
47
5 INTERPRETACIJA IN RAZPRAVA .......................................... 50
6 SKLEP ............................................................................................. 55
7 LITERATURA ................................................................................ 57
viii
SEZNAM TABEL
Tabela 1: Program PCR za E. coli ............................................................................. 23 Tabela 2: Deklarirane probiotične baterije v raziskovanih probiotičnih izdelkih ...... 25 Tabela 3: Merila razponov inhibicijske cone za ocenjevanje antimikrobnega učinka
probiotikov ......................................................................................................... 27
Tabela 4: Antimikrobni učinek probiotikov proti različnim sevom in patotipom E.coli
z metodo agar spot ............................................................................................. 28 Tabela 5: Štetje E. coli na agarju MacConkey po tridnevni inkubaciji na sobni
temperaturi v mleku, z ali brez dodanega probiotika 1 ...................................... 29 Tabela 6: Štetje Probiotika 1 na agarjih MRS, PCA, KAZ po tridnevni inkubaciji v
mleku, z ali brez dodane E. coli ......................................................................... 30
Tabela 7: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni
temperaturi v mleku, z ali brez dodanega probiotika 2 ...................................... 31 Tabela 8: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 2) na MRS, PCA, KAZ
agarjih po tridnevni inkubaciji v mleku, z ali brez dodane E. coli .................... 32 Tabela 9: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni
temperaturi v mleku, z ali brez dodanega probiotika 3 ...................................... 33 Tabela 10: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 3) na MRS, PCA, KAZ
agarjih po tridnevni inkubaciji v mleku, z ali brez dodane E. coli .................... 34 Tabela 11: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni
temperaturi v mleku, z ali brez dodanega probiotika 4 ...................................... 35
Tabela 12: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 4) na MRS, PCA, KAZ
agarjih po tridnevni inkubaciji v mleku, z ali brez dodane E. coli .................... 36
Tabela 13: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni
temperaturi v mleku, z ali brez dodanega probiotika 5 ...................................... 37
Tabela 14: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 5) na MYP in PCA
agarjih po tridnevni inkubaciji v mleku, z ali brez dodane E. coli .................... 38 Tabela 15: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni
temperaturi v mleku, z ali brez dodanega probiotika 6 ...................................... 39
Tabela 16: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 6) na MRS, PCA, KAZ
agarjih po tridnevni inkubaciji mleku, z ali brez dodane E. coli ....................... 40 Tabela 17: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni
temperaturi v mleku, z ali brez dodanega probiotika 7 ...................................... 41 Tabela 18: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 7) na MRS in PCA
agarjih po tridnevni inkubaciji v mleku, z ali brez dodane E. coli .................... 42 Tabela 19: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni
temperaturi v mleku, z ali brez dodanega probiotika 8 ...................................... 43 Tabela 20: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 8) na MRS, PCA, KAZ
agarjih po tridnevni inkubaciji v mleku, z ali brez dodane E. coli .................... 44 Tabela 21: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni
temperaturi v mleku, z ali brez dodanega probiotika 9 ...................................... 45
Tabela 22: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 9) na MRS, PCA, KAZ
agarjih po tridnevni inkubaciji v mleku, z ali brez dodane E. coli .................... 46
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
1
1 Uvod in opis problema
Probiotiki so živi mikroorganizmi, ki dokazano pozitivno učinkujejo na zdravje
gostitelja, če jih zaužije v zadostnih količinah. Uradno definicijo o probiotikih sta
sprejeli Organizacija za prehrano in kmetijstvo Združenih narodov (Food and
Agriculture Organization of the United Nations [FAO]) in Svetovna zdravstvena
organizacija (World Health Organization [WHO]) (FAO/WHO, 2002).
Najpogostejše probiotične bakterije so točno določeni sevi mlečnokislinskih bakterij
iz rodu Lactobacillus in določeni sevi bakterij iz rodu Bifidobacterium, uporabljajo
pa se tudi sevi drugih vrst bakterij in nekatere kvasovke (Fijan, 2014; Didari, Solki,
Mozaffari, Nikfar, & Abdollahi, 2014; Jiang, et al., 2014). Laktobacili veljajo za
varne bakterije, ki jih človek že tisočletja uživa skupaj s fermentirano hrano (Rogelj,
2009). Status GRAS (Generally Recognized as Safe) imajo tudi bifidobakterije, ki jih
že kar tradicionalno opisujemo skupaj z mlečnokislinskimi bakterijami, čeprav so
filogenetsko precej oddaljene od njih (Biavati, B., & Mattarelli, P., 2006).
Pomembno je razumeti, da vsi laktobacili in bifidobakterije niso probiotiki.
Probiotične bakterije so natančno preučene bakterije s posebnimi, samo zanje
značilnimi lastnostmi (Rogelj, 2009). Probiotični sevi morajo biti odporni proti
želodčnemu soku in žolčnim kislinam, da preživijo prehod skozi prebavila. V
spodnjem predelu črevesja se namnožijo in blagodejno učinkujejo na zdravje (Elmer,
et al., 2007; Fijan, 2014). Vrsta kakovostnih kliničnih raziskav mora potrditi
pozitivni učinek točno določenega seva na zdravje, da se lahko imenuje probiotik
(FAO/WHO, 2002, Rogelj, 2014).
Predstavniki laktobacilov in bifidobakterij so naravni člani zdrave mikrobiote
prebavil (Gomes, et al., 2010). Številni dejavniki lahko porušijo mikrobno
ravnovesje, kar pripelje do prevlade patogenih mikroorganizmov in povzroči
preobrat iz koristnega v škodljivo delovanje. Zunanja podpora s probiotiki v takšnih
primerih pripomore k ponovni vzpostavitvi ravnovesja črevesne mikrobiote (Fijan,
2014; Pavčič, & Vitezić, 2001).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
2
Najpogosteje probiotičnim bakterijskim kulturam pripisujejo naslednje pozitivne
učinke: skrajšanje trajanja infekcijske driske (zlasti pri otrocih), preprečevanje
driske, povezane z jemanjem antibiotikov, preprečevanje driske, povezane z
bakterijo Clostridium difficile, vzdrževanje remisije pri ulceroznem kolitisu,
preprečevanje obolevnosti za nekrotizirajočim enterokolitisom, preprečevanje
atopijskega dermatitisa pri dojenčkih, zmanjšanje pogostosti okužb (na primer blagih
virusnih enteritisov) ter izboljšanje imunosti (Sanders, 2014). Zmotno je mišljenje,
da ima ena probiotična bakterija vse zgoraj naštete ugodne učinke. Probiotične
bakterije se med seboj razlikujejo, prav tako se razlikujejo njihovi mehanizmi
delovanja (Rogelj, 2009).
Na trgu so probiotiki na voljo v obliki funkcionalnih živil, prehranskih dopolnil in
zdravil brez recepta (Bogovič Matijašić, Zorič Peternel, & Rogelj, 2010). Zaradi
potrošniške industrije moramo biti pozorni, da za probiotike štejemo zgolj izdelke, ki
so analizirani in vsebujejo seve, katerih pozitivni učinki so že bili dokazani in jih
potrjujejo klinične znanstvene raziskave (Bereswill, et al., 2013; Cao, et al., 2013;
Choi, et al., 2011; Hempel, et al., 2012; Li, Rosito, & Slagle, 2013; Mehta, Arya,
Goyal, Singh, & Sharma, 2013; Savard, et al., 2011; Zelaya, et al., 2014).
Escherichia coli (E. coli) je po Gramu negativna bakterija paličaste oblike.
Najpogosteje jo najdemo kot del normalne črevesne mikrobiote ljudi in toplokrvnih
živali (Palaniappan, et al., 2006). Čeprav je večinoma komenzalna bakterija in
človeku neposredno ne škoduje, so nekateri njeni sevi za človeka zelo škodljivi
(Todar, 2008). Patogenost E. coli je povezana z določeno kombinacijo virulentnih
genov (Trkov, et. al, 2012). Glede na prisotnost različnih virulentnih dejavnikov in
na podlagi povzročanja podobnih bolezenskih simptomov in stanj, jih razvrstimo v
različne patotipe (Centers for Disease Control and Prevention [CDC], 2014).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
3
Po drugi strani pa obstaja tudi probiotični sev E. coli Nissle 1917 (EcN), ki nima
nobenih virulentnih dejavnikov. EcN lahko pozitivno vpliva na mehanizme
modulacije imunskega sistema, krepitev črevesne pregrade, ohranja stanje remisije
pri ulceroznem kolitisu ter deluje zaviralno proti drugim patogenim sevom E. coli
(Scaldaferri, et al., 2016; Sonnenborn, & Schulze, 2009; Sturm, et al., 2005).
V magistrskem delu smo raziskovali vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje
bakterije E. coli v mleku. Za primerjavo rezultatov smo antimikrobni učinek
probiotikov ugotavljali tudi z metodo agar spot. Dokazovanje E. coli v združbah z
različnimi probiotiki smo izvedli z molekularno metodo PCR.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
4
1.1 Namen magistrskega dela
Namen magistrskega dela je predstavitev vpliva različnih probiotikov na rast in
preživetje potencialno patogene bakterije E. coli po 72 urni inkubaciji v mleku. V
raziskavo smo vključili več različnih probiotičnih prehranskih dopolnil ter
probiotični zdravili, katerih imena smo izpustili, da bi omogočili nepristranskost
raziskave. Naredili smo pregled probiotičnih sevov, ki jih vsebujejo izbrani
probiotiki. Pri analizi smo uporabili različne klinične izolate E. coli, ki pripadajo
različnim patotipom, referenčni sev E. coli K12 in probiotični sev EcN.
Protimikrobni učinek probiotikov smo ugotavljali s klasično gojitveno metodo na
selektivnih gojiščih ter z metodo agar spot za primerjavo dobljenih rezultatov.
Identifikacijo DNA E. coli v združbah z različnimi probiotiki smo opravili z
molekularno metodo PCR. V teoretičnem delu smo predstavili pozitivne učinke
probiotikov na človeka in njihove mehanizme delovanja, značilnosti bakterije E. coli,
opisali patotipe ter izpostavili probiotični sev EcN.
1.2 Cilji magistrskega dela
Cilji v teoretičnem delu so:
- opisati pozitivne učinke probiotikov na človeka, predstaviti lastnosti
probiotičnih mikroorganizmov in različne mehanizme delovanja,
- predstaviti lastnosti bakterije E. coli, opisati razvrščanje v različne patotipe,
predstaviti probiotični sev EcN ter poiskati osnovo za probiotično naravo
seva v genetskem zapisu.
Cilji empirične raziskave so:
- ugotoviti vpliv probiotikov na rast in razmnoževanje potencialno patogenih
sevov bakterije E. coli v mleku,
- spoznati različne metode za ugotavljanje protimikrobnega učinka probiotikov
(klasične gojitvene metode štetja mikroorganizmov, metodo agar spot),
molekularno metodo PCR za identifikacijo izbranih vrst mikroorganizmov v
vzorcu.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
5
2 Teoretični del
2.1 Črevesna mikrobiota
Mikroorganizmi v našem črevesju so povezani v kompleksno skupnost, ki ji pravimo
mikrobiota (Sanders, 2014). Strokovnjaki ocenjujejo, da je v prebavilih odraslega
človeka do 100 bilijonov mikroorganizmov (Elmer, McFarland, & McFarland, 2007;
Fijan, & Šostar Turk, 2013; Rogelj, 2009). Število mikroorganizmov v prebavilih za
več kot desetkrat presega število človeku lastnih celic (Fijan, & Šostar Turk, 2013;
Sanders, 2014; Weizman, 2014).
Mikrobiota prebavil je eden izmed najbolj kompleksnih mikrobnih ekosistemov, ki
jih poznamo, saj jo sestavlja več sto različnih vrst, med katerimi številčno
prevladujejo vrste rodov Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium, Clostridium,
Lactobacillus, Fusobacterium in različni po Gramu pozitivni koki. V manjšem
številu so zastopane tudi vrste rodu Enterococcus (Rogelj, 2014). Porazdelitev
mikrobiote v prebavilih je v posameznih predelih zelo raznolika. Število
mikroorganizmov narašča vzdolž prebavne poti (Fijan, & Šostar Turk, 2013).
Količina mikroorganizmov je najmanjša v želodcu (103 do 10
5 bakterij/g vsebine),
največja pa v debelem črevesu (108 do 10
10 bakterij/g vsebine), zlasti v danki (10
11
bakterij/g vsebine) (Seme, 2002). Premalo se zavedamo, da je takšnih bakterij, ki
nam škodujejo malo v primerjavi s številom tistih, ki nam pomagajo živeti in
preživeti. Prebavni trakt deluje v simbiozi s številnimi bakterijami in drugimi
mikroorganizmi. V normalnih pogojih stabilnega delovanja prebavil prevladujejo
nevtralni in zdravju koristni mikroorganizmi, v manjšini so zastopane potencialno
patogene bakterije (Elmer, et al., 2007; Fijan, & Šostar Turk, 2013). Črevesna
mikrobiota ima precej večji vpliv na razvoj številnih bolezni, kot smo mislili doslej
(Rogelj, 2014; Weizman, 2014). Delovanje vseh organov je povezano s prebavnim
sistemom, ki se začne z ustno votlino in konča z anusom (Dragaš, 2010).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
6
2.1.1 Mikrobno ravnovesje
Normalna mikrobiota, kjer vlada mikrobno ravnovesje, ima za človeka pomembne
funkcije pri prebavi hrane, proizvodnji vitaminov, spodbujanju imunskega odziva,
preprečevanju razvoja patogenih bakterij. Črevesna sluz in epitel sta pomembna
zaščita pred antigeni iz hrane in mikroorganizmi, ki pridejo v organizem iz okolja.
To predstavlja prvo obrambo gostitelja, ki je usmerjena v regulacijo antigensko
specifičnih imunskih odzivov (Rogelj, 2009).
Ravnovesje mikrobiote se imenuje evbioza. Nasprotno je stanje disbioze. Izraz
disbioza je vpeljal ruski znanstvenik, imunolog Ilya Metchnikoff (1845-1916), ko je
pri svojih raziskavah želel opisati spremenjene patogene bakterije v črevesju
(Walker, & Lawley, 2012). Disbioza je stanje, ko sicer komenzalne črevesne
bakterije povzročajo škodljive učinke zaradi sprememb v črevesni mikrobioti
(Holzapfel, W. H., Haberer, P., Snel, J., Schillinger, U., & Huis in't Veld, J. H., 1998;
Weizman, 2014). Ravnovesje mikrobiote lahko porušijo različni dejavniki, kot so
vsakodnevni stres, staranje, sprememba okolja ali sprememba prehranskih navad,
okužbe, različne bolezni, zdravljenje z antibiotiki, pooperativna stanja in obsevalno
zdravljenje (Elmer, et al., 2007; Rogelj, 2009; Pavčič, & Vitezič, 2001; Weizman,
2014). Na primer, antibiotiki uničijo bakterije, ki so povzročiteljice bolezni, hkrati pa
lahko uničijo nepatogene bakterije in povzročijo disbiozo. Človek je lahko po
prenehanju zdravljenja z antibiotikom izpostavljen invaziji druge patogene bakterije.
V primeru hospitalizacije je tveganje za razvoj nove bolezni v stanju porušene
mikrobiote večje (Elmer, et al., 2007). Ko je mikrobno ravnotežje porušeno, kar
povzroči preobrat iz koristnega v škodljivo delovanje, je zunanja podpora s
probiotiki zelo dobrodošla (Elmer, et al., 2007; Fijan, 2014; Fijan, & Šostar Turk,
2013). Disbiozo so povezali s patogenezo številnih kliničnih motenj. Največ
podatkov izvira iz raziskav, pri katerih so obravnavali vnetne črevesne bolezni
(Weizman, 2014).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
7
2.2 Probiotiki
Etimološko je izraz probiotik sestavljen iz latinskega predloga pro (za) in grškega
pridevnika biotik, ki izhaja iz samostalnika bios (življenje) (Elmer, et al., 2007; Fijan,
& Šostar Turk, 2013; Gomes, Pintado, & Malcata, 2010; Rogelj, 2014). Uradno
definicijo o probiotikih sta sprejeli Organizacija za prehrano in kmetijstvo Združenih
narodov ter Svetovna zdravstvena organizacija (FAO/WHO, 2002; Fijan, & Šostar
Turk, 2013; Rogelj, 2014). Probiotike definiramo kot žive mikroorganizme, ki
ugodno vplivajo na zdravje gostitelja, če jih zaužije v zadovoljivi količini
(FAO/WHO, 2002; Fijan, 2014; Gomes, et al., 2010; Jiang, et al., 2014; Sonnenborn,
& Schulze, 2009).
Koristne mikroorganizme so s fermentirano hrano uživali že pred tisočletji, vendar
pa spoznanja, ki bakterije povezujejo z ugodnimi učinki na zdravje, segajo v začetek
dvajsetega stoletja. V splošnem mnenju se je koncept probiotikov začel z Nobelovim
nagrajencem Ilyo Ilyichom Metchnikoffom (1845–1916), ki je velik del svojih
raziskav namenil vlogi zdravega črevesja za dolgo življenje (Rogelj, 2014).
Najpogostejše probiotične bakterije so točno določeni sevi mlečnokislinskih bakterij
iz rodu Lactobacillus in določeni sevi bakterij iz rodu Bifidobacterium, uporabljajo
pa se tudi sevi drugih bakterij (Lactococcus spp., Pediocococcus spp., Leuconostoc
spp., Streptococcus spp., Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Bacillus
coagulans, Escherichia coli itd.) in nekatere kvasovke (Saccharomyces boulardii
itd.) (Didari, Solki, Mozaffari, Nikfar, & Abdollahi, 2014; Fijan, 2014; Jiang, et al.,
2014; Rogelj, 2009).
Za probiotike je zelo pomembna določitev seva (FAO/WHO, 2002). Zmotno je
mišljenje, da so vse mlečnokislinske bakterije ali vsi laktobacili in bifidobakterije
probiotiki. Po drugi strani pa ima probiotične seve kvasovka Saccharomyces
boulardii, probiotični so lahko tudi nepatogeni sevi iz vrst Enterococcus faecium,
Enterococcus faecalis, Bacillus coagulans, itd, probiotični je sev E. coli Nissle 1917
(Fijan, 2014; Fijan, et al., 2017b).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
8
Probiotične bakterije morajo imeti posebne lastnosti, da delujejo negativno na
zdravju škodljive bakterije, stimulirajo imunski sistem, spodbujajo delovanje
prebavil in pomagajo pri vzdrževanju normalne mikrobiote. V črevesju lahko svoje
delo opravijo samo v primeru, da se v njem začasno ustavijo ali naselijo (Elmer, et
al., 2007; Rogelj, 2009). Probiotična kultura mora biti humanega izvora, normalni
prebivalec črevesja (Gomes, et al., 2010).
2.2.1 Pozitivni učinki probiotikov
Probiotični sevi se med seboj razlikujejo, kar pomeni, da imajo različne ugodne
učinke (Fijan, 2014). Delujejo na različne načine, nekateri v smeri krepitve
imunskega sistema, drugi so uspešnejši pri boju proti škodljivim bakterijam, tretji
spodbujajo delovanje prebavil in skrbijo za mikrobno ravnovesje v prebavilih.
(Bogovič Matijašič, 2009; Rogelj, 2009).
Najpogosteje probiotičnim bakterijam pripisujejo naslednje pozitivne učinke:
vzdrževanje uravnotežene mikrobiote, preprečevanje oziroma krajšanje časa
infekcijske, potovalne driske in driske povezane z jemanjem antibiotikov,
preprečevanje zaprtja, znižanje ravni holesterola, zmanjševanje pogostih okužb kot
so prehlad, blage trebušne viroze, zmanjševanje pogostosti vaginalnih infekcij, še
posebej glivičnih, vzdrževanje remisije pri ulceroznem kolitisu, preprečevanje
obolevnosti in umrljivosti povezane z nekrotizirajočim enterokolitisom, zmanjšanje
tveganja za nastanek raka na črevesju in za pojav nekaterih alergijskih obolenj,
blažitev simptomov laktozne intolerance (Fijan, et al., 2017a; Fijan, 2014; Pavčič, &
Vitezić, 2001). Glavni namen uživanja probiotikov je ohranjanje, obnavljanje in
bogatenje črevesne mikrobiote s koristnimi bakterijami, s tem pa vzdrževanje
mikrobnega ravnovesja (Rogelj, 2009). Vse pogosteje znanost probiotikom pripisuje
pomembno vlogo pri vzdrževanju imunskega sistema. Z razgradnjo škodljivih snovi,
ki jih zaužijemo, lahko tudi zmanjšajo tveganje za nastanek rakavih celic (Elmer, et
al., 2007; Fijan, & Šostar Turk, 2013; Rogelj 2009).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
9
Pozitivne učinke so že dokazali v probiotičnih sevih naslednjih rodov: Lactobacillus
(L. rhamnosus, L. acidophilus, L. plantarum, L. casei, L. delbrueckii subsp.
bulgaricus, L. brevis, L. johnsonii, L. fermentum, L. reuteri, itd.), Bifidobacterium (B.
infantis, B. animalis subsp. lactis, B. bifidum, B. longum, B. breve, itd.),
Saccharomyces (S. boulardii, itd.), Enterococcus (E. durans, E. faecium, itd.),
Streptococcus (S. thermophiles, itd.), Pediococcus (P. acidilactici, itd.), Leuconostoc
(L. mesenteroides, itd.) in Escherichia coli (sev E. coli Nissle 1917) itd. (Bereswill,
et al., 2013; Cao, et al., 2013; Choi, et al., 2011; Hempel, et al., 2012; Li, Rosito, &
Slagle, 2013; Mehta, Arya, Goyal, Singh, & Sharma, 2013; Savard, et al., 2011;
Zelaya, et al., 2014).
Probiotične bakterije imajo tudi močan vpliv na imunski sistem, saj je črevesje
pomembna komponenta imunskega sistema (gut-associated lymphoid tissue –
GALT) (Fijan, & Šostar Turk, 2013; Rogelj, 2009; Sanders, 2014). Probiotične
črevesne bakterije krepijo epitelno pregrado črevesne stene, ki je zaščita pred
antigeni (Elmer, et al., 2007; Rogelj, 2009; Sanders, 2014) ter pospešijo njeno
obnovo s fermentacijsko tvorbo kratkoverižnih maščobnih kislih (Fijan, & Šostar
Turk, 2013; Sanders, 2014; Weizman, 2014). Neposredno vplivajo na tvorbo
beljakovin ter interlevkinov (na primer IL-6, IL-10) (Fijan, & Šostar Turk, 2013), ki
jih proizvajajo TH2 celice (T helper cell), ki usmerjajo v humoralni ali protitelesni
imunski odziv (Murch, 2014). Probiotične bakterije so z mehanizmom
kompetitivnega izločanja sposobne zasesti mesto na steni črevesne sluznice, kamor
se sicer pripenjajo patogene bakterije, ki lahko povzročajo črevesne okužbe (Fijan, et
al., 2017a; Fijan, & Šostar Turk, 2013). Probiotiki odpornost proti naselitvi
patogenih bakterij dosegajo tudi z ustvarjanjem za njih neugodnih življenjskih
pogojev, kot je tvorba bakteriocinov, ter s tekmovanjem za hranilne snovi (Fijan, et
al., 2017a). Črevesne bakterije pomagajo tudi pri proizvodnji vitaminov B in K
(Sanders, 2014; Seme, 2002; Weizman, 2014).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
10
2.2.2 Probiotiki in problem trga
Na trgu so probiotiki na voljo v obliki funkcionalnih živil, prehranskih dopolnil in
zdravil brez recepta (Bogovič Matijašić, Zorič Peternel, & Rogelj, 2010). V
prehranski industriji večinoma vključujejo mlečnokislinske bakterije, največ
laktobacile in laktokoke, uporabljajo pa se tudi bifidobakterije, streptokoki,
enterokoki, itd. (Sonnenborn, & Schulze, 2009). Med funkcionalnimi živili je
fermentirana hrana najpomembnejši način pridobivanja probiotičnih
mikroorganizmov (Bogovič Matijašič, 2010; Fijan, & Šostar Turk, 2013; Gomes, et
al., 2010; Rogelj, 2009), vendar to ne pomeni, da so vsi mlečni izdelki probiotični
izdelki ter vsak jogurt probiotični. Jogurt je še vedno najbolj znan in priljubljen
produkt fermentiranih mlečnih proizvodov (Elmer, et al., 2007; Fijan, & Šostar Turk,
2013). Probiotične jogurte izdelujejo s pomočjo dodatno izbranih probiotičnih
bakterij (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus,
Bifidobacterium bifidum itd.) v procesu fermentacije mleka, kjer se del laktoze
spremeni v mlečno kislino (Fijan, & Šostar Turk, 2013). Jogurtu sledijo probiotični
mlečni napitki in mlečni namazi s probiotiki (Bogovič Matijašić, et al., 2010).
Zakladnico potencialnih koristnih bakterij pa lahko najdemo tudi v drugih izdelkih,
med katere spadajo kefir, pivo, kombuča čaj, kislo zelje, sojina omaka, itd. (Fijan, &
Šostar Turk, 2013).
Prehranska dopolnila in zdravila brez recepta lahko zaužijemo v obliki kapsul, tablet,
pastil, peroralnih praškov in peroralnih kapljic (Gomes, et al., 2010). Pri zdravilih
brez recepta so lahko navedeni učinki na bolezenska stanja, če so dokazani s
kliničnimi raziskavami, medtem ko pri prehranskih dopolnilih napisi, ki kakorkoli
namigujejo na zdravljenje, niso dovoljeni (Bogovič Matijašič, 2009; Rogelj, 2009).
Na trgu je v zadnjih letih na voljo vedno več probiotičnih prehranskih dopolnil, ki
daleč prednjačijo pred ponudbo probiotičnih zdravil brez recepta, saj so regulatorne
zahteve za prehranska dopolnila bistveno blažje od tistih za zdravila (Rogelj, 2009;
Tuš, & Mlinarič, 2007).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
11
Na slovenskem trgu je večina izdelkov prehranskih dopolnil (Bogovič Matijašič,
2009), kot so na primer BioGaia, Yogermina 100 neo, Probiolex, Waya AB, itd.
(Zveza potrošnikov Slovenije [ZPS], 2012). V zakonodaji sicer ni predpisano
preverjanje sestave probiotičnih prehranskih dopolnil pred prodajo, obstajajo pa
priporočila, ki so nosilcem dejavnosti lahko v pomoč pri zagotavljanju kakovosti
prehranskih dopolnil in predstavljajo izhodišče za ocenjevanje kakovosti prehranskih
dopolnil na tržišču. Prehransko dopolnilo mora biti varno za uporabo. Označbe na
izdelkih morajo biti predstavljene tako, da ne zavajajo potrošnika, navedeni morajo
biti njihova sestava, rok uporabnosti proizvoda ter navodila za shrambo (Pravst, et
al., 2012; Rogelj, 2009). Ne glede na to ali se probiotiki uporabljajo kot prehranska
dopolnila ali kot zdravila brez recepta, morajo izpolnjevati določena selekcijska
merila. Potrebna je pravilna identifikacija vseh sevov v izdelku. Z vidika varnosti je
pomembno, da probiotični sevi ne povzročajo okužb in prebavnih težav, ne izločajo
toksinov ter encimov s škodljivim delovanjem, ne vsebujejo virulentnih dejavnikov
ter prenosljivih genov za odpornost proti antibiotikom. Merila za zagotavljanje
funkcionalnosti zahtevajo, da so probiotični sevi odporni proti kislini, želodčnemu
soku in žolču, imeti morajo sposobnost vezave na črevesne epitelne celice. Potrebni
sta stabilnost seva in zmožnost, da zraste v velikih količinah ter tako ohranja svojo
dejavnost v črevesju (FAO/WHO, 2002; Rogelj, 2009).
Probiotiki v kapsulah, pa tudi v praških, so ponavadi liofilizirani, kar pomaga
ohranjati njihovo preživetje (število živih organizmov), za dalj časa. Pri probiotičnih
izdelkih, ki so toplotno sušeni lahko proces ogrevanja pri proizvodnji ubije mikrobe
in tako izniči njihov probiotični učinek (Elmer, et al., 2007).
Na trgu se število probiotičnih izdelkov hitro povečuje, čeprav so le redke
probiotične bakterije dovolj klinično proučene v smislu njihovega učinka na zdravje
(Rogelj, 2009). Predpisi v zvezi s probiotiki se razlikujejo od države do države
(Elmer, et al., 2007; Rogelj, 2009). V EU so merila za ustrezno vsebnost probiotičnih
sevov v izdelkih ter standardi, na podlagi katerih bodo predpisali metode za
ugotavljanje ustreznosti probiotičnih izdelkov, še v pripravi (Zveza potrošnikov
Slovenije [ZPS], 2012).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
12
V Sloveniji obstajajo različni pravilniki, ki pokrivajo področji prehranskih dopolnil
in funkcionalne hrane. Prvo področje v večji meri obravnava Ministrstvo za zdravje,
drugo pa je bolj v domeni Ministrstva za kmetijstvo, gozdarstvo in prehrano
(Bogovič Matijašič, 2010). Slovenska zakonodaja ne vsebuje predpisov, ki bi
zahtevali preverjanje sestave probiotičnih prehranskih dopolnil pred prodajo (Rogelj,
2009; Bogovič Matijašić, et al., 2010), zato se pogosto zgodi, da se proizvajalci
zanašajo le na uveljavljeni status laktobacilov in bifidobakterij kot varnih bakterij
(Generally Recognized as Safe- GRAS) (Rogelj, 2009; Vandenplas, & Hauser,
2014), pri tem pa zanemarijo pomembne lastnosti probiotičnih izdelkov, kot so
taksonomska razvrstitev probiotičnih bakterij, prisotno število probiotičnih sevov in
viabilnost, odpornost proti antibiotikom in virulentnost (Rogelj, 2009).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
13
2.2.3 Mikrobiološke analize izdelkov
Mikrobiološke analize probiotičnih izdelkov lahko razkrijejo neskladje med
dejanskim številom probiotičnih mikroorganizmov ter izoliranimi sevi iz izdelka, z
informacijo, ki je zapisana na deklaraciji (Rogelj, 2009).
Leta 2006 so prvič objavlili podatke o ustreznosti probiotičnih izdelkov naprodaj v
Sloveniji (Bogovič Matijašić, & Rogelj, 2006). V raziskavo so zajeli fermentirane
probiotične izdelke, kupljene v supermarketih v Sloveniji, prehranska dopolnila in
zdravila v liofilizirani obliki, kupljena v lekarnah. Rezultati raziskave so pokazali, da
je označevanje probiotikov pogosto pomanjkljivo ali neustrezno glede števila živih
probiotičnih bakterij in navedenih vrst. Zasledili so tudi uporabo neobstoječih imen
bakterij, na primer Lactobacillus sporogenes in Lactobacillus thermophilus (Bogovič
Matijašić, & Rogelj, 2006). Ponovno raziskavo so opravili leta 2009, v katero so
vključili 20 probiotičnih prehranskih dopolnil in dve probiotični zdravili brez
recepta, kupljenih v slovenskih lekarnah. Ugotovili so, da je le pet izdelkov
vsebovalo dovolj živih probiotičnih mikroorganizmov glede na deklaracijo, pri
dvanajstih izdelkih je bilo dejansko število mikroorganizmov nižje od navedenega,
pri dveh število ni bilo navedeno, v enem izdelku pa niso potrdili živih bakterij. V
večini primerov so zasledili zgolj navajanje vrst bakterij, brez oznak sevov.
Navedene vrste so večinoma lahko potrdili, razen v primerih izdelkov z velikim
številom bakterij (6–8). Obe probiotični zdravili sta ustrezali tako po vrsti kot številu
probiotičnih bakterij (Bogovič Matijašić, Zorič Peternel, & Rogelj, 2010). V
raziskavo iz leta 2012 je bilo vključenih 12 probiotičnih prehranskih dopolnil. V
osmih od dvanajst izdelkov so bile vrste deklariranih probiotičnih bakterij potrjene.
V devetih od dvanajstih izdelkov je dejansko število probiotičnih bakterij ustrezalo
deklariranemu. Napredka niso opazili v označbah izdelkov, saj so bile te le v štirih
primerih ustrezne (Zveza potrošnikov Slovenije [ZPS], 2012).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
14
2.3 Escherichia coli
Theodor Escherich (1857–1911) je eden prvih, ki so poudarjali pomen raziskave
bakterij v prebavnem traktu in blatu človeka. S svojimi raziskavami je pripomogel h
kasnejšemu razumevanju fiziologije prebave ter patogeneze (Vasiljevič & Shah,
2008). Leta 1885 je Escherich prvi opisal bakterijo Escherichio coli (E. coli), ki
danes velja za enega izmed najbolj raziskanih prokariontskih organizmov. Na E. coli
so proučili zgradbo, rast in metabolizem bakterijske celice. V rabi je kot vektor za
kloniranje genov in testni organizem za preverjanje učinkovitosti protimikrobnih
zdravil in razkužil ter kot indikator fekalne kontaminacije vode in hrane (Andlovic,
2002b; Dragaš, 2010).
E. coli je predstavnica družine Enterobacteriaceae in je po Gramu negativna
fakultativno anaerobna bakterija paličaste oblike (Andlovic, 2002a; Andlovic, 2002b;
Conway, & Cohen, 2016; Dragaš, 2010; Madigan, Martinko, Stahl, & Clark, 2012;
Palaniappan, et al., 2006). V dolžino meri od 2 μm do 6 μm, v širino pa od 1 μm do
1,5 μm (Madigan, et al., 2012). Najpogosteje jo najdemo kot del normalne črevesne
mikrobiote ljudi in toplokrvnih živali (Conway, & Cohen, 2016; Palaniappan, et al.,
2006; Todar, 2008).
E. coli je razvila več sistemov za odpornost proti želodčni kislini, kar ji omogoča
preživetje tudi v ekstremnih razmerah (pH 2 ali manj) (Zhuo, Hope, Don L, Tyrrell,
& Foster, 2002). Princip delovanja enega od sistemov (AR2 sistem) je v regulaciji
genov gadA, gadB in gadC (Castanie-Cornet, Treffandier, Francez-Charlot,
Gutierrez, & Kaymeuang, 2007). Gena gadA in gadB kodirata encim glutamat
dekarboksilazo (glutamate decarboxylase [GAD]), ki sodeluje pri reakciji pretvorbe
glutamata v -aminobutanojsko kislino (-amino butyric acid [GABA]). Gen gadC
deluje kot antiporter, ki uvaža glutamat v celico, istočasno pa izvaža -
aminobutanojsko kislino iz nje (Zhuo, et al., 2002). Kombinirana aktivnost teh genov
zvišuje znotrajcelični pH na raven, ki se približa nevtralnemu (Castanie-Cornet, et
al., 2007).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
15
E. coli je genetsko heterogena in nagnjena k mutiranju (naravnemu in bioinženirsko
povzročenemu), kar pojasnjuje njeno dualno naravo (Todar, 2008). Med njenimi sevi
najdemo komenzalne seve, črevesne patogene in zunajčrevesne patogene (Wiles,
Kulesus, & Mulvey, 2008). Večina sevov je za gostitelje nepatogena, nekateri med
njimi pa so med evolucijo s horizontalnim prenosom ali mutacijami pridobili različne
gene, ki so omogočili nastanek in kasneje povečanje virulence. Patogenost E. coli je
povezana s kombinacijo virulentnih genov (Trkov, et. al, 2012).
Koristni sevi E. coli fermentirajo za nas neprebavljive snovi, proizvajajo vitamin K
in biotin. Kot komenzali onemogočajo tudi naselitev oz. kolonizacijo patogenih
bakterij (Madigan, et al., 2012). Komenzalne bakterije, ki kolonizirajo mikrobioto, v
normalnih okoliščinah ne škodujejo gostitelju. Ob zmanjšani odpornosti gostitelja,
pomanjkljivem imunskem odzivu ali ob vstopu v telesne predele, kjer običajno ni
mikrobov, pa lahko povzročijo oportunistične okužbe. (Koren, Ihan, & Gubina,
2002; Scheutz, & Strockbine, 2005; Trkov, et. al, 2008). Zato pravimo, da je E. coli
oportunist oziroma pogojno patogena bakterija (Koren, Ihan, & Gubina, 2002).
Nekateri sevi E. coli imajo zapise za virulentne dejavnike, kot so eksotoksini,
endotoksini, kapsula, bički, fimbrije (Andlovic, 2002b). Za prvi stik z gostiteljem so
potrebni adhezini, ki omogočajo pritrditev bakterije na gostiteljsko celico (Dragaš,
2010; Koren, Ihan, & Gubina, 2002). Najbolje raziskani adhezini so na pilusih ali
fimbrijah (Koren, Ihan, & Gubina, 2002). Patogeni sevi E. coli povzročajo krvavo
drisko, vnetja sečil, pri katerih lahko pride do razkrajanja celic sečnih poti, vnetja in
odpovedi ledvic (Munda, 2011). Okužbe sečil so najpogostejše zunajčrevesne okužbe
(Andlovic, 2002b; Trkov, et. al, 2008). Določeni sevi E. coli lahko povzročajo tudi
neonatalni meningitis. V primerih večjih vnetij ali prehodih patogenih sevov čez
črevesno bariero, lahko povzročijo bolezenske krvavitve raznih organov, sepso in
končno tudi smrt (Munda, 2011). Okužbe, ki jih povzročajo virulentni sevi E. coli
delimo v dve skupini, na črevesne in zunajčrevesne okužbe (Andlovic, 2002b;
Palaniappan, et al., 2006). Glede na prisotnost različnih virulentnih dejavnikov in na
podlagi povzročanja podobnih bolezenskih simptomov in stanj, jih razvrstimo v
različne patotipe ([CDC], 2014; Palaniappan, et al., 2006; Wiles, et al., 2008).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
16
2.3.1 Različni sevi in patotipi E. coli
Patotipi E. coli, ki povzročajo črevesne okužbe
ETEC: Enterotoksigene E. coli izdelujejo toplotno labilne (toksin TL) ali pa toplotno
stabilne (toksin TS) enterotoksine (Scheutz, & Strockbine, 2005). Sevi ETEC
pogosto povzročajo potovalno drisko. Prenašajo se predvsem s hrano in vodo, le
redko s stikom (Andlovic, 2002b). Med ETEC lahko sodijo serološke skupine O6,
O8, O25, O78, O153, O128, O86 (Scheutz, & Strockbine, 2005).
VTEC/STEC: Za verotoksigene in šigatoksične E. coli je značilna zmožnost
izdelovanja verotoksinov (VT) (Trkov, et. al, 2012). Ker so podobni toksinom
bakterije Shigella dysenteriae serotiopa 1, zanje uporabljamo tudi okrajšavo Stx
(angl. Shiga toxins) (Andlovic, 2002b; Scheutz, & Strockbine, 2005; Trkov, et. al,
2012).
EHEC ali enterohemoragične E. coli so podskupina VTEC, ki lahko povzročajo
krvavo drisko, ki jo pogosto spremljata bruhanje in povišana telesna temperatura. Pri
majhnih otrocih in starejših ljudeh lahko pride do nevarnega zapleta, hemolitično
uremičnega sindroma (HUS) (Andlovic, 2002b; Trkov, et al., 2008). Najbolj znan
serotip iz te skupine je E. coli O157: H7, ki lahko povzroči epidemije hemoragičnega
kolitisa (Andlovic, 2002b; Gruber, et al., 2013). EHEC imajo na genomu otok
patogenosti LEE (angl. locus for enterocyte effacement), ki nosi zapise za intimin,
sekrecijski sistem III, beljakovino Tir in različne sekrecijske beljakovine, ki
sodelujejo pri pritrjevanju bakterijske celice na evkariontsko celico. Patogena
bakterija si tako izdela lastni receptor, ki ji omogoča pritrjevanje na celice gostitelja
(Trkov, et al., 2012).
EPEC: Enteropatogeni sevi bakterije E. coli ne izdelujejo toksinov, povzročajo pa
histopatološke spremembe črevesnega epitela (Trkov, et al., 2011). Zanje je prav
tako značilen otok patogenosti LEE. Patogeni sevi se tesno pritrdijo na mikroviluse
enterocitov in jih uničijo (Andlovic, 2002b). EPEC najpogosteje povzročajo vodeno
drisko pri majhnih otrocih do 3. leta starosti (Trkov, et al., 2008). Najpogosteje so
vpletene serološke skupine O55, O111 in O142 (Andlovic, 2002b).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
17
EIEC: Enteroinvazivne E. coli običajno povzročajo vodeno drisko, včasih
dizenterijo in kolitis (Trkov, et al., 2008). Njihova značilnost je, da vdrejo v epitelne
celice, se v njih razmnožujejo, potujejo v citoplazmi in prehajajo v sosednje celice
(Trkov, et al., 2008). Ob prehodu v sosednje celice močno poškodujejo črevesno
steno. Okužbe najpogosteje povzročajo sevi iz seroloških skupin O124, O143, O152
(Andlovic, 2002b).
EAEC: Enteroagregativni sevi E. coli povzročajo akutno in dolgotrajno drisko
predvsem pri otrocih, manj pri odraslih (Andlovic, 2002b; Trkov, et al., 2011). Po
vezavi na celice izločajo različne enterotoksine, npr. ShET1 (Shigella enterotoksin 1)
EAST1 itd. (Trkov, et al., 2011). Difuzno adherentne E. coli (DAEC) so podskupina
EAEC in povzročajo drisko pri otrocih (Palaniappan, et al., 2006).
Patotipi E. coli, ki povzročajo zunajčrevesne okužbe
UPEC je patotip E. coli, ki povzroča okužbo urinarne poti (UTI), ki je najpogostejša
zunajčrevesna okužba (Trkov, et. al, 2011). Večina bakterij, ki povzročajo okužbo
sečil, izvira iz prebavil (Andlovic, 2002b; Car, & Marinko, 2003). Virulentni
dejavniki fimbrije tipa 1 povzročajo cistitise (okužbo mehurja), fimbrije tipa P pa so
povezane z okužbo ledvic (Andlovic, 2002b; Kaper, Nataro, & Mobley, 2004).
NEMEC je patotip E. coli, ki povzroča neonatalni meningitis. Za te seve so značilni
kapsularni polisaharidni antigeni tipa K1 (Kaper, Nataro, & Mobley, 2004; Andlovic,
2002b). Kapsula jih varuje pred fagocitozo in ovira vezavo protiteles na bakterije
(Andlovic, 2002a).
SEPEC je patotip E. coli, ki povzroča sepso. Ti primeri okužb so pogostejši pri
bolnišničnih bolnikih (Andlovic, 2002b).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
18
ESBL pozitivna E. coli
ESBL je kratica za encime, imenovane β- laktamaze razširjenega spektra (iz angl.
extended-spectrum β-lactamase). Več različnih bakterij, ki lahko proizvaja te encime,
je odpornih proti številnim antibiotikom, ki vsebujejo cefalosporin in penicilin, itd.
ESBL pozitivne E. coli lahko povzročijo okužbe sečil, ki lahko napredujejo do
resnejših okužb, kot je sepsa, kar lahko ogrozi življenje (Gudiol, et al., 2010).
Probiotični sev E. coli Nissle 1917
Probiotični sev E. coli Nissle 1917 (EcN) je odkril in izoliral nemški zdravnik in
znanstvenik Alfred Nissle (1874–1965), ko je raziskoval antagonistične aktivnosti E.
coli proti nekaterim patogenim enterobakterijam (Jiang, et al., 2014; Sonnenborn,
2017; Sonnenborn, & Schulze, 2009). Nissle je sev EcN izoliral v času prve svetovne
vojne (leta 1917) iz blata vojaka, ki v nasprotju z ostalimi pripadniki vojske ni razvil
nalezljive driske, ki je razhajala na Balkanskem polotoku (Scaldaferri, et al., 2016;
Sonnenborn, 2017; Sonnenborn, & Schulze, 2009). Nissle je domneval, da je bil v
črevesju vojaka prisoten močan, antagonistično aktiven sev, ki ga je zaščitil pred
okužbo. Prišel je do ugotovitve, da so nekateri fekalni izolati E. coli pokazali
antagonistično delovanje proti enteropatogenim bakterijam, medtem ko drugi niso
zavirali njihove rasti (Sonnenborn, & Schulze, 2009). EcN je nepatogeni sev, ki se
danes uporablja kot probiotik. EcN nima nobenih virulentnih dejavnikov, ne nosi
patogenih adhezijskih dejavnikov, ne proizvaja nobenih enterotoksinov ali
citotoksinov, ni invaziven, ne uropatogen (Scaldaferri, et al., 2016). Odkritih je bilo 5
genomskih otokov (GEIs) in nekaj manjših, na katerih so genski skupki odgovorni za
sintezo dejavnikov, ki prispevajo k probiotični naravi seva. Ti dejavniki so geni za
proizvodnjo mikrocinov, ki zavirajo rast patogenih enterobakterij (Sonnenborn, &
Schulze, 2009; Sonnenborn, 2017). EcN lahko pozitivno vpliva na mehanizme
modulacije imunskega sistema, krepitev črevesne pregrade, ohranja stanje remisije
pri ulceroznem kolitisu ter deluje zaviralno proti drugim patogenim sevom E. coli
(Scaldaferri, et al., 2016; Sonnenborn, & Schulze, 2009; Sturm, et al., 2005).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
19
Escherichia coli K-12
E. coli K-12 je benigni komenzal človeškega črevesja (Koli, Sudan, Fitzgerald,
Adhya, & Kar, 2011). Sev je bil izoliran leta 1922 in uveljavljen kot standardni
laboratorijski raziskovalni sev na Univerzi Stanford (Liu, & Reeves, 1994). E. coli
K-12, sicer dobro uveljavljeni zunajcelični komenzal, lahko v določenih specifičnih
gostiteljskih pogojih preide na aktivno invazivno ali patogeno delovanje (Koli, et al.,
2011).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
20
3 Empirični del
3.1 Raziskovalna vprašanja
1. Raziskovalno vprašanje: Ali imajo probiotiki vpliv na rast in preživetje
potencialno patogenih sevov bakterije Escherichia coli med inkubacijo v
mleku?
2. Ali po testiranju metod za določanje protimikrobnega učinka probiotikov
opazimo razlike v občutljivosti metod in posledično razlike v dobljenih
rezultatih?
3.2 Metodologija
3.2.1 Raziskovalne metode
V magistrskem delu smo preverili vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje
bakterije Escherichia coli v mleku. Vzorci so vsebovali 10 mL mleka, potencialno
patogeno bakterijo E. coli ter 1 mL suspenzije različnih probiotikov. Pripravljene
vzorce smo inkubirali tri dni pri sobni temperaturi. Nato smo preverili antimikrobni
učinek probiotikov s klasično gojitveno metodo štetja. Za E. coli smo uporabili
selektivni agar MacConkey. Za določevanje števila preživelih probiotikov pa smo
uporabili agar PCA, agar MRS, kanamycin eskulin azidni agar in agar MYP.
Protimikrobni učinek probiotikov smo preverili tudi z metodo agar spot. Potrditev
prisotnosti E. coli v vseh vzorcih smo nato izvedli še z molekularno metodo verižne
reakcije s polimerazo (PCR).
3.2.1.1 Gojišča
Agar MacConkey (Becton Dickinson 221601) je selektiven in diferencialni medij za
odkrivanje koliformnih organizmov in enteričnih patogenov. Uporablja se za
identifikacijo Escherichia coli (Difco & BBL, 2009). Odtehtali smo 50 g
dehidriranega medija in ga suspendirali v 1 L destilirane vode.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
21
Suspenzijo smo segrevali do vrenja (uporabili smo magnetno mešalo) in 15 min
sterilizirali v avtoklavu pri 121 °C. Ohlajeni agar smo aseptično odlili v petrijevke.
E. coli prepoznamo po 24-urni inkubaciji pri 35 °C po okroglih rožnato rdečih
kolonijah.
Agar de Man, Rogosa and Sharpe (MRS, BioMerieux, 151752) smo uporabili za
identifikacijo bakterij iz rodu Lactobacillus. 70 g dehidriranega medija smo
suspendirali v 1 L destilirane vode, segreli do vrenja in avtoklavirali. Ohlajeni agar
smo aseptično odlili v petrijevke. Mlečnokislinske bakterije prepoznamo po 72-urni
anaerobni inkubaciji pri 35 °C po okroglih belih kolonijah. Za anaerobno inkubacijo
smo uporabili vrečke za anaerobno inkubacijo (GenBag).
Kanamicin eskulin azidni agar (KAZ) je selektivni medij za izolacijo in štetje
enterokokov. Prisotnost enterokokov se dokazuje s hidrolizo eskulina (Sigma-
Aldrich Co., 2011). KAZ (Fluka 17151) smo uporabili za identifikacijo E. faecium.
Odtehtali smo 44,67 g dehidriranega medija, ga suspendirali v 1 L destilirane vode,
segreli do vrenja in avtoklavirali. Ohlajenemu agarju smo aseptično dodali
rehidrirano vsebino ene stekleničke kanamicin sulfata (FD 146). Raztopljen medij
smo dobro premešali in odlili v petrijevke. Po 48-urni inkubaciji pri 37 °C E. faecium
prepoznamo po okroglih sivo belih kolonijah, pod katerimi je substrat obarvan rjavo-
črno.
Mannitol Yolk Polymyxin Agar (MYP) smo uporabili za identifikacijo Bacillus
coagulans. Odtehtali smo 23 g dehidriranega medija, ga suspendirali v 1 L
destilirane vode, segreli do vrenja in avtoklavirali. Bakterije po 48-urni inkubaciji pri
35 °C prepoznamo po okroglih rožnatih kolonijah z oborino.
Plate Count Agar (PCA, Sigma Aldrich, 70152) je neselektivni medij za štetje
mikroorganizmov v mleku, drugih mlečnih izdelkih in živilih (Sigma Aldrich, 2011).
Uporabili smo ga za določitev celokupnega števila živih bakterij. 17,5 g agarja smo
suspendirali v 1 L destilirane vode.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
22
Suspenzijo smo segrevali do vrenja in 15 min sterilizirali v avtoklavu pri 121 °C.
Ohlajeni agar smo aseptično odlili v petrijevke. Po nanosu vzorcev smo plošče
inkubirali 48 ur pri 32 °C in prešteli število nastalih kolonij.
3.2.2 Metoda agar spot
Za ugotavljanje protimikrobne aktivnosti probiotikov smo uporabili metodo agar spot
(Kholy, A. M., Shinawy, S. H., Meshref, A.M.S., & Korny, A.M., 2014). 10 μL
suspenzije različnih probiotikov smo točkovno nanesli na gojišče MRS (za vse
probiotike razen probiotika 5) in petrijevke zaradi večje selektivnosti inkubirali
anaerobno pri 35 °C 24 ur ter na gojišče MYP (za probiotik 5) in petrijevke aerobno
inkubirali pri 35 °C 24 ur. Nato smo odpipetirali po 1 mL kulture E. coli in jo dodali
v mehki agar MacConkey (40g/1000 mL) ter prelili preko predhodno pripravljenih
gojišč s probiotiki. Po 24 urah aerobnega inkubacijskega časa smo izmerili in
zabeležili premer inhibicijske cone, brez upoštevanja premera točke kolonij testnih
sevov. Pridobljene vrednosti so povprečja rezultatov enega eksperimenta, v trikratnih
izvedbah za posamezni probiotik.
3.2.3 Inkubacija probiotikov in različnih sevov E. coli v mleku
Po 0,5 mL različnih sevov in patotipov bakterije E. coli smo 72 ur inkubirali pri
sobni temperaturi v 10 mL predhodno steriliziranega kravjega mleka z ali brez
dodanega 1 mL suspenzij različnih probiotikov.
Pred in po inkubaciji smo število mikroorganizmov prešteli z indirektno gojitveno
metodo štetja z uporabo desetiških razredčitev, izračunali smo število nastalih kolonij
(cfu/mL) ter stopnjo zmanjšanja mikroorganizmov po inkubaciji.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
23
3.2.4 Identifikacija DNA E. coli z molekularno metodo PCR
Osamitev DNA je potekala s pomočjo reagenta PrepMan Ultra (Life Technologies).
Po 2 mL vzorca smo centrifugirali v mikrocentrifugi 2 min pri 12000 obr/min in
odpipetirali supernatant. Aseptično smo dodali 100 μL PrepMan reagenta ter
inkubirali 10 min pri 100 °C. Sledilo je ponovno centrifugiranje vzorcev za 2 min pri
12000 obr./min in odvzem 50 μL supernatanta z osamljeno DNA.
Reakcija pomnoževanja DNA: za reakcijo pomnoževanja z verižno reakcijo s
polimerazo (PCR, iz angl.: Polymerase Chain Reaction) smo uporabili začetne
oligonukleotide f(5'-ACC TGC GTT GCG TAA ATA-3'), r(5'-GGG CGG GAG
AAG TTG ATG-3'). Bakterijski sev smo identificirali z dokazom gena gadB.
Velikost produkta za E. coli je 670 bp (McDaniels et al., 1996). Skupna reakcijska
mešanica je bila sestavljena iz 1 mM MgCl2, 1,5 mM 10x reakcijskega pufra, 0,2
mM mešanice dNTP, 25 pM začetnega oligonukleotida GADA BF in 25 pM
začetnega oligonukleotida GADA BR in 2,5 U HotStarTaq polimeraze. Z vodo brez
nukleaz smo dopolnili do končnega volumna 50 µL in priključili ustrezen program za
pomnoževanje (Tabela 1). Po končanem programu smo pomnožke analizirali z
agarozno gelsko elektroforezo (Fijan, Rozman, & Šostar Turk (2013)
Tabela 1 prikazuje program reakcije PCR za bakterijo E. coli
Tabela 1: Program PCR za E. coli
Program Proces Temperatura Čas Število
ciklov
Denaturcija Denaturacija ali razdvajanje 94 °C 15 min 1
Pomnoževanje
Razdvajanje 94 °C 30 s
35 Vezava začetnih
oligonukleotidov 52 °C 30 s
Podaljševanje 72 °C 1 min
Končno podaljševanje 72 °C 7 min 1
Konec Ohladitev 10 °C 1
Vir: Fijan, Rozman, & Šostar Turk (2013)
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
24
Z agarozno gelsko elektroforezo smo ugotavljali velikost pomnožkov PCR. Pripravili
smo 1,5 % agarozni gel v 0,5 kratnem pufru TBE (89 mM Tris HCl baza, 89 mM
borova kislina, 2 mM EDTA, pH= 8 z dodanim 8 μL SYBER Green I (Sigma).
Izvedli smo elektroforezo pri konstantni napetosti 100 V in času 60 min. Z aparatom
Transiluminator Super Bright (Vilber Lourmat) pri valovni dolžini 312 nm smo
poslikali gel s kamero DocPrint VX2 (Vilber Lourmat). Slike smo računalniško
obdelali.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
25
3.3 Raziskovalni vzorec
V raziskavo smo vključili 10 probiotikov, katerih imena smo izpustili, da bi
omogočili nepristranskost raziskave. Za probiotike, ki smo jih označili od 1 do 10,
smo poiskali vsebovane probiotične kulture, ki so podane v Tabeli 2.
Tabela 2: Deklarirane probiotične baterije v raziskovanih probiotičnih izdelkih
Oznaka
probiotičnega
izdelka
Deklarirane probiotične bakterije
Probiotik 1
(kapsule)
Lactobacillus acidophilus (L. gasseri)*; Bifidobacterium infantis*;
Enterococcus faecium*
Probiotik 2
(kapljice) Bifidobacterium animalis subsp. lactis, BB-12
Probiotik 3
(kapljice) Lactobacillus reuteri DSM 17938
Probiotik 4
(suspenzija) Lactobacillus casei Shirota
Probiotik 5
(kapsule) Bacillus coagulans LMG S-24828
Probiotik 6
Lactobacillus bulgaricus Lb-64; Bacillus coagulans BC599; Lactobacillus
acidophilus La-14; Bifidobacterium animalis lactis Bl-04; Bifidobacterium
breve Bb-03
Probiotik 7
(suspenzija)
Bifidobacterium lactis Bl-04; Lactobacillus acidophilus La-14;
Lactobacillus plantarum Lp-115; Lactobacillus paracasei Lpc-37
Probiotik 8
(prašek)
Bifidobacterium bifidum NIZO 3804; Bifidobacterium lactis NIZO 3680;
Lactobacillus acidophilus NIZO 3678, NIZO 3887; Lactobacillus paracasei
NIZO 3672; Lactobacillus plantarum NIZO 3684; Lactobacillus rhamnosus
NIZO 3689; Lactobacillus salivarius NIZO 3675; Enterococcus faecium
NIZO3886
Probiotik 9
(prašek)
Lactobacillus acidophilus W55: Lactobacillus acidophilus W37;
Lactobacillus paracasei W72; Lactobacillus rhamnosus W71; Enterococcus
faecium W54; Lactobacillus salivarius W24; Lactobacillus plantarum W62;
Bifidobacterium bifidum W23; Bifidobacterium lactis W18; Bifidobacterium
longum W51
Probiotik 10
(kapsule)
Escherichia coli Nissle 1917
*ni deklariranega seva
Pri raziskavi smo uporabili različne klinične izolate E. coli, ki pripadajo različnim
patotipom (EAEC, EPEC, ETEC), ESBL-pozitivne E. coli ter komenzalni sev E. coli
K12.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
26
Predhodno okarakterizirane seve E. coli: EAEC-V7/291/12 (v nadaljevanju EAEC1),
EAEC-V7/64/12 (v nadaljevanju EAEC2), EAEC-V7/129/12 (v nadaljevanju
EAEC3), EPEC-V7/119/12 (v nadaljevanju EPEC1), EPEC-V7/95/12 (v
nadaljevanju EPEC2), ESBL-V7/291/12 (v nadaljevanju ESBL1) ter ETEC-
V7/291/12 (v nadaljevanju ETEC1) smo dobili iz arhiva Univerze v Ljubljani,
Medicinske Fakultete, Inštituta za mikrobiologijo in imunologijo ter Nacionalnega
laboratorija za zdravje, okolje in hrano. Sev E. coli K12 DSM 1562 (v nadaljevanju
Ec-K12) pa smo uporabili iz zamrznjenih kultur Univerze v Mariboru, Fakultete za
zdravstvene vede.
3.4 Postopki zbiranja podatkov
V teoretičnem delu magistrskega naloge smo s povzemanjem zbrali podatke, ki so
pomembni za raziskavo in razumevanje področja obravnave. Pregledali in primerjali
smo slovensko in tujo literaturo, znanstvene članke in strokovne internetne vire.
Poslužili smo se prosto dostopnih znanstvenih baz: ScienceDirect, PubMed, National
Center for Biotechnology Information, Research Gate.
V drugem, empiričnem delu naloge, smo preverjali vpliv probiotikov na rast in
preživetje različnih sevov bakterije Escherichia coli med inkubacijo v mleku. Delo
smo izvajali v aseptičnih pogojih v mikrobiološkem laboratoriju Fakultete za
zdravstvene vede Univerze v Mariboru. Rezultate smo analizirali in grafično
predstavili s pomočjo programa Microsoft Excel.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
27
4 Rezultati vpliva probiotikov na rast in preživetje E. coli
4.1 Antimikrobni učinek probiotikov z metodo agar spot
V naši raziskavi smo pri merjenju inhibicije upoštevali premer inhibicijske cone brez
točke testnih sevov. Pridobljene vrednosti so povprečja rezultatov enega
eksperimenta, v trikratnih ponovitvah za posamezni probiotik. Antimikrobni učinek
probiotikov smo ocenili po različnih merilih, ki so bila določena v naslednjih
raziskavah: Kholy, et al. (2014), Shokryazdan, et al. (2014), Mami, et al. (2014),
Jacobsen, et al. (1999). V omenjenih raziskavah so avtorji ocenjevali antimikrobni
učinek določenih probiotičnih sevov proti različnim patogenim bakterijam. Pri
merjenju inhibicije so upoštevali premer inhibicijske cone brez točke testnih sevov.
Tabela 3: Merila razponov inhibicijske cone za ocenjevanje antimikrobnega učinka probiotikov
Merila razponov inhibicijske cone glede na referenco
oznaka Kholy, et al. Shokryazdan, et al Mami, et al. Jacobsen, et al
+ 5–10 mm < 10 mm >= 2 mm 2–5 mm
++ 11–17 mm 10–20 mm ni merila >5
+++ > 17 mm > 20 mm ni merila ni merila
Tabela 4 prikazuje ocene antimikrobnega učinka izbranih probiotikov proti različnim
sevom E. coli, glede na različna merila razponov inihibicije, ki so predstavljena v
Tabeli 3. Glede na rezultate naše raziskave, je najbolj primerna ocena
antimikrobnega učinka probiotikov po referenci Kholy, et al., ki v primerjavi z
drugimi ocenami prikaže večje razlike uspešnosti probiotikov. Prav tako
ugotavljamo, da so najšibkejše inhibicije dosegli nekateri probiotiki, ki vsebujejo
monokulture živih mikroorganizmov. Rezultati kažejo manjše razlike v ocenah
patogenih sevov, ki pripadajo enaki skupini patotipov, zato smo v nadaljnih
raziskavah upoštevali samo en sev iz vsake skupine.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
28
Tabela 4: Antimikrobni učinek probiotikov proti različnim sevom in patotipom E.coli z metodo
agar spot
Sev
E. coli
Probiotik Ocena
antimikrobnega
učinka glede na
referenco 1 2 3 5 6 7 9 10
EAEC1
+ +++ + / ++ ++ +++ - Kholy, et al.
++ ++ + + ++ ++ +++ - Shokryazdan, et al
+ + + + + + + - Mami, et al.
++ ++ + + ++ ++ ++ - Jacobsen, et al
EAEC2
++ + / / + +++ ++ / Kholy, et al.
++ + + + + ++ ++ + Shokryazdan, et al
+ + + + + + + + Mami, et al.
++ ++ + + ++ ++ ++ + Jacobsen, et al
EAEC3
++ + / / ++ ++ ++ / Kholy, et al.
++ ++ + + ++ ++ ++ + Shokryazdan, et al
+ + + + + + + + Mami, et al.
++ ++ + + ++ ++ ++ + Jacobsen, et al
EPEC1
+ + + / + + +++ / Kholy, et al.
++ ++ + + ++ + +++ + Shokryazdan, et al
+ + + + + + + + Mami, et al.
++ ++ ++ + ++ ++ ++ + Jacobsen, et al
EPEC2
++ ++ + / + + + / Kholy, et al.
++ ++ + + + + + + Shokryazdan, et al
+ + + + + + + + Mami, et al.
++ ++ ++ + ++ ++ ++ + Jacobsen, et al
ESBL1
++ + + / + / + + Kholy, et al.
++ ++ ++ + + + + + Shokryazdan, et al
+ + + + + + + + Mami, et al.
++ ++ ++ + ++ + ++ ++ Jacobsen, et al
ETEC1
++ +++ / / + + + / Kholy, et al.
++ ++ + + + + ++ + Shokryazdan, et al
+ + + + + + + + Mami, et al.
++ ++ + + ++ ++ ++ + Jacobsen, et al
Ec-K12
+++ +++ - + + / ++ / Kholy, et al.
++ ++ - + ++ + ++ + Shokryazdan, et al
+ + - + + + + + Mami, et al.
++ ++ - + ++ + ++ + Jacobsen, et al
Kjer pomeni: z 1-10 so označeni izbrani probiotiki (Tabela 5). Kholy, et al. (2014): +, 5-10 mm; ++,
11-17 mm; +++, > 17 mm; Shokryazdan, et al. (2014): +, < 10 mm; ++, 10-20 mm; +++, > 20 mm;
Mami, et al. (2014): +, >= 2 mm; Jacobsen, et al. (1999): +, 2-5 mm; ++, >5. /, minimalna inhibicija
(= inhibicija pod merili) <=1mm; -, ni inhibicije.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
29
4.2 Štetje E. coli po tridnevni inkubaciji v mleku, z ali brez
dodanega probiotika
PROBIOTIK 1
Tabela 5: Štetje E. coli na agarju MacConkey po tridnevni inkubaciji na sobni temperaturi v
mleku, z ali brez dodanega probiotika 1
E. coli
Začetno
stanje
E. coli
(cfu/mL)
Koncentracije vzorcev po 72 h inkubaciji (cfu/mL)
E. coli +
mleko RedM
E. coli +
mleko +
probiotik
RedP
EAEC1 7,60 × 108 7,40 × 10
8 0,01 7,10 × 10
7 1,03
EPEC1 7,90 × 107 5,25 × 10
7 0,18 4,70 × 10
7 0,23
ESBL1 5,50 × 108 5,55 × 10
8 0,00 3,10 × 10
7 1,25
ETEC1 6,30 × 108 1,91 × 10
8 0,52 8,50 × 10
6 1,87
EcN 9,70 × 108 8,60 × 10
8 0,05 5,30 × 10
7 1,26
Ec-K12 8,80 × 108 1,62 × 10
8 0,73 3,40 × 10
7 1,41
RedM: stopnja zmanjšanja mikroorganizmov E. coli po inkubaciji v mleku, RedP: stopnja zmanjšanja
mikroorganizmov E. coli po inkubaciji v mleku z dodanim probiotikom
Graf 1: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni temperaturi v
mleku, z ali brez dodanega probiotika 1
Glede na rezultate v Tabeli 5 ugotavljamo, da so se koncentracije različnih sevov E.
coli po treh dneh inkubacije v mleku znižale, vendar v nobenem primeru razlike v
koncentracijah ne dosežejo 1 log10 stopnje. Dodan probiotik 1 je po tridnevni
inkubaciji v mleku znižal koncentracije različnih sevov E. coli za več kot 1 log10
stopnjo, razen ob dodanem patogenem sevu EPEC1.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
30
Tabela 6: Štetje Probiotika 1 na agarjih MRS, PCA, KAZ po tridnevni inkubaciji v mleku, z ali
brez dodane E. coli
agar
Začetno
stanje
probiotika
(cfu/mL)
koncentracije vzorcev po 72 h inkubaciji (cfu/mL)
Probiotik +
mleko Probiotik + mleko + E. coli
Razlika po
inkubaciji
MRS
1,18 × 107 9,00 × 10
8 EAEC1 6,70 × 10
8 -2,30 × 10
8
6,20 × 106 1,55 × 10
9
EPEC1 1,20 × 109 -3,50 × 10
8
ESBL1 8,80 × 109 7,25 × 10
9
ETEC1 2,40 × 109 8,50 × 10
8
1,32 × 107 7,60 × 10
8
EcN 9,50 × 108 1,90 × 10
8
Ec-K12 8,00 × 108 4,00 × 10
7
PCA
1,08 × 105 5,40 × 10
6 EAEC1 1,70 × 10
8 1,65 × 10
8
7,00 × 106 1,30 × 10
9
EPEC1 3,20 × 108 -9,80 × 10
8
ESBL1 2,30 × 109 1,00 × 10
9
ETEC1 5,30 × 108 -7,70 × 10
8
1,35 × 107 1,78 × 10
7
EcN 9,40 × 107 7,62 × 10
7
Ec-K12 1,92 × 107 1,40 × 10
6
KAZ
1,64 × 105 2,00 × 10
6 EAEC1 1,10 × 10
8 1,08 × 10
8
4,90 × 106 3,00 × 10
7
EPEC1 3,00 × 107 0,00
ESBL1 3,00 × 107 0,00
ETEC1 3,00 × 107 0,00
3,60 × 107 5,50 × 10
7
EcN 3,90 × 107 -1,60 × 10
7
Ec-K12 5,60 × 107 1,00 × 10
6
Razlika po inkubaciji med cfu (probiotik + mleko + E. coli) in cfu (probiotik + mleko)
Želeli smo izvedeti, ali je tridnevna inkubacija probiotika z ali brez dodanih sevov E.
coli v mleku vplivala na število nastalih kolonij probiotičnih bakterij. Glede na
rezultate v Tabeli 6 lahko povzamemo, da so dodani sevi E. coli na agarju MRS
povzročili manjše spremembe v številu probiotičnih mikroorganizmov, ki so bili
inkubirani v mleku. Nekoliko večjo razliko v številu probiotičnih mikroorganizmov
ugotavljamo v primeru dodanega patogenega seva ESBL1, kjer smo opazili
povečano rast probiotičnih mikroorganizmov. Na agarju PCA se je število
probiotičnih mikroorganizmov povečalo v primeru dodanega patogena seva ESBL1,
zmanjšalo pa ob dodanima patogenima sevoma EPEC1 in ETEC1. Na agarju KAZ se
je število probiotičnih mikroorganizmov povečalo ob dodanem patogenem sevu
EAEC1, v ostalih primerih dodani sevi E. coli niso povzročili sprememb.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
31
PROBIOTIK 2
Tabela 7: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni temperaturi v
mleku, z ali brez dodanega probiotika 2
E. coli
Začetno
stanje
E. coli
(cfu/mL)
koncentracije vzorcev po 72 h inkubaciji (cfu/mL)
E. coli + mleko RedM
E. coli +
mleko +
probiotik
RedP
EAEC1 4,20 × 108 3,60 × 10
8 0,07 8,40 × 10
7 0,70
EPEC1 4,70 × 108 8,00 × 10
8 -0,23 5,10 × 10
6 1,96
ESBL1 3,40 × 108 1,48 × 10
8 -0,64 1,10 × 10
7 1,49
ETEC1 1,85 × 108 2,45 × 10
8 -0,12 7,20 × 10
6 1,41
EcN 5,60 × 108 2,80 × 10
8 0,30 8,60 × 10
5 2,81
Ec-K12 8,20 × 108 7,30 × 10
8 0,05 8,20 × 10
7 1,00
RedM: stopnja zmanjšanja mikroorganizmov E. coli po inkubaciji v mleku, RedP: stopnja zmanjšanja
mikroorganizmov E. coli po inkubaciji v mleku z dodanim probiotikom
Graf 2: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni temperaturi v
mleku, z ali brez dodanega probiotika 2
Glede na rezultate v Tabeli 7 ugotavljamo, da so se koncentracije patogenih sevov
EPEC1, ETEC1 ter ESBL1 po treh dneh inkubacije v mleku povišale, koncentracije
patogenega seva EAEC1, komenzalnega seva Ec-K12 ter probiotičnega seva EcN pa
so se po treh dneh inkubacije v mleku znižale. Razlike v koncentracijah v nobenem
primeru ne dosežejo 1 log10 stopnje. Dodan probiotik 2 je po treh dneh inkubacije v
mleku v vseh primerih znižal koncentracije različnih sevov E. coli za najmanj 10-
krat, razen pri patogenem sevu EAEC1, kjer je razlika v koncentraciji 0,7 log10.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
32
Tabela 8: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 2) na MRS, PCA, KAZ agarjih po
tridnevni inkubaciji v mleku, z ali brez dodane E. coli
agar
Začetno
stanje
probiotika
(cfu/mL)
koncentracije vzorcev po 72 h inkubaciji (cfu/mL)
Probiotik +
mleko Probiotik + mleko+ E. coli
Razlika po
inkubaciji
MRS
6,90 × 106 7,50 × 10
8
EAEC1 6,50 × 108 -1,00 × 10
8
EPEC1 2,70 × 108 -4,80 × 10
8
ESBL1 4,80 × 108 -2,70 × 10
8
ETEC1 7,70 × 108 2,00 × 10
7
6,30 × 104 6,00 × 10
8
EcN 5,90 × 108 -1,00 × 10
7
Ec-K12 9,10 × 108 3,10 × 10
8
PCA 7,20 × 106 9,20 × 10
7
EAEC1 2,75 × 108 1,83 × 10
8
EPEC1 1,95 × 107 -7,25 × 10
7
ESBL1 2,73 × 108 1,81 × 10
8
ETEC1 2,19 × 108 1,27 × 10
8
KAZ
1,21 × 107 5,80 × 10
5
EAEC1 1,01 × 106 4,30 × 10
5
EPEC1 1,40 × 107 1,34 × 10
7
ESBL1 1,20 × 107 1,14 × 10
7
ETEC1 1,03 × 108 1,02 × 10
8
2,10 × 105 1,50 × 10
4
EcN 5,90 × 107 5,90 × 10
7
Ec-K12 7,00 × 107 7,00 × 10
7
Razlika po inkubaciji med cfu (probiotik + mleko + E. coli) in cfu (probiotik + mleko)
Glede na rezultate v Tabeli 8 lahko povzamemo, da so dodani sevi E. coli na agarju
MRS povzročili manjše spremembe v številu probiotičnih mikroorganizmov, ki so
bili inkubirani v mleku. Nekoliko večjo razliko v številu probiotičnih
mikroorganizmov ugotavljamo v primeru dodanega patogenega seva EPEC1, kjer
smo opazili zmanjšano rast probiotičnih mikroorganizmov. Na agarju PCA se je
število probiotičnih mikroorganizmov povečalo v vseh primerih, razen ob dodanem
patogenem sevu EPEC1. Na agarju KAZ se je v vseh primerih število probiotičnih
mikroorganizmov ob dodanih sevih E. coli povečalo.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
33
PROBIOTIK 3
Tabela 9: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni temperaturi v
mleku, z ali brez dodanega probiotika 3
E. coli
Začetno
stanje
E. coli
(cfu/mL)
koncentracije vzorcev po 72 h inkubaciji (cfu/mL)
E. coli + mleko RedM
E. coli +
mleko +
probiotik
RedP
EAEC1 7,60 × 108 7,40 × 10
8 0,01 1,00 × 10
7 1,88
EPEC1 2,20 × 108 9,60 × 10
8 -0,64 5,60 × 10
6 1,59
ESBL1 4,70 × 108 3,20 × 10
8 0,17 6,00 × 10
6 1,89
ETEC1 6,00 × 108 5,10 × 10
8 0,07 5,10 × 10
7 1,07
EcN 5,60 × 108 2,80 × 10
8 0,30 3,00 × 10
6 2,27
Ec-K12 8,20 × 108 7,30 × 10
8 0,05 6,20 × 10
7 1,12
RedM: stopnja zmanjšanja mikroorganizmov E. coli po inkubaciji v mleku, RedP: stopnja zmanjšanja
mikroorganizmov E. coli po inkubaciji v mleku z dodanim probiotikom
Graf 3: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni temperaturi v
mleku, z ali brez dodanega probiotika 3
Glede na rezultate v Tabeli 9 ugotavljamo, da so se koncentracije različnih sevov E.
coli po treh dneh inkubacije v mleku znižale, razen v primeru dodanega patogenega
seva EPEC1, vendar pa razlike v koncentracijah v nobenem primeru ne dosežejo 1
log10 stopnje. Dodan probiotik 3 je po treh dneh inkubacije v mleku v vseh primerih
znižal koncentracije različnih sevov E. coli za več kot 1 log10 stopnjo.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
34
Tabela 10: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 3) na MRS, PCA, KAZ agarjih po
tridnevni inkubaciji v mleku, z ali brez dodane E. coli
agar
Začetno
stanje
probiotika
(cfu/mL)
koncentracije vzorcev po 72 h inkubaciji (cfu/mL)
Probiotik +
mleko Probiotik + mleko+ E. coli
Razlika po
inkubaciji
MRS
3,40 × 107 8,30 × 10
8
EAEC1 1,15 × 109 3,20 × 10
8
EPEC1 7,00 × 108 -1,30 × 10
8
ESBL1 8,10 × 108 -2,00 × 10
7
ETEC1 8,20 × 109 7,37 × 10
9
5,00 × 107 2,90 × 10
8
EcN 1,80 × 109 1,51 × 10
9
Ec-K12 4,00 × 108 1,10 × 10
8
PCA
1,00 × 103 1,08 × 10
6
EAEC1 4,10 × 108 4,09 × 10
8
EPEC1 1,27 × 107 1,16 × 10
7
ESBL1 4,70 × 107 4,59 × 10
7
ETEC1 2,20 × 108 2,19 × 10
8
2,00 × 103 4,50 × 10
8
EcN 8,60 × 108 4,10 × 10
8
Ec-K12 3,60 × 108 -9,00 × 10
7
KAZ
1,00 × 103 4,00 × 10
5
EAEC1 7,80 × 107 7,76 × 10
7
EPEC1 5,80 × 106 5,40 × 10
6
ESBL1 7,90 × 106 7,50 × 10
6
ETEC1 1,00 × 108 9,96 × 10
7
1,00 × 103 1,10 × 10
8
EcN 1,30 × 108 2,00 × 10
7
Ec-K12 1,50 × 108 4,00 × 10
7
Razlika po inkubaciji med cfu (probiotik + mleko + E. coli) in cfu (probiotik + mleko)
Glede na rezultate v Tabeli 10 lahko povzamemo, da sta večje spremembe v
povišanju števila probiotičnih mikroorganizmov na agarju MRS povzročila patogeni
sev EAEC1 in probiotični sev EcN. Na agarju PCA se je število probiotičnih
mikroorganizmov povečalo v vseh primerih, razen ob dodanem komenzalnem sevu
Ec-K12, kjer ugotavljamo rahlo zmanjšanje rasti probiotičnih mikroorganizmov. Na
agarju KAZ se je v vseh primerih število probiotičnih mikroorganizmov ob dodanih
sevih E. coli povečalo.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
35
PROBIOTIK 4
Tabela 11: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni temperaturi v
mleku, z ali brez dodanega probiotika 4
E. coli
Začetno
stanje
E. coli
(cfu/mL)
koncentracije vzorcev po 72 h inkubaciji (cfu/mL)
E. coli + mleko RedM
E. coli +
mleko +
probiotik
Redp
EAEC1 7,60 × 108 7,40 × 10
8 0,01 6,20 × 10
7 1,09
EPEC1 2,20 × 108 9,60 × 10
8 -0,64 3,80 × 10
7 0,76
ESBL1 4,70 × 108 3,20 × 10
8 0,17 5,30 × 10
6 1,95
ETEC1 6,00 × 108 5,10 × 10
8 0,07 1,16 × 10
7 1,71
EcN 5,60 × 108 2,80 × 10
8 0,30 1,50 × 10
5 3,57
Ec-K12 8,20 × 108 7,30 × 10
8 0,05 5,50 × 10
7 1,17
RedM: stopnja zmanjšanja mikroorganizmov E. coli po inkubaciji v mleku, RedP: stopnja zmanjšanja
mikroorganizmov E. coli po inkubaciji v mleku z dodanim probiotikom
Graf 4: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni temperaturi v
mleku, z ali brez dodanega probiotika 4
Glede na rezultate v Tabeli 11 ugotavljamo, da so se koncentracije različnih sevov E.
coli po treh dneh inkubacije v mleku znižale, razen pri patogenem sevu EPEC1.
Razlike v koncentracijah v nobenem primeru ne dosežejo 1 log10 stopnje. Dodan
probiotik 4 je po tridnevni inkubaciji v mleku znižal koncentracije vseh sevov E.
coli. Rezultati kažejo 10-kratno znižanje koncentracij patogenih sevov EAEC1,
EPEC1 in ETEC1 ter 100-kratno znižanje koncentracije patogenega seva ESBL1. Pri
EcN lahko opazimo znižanje koncentracije po inkubaciji v mleku za več kot 3 log10
stopnje.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
36
Tabela 12: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 4) na MRS, PCA, KAZ agarjih po
tridnevni inkubaciji v mleku, z ali brez dodane E. coli
agar
Začetno
stanje
probiotika
(cfu/mL)
koncentracije vzorcev po 72 h inkubaciji (cfu/mL)
Probiotik +
mleko Probiotik + mleko+ E. coli
Razlika po
inkubaciji
MRS
6,60 × 107 8,50 × 10
8
EAEC1 4,90 × 108 -3,60 × 10
8
EPEC1 4,40 × 109 3,55 × 10
9
ESBL1 8,60 × 109 7,75 × 10
9
ETEC1 4,10 × 109 3,25 × 10
9
4,60 × 106 2,80 × 10
8
EcN 7,40 × 108 4,60 × 10
8
Ec-K12 8,20 × 108 5,40 × 10
8
PCA
4,20 × 107 6,10 × 10
6
EAEC1 6,30 × 107 5,69 × 10
7
EPEC1 5,90 × 107 5,29 × 10
7
ESBL1 6,70 × 106 6,00 × 10
5
ETEC1 5,00 × 108 4,94 × 10
8
5,00 × 106 4,50 × 10
8
EcN 5,50 × 108 1,00 × 10
8
Ec-K12 4,90 × 108 4,00 × 10
7
KAZ
6,80 × 107 7,00 × 10
6
EAEC1 3,60 × 107 2,90 × 10
7
EPEC1 4,20 × 107 3,50 × 10
7
ESBL1 1,52 × 106 -5,48 × 10
6
ETEC1 7,40 × 107 6,70 × 10
7
4,30 × 106 3,10 × 10
7
EcN 6,10 × 107 3,00 × 10
7
Ec-K12 8,70 × 107 5,60 × 10
7
Razlika po inkubaciji med cfu (probiotik + mleko + E. coli) in cfu (probiotik + mleko)
Glede na rezultate v Tabeli 12 lahko povzamemo, da so večje razlike v povišanju
števila probiotičnih mikroorganizmov v mleku na agarju MRS povzročili patogeni
sevi EPEC1, ESBL1 in ETEC1. Na agarju PCA se je v vseh primerih število
probiotičnih mikroorganizmov povečalo. Minimalno rast probiotičnih
mikroorganizmov ugotavljamo ob dodanem patogenem sevu ESBL1, probiotičnem
sevu EcN in komenzalnem sevu Ec-K12. Na agarju KAZ se je v večini primerov ob
dodanih sevih E. coli število probiotičnih mikroorganizmov povečalo, razen ob
dodanem patogenem sevu ESBL1, kjer ugotavljamo zmanjšano rast probiotičnih
mikroorganizmov.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
37
PROBIOTIK 5
Tabela 13: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni temperaturi v
mleku, z ali brez dodanega probiotika 5
E. coli
Začetno
stanje
E. coli
(cfu/mL)
koncentracije vzorcev po 72 h inkubaciji (cfu/mL)
E. coli + mleko RedM
E. coli +
mleko +
probiotik
RedP
EAEC1 7,60 × 108 7,40 × 10
8 0,01 4,00 × 10
7 1,28
EPEC1 2,20 × 108 9,60 × 10
8 -0,64 3,90 × 10
7 0,75
ESBL1 4,70 × 108 3,20 × 10
8 0,17 9,00 × 10
7 0,72
ETEC1 6,00 × 108 5,10 × 10
8 0,07 2,10 × 10
8 0,46
EcN 5,60 × 108 2,80 × 10
8 0,30 3,60 × 10
7 1,19
Ec-K12 8,20 × 108 7,30 × 10
8 0,05 6,70 × 10
8 0,09
RedM: stopnja zmanjšanja mikroorganizmov E. coli po inkubaciji v mleku, RedP: stopnja zmanjšanja
mikroorganizmov E. coli po inkubaciji v mleku z dodanim probiotikom
Graf 5: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni temperaturi v
mleku, z ali brez dodanega probiotika 5
Glede na rezultate v Tabeli 13 ugotavljamo, da so se koncentracije različnih sevov E.
coli po treh dneh inkubacije v mleku znižale, razen pri patogenem sevu EPEC1, kjer
lahko opazimo povišanje koncentracije. Dodan probiotik 5 je po tridnevni inkubaciji
v mleku znižal koncentracije vseh sevov E. coli. V večini primerov so razlike v
zmanjšanju koncentracije manjše od 1 log10 stopnje, razen pri dodanem patogenem
sevu EAEC1 in probiotičnem sevu EcN.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
38
Tabela 14: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 5) na MYP in PCA agarjih po
tridnevni inkubaciji v mleku, z ali brez dodane E. coli
agar
Začetno
stanje
probiotika
(cfu/mL)
koncentracije vzorcev po 72 h inkubaciji (cfu/mL)
Probiotik +
mleko Probiotik + mleko+ E. coli
Razlika po
inkubaciji
MYP
1,13 × 106 1,50 × 10
7
EAEC1 1,30 × 108 1,15 × 10
8
EPEC1 4,00 × 108 3,85 × 10
8
ESBL1 8,30 × 107 6,80 × 10
7
ETEC1 1,40 × 108 1,25 × 10
8
7,60 × 1011
6,60 × 108
EcN 7,30 × 108 7,00 × 10
7
Ec-K12 6,00 × 109 5,34 × 10
9
PCA
4,70 × 109 3,20 × 10
7
EAEC1 1,08 × 108 7,60 × 10
7
EPEC1 3,40 × 108 3,08 × 10
8
ESBL1 5,10 × 109 5,07 × 10
9
ETEC 1 7,20 × 108 6,88 × 10
8
9,80 × 107 5,80 × 10
8
EcN 2,10 × 109 1,52 × 10
9
Ec-K12 1,50 × 109 9,20 × 10
8
Razlika po inkubaciji med cfu (probiotik + mleko + E. coli) in cfu (probiotik + mleko)
Glede na rezultate v Tabeli 14 lahko povzamemo, da se je število probiotičnih
mikroorganizmov na agarju MYP ob dodanih sevih E. coli v vseh primerih povečalo.
Najmanjšo spremembo rasti ugotavljamo v primeru dodanega probiotičnega seva
EcN. Število probiotičnih mikroorganizmov se je v vseh primerih povečalo tudi na
agarju PCA.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
39
PROBIOTIK 6
Tabela 15: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni temperaturi v
mleku, z ali brez dodanega probiotika 6
E. coli
Začetno
stanje
E. coli
(cfu/mL)
koncentracije vzorcev po 72 h inkubaciji (cfu/mL)
E. coli + mleko RedM
E. coli +
mleko +
probiotik
RedP
EcN 5,60 × 108 2,80 × 10
8 0,30 3,00 × 10
6 2,27
Ec-K12 8,20 × 108 7,30 × 10
8 0,05 2,60 × 10
8 0,50
RedM: stopnja zmanjšanja mikroorganizmov E. coli po inkubaciji v mleku, RedP: stopnja zmanjšanja
mikroorganizmov E. coli po inkubaciji v mleku z dodanim probiotikom
Graf 6: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni temperaturi v
mleku, z ali brez dodanega probiotika 6
Glede na rezultate v Tabeli 15 ugotavljamo majhne spremembe v koncentracijah
probiotičnega seva EcN ter komenzalnega seva Ec-K12 po treh dneh inkubacije v
mleku. Dodan probiotik 6 je po tridnevni inkubaciji v mleku zmanjšal koncentracijo
EcN za več kot 2 log10 stopnji.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
40
Tabela 16: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 6) na MRS, PCA, KAZ agarjih po
tridnevni inkubaciji mleku, z ali brez dodane E. coli
agar
Začetno stanje
probiotika
(cfu/mL)
koncentracije vzorcev po 72 h inkubaciji (cfu/mL)
Probiotik +
mleko Probiotik + mleko+ E. coli
Razlika po
inkubaciji
MRS 2,20 × 108 4,60 × 10
8
EcN 6,30 × 108 1,70 × 10
8
Ec-K12 5,10 × 108 5,00 × 10
7
PCA 3,00 × 106 5,70 × 10
8
EcN 5,40 × 108 -3,00 × 10
7
Ec-K12 6,00 × 108 3,00 × 10
7
KAZ 5,10 × 106 3,80 × 10
7
EcN 1,15 × 108 7,70 × 10
7
Ec-K12 1,49 × 108 1,11 × 10
8
Razlika po inkubaciji med cfu (probiotik + mleko + E. coli) in cfu (probiotik + mleko)
Glede na rezultate v Tabeli 16 lahko povzamemo, da sta probiotični sev EcN in
komenzani sev Ec-K12 na agarjih MRS in PCA povzročila manjše spremembe v
rasti probiotičnih mikroorganizmov v mleku. Na agarju KAZ ugotavljamo večjo rast
probiotičnih mikroorganizmov ob dodanih EcN in Ec-K12.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
41
PROBIOTIK 7
Tabela 17: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni temperaturi v
mleku, z ali brez dodanega probiotika 7
E. coli
Začetno
stanje
E. coli
(cfu/mL)
koncentracije vzorcev po 72 h inkubaciji (cfu/mL)
E. coli + mleko RedM
E. coli +
mleko +
probiotik
RedP
EAEC1 3,12 × 109 6,29 × 10
8 0,70 2,90 × 10
8 1,03
EPEC1 7,90 × 107 5,25 × 10
7 0,18 5,80 × 10
7 0,13
ESBL1 5,50 × 108 5,55 × 10
8 0,00 5,50 × 10
7 1,00
ETEC1 6,30 × 108 1,91 × 10
8 0,52 1,68 × 10
8 0,57
RedM: stopnja zmanjšanja mikroorganizmov E. coli po inkubaciji v mleku, RedP: stopnja zmanjšanja
mikroorganizmov E. coli po inkubaciji v mleku z dodanim probiotikom
Graf 7: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni temperaturi v
mleku, z ali brez dodanega probiotika 7
Glede na rezultate v Tabeli 17 ugotavljamo, da so se koncentracije patogenih sevov
EAEC1, EPEC1 in ETEC1 po treh dneh inkubacije v mleku znižale, pri ESBL1 pa ni
sprememb v koncentraciji. Dodan probiotik 7 je po tridnevni inkubaciji v mleku
znižal koncentracije vseh patogenih sevov E. coli. Razliko v koncentraciji za 1 log10
stopnjo ugotavljamo v primeru patogenih sevov EAEC1 ter ESBL1.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
42
Tabela 18: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 7) na MRS in PCA agarjih po
tridnevni inkubaciji v mleku, z ali brez dodane E. coli
agar
Začetno
stanje
probiotika
(cfu/mL)
koncentracije vzorcev po 72 h inkubaciji (cfu/mL)
Probiotik +
mleko Probiotik + mleko+ E. coli
Razlika po
inkubaciji
MRS
6,80 × 1012
1,40 × 109 EAEC1 8,60 × 10
8 -5,40 × 10
8
3,50 × 106 3,50 × 10
9
EPEC1 5,10 × 108 -2,99 × 10
9
ESBL1 4,30 × 109 8,00 × 10
8
ETEC1 4,70 × 109 1,20 × 10
9
PCA 4,30 × 106 1,00 × 10
9
EPEC1 2,70 × 108 -7,30 × 10
8
ESBL1 1,80 × 108 -8,20 × 10
8
ETEC1 2,40 × 109 1,40 × 10
9
Razlika po inkubaciji med cfu (probiotik + mleko + E. coli) in cfu (probiotik + mleko)
Glede na rezultate v Tabeli 18 lahko povzamemo, da sta večje spremembe v številu
probiotičnih mikroorganizmov na agarju MRS povzročila patogena seva EAEC1 in
EPEC1, ki sta zmanjšala rast probiotičnih mikroorganizmov. Število probiotičnih
mikroorganizmov se je nekoliko povečalo ob dodanih patogenih sevih ESBL1 in
ETEC1. Na agarju PCA ugotavljamo zmanjšanje števila probiotičnih
mikroorganizmov ob dodanih patogenih sevih EPEC1 in ESBL1.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
43
PROBIOTIK 8
Tabela 19: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni temperaturi v
mleku, z ali brez dodanega probiotika 8
E. coli
Začetno
stanje
E. coli
(cfu/mL)
koncentracije vzorcev po 72 h inkubaciji (cfu/mL)
E. coli + mleko RedM
E. coli +
mleko +
probiotik
RedP
EAEC1 1,94 × 109 6,85 × 10
8 0,45 4,10 × 10
8 0,68
EPEC1 7,90 × 107 5,25 × 10
7 0,18 4,30 × 10
7 0,26
ESBL1 5,50 × 108 5,55 × 10
8 0,00 3,20 × 10
7 1,24
ETEC1 6,30 × 108 1,91 × 10
8 0,52 4,60 × 10
7 1,14
EcN 5,60 × 108 2,80 × 10
8 0,30 1,10 × 10
6 2,71
Ec-K12 8,20 × 108 7,30 × 10
8 0,05 3,70 × 10
7 1,35
RedM: stopnja zmanjšanja mikroorganizmov E. coli po inkubaciji v mleku, RedP: stopnja zmanjšanja
mikroorganizmov E. coli po inkubaciji v mleku z dodanim probiotikom
Graf 8: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni temperaturi v
mleku, z ali brez dodanega probiotika 8
Glede na rezultate v Tabeli 19 ugotavljamo, da so se koncentracije različnih sevov
E. coli po treh dneh inkubacije v mleku znižale, razen pri patogenem sevu ESBL1 in
komenzalnem sevu Ec-K12, kjer ni sprememb v koncentraciji oziroma so
spremembe minimalne. Dodan probiotik 8 je po tridnevni inkubaciji v mleku znižal
koncentracije vseh sevov E. coli. Opazimo lahko najmanj 10-kratno znižanje
koncentracij sevov E. coli, razen pri patogenima sevoma EPEC1 ter EAEC1, kjer ni
znižanja v stopnji (cfu/ml).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
44
Tabela 20: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 8) na MRS, PCA, KAZ agarjih po
tridnevni inkubaciji v mleku, z ali brez dodane E. coli
agar
Začetno stanje
probiotika
(cfu/mL)
koncentracije vzorcev po 72 h inkubaciji (cfu/mL)
Probiotik +
mleko Probiotik + mleko+ E. coli
Razlika po
inkubaciji
MRS
6,70 × 1010
2,60 × 109 EAEC1 1,10 × 10
9 -1,50 × 10
9
9,60 × 107 4,00 × 10
9
EPEC1 3,20 × 109 -8,00 × 10
8
ESBL1 6,30 × 109 2,30 × 10
9
ETEC1 2,50 × 109 -1,50 × 10
9
3,30 × 109 7,60 × 10
8
EcN 1,01 × 109 2,50 × 10
8
Ec-K12 3,90 × 109 3,14 × 10
9
PCA
7,00 × 108 4,00 × 10
7 EAEC1 1,36 × 10
8 9,60 × 10
7
8,00 × 107 2,50 × 10
9
EPEC1 2,20 × 109 -3,00 × 10
8
ESBL1 5,20 × 109 2,70 × 10
9
ETEC1 3,20 × 108 -2,18 × 10
9
4,40 × 109 1,10 × 10
9
EcN 1,90 × 109 8,00 × 10
8
Ec-K12 2,50 × 109 1,40 × 10
9
KAZ
2,57 × 108 3,90 × 10
7 EAEC1 4,50 × 10
7 6,00 × 10
6
4,30 × 106 3,00 × 10
7
EPEC1 3,00 × 107 0,00
ESBL1 3,00 × 107 0,00
ETEC1 4,00 × 107 1,00 × 10
7
9,20 × 106 1,00 × 10
7
EcN 3,00 × 107 2,00 × 10
7
Ec-K12 2,60 × 107 1,60 × 10
7
Razlika po inkubaciji med cfu (probiotik + mleko + E. coli) in cfu (probiotik + mleko)
Glede na rezultate v Tabeli 20 lahko povzamemo, da se je število probiotičnih
mikroorganizmov na agarju MRS povečalo v primeru dodanega probiotičnega seva
EcN, komenzalnega seva Ec-K12 ter patogenega seva ESBL1. Na agarju PCA se je
število probiotičnih mikroorganizmov povečalo v vseh primerih, razen ob dodanima
patogenima sevoma ETEC1 ter EPEC1. Na agarju KAZ se je število probiotičnih
mikroorganizmov najbolj povečalo v primeru dodanega probiotičenga seva EcN in
komenzalnega seva Ec-K12, v ostalih primerih ni sprememb v rasti probiotičnih
mikroorganizmov ali pa so spremembe minimalne.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
45
PROBIOTIK 9
Tabela 21: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni temperaturi v
mleku, z ali brez dodanega probiotika 9
E. coli
Začetno
stanje
E. coli
(cfu/mL)
koncentracije vzorcev po 72 h inkubaciji (cfu/mL)
E. coli + mleko RedM
E. coli +
mleko +
probiotik
RedP
EAEC1 1,94 × 109 6,85 × 10
8 0,45 4,03 × 10
8 0,68
EPEC1 7,90 × 107 5,25 × 10
7 0,18 8,60 × 10
6 0,96
ESBL1 5,50 × 108 5,55 × 10
8 0,00 5,20 × 10
7 1,02
ETEC1 6,30 × 108 1,91 × 10
8 0,52 3,30 × 10
8 0,28
EcN 5,60 × 108 2,80 × 10
8 0,30 2,20 × 10
6 2,41
Ec-K12 8,20 × 108 7,30 × 10
8 0,05 3,10 × 10
7 1,42
RedM: stopnja zmanjšanja mikroorganizmov E. coli po inkubaciji v mleku, RedP: stopnja zmanjšanja
mikroorganizmov E. coli po inkubaciji v mleku z dodanim probiotikom
Graf 9: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni temperaturi v
mleku, z ali brez dodanega probiotika 9
Glede na rezultate v Tabeli 21 ugotavljamo, da so se koncentracije različnih sevov E.
coli po tridnevni inkubaciji v mleku znižale, razen pri patogenem sevu ESBL1 in
komenzalnem sevu Ec-K12, kjer ni sprememb v koncentraciji oziroma so
spremembe minimalne. Dodan probiotik 9 je po tridnevni inkubaciji v mleku znižal
koncentracije vseh sevov E. coli. Razliko v koncentraciji za najmanj 1 log10 stopnjo
ugotavljamo v primeru sevov EcN in Ec-K12 ter patogenega seva ESBL1.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
46
Tabela 22: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 9) na MRS, PCA, KAZ agarjih po
tridnevni inkubaciji v mleku, z ali brez dodane E. coli
agar
Začetno stanje
probiotika
(cfu/mL)
koncentracije vzorcev po 72 h inkubaciji (cfu/mL)
Probiotik +
mleko Probiotik + mleko+ E. coli
Razlika po
inkubaciji
MRS
3,40 × 109 1,48 × 10
9 EAEC1 9,60 × 10
8 -5,20 × 10
8
1,11 × 108 3,90 × 10
9
EPEC1 3,70 × 109 -2,00 × 10
8
ESBL1 1,90 × 109 -2,00 × 10
9
ETEC1 7,70 × 109 3,80 × 10
9
7,00 × 107 3,20 × 10
8
EcN 1,21 × 109 8,90 × 10
8
Ec-K12 1,30 × 109 9,80 × 10
8
PCA
2,18 × 108 5,00 × 10
8 EAEC1 5,80 × 10
7 -4,42 × 10
8
1,05 × 108 2,20 × 10
9
EPEC1 7,00 × 108 -1,50 × 10
9
ESBL1 4,40 × 108 -1,76 × 10
9
ETEC1 2,60 × 109 4,00 × 10
8
3,50 × 107 7,10 × 10
8
EcN 8,40 × 108 1,30 × 10
8
Ec-K12 4,90 × 108 -2,20 × 10
8
KAZ
1,30 × 108 7,30 × 10
6 EAEC1 2,50 × 10
6 -4,80 × 10
6
1,70 × 106 5,00 × 10
6
EPEC1 5,80 × 106 8,00 × 10
6
ESBL1 3,00 × 107 2,50 × 10
7
ETEC1 6,00 × 105 -4,40 × 10
6
8,60 × 106 6,20 × 10
6
EcN 1,05 × 108 9,88 × 10
7
Ec-K12 7,60 × 107 6,98 × 10
7
Razlika po inkubaciji med cfu (probiotik + mleko + E. coli) in cfu (probiotik + mleko)
Glede na rezultate v Tabeli 22 lahko povzamemo, da se je število probiotičnih
mikroorganizmov na agarju MRS povečalo v primeru dodanega patogenega seva
ETEC1, probiotičnega seva EcN ter komenzalnega seva Ec-K12. Na agarju PCA
ugotavljamo zmanjšanje števila probiotičnih mikroorganizmov v vseh primerih,
razen v primeru patogenega seva ETEC1 ter probiotičnega seva EcN, kjer so
spremembe v rasti probiotičnih mikroorganizmov minimalne. Na agarju KAZ se je
število probiotičnih mikroorganizmov najbolj povečalo v primeru dodanega
probiotičenga seva EcN, komenzalnega seva Ec-K12 ter patogenega seva ESBL1.
Zmanjšanje števila probiotičnih mikroorganizmov ugotavljamo v primeru dodanega
patogenega seva ETEC1.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
47
4.3 Identifikacija DNA E. coli s pomočjo molekularne metode PCR
Slika 1: Agarozna gelska elektroforeza pomnožkov PCR za identifikacijo vzorcev DNA različnih
sevov bakterije E. coli
Vir: lasten arhiv (2017)
Kjer pomeni: Ec1: EAEC1, Ec2: EAEC2, Ec3: EAEC3; Ec4: EPEC1, Ec5: EPEC2; Ec6: ESBL1;
Ec7: ETEC1.
Pozitivne rezultate pomnožkov PCR bakterije E. coli smo dobili pri vseh vzorcih (pri
velikostnem razredu 670 bp).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
48
Slika 2: Agarozna gelska elektroforeza pomnožkov PCR za identifikacijo vzorcev DNA
bakterije E. coli Nissle 1917 ob dodanih probiotikih
Vir: lasten arhiv (2017)
Kjer pomeni: 1: Escherichia coli sev Nissle 1917 (v nadaljevanju EcN) + probiotik 1; 2: EcN +
probiotik 3; 3: EcN + probiotik 5; 4: EcN + probiotik 6; 5: EcN + probiotik 8; 6: EcN + probiotik 2; 7:
EcN + probiotik 4; Neg. kontr.: negativna kontrola.
Pozitivne rezultate pomnožkov PCR bakterije E. coli smo dobili pri vseh vzorcih (pri
velikostnem razredu 670 bp).
Slika 3: Agarozna gelska elektroforeza pomnožkov PCR za identifikacijo vzorcev DNA
enteropatogene E. coli (EPEC1) ter ESBL-pozitivne E. coli (ESBL1) ob dodanih probiotikih
Vir: lasten arhiv (2017)
Kjer pomeni: 1: EPEC1 + probiotik 1; 2: EPEC1 + probiotik 3; 3: EPEC1 + probiotik 5; 4: EPEC1 +
probiotik 8; 5: EPEC1 + probiotik 4; 6: EPEC1 + probiotik 9; 7: EPEC1 + probiotik 2; 8: EPEC1 +
probiotik 7; 9: ESBL1 + probiotik 1; 10: ESBL1 + probiotik 3; 11: ESBL1 + probiotik 5; 12: ESBL1
+ probiotik 8; 13: ESBL1 + probiotik 4; 14: ESBL1 + probiotik 9; 15: ESBL1 + probiotik 2; 16:
ESBL1 + probiotik 7; Neg. kontr.: negativna kontrola.
Pozitivne rezultate pomnožkov PCR bakterije E. coli smo dobili pri vseh vzorcih (pri
velikostnem razredu 670 bp).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
49
Slika 4: Agarozna gelska elektroforeza pomnožkov PCR za identifikacijo vzorcev DNA
enterotoksigene E. coli (ETEC1) ter enteroagregativne E. coli (EAEC1) ob dodanih probiotikih
Vir: lasten arhiv (2017)
Kjer pomeni: 1: ETEC1 + probiotik 1; 2: ETEC1 + probiotik 3; 3: ETEC1 + probiotik 5; 4: ETEC1 +
probiotik 8; 5: ETEC1 + probiotik 4; 6: ETEC1 + probiotik 9; 7: ETEC1 + probiotik 2; 8: ETEC1 +
probiotik 7; 9: EAEC1 + probiotik 1; 10: EAEC1 + probiotik 3; 11: EAEC1 + probiotik 5; 12: EAEC1
+ probiotik 8; 13: EAEC1 + probiotik 4; 14: EAEC1 + probiotik 9; Neg. kontr.: negativna kontrola.
Pozitivne rezultate pomnožkov PCR bakterije E. coli smo dobili pri vseh vzorcih (pri
velikostnem razredu 670 bp).
Slika 5: Agarozna gelska elektroforeza pomnožkov PCR za identifikacijo vzorcev DNA
enterotoksigene E. coli (ETEC1) ob dodanih probiotikih
Vir: lasten arhiv (2017)
Kjer pomeni: 1: ETEC1 + probiotik 1; 2: ETEC1 + probiotik 3; 3: ETEC1 + probiotik 5; 4: ETEC1 +
probiotik 6; 5: ETEC1 + probiotik 8; 6: ETEC1 + probiotik 2; 7: ETEC1 + probiotik 4; Neg. kontr.:
negativna kontrola.
Pozitivne rezultate pomnožkov PCR bakterije E. coli smo dobili pri vseh vzorcih (pri
velikostnem razredu 670 bp).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
50
5 Interpretacija in razprava
V magistrskem delu smo preverili vpliv probiotikov na rast in preživetje bakterije
Escherichia coli med inkubacijo v mleku. Imena probiotikov smo izpustili, da bi
omogočili nepristranskost raziskave. Probiotični sevi imajo različne mehanizme
delovanja, s čimer tudi njihovi pozitivni učinki niso splošni. To pomeni, da vsi
probiotiki niso enako uspešni pri preprečevanju driske, ampak se na primer bolje
izkažejo pri znižanju ravni holesterola. Univerzalni probiotik ne obstaja (FAO/WHO,
2002). Različno učinkovanje probiotikov poudarjata tudi prof. dr. Rogelj in prof. dr.
Orel (Širca, 2013). Tudi farmacevtska podjetja za posamezne probiotične izdelke
poudarijo namen uživanja.
Raziskovalno vprašanje 1: Ali imajo probiotiki vpliv na rast in preživetje
bakterije Escherichia coli med inkubacijo v mleku?
Po rezultatih lahko povzamemo, da so probiotiki uspešno znižali koncentracije
patogenih sevov bakterije E. coli po treh dneh inkubacije v mleku v povprečju za 1
log10 stopnjo. Glede na razultate prav tako ugotavljamo, da so bili različni patogeni
sevi E. coli po treh dneh inkubacije s probiotiki še vedno viabilni.
Učinkovanje probiotikov smo preverjali s patogenimi sevi različnih skupin patotipov,
ki imajo različne zapise za virulentne dejavnike. Ugotovili smo, da so bili probiotiki
pri učinkovanju z določenimi patogenimi sevi različno učinkoviti. Probiotik 1, ki je
uveljavljen kot probiotično zdravilo brez recepta, je imel najvišjo stopnjo reduciranja
(Tabela 5) proti patogenemu sevu, ki pripada patotipu ETEC, ki pogosto povzroča
potovalno drisko in se prenaša predvsem s hrano in vodo (Andlovic, 2002b;
Elsinghorst, 2002). Od uporabljenih probiotičnih vrst (Tabela 2) so s kliničnimi
raziskavami potrjeni pozitivni učinki delovanja Lactobacillus acidophilus proti
potovalni driski (Cortés-Zavaleta, López-Malo, Hernández-Mendoza, & García,
2014), infekcijski driski (McFarland, 2007), preprečevanju driske, povezane z
bakterijo Clostridium difficile (Phavichitr, Puwdee, & Tantibhaedhyangkul, 2013).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
51
Če upoštevamo rezultate vseh sevov E. coli, ki smo jih zajeli v raziskavi, smo dobili
minimalno stopnjo reduciranja v združbi s komenzalnim sevom Ec-K12 (Probiotik
5), kar je bilo za pričakovati, saj ne gre za patogeni sev. Rezultat z maksimalno
stopnjo reduciranja (Red = 3,57) smo dobili v združbi s probiotičnim sevom EcN pri
probiotiku 4. V tem primeru smo lahko opazili tudi največjo rast probiotičnih
mikroorganizmov na agarjih MRS, KAZ in PCA.
Po izračunu stopenj reduciranja, kjer smo upoštevali samo virulentne tipe E. coli,
smo na primeru patogenega seva EPEC1 pri različnima probiotikoma dobili
vsesplošno najboljši in najslabši rezultat reduciranja. Najboljše delovanje proti
patogenemu sevu EPEC1 ugotavljamo pri probiotiku 2 (Red = 1,96). Najslabše
delovanje proti patogenem sevu EPEC1 ugotavljamo pri probiotiku 7 (Red = 0,13).
Največ probiotikov (probiotki 1, 4, 7, 8) je imelo najnižji rezultat reduciranja v
primeru patogenega seva EPEC1, kar pomeni, da je bilo učinkovanje proti tem
patogenu nasplošno najslabše. Vsesplošno najboljši rezultat učinkovanja različnih
probiotikov (probiotki 3, 4, 8, 9) pa ugotavljamo proti ESBL-pozitivni E. coli
(ESBL1). Vsi probiotki, ki so dosegli najvišje rezultate reduciranja proti ESBL1
vsebujejo bodisi monokulture ali multikulture probiotičnih sevov iz rodu
Lactobacillus. Tudi v raziskavi Heshmatipour, et. al (2015) so ugotovili, da so
probiotične bakterije iz rodu Lactobacillus, ki so jih izolirali iz domačega
probiotičnega jogurta, pokazale antibakterijske učinke proti ESBL- pozitivni E. coli.
Najboljši povprečen rezultat učinkovanja proti vsem patogenim sevom E. coli je
dosegel probiotik 3, ki vsebuje mono kulturo Lactobacillus reuteri DSM 17938.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
52
Podobne ugotovitve lahko opazimo v raziskavi Fijan (2016), kjer so več različnih
kombinacij sevov probiotikov ter mikrobiota kefirja uspešno zmanjšali koncentracijo
potencialno patogene Pseudomonas aeruginosa za 3 log10 stopnje po štirih dneh
inkubacije v mleku. Tudi v tej raziskavi nobena kombinacija probiotičnih
mikroorganizmov ni popolnoma zavirala rasti patogene bakterije (Fijan, 2016). V tej,
kakor tudi v drugih raziskavah (Atkinson, & Williams, 2009) ugotavljajo, da ob
različnih okoljskih izzivih, bakterije opustijo svoje individualno delovanje in aktivno
sodelujejo z drugimi mikroorganizmi tako, da uspešno ustvarjajo komunikacijska
omrežja zaznavanja kvorum. Raziskava, kjer smo preverjali antagonistični učinek
različnih probiotikov na rast potencialno patogene E. coli po tridnevni inkubaciji v
mleku, je tako vključevala simulacijo, kjer domnevamo, da so probiotični
mikroorganizmi imeli priložnost aktivnega delovanja komuniciranja in koordiniranja
odzivov na nivoju skupnosti. Glede na rezultate ugotavljamo, da noben probiotik ni
popolnoma zaviral patogenih sevov, temveč le zmanjšal njihovo rast. Domnevamo
lahko, da so tudi različni sevi in patotipi bakterije E. coli ustvarili regulatorno mrežo,
saj so uspešno preživeli antagonistična prizadevanja vseh probiotičnih bakterij.
Rezultati z metodo agar spot kažejo drugače, saj ponekod nismo zasledili
protimikrobnega učinka. Najšibkejše inhibicije patogenih sevov E. coli ugotavljamo
v primerih probiotikov, ki vsebujejo monokulture probiotičnih sevov. Iz tega lahko
domnevamo, da so probiotiki med inkubacijo v mleku z mikrobnimi populacijami
ustvarili sinergijo, s tem dopolnjevali medsebojni učinek in se povezali v učinkovito
skupnost, ki tekmuje proti patogenim mikroorganizmom. Prvotno so bile bakterijske
celice obravnavane kot samostojne, nepovezane.
Želeli smo izvedeti, ali je tridnevna inkubacija z ali brez dodanim sevom E. coli
vplivala tudi na število probiotičnih bakterij. Skupno število nastalih kolonij
(cfu/mL) vseh vzorcev, ki smo jih inkubirali s probiotikom in brez E. coli znaša okoli
108 cfu/mL. Dodani sevi E. coli so ponekod povzročili 10-kratno povečanje
celotnega števila nastalih kolonij.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
53
Na agarju MRS, selektivnem predvsem za laktobacile, je v večini primerov število
probiotičnih mikroorganizmov ob dodanih patogenih bakterijah narastlo, kar kaže na
antagonistična prizadevanja probiotičnih bakterij. Zmanjšanje probiotičnih
mikroorganizmov pa smo v največ primerih zasledili ob dodani EAEC1 (Probiotiki
7, 8, 9). Podobne ugotovitve lahko opazimo v raziskavi Fijan (2016), kjer je dodana
potencialno patogena bakterija Pseudomonas aeruginosa v nekaterih primerih
povzročila 10-kratno zmanjšanje celotnega števila nastalih kolonij probiotičnih
bakterij na triptičnem sojinem agarju; ti vzorci so pokazali nižja zmanjšanja
koncentracij potencialno patogene Pseudomonas aeruginos na selektivnem
cetrimidnem agarju.
Raziskovalno vprašanje 2: Ali po testiranju metod za določanje
antagonističnega učinka probiotikov opazimo razlike v občutljivosti metod in
posledično razlike v dobljenih rezultatih?
Za ugotavljanje protimikrobne aktivnosti probiotičnih bakterij smo najprej uporabili
metodo agar spot po postopku Kholy, et al. (2014). Rezultate smo ovrednotili v tri
razpone inhibicije ( +, ++, +++, ) oziroma brez inhibicije. Najšibkejše inhibicije so
dosegli nekateri probiotiki, ki vsebujejo monokulture živih mikroorganizmov. Pri
metodi agar spot ni predpisanega oziroma poenotenega merila razpona inhibicije.
Razliko možne ocene rezultatov smo prikazali z vrednotenjem po različnih avtorjih:
Kholy, et al. (2014), Shokryazdan, et al. (2014), Mami, et al. (2014), Jacobsen, et al.
(1999) (Tabela 24). Za naše rezultate lahko rečemo, da sta merili razpona po avtorjih
Mami, et al. (2014) in Jacobsen, et al. (1999) manj primerni kot ostala oziroma nam
ostala merila razponov prikažejo večje razlike pri uspešnosti probiotikov. Prav tako
moramo upoštevati različne načine merjenja inhibicijskih con. Nekateri pri računanju
upoštevajo premer inhibicijske cone brez premera spot točke kolonij testnih sevov
(Georgievaa, et al., 2015; Jacobsen, et al., 1999; Kholy, et al., 2014; Mami, et al.,
2014; Shokryazdan, et al., 2014), drugi računajo premer inhibicijske cone z
upoštevanjem premera (spot) točke, zasledimo pa lahko tudi merjenje od roba točke
testnega seva do zunanjih robov inhibicije (Ayeni, et al., 2009).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
54
Rezultati, kjer smo protimikrobni učinek probiotikov preverjali s tridnevno
inkubacijo E. coli v mleku, z ali brez dodanih probiotikov, kažejo razlike. Ugotovili
smo, da so probiotiki uspešno znižali koncentracije patogenih sevov bakterije E. coli
v povprečju za 1 log10 stopnjo. E. coli smo najprej identificirali s klasično gojitveno
metodo na agarju MacConkey. Tudi molekularna metoda PCR je pokazala, da je bil
DNA E. coli ob dodanih probiotikih prisoten v vseh vzorcih. Clark (2005)
predstavlja verižno reakcijo s polimerazo kot najpomembnejšo molekularno biološko
tehniko. PCR omogoča tudi zelo specifično detekcijo določenih (pod) vrst, na primer
Escherichia coli: EHEC, ETEC, STEC, UPEC itd (Köster, et al., 2003), vendar te
metode nismo izvedli v naši raziskavi. Z metodo PCR lahko sicer dobimo rezultate
tudi v primerih, ko je količina mikroorganizmov tako majhna, da jih ne moremo
identificirati s pomočjo gojenja na agarjih (Madigan, et al., 2012).
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
55
6 Sklep
V okviru raziskave smo se soočili s problematiko literature, ki obravnava probiotike.
Spoznanja, ki bakterije povezujejo s pozitivnimi učinki na zdravje sicer segajo v
začetek dvajsetega stoletja, šele v zadnjih letih pa se znanstveniki zavedajo
pomembne vloge mikrobiote črevesja pri zdravju ljudi ter proučevanja probiotikov z
vidika potencialnega pozitivnega učinkovanja na mikrobno ravnovesje. V zadnjih
desetih letih se je znatno povečalo število objav v povezavi s probiotiki in njihovimi
protimikrobnimi učinki. Ker je veliko raziskav še v teku, lahko dnevno prihaja do
novih spoznanj. Pri pregledu literature smo naleteli na naslednje nepravilnosti:
uporabo izraza mikroflora namesto mikrobiota, razvrščanje bifidobakterij kot
mlečnokislinskih bakterij, nepravilno razvrščanje fermentiranih izdelkov med
probiotične.
Probiotiki imajo velik potencial pozitivnega učinkovanja na mnogih področjih.
Nekatere probiotične bakterije lahko pripomorejo k ohranjanju mikrobnega
ravnovesja v črevesju, druge lahko vzdržujejo stanje remisije pri različnih boleznih
ali pa se borijo proti različnim patogenim organizmom, itd. Pri probiotikih je
ključnega pomena določitev probiotičnega seva, iz stališča področja učinkovanja, kot
tudi iz varnosti. Nadaljnje raziskave lahko pripeljejo do večje specifične izbire sevov,
med katerimi bodo sevi, ki so v primerjavi z drugimi, bodisi uspešnejši v kolonizaciji
črevesja, imajo boljšo sposobnost vezave na črevesne epitelne celice ali pa aktivnejše
mehanizme delovanja, itd.
Kljub specifičnosti delovanja različnih bakterij, le-te ne moremo obravnavati zgolj
kot individualiste, na kar opozarjajo tudi rezultati iz naše raziskave. Ob določenih
pogojih ali spremembah okolja, lahko bakterije opustijo svoje primarno delovanje,
aktivno komunicirajo z drugimi mikroorganizmi in se z njimi povežejo v skupnosti, v
katerih dopolnjujejo medsebojne učinke.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
56
Glede na različne rezultate vpliva probiotikov na rast in preživetje potencialno
patogene bakterije Escherichia coli v mleku, ki so prikazani v tem magistrskem delu,
velja izpostaviti pomembnost kvalitetnih raziskav probiotikov z večkratnimi
ponovitvami različnih »in vitro« metod ter ključnimi kliničnimi raziskavami.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
57
7 Literatura
Andlovic, A. (2002a). Patogene bakterije: Enterobakterije. V M. Gubina, & A. Ihan
(Ured.), Medicinska bakteriologija z imunologijo in mikologijo (str. 179-184).
Ljubljana, Slovenija: Medicinski razgledi.
Andlovic, A. (2002b). Patogene bakterije: Escherichia coli. V M. Gubina, & A. Ihan
(Ured.), Medicinska bakteriologija z imunologijo in mikologijo (str. 185-188).
Ljubljana, Slovenija: Medicinski razgledi.
Atkinson, S., & Williams, P. (2009). Quorum sensing and social networking in the
microbial world. J. R. Soc. Interface 6, 959–978.
Ayeni, F. A., Adeniyi, B. A., Ogunbanwo, S. T., Tabasco, R., Paarup, T., Pelaez, C.
& Requena, T. (2009). Inhibition of uropathogens by lactic acid bacteria
isolated from dairy foods and cow’s intestine in Western Nigeria. Arch
Microbiol, 191, 639-648
Bereswill, S., Fischer, A., Dunay, I.R., Kühl, A.A., Göbel, U.B., Liesenfeld, O., &
Heimesaat, M.M. (2013). Pro-inflammatory potential of Escherichia coli
strains K12 and Nissle 1917 in a murine model of acute ileitis. European
Journal of Microbiology and Immunology, 3, 126–134.
Biavati, B., & Mattarelli, P. (2006). The family bifidobacteriaceae. V M. Dworkin, S.
Falkow, E. Rosenberg, K. H. Schleifer, & E. Stackebrandt (Ured.), The
prokaryotes: A Handbook on the Biology of Bacteria (str. 383-321). New
York: Springer Science+Business Media.
Bogovič Matijašić, B., & Rogelj, I. (2006). Demonstration of suitability of probiotic
products. An emphasis on survey of commercial products obtained on
Slovenian market. Agro Food Ind Hi Tech, 17(3), 38-40.
Bogovič Matijašić, B. (2010). Različne oblike probiotičnih izdelkov. Naša lekarna -
revija za zdrav življenjski slog, 43, 32-37.
Bogovič Matijašić, B., Zorič Peternel M., & Rogelj, I. (2010). Ugotavljanje
deklariranih bakterij v probiotičnih prehranskih dopolnilih in zdravilih na
slovenskem trgu. Farmacevtski vestnik, 61, 263- 269.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
58
Cao, G.T., Zeng, X.F., Chen, A.G., Zhou, L., Zhang, L., Xiao, Y.P., & Yang, C.M.
(2013). Effects of a probiotic, Enterococcus faecium, on growth performance,
intestinal morphology, immune response, and cecal microflora in broiler
chickens challenged with Escherichia coli K88. Poulty Science, 92, 2949–
2955.
Car, J., Marinko, T. (2003). Zdravljenje nezapletene okužbe sečnega mehurja pri
ženskah v družinski medicini. Zdravstveni vestnik, 72, 79 – 83.
Castanie-Cornet, M. P., Treffandier, H., Francez-Charlot, A., Gutierrez, C., &
Kaymeuang, C. (2007). The glutamate-dependent acid resistance system in
Escherichia coli: essential and dual role of the His–Asp phosphorelay
RcsCDB/AF. Microbiology, 153, 238–246.
Centers for Disease Control and Prevention CDC. (2014). Escherichia coli. Prevzeto
5. marec 2016 iz http://www.cdc.gov/ecoli/general/index.html#what-are-shiga-
toxin
Choi, C.H., Jo, S.Y., Park, H.J., Chang, S.K., Byeon, J.S., & Myung, S.J. (2011). A
randomized, double-blind, placebo-controlled multicenter trial of
Saccharomyces boulardii in irritable bowel syndrome: Effect on quality of life.
Journal of Clinical Gastroenterology, 45, 679–683.
Conway, T., & Cohen, P. (2016). Commensal and Pathogenic Escherichia coli
Metabolism in the Gut. Microbiology Spectrum, American Society for
Microbiology, 3, 1-15.
Cortés-Zavaleta, O., López-Malo, A., Hernández-Mendoza, A., & García, H.S.
(2014). Antifungal activity of Lactobacilli and its relationship with 3-
phenyllactic acid production. Int. J. Food. Microbiol. 2014, 30–35.
Difco™ & BBL™ Manual. (2009). MacConkey II Agar. Prevzeto 8. november iz
http://www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/Difco_BBL/212306.pdf
Didari, T., Solki, S., Mozaffari, S., Nikfar, S., & Abdollahi, M. (2014). A systematic
review of the safety of probiotics. Expert Opin Drug Saf., 13, 227–239.
Dragaš, A. Z. (2010). Mikrobiologija z epidemiologijo. Ljubljana, Slovenija: DZS.
Elmer, G. W., Mcfarland, L. W., & Mcfarland, M. (2007). The Power of Probiotics:
Improving Your Health with Beneficial Microbes. New York: The Haworth
Press Inc.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
59
Elsinghorst, E. A. (2002). Enterotoxigenic Escherichia coli. V M. S. Donnenberg
(Ured.), Escherichia coli. Virulence mechanisms of a versatile pathogen (str.
155-187). San Diego, United States: Academic Press.
Fijan, S. (2016). Influence of the Growth of Pseudomonas aeruginosa in Milk
Fermented by Multispecies Probiotics and Kefir Microbiota. Journal of
probiotics & health, ISSN 2329-8901, 4, 1-6. doi:10.4172/2329-
8901.1000136
Fijan, S. (2014). Microorganisms with Claimed Probiotic Properties: An Overview of
Recent Literature. International Journal of Enviromental Research and Public
Health, 11, 4745- 4767.
Fijan, S., Lorber, M., Povalej, P., Štante, A., Lončarič, J., Šulc, D., Petek Regoršek,
V., Galun, T., Jelen, Š., Nemet, U., & Belinc, J. (2017a). Vpliv različnih
sevov probiotikov na zdravje: elaborat v okviru projekta SezMiPro. Maribor:
Univerza v Mariboru, Fakulteta za zdravstvene vede.
Fijan, S., Lorber, M., Povalej, P., Klinc, I., Štante, A., Šulc, D., Lončarič, J., Jelen,
Š., Petek Regoršek, V., Galun, T., Nemet, U., & Tašner, S. (2017b).
Določevanje dejanskega števila bakterij v izbranih prehranskih dopolnilih z
indirektno gojitveno metodo štetja: elaborat v okviru projekta SezMiPro.
Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za zdravstvene vede.
Fijan, S., Rozman, U., & Šostar Turk, S. (2013). Comparing the Detection of Various
Microorganisms on Metal and Glass Surfaces Using Incubation Methods on
Selective Agars, Modifield PCR Methods and Simultaneous Detection by A
Unified Parallel PCR Method. Journal of Pure and Applied Microbiology, 7,
1636-1546.
Fijan, S., & Šostar Turk, S. (2013). Probiotiki in kefir. Kefir je pomembna združba
probiotičnih mikroorganizmov. Naša lekarna - revija za zdrav življenjski slog,
78, 36- 43.
Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization
FAO/WHO. (2002). Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food; Joint
FAO/WHO Working Group on Drafting Guidelines for the Evaluation of
Probiotics in Food: London, Ontario, Kanada.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
60
Georgievaa, R., Yochevab, L., Tserovskab, L., Zhelezovab, G., Stefanovaa, N.,
Atanasovaa, A., Dangulevaa, A., Ivanovaa, G., Karapetkova, N., Rumyana,
N., & Karaivanovaa, E. (2015). Antimicrobial activity and antibiotic
susceptibility of Lactobacillus and Bifidobacterium spp. intended for use as
starter and probiotic cultures. Biotechnology & Biotechnological Equipment,
29, 84-91.
Gomes, A. M., Pintado, M. E., & Malcata, X. (2010). Probiotics. V L. M. L Nollet,
& F., Toldra (Ured.), Handbook of Dairy Foods Analysis (str. 503 – 541).
Florida, United States of America: CRC Press Taylor & Francis Group.
Gruber, I., Heudorf, U., Werner, G., Pfeifer, Y., Imirzalioglu, C., Ackermann, H.,
Brandt, C., Besier, S., & Wichelhaus, T.A. (2013). Multidrug-resistant bacteria
in geriatric clinics, nursing homes, and ambulant care-prevalence and risk
factors. International Journal of Medical Microbiology, 303, 405–409.
Gudiol, C., Calatayud, L., Garcia-Vidal, C., Lora-Tamayo, J., Cisnal, M., Duarte, R.,
Arnan, M., Marin, M., Carratala, J., & Gudiol, F. (2010). Bacteraemia due to
extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli (ESBL-EC) in
cancer patients: clinical features, risk factors, molecular epidemiology and
outcome. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 65, 333-341.
Hempel, S., Newberry, S.J., Maher, A.R., Wang, Z., Miles, J.N., Shanman, R.,
Johnsen, B., & Shekelle, P.G. (2012). Probiotics for the prevention and
treatment of antibiotic- associated diarrhea: A systematic review and meta-
analysis. JAMA, 307, 1959–1969.
Heshmatipour, Z., Aslikousha, H., Mohamadiebli, F., & Ashrafi Eslami, A. (2015).
Antibacterial Activity Lactic Acid Bacteria (LAB) Isolated Native Yogurt
against ESBL Producing E. coli Causing Urinary Tract Infection (UTI).
International Journal of Life Sciences Biotechnology and Pharma Research, 2,
117-121.
Holzapfel, W. H., Haberer, P., Snel, J., Schillinger, U., & Huis in't Veld, J. H.
(1998). Overview of gut flora and probiotics. International Journal of Food
Microbiology, 41, 85-101.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
61
Jacobsen, C. N., Rosenfeldt, V. N., Hayford, A. E., Møller, P. L., Michaelsen, K. F.,
Perregaard, A., Sandstrom, B., Tvede, M., & Jakobsen, M. (1999). Screening
of Probiotic Activities of Forty-Seven Strains of Lactobacillus spp. by In
Vitro Techniques and Evaluation of the Colonization Ability of Five Selected
Strains in Humans. Applied and environmental microbiology, 65, 4949–4956.
Jiang, Y., Kong, Q., Roland, K. L., Wolf A., & Curtiss, R. (2014). Multiple effects of
Escherichia coli Nissle 1917 on growth, biofilm formation and inflammation
cytokines profile of Clostridium perfringens type A strain CP4. Pathog Dis.,
70, 390 – 400
Kaper, J. B., Nataro, J. P., & Mobley, H. L. (2004). Pathogenic Escherichia coli.
Nature Reviews Microbiology 2, 123-140.
Kholy, A. M., Shinawy, S. H., Meshref, A.M.S., & Korny, A.M. (2014). Screening
of Antagonistic Activity of Probiotic Bacteria against Some Food-Borne
Pathogens. Journal of Applied & Environmental Microbiology, 2, 53-60.
Koli, P., Sudan, S., Fitzgerald, D., Adhya, S., & Kar, S. (2011). Conversion of
Commensal Escherichia coli K-12 to an Invasive Form via Expression of a
Mutant Histone-Like Protein. mBio, 5, 1-13.
Koren, S., Ihan, A., & Gubina, M. (2002). Patogeneza in širjenje bakterijskih okužb.
V M. Gubina, & A. Ihan (Ured.), Medicinska bakteriologija z imunologijo in
mikologijo (str. 65-73). Ljubljana, Slovenija: Medicinski razgledi.
Köster, W., Egli, T., Ashbolt, N., Botzenhart, K., Burlion, N., Endo, T., Grimont, P.,
Guillot, E., Mabilat, C., Newport, L., Niemi, M., Payment, P., Prescott, A.,
Renaud, P. & Rust, A. (2003). Analytical methods formicrobiological water
quality testing. V A. Dufour, M. Snozzi, W. Koster, et al. (Ured.), Assessing
microbial safety od drinking water: improving approaches and methods (str.
237-242). London: IWA Publishing.
Li, D., Rosito, G., & Slagle, T. (2013). Probiotics for the prevention of necrotizing
enterocolitis in neonates: An 8-year retrospective cohort study. Journal of
Clinical Pharmaceutic Therapy, 38, 445–449.
Liu, D., & Reeves, P. R. (1994). Escherichia coli K12 regains its O antigen.
Microbiology, 140, 49 - 57.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
62
Madigan, M. T., Martinko, J. M., Stahl, D., & Clark, D. (2012). Brock Biology of
microorganisms. United States of America, Boston: Benjamin Clummings.
Mami, A., Ahmedb, K., & Mebroukc, K. (2014). Study of the Antimicrobial and
Probiotic Effect of Lactobacillus Plantarum Isolated from Raw Goat's Milk
from the Region of Western Algeria. International Journal of Sciences: Basic
and Applied Research (IJSBAR), 13, 18-27.
McDaniels, A., Rice, E., Reyes, A., Johnson, C., Haugland, R. & Stelma, G. (1996).
Confirmational identification of Escherichia coli, a comparison of genotypic
and phenotypic assays for glutamate decarboxylase and beta-D-
glucuronidase. Applied and Environmental Microbiology, 62, 3350-3354.
McFarland, L.V. (2007). Meta-analysis of probiotics for the prevention of traveler’s
diarrhea. Travel Med. Infect. Dis., 5, 97–105.
Mehta, R., Arya, R., Goyal, K., Singh, M., & Sharma, A.K. (2013). Bio-preservative
and therapeutic potential of pediocin: Recent trends and future perspectives.
Recent Patology in Biotechnology, 7, 172–178.
Munda, M. (2011). Kaj je bakterija E. coli? Prevzeto 4. marec 2016 iz
http://www.aktivni.si/zdravje/preventiva/kaj-je-bakterija-e-coli/
Murch, S. (2014). The Immune System and Intestinal Microbiota. V R. Orel (Ured.),
Intestinal microbiota probiotics and prebiotics: comprehensive textbook for
health professionals (str. 38-51). Ljubljana, Slovenija: Institute for Probiotics
and Functional Foods
Palaniappan, R. U. M., Zhang, Y., Chiu, D., Torres, A., DebRoy, C., Whittman, T.S.,
& Chang, Y. (2006). Differentiation of Escherichia coli Pathotypes by
Oligonucleotide Spotted Array. Journal of Clinical Microbiology, 44, 1495 –
1501.
Pavčič, M., & Vitezić, N. (2001). Uvodnik. V M. Pavčič, & N. Vitezić (Ured.),
Probiotiki in možnosti njihove uporabe : zbornik predavanj (str. 5). Ljubljana,
Slovenija: Zbornica nutricionistov in dietetikov.
Phavichitr, N., Puwdee, P., & Tantibhaedhyangkul, R. (2013). Cost-benefit analysis
of the probiotic treatment of children hospitalized for acute diarrhea in
Bangkok, Thailand. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 44, 1065–
1071.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
63
Pravst, I., Blaznik, U., Krbavčič, A., Kreft, S., Kušar, A., Mičović, E., Razinger, B.,
Recek, M., Repe, J., Rogelj, I., & Stibilj, V. (2012). Priporočila za
zagotavljanje kakovosti prehranskih dopolnil. Farmacevtski vestnik, 63, 216-
224.
Rogelj, I. (2009). Črevesna mikrobiota in probiotiki: Mikrobi – naši nepogrešljivi
sopotniki. Prevzeto 5. marec 2016 iz
http://www.waya.eu/fileadmin/medis/waya.eu/documents/Irena_Rogelj_-
_Crevesna_mikrobiota_in_probiotiki.pdf
Rogelj, I. (2014). Probiotics – Historical Overview, General Concepts and
Mechanism of Action. V R. Orel (Ured.), Intestinal microbiota probiotics and
prebiotics: comprehensive textbook for health professionals (str. 59-71).
Ljubljana, Slovenija: Institute for Probiotics and Functional Foods.
Sanders, M. E. (2014). Overview of the Human Intestinal Microbiota. V R. Orel
(Ured.), Intestinal microbiota probiotics and prebiotics: comprehensive
textbook for health professionals (str. 27-37). Ljubljana, Slovenija: Institute
for Probiotics and Functional Foods.
Savard, P., Lamarche, B., Paradis, M.E., Thiboutot, H., Laurin, E., & Roy, D. (2011).
Impact of Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 and, Lactobacillus
acidophilus LA-5-containing yoghurt, on fecal bacterial counts of healthy
adults. International Journal of Food Microbiology, 149, 50–57.
Scaldaferri, F., Gerardi, V., Mangiola, F., Lopetuso, L. R., Pizzoferrato, M., Petito,
V., Papa, A., Stojanovic, J., Poscia, A., Cammarota, G., & Gasbarrini, A.
(2016). Role and mechanisms of action of Escherichia coli Nissle 1917 in the
maintenance of remission in ulcerative colitis patients: an update. World J
Gastroenterol, 22, 5505-5511.
Scheutz, F., & Strockbine, NA. (2005) Escherichia. V DJ. Brenner, NR. Krieg, JT.
Staley, & GM. Garrity (Ured.), Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology
(str. 607-624). New York: Springer.
Seme, K. (2002). Normalna mikrobna flora. V M. Gubina, & A. Ihan (Ured.),
Medicinska bakteriologija z imunologijo in mikologijo (str. 59 – 64).
Ljubljana, Slovenija: Medicinski razgledi.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
64
Shokryazdan, P., Sieo, C. C., Kalavathy, R., Liang, J. B., Alitheen, N. B., Jahromi,
M. F., & Ho, Y. W. (2014). Probiotic Potential of Lactobacillus Strains with
Antimicrobial Activity against Some Human Pathogenic Strains. Hindawi
Publishing Corporation BioMed Research International, 1-16
Sigma-Aldrich Co. (2011). Methods and Techniques for Detection of Coliforms.
Microbiology Focus, 3.2, 1-8.
Sonnenborn, U. (2017). 100 years of E. coli strain Nissle 1917. Prevzeto 20. junij
2017 iz https://blog.oup.com/2017/04/e-coli-strain-nissle-1917-timeline/
Sonnenborn, U., & Schulze, J. (2009). The non-pathogenic Escherichia coli strain
Nissle 1917 – features of a versatile probiotic. Microbial Ecology in Health
and Disease, 21, 122-158.
Sturm, A., Rilling, K., Baumgart, D. C., Gargas, K., Abou-Ghazale T., Raupach,
Eckert, J., Schumann, R. R., Enders, C., Sonnenborn, U., Wiedenmann, B., &
Dignass, A. U. (2005). Escherichia coli Nissle 1917 Distinctively Modulates
T-Cell Cycling and Expansion via Toll-Like Receptor 2 Signaling. Infection
And Immunity, 73, 1452 – 1465.
Širca, S. (2013). Probiotiki in prebiotiki v praksi. Naša lekarna, 69, 34-37.
Todar, K. (2008). Pathogenic E. coli. Prevzeto 15. januar 2016 iz Todar's Online
Textbook of Bacteriology: http://textbookofbacteriology.net/e.coli.html
Trkov, M., Andlovic, A., Berce, I., Štorman, A., Ravnik, M, & Paragi, M. (2012).
Verotoksigeni sevi bakterije Escherichia coli, osamljeni v Sloveniji iz
humanih vzorcev. Zdravniški Vestnik, 81, 32 – 43.
Trkov, M., Grilc, E., Andlovic, A., Berce, I., Štorman, A. , Ravnik, M. , Drinovec,
B., Orešič, N., & Paragi, M. (2011). Spremljanje E. coli, ki povzročajo
črevesne okužbe s poudarkom na spremljanju verotoksigenih E. coli. Prevzeto
10. junij 2017 iz http://www.spm.si/wp-content/uploads/2013/10/Trkov-
Marija.pdf
Trkov, M., Berce, I., Dovečar, D., Grilc, E., Bujko, M., & Kraigher, A. (2008).
Odkrivanje nekaterih genov, povezanih z virulenco, pri sevih E.coli , ki
povzročajo črevesne okužbe. Zdravstven varstvo, 47, 81-88.
Tuš, M., Mlinarič, A. (2007). Prehranska dopolnila – zakonodaja, problematika,
primeri. Farmacevtski vestnik, 58, 72-73.
Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v
mleku, 2017.
65
Vandenplas, Y., Hauser, B. (2014). Probiotics and Prebiotics in Infant Formula. V R.
Orel (Ured.), Intestinal microbiota probiotics and prebiotics: comprehensive
textbook for health professionals (str. 93-109). Ljubljana, Slovenija: Institute
for Probiotics and Functional Foods.
Vasiljević, T., & Shah, NP. (2008). Probiotics - From Metchnikoff to bioactives.
International Dairy Journal 18, 714-728.
Walker, A. W., & Lawley, T. D. (2012). Therapeutic modulation of intestinal
dysbiosis. Pharmacological Research, 69, 75-86.
Weizman, Z. (2014). Dysbiosis – the Concept of Dysfunctional Intestinal
Microbiota. V R. Orel (Ured.), Intestinal microbiota probiotics and prebiotics:
comprehensive textbook for health professionals (str. 52-58). Ljubljana,
Slovenija: Institute for Probiotics and Functional Foods.
Wiles, T. J., Kulesus, R. R., & Mulvey, M. A. (2008). Origins and Virulence
Mechanisms of Uropathogenic Escherichia coli. Exp Mol Pathol, 85, 11-19.
Zelaya, H., Tsukida, K., Chiba, E., Marranzino, G., Alvarez, S., Kitazawa, H.,
Agüero, G., & Villena, J. (2014). Immunobiotic Lactobacilli reduce viral-
associated pulmonary damage through the modulation of inflammation-
coagulation interactions. International Immunopharmacology, 19, 161–173.
Zhuo, M., Hope, R., Don L, T., Tyrrell, C., & Foster, J. W. (2002). Collaborative
Regulation of Escherichia coli Glutamate-Dependent Acid Resistance by Two
AraC-Like Regulators, GadX and GadW (YhiW). Journal of Bacteriology, 24,
7001–7012.
Zveza potrošnikov Slovenije [ZPS]. (4. april 2012). Test - probiotična prehranska
dopolnila. Prevzeto 21. april 2017 iz https://www.zps.si/index.php/hrana-in-
pijaa-topmenu-327/kakovost-ivil/5413-test-probiotina-prehranska-
dopolnila#probiotična-prehranska-dopolnila-na-testu