Walidacja metod analitycznychRaport z walidacji

Małgorzata JakubowskaKatedra Chemii Analitycznej WIMiC AGH

Walidacja metod analitycznych (według ISO)to proces ustalania parametrów charakteryzujących

sprawność działania i ograniczeń metody oraz sprawdzenie jej przydatności do określonych celów.

Podczas wykonywania walidacji należy: określić, które parametry charakteryzujące metodę powinny

być wyznaczonewyznaczyć wartości tych parametrów na tej podstawie określić czy metoda spełnia stawiane jej

wymagania związane z zamierzonym zastosowaniem wyników analitycznych.

W efekcie wykonania walidacji można uzyskać pewność, żeproces analizy przebiega w sposób rzetelny i precyzyjnie orazdaje wiarygodne wyniki.

Proces walidacji składa się zazwyczaj z następujących etapów:

określenie przeznaczenia metody analitycznej i jej zakresu,definicja testowanych parametrów analitycznych oraz

kryteria akceptacji,opracowanie planu eksperymentów walidacyjnych,sprecyzowanie charakterystyki sprzętu,przygotowanie wzorców oraz odczynników,eksperymenty walidacyjne z ewentualną korektą parametrów

metody,obliczenia, interpretacja wyników,sprawdzenie kryteriów akceptacji,opracowanie standardowej procedury operacyjnej dla

badanej metodyki,określenie kryteriów rewalidacji,sporządzenie raportu.

Parametry brane pod uwagę podczas walidacji:

specyficznośćprecyzja (powtarzalność i odtwarzalność)dokładnośćzakres metodyliniowośćgranica wykrywalnościgranica oznaczalnościelastyczność.

Specyficzność:

jedynie analit jest źródłem niezakłóconego sygnałuanalitycznego, zaś interferencje nie występują

zdolność jednoznacznego określenia substancji analizowanej w obecności składników, które mogą byćzawarte w próbce, np. substancji pomocniczych, zanieczyszczeń, itd.

zdolność rozróżniania związków o podobnej strukturze.

Precyzja:stopień zgodności między pojedynczymi wynikami

analizy (rozrzut wyników), gdy dana procedura jest stosowana dla wielokrotnie powtarzanych, niezależnych oznaczeń jednorodnej próbki

najczęściej miarą precyzji jest odchylenie standardowe S, względne odchylenie standardowe RSD lub współczynnik zmienności CV

obejmuje dwa pojęcia: powtarzalność i odtwarzalność.

Kryteria akceptacji:CV wyników zawartości składnika głównego nie powinno

być większe niż 3%CV wyników oznaczania zawartości składników na

poziomie śladowym nie powinno być większe niż 15%.

Powtarzalność : wyraża precyzję oznaczeń wykonanych w krótkim odstępie

czasu, przez tego samego analityka i w tych samych warunkach (te same odczynniki, ten sam sprzęt)

należy wykonać minimum 6 powtórzeń dla poziomu stężenia 100% lub po trzy powtórzenia dla każdego z minimum trzech poziomów stężeń w zakresie metody (zalecane 50 – 150% nominalnego stężenia)

wyznacza się wartość średnią, przedział ufności, odchylenie standardowe, względne odchylenie standardowe oraz współczynnik zmienności uzyskanych wyników.

Odtwarzalność:pozwala ocenić, czy metoda prowadzi do tych samych

rezultatów w różnych laboratoriach z różnymi analitykami, na innym sprzęcie i w innych warunkach, z zachowaniem parametrów wymaganych w opisie metody

badania są prowadzone analogicznie jak w przypadku powtarzalności

wyznacza się wartość średnią, przedział ufności, odchylenie standardowe, względne odchylenie standardowe oraz współczynnik zmienności uzyskanych wyników.

Dokładność:zgodność między wartością rzeczywistą (zawartością,

stężeniem) a wartością będącą wynikiem analizymiarą dokładności metody analitycznej jest wielkość jej

błędu systematycznego metoda niedokładna może być obarczona błędem

systematycznym stałym (niezależnym od poziomu zawartości oznaczanego składnika) i zmiennym (zależnym od stężenia oznaczanego składnika)

powinna być oszacowana na podstawie minimum 9 wyników oznaczeń dla minimum trzech różnych poziomów stężeń z badanego zakresu (np. trzykrotne oznaczenie dla trzech poziomów)

najczęściej wynik przedstawia się jako błąd bezwzględny lub względny.

Szacowanie dokładności metody :przez analizę próbki o znanym stężeniu (np. certyfikowany

materiał odniesienia) i porównanie wyników uzyskanych walidowaną metodą z wartością prawdziwą

przez porównanie wyników uzyskanych walidowaną metodąz wynikami otrzymanymi metodą odniesienia, której dokładność jest znana

przez dodanie znanej ilości analitu do badanego produktu, a następnie jego oznaczenie sprawdzaną metodą.

Dokładność może być przedstawiona jako procent odzysku, który oblicza się wg wzoru:

xi – oznaczona ilość analitu w badanej próbce,

µ- znana ilość analitu w badanej próbce

Kryteria akceptacji

Odzysk powinien wynosić 95 – 105% w przypadku składnika głównego i 80 – 120% dla składników na poziomie śladowym(wartości te zależą między innymi od stężenia analitu w badanej próbie i metody badania).

gdzie %,100*µ

ix

Zakres:przedział między minimalną i maksymalną zawartością

(stężeniem) substancji aktywnej w badanej próbie, w którym metoda analityczna ma odpowiednią liniowość, dokładność i precyzję.

Minimalny zakres stosowania metody analitycznej powinien wynosić (kryteria akceptacji):

dla zawartości substancji głównej – od 80% do 120% deklarowanej ilości analitu w badanej próbie

w przypadku oznaczania substancji na poziomie śladowym zakres powinien wynosić od 10% do 120% maksymalnej dopuszczalnej zawartości tej substancji określonej w specyfikacji.

Granica wykrywalności (DL)jest to najmniejsza ilość (stężenie) badanej substancji w

próbce, które może być wykryta, lecz niekoniecznie oznaczona z odpowiednią dokładnością.

Granica oznaczalności (QL)jest to najmniejsza ilość (stężenie) badanej substancji w

próbce, jaka może być ilościowo oznaczona z odpowiedniąprecyzją i dokładnością.

bSDL *3.3

=b

SQL *10=

S – odchylenie standardowe ślepej próby

b – nachylenie prostej kalibracji

Liniowość:zdolność do uzyskiwania wyników pomiaru analitycznego

wprost proporcjonalnych do stężenia (zawartości) substancji oznaczanej w próbce, w określonym zakresie – zgodnie z wyznaczonym równaniem matematycznym y = ax+b

zależność między obu zmiennymi charakteryzuje współczynnik korelacji r

liniowość wykazuje się przez analizę próbek o stężeniach analitu, obejmujących deklarowany zakres stężeń metody

należy wykonać badanie minimum 5-ciu serii wzorców (3-6 powtórzeń), których stężenia obejmują 80-120% stężenia spodziewanego w próbce.

Kryterium akceptacji:w przypadku oznaczania substancji głównej współczynnik rpowinien być większy od 0,995, w przypadku oznaczania śladów powinien być większy od 0,98.

Liniowość:

0 20 40 60 80 100 1200,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

y = 0,0085x + 0,00235r = 0,99662

y,zm

ierz

ony

sygn

ał

x,odważka badanej próbki [mg]

Elastyczność (stabilność metody):

badanie elastyczności metody powinno udowodnićniezawodność analizy po wprowadzeniu niewielkich celowych zmian parametrów metody

jeśli pomiar jest wrażliwy na zmianę warunków analitycznych, warunki te powinny być odpowiednio kontrolowane lub dokładnie opisane w procedurze.

Raport walidacyjny

Raport z walidacji metod analitycznych (wykonany po zakończeniu prac laboratoryjnych) powinien zawierać:

przedmiot i zakres walidacjirodzaj oznaczanych związków i matrycyopis metodykryteria akceptacjistosowane odczynniki, substancje porównawcze i wzorceopis aparatury (producent, typ)względy bezpieczeństwaparametry pomiaruopis przeprowadzonego eksperymentupostępowanie statystyczne i obliczeniareprezentatywne wykresykryteria rewalidacjipodsumowanie i wnioski.

Raport walidacyjny

1. Oznaczana metoda analityczna- ogólne informacje o metodzie i zastosowanej aparaturze z podaniem jej typu- roztwory wzorcowe- rozwory badane- wykonanie pomiaru.

Raport walidacyjny2. Wybór optymalnych warunków pomiaru

- badania jakie wykonano w celu okreslenia optymalnych warunków pomiaru- parametry podlegające modyfikacji- wyniki osobno dla każdego zmienianego parametru (w tabeli – wartość parametru, wyniki – np. 7 powtórzeń, średnia, odchylenie standardowe)- wnioski.

Raport walidacyjnyPrzykład: Dobór optymalnego przepływu acetylenu (fragment tabeli wyników)

Numer poziomu Absorbancja Średnia

absorbancjaOdchylenie

standardowe

2

0.0510.0520.0500.0470.049

4

0.0760.0770.0800.0770.078

Raport walidacyjny3. Założenia walidacyjne3.1. Specyficzność/selektywność

- opis pomiarów jakie należy wykonać- wymagane wzorce wraz z okeśleniem stężeń- sposób obliczenia wyniku- kryterium akceptacji.

3.2. Powtarzalność3.3. Precyzja pośrednia3.4. Dokładność3.5. Liniowość3.6. Zakres metody3.7. Granica oznaczalności.

Raport walidacyjny4. Wyniki testów walidacyjnych4.1. Specyficzność/selektywność

- opis pomiarów jakie wykonano- lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem stężeń- wyniki pomiarów- wyniki obliczeń- informacja czy spełnione kryterium akceptacji.

Raport walidacyjnyPrzykład. Badanie wpływu Na na wynik oznaczenia Ca metodą ASA.

Stosunek stężeńNa:Ca

Średnia absorbancja

Różnica średnich absorbancji wzorca bez dodatku Na i wzorca z

dodatkiem Na

Kryterium akceptacji

0:1 0.163 0.000

1:10 0.159 0.004

1:5 0.165 0.002

1:2 0.168 0.005

1:1 0.169 0.006

10:1 0.186 0.023

0.006

Raport walidacyjny4. Wyniki testów walidacyjnych4.2. Powtarzalność

- opis pomiarów jakie wykonano- lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem stężeń- wyniki pomiarów- wyniki obliczeń- informacja czy spełnione kryterium akceptacji.

Raport walidacyjnyPrzykład. Badanie powtarzalności oznaczania Ca metodąASA.

Stężenie

[mg/l]A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 S CV

[%]

1 0.067 0.068 0.071 0.070 0.069 0.071 0.070

2 0.110 0.107 0.110 0.107 0.109 0.110 0.109

3

4

5

7.5

A

Raport walidacyjny4. Wyniki testów walidacyjnych4.2. Precyzja pośrednia

- tak jak powtarzalność ale dwóch różnych dniach

Raport walidacyjny4. Wyniki testów walidacyjnych4.4. Dokładność

- opis pomiarów jakie wykonano- lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem stężeń- wyniki pomiarów- obliczony wynik wraz z podaniem poziomu niepewności- pozostałe wyniki obliczeń- informacja czy spełnione kryterium akceptacji.

Raport walidacyjnyPrzykład. Badanie dokładności oznaczeania Ca metoda ASA.

Stężenie [mg/l] Absorbancja Średnia

absorbancjaŚrednie stężenie

Stopieńodzysku [%]

2.5

0.1340.1320.1330.1320.133

4.5

0.2260.2280.2240.2250.228

Prosta kalibracji: y=0.0485x+0.0075

Raport walidacyjny4. Wyniki testów walidacyjnych4.5. Liniowość

- opis pomiarów jakie wykonano- lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem stężeń- wyniki pomiarów- wyniki obliczeń (współczynniki prostej kalibracji, współczynnik korelacji)- wykres prostej kalibracji- informacja czy spełnione kryterium akceptacji.

Raport walidacyjnyPrzykład. Badanie liniowości oznaczania Ca metodą ASA.

Stężenie [mg/l] Średnia absorbancja

0 0.000

1 0.059

2 0.109

3 0.154

4 0.203

5 0.250

7.5 0.368

Raport walidacyjny4. Wyniki testów walidacyjnych4.6. Zakres metody

- informacja jak obliczono zakres metody- uzyskany wynik (tj. zakres)- informacja czy spełnione kryterium akceptacji.

Raport walidacyjny4. Wyniki testów walidacyjnych4.7. Granica oznaczalności

- informacja jak obliczono granicę oznaczalności- uzyskany wynik (tj. DL)- informacja czy spełnione kryterium akceptacji.

Raport walidacyjny5. Wnioski końcowe

- informacja czy walidacja została zakończona wynikiem pozytywnym i metoda może być stosowana.

KONIEC RAPORTUWykonał: xxx

Dziękuję za uwagę!