Vysoké učení technické v Brně

KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE

2009

Laboratoře – Ústav fyziky

KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP LEXT 3100

Aplikace:

Lomové plochy

Vodivé i nevodivé materiály (polovodiče, keramika, plasty, povlaky, vrstvy a kovy)

Analýza:

Drsností

Profilů

Částic

Objemová analýza přímo ve 3D zobrazení

PRVKY KONFOKÁLNÍHO MIKROSKOPU

Optické prvky jsou uzpůsobené vlnové délce laseru o λ = 408 nm:

Zdroj

Objektiv

Konf. opt. clonka

Fotonásobič

Detektor

CCD (snímání barevného obrazu-RGB) fotoefekt

PRINCIP KONFOKÁLNÍHO MIKROSKOPU

Osvětlení:

Bodový zdroj světla (laserový paprsek fokusovaný na clonku)

čárkovaně: paprsky jdoucí z mimoohniskových rovin, zachycené clonkou.

Clonka:

Je objektivem mikroskopu zobrazena na vzorek, do bodu o průměru rovnajícím difrakční mezi mikroskopu

Objektiv:

Sbírá světlo vzorkem odražené nebo rozptýlené

Zpětný průchod objektivem:

Obraz bodové clonky => fotonásobič => druhá konfokální bodová clonka (blokující)

HISTORIE KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE

Marvin Minsky 1957 – patentoval nápad na konfokální mikroskopii, ale nenašel vhodný zdroj světla

M. Petráň a M. Hadravský 1967 – Tandem Scanning Confocal Microscope

Koncem 70. let – první spolehlivý konfokální mikroskop s rozmítaným laserovým paprskemm laserovým paprskem

SROVNÁNÍ S „KLASICKOU“ MIKROSKOPIÍ

„Klasická“ mikroskopie:

Předpokládá nekonečně malou tloušťku preparátu (vzorku)

Při zkoumání silných vzorků je kvalita zobrazení nepříznivě ovlivňována překrýváním obrazu roviny, do níž je mikroskop právě zaostřen, s neostrými obrazy rovin ležících nad ní a pod ní.

Lze zkoumat jen vzorky o tloušťce menší, než je hloubka ostrosti objektivu, která závisí na jeho numerické apertuře (Zmin= 0,25 nλ/NA2).

Obrazem bodu není bod, ale tzv. Airyho kroužky

Difrakční obrazec vzniká ohybem zobrazujícího se světla na čočkách objektivu. Při zobrazení blízkých bodů se mohou jejich Airyho kroužky překrývat, až se stanou téměř nerozlišitelnými.

SROVNÁNÍ S „KLASICKOU“ MIKROSKOPIÍ

Konfokální mikroskopie tyto nevýhody odstraňuje nicméně má navíc výhody i nevýhody:

Výhody:

Potlačení mlhavého pozadí obrazu

Optická tomografie

Není limitována Rayleighovým kriteriem: (Obraz vzniká skládáním z jednotlivých bodů, které jsou navíc pozorovány přes clonku, jejíž rozměry bývají menší než průměr Airyho kroužků.)

Nevýhody:

Zatíženost statistickým šumem, jehož velikost je úměrná √N/N, kde N je počet detekovaných fotonů.

Nelze snadno řešit zvýšením intenzity záření (Interakce s /fluorescenčním/ preparátem)

SROVNÁVACÍ SNÍMKY

Nekonfokální mikroskop Konfokální mikroskopRastrující konfokální mikroskop:

U něj skenující zařízení zařizuje posun ohniska excitujícího laserového paprsku – velmi efektivní pro sestavování 3D modelů

Rastrování (obraz celé zaostřené roviny se získává bod po bodu následovně):

Rozmítáním laserového paprsku

Příčným posuvem vzorku před objektivem

Posuvem objektivu nad vzorkem

Optické řezy:

Optické řezy se pohybují v řádech mikrometrů (lze numerické apertury a využitého laseru)

PRACOVIŠTĚ ÚSTAVU FYZIKY

MĚŘENÍ A MODELOVÁNÍ

Lomová plocha hydratované cementové pasty:

Zvětšení

120 x

Rastrů

250

MĚŘENÍ A MODELOVÁNÍ

Lomová plocha hydratované cementové pasty:

Zvětšení

480 x

Rastrů

250

Děkuji za pozornost

Děkuji za pozornost