Embed Size (px)
Citation preview
21Årgång 164 Nr 1, 2004
Webb-baserad virtuellmikroskopi
Mikael Lundin, Johan Lundin och Jorma Isola
Genom att digitalisera hela mikroskoppreparat och utveckla teknikför att kunna se alla delar av ett sådant preparat med valfri förstoringpå en datorskärm kan man genomföra ett flertal nya funktioner inomklinisk laboratorieverksamhet, kvalitetskontroll och forskning. Virtu-ell mikroskopi innebär ett stort steg framåt för undervisningen inompatologi, hematologi och cytologi, där t.ex. omfattande samlingar avvirtuella cell- och vävnadsprover kan göras tillgängliga på webben.Vår forskargrupp har nyligen färdigställt en atlas över bröstkörtelnshistopatologi bestående av mer än 150 hela histologiska preparat; vipresenterar här den teknik som använts.
Vad är virtuell mikroskopi?
Traditionellt fotograferade mikroskopbildersom ingår i tryckta läroböcker eller i diabild-serier representerar endast små och på för-hand utvalda områden av exempelvis cell- ochvävnadsprover. Virtuell mikroskopi innebäratt mikroskoppreparat digitaliseras i sin hel-het med en detaljupplösning som motsvarardet starkast förstorande objektivet i ett ljus-mikroskop, och de “virtuella” preparaten kandärefter ses på en datorskärm. För att detta
skall motsvara verklig mikroskopering börman kunna fritt zooma och navigera i prepa-raten. Den enorma mängd bildinformationsom krävs för ett virtuellt preparat har hittillsförsvårat utvecklingen av funktionerande sys-tem för virtuell mikroskopi, det är t.ex. detinte praktiskt möjligt att distribuera bildernamed flyttbara medier (cd, dvd). Den för när-varande enda realistiska lösningen är att lag-ra de virtuella preparaten på en bildserver ochgöra dem tillgängliga via ett datanätverk. Det-ta utgör dock en stor teknisk utmaning, ochytterst få tillämpningar av virtuell mikrosko-pi har hittills beskrivits.
Inom vår forskningsgrupp framkastadesidén om att flyg- och satellitbildsindustrin an-tagligen i stor utsträckning brottas med justdessa problem. Liksom digitalisering av mik-roskoppreparat sker genom att man systema-tiskt fotograferar och sammanfogar ett stortantal digitala bilder, produceras även bilderav större geografiska områden genom sam-manfogning av flyg- eller satellitfotografiertagna med stor förstoring. Analogt med mik-roskopin behöver man likaså kunna navigerai dessa stora digitala montage och zooma inpå intressanta områden. Det finns dock ing-en motsvarighet till mikroskopet då det gäl-ler verktyg för att överblicka ett digitalt flyg-bildsmontage av ett geografiskt område. Där-
MK Mikael Lundin är doktorand vidKirurgiska kliniken, HUCS, med special-intresse inom webb- och databaspro-grammering
MD Johan Lundin är docent i biomedi-cinsk informatik vid Helsingfors univer-sitet och forskare vid Folkhälsans forsk-ningscentrum, samt vid Cancerkliniken,HUCS
Jorma Isola är professor i cancerbiologivid Tammerfors universitet
FÖRFATTARNA
FLS_tidning_juni_04_mac.p65 29.6.2004, 22:4621
22 Finska Läkaresällskapets Handlingar
för har utvecklingen inom denna sektor varitsnabb, och man har t.o.m. tagit fram systemför att över internet zooma och navigera i bil-der med en storlek på upptill flera terabyte.
Genom att modifiera programvara som ut-vecklats inom satellit- och flygbildsindustrinoch genom att samtidigt utveckla ett systemför att automatiskt digitalisera större serierav mikroskoppreparat, har vi skapat en nyplattform för virtuell mikroskopi. I dennaartikel beskriver vi kort de tekniska lösning-arna och lyfter fram de viktigaste använd-ningsområdena.
Digitalisering av mikroskoppreparat
Digitalisering av mikroskopglas sker medhjälp av ett datorstyrt motoriserat mikroskop
utrustat med en digital kamera. Vid digitali-seringen styrs robotmikroskopet över ytansom skall digitaliseras och ett stort antal min-dre bilder (ca 1 200 bilder / cm2) fotograferasefter autofokusering (Figur 1). Bilderna sam-manfogas därefter digitalt så att en enda storbildfil skapas. I motsats till den närmast obe-gränsade storleken på ett montage av flyg-eller satellitbilder begränsas storleken på ettvirtuellt mikroskoppreparat dels av glasetskanter, dels av ljusets våglängd.
Ljusets våglängd begränsar den spatialaupplösningen i ett ljusmikroskop till ca 0,2µm. För att fånga upp all denna bildinforma-tion krävs enligt Nyqvist-Shannons teoremungefär den dubbla digitaliseringsresolutio-nen (0,10 µm) [1, 2]. Ett mikroskopglas avstandardstorlek (10 cm2) med denna resolu-tion ger en bildstorlek på 250 gigabyte, mot-svarande ca 300 fullskrivna cd-skivor, ellerca 15 000 disketter. Utskriven skulle en så-dan bild uppta en yta på ca 25 x 40 meter. Attdigitalisera med maximal resolution är dockoerhört resurskrävande, och kompromissermellan detaljupplösning och överkomlig da-tamängd måste göras. I praktiken har det vi-sat sig att en något lägre resolution ger till-fredsställande resultat men med exponenti-ellt minskande filstorlek. Trots att den ytasom skall digitaliseras i ett preparat dessut-om oftast kan avgränsas betydligt, är data-mängden redan i ett litet virtuellt preparatöverväldigande, vilket illustreras av jämfö-relsen i (Tabell I; Figur 2). Den respons vifått av patologer visar att en digitaliserings-upplösning på ca 0,25 µm (40x, NA 1,3) ärett minimikrav för histopatologiska prepa-rat. Detta betyder att ca 4 gigabyte data be-hövs per cm2. För hematologiska och cytolo-giska preparat krävs något högre upplösning.Beroende på preparatet (detaljrikedom, tom-ma områden, färgvariationer) kan mikroskop-bilder komprimeras i medeltal 1:25 utan vi-suell kvalitetsförlust. En bild av storleken 10gigabyte kan således arkiveras som en 400megabyte datorfil.
Digitaliseringsresolutionen avgör hur myck-et detaljer som kan ses i de virtuella prepara-ten på stor förstoring. En hög digitaliserings-resolution är dock inte automatiskt detsam-ma som hög bildkvalitet. Den subjektiva upp-levelsen av bildkvalitet påverkas av inställ-ningar för bl.a. vitbalans, färgtemperatur,skärpa, kontrast, fokusering och bildkom-pression.
Figur 1. Ett mikroskoppreparat digitaliseras genomatt ett datorstyrt mikroskop systematiskt fotogra-ferar ett stort antal enskilda bilder (1). Vårt egetdatorprogram “limmar” därefter ihop de enskildabilderna till en enda storbild samtidigt som bild-kvaliteten kan förbättras digitalt (skärpa, färgtem-peratur, kontrast) (2). I fogarna används överlapp-ningsteknik. Den färdiga storbilden (3) består i dethär fallet av 12 x 12 = 144 bilder à 16 MB = 2,15GB. Bilden komprimeras därefter till ca 100 MB(1:20) utan visuell kvalitetsförlust. Den kompri-merade bilden flyttas till vår internetserver och kandär ses med valfri förstoring.
FLS_tidning_juni_04_mac.p65 29.6.2004, 22:4622
23Årgång 164 Nr 1, 2004
Virtuell mikroskopering
Genom att modifiera programvara utveckladför satellit- och flygfotografering har vi kon-struerat ett system som möjliggör virtuell mik-roskopering över internet med en stan-dardwebbläsare och en helt vanlig dator(~300 MHz processor nödvändig). Snabbhe-ten baserar sig på en avancerad interaktionmellan bildservern och användarens webblä-sare, där inte hela bilden utan endast det ak-tuella området som syns på bildskärmen över-förs i komprimerad form. Ytterligare krävs atten kontinuerlig överföring av data inte låsermikroskoperingen medan bilddata laddas.Detta gör att man fritt kan zooma och navi-gera i ett preparat medan bilden uppdateraspå skärmen. Gränssnittet är utformat i enlig-het med önskemål från patologer, med för-
handsinställda zoomnivåer som motsvararmikroskopets olika objektiv, och en tangent-navigering som motsvarar styrningen av ob-jektbordet. Funktioner som är unika för vir-tuell mikroskopi är en helt steglös zoomning,musnavigering och en översiktsbild som vi-sar var i preparatet man befinner sig (Figur3).
Vår forskningsgrupp upprätthåller en inter-netserver för virtuell mikroskopi som är kopp-lad till Helsingfors universitets nätverk, som isin tur är en del av det nordiska universitets-nätverket (NORDUNET). En snabb heman-slutning (ADSL) till internet räcker i principtill för en fungerande virtuell mikroskopering,och med en fast förbindelse (2 Mbit och upp-åt) löper mikroskoperandet mycket smidigt.På vår bildserver finns en funktion för att mäta
Tabell 1. Samma avbildningsteknik – olika användningsområden (se figur 2)
Flygbildsmosaik Virtuellt mikroskop-preparat
Bild New York området Papillärt adenomBildstorlek 10 GB 10 GBArea 20000 km2 2 cm2
Pixel storlek 3 m 0,3 µm5 x 5 pixlar Bethesda fountain En cellkärna50 x 50 pixlar Liberty Island Tvärsnittet av en arteriolGräns för yta att fotografera Ingen (jordklotet?) ObjektglasetUpplösningsgräns I praktiken obegränsad Begränsad av ljusets våglängd
Figur 2. Analogi mellan satellit- och mikroskop-bilder. Uppe till vänster New York med omnejd(20.000 km2), till höger ett papillärt adenom (2cm2). Samma mängd bilddata (10 GB), men reso-lutionen (pixelstorleken) i mikroskopbilden är 10miljoner gånger högre (3 m vs 0,3 um). Nere tillvänster en förstoring av Liberty Island (500 x 300m) med frihetsgudinnans stjärnformade sockel, tillhöger ett till datamängd motsvarande stort områ-de i mikroskopbilden (50 x 30 um) med ett litetblodkärl där erytrocyter syns.
FLS_tidning_juni_04_mac.p65 29.6.2004, 22:4623
24 Finska Läkaresällskapets Handlingar
dataöverföringshastigheten. En tillräckligtsnabb förbindelse har uppmätts av använda-re runt om i Europa och från Nordamerika.
Användningsområden
Det höga kravet på bildkvalitet medför att vimed vårt nuvarande system kan digitaliseraendast ett begränsat antal preparat per dygn.Systemet är således än så länge inte lämpatför digitalisering av mikroskoppreparat förkliniskt rutinbruk. De största fördelarna medvirtuell mikroskopi finns inte heller inom ru-tinpatologin. Däremot erbjuder virtuell mik-roskopi helt nya möjligheter inom undervis-ning och forskning. Delvis helt nya funktio-ner har blivit möjliga att förverkliga, såsomomfattande kvalitetsgranskning och standar-disering, samt arrangemang av större prepa-ratseminarier.
Grundutbildningen i medicin ochcellbiologi
Digitalisering av preparatserier som traditio-nellt använts inom grundutbildningen i pato-logi, hematologi och cytologi ger stora peda-gogiska fördelar. Preparaten kan förses medinformativa annoteringar som pekar ut de vik-tiga fyndena i preparaten. Undervisningen är
inte beroende av specialutrymmen med mik-roskoputrustning. Läraren kan styra mikro-skopbilden på elevernas monitorer och pekaut och förklara aktuella områden och fynd.Tentamina kan göras mer pedagogiska, t.ex.kan eleverna ge sina svar med hjälp av anno-teringar som läraren lätt kan kommentera.
Specialistutbildningen i patologi,cytologi och hematologi
Större serier av virtuella preparat som orga-niserats enligt aktuella klassifikationssystemoch som är tillgängliga på internet kan fung-era som komplement till klassiska textböck-er. Multipla exempelfall av även rariteter kaninkluderas i dessa “bildatlasar”, och textsek-tioner kan förses med snabblänkar till andrainformationssystem, t.ex. PubMed. Interakti-va pedagogiska funktioner, såsom gradering avtumörer där användaren omedelbart kan jäm-föra sina resultat med graderingar gjorda avexperter på området, är likaså möjliga tillämp-ningar. Specialistläkarföreningarnas återkom-mande nationella och internationella prepa-ratseminarier kan lätt genomföras med hjälpav virtuell mikroskopi. Där har problemet påsamma sätt som vid kvalitetskontroll varit dist-ribution av preparaten för förhandsgranskning.
Vi har arrangerat ett flertal preparatsemin-arier i samarbete med bl.a. IAP Finland (In-ternational Academy of Pathology, http://www.webmicroscope.net/seminars) och sam-manställt en första omfattande bildatlas somtäcker bröstkörtelns histopatologi, med över150 virtuella preparat. Atlasen som är orga-niserad enligt WHOs senaste klassifikation [3]finns allmänt tillgänglig på vår internetserver(http://www.webmicroscope.net/breastatlas).
Forskning
I vetenskapliga artiklar illustreras fynden oftamed fotografier vilka av tryckningstekniskaskäl ofta är av otillräcklig kvalitet (små, svart-vita). Genom att bifoga virtuella mikroskop-preparat som webblänkar kan författaren avt.ex. en fallstudie låta läsaren se de aktuellapreparaten i sin helhet (ex: http://www.webmicroscope.net/supplements). Vidbeskrivning av immunhistokemiska färgning-ar kan tolkningskriterier och mönster illus-treras fullständigt. Kraven på en större öppen-het och insyn vid publiceringen av forsknings-resultat har blivit allt tydligare. Med webb-baserad virtuell mikroskopi kan både mikro-skopglas och deras tolkning göras tillgängli-
Figur 3. Bildskärmsavbildning av användargränssnittet för virtuellmikroskopi. Uppe till höger ser användaren en översiktsbild av helapreparatet, och en ruta markerar den del av preparatet som försto-rats.
FLS_tidning_juni_04_mac.p65 29.6.2004, 22:4624
25Årgång 164 Nr 1, 2004
ga för andra forskare. Extremexemplet är stu-dier baserade på vävnadsmikromatriser (tu-mor microarray, TMA), där t.o.m. hela stu-diematerialet kan läggas ut för öppen evalue-ring. Virtuell mikroskopi erbjuder ytterligarefördelar i form av möjlighet till automatiskresultatanalys, förenklade histomorfometris-ka mätningar samt analys av multipla under-sökare oberoende av tid och plats.
Klinisk laboratorieverksamhet
Före klinisk-patologiska möten där pro-blemfall tas upp, cirkulerar preparatglasensom skall behandlas bland deltagande läkareså att alla får en chans att bekanta sig medfallen på förhand. Mötena fungerar både somkonsultations- och undervisningstillfällen.Med hjälp av virtuell mikroskopi förenklasdenna process, läkarna får längre tid på sigatt undersöka fallen, och läkare från periferaenheter i sjukvårdsdistrikten kan delta. Intres-santa områden kan märkas ut på förhand (an-noteringar), och även läkare som inte deltar isjälva mötet kan komma med sina synpunk-ter. De digitaliserade glasen kan arkiveras till-sammans med mötesprotkoll för att framö-ver fungera som undervisningsmaterial. Medwebb-baserad virtuell mikroskopi kan kon-sultation sjukhus emellan göras snabbt ochbekvämt, oberoende av geografiska avstånd.
Kvalitetskontroll
Kvalitetskontroll inom patologi, hematologioch cytologi kräver serier med så gott somidentiska preparat, vilket för vissa typer avpreparat och diagnoser t.o.m. är omöjligt attåstadkomma. Cirkulering av preparat mellanlaboratorier har upplevts som besvärligt. Manhar i praktiken varit tvungen att begränsa sigtill fall där en större serie preparat som så långtsom möjligt motsvarar varandra kan produ-ceras och därefter postas till deltagande la-boratorium. Trots att en serie glas kan varasnittade från samma tumör kan variationensnitten emellan bli stor om snitten är många.Med virtuell mikroskopi för kvalitetskontrollser alla deltagare exakt samma snitt, och allatyper av preparat kan användas. Kvalitet-skontrollen kan göras mer omfattande, t.ex.på nationell eller internationell nivå. Ett fort-löpande samarbetsprojekt där vårt systemanvänds är kvalitetsgranskning inom ERSPC-studien (European Randomized Study ofScreening for Prostate Cancer) (http://www.webmicroscope.net/QA) [4].
Framtidsperspektiv
Responsen från patologer har varit övervägan-de positiv och visar att virtuell mikroskopi skalluppfattas som ett nyttigt komplement till verk-lig mikroskopering. Bildskärmar och digitalabilder kommer inte att ersätta traditionellamikroskop på samma sätt som röntgenavdel-ningar har digitaliserats. Skarpa digitala skär-mar har dock på en kort tid trängt undan tra-ditionella bildrörsmonitorer och kommer inomen inte alltför avlägsen framtid att uppnå ennärapå fotografisk bildkvalitet. Detta tillsam-mans med kontinuerligt stigande överförings-hastigheter på internet betyder att tröskeln föratt använda virtuell mikroskopi för allt flerpraktiskt nyttiga funktioner blir lägre. Sett urett något annorlunda perspektiv kommer derätt låga tekniska kraven på användarens ut-rustning – en helt vanlig dator och en lite snab-bare internetkontakt – att göra den fascine-rande mikroskopiska världen tillgänglig för enmycket bredare krets än i dag.
MK Mikael LundinForskningsgruppen för biomedicinskinformatikAvdelningen för cancersjukdomarInstitutionen för klinisk medicinHelsingfors universitetPostadress: HUCS institutPB 105, 00290 [email protected]
Docent Johan LundinForskningsgruppen för biomedicinskinformatikAvdelningen för cancersjukdomarInstitutionen för klinisk medicinHelsingfors universitetPostadress: HUCS institutPB 105, 00290 [email protected]
Professor Jorma IsolaInstitutet för medicinsk teknologi33014 Tammerfors [email protected]
Referenser
1. Glatz-Krieger, K., D. Glatz, and M.J. Mihatsch, Virtual sli-des: high-quality demand, physical limitations, and afforda-bility. Hum Pathol, 2003. 34(10): p. 968-74.
2. The Nyquist-Shannon Sampling Theorem.3. Standaert, B. and L. Denis, The European Randomized Stu-
dy of Screening for Prostate Cancer: an update. Cancer, 1997.80(9): p. 1830-4.
4. tumours, W.h.o.c.o., Tumours of the Breast and Female Ge-nital Organs, ed. P.D. Fattaneh A.Tavassoli. 2003, Lyon: IAR-CPress.
FLS_tidning_juni_04_mac.p65 29.6.2004, 22:4625
