wiczenia laboratoryjne Inżynieria Środowiska · Na efektywnoś działania środków dezynfekcyjnych mają wpływ: czas stosowania, stężenie, temperatura, pH, wilgotnoś środowiska

Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie

przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska

Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 1


Przedmiot: Biologia

Ćwiczenia laboratoryjne dla kierunków: Ochrona Środowiska i Inżynieria Środowiska

Prowadząca: dr Beata Dudzińska-Bajorek

Spis treści:

1. Wprowadzenie

2. Sterylizacja (wyjaławianie)

3. Dezynfekcja

4. Podłoża mikrobiologiczne

5. Pobieranie materiału mikrobiologicznego do badań

6. Techniki wykonywania posiewów

7. Warunki hodowli mikroorganizmów

8. Wzrost drobnoustrojów na podłożach

9. Barwienie drobnoustrojów

10. Mikroskopowanie

11. Zasady bezpiecznej pracy

12. Część praktyczna

Ćwiczenie 1 - Mikroflora środowiska, posiewy ze środowiska

Ćwiczenie 2 - Analiza mikrobiologiczna wody i gleby cz.1


Ćwiczenie 4 - Analiza mikrobiologiczna wody i gleby cz.3. Identyfikacja pałeczek Gram-

ujemnych cz.1

Ćwiczenie 5 - Identyfikacja pałeczek Gram-ujemnych cz.2



Ćwiczenie 8 - Czynniki fizyczne i chemiczne mające wpływ na wzrost drobnoustrojów cz.1

Ćwiczenie 9 - Wpływ wybranych związków chemicznych na wzrost bakterii cz.2

Ćwiczenia 10 - Badania mikrobiologiczne żywności

Ćwiczenie 11 - Badania mikrobiologiczne kosmetyków

Ćwiczenie 12 - Izolacja DNA z komórek roślinnych

Ćwiczenie 13 - Izolacja chromosomalnego DNA z komórek bakteriyjnych

Ćwiczenie 14 - Reakcja RAPD-PCR (losowa amplifikacja polimorficznego DNA)

13. Literatura




1. Wprowadzenie

Mikrobiologia, jako nauka o drobnoustrojach, zajmuje się cechami morfologicznymi,

właściwościami biochemicznymi, rolą w środowisku naturalnym, właściwościami

chorobotwórczymi, jak również zastosowaniem mikroorganizmów w przemyśle. Drobnoustroje

spotykane są we wszystkich środowiskach naturalnych na Ziemi, dotyczy to również wszystkich

organizmów żywych. Z punktu widzenia człowieka, mikroorganizmy mogą być pożyteczne,

obojętne lub stanowić zagrożenie. Praca z materiałem zakaźnym zawsze wiąże się z ryzykiem

zakażenia siebie lub osób z otoczenia. Należy zawsze brać pod uwagę nieprzewidziane zdarzenia

takie jak pęknięcie probówki w trakcie wirowania czy źle zabezpieczony materiał od pacjenta.

Na największe ryzyko mikrobiologiczne narażone są osoby stykające się z materiałem

mikrobiologicznym z racji wykonywania swojego zawodu: mikrobiolog, lekarz, pielęgniarka.

O ryzyku mikrobiologicznym muszą również pamiętać studenci zapoznający się z metodami

laboratoryjnymi pracy z drobnoustrojami. W związku z taką specyfiką pracy w każdym laboratorium

mikrobiologicznym wprowadza się przepisy dotyczące sposobu obchodzenia się z materiałem

mikrobiologicznym, wykonywaniem posiewów, badań, sterylizacji pożywek, utylizacji odpadów oraz

dezynfekcji pomieszczeń i osobistej.

2. Sterylizacja (wyjaławianie)

Wyjaławianie to proces zabijania drobnoustrojów, zarówno ich komórek wegetatywnych, jak

i form przetrwalnych. Sterylizację można przeprowadzić posługując się metodami fizycznymi

(Rys. 1) lub chemicznymi.

Rys. 1. Fizyczne metody sterylizacji




Do fizycznych metod sterylizacji zaliczmy:

wyżarzanie w płomieniu palnika gazowego - służy do wyjaławiania ezy i igieł preparacyjnych,

drobnoustroje są niszczone przez spalenie, jest stosowana przed i po szczepieniu pożywki

za pomocą ezy. Aby sterylizacja ezy była efektywna, należy pamiętać o konieczności

ogrzewania drucika ezy do czerwonego żaru (Rys. 2A)

opalanie w płomieniu palnika brzegów probówek lub kolb (po wyjęciu korka), bagietek, głaszczek

szklanych oraz szkiełek podstawowych do preparatów mikroskopowych (Rys. 2B). Można

sterylizować również przez zanurzenie w alkoholu etylowym i opalenie w płomieniu palnika

gazowego.

Rys. 2. Termiczne wyjaławianie na sucho: A – wyżarzanie, B - opalanie wylotów np. probówek

w celu zapobieżenia reinfekcji

sterylizacja gorącym suchym powietrzem służy do wyjaławiania szkła laboratoryjnego, a także

trwałych materiałów lub przedmiotów stalowych, np. opraw metalowych do filtrów (sterylizację

wykonuje się w suszarkach w temperaturze 140°C przez 2,5 godziny, 160°C - 2 godziny lub

180°C - 1 godzinę)

dekoktacja (wyjaławianie przez gotowanie) – metoda powszechnie stosowana w przeszłości,

obecnie ten sposób sterylizacji powinien być ograniczony jedynie do wyjątkowych sytuacji, gdyż

zabieg ten nie niszczy wirusów zapalenia wątroby, a także przetrwalników bakterii

pasteryzacja (działanie na drobnoustroje temperaturą do 100°C) - proces zniszczenia form

wegetatywnych drobnoustrojów obecnych w środowisku płynnym, np. produktach spożywczych:

mleku i jego przetworach, piwie, sokach owocowych itp. (pasteryzacja niska - ogrzanie

w temperaturze 63-65°C przez 30 minut, pasteryzacja wysoka - ogrzewanie w temperaturze

72°C lub 90°C przez 15 sekund)

tyndalizacja (sterylizacja w aparacie Kocha) - proces trzykrotnej sterylizacji w bieżącej parze

wodnej podłoży mikrobiologicznych, których skład nie pozwala na wyjaławianie w temperaturze

powyżej 100°C, proces przeprowadza się w odstępach 24-godzinnych; w przerwach między

wyjaławianiem podłoża umieszcza się w cieplarce o temperaturze 32°C; po pierwszym




wyjałowieniu zostają zabite formy wegetatywne, żywe pozostają przetrwalniki, które kiełkują

w czasie inkubacji pożywki w cieplarce, pochodzące z nich formy wegetatywne drobnoustrojów

zostają zabite podczas następnej sterylizacji, trzecie wyjałowienie, poprzedzone inkubacją

w temperaturze 32°C, zapewnia pełną skuteczność metody (aparat Kocha to zamykany

pokrywą kocioł z podwójnym dnem, którego spód stanowi zbiornik z wodą podgrzewaną do

temperatury wrzenia; gorąca para wodna ulatnia się przez dziurkowane dno zbiornika, w którym

ustawia się kolby z jałowionymi podłożam)

wyjaławianie za pomocą pary wodnej pod zwiększonym ciśnieniem - sterylizację tą metodą

prowadzi się w autoklawie, tej metodzie można poddać jedynie te materiały, pożywki lub płyny,

których składniki nie ulegają rozkładowi w temperaturze powyżej 100°C; najczęściej stosuje się

nadciśnienie od 0,8 do 1,6 atm (od 810,6 do 1621,2 HPa), co odpowiada temperaturze

117,0-127,0°C (działanie autoklawu polega na sterylizacji wysoką temperaturą uzyskaną

po sprężeniu nasyconej pary wodnej; para w zetknięciu z bardziej chłodnymi przedmiotami

wyjaławianymi skrapla się w postaci wody, uwalniając dużą ilość utajonego ciepła kondensacji,

które podnosi temperaturę sterylizacji)

sterylizacja przez sączenie (filtrowanie) - sączenie przez filtry o średnicy porów mniejszej

od średnicy bakterii, najczęściej 0,2 i 0,45 m; przez tak małe otwory w filtrze płyn

przemieszcza się z trudem, w związku z tym należy stosować podciśnienie, uzyskiwane

za pomocą pompki wodnej lub pompy olejowej (Rys. 3) lub nadciśnienie (w filtrach

strzykawkowych); filtry mikrobiologiczne działają nie tylko na zasadzie sita mechanicznego, ale

także przez adsorpcję cząstek sączonych na ścianach porów; skuteczność sączenia

mikrobiologicznego zależy nie tylko od wielkości bakterii, ale także ich ładunku elektrycznego,

budowy powierzchni oraz powierzchni porów filtrów

Rys. 3. Zestaw do filtracji próżniowej

wyjaławianie za pomocą promieniowania ultrafioletowego (UV) - promieniowanie o zakresie fal

230-270 nm wykazuje bardzo silnie działanie bakteriobójcze lub mutagenne; jest pochłaniane

w komórkach bakteryjnych przez zasady purynowe i pirymidynowe DNA oraz aminokwasy




aromatyczne białek; stosowane do sterylizacji powietrza, pomieszczeń (sale operacyjne,

gabinety zabiegowe, linie technologiczne np. do produkcji Ieków w warunkach jałowych, boksy

bakteriologiczne, wirusologiczne itp.); jako źródło promieniowania stosuje się lampy kwarcowe

sterylizacja radiacyjna - niszczenie drobnoustrojów za pomocą promieniowania jonizującego

(przenikliwego); najsilniejsze działanie bakteriobójcze wykazują promienie X i oraz katodowe

(strumienie szybkich elektronów); jako dawkę sterylizującą stosuje się 1-3 megaradów,

sterylizacji radiacyjnej poddaje się przede wszystkim sprzęt medyczny jednorazowego użytku

(np. strzykawki igły, skalpele, cewniki, zestawy do przetaczania krwi, zestawy kroplówek,

protezy itp.) wykonane z tworzyw sztucznych i metali, przeszczepy tkanek (tzw. protezy

biologiczne - kości, tkanki chrzestnej, zastawek serca), materiały opatrunkowe oraz niektóre

produkty żywnościowe, leki, surowce farmaceutyczne i spożywcze (produkty suche), kosmetyki,

artykuły kosmetyczne (np. sztuczne rzęsy), korki do butelek do wina, osady po oczyszczaniu

ścieków i inne

Chemiczne metody sterylizacji oparte są na sterylizacji gazowej, która jest stosowana na skalę

przemysłową do wyjaławiania produktów jednorazowego użytku, np. drobnego sprzętu medycznego,

aparatury medycznej, materiałów opatrunkowych, odzieży i pościeli szpitalnej, książek, tkanin,

obrazów, a także suszy warzywnych i owocowych. Spośród gazów najczęściej stosuje się tlenek

etylenu (Rys. 4). Ze względu na właściwości wybuchowe tlenku etylenu, używa się go w

mieszaninie z CO2, parami formaldehydu lub bromku metylowego. Podwyższenie temperatury

otoczenia wpływa dodatnio na efektywność sterylizacji tymi gazami. Tlenek etylenu działa

zabójczo na wszystkie drobnoustroje oraz ich formy przetrwalne. Gaz ten jest trucizną

protoplazmatyczną, alkiluje grupy funkcyjne karboksylowe, aminowe, fenylowe i sulfhydrylowe w

białkach bakterii (grupy -SH najszybciej).

Rys. 4. Mechanizm działania tlenku etylenu na bakterie

Do dezynfekcji wody używa się ozonu i chloru, w mniejszym stopniu fluoru.

Główną wadą sterylizacji gazowej jest związana z nią toksyczność całego procesu. Wymaga ona

specjalnej kontroli i reżimu technologicznego, co podraża jej koszty.




3. Dezynfekcja

Dezynfekcja (odkażanie) jest procesem prowadzącym do zniszczenia drobnoustrojów

chorobotwórczych oraz zmniejszenia zanieczyszczenia innymi drobnoustrojami w danym

środowisku. Różnica pomiędzy dezynfekcją a sterylizacją polega na rodzaju środków oraz

spektrum drobnoustrojów, które są eliminowane podczas ich stosowania. Do dezynfekcji stosuje

się przede wszystkim środki chemiczne i postępowanie to prowadzi do eliminacji wegetatywnych

form drobnoustrojów, podczas gdy sterylizacja powoduje zniszczenie wszelkich form życia,

zarówno wegetatywnych, jak i przetrwalnych.

W dezynfekcji stosuje się metody zaliczane również do metod sterylizacji: dekoktację oraz

promieniowanie UV (powszechnie stosowane do dezynfekcji pomieszczeń - sal operacyjnych,

gabinetów zabiegowych, boksów w aptekach do jałowego przygotowywania leków, boksów dla

noworodków w szpitalach, sal, w których odbywa się produkcja leków itp.).

Z dezynfekcją wiążą się następujące pojęcia:

sanityzacja – mycie przy użyciu detergentów pomieszczeń i ich wyposażenia narażonych

na silne zanieczyszczenie drobnoustrojami (sale chorych, korytarze szpitalne, łazienki, toalety

itp.); prowadzi to do obniżenia liczby drobnoustrojów w środowisku i zwiększa skuteczność

dezynfekcji właściwej

aseptyka – zespół czynności umożliwiających jałowe przygotowanie leków lub produktów

medycznych

antyseptyka - postępowanie prowadzące do usuwania drobnoustrojów za skóry, błon

śluzowych, uszkodzonych tkanek. W tym przypadku stosuje się wyłącznie nietoksyczne środki

dezynfekcyjne, które działają bójczo na drobnoustroje, nie drażniąc równocześnie i nie

uszkadzając tkanek.

Wymagania stawiane środkom dezynfekcyjnym stosowanym w praktyce są następujące:

środek dezynfekcyjny powinien być skuteczny - jego skuteczność zależy od rodzaju

drobnoustrojów, na które ma działać; przed dokonaniem wyboru środka dezynfekcyjnego

należy więc sprawdzić, jakie drobnoustroje mogą występować w danym środowisku i które

spośród nich są najmniej pożądane

najlepszy środek dezynfekcyjny to taki, który działa na drobnoustroje w małym stężeniu,

w krótkim czasie w temperaturze otoczenia

związki chemiczne stosowane do dezynfekcji nie powinny wpływać ujemnie na żywność

(pogorszenie jej trwałości i jakości)

środki dezynfekcyjne w stężeniu użytkowym nie powinny niszczyć dezynfekowanych maszyn,

urządzeń itp.

substancje chemiczne wykorzystywane do dezynfekcji nie mogą stanowić zagrożenia dla ludzi




tak w trakcie ich stosowania, jak i po dezynfekcji

środek dezynfekcyjny powinien dać się łatwo spłukać wodą

związki chemiczne stosowane obecnie w praktyce do dezynfekcji powinny charakteryzować się

brakiem nieprzyjemnego zapachu

najlepsze środki dezynfekcyjne to takie, które charakteryzują się szerokim spektrum działania

na drobnoustroje

środek dezynfekcyjny stosowany na wielką skalę powinien być tani.

Na efektywność działania środków dezynfekcyjnych mają wpływ: czas stosowania,

stężenie, temperatura, pH, wilgotność środowiska i obecność substancji organicznych w otoczeniu.

Wykazano, że im dłuższy jest czas i im wyższa temperatura otoczenia, w której działa środek

dezynfekujący, tym większa liczba drobnoustrojów ginie. Duża zawartość substancji organicznych

w środowisku obniża efektywność działania środka.

Mechanizm działania środków dezynfekcyjnych polega na:

uszkodzeniu ściany i błony komórkowej - np. przez detergenty, czwartorzędowe związki

amoniowe, kwasy, fenole, zasady;

denaturacji białek, głównie enzymów, których dezaktywacja prowadzi do śmierci komórki

np. alkohole, aldehydy, fenole, czwartorzędowe związki amonowe

blokowaniu wolnych grup sulfhydrylowych - enzymy zawierające tę grupę mogą działać tylko

w wolnej, zredukowanej formie. Zredukowanie grupy –SH przez czynnik utleniający powoduje

uszkodzenie lub śmierć komórki. Podobne działanie wykazują również preparaty jodowe

i preparaty zawierające metale ciężkie

uszkodzeniu kwasów nukleinowych - barwniki zasadowe jak fiolet krystaliczny, zieleń

brylantowa tworzą sole z kwasami nukleinowymi mikroorganizmów

Do dezynfekcji najczęściej stosuje się kwasy i zasady, środki utleniające, sole metali

ciężkich, alkohole, fenole, krezole, aldehydy i czwartorzędowe związki amonowe.

Kwasy i zasady - efekt ich działania wiąże się z aktywnością jonów wodorowych lub

wodorotlenowych. Kwasy wywierają silniejszy wpływ na drobnoustroje niż zasady. Oba rodzaje

związków chemicznych wykazują silne działanie bakteriobójcze, nie tylko wobec form

wegetatywnych, ale i przetrwalnych; nie mogą być jednak szerzej stosowane, gdyż niszczą nie

tylko drobnoustroje, ale też przedmioty i materiały poddawane dezynfekcji. 10% roztwory zasad

używane są do dezynfekcji magazynów żywności i pomieszczeń po zwierzętach dotkniętych

chorobami wirusowymi. 20% zawiesinę wodorotlenku wapnia (mleko wapienne) stosuje się

do dezynfekcji pomieszczeń, wagonów do transportu zwierząt, toalet, śmietników itp. Mocne kwasy

nieorganiczne - HCl, H2SO4 są bardziej skuteczne niż kwasy organiczne.

Zastosowanie znalazł również kwas nadoctowy, który działa silnie utleniająco w niskich

stężeniach (0,25-2,5%). Związek ten jest aktywny w stosunku do form wegetatywnych




i przetrwalnych bakterii. Ponieważ nie wykazuje właściwości korozyjnych i łatwo ulega rozkładowi

na produkty nieszkodliwe dla produktów spożywczych (woda, tlen, kwas octowy), może być

stosowany do dezynfekcji systemów zamkniętych (np. w browarnictwie i winiarstwie) bez

konieczności przepłukiwania ich wodą. Taka procedura zapobiega powtórnemu skażeniu systemu,

gdy jakość mikrobiologiczna będącej do dyspozycji wody nie jest najlepsza. Ponadto związek ten

może być użyty do sterylizacji przedmiotów termowrażliwych i dezynfekcji rąk.

W niższych stężeniach 2-5% stosuje się również kwas siarkowy do dezynfekcji rur i kranów

wodociągowych oraz roztwór fenolu do dezynfekcji sit i worków.

Środki utleniające - najważniejsze miejsce wśród nich zajmują związki chloru. W wyniku reakcji

chloru z wodą powstaje silnie bakteriobójczy kwas podchlorawy. Zaledwie 0,006% stężenie chloru

w wodzie niszczy formy wegetatywne i przetrwalne drobnoustrojów. W praktyce używa się

chloraminy organiczne (S, B, T) i podchloryny (sodu lub wapnia). Chloramina T i dwuchloramina T

zawierają odpowiednio 12,5% i 29,5% czynnego chloru i działają najsilniej w środowisku kwaśnym.

Do dezynfekcji rąk stosuje się je w stężeniach 0,5-1%, a do odkażania pomieszczeń w stężeniu

5%. Chloraminy i podchloryny działają bardzo dobrze na bakterie Gram-ujemne, słabiej na Gram-

dodatnie. Chloraminę stosuje się zwłaszcza w laboratoriach wirusologicznych. Podchloryn sodowy

i wapniowy wykazują silną aktywność wobec komórek wegetatywnych, ich działanie na spory jest

znacznie słabsze. Związki te są aktywne jedynie w środowisku wolnym od białek i ich pochodnych.

Chlor, uwolniony z tych soli, reaguje z nimi tworząc chlorobiałczany i chloropeptony. Nie powstaje

wtedy aktywna wobec bakterii cząsteczka kwasu podchlorowego. Podchloryny działają najlepiej

w pH obojętnym lub kwaśnym i w niskich temperaturach. Podchloryn sodowy, w praktyce, stosuje

się do dezynfekcji pomieszczeń, zwłaszcza chłodni oraz komór składowych żywności.

Bardzo silnym utleniaczem stosowanym do dezynfekcji wody jest ozon. Działa on silnie

na bakterie, wirusy, utlenia również niektóre zanieczyszczenia chemiczne, m.in. fenole. Jest łatwo

usuwany z wody, gdyż sam się rozkłada. Stosowany jest coraz częściej obok chloru (dodawany

w stężeniu 0,1 mg/litr wody) do dezynfekcji wody wodociągowej.

Do środków utleniających wykorzystywanych powszechnie do dezynfekcji zaliczamy

również nadmanganian potasowy oraz 3% roztwór H2O2 - wodę utlenioną.

Alkohole - aktywność bójcza alkoholi wzrasta wraz z liczbą atomów węgla w ich cząsteczce

(C1 - C5). Najczęściej stosowanymi są etanol i propanol. Ten ostatni wykazuje najsilniejsze

działanie spośród alkoholi, słabiej działa etanol, najsłabiej metanol, który będąc silną trucizną

w praktyce nie jest stosowany. Propanolu używa się w wodnym roztworze 80%. Nie należy

stosować go do dezynfekcji osobistej, gdyż działa silnie alergicznie. Aktywność bójcza alkoholu

etylowego związana jest z jego działaniem denaturacyjnym wobec białek, wymaga więc obecności

wody w środowisku. Etanol wykazuje najsilniejsze działanie odkażające w stężeniu 70% w wodzie.

Z innych alkoholi stosuje się także alkohol benzylowy.




Aldehydy - wykazują szeroki zakres działania, obejmujący bakterie, prawie wszystkie wirusy,

grzyby oraz w określonych warunkach przetrwalniki bakteryjne, również w obecności

zanieczyszczeń organicznych. Aldehydy wykorzystuje się często w formie preparatów mieszanych

np. z detergentami - związkami powierzchniowo czynnymi, które umożliwiają penetrację aldehydu

przez zanieczyszczenia organiczne bezpośrednio do mikroorganizmów. Najsilniejsze działanie

przeciwdrobnoustrojowe wykazuje aldehyd mrówkowy i aldehyd glutarowy. Preparatem

handlowym aldehydu mrówkowego stosowanym w dezynfekcji jest formalina zawierająca 37%

tego związku i 10-15% aldehydu metylowego (dla zapobieżenia polimeryzacji aldehydu

mrówkowego). Do odkażania przygotowuje się roztwór wodny lub alkoholowy formaliny w stężeniu

od 3 do 20%. Nieprzyjemny zapach to główna niedogodność ich stosowania. Aldehyd glutarowy

działa bardzo silnie zarówno na bakterie Gram-ujemne jak i Gram-dodatnie, również prątki

gruźlicy, a także wirusy i grzyby chorobotwórcze. Produkt działający w stężeniu 2% może być

wykorzystywany w czasie 4 godzin jako czynnik sterylizujący.

Związki fenolu i ich pochodne - działają silnie bakteriobójczo, słabiej na wirusy i formy

przetrwalne bakterii. Środowisko kwaśne sprzyja działaniu bójczemu pochodnych fenolu, osłabia je

obecność substancji organicznych, zwłaszcza białek. Preparaty handlowe tych związków

stosowane w praktyce to lizol (roztwór krezolu i kwasów tłuszczowych i jest wykorzystywany do

odkażania w stężeniu 2-8%), septyl (zawiera pochodne fenolu - amylofenol i fenylofenol -

i stosowany jest w stężeniu 1-2% - czas ekspozycji 60 minut) i desson (zawiera chloro-ksylenol-

terpineol oraz sól potasową kwasu rycynowego i wykazuje działanie w roztworze od 2 do 5%).

Związki te stosuje się zewnętrznie.

Związki powierzchniowo czynne - czwartorzędowe związki amoniowe, ulegające łatwej

dysocjacji w wodzie do naładowanego ujemnie jonu chlorkowego i kompleksowego jonu

naładowanego dodatnio. Związki te obniżają napięcie powierzchniowe, charakteryzuje je szerokie

spektrum działania (bakterie, grzyby strzępkowe - pleśnie, drożdże, wirusy), długotrwały efekt

i przyjemny zapach. Zetknięcie się drobnoustroju z detergentem kationowym powoduje jego

adsorpcję na powierzchni komórki, co ułatwia jej ujemny ładunek. Mechanizm działania tych

substancji opiera się na zmianie przepuszczalności ściany i błony komórkowej drobnoustrojów.

Ujemną stroną jest możliwość uodpornienia się bakterii szczególnie Gram-ujemnych, co wymusza

konieczność przemiennego ich stosowania z preparatami o odmiennych mechanizmach działania

(związkami nadtlenowymi, podchlorynem). Ich aktywność ulega osłabieniu w obecności związków

organicznych i mydła. W praktyce najczęściej stosuje się czwartorzędowe zasady bcnzylo-alkilo-

amoniowe i pyrimidyniowe, np. sterinol (10% roztwór bromku dimetylo-laurylo-benzylo-

amoniowego) i zanosept (25% wodny roztwór bromku laurylo-propylo-amonowego). Do odkażania

stosuje się roztwory 2-10% tych związków.

Jodofory - koloidalne roztwory jodu w związkach powierzchniowo czynnych lub polimerach

spełniających rolę nośników. Ich aktywność opiera się na uwalnianiu m.in. jodu, działającego




drobnoustrojobójczo. W praktyce stosuje się 2-10% roztwory preparatów jodoseptylu lub incodyny.

Do dezynfekcji ran stosuje się 10% roztwór jodu - jodynę.

Chloroheksydyna - stosowana jest do dezynfekcji ogólnej, działając silnie na bakterie Gram-

dodatnie, słabiej na Gram-ujemne. W praktyce używa się 20% roztworu wodnego dwuglukonianu

chloroheksydyny, który do celów antyseptycznych rozcieńcza się wodą do stężenia 0,5% lub -

do dezynfekcji 70% etanolem do stężenia 2,5%.

Sole metali ciężkich - w praktyce stosuje się działające bakteriobójczo sole rtęci i srebra. Silne

działanie wykazują organiczne związki rtęci, np. jej fenylopochodne. Chlorek rtęci tzw. sublimat,

stosowany jest do dezynfekcji skór, futer, naczyń porcelanowych i szklanych. Nie może być

stosowany natomiast do dezynfekcji sprzętu mającego kontakt z żywnością. Zarówno organiczne,

jak i nieorganiczne związki tego pierwiastka niszczą tylko formy wegetatywne bakterii.

4. Podłoża mikrobiologiczne

Pożywki hodowlane, zwane inaczej podłożami mikrobiologicznymi, służą do hodowli

mikroorganizmów w warunkach laboratoryjnych. Stosując różne podłoża możemy prowadzić

izolację mikroorganizmów, różnicować je, namnażać oraz identyfikować.

Składniki podłoży mikrobiologicznych:

źródło węgla i energii

najczęściej węglowodany (np. glukoza, laktoza, maltoza, skrobia, celuloza)

glicerol, mannitol oraz niektóre kwasy organiczne (dodaje się je w ilości 0,5-2%)

źródło azotu

bakterie, które wiążą azot z atmosfery

pepton - polipeptydy tworzące się podczas enzymatycznego rozpadu białek (pod wpływem

działania trypsyny, pepsyny bądź 20% HCl), liczne wolne aminokwasy i krótkie łańcuchy

peptydowe, pewne witaminy i czasami węglowodany.

ekstrakty (mięsny, drożdżowy)

sole amonowe, wodorotlenek amonu oraz azotany

często dodaje się czyste białko, bądź wolne aminokwasy

składniki mineralne – sole mineralne oraz pierwiastki śladowe

fosforan potasu utrzymujący właściwy odczyn pH, zwiększa pojemność buforową

NaCl dodawana w ilości 3-5g/l, reguluje ciśnienie osmotyczne

pierwiastki

biogenne: O,H, P,S - składniki budulcowe komórki

biorące udział w procesach życiowych komórki: Na, K, Mg, Ca, Fe

mikroelementy biorące udział w reakcjach komórkowych: Zn, Mn, Cu, Co




substancje wzrostowe

roztwory syntetyczne witamin

ekstrakty roślinne i zwierzęce

sok pomidorowy, wyciąg glebowy, brzeczka słodowa, wyciąg ziemniaczany

substancje różnicujące i wybiórcze

składniki różnicujące: te, które po dodaniu do pożywki ulegają pod wpływem wzrostu

drobnoustrojów rozkładowi (np. cukry – następuje zmiana barwy pożywki) lub też wskazują

na obecność produktów metabolizmu bakterii (np. wytwarzanie siarkowodoru, tworzenie

indolu)

składniki wybiórcze dodaje się po to, żeby hamując wzrost pewnych grup mikroorganizmów

umożliwić jednocześnie rozwój flory pożądanej (mogą to być: sole kwasów żółciowych, fiolet

krystaliczny, błękit brylantowy, antybiotyki)

czynniki zestalające (przypadku pożywek o konsystencji stałej)

agar - polisacharyd, który ma właściwości żelujące, dodaje się go w ilości 1,5-3%

żelatyna - substancja białkowa, bogata w kolagen, dodaje się w ilościach 12-15%

Podłoża hodowlane podzielić możemy biorąc pod uwagę:

skład chemiczny

naturalne – bulion, mleko, brzeczka słodowa, melasa buraczana

syntetyczne – złożone z odczynników chemicznych o ściśle znanym składzie ilościowym

i jakościowym

półsyntetyczne – przygotowane z odczynników chemicznych z dodatkiem pojedynczego

składnika naturalnego (wyciąg mięsny, mleko, serwatka, wyciągi roślinne: ziemniaczany,

pomidorowy, melasa buraczana, namok kukurydziany, brzeczka słodowa).

cel hodowli

namnażające – służące do otrzymania biomasy drobnoustroju

selektywne – zawierają zarówno składniki odżywcze jak i wybiórcze

różnicujące – zawierają substancje diagnostyczne, pozwalające stwierdzić w środowisku

obecność drobnoustrojów określonych rodzajów

wymagania pokarmowe drobnoustrojów

ogólne – do hodowli drobnoustrojów heterotroficznych o niewielkich wymaganiach

pokarmowych, prototroficznych (bulion odżywczy, agar odżywczy)

wzbogacone – do hodowli drobnoustrojów o zwiększonych wymaganiach hodowlanych,

auksotroficznych (np. bulion odżywczy z dodatkiem substancji wzrostowych; agar

wzbogacony z dodatkiem glukozy)

wybiórcze – do izolacji ściśle określonych grup drobnoustrojów (do podłoża dodaje się

składnik, który w przypadku hodowli mieszanej pozwala na wzrost tylko tych




mikroorganizmów, które tolerują ten składnik)

różnicujące – do identyfikacji drobnoustrojów w hodowli mieszanej (określone grupy

mikroorganizmów różnicuje się na podstawie rozkładu przez nie substratów wprowadzonych

do podłoża)

konsystencję

płynne – służą głównie do namnażana drobnoustroju (np. bulion)

półpłynne - zawierają agar w ilości 0,15—0,5% i służą do hodowli organizmów

o mniejszym zapotrzebowaniu na tlen oraz do badania ruchu bakterii

stałe – jako czynnik zestalający stosuje się agar, bądź żelatynę, służą do różnicowania

i izolowania bakterii i grzybów, a także hodowli i liczenia bakterii.

Przykłady pożywek stosowanych w mikrobiologii:

Pożywki ogólnego zastosowania

bulion zwykły, odżywczy, brzeczka słodowa

agar zwykły, odżywczy, bulion z agarem

żelatyna

Pożywki wybiórcze stosowane do hodowli bakterii

podłoża dla beztlenowców (podłoże Wrzoska, Wilsona-Blaira)

podłoża dla pałeczek z grupy coli (z żółcią i zielenią brylantową, Kesslera-Swenartona,

Endo)

podłoże do wykrywania enterokoków (z azydkiem sodu)

podłoże do wykrywania gronkowców (Chapmanna z mannitolem)

Pożywki wybiórcze stosowane do hodowli grzybów pleśniowych i drożdży

podłoże Sabourauda

brzeczka agarowa

pożywka Czapka – Doxa

podłoże Wikena i Richardsa do izolacji drożdży.

Znając skład jakościowy i ilościowy pożywki, dodaje się do wody destylowanej

poszczególne składniki zgodnie z podaną recepturą, następnie ogrzewa do momentu uzyskania

klarowności płynu i koryguje pH (jeżeli jest różne od oczekiwanego). W zależności od rodzaju

pożywki i wymaganych temperatur sterylizacji wyjaławia się rozpuszczoną pożywkę w aparacie

Kocha lub w autoklawie w określonym czasie. Po sterylizacji należy również sprawdzić

i ewentualnie skorygować pH. Ustalając pH pożywki zaraz po wyjęciu z autoklawu należy

uwzględnić, że po ostygnięciu do temperatury 37ºC kwasowość przesunie się w kierunku

zasadowym. Korektę pH prowadzi się za pomocą roztworów NaOH lub HCl. Po ostudzeniu, jeżeli

pożywka nie wymaga dodatku witamin, bądź przesączenia, rozlewa się ją. Sposób rozlewania

zależy od potrzeb, do jakich ma służyć przygotowane podłoże. Jeżeli potrzebujemy podłoża stałe




to można je rozlać na płytki Petriego lub do probówek gdzie zestala się je w formie skosu lub

słupka (rozlewane podłoże nie może mieć temperatury niższej od 45ºC, gdyż nie będzie się równo

zestalało). Pożywki płynne rozlewa się do probówek lub kolbek.

5. Pobieranie materiału mikrobiologicznego do badań

Odpowiednie pobranie materiału do badań jest bardzo ważnym elementem pracy

w mikrobiologii, gdyż decyduje o dalszym przebiegu badania oraz wyniku posiewu.

Pobieranie materiału do badań z powierzchni:

metoda tamponowa - stosowana do oceny skażenia mikrobiologicznego dużych powierzchni

(kadzie fermentacyjne, beczki, kontenery) oraz powierzchni wewnętrznych (przewodów,

zaworów, uszczelek). Materiał pobiera się przecierając jałowym tamponem z waty lub gazy

powierzchnię przeznaczoną do badania, następnie tampony umieszcza się w probówce

z jałowym płynem i przez dokładne wytrząsanie spłukuje pobrany materiał. Zawiesina

z materiałem jest wysiewana na odpowiednie podłoże.

metoda wypłukiwania - stosowana do oceny czystości opakowań szklanych lub metalowych.

Wewnętrzne powierzchnie naczynia opłukuje się przez wytrząsanie określoną ilością jałowego

płynu fizjologicznego lub wody destylowanej. Uzyskaną w ten sposób zawiesinę przeznacza się

do dalszych badań.

metoda Richtera - stosowana do badania czystości opakowań szklanych poprzez wlewanie

do naczynia podłoża agarowego, które przez obracanie naczynia rozprowadza się

równomiernie na jego wewnętrznych ściankach. Naczynie dokładnie zamknięte inkubuje się

w odpowiedniej temperaturze i po określonym czasie ocenia obecność kolonii drobnoustrojów.

metoda odciskowa - stosowana przy ocenie czystości materiałów opakowaniowych, korków,

wieczek lub innych małych powierzchni. Badany materiał przyciska się do powierzchni

zestalonego podłoża agarowego. Po określonym okresie inkubacji w odpowiedniej

temperaturze określa się obecność kolonii mikroorganizmów.

Kontrola powierzchni może być wykonywana specjalnymi przyrządami, które są w ofercie

firm zajmujących się diagnostyką mikrobiologiczną. Należą do nich płytki łopatkowe składające się

z umieszczonej w plastikowym zakręcanym opakowaniu plastikowej łopatki pokrytej z obu stron

podłożem agarowym. Posiew można wykonywać trzema sposobami:

dociśnięcie podłoża na łopatce do badanej powierzchni stałej;

potarcie podłóż na łopatce materiałem badanym pobranym za pomocą tamponu z waty;

zanurzenie łopatki jeżeli badany materiał jest w postaci płynnej.

Po okresie inkubacji w określonej temperaturze wzrost drobnoustrojów na łopatce ocenia się

zgodnie z dołączonym do opakowania wzorcem.




Ocenę czystości powierzchni można wykonać metodą bioluminescencji poprzez pomiar stężenia

ATP (adenozynotrifosforanu). Ocenę zawartości ATP prowadzi się zgodnie z dołączonymi

normami dla poszczególnych produktów.

Pobieranie płynów do badań - soki, mleko, wodę itp. pobiera się jałową pipetą do jałowej butelki,

kolbki lub probówki w ilości ¾ objętości naczynia i szczelnie korkuje. Próby pobiera się przy

palniku zgodnie z opisaną procedurą. Przed posiewem należy dokładnie wytrząsnąć próbkę

przygotowaną do badania.

Pobieranie past do badań - galaretki, przeciery, pasty itp. pobiera się jałową łopatką w ilości 20 –

50 g do wyjałowionej i wytarowanej kolbki o pojemności 200 cm3 i rozcieńcza przed posiewem

określoną ilością rozcieńczalnika (rozcieńczenie 1 : 10 lub 1 : 100).

Pobieranie do badań produktów o konsystencji stałej - z narządów wewnętrznych, mięsa,

wędlin, serów itp. pobiera się wyjałowionym skalpelem i pincetą ok. 200 g próbki (osobno z warstw

powierzchniowych i z głębszych). Wycinki wkłada się do płytek Petriego lub szerokich probówek

z gumowym korkiem. Pobrane próby tnie się na kawałki o boku 0,5 cm. Tak przygotowaną próbę

(na ogół o masie 20 g) rozciera się w moździerzu lub rozdrabnia w homogenizatorze i dodaje

do 180 g jałowego rozcieńczalnika (rozcieńczenie 1 : 10), a następnie przygotowuje się materiał

do posiewu.

6. Techniki wykonywania posiewów

Posiew mikrobiologiczny jest to przeniesienie badanego materiału na jałową pożywkę, którą

umieszcza się w zależności od oczekiwanego wyniku w inkubatorze. Wszystkie posiewy wykonuje

się przestrzegając zasad jałowości, czyli posiew wykonuje się przy zapalonym palniku, opalając

wyloty naczyń i pipet w płomieniu palnika, a także wyżarzając, a następnie chłodząc używane

podczas posiewu ezy i igły (Rys. 5A, 5B). Posiewy możemy również wykonać używając jałowych

tamponów z waty lub gazy, a także tzw. głaszczek - wygiętych pod kątem szklanych bagietek

(Rys. 5C).

Rys. 5. Drobny sprzęt laboratoryjny: A – eza, B – igła bakteriologiczna, C – szalka Patriego,

E – probówka z rurką Durhama, F – pipeta pasteurowska




W zależności od sposobu nanoszenia materiału hodowlanego wyróżniamy metody posiewów:

powierzchniowych – badany materiał wysiewany jest na powierzchnię zestalonej pożywki

wgłębnych – materiał wysiewany jest bezpośrednio do naczyń przeznaczonych do hodowli,

zalewany odpowiednią ilością schłodzonej pożywki, całość jest mieszana i pozostawiana do

zestalenia.

Wykonywanie posiewów ezą

Ezę używa się do posiewów na podłożach płynnych lub na podłożach stałych na skosach

agarowych w probówkach albo też na płytkach Petriego:

na podłożu płynnym należy pobrać ezą badany materiał, a następnie zanurzyć w probówce

z pożywką i lekko potrząsając ezą wypłukać materiał z jej oczka (Rys. 6A)

na skosie agarowym pobieramy ezą badany materiał, a następnie dotykamy ezą powierzchni

skosu i ruchem falistym lub zygzakowatym przeciągamy ezę po powierzchni podłoża w kierunku

wylotu probówki (Rys. 6B)

na płytce Petriego odrobinę badanego materiału rozprowadza się zygzakiem lub promieniście

na całej powierzchni zestalonego podłoża agarowego lub też dzieli się je na sektory i w nich

rozprowadza materiał (Rys. 6C).

Rys. 6. Posiew za pomocą ezy: A – na podłoże płynne, B – na skos agarowy, C - na płytce

Petriego

Wykonywanie posiewów igłą bakteriologiczną

Opaloną igłą pobiera się badany materiał, następnie wkłuwa igłę w zestalone w probówce

podłoże agarowe lub żelatynowe w postaci słupka (Rys. 7A).

Wykonywanie posiewów pipetą

Pipeta służy do wykonania posiewu materiału płynnego. Wyjałowioną pipetą pobiera się

określoną ilość badanego materiału i przenosi do pożywki płynnej (1 cm3), bądź na zestalone




podłoże agarowe na płytce Petriego (0,1 lub 0,5 cm3). Wylany na płytkę materiał rozprowadza się

po całej powierzchni szklaną głaszczką (metoda powierzchniowa) (Rys. 7B).

Używając pipety można wykonać posiew metodą zalewową. Określoną ilość materiału (1 cm3)

przenosi się na płytkę Petriego, następnie zalewa upłynnionym i odpowiednio ochłodzonym

podłożem agarowym (9 cm3). Całość lekko miesza się poruszając płytkę ruchem kolistym

po powierzchni stołu. Ten rodzaj posiewu jest wykorzystywany w posiewach ilościowych i do

izolacji czystych kultur (Rys. 7C).

Rys. 7. Posiew: A – za pomocą igły bakteriologicznej metodą kłutą, B – za pomocą pipety metodą

powierzchniową, C - za pomocą pipety metodą zalewową

Wykonywanie posiewów jałowym tamponem z gazy lub z waty

Przy pobieraniu materiałów z dużych powierzchni np.: stołów, naczyń, opakowań możemy

używać jałowego tamponu, którym pocieramy wybrany fragment badanej powierzchni, następnie

wypłukujemy go w odpowiednim rozcieńczalniku i wykonujemy posiew bezpośrednio

z rozcieńczalnika.

Posiew ilościowy

Posiew ilościowy stosuje się w przypadku konieczności oznaczenia liczby drobnoustrojów

w badanym materiale. Przygotowując próbę badanego materiału do posiewu ilościowego należy

zastosować metodę kolejnych rozcieńczeń (Rys. 8). W tym celu należy odważyć lub odmierzyć

określoną ilość produktu (1 lub 10 cm3/g), po ewentualnym rozdrobnieniu umieścić w naczyniu i

zalać 9 lub 90 cm3 roztworu rozcieńczalnika. Po dokładnym wymieszaniu uzyskuje się

rozcieńczenie wyjściowe 10-1 (1:10). Kolejne rozcieńczenie 10-2 (1:100) sporządza się przenosząc

1 cm3 zawiesiny do kolejnej probówki z 9 cm3 rozcieńczalnika. Sposób wykonania kolejnych




rozcieńczeń jest identyczny, a ich liczba zależy od rodzaju badanego materiału.

Po sporządzeniu odpowiedniego rozcieńczenia wykonuje się posiew ilościowy metodą płytkową

Kocha (zalewową lub powierzchniową). Po okresie inkubacji do pomiarów bierze się te płytki,

na których liczba kolonii mieści się w granicach od 30 do 200.

Rys. 8. Metoda kolejnych rozcieńczeń

Izolacja czystych kultur

W badaniach mikrobiologicznych należy posługiwać się czystymi kulturami, tj. hodowlami

wyprowadzonymi z jednej komórki (zarodnika), które reprezentują jeden gatunek drobnoustroju.

Sposoby izolacji czystych kultur:

posiewu na całej powierzchni (Rys. 9A)

posiewu sektorowo – redukcyjny (Rys. 9B) - płytkę Petriego z zestalonym podłożem dzieli się

na cztery sektory; pobrany do izolacji materiał rozsiewa się ezą przez wszystkie sektory

metoda płytek lanych (Rys. 9C) - polega na posiewie odpowiedniego rozcieńczenia (10-4; 10-5)

zawiesiny bakterii i wykonaniu posiewu techniką wgłębną.

Po uzyskaniu wzrostu pojedynczych koloni przenosi się je sterylnie z kultur mieszanych,

za pomocą ezy lub igły bakteriologicznej, na jałową pożywkę w płytce Petriego lub probówce. Tak

wyizolowane czyste kultury mikroorganizmów należących do jednego gatunku nazywamy

szczepami.




Rys. 9. Izolacja czystych kultur metodą posiewu na całej powierzchni (A), sektorową (B) oraz

płytek lanych (C)

Rozcieńczalniki stosowane do przygotowywania zawiesin:

płyn fizjologiczny (0,85%): NaCl (8,5g) + woda destylowana 100 ml

płyn Ringera: NaCl (9g) + KCl (0,42g) + CaCl2 (0,48g) +NaHCO3 (0,2g) + woda destylowana

4000 ml;

woda buforowana: bufor fosforanowy (1,25ml) + 1000 ml wody destylowanej;

Roztwory te są izotoniczne dla drobnoustrojów. Dozwolone jest również stosowanie wody

destylowanej ale tylko w tych przypadkach, gdy metodyka obróbki badanego materiału

na to pozwala. Pamiętać należy o jałowości używanych rozcieńczalników.

7. Warunki hodowli mikroorganizmów

Najważniejszymi czynnikami abiotycznymi wpływającymi na wzrost i rozwój

drobnoustrojów, w tym także na podłożach mikrobiologicznych w warunkach laboratoryjnych,

są czynniki fizyczne (temperatura), chemiczne (kwasowość, tlenowość), a także zawartość

składników odżywczych.

Temperatura

Mikroorganizmy rozwijać się mogą w bardzo szerokim zakresie temperatur,

od – 23°C (silnie zasolone wody Antarktydy, w których stwierdzono obecność bakterii z rodzaju




Corynebacterium i grzybów z rodzaju Sporobolomyces) do 113°C (gorące źródła, kominy termalne

– Pyrodictium brockii). Większość mikroorganizmów rozwija się jednak w temperaturach

od 10 – 37°C. W warunkach laboratoryjnych najczęściej stosowaną temperaturą hodowli bakterii

jest zakres 30 – 37°C, natomiast dla grzybów temperatura 20 – 25°C.

Ze względu na różnice w minimalnych, optymalnych i maksymalnych temperaturach wzrostu,

mikroorganizmy dzieli się na ogół na trzy grupy:

psychrofilne (temperatury poniżej 0°C, optymalna poniżej 15°C) - drobnoustroje zdolne

do rozwoju w środowiskach naturalnych o niskich temperaturach (rejony podbiegunowe, szczyty

wysokich gór, dna oceanów, osady głębokich jezior, mórz i oceanów).

mezofilne (10-30; 20-37; 35-50°C) - grupa drobnoustrojów zdolna do wzrostu w umiarkowanych

temperaturach. Do mezofili zalicza się większość drobnoustrojów występujących w środowisku

(glebie, wodzie, na powierzchni ciała roślin i zwierząt). Są to na ogół mikroorganizmy

saprofityczne oraz chorobotwórcze dla roślin, zwierząt i człowieka, wśród nich wywołujące

zatrucia pokarmowe.

termofilne (optymalna temperatura dla bakterii 60°C, dla grzybów 20-50°C) - drobnoustroje

o wysokich optymalnych temperaturach wzrostu. Podzielono je na dwie grupy. Pierwsza zwana

termofilami - obejmuje mikroorganizmy o optymalnej temperaturze wzrostu powyżej 45°C,

występujące w kompoście, nawozie organicznym, sianie, glebie, kiszonce. Druga grupa

to hipertermofile o optymalnej temperaturze wzrostu powyżej 80°C, zajmujące środowiska

o temperaturach ekstremalnych: solfatary, gorące źródła, gejzery, geotermiczne osady dna

morskiego, głębokie gorące źródła oceaniczne.

Kwasowość - odczyn środowiska

pH jest jednym z czynników, który znacząco wpływa na ilościowy i jakościowy skład

mikroflory w danym środowisku. pH wnętrza komórki mikroorganizmów utrzymuje się na poziomie

bliskim obojętnemu, co zapobiega rozkładowi wrażliwych na działanie kwasów i zasad składników

komórkowych. Większości bakterii odpowiada na ogół odczyn środowiska lekko zasadowy lub

obojętny (pH 6,5-7,7). Grzyby pleśniowe i drożdże rozwijają się lepiej przy niższych wartościach

pH (4-6). Część drobnoustrojów rozwija się w dość wąskim zakresie pH natomiast inne w szerokim

zakresie - pH od 1,5 – 11.

Biorąc pod uwagę reakcję drobnoustrojów na minimalne, optymalne i maksymalne stężenie

jonów wodorowych podzielono je na:

alkalofile - rozwijają się najlepiej w środowisku alkalicznym (optimum pH 8,0 – 11)

neutrofile - rozwijają się najlepiej w środowisku nautralnym (optimum pH od 6,5 – 7,5)

acidofile - drobnoustroje środowisk kwaśnych (optimum pH 2,0 – 5,0).

Odczyn środowiska wpływa nie tylko na wzrost drobnoustrojów, ale modyfikuje także




biochemizm komórki. Wobec silnej reakcji mikroorganizmów na pH, regulowanie odczynu

środowiska jest ważnym zabiegiem w wielu procesach badawczych i technicznych. Ma znaczenie

przy przygotowywaniu podłoży agarowych dla hodowli mikroorganizmów. Pamiętać należy,

że kwasowość podłoża zależy od jego temperatury. Obniżenie pH zwiększa wrażliwość

mikroorganizmów na wysokie temperatury.

Tlenowość

Pod względem reakcji na natlenienie środowiska mikroorganizmy dzielimy na:

bezwzględne tlenowce - obecność tlenu jest dla wzrostu i rozwoju tych mikroorganizmów

niezbędna. Do tej grupy zalicza się liczne autotroficzne bakterie chemosyntetyzujące (bakterie

nitryfikacyjne, Thiobacillus), wiele bakterii heterotroficznych (Pseudomonas, bakterie śluzowe),

wiele gatunków grzybów pleśniowych i drożdży

względne beztlenowce - wiele różnorodnych gatunków bakterii, grzybów i pierwotniaków.

Obecność tlenu może być dla tych mikroorganizmów korzystna, brak tlenu nie wyklucza jednak

możliwości ich rozwoju (np. bakterie Escherichia coli, drożdże Saccharomyces cerevisiae).

Mikroorganizmy te zależnie od warunków wzrostu uzyskują energię zarówno na drodze

oddychania tlenowego, jak i beztlenowego.

mikroaerofile - rosną najlepiej gdy stężenie tlenu w środowisku ich bytowania jest mniejsze.

Większe stężenia tlenu powodują zahamowanie wzrostu i zatrucie komórki (bakterie fermentacji

mlekowej).

bezwzględne beztlenowce - rozwijają się jedynie w środowisku beztlenowym. Energię uzyskują

na drodze fermentacji lub oddychania beztlenowego.

Tlenowe metody hodowli mikroorganizmów

hodowle powierzchniowe – na powierzchni pożywek zestalonych

hodowle statyczne – służą do badań morfologii, fizjologii, biochemii oraz otrzymywania czystych

kultur

hodowle wgłębne – wzrost mikroorganizmów zachodzi w całej objętości pożywki płynnej

na skutek ciągłego ruchu pożywki wywołanego intensywnym mieszaniem lub wytrząsaniem

hodowle ciągłe – wymagające stałego utrzymywania wzrostu drobnoustrojów przez sukcesywne

zaopatrywanie hodowli w świeżą pożywkę, jednocześnie z fermentatora odprowadzana jest

taka sama ilość podłoża zawierającego biomasę i szkodliwe metabolity.

Beztlenowe metody hodowli bakterii

Prowadzi się je eliminując ze środowiska hodowlanego tlen następującymi metodami:

fizycznymi – jedną z metod jest wypompowanie tlenu ze środowiska przez zagotowanie

pożywki, szybkie schłodzenie i zalanie jałowym, płynnym olejem parafinowym (Rys. 10A1).

Innym sposobem jest hodowla drobnoustrojów w anaerostacie (słoju próżniowym)




w próżni lub w atmosferze gazu obojętnego, np. azotu lub argonu. Obecnie stosuje się również

wkłady z substancjami pochłaniającymi tlen (Gas Pack) (Rys. 10A3). Kolejną metodą jest

hodowla bakterii w pożywce płynnej zawierającej tkankę zwierzęcą lub tkankę roślinną, które

adsorbują tlen ze środowiska hodowlanego (Rys. 10A2).

chemicznymi – zastosowanie substancji wiążących tlen, np. pyrogallolu (trioksybenzen)

w środowisku alkalicznym, podsiarczynu sodu, chlorku miedziowego, a także środków

chemicznych redukujących tlen: kwas askorbinowy, tioglikolan sodowy, cysteina, siarczyn

sodowy (Rys. 10B).

biologicznymi – wspólna hodowla drobnoustrojów tlenowych i beztlenowych w dwóch

oddzielonych od siebie częściach płytki Petriego szczelnie oklejonej parafilmem lub plasteliną.

Wyrastający wcześniej organizm tlenowy wykorzystuje tlen ze środowiska umożliwiając rozwój

organizmu beztlenowego (metoda Fortnera). Niezbędnym warunkiem prowadzenia tej metody

jest zastosowanie pożywki, która jest optymalna zarówno dla tlenowców jak i beztlenowców

(Rys. 10C).

Rys. 10. Beztlenowe metody hodowli drobnoustrojów: A – fizyczne (1 – korek parafinowy,

2 – tkanka zwierzęca, 3 – substancje pochłaniające tlen), B – chemiczne, C – biologiczne

8. Wzrost drobnoustrojów na podłożach

Diagnostyka mikrobiologiczna jest zespołem czynności mających na celu identyfikację

drobnoustrojów (ustalenie przynależności gatunkowej) występujących w badanym materiale

mikrobiologicznym. Badania obejmują:

1. badania wstępne

obserwacje preparatu mikroskopowego przyżyciowego

obserwacje preparatu mikroskopowego utrwalonego

2. badania właściwe

wyodrębnienie drobnoustrojów z badanego materiału




uzyskanie hodowli czystych tych drobnoustrojów

określenie ich cech morfologicznych (morfologia makro- i mikroskopowa)

wygląd kolonii na płytce agarowej

wzrost rysy na skosie agarowym

wzrost na podłożu płynnym (bulion, brzeczka)

wzrost w słupku agarowym oraz hodowli kłutej na żelatynie

morfologia komórek drobnoustrojów

zbadanie właściwości fizjologicznych wyizolowanych drobnoustrojów

badanie zdolności do wykorzystania różnych źródeł energii i węgla

wykorzystanie różnych źródeł azotu

wzrost lub brak wzrostu w obecności tlenu i dwutlenku węgla

badanie zdolności ruchu, wytwarzania przetrwalników i barwników w zależności

od warunków wzrostu

badanie wpływu temperatury, pH, wybranych czynników fizykochemicznych

na drobnoustroje

zbadanie właściwości biochemicznych wyizolowanych drobnoustrojów

badanie właściwości glikolitycznych (sacharolitycznych)

badanie właściwości proteolitycznych

badanie właściwości lipolitycznych

badanie właściwości oksydo-redukcyjnych

badanie właściwości hemolitycznych i biochemicznych, testy serologiczne, typowanie

fagowe, oznaczanie wrażliwości na antybiotyki

Wzrost i charakterystyka mikroorganizmów na podłożach stałych - ma zastosowanie

w diagnostyce, przy otrzymywaniu czystych kultur oraz w analizach ilościowych.

Kolonia to skupisko bakterii widoczne gołym okiem, wyrosłe najczęściej z jednej komórki.

W standardowych warunkach środowiska kolonie charakteryzują się stałymi cechami,

uwzględnianymi w diagnostyce. Obserwacje koloni przeprowadza się przy pomocy lupy lub

binokularu biorąc pod uwagę (Rys. 11):

wielkość - duże, średnie, małe lub podaje się wielkość w milimetrach

typ wzrostu kolonii na podłożu - powierzchniowy, podpowierzchniowy, wgłębny

kształt koloni - okrągły, nieregularny, rozgałęziony, nitkowaty

brzeg koloni - gładki, falisty regularny lub nieregularny, płatowaty regularny lub nieregularny,

ząbkowany regularny lub nieregularny, nitkowaty

powierzchnia koloni - gładka, pomarszczona, lśniąca lub matowa, pofałdowana, krzaczkowata

barwa kolonii i jej otoczenia – podaje się rodzaj zabarwienia lub jego brak, ewentualnie

stwierdza się czy barwnik dyfunduje do podłoża




przejrzystość kolonii - przejrzysta, półprzejrzysta, mętna, opalizująca, nieprzejrzysta,

występowanie lub brak fluorescencji

konsystencja, sprawdza się za pomocą ezy – sucha, krucha, ziarnista, skórzasta, ciągnąca się,

mazista, śluzowata

profil koloni ponad powierzchnię pożywki - płaski, lekko wzniesiona, wypukła, stożkowata,

kraterowata

zapach kolonii - mydlany, kwaśny, piwa, miodu, kasztanów, gnilny

Rys. 11. Charakterystyka wzrostu mikroorganizmów na podłożach stałych

Wzrost i charakterystyka drobnoustrojów w pożywkach płynnych

Charakter wzrostu na podłożu płynnym pozwala na określenia zapotrzebowania bakterii na tlen:

bezwzględne tlenowce rosną na powierzchni pożywki w postaci pierścienia, błonki lub kożucha

utworzonych z komórek. W zależności od gatunku bakterii kożuch może być biały, zabarwiony,

suchy, sfałdowany, jednolity lub rozpadający się, kłaczkowaty, wznoszący się po ściankach

(Rys. 12A)

względne beztlenowce charakteryzuje wzrost dyfuzyjny, objawiający się jednolitym zmętnieniem

całej objętości pożywki (Rys. 12B)

bezwzględne beztlenowce rosną w postaci osadu na dnie probówki. Po wstrząśnięciu osad

unosi się w sposób pylisty, osiadający, kłaczkowaty lub ziarnisty (Rys. 12C)




mikroaerofile rozwijają się w postaci pierścienia w pewnym oddaleniu od powierzchni pożywki

(Rys. 12D).

Wymienione typy wzrostu na podłożach płynnych można obserwować w różnych kombinacjach,

np. zmętnienie i osad, zmętnienie i kożuszek.

Rys. 12. Wzrost bakterii w hodowlach płynnych: A - wzrost na powierzchni w postaci pierścienia,

B - wzrost dyfuzyjny, C - częściowe zmętnienie i osad, D - wzrost podpowierzchniowy

Wzrost i charakterystyka hodowli na skosie agarowym

Przy posiewie na skosie bakterie najczęściej nie tworzą wyodrębnionych koloni, jednak sposób

wzrostu jest również ważną cechą diagnostyczną. Wzrost bakterii na skosie opisujemy

uwzględniając następujące cechy:

charakter wzrostu: jednolity (w postaci zwartego nalotu komórek); perlisty (tworzą się oddzielne,

niezlewające ze sobą kolonie) o brzegach gładkich, ząbkowanych, kolczastych, ziarnistych;

krzewiasty, nieregularny (Rys. 13)

powierzchnia rysy: lśniąca, matowa, czasem cienka, sucha błonka

struktura: gładka, ziarnista, pofałdowana

barwa i przeźroczystość

Rys. 13. Typy wzrostu bakterii w hodowlach na skosie agarowym: A – drzewiasty,

B – mgławicowy, C – pierzasty, D – korzonkowy, E – perlisty, F – jednolity




Wzrost drobnoustrojów na słupku w hodowli kłutej

W opisie należy uwzględnić następujące cechy:

ruchliwość

upłynnianie żelatyny (w przypadku bakterii proteolitycznych), a także charakter upłynnienia

wzdłuż nakłucia (Rys. 14)

zależność bakterii od zapotrzebowania na tlen. Określenie stosunku bakterii do wolnego tlenu

polega na badaniu wzrostu na słupku agarowym zaszczepionym igłą do dna probówki.

bezwzględne tlenowce rosną tylko na powierzchni pożywki; bezwzględne beztlenowce rosną

tylko w dolnych partiach pożywki; względne beztlenowce rosną na całej wysokości słupka;

mikroaerofile rosną tuż pod powierzchnią pożywki.

Rys. 14. Wzrost bakterii na żelatynie kłutej: A – brak upłynnienia, B – upłynnienie kraterowate, C –

upłynnienie workowate, D – upłynnienie lejkowate, E – upłynnienie walcowate, F – upłynnienie

kielichowate

9. Barwienie drobnoustrojów

Za pomocą preparatów mikroskopowych można określić:

obecność lub liczbę żywych i martwych komórek drobnoustrojów

kształty, wielkość i obecność otoczki oraz zdolność do ruchu

wzajemny układ komórek w hodowli, tzn. występowanie komórek pojedynczo lub w różnych

układach

sposób rozmnażania się – przez podział, tworzenie pączków, zarodników i form przetrwalnych.

W zależności od kierunku prowadzanych badań mikroskopowych wykonuje się preparaty

przyżyciowe lub utrwalone.

Przygotowanie preparatów przyżyciowych

Preparaty przyżyciowe służą do obserwacji ruchliwości, żywotności, sposobu rozmnażania,




a czasami do wykrywania substancji zapasowych. Najczęściej prowadzi się obserwacje drożdży

i pleśni ze względu na ich budowę i rozmiar. Obserwacja bakterii, ze względu na małe rozmiary,

ogranicza się jedynie do oceny ich ruchliwości.

Preparaty przyżyciowe wykonuje się na szkiełku podstawowym, a w przypadku badania

ruchliwości bakterii lub prowadzenia obserwacji nad sposobem rozmnażania drożdży preparaty

wykonuje się na szkiełku z wgłębieniem zwanym komorą Lindnera. Wykonanie preparatu na

szkiełku podstawowym określa się sposobem kropli spłaszczonej, natomiast preparat wykonany

w komorze Lindnera sposobem kropli wiszącej (Rys. 15).

Rys. 15. Wykonywanie preparatu przyżyciowego: A – szkiełko z komorą Lindnera, B – szkiełko

nakrywkowe z kroplą preparatu, C – preparat wykonany sposobem kropli wiszącej

Barwienie preparatów przyżyciowych

Preparat przyżyciowy może być barwiony lub nie barwiony. Chcąc wykonać barwienie obok

kropli z materiałem badanym umieszcza się kroplę barwnika, miesza ezą i przykrywa szkiełkiem

nakrywkowym. W przypadku nadmiernej ilości płynu usuwa się go bibułą filtracyjną, umieszczoną

z jednej strony szkiełka nakrywkowego.

Przygotowanie preparatów utrwalonych

Przygotowanie preparatów utrwalonych obejmuje następujące czynności:

wykonanie rozmazu (Rys. 16A-D)

w przypadku hodowli płynnych rozprowadza się kroplę badanego materiału cienką warstwą

na odtłuszczonym szkiełku podstawowym

w przypadku materiału z hodowli stałej należy najpierw na szkiełku umieścić kroplę wody,

a następnie pobrany ezą materiał rozprowadzić w niej

w przypadku wykonywania preparatów bezpośrednio z badanych próbek należy odcisnąć

próbkę na szkiełku pozostawiając wyraźny ślad, cienki i bez wolnych przestrzeni.

Po wykonaniu rozmazu preparaty zostawia się do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.

utrwalanie preparatów - ma na celu: zabicie komórek drobnoustrojów, przyklejenie się komórek

do powierzchni szkiełka, odsłonięcie w ścianach komórkowych martwych mikroorganizmów

związków, z którymi łączy się barwnik. Utrwalanie można wykonywać metodą:

termiczną - wyschnięty preparat przeprowadza się 3-krotnie w pozycji poziomej (rozmazem




do góry) przez płomień palnika (Rys. 16E)

chemiczną przy użyciu alkoholu (60 – 70 %), formaliny lub mieszaniny eteru i alkoholu.

W tym celu na wysuszony rozmaz nalewa się odpowiedni odczynnik. Po 5 – 10 min. zlewa

się utrwalacz i barwi jedną z podanych metod.

Rys. 16. Wykonywanie preparatu utrwalonego: A - odtłuszczenie szkiełka, B - naniesienie kropli

wody, C - wykonanie rozmazu, D - suszenie rozmazu, E - utrwalanie w płomieniu, F - barwienie

preparatu.

Barwienia preparatów utrwalonych

Preparaty utrwalone barwi się, co pozwala na określenie kształtu drobnoustrojów, a także

obserwację układów komórek i struktur komórkowych. W mikrobiologii mają zastosowanie

następujące sposoby barwienia (Rys. 16F):

barwienie proste, gdzie używany jest jeden barwnik (fiolet krystaliczny lub gencjanowy, błękit

metylenowy według Löfflera, rozcieńczona fuksyna fenolowa)

barwienie złożone, na które składa się więcej barwników (barwienie metodą Grama, barwienie

przetrwalników metodą Schaeffera – Fultona, barwienie rzęsek metodą Löfflera)

barwienie pozytywne, polegające na zabarwieniu komórek, podczas gdy tło zostaje bezbarwne

barwienie negatywowe – komórki bezbarwne na barwnym tle.

Barwienie metodą Grama (Rys. 17) – barwienie różnicujące, pozwala wyodrębnić bakterie

charakteryzujące się odmienną budową ściany komórkowej: bakterie Gram-dodatnie (ściana

komórkowa zbudowana z około 40 warstw mureiny) i Gram-ujemne (ściana komórkowa

zbudowana z 2-3 warstw mureiny):

pierwszym etapem jest nałożenie barwnika - fioletu krystalicznego – barwnik zasadowy, słabo

rozpuszczalny, tworzący w roztworze kationy, który łatwo penetruje przez ścianę komórkową

i błonę cytoplazmatyczną bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich wnikając do wnętrza

komórki; na tym etapie wszystkie komórki wybarwione są na fioletowo (Rys. 17A)

następnie na preparat nanosi się płyn Lugola (roztwór jodu w jodku potasu) - jony jodu

przenikają do wnętrza komórki, podobnie jak cząsteczki fioletu krystalicznego, kationy

fioletowego barwnika reagują z jonami jodu tworząc wielkocząsteczkowe, nierozpuszczalne

w wodzie kompleksy; wszystkie komórki pozostają zabarwione na kolor fioletowy (Rys. 17B)




trzeci etap polega na naniesieniu odbarwiacza (roztworu alkoholu lub mieszaniny acetonu

z alkoholem), który wnika w warstwy mureiny bakterii powodując dehydratację (usunięcie

wody), w jej wyniku następuje:

zagęszczenie sieci mureiny i zmniejszenie pustych przestrzeni w wielowarstwowych

ścianach komórkowych

u bakterii Gram-ujemnych dodatkowo zniszczeniu ulega zewnętrzna błona

lipopolisacharydowa eksponując cienką warstwę mureiny

w komórkach bakterii Gram-dodatnich kompleks barwnika z jodem zostaje uwięziony pod

zwartą i grubą warstwą mureiny

w komórkach bakterii Gram-ujemnych, które mają tylko 2-3 warstw mureiny, kompleks

barwnika z jodem jest łatwo wymywany odbarwiaczem

na tym etapie następuje właściwe zróżnicowanie komórek - komórki Gram-dodatnie

z uwięzionym kompleksem barwnika nadal mają zabarwienie fioletowe, podczas gdy komórki

Gram-ujemne stają się bezbarwne po wypłukaniu kompleksu (Rys. 17C)

ostatnim etapem jest dodanie barwnika kontrastowego – fuksyny zasadowej, barwnika, który

podobnie jak fiolet krystaliczny, wykazuje charakter zasadowy, a w roztworze tworzy kationy,

które łatwo penetrują poprzez warstwę mureiny i łączą się z ujemnie naładowanymi

cząsteczkami takimi jak kwasy tejchojowe, peptydy czy główki fosfolipidów, kolor fuksyny jest

mniej intensywny niż fioletu krystalicznego komórki Gram-dodatnie pozostają fioletowe,

bezbarwne komórki Gram-ujemne zabarwione fuksyną przyjmują kolor różowy (Rys. 17D).

Rys. 17. Barwienie metodą Grama: A – fiolet krystaliczny, B – płyn Lugola, C – odbarwiacz,

D – fuksyna zasadowa




Rys. 18. Przykładowe rodzaje bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, * - rodzaje bakterii

charakteryzujące się Gram-zmiennością

Barwienie metodą Ziehl-Neelsena (kwasoodporność bakterii) – metoda barwienia złożonego

i różnicującego, uwidacznia drobnoustroje charakteryzujące się kwasoodpornością. Wykazują

ją prątki (Mycobacteriales) i niektóre promieniowce (Acinomycetales), a także przetrwalniki

laseczek tlenowych i beztlenowych. Prątki i promieniowce wytwarzają ścianę komórkową

o odmiennej budowie chemicznej w porównaniu z bakteriami niekwasoopornymi. Drobnoustroje

te zawierają dużą ilość lipidów,. Wśród których występuje kwas mykolowy warunkujący cechę

kwasoodporności. Barwienie Ziehl-Neelsena polega na wprowadzeniu do komórek, na gorąco,

roztworu fuksyny zasadowej. Barwnika tego nie można następnie wypłukać z komórki roztworem

alkoholu etylowego zakwaszonego kwasem solnym. W tej metodzie dodatkowo stosuje się

dobarwianie barwnikiem kontrastowym – błękitem metylenowym, co ułatwia rozpoznawanie

prątków (czerwone) na niebieskim tle preparatu.

Barwienie metodą Neissera – metoda barwienia złożonego, wykorzystywana do wykrywania

w komórkach maczugowców polifosforanów, występujących tam w postaci wtrętów komórkowych

(ziarnistości zwykle na końcach komórek). Polifosforany wiążą w silniejszym stopniu barwnik

Neissera (mieszaninę fioletu krystalicznego i błękitu metylenowego w alkoholu) niż cytoplazma.

Dobarwianie komórki roztworem chryzoidyny powoduje, że staje się ona żółta (chryzoidyna

wypiera barwnik główny z cytoplazmy).

Barwienie metodą Wirtza (Schaeffer-Fultona) – barwienie pozytywne złożone, pozwala

na zabarwienie przetrwalników wewnątrz komórki bakterii. Polega na naniesieniu na utrwalony

preparat mikrobiologiczny wodnego roztworu zieleni malachitowej, a następnie kilkukrotnym




podgrzaniu szkiełka podstawowego w płomieniu palnika do zagotowania barwnika. Zieleń

malachitowa w podwyższonej temperaturze penetruje przez powłoki przetrwalnika zabarwiając

go podobnie jak komórkę wegetatywną. Kolejnym etapem jest przemywanie preparatu wodą -

dekoloryzacja. Barwnik silnie zaadsorbowany we wnętrzu przetrwalnika nie zostaje z niego

wypłukany w przeciwieństwie do komórki bakterii, która się odbarwia. Bezbarwną komórkę

wegetatywną zabarwia się zasadowym barwnikiem kontrastowym – fuksyną zasadową. W wyniku

barwienia przetrwalniki mają zabarwienie zielone, a komórki wegetatywne – różowe.

Barwienie metodą Burri-Ginsa – barwienie ma na celu uwidocznienie bezbarwnej otoczki

bakteryjnej pokrywającej na zewnątrz zabarwioną komórkę wegetatywną na tle barwnego tła

preparatu. Otoczka zbudowana jest z substancji śluzowych, zwykle polimerów cukrów i białek.

Może być łatwo usunięta z powierzchni komórki w wyniku podgrzewania. Dlatego też w barwieniu

Burri-Ginsa nie stosuje się termicznego utrwalania preparatu. Zawiesinę komórek miesza się

z gruboziarnistym barwnikiem np. nigrozyną i pozostawia do wyschnięcia w powietrzu

atmosferycznym. Na tym etapie zabarwione zostaje jedynie tło preparatu. Następnie komórki

bakteryjne zabarwia się fuksyną fenolową. W wyniku barwienia na ciemnym polu preparatu

widoczne są nie zabarwione otoczki okalające zabarwione na czerwono komórki.

10. Mikroskopowanie

Wielkość różnych komórek waha się w znacznym zakresie, wszystkie one jednak mają

wymiary mikroskopowe. Jednym z podstawowych urządzeń w laboratorium mikrobiologicznym jest

mikroskop. Służy on do obserwacji drobnoustrojów, ich wielkości, kształtu, naturalnego ułożenia

komórek, zdolności ruchu czy sposobu ich rozmnażania.

Mikroskop świetlny

Mikroskop świetlny (Rys. 19) zbudowany jest z dwóch układów: optycznego (obiektywu,

okularu, urządzenia oświetlającego) i mechanicznego (podstawa, statyw, tubus, mechanizmy

ruchu, stolik podstawowy). Układ optyczny służy do optymalnego oświetlenia obserwowanego

obiektu (preparatu) i dwustopniowego powiększenia jego obrazu. Układ mechaniczny zapewnia

właściwe położenie poszczególnych elementów układu optycznego. W mikroskopie powstający

obraz jest prosty, powiększony i pozorny.

elementy optyczne mikroskopu

źródło światła - w prostych mikroskopach element ten stanowiło lusterko, współcześnie jest

to wbudowana żarówka z reflektorem

kondensor – zespół 2–3 soczewek silnie koncentrujących światło formując stożek

wystarczający do oświetlenia pola przedmiotowego preparatu

przysłona – reguluje ilość światła wpadającego do kondensora

obiektywy - elementy powiększające obraz, zbierają światło wychodzące z przedmiotu




i tworzą jego powiększony obraz pośredni, oglądany przez okulary mikroskopu. Wyróżniamy

obiektywy suche (powietrzne) - powiększają do 60 razy i mokre (immersyjne, zanurzeniowe)

- powiększaja 90 do 150 razy.

imersja polega na wypełnieniu cieczą (olejkiem immersyjnym) przestrzeni pomiędzy

szkiełkiem podstawowym (preparatem) a obiektywem

okulary – są zbudowane z szeregu soczewek i powiększają obraz na zasadzie lupy, zwykle

powiększają od 2-30 razy

powiększenie mikroskopu równe jest iloczynowi powiększenia obiektywu i powiększenia

okularu (powiększenie podawane jest na oprawkach obiektywów i okularów)

elementy mechaniczne mikroskopu

podstawa i statyw – zapewniają sztywność konstrukcji

stolik przedmiotowy - służy do umocowania preparatu i jego przesuwu w poziomie w osiach

X, Y, przez co następuje zmiana pola widzenia

śruba makrometryczna – służy do ustalania odległości preparat – obiektyw (w zależności

od konstrukcji śruba podnosi/opuszcza stolik przedmiotowy lub tubus z obiektywami)

śruba mikrometryczna – służy do nastawiania ostrości, ogniskowania

rewolwer – jest to obrotowa tarcza mikroskopu, w której umieszczone są obiektywy

tubus – jest to przestrzeń pomiędzy obiektywem a okularem, w której następuje formowanie

się obrazu

układ mechaniczny kondensora - pozwala na regulację położenia kondensora w pionie

Rys. 19. Budowa mikroskopu świetlnego




Technika mikroskopowania przy użyciu obiektywów suchych:

1. Ustawić mikroskop 10-15 cm od krawędzi stołu, sprawdzić czystość mikroskopu, optyczne

części (obiektyw, okular) przetrzeć miękka, sucha ściereczką

2. Włączyć źródło światła, otworzyć przysłonę kondensora znajdującą sie pod stolikiem

3. Przekręcając śrubą makrometryczną obniżyć maksymalnie stolik

4. Włączyć w oś optyczną mikroskopu obiektyw o wybranym powiększeniu (poprzez obrót

rewolweru)

5. Przygotowany preparat umieścić na stoliku i docisnąć zaciskami

6. Patrząc z boku zbliżyć maksymalnie stolik z preparatem do soczewki obiektywu

7. Patrząc w okular, przy użyciu śruby makrometrycznej, bardzo wolno opuszczać stolik

aż do ujrzenia konturu badanego obiektu. Ostrość obrazu nastawić za pomocą śruby

mikrometrycznej.

8. Przeprowadzić korektę oświetlenia - regulować kontrast i ostrość obrazu za pomocą przysłony

9. Szukać nowych obrazów mikroskopowych przy użyciu śruby do zmiany pola widzenia

10. Po zakończeniu mikroskopowania usunąć preparat ze stolika, a obiektyw przetrzeć miękką

ściereczką

11. Zostawić mikroskop z obiektywem o najmniejszym powiększeniu w osi optycznej.

Technika mikroskopowania przy użyciu obiektywów immersyjnych:

1. Ustawić mikroskop 10-15 cm od krawędzi stołu, sprawdzić czystość mikroskopu, optyczne

części (obiektyw, okular) przetrzeć miękka, sucha ściereczką

2. Włączyć źródło światła, otworzyć przysłonę kondensora znajdującą się pod stolikiem

3. Przekręcając śrubą makrometryczną obniżyć maksymalnie stolik

4. Włączyć w oś optyczną mikroskopu obiektyw immersyjny o powiększeniu 100x (poprzez obrót

rewolweru)

5. Na preparat nanieść kroplę olejku immersyjnego, przygotowany preparat umieścić na stoliku

i docisnąć zaciskami

6. Patrząc z boku zbliżyć maksymalnie stolik z preparatem do soczewki obiektywu tak, aby

koniec soczewki zanurzył się w naniesionej kropli olejku immersyjnego

7. Patrząc w okular, przy użyciu śruby makrometrycznej, bardzo wolno opuszczać stolik

aż do ujrzenia konturu badanego obiektu. Ostrość obrazu nastawić za pomocą śruby

mikrometrycznej

8. Przeprowadzić korektę oświetlenia - regulować kontrast i ostrość obrazu za pomocą przysłony

9. Szukać nowych obrazów mikroskopowych przy użyciu śruby do zmiany pola widzenia, tak,

aby soczewka była zawsze zanurzona w olejku immersyjnym

10. Po zakończeniu mikroskopowania usunąć preparat ze stolika, a obiektyw przemyć ściereczką

namoczoną alkoholem

11. Zostawić mikroskop z obiektywem o najmniejszym powiększeniu w osi optycznej.




Mikroskop z ciemnym polem widzenia

Technika polegająca na oświetleniu bocznym preparatu, uzyskanym poprzez specjalnej

konstrukcji kondensor, bądź układ optyczny formujący wiązkę światła niemalże równolegle

do powierzchni preparatu (wiązka światła rozproszonego). Stąd, od wypukłych elementów

preparatu (bądź wklęsłych mocno odbijających światło - lustrzanych) odbija się szczątkowe

oświetlenie wiązki wychodzącej z kondensora, a do obserwatora dociera obraz jasnych elementów

na ciemnym tle. Technikę obserwacji w ciemnym polu stosuje się do preparatów dla których

barwienie jest niepożądane, bądź z jakichś powodów niemożliwe. Technika pola ciemnego

pozwala ponadto na uzyskanie obrazu o lepszej szczegółowości.

Mikroskop kontrastowo-fazowy

Drobnoustroje są organizmami bezbarwnymi, praktycznie przezroczystymi; trudno

je obserwować w normalnym mikroskopie, gdyż ich współczynnik załamania światła niewiele różni

się od współczynnika załamania promieni swietlnych w środowisku. Obiekty niezdolne do absorpcji

światła przechodzącego, a zmieniające jedynie jego fazę, nazywamy obiektami fazowymi. Do nich

zaliczamy również drobnoustroje. Oko ludzkie nie jest w stanic zarejestrować takich zmian fazy fal

świetlnych, drobnoustroje mogą więc być uwidocznione w mikroskopie dopiero po wybarwieniu,

które pozwala przekształcić obiekty fazowe w amplitudowe, tj. takie, które zmieniają intensywność

światła przez nie przechodzącego. Barwienie bakterii łączy się jednak z ich zabiciem, co może

prowadzić do zmiany kształtu ich komórki. Możliwość obserwacji drobnoustrojów bez konieczności

ich barwienia daje mikroskop kontrastowo-fazowy, w którym bezbarwne obiekty fazowe można

przekształcić w obiekty amplitudowe. Mikroskop tego rodzaju wykorzystuje się do obserwacji

żywych drobnoustrojów; szczególne zastosowanie mikroskop ten znalazł w badaniach ruchliwości

bakterii.

Mikroskop ultrafioletowy

W mikroskopii w ultrafiolecie wykorzystano właściwości pochłaniania przez struktury

komórkowe części ultrafioletowej widma promieniowania. Mikroskop ultrafioletowy składa się

z części optycznych wykonanych z kwarcu, przepuszczającego promieniowanie UV. Jako źródło

światła stosuje się lampy rtęciowo-kwarcowe, używane także w mikroskopie fluorescencyjnym.

Mikroskop fluorescencyjny (luminescencyjny)

Mikroskop ten wykorzystuje zjawisko fluorescencji, tj. pobudzania świecenia preparatów

oświetlanych promieniami ultrafioletowymi. Wyróżniamy fluorescencję: naturalną (pierwotna,

właściwa, autofluorescencja), którą wykazuje np. chlorofil, witamina A, porfiryna, rybofiawina

i fluoresceina oraz fluorescencję sztuczną (wtórną), którą uzyskuje się po wybarwieniu preparatu

fluorochromami, tj. barwnikami, które po wzbudzeniu promieniami ultrafioletowymi wysyłają światło

o długiej fali. Najczęściej stosowanymi fluorochromami są erytrozyna, rodamina, auramina,

primulina i oranż akrydynowy.




Mikroskop polaryzacyjno-interferencyjny

Służy do obserwacji obiektów zarówno fazowych (przezroczystych), jak również

amplitudowych (pochłaniających światło). Zasadniczą jego częścią, odróżniającą

go od mikroskopu świetlnego zwykłego, jest układ interferencyjno-polaryzacyjny, składający się

m.in. z pryzmatu dwójułomnego, polaryzatora oraz analizatora. Pryzmat, umieszczony

za obiektywem, rozdwaja wiązkę światła na dwie: zwyczajną i nadzwyczajną i powoduje

przesunięcie fazowe pomiędzy tymi wiązkami. Polaryzator, znajdujący się pod kondensorem,

powoduje liniową polaryzację światła. Analizator umieszczony jest pomiędzy pryzmatem

a okularem. Promienie świetlne po przejściu przez cały układ są spolaryzowane liniowo

w płaszczyznach względem siebie równoległych. Fale te interferują ze sobą i w wyniku ich

nakładania się powstaje tzw. obraz interferencyjny. Oglądany w tym mikroskopie obraz sprawia

wrażenie przestrzennego. Zdolność rozdzielcza tego mikroskopu wynosi 0,1 m.

Mikroskop elektronowy - transmisyjny

Zwykły mikroskop świetlny pozwala rozróżnić w preparacie komórki bakteryjne, nie pozwala

natomiast obserwować ich struktur. Możliwości te daje mikroskop elektronowy, którego działanie

oparte jest na właściwościach falowych strumienia elektronów. Stwierdzono, że szybko

przemieszczające się elektrony w próżni (strumień elektronów rozpędzany napięciem

kilkudziesięciu tysięcy woltów) wykazuje właściwości fal o długości poniżej 1 Å (Å Angstrom).

Strumień takich ujemnie naładowanych, rozpędzonych elektronów może ulec ugięciu przez

preparat o bardzo małej grubości, ustawiony na jego drodze. „Ugięte" elektrony zbierane są przez

układ „soczewek magnetycznych”.

W mikroskopie tego typu zamiast światła widzialnego wykorzystuje się wiązkę elektronów

oraz zamiast okularu, obiektywu i kondensora trzy elektromagnesy. Obraz powstały w „okularze"

jest przekazywany na ekran lub na kliszę fotograficzną. Zdolność rozdzielcza mikroskopu

elektronowego wynosi 4-10 Å, a jego powiększenie od kilkunastu tysięcy do milionów razy,

wliczając w to również powiększenie zdjęcia na kliszy fotograficznej.

Ze względu na precyzję działania mikroskop elektronowy musi być umieszczony

na stabilnym, nie narażonym na wstrząsy podłożu oraz zabezpieczony przed wahaniami

zewnętrznego pola magnetycznego, napięcia i natężenia prądu. Odmienny, w porównaniu

z mikroskopią świetlną, jest też sposób przygotowania preparatów do mikroskopu elektronowego.

W miejsce szkiełka podstawowego stosuje się siatki platynowe, miedziane lub niklowe, błonki

koloidalne lub temu podobne. Inaczej również przygotowuje się materiał do badań; należy

sporządzić ultracienkie, utrwalone skrawki materiału o grubości nic przekraczającej 0,5 m,

bowiem grubsze skrawki preparatu nie przepuszczają elektronów. Skrawki takie uzyskuje się przez

„pocięcie" materiału za pomocą ultramikrotomu - urządzenia wyposażonego w specjalne noże

szklane lub diamentowe. Dla uzyskania lepszego kontrastu preparaty pokrywa się atomami metali




ciężkich. W tym celu preparaty napyla się (cieniowanie) czterotlenkiem osmu, azotanem srebra,

octanem ołowiu lub uranylu, chlorkiem rtęci, a w jego wyniku (barwienie negatywne, negatywne

kontrastowanie) uzyskuje się obraz trójwymiarowy.

Mikroskop skaningowy

Jest to odmiana mikroskopu elektronowego, w którym emitowane elektrony nie przechodzą

przez obserwowany obiekt, ale przez całą szerokość preparatu. Elektrony te ulegają odbiciu

od powierzchni preparatu; są następnie skupiane i wzmacniane, a powstały obraz jest

fotografowany lub może być obserwowany na monitorze. Preparaty do tego typu mikroskopu

napyla się nieprzepuszczalnymi dla elektronów stopami złota lub palladu. Powstający w tym

mikroskopie obraz sprawia wrażenie trójwymiarowego. Mikroskop skaningowy jest szczególnie

stosowany przez mikrobiologów do obserwacji kształtów i ugrupowań bakterii oraz ich adherencji

i penetracji do komórek makroorganizmu. Zdolność rozdzielcza tego mikroskopu wynosi 0,02 m,

powiększenie zaś 15 000-50 000 razy.




11. Zasady bezpiecznej pracy w laboratorium mikrobiologicznym

Aby zapobiec przypadkowemu zakażeniu oraz uniknąć zranień lub oparzeń w trakcie

wykonywania poszczególnych czynności w laboratorium wymaga się stosowania właściwych

warunków pracy. W tym celu przed rozpoczęciem ćwiczeń studenci są zobowiązani do zapoznania

się z następującymi zasadami bezpiecznej i aseptycznej pracy:

1. W laboratorium mikrobiologicznym należy przebywać w fartuchu ochronnym uszytym

z naturalnego materiału. Ubrania wierzchnie (płaszcze) zostawiać w szatni uczelni.

2. Na sali ćwiczeń nie wolno pić, jeść, palić, a także żuć gumy.

3. Przed przystąpieniem do ćwiczeń należy zapoznać się z metodyką ćwiczeń oraz przestrzegać

wskazówek dotyczących ich wykonania.

4. W czasie wykonywania ćwiczeń przestrzegać zasad jałowej pracy, ostrożnie obchodzić się

z materiałem badanym, wszelkie czynności związane z posiewami wykonywać przy

zapalonym palniku, założone hodowle dokładnie opisywać.

5. Płytki Petriego, probówki z hodowlami powinny być zawsze zamknięte. Otwierane się je tylko

na czas pobrania materiału i natychmiast zamyka.

6. Z sali ćwiczeń nie wolno wynosić na zewnątrz hodowli mikroorganizmów, preparatów,

odczynników i szkła laboratoryjnego.

7. Drobny sprzęt metalowy (ezy, igły, skalpele, szczypce, pincety) należy zarówno przed jak

i po użyciu opalić w palniku w celu zniszczenia drobnoustrojów.

8. Każde rozbicie naczyń z hodowlami oraz wszelkie skaleczenia lub oparzenia powstałe

w trakcie zajęć należy zgłosić prowadzącemu.

9. Używane szkło, szkiełka, pipety odkładać do wyznaczonych przez prowadzącego pojemników.

10. Przed rozpoczęciem pracy i po jej zakończeniu miejsce pracy dokładnie przemyć środkiem

dezynfekcyjnym.

11. Kilkakrotnie w czasie pracy i po jej zakończeniu myć ręce, stosując do ich mycia środki

dezynfekcyjne.

12. Po zakończeniu zajęć uporządkować stoły, sprawdzić czy zostały zgaszone palniki. Schować

używane przedmioty do szafek. Przemyć stoły środkiem odkażającym, umyć ręce.




12. Część praktyczna

Ćwiczenie 1 - Mikroflora środowiska, posiewy ze środowiska

Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z metodami pobierania materiału mikrobiologicznego

– metodą sedymentacyjną i metodą odciskową, oraz przygotowania posiewu, przeprowadzenie

izolacji mikroorganizmów z powietrza i wybranych powierzchni.

rozlewanie pożywki na płytki Petriego

Przygotować 6 sterylnych płytek Petriego w pobliżu płomienia palnika. Pożywkę w kolbie (podłoże

agarowe odżywcze) ogrzewać do uzyskania płynnej konsystencji. Odkorkować kolbkę z pożywką

i opalić jej wylot w płomieniu palnika. Uchylić lekko wieczko szalki Petriego i wlać do niej pożywkę

tak aby utworzyła na dnie kilkumilimetrową warstwę. Zostawić uchylone wieczko płytki

aż do zestalenia podłoża. Ponownie opalić w płomieniu wylot kolby z podłożem i zamknąć ją

korkiem.

badania mikrobiologiczne powietrza

Posiew z powietrza przeprowadzić metodą sedymentacyjną na stanowiskach różniących się

stopniem zanieczyszczenia:

1. na sali ćwiczeń laboratoryjnych na początku zajęć

2. na sali ćwiczeń laboratoryjnych na końcu zajęć

3. na zewnątrz budynku

Przed przystąpieniem do poboru próbek należy opisać charakterystykę stanowisk badawczych,

uwzględniając czynniki wpływające na zanieczyszczenie powietrza. Przy opisie stanowisk

zlokalizowanych w pomieszczeniach zamkniętych należy uwzględnić rodzaj pomieszczenia, liczbę

osób użytkujących pomieszczenie, czas użytkowania, rodzaj wentylacji. Charakteryzując

stanowiska wytypowane na otwartej przestrzeni należy uwzględnić miejsce usytuowania

stanowiska oraz obecność źródeł emisji zanieczyszczeń mikrobiologicznych do powietrza. Należy

również określić warunki meteorologiczne w miejscu poboru próbek powietrza – temperatura,

ciśnienie, wilgotność względna, kierunek i prędkość wiatru, stopień nasłonecznienia.

Płytki Petriego z podłożem należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nr doświadczenia, następnie

ustawić w miejscu przeznaczonym do badania. Z płytek zdjąć wieczka i pozostawić je otwarte

przez 20 min. Po ekspozycji płytki zakryć. Inkubację hodowli prowadzić w temp. 20 i 37°C przez

24 godziny.

badania mikrobiologiczne wybranych powierzchni

Przeprowadzić posiew metodą odciskową z rąk:

1. nieumytych




2. umytych wodą i mydłem

3. zdezynfekowanych specjalnym płynem do dezynfekcji rąk

Przed przystąpieniem do poboru próbek należy opisać charakterystykę powierzchni badanych.

Przy opisie należy uwzględnić rodzaj użytych środków myjących.

Płytki Petriego z podłożem należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nr doświadczenia, następnie

z płytek zdjąć wieczka i odcisnąć palce. Płytki po zamknięciu umieścić w cieplarce i inkubować

w temp. 37°C przez 24 godziny.

opis wyników badań (na następnych zajęciach)

Opis wyglądu kolonii bakteryjnych na płytce Petriego i preparatu mikroskopowego należy umieścić

w tabeli:

Posiew Temp. inkubacji

Opis kolonii Opis preparatu mikroskopowego

Np. z powietrza w pomieszczeniu laboratoryjnym przed zajęciami Temp. inkubacji 37°C

Kolonia 1:

wielkość

kształt koloni

brzeg koloni

powierzchnia koloni

barwa kolonii i jej otoczenia przejrzystość kolonii konsystencja

profil koloni ponad powierzchnię pożywki

zapach kolonii

zabarwienie metodą Grama (Gram-dodatnie lub Gram-ujemne)

kształt komórki

ewentualnie szkic preparatu

Kolonia 2:

wielkość

kształt koloni

brzeg koloni

powierzchnia koloni



zapach kolonii


kształt komórki


Np. z powietrza na zewnątrz Temp. inkubacji 20°C

Kolonia 1:

wielkość

kształt koloni

brzeg koloni

powierzchnia koloni



zapach kolonii


kształt komórki


Obserwacje mikroskopowe mikroorganizmów - wykonanie preparatów utrwalonych barwionych

metodą Grama (Rys. 20):




Rys. 20. Barwienie preparatów utrwalonych metodą Grama





Celem ćwiczenia jest poznanie metod izolacji mikroorganizmów ze środowisk naturalnych

metodą posiewu na podłoże stałe, hodowla w warunkach laboratoryjnych oraz obserwacje

mikroskopowe mikroorganizmów w preparatach utrwalonych uzyskanych z hodowli w ćwiczeniu 1.


Przygotować 9 sterylnych płytek Petriego w pobliżu płomienia palnika. Pożywkę (podłoże agarowe

odżywcze) rozlać do płytek zgodnie z opisem w ćwiczeniu 1.

izolowanie mikroorganizmów z gleby

Przed przystąpieniem do poboru próbek należy opisać charakterystykę badanej gleby,

uwzględniając czynniki wpływające na jej zanieczyszczenie: struktura gleby, sposób nawożenia,

pokrycie roślinne, warunki klimatyczne, wielkość badanej powierzchni gleby, umiejscowienie na

niej źródeł zanieczyszczeń, obecność lub brak kanalizacji.

Do 10 g gleby dodać 90 ml sterylnej wody buforowanej, następnie wytrząsać na wytrząsarce przez

15 min., celem wymycia mikroorganizmów z cząstek gleby. Przygotować 5 probówek

zawierających 9 ml sterylnej wody buforowanej. Do pierwszej probówki dodać sterylną pipetą 1 ml

próbki roztworu znad gleby i dokładnie wymieszać (rozcieńczenie 10-1). Kolejne rozcieńczenie

(10-2) wykonać przenosząc 1 ml rozcieńczenia 10-1 do następnej probówki zawierającej 9 ml

sterylnej wody buforowanej. Dalsze rozcieńczenie (10-3, 10-4, 10-5) wykonać w sposób analogiczny,

zwracając szczególną uwagę na dokładne mieszanie i zmianę pipet dla każdego rozcieńczenia.

Wykonać posiew rozcieńczonych próbek (10-5) na płytkę Petriego z podłożem agarozowym

odżywczym. Płytki Petriego należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia.

0,2 ml próbki przenieść pipetą na podłoże, a następnie równomiernie rozprowadzić po całej

powierzchni za pomocą szklanej głaszczki (przed i po każdym użyciu głaszczki należy ją ogrzewać

w płomieniu palnika). Inkubację hodowli prowadzić w temp. 20°C (bakterie psychrofilne), 37°C

(bakterie mezofilne) i 55°C (bakterie termofilne) przez 24-48 godzin (Rys. 21).

izolowanie mikroorganizmów z wody

1. Woda powierzchniowa:

Wodę należy pobrać ze zbiorników wodnych na głębokości 10-15 cm od powierzchni wody. W tym

celu należy butelkę zanurzyć pod powierzchnię wody skośnie w kierunku prądu i pod wodą obrócić

przeciwko prądowi. Przy pobieraniu próbki należy zwrócić uwagę, aby do butelki nie dostały się

osady z dna lub części stałe pływające na powierzchni wody. Po nabraniu wody, butelkę wyjąć,

odlać ¼ objętości wody, zamknąć i zaopatrzyć w etykietę uwzględniającą: datę, godzinę, miejsce

poboru próbki i nazwisko pobierającego.




2. Woda wodociągowa:

Wylot kurka należy dokładnie umyć płynem do dezynfekcji i wytrzeć ręcznikiem. Spuszczać wodę

w ciągu 10 min. Przy możliwie największym przepływie, przy którym woda nie rozpryskuje się.

Po upływie tego czasu, nie przerywając strumienia, pobrać próbkę wody do jałowych butelek,

napełnić je do ¾ pojemności i zamknąć. Wszystkie czynności wykonać z zachowaniem warunków

aseptycznych. Butelki zaopatrzyć w etykietę uwzględniającą: datę, godzinę, miejsce poboru próbki

i nazwisko pobierającego.

Dla obu próbek wody wykonać rozcieńczenia tak samo jak rozcieńczenia gleby.

Wykonać posiew rozcieńczonych próbek (10-5) na płytkę Petriego z podłożem agarozowym

odżywczym tak samo jak dla próbek gleby. Płytki Petriego należy czytelnie opisać nazwiskiem,

datą i nazwą doświadczenia. Inkubację hodowli prowadzić w temp. 20°C (bakterie psychrofilne),

37°C (bakterie mezofilne) i 55°C (bakterie termofilne) przez 24-48 godzin (Rys. 21).

Rys. 21. Schemat wykonania rozcieńczeń i posiewów próbek gleby i wody



w tabeli (zgodnie z opisem w ćwiczeniu 1).





Celem ćwiczenia jest określenie stopnia zanieczyszczenia próbek wody i gleby pod

względem sanitarno-higienicznym: oznaczenie w glebie miana beztlenowych bakterii

przetrwalnikujących Clostridium perfringens oraz bakterii grupy coli metodą fermentacyjno

probówkową, oznaczenie w wodzie bakterii grupy coli metodą fermentacyjną probówkową oraz

paciorkowców kałowych (Streptococcus faecalis) metodą probówkową oraz obserwacje

mikroskopowe mikroorganizmów w preparatach utrwalonych uzyskanych z hodowli w ćwiczeniu 2.

rozlewanie pożywek do probówek

Przygotować 12 sterylnych probówek w stojaku w pobliżu płomienia palnika. Do każdej probówki

włożyć rurkę Durhama dnem do góry. Probówki odpowiednio opisać. Do probówek należy rozlać

ok. 10 ml odpowiedniego podłoża, po 3 probówki na każde podłoże: podłoże Kesslera-

Swenartona, podłoże wg Willsona-Blaira, podłoże laktozowe z purpurą bromokrezolową, podłoże

z azydkiem sodu i purpurą bromokrezolową. Otworzyć kolbkę z podłożem i opalić jej wylot

w płomieniu palnika, wlać podłoże do probówek. Po wlaniu podłoża zamknąć probówki folią

aluminiową. Ponownie opalić w płomieniu wylot kolby z podłożem i zamknąć ją folią aluminiową.

oznaczanie mikroorganizmów z gleby

Przed przystąpieniem do poboru próbek należy opisać charakterystykę badanej gleby (zgodnie

z opisem w ćwiczeniu 2). Wykonać rozcieńczenia próbek gleby (10-1 - 10-4) zgodnie z opisem

w ćwiczeniu 2.

1. oznaczenie bakterii grupy coli i bakterii grupy coli typu kałowego (E. coli) w glebie – badanie

wstępne (Rys. 22)

Wykonać posiew 1 ml rozcieńczonych próbek (10-2 - 10-4) do probówek z podłożem Kesslera-

Swenartona. Probówki należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia. Po

dodaniu próbek rozcieńczeń do podłoża zawartość probówek należy delikatnie wymieszać.

Inkubację hodowli prowadzić w temp. 37°C przez 24 godziny.




Rys. 22. Schemat oznaczenie bakterii grupy coli i bakterii grupy coli typu kałowego (E. coli)

w glebie




2. oznaczenie bakterii przetrwalnikujących (Clostridium perfringens) w glebie

Próbki rozcieńczeń (po posiewie na podłoże Kesslera-Swenartona) przeznaczone do oznaczania

bakterii przetrwalnikujących należy przed posiewem inkubować przez 15 min w 80°C. Wykonać

posiew 1 ml rozcieńczonych próbek (10-2 - 10-4) do probówek z podłożem wg Wilsona-Blaira.

Probówki należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia. Po dodaniu próbek

rozcieńczeń do podłoża zawartość probówek należy delikatnie wymieszać. Inkubację hodowli

prowadzić w temp. 37°C przez 24 godziny (Rys. 23.).

Rys. 23. Schemat oznaczania bakterii przetrwalnikujących (Clostridium perfringens) w glebie

oznaczanie mikroorganizmów z wody

Próbki wody powierzchniowej i wodociągowej należy pobrać i opisać zgodnie z opisem

w ćwiczeniu 2. Rozcieńczenia próbek wody należy wykonać zgodnie z opisem w ćwiczeniu 2.

1. oznaczenie bakterii grupy coli i bakterii grupy coli typu kałowego (E. coli) w wodzie

powierzchniowej i wodociągowej – badanie wstępne (Rys. 24.)

Wykonać posiew 1 ml rozcieńczonych próbek (10-2 - 10-4) do probówek z podłożem laktozowym

z purpurą bromokrezolową. Probówki należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą

doświadczenia. Po dodaniu próbek rozcieńczeń do podłoża zawartość probówek należy delikatnie

wymieszać. Inkubację hodowli prowadzić w temp. 37°C przez 24 godziny.




Rys. 24. Schemat oznaczania bakterii grupy coli i bakterii grupy coli typu kałowego (E. coli)

w wodzie




2. oznaczenie paciorkowców kałowych (Streptococcus faecalis) w wodzie powierzchniowej

i wodociągowej – badanie wstępne (Rys. 25.)

Wykonać posiew 1 ml rozcieńczonych próbek (10-2 - 10-4) do probówek z podłożem z azydkiem

sodu i purpurą bromokrezolową. Probówki należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą

doświadczenia. Po dodaniu próbek rozcieńczeń do podłoża zawartość probówek należy delikatnie

wymieszać. Inkubację hodowli prowadzić w temp. 37°C przez 24 godziny.

Rys. 25. Schemat oznaczania paciorkowców kałowych (Streptococcus faecalis) w wodzie


Opis wyglądu kolonii bakteryjnych w poszczególnych probówkach: probówki z podłożem Kesslera-

Swenartona - za wynik dodatni przyjmuje się obecność gazu w rurkach Durhama i zmętnienie

podłoża, probówki z podłożem wg Wilsona-Blaira – za wynik dodatni przyjmuje się czarne kolonie

wewnątrz podłoża świadczące o obecności bakterii prztrwalnikujących Clostridium perfringens

(kolor czarny – obecość FeS powstałego w wyniku działania bakterii), probówki z podłożem




laktozowym z purpurą bromokrezolową – za wynik dodatni przyjmuje się zmianę barwy

na żółtą, obecność gazu w rurkach Durhama i zmętnienie podłoża, probówki z podłożem

z azydkiem sodu i purpurą bromokrezolową - za wynik dodatni przyjmuje się zmianę barwy na

żółtą i zmętnienie podłoża. Wybranie probówek do badań potwierdzających.

Ćwiczenie 4 - Analiza mikrobiologiczna wody i gleby cz.3. Identyfikacja pałeczek

Gram-ujemnych cz.1

Celem ćwiczenia jest określenie stopnia zanieczyszczenia próbek wody i gleby pod

względem sanitarno-higienicznym: oznaczenie w glebie miana bakterii grupy coli metodą

fermentacyjno probówkową, oznaczenie w wodzie bakterii grupy coli metodą fermentacyjną

probówkową oraz paciorkowców kałowych (Streptococcus faecalis) metodą probówkową oraz

obserwacje wzrostu mikroorganizmów w pożywkach uzyskanych z hodowli w ćwiczeniu 3. Celem

ćwiczenia jest różnicowanie pałeczek Gram-ujemnych (Pseudomonas putida, Acinetobacter,

Escherichia coli i Proteus.) na fermentujące i niefermentujące laktozy.

oznaczanie mikroorganizmów z gleby

1. oznaczenie bakterii grupy coli i bakterii grupy coli typu kałowego (E. coli) w glebie – badanie

potwierdzające (Rys. 22)

Przed przystąpieniem do posiewów należy dokładnie obejrzeć probówki z podłożem Kesslera-

Swenartona i zanotować zmiany. Za wynik dodatni przyjmuje się obecność gazu w rurkach

Durhama i zmętnienie podłoża. Brak tych zmian przyjmuje się jako wynik ujemny. W przypadku

wystąpienia zmian dodatnich należy przystąpić do badań potwierdzających. Próbki, w których

wystąpiły obie zmiany dodatnie (zmętnienie i gaz) należy posiać metodą powierzchniową za

pomocą ezy na płytki Petriego z podłożem Endo (płytki z podłożem przygotować zgodnie

z instrukcja opisaną w ćwiczeniu 1). Inkubację hodowli prowadzić w temp. 37°C przez 24 godziny.

Próbki, w których wystąpiła jedna ze zmian (zmętnienie lub gaz) należy posiać na podłoże płynne

z zielenią brylantową i na podłoże płynne woda peptonowa z tryptofanem, po 1 ml do każdej

probówki (podłoże rozlać do probówek zgodnie z instrukcją opisaną w ćwiczeniu 3). Inkubację

hodowli prowadzić w temp. 44°C przez 24 godziny.

oznaczanie mikroorganizmów z wody

1. oznaczenie bakterii grupy coli i bakterii grupy coli typu kałowego (E. coli) w wodzie

powierzchniowej i wodociągowej – badanie potwierdzające (Rys. 24.)

Przed przystąpieniem do posiewów należy dokładnie obejrzeć probówki z podłożem laktozowym

z purpurą bromokrezolową i zanotować zmiany. Za wynik dodatni przyjmuje się zmianę barwy

na żółtą, obecność gazu w rurkach Durhama i zmętnienie podłoża. Brak tych zmian przyjmuje się

jako wynik ujemny. W przypadku wystąpienia zmian dodatnich należy przystąpić do badań




potwierdzających. Próbki, w których wystąpiły wszystkie zmiany dodatnie (zmiana barwy,

zmętnienie i gaz) należy posiać metodą powierzchniową za pomocą ezy na płytki Petriego

z podłożem Endo (płytki z podłożem przygotować zgodnie z instrukcja opisaną w ćwiczeniu 1).

Inkubację hodowli prowadzić w temp. 37°C przez 24 godziny. Próbki, w których wystąpiła jedna lub

dwie ze zmian (zmiana barwy lub zmętnienie lub gaz) należy posiać na podłoże

z zielenią brylantową i na podłoże woda peptonowa z tryptofanem, po 1 ml do każdej probówki

(podłoże rozlać do probówek zgodnie z instrukcją opisaną w ćwiczeniu 3). Inkubację hodowli

prowadzić w temp. 44°C przez 24 godziny.

2. oznaczenie paciorkowców kałowych (Streptococcus faecalis) w wodzie powierzchniowej

i wodociągowej – badanie potwierdzające (Rys. 25.)

Przed przystąpieniem do posiewów należy dokładnie obejrzeć probówki z podłożem z azydkiem

sodu i purpurą bromokrezolową i zanotować zmiany. Za wynik dodatni przyjmuje się zmianę barwy

na żółtą i zmętnienie podłoża. Brak tych zmian przyjmuje się jako wynik ujemny. W przypadku

wystąpienia zmian nietypowych – wystąpienie tylko jednej zmiany (barwa lub zmętnienie) należy

przystąpić do badań potwierdzających. Próbki posiać na podłoże z azydkiem sodu i fioletem

etylowym, 1 ml do probówki (podłoże rozlać do probówek zgodnie z instrukcją opisaną w ćwiczeniu

3). Inkubację hodowli prowadzić w temp. 37°C przez 24 godziny.


Opis wyglądu kolonii bakteryjnych w poszczególnych probówkach: podłoże Endo – za wynik

dodatni przyjmuje się kolonie różowo-czerwone z metalicznym, zielonym połyskiem, podłoże

z zielenią brylantową - za wynik dodatni przyjmuje się obecność gazu w rurkach Durhama

i zmętnienie podłoża, podłoże woda peptonowa z tryptofanem – za wynik dodatni przyjmuje się

pojawienie się czerwonego zabarwienia na granicy płynów po dodaniu kroplami odczynnika

Ehrlicha-Böhme świadczące o obecności indolu, podłoże z azydkiem sodu i fioletem etylowym – za

wynik dodatni przyjmuje się zmętnienie podłoża i pojawienie się niebiesko zabarwionego osadu.

Wybranie probówek do badań uzupełniających: posiew na skosie agarowym.

przygotowanie zawiesiny komórek bakteryjnych do posiewów

Do badań użyte zostaną cztery szczepy kontrolne Pseudomonas putida, Acinetobacter,

Escherichia coli i Proteus. Przygotować po 5 probówek zawierających 9 ml sterylnej wody

destylowanej dla każdego szczepu bakterii. Do każdej pierwszej probówki dodać sterylną pipetą

1 ml odpowiedniej hodowli bakteryjnej i dokładnie wymieszać (rozcieńczenie 10-1). Kolejne

rozcieńczenie (10-2) wykonać przenosząc 1 ml rozcieńczenia 10-1 do następnej probówki

zawierającej 9 ml sterylnej wody buforowanej. Dalsze rozcieńczenie (10-3, 10-4, 10-5) wykonać

w sposób analogiczny, zwracając szczególną uwagę na dokładne mieszanie i zmianę pipet dla

każdego rozcieńczenia.





Przygotować 8 sterylnych płytek Petriego w pobliżu płomienia palnika. Pożywki - podłoże agarowe

odżywcze i podłoże McConkeya rozlać do 4 płytek każdą zgodnie z opisem w ćwiczeniu 1.

różnicowanie pałeczek Gram-ujemnych

Wykonać posiew rozcieńczonych próbek (10-5) każdego szczepu bakteryjnego na 2 płytki Petriego:

z podłożem agarozowym odżywczym oraz z podłożem McConkeya. 0,2 ml próbki przenieść pipetą

na podłoże, a następnie równomiernie rozprowadzić po całej powierzchni za pomocą szklanej

głaszczki (przed i po każdym użyciu głaszczki należy ją ogrzewać w płomieniu palnika). Płytki

Petriego należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia. Inkubację hodowli

prowadzić w temp. 30°C dla szczepów Pseudomonas putida i Acinetobacter oraz 37°C dla

szczepów Escherichia coli i Proteus przez 24 godziny.


Podłoże McConkeya jest podłożem wybiórczym dla bakterii Gram-ujemnych, fiolet krystaliczny

i sole żółciowe uniemożliwiają wzrost bakteriom Gram-dodatnim. Podłoże to jest również podłożem

różnicującym bakterie fermentujące laktozę od niefermentujących laktozy. Bakterie mające

zdolność wykorzystywania laktozy z wytworzeniem kwasów – fermentujące laktozę (Escherichia

coli i Acinetobacter), powodują spadek pH środowiska hodowli, co stwierdza się dzięki obecności

indykatora pH – czerwieni obojętnej. Podłoże pozostaje koloru czerwonego i kolonie mają kolor

czerwony. Bakterie laktozo-ujemne – niefermentujące laktozy (Pseudomonas putida i Proteus),

rosną w postaci bezbarwnych lub jasnożółtych kolonii oraz obserwuje się zmianę zabarwienia

podłoża z czerwonej na żółtą (Rys. 26).

Rys. 26. Wzrost mikroorganizmów na podłożu MaConkeya

Opis wyglądu kolonii bakteryjnych na płytce Petriego należy umieścić w tabeli:

Rodzaj bakterii Podłoże McConkeya

Pałeczki G(-) Fermentacja laktozy

Pseudomonas putida

Acinetobacter

Escherichia coli

Proteus





Celem ćwiczenia jest dalsze różnicowanie pałeczek Gram-ujemnych pod względem

biochemicznym na: katalazododatnie i katalazoujemne, oksydazododatnie i oksydazoujemne,

fermentujące glukozę i niefermentujące glukozy oraz obserwacje wzrostu mikroorganizmów w

pożywkach uzyskanych z hodowli w ćwiczeniu 4.

test na wykrywanie katalazy

Przygotować 4 szkiełka podstawowe, na każde szkiełko nałożyć kroplę wody utlenionej 3%.

Sterylną ezą pobrać fragment kolonii bakteryjnej (Pseudomonas putida, Acinetobacter, Escherichia

coli i Proteus.) z pożywki agarowej odżywczej. Każdą kolonię zawiesza się w oddzielnej kropli

wody utlenionej. Uwalnianie pęcherzyków tlenu świadczy o wyniku dodatnim – wytwarzaniu

katalazy. Wyniki zanotować w tabeli.

test na wykrywanie oksydazy cytochromowej

Przygotować 4 paski nasączone odczynnikiem do wykrywania oksydazy, na każdy pasek nałożyć

sterylną ezą fragment kolonii bakteryjnej (Pseudomonas putida, Acinetobacter, Escherichia coli

i Proteus.) z pożywki agarowej odżywczej (z ćwiczenia 4). Zmiana barwy na fioletową świadczy

o wyniku dodatnim – wytwarzaniu oksydazy (Rys. 27). Wyniki zanotować w tabeli.

Rys. 27. Wynik testu na wykrywanie oksydazy cytochromowej

różnicowanie bakterii fermentujących glukozę od niefermentujących glukozy

Przygotować 8 sterylnych probówek z podłożem Hugh-Leifsona, poczekać aż podłoże zastygnie.

Do każdych dwóch probówek należy wkłuć igłą bakteriologiczną pojedynczą kolonię bakteryjną

(Pseudomonas putida, Acinetobacter, Escherichia coli i Proteus.) pobraną z pożywki agarowej

odżywczej (z ćwiczenia 4). Jedną z probówek należy zalać 1-2 cm warstwą sterylnej parafiny.

Probówki należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia. Inkubację hodowli

prowadzić w temp. 30°C dla szczepów Pseudomonas putida i Acinetobacter oraz 37°C dla

szczepów Escherichia coli i Proteus przez 24 godziny.


Bakterie, które produkują enzym - katalazę mają zdolność rozkładu H2O2 na wodę i tlen, za wynik

dodatni testu przyjmuje się szybkie wydzielanie pęcherzyków gazu.




Bakterie, które posiadają enzym oksydazę cytochromową, w obecności tlenu mogą redukować

dichlorek N,N–dimetylo–1,4–fenylodiaminy do niebieskiej cząsteczki indofenolu, za wynik dodatni

testu przyjmuje się niebieskie zabarwienie strefy reakcyjnej paska.

Podłoże Hugh–Leifsona służy do określenia sposobu rozkładu glukozy przez mikroorganizmy.

Glukoza, w zależności od rodzaju bakterii, może być rozkładana tlenowo lub/i beztlenowo

do kwasów. Wskaźnikiem odpowiedzialnym za barwę podłoża jest błękit bromotymolowy, który

w kwaśnym pH jest żółty, w obojętnym – zielony, a w zasadowym zielono-niebieski. Bakterie

nierozkładające glukozy w warunkach tlenowych ani beztlenowych nie zmieniają zabarwienia

podłoża (zielone). Bakterie rozkładające glukozę do kwasów tylko w warunkach tlenowych

powodują zmianę zabarwienia z zielonej na żółtą w górnej części probówki bez parafiny. Bakterie

rozkładające glukozę do kwasów zarówno w warunkach tlenowych jak i beztlenowych

(fermentacja) powodują zmianę zabarwienia z zielonej na żółtą w obu probówkach – bez parafiny

i z parafiną (Rys. 28).

Rys. 28. Wzrost mikroorganizmów na podłożu Hugh-Leifsona: O- warunki tlenowe (zachodzi

utlenianie glukozy), F – warunki beztlenowe, probówki zalane parafiną (zachodzi fermentacja

glukozy), 1 – próba kontrolna lub brak reakcji, 2 – rozkład glukozy w warunkach tlenowych, 3 –

rozkład glukozy w warunkach tlenowych i beztlenowych

Wyniki testów należy umieścić w tabeli:

Rodzaj bakterii Wytwarzanie

katalazy

Wytwarzanie

oksydazy

Fermentacja glukozy

(podłoże Hugh-Leifsona)

Pseudomonas putida

Acinetobacter

Escherichia coli

Proteus





Celem ćwiczenia jest identyfikacja pałeczek Gram-ujemnych fermentujących glukozę oraz

obserwacje wzrostu mikroorganizmów w pożywkach uzyskanych z hodowli w ćwiczeniu 5.

przygotowanie szczepów bakteryjnych do posiewów

Do badań użyte zostaną dwa szczepy kontrolne Escherichia coli i Proteus, posiane wcześniej na

podłoże agarowe odżywcze.

wykrywanie obecności indolu

Przygotować 2 sterylne probówki z podłożem płynnym woda peptonowa z tryptofanem. Wykonać

posiew pojedynczej kolonii szczepów bakteryjnych Escherichia coli i Proteus do probówek z

podłożem płynnym woda peptonowa z tryptofanem. Probówki należy czytelnie opisać nazwiskiem,

datą i nazwą doświadczenia. Po dodaniu kolonii bakteryjnej do podłoża zawartość probówek

należy delikatnie wymieszać. Inkubację hodowli prowadzić w temp. 44°C przez 24 godziny.

wykrywanie fermentacji laktozy

Przygotować 2 sterylne probówki z płynnym podłożem laktozowym z purpurą bromokrezolową.

Wykonać posiew pojedynczej kolonii szczepów bakteryjnych Escherichia coli i Proteus do

probówek z podłożem laktozowym z purpurą bromokrezolową. Probówki należy czytelnie opisać

nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia. Po dodaniu kolonii bakteryjnej do podłoża zawartość

probówek należy delikatnie wymieszać. Inkubację hodowli prowadzić w temp. 37°C przez 24

godziny.

wykrywanie obecności ureazy

Przygotować 2 sterylne probówki z podłożem z mocznikiem wg Christensena, pozostawić do

zestalenia tak, aby otrzymać probówki ze skosami. Wykonać posiew szczepów bakteryjnych

Escherichia coli i Proteus poprzez posiew rysowy, przy użyciu ezy, pojedynczej kolonii. Probówki

należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia. Inkubację hodowli prowadzić w

temp. 37°C przez 24 godziny.

wykrywanie fermentacji glukozy, laktozy i wydzielania siarkowodoru

Przygotować 2 sterylne probówki z podłożem Kliglera, pozostawić do zestalenia tak, aby otrzymać

probówki ze skosami. Wykonać posiew szczepów bakteryjnych Escherichia coli i Proteus poprzez

wkłucie igłą bakteriologiczną, pojedynczej kolonii do 2/3 wysokości słupka oraz rozprowadzając

materiał bakteryjny za pomocą ezy po powierzchni skosu. Probówki należy czytelnie opisać

nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia. Inkubację hodowli prowadzić w temp. 37°C przez 48

godziny.





Podłoże woda peptonowa z tryptofanem służy do oceny zdolności bakterii do produkcji indolu na

drodze dezaminacji tryptofanu – za wynik dodatni przyjmuje się pojawienie się czerwonego

zabarwienia na granicy płynów po dodaniu kroplami odczynnika Ehrlicha-Böhme świadczące o

obecności indolu (Rys. 29).

Rys. 29. Wynik reakcji z odczynnikiem Ehrlicha-Böhme

Podłoże laktozowe z purpurą bromokrezolową jest podłożem różnicującym bakterie rozkładające

laktozę od nierozkładających laktozy. W pH obojętnym wskaźnik - purpura bromokrezolowa,

przyjmuje barwę fioletową. Bakterie wykorzystujące laktozę rozkładają ją do kwasów powodując

obniżenie pH środowiska i zmianę zabarwienia podłoża na żółto (Rys. 30).

Rys. 30. Wzrost mikroorganizmów na podłożu laktozowym z purpurą bromokrezolową

Podłoże z mocznikiem wg Christensena służy do wykrywania zdolności rozkładu mocznika przez

mikroorganizmy. Mikroorganizmy, które posiadają enzym – ureazę, mogą rozkładać mocznik do

dwutlenku węgla i amoniaku. Uwolniony amoniak powoduje alkalizację podłoża, a wskaźnik w

postaci czerwieni fenolowej, w środowisku zasadowym, zmienia barwę z czerwonej na purpurowo-




czerwoną. W przypadku bakterii nie wytwarzających ureazy mocznik nie jest rozkładany,

mikroorganizmy wykorzystują wtedy glukozę z podłoża wytwarzając przy tym kwasy. Przy niskim

pH wskaźnik – czerwień fenolowa, barwi się na żółto (Rys. 31).

Rys. 31. Wzrost mikroorganizmów na podłożu z mocznikiem wg Christensena

Podłoże Kliglera stosowane jest do identyfikacji Gram-ujemnych pałeczek jelitowych, głównie z

rodziny Enterobacteriaceae, w oparciu o zdolność do fermentacji glukozy, laktozy i redukcji

tiosiarczanu do H2S. Różnicowanie bakterii odbywa się na podstawie zmian zabarwienia

wskaźnika w postaci czerwieni fenolowej w odpowiedzi na odczyn kwaśny lub zasadowy powstały

podczas fermentacji glukozy i laktozy (Rys. 32):

rozkład glukozy - bakterie wykorzystujące tylko glukozę rosną słabo w części słupkowej w

linii wkłucia, powoli rozkładając zapas tego cukru. Kwaśne produkty rozkładu glukozy

prowadzą do zmiany zabarwienia podłoża na kolor żółty. Przy obfitym wzroście bakterii na

powierzchni skosu glukoza zostaje szybko zużyta jak również kwaśne produkty jej rozkładu.

Następuje wtórna alkalizacja podłoża, będąca następstwem rozkładu peptonu, co powoduje

zaczerwienienie części skośnej podłoża. Czerwone zabarwienie części skośnej i żółte

zabarwienie słupkowej świadczy o fermentacji glukozy i braku fermentacji laktozy.

rozkład glukozy i laktozy – w przypadku bakterii fermentujących również laktozęnie

zachodzi zjawisko wtórnej alkalizacji podłoża, ze względu na 10-krotnie większą ilość

laktozy w podłożu w porównaniu z glukozą. Pozwala to na utrzymanie zakwaszenia

podłoża przez dłuższy czas. Żółte zabarwienie części skośnej i słupkowej wskazuje na

fermentację glukozy i laktozy.

wytwarzanie gazu – zdolność szczepu do fermentacji glukozy i laktozy z wytworzeniem

gazu uwidacznia się pojawieniem pęcherzyków gazu w części słupkowej lub rozerwaniem

podłoża.

wytwarzanie H2S – szczepy wytwarzające H2S powodują zaczernienie podłoża w wyniku




redukcji tiosiarczanu do H2S. H2S reaguje z jonami żelaza dając siarczek żelaza, który

tworzy czarne precypitaty na granicy skosu i słupka lub głębiej w słupku. Na podłożu silnie

zakwaszonym zaczernienie może zniknąć po 48-godzinnej inkubacji.

Rys. 32. Wzrost mikroorganizmów na podłożu Kliglera


Rodzaj bakterii Woda peptonowa z tryptofanem

–

obecność indolu

Podłoże laktozowe z purpurą

bromokrezolową

-

fermentacja laktozy

Podłoże z mocznikiem wg Christensena

-

obecność ureazy

Podłoże Kliglera

-

fermentacja glukozy i laktozy,

wydzielanie siarkowodoru

Escherichia coli

Proteus


Celem ćwiczenia jest identyfikacja pałeczek Gram-ujemnych niefermentujących glukozy

oraz obserwacje wzrostu mikroorganizmów w pożywkach uzyskanych z hodowli w ćwiczeniu 6.

przygotowanie szczepów bakteryjnych do posiewów

Do badań użyte zostaną dwa szczepy kontrolne Pseudomonas putida i Acinetobacter, posiane

wcześniej na podłoże agarowe odżywcze.

różnicowanie bakterii Pseudomonas

Przygotować 2 płytki Petriego z podłożem agar z cetrymidem. Wykonać posiew pojedynczej kolonii

szczepów bakteryjnych Pseudomonas putida i Acinetobacter, na plytki z podłożem agar z

cetrymidem. Płytki należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia. Inkubację

hodowli prowadzić w temp. 30°C przez 24 godziny.




wpływ temperatury

Przygotować 2 kolby stożkowe z bulionem odżywczym. Wykonać posiew pojedynczej kolonii

szczepów bakteryjnych Pseudomonas putida i Acinetobacter, do kolb z bulionem odżywczym.

Kolby należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia. Po dodaniu kolonii

bakteryjnej do podłoża zawartość kolb należy delikatnie wymieszać. Inkubację hodowli prowadzić

w temp. 42°C przez 24 godziny.

wykrywanie zdolności proteolitycznych

Przygotować 2 sterylne probówki z podłożem bulion odżywczy z żelatyną, pozostawić do


Pseudomonas putida i Acinetobacter poprzez wkłucie igłą bakteriologiczną, pojedynczej kolonii do

2/3 wysokości słupka. Probówki należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia.


wykrywanie zdolności ruchu

Przygotować 2 sterylne probówki z podłożem do badania zdolności ruchu bakterii, pozostawić do


Pseudomonas putida i Acinetobacter poprzez wkłucie igłą bakteriologiczną, pojedynczej kolonii do

2/3 wysokości słupka. Probówki należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia.



Podłoże agar z cetrymidem jest podłożem wybiórczym do izolacji i różnicowania szczepów

Pseudomonas. Podłoże ma charakter wybiórczy dzięki obecności cetrymidu, który hamuje wzrost

większości mikroorganizmów. Obecność w podłożu chlorku magnezu i siarczanu potasu sprzyja

wytwarzaniu charakterystycznej pigmentacji przez bakterie z rodzaju Pseudomonas –

przezroczyste kolonie w świetle dziennym mogą barwić się na żółto-zielono lub pozostawać

bezbarwne (Rys. 33).

Rys. 33. Wzrost bakterii z rodzaju Pseudomonas




Podłoże bulion odżywczy jest podłożem uniwersalnym do hodowli mikroorganizmów, czynnikiem

różnicującym jest podwyższona temperatura (42°C), która uniemożliwia wzrost mikroorganizmom

mniej odpornym na temperaturę (Rys. 34).

Rys. 34. Wzrost bakterii odpornych na temperaturę

Podłoże bulion odżywczy z żelatyną służy do wykrywania zdolności proteolitycznych (hydrolityczny

rozkład wiązania peptydowego) mikroorganizmów. Upłynnienie pożywki świadczy o rozkładzie

żelatyny przez mikroorganizm, który posiada zdolności proteolityczne (Rys. 35).

Rys. 35. Wykrywanie zdolności proteolitycznych mikroorganizmów

Podłoże do wykrywania zdolności ruchu bakterii – o zdolności ruch świadczy zmętnienie podłoża

w całym słupku, wzrost bakterii tylko wzdłuż linii nakłucia świadczy o braku zdolności do ruchu

(Rys. 36).

Rys. 36. Wykrywanie zdolności ruchu bakterii





Rodzaj bakterii Agar z cetrymidem

–

różnicowanie bakterii

Bulion odżywczy

-

wpływ temperatury

Bulion odżywczy z żelatyną

-

zdolności proteolityczne

Podłoże do badania zdolności ruchu

bakterii

Pseudomonas putida

Acinetobacter

Ćwiczenie 8 - Czynniki fizyczne i chemiczne mające wpływ na wzrost drobnoustrojów cz.1

Celem ćwiczenia jest określenie wpływu promieniowania UV, temperatury, pH

i antybiotyków na wzrost wzorcowego szczepu bakterii - Escherichia coli, na podstawie obserwacji

wzrostu bakterii w hodowlach poddanych działaniu poszczególnych czynników stresujących

i w hodowli kontrolnej oraz obserwacje wzrostu mikroorganizmów w pożywkach uzyskanych z

hodowli w ćwiczeniu 7.


Przygotować 5 probówek zawierających 9 ml sterylnej wody destylowanej. Do pierwszej probówki

dodać sterylną pipetą 1 ml hodowli bakteryjnej i dokładnie wymieszać (rozcieńczenie 10-1). Kolejne

rozcieńczenie (10-2) wykonać przenosząc 1 ml rozcieńczenia 10-1 do następnej probówki

zawierającej 9 ml sterylnej wody buforowanej. Dalsze rozcieńczenie (10-3, 10-4, 10-5) wykonać

w sposób analogiczny, zwracając szczególną uwagę na dokładne mieszanie i zmianę pipet dla

każdego rozcieńczenia.

badanie wpływu temperatury na wzrost bakterii

Wykonać posiew rozcieńczonych próbek (10-5) na 3 płytki Petriego z podłożem agarozowym

odżywczym. 0,2 ml próbki przenieść pipetą na podłoże, a następnie równomiernie rozprowadzić po

całej powierzchni za pomocą szklanej głaszczki (przed i po każdym użyciu głaszczki należy ją

ogrzewać w płomieniu palnika). Płytki Petriego należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą

doświadczenia. Inkubację hodowli prowadzić w temp. 6°C, 37°C i 55°C przez 24 godziny.

badanie wpływu pH na wzrost bakterii


odżywczym o pH4 i pH12 (zgodnie z opisem powyżej). Płytki Petriego należy czytelnie opisać

nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia. Inkubację hodowli prowadzić w temp. 37°C przez

24 godziny.




badanie wpływu promieniowania UV na wzrost bakterii


odżywczym (zgodnie z opisem powyżej). Płytki Petriego należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą

i nazwą doświadczenia. Płytki z posiewem naświetlać przez 3 min. promieniami UV o długości fali

240 nm., bezpośrednio (otwarta płytka) i pośrednio (zamknięta płytka). Inkubację hodowli

prowadzić w temp. 37°C przez 24 godziny.

badanie oporności bakterii na antybiotyki


odżywczym (zgodnie z opisem powyżej). Płytki Petriego należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą

i nazwą doświadczenia. Na przygotowany materiał mikrobiologiczny należy nałożyć krążki

zawierające standardowe stężenia różnych antybiotyków. Inkubację hodowli prowadzić w temp.

37°C przez 24 godziny.


Opis wyglądu kolonii bakteryjnych na płytce Petriego należy umieścić w tabeli:

Warunki hodowli Opis kolonii Wnioski

Temp. 37°C, pH7 (próba kontrolna)

Temp. 6°C

Temp. 55°C

pH4

pH12

UV (zamknięta płytka)

UV (otwarta płytka)

Antybiotyk 1 ……………………….

Antybiotyk 2

……………………….




Ćwiczenie 9 - Wpływ wybranych związków chemicznych na wzrost bakterii cz.2

Celem ćwiczenia jest określenie wpływu wybranych środków dezynfekcyjnych: fenolu,

jodyny i wody utlenionej, na wzrost bakterii Escherichia coli w zależności od ich stężenia i czasu

oddziaływania oraz obserwacje wzrostu mikroorganizmów w pożywkach uzyskanych z hodowli w

ćwiczeniu 8.


Rozcieńczenie przygotować zgodnie z opisem w ćwiczeniu 5.

oznaczanie wpływu środków chemicznych na wzrost bakterii

Przygotować roztwory środków dezynfekcyjnych (1, 2 i 3% fenol, 1 i 2% jodyna, 3% woda

utleniona) stosując do rozcieńczeń sterylną wodę destylowaną. Po 10 cm3 każdego roztworu

przenieść do sterylnych probówek. Jako próbę kontrolną przygotować próbówkę z 10 cm3 sterylnej

wody destylowanej. Próby kontrolną i badane zaszczepić 1 cm3 zawiesiny E. coli. Po 5, 15, 30 i 45

minut z każdego roztworu przenieść ezą zawiesiną do probówek z 10 ml podłoża hodowlanego

i rurkami Durhama (Rys. 37). Hodowle inkubować w temp. 37C przez 48h.

Rys. 37. Schemat oznaczania wpływu środków chemicznych na wzrost bakterii





Opis wzrostu bakterii w pożywce płynnej w probówkach należy umieścić w tabeli:

Hodowla Wygląd hodowli Wnioski

po 5 min. po 15 min. po 30 min. po 45 min.

W wodzie destylowanej (kontrola)

Fenol 1%

Fenol 2%

Fenol 3%

Jodyna 1%

Jodyna 2%

Woda utleniona 3%

Ćwiczenie 10 - Badania mikrobiologiczne żywności

Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie izolacji mikroorganizmów z produktów spożywczych

metodą posiewu na podłoże stałe oraz określenie jakości żywności na podstawie obecności

bakterii z grupy Lactobacillus i grzybów strzępkowych.


Przygotować 6 sterylnych płytek Petriego w pobliżu płomienia palnika. Pożywkę (podłoże

z chloramfenikolem oraz MRS) rozlać do płytek (po 3 na każde podłoże) zgodnie z opisem

w ćwiczeniu 1.

oznaczanie mikroorganizmów z produktów spożywczych

Produkty spożywcze (6 różnych): mleko (np. z butelki, prosto od krowy), jogurt, mięso (np. wołowe,

wieprzowe, ryba), koncentrat pomidorowy, ser żółty, kapusta kwaszona, ogórek kwaszony.

Do badań pobrać 5 ml substancji płynnych (np. mleko, jogurt) oraz 5 g substancji o konsystencji

zawiesistej (koncentratu pomidorowego, jogurt). Substancje zawiesiste rozetrzeć w moździerzu




z 50 ml soli fizjologicznej. Homogenizaty i substancje płynne rozcieńczyć roztworem soli

fizjologicznej do uzyskania rozcieńczeń 10-1, 10-2 i 10-3 (Rys. 38). Podczas wykonywania

rozcieńczeń należy zwrócić szczególną uwagę na dokładne mieszanie i zmianę pipet dla każdego

rozcieńczenia.

Rys. 38. Schemat wykonania rozcieńczeń i posiewów produktów spożywczych

1. oznaczanie drożdży i grzybów pleśniowych w produktach spożywczych

Wykonać posiew 0,2 ml rozcieńczonych próbek (10-3) produktów o konsystencji zawiesistej oraz

posiew metodą odciskową produktów o konsystencji stałej na płytki Petriego z podłożem z

chloramfenikolem. Płytki Petriego należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą

doświadczenia. Inkubację hodowli prowadzić w temp. 5-28°C przez 5-7 dni.

2. oznaczanie bakterii z rodzaju Lactobacillus w produktach mlecznych i jego przetworach

Wykonać posiew 0,2 ml rozcieńczonych próbek (10-3) produktów mlecznych na płytki Petriego z

podłożem MRS. Płytki Petriego należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia.

Inkubację hodowli prowadzić w temp. 30°C przez 3-5 dni.



w tabeli (zgodnie z opisem w ćwiczeniu 1). Obserwacje mikroskopowe mikroorganizmów -

wykonanie preparatów utrwalonych barwionych metodą Grama (Rys. 20).




Ćwiczenie 11 - Badania mikrobiologiczne kosmetyków

Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie izolacji mikroorganizmów z produktów

kosmetycznych metodą posiewu na podłoże stałe oraz zbadanie jakości kosmetyków i aktywności

biochemicznej mikroflory obecnej w produktach kosmetycznych.


Przygotować 9 sterylnych płytek Petriego w pobliżu płomienia palnika. Pożywkę (podłoże agarowe

odżywcze) rozlać do płytek zgodnie z opisem w ćwiczeniu 1.

przygotowanie prób do posiewów

Produkty kosmetyczne (6 różnych): krem, mleczko kosmetyczne, tonik, puder, itp.

Do badań pobrać 5 ml lub 5 g kosmetyków. Krem, mleczko kosmetyczne i puder rozetrzeć

w moździerzu z 50 ml soli fizjologicznej. Homogenizaty i tonik rozcieńczyć roztworem soli

fizjologicznej do uzyskania rozcieńczeń 10-1, 10-2 i 10-3. Podczas wykonywania rozcieńczeń należy

zwrócić szczególną uwagę na dokładne mieszanie i zmianę pipet dla każdego rozcieńczenia.

Wykonać posiew próbek rozcieńczonych (10-3) na płytki Petriego z podłożem agarozowym

odżywczym. 0,2 ml próbki przenieść pipetą na podłoże, a następnie równomiernie rozprowadzić po

całej powierzchni za pomocą szklanej głaszczki (przed każdym użyciem głaszczki należy ją

ogrzewać w płomieniu palnika, aż do uzyskania czerwonego zabarwienia). Płytki Petriego należy

czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia. Inkubację hodowli prowadzić w temp.

37°C przez 24 godziny.



w tabeli (zgodnie z opisem w ćwiczeniu 1). Obserwacje mikroskopowe mikroorganizmów -

wykonanie preparatów utrwalonych barwionych metodą Grama (Rys. 20).

Ćwiczenie 12 – Izolacja DNA z komórek roślinnych

Celem ćwiczenia jest wyizolowanie DNA roślinnego i uzyskanie maksymalnej wydajności

wysokoczasteczkowego DNA, przy jednoczesnym oczyszczeniu preparatu DNA z białek

i inhibitorów enzymów, które mogą utrudniać następne etapy pracy z DNA.

izolacja całkowitego DNA z komórek roślinnych

Liście lub kilkudniowe siewki umieścić w moździerzu z małą ilością ciekłego azotu i rozetrzeć na

proszek w celu mechanicznego uszkodzenia ścian komórkowych. Po wyparowaniu azotu dodać 1

ml buforu CTAB i dokładnie rozetrzeć na proszek. Detergenty takie jak CTAB (bromek

heksadecylotrimetylo amoniowy) umożliwiają rozpuszczenie błon, natomiast EDTA, zawarty w




buforze CTAB, chelatuje jony magnezu, naturalne kofaktory większości nukleaz, chroni uwolniony

DNA przed działaniem endogennych enzymów o aktywności nukleolitycznej. Ekstrakt przelać do

probówki Eppendorf zawierającej 100l mieszaniny chloroform-izopropanol. Inkubować 25 min w

temp 65°C. Ochłodzić probówki do temp pokojowej i uzupełnić do poziomu pełnej probówki

mieszaniną chloroform-izopropanol. Wytrząsać do utworzenia emulsji. Wirować w mikrowirówce

przez 10 min przy 10 000 rpm w celu rozdzielenia faz. Rozpuszczalniki organiczne, takie jak

chloroform i izopropanol powodują całkowite odbiałczenie roztworu. Chloroform powoduje

powierzchniową denaturację białek. Izopropanol redukuje pienienie i stabilizuje granicę fazową,

gdzie koncentruje się białko. W rezultacie wytrząsania powstają trzy warstwy: górna faza wodna,

zawierającą kwasy nukleinowe, dolna faza organiczna i wąskie pasmo zdenaturowanego białka na

granicy faz. Fazę wodną (górną) przenieść do nowej probówki. Wytrącić DNA przez dodanie

zimnego etanolu (do poziomu pełnej probówki). Delikatnie mieszać, obracając probówkę. Wirować

w mikrowirówce przez 10 min przy 10 000 rpm w celu oddzielenia osadu. Supernatant zlać znad

osadu. Do probówek dodać 0,5-1 ml 0,2 M octan sodu w 75% etanolu w celu zwiększenia

efektywności wytrącania DNA. Ponownie wirować w mikrowirówce przez 10 min przy 10 000 rpm

w celu oddzielenia osadu. Supernatant zlać znad osadu. Osad osuszyc w temp pokojowej.

Następnie rozpuścić w 100l sterylnej wody. DNA przechowywać w -20°C.

pomiar czystości i stężenia wyizolowanego DNA

Absorpcja kwasów nukleinowych mierzona jest przy 260 nm. Z uwagi na fakt, że w kwasach

nukleinowych występują oddziaływania między zasadami obserwuje się efekt tzw. hipochroizmu,

tzn., że absorpcja helisy DNA jest mniejsza od absorpcji jednoniciowego DNA czy RNA, a ta z kolei

jest mniejsza od absorpcji izolowanych nukleotydów. Ponadto widmo absorpcji może być

wykorzystane do określenia stężenia i czystości próbki DNA. Preparat DNA uznaje się za czysty

jeżeli A 260/A 280 wynosi 1,8. Jeżeli próbka DNA zanieczyszczona jest RNA to wartość A 260/A

280 jest bliższa 2,0, natomiast jeżeli próbka zanieczyszczona jest białkami to wartość A 260/A 280

jest niższa niż 1,8 (maksimum absorpcji UV dla białek wynosi 280 nm). Stężenie DNA w roztworze

(określane często jako OD - gęstość optyczna), oznacza się korzystając z prawa Lamberta -

Beera, mierząc w kuwetce 1 cm, absorbancję przy długości fali = 260 nm. W przybliżeniu przyjmuje

się, że jeżeli A 260 równa się 1 to stężenie dwuniciowego DNA (dsDNA) wynosi oko o 50 μg/ml,

jednoniciowego DNA (ssDNA) 36 μg/ml, RNA - 40 μg/ml, a oligonukleotydów 30 μg/ml.

Rozcieńczyć 1:10 roztwór DNA przy pomocy sterylnej wody; w razie potrzeby przygotować

rozcieńczenie 1:100. Zmierzyć z użyciem kuwet kwarcowych absorpcje roztworu DNA przy

długości fali 230, 260 i 280 nm, stosując sterylną wodę jako odnośnik. Wyznaczyć stężenie DNA.

opis wyników badań

Opis wykonania eksperymentu i ewentualnych trudności oraz wynik pomiaru OD.




Ćwiczenie 13 – Izolacja chromosomalnego DNA z komórek bakteryjnych

Celem ćwiczenia jest wyizolowanie chromosomalnego DNA bakteryjnego i uzyskanie

maksymalnej wydajności wysokoczasteczkowego DNA, przy jednoczesnym oczyszczeniu

preparatu DNA z białek i inhibitorów enzymów, które mogą utrudniać następne etapy pracy z DNA.

izolacja całkowitego chromosomalnego DNA z komórek bakteryjnych

Do wykonania doświadczenia należy zastosować specjalistyczny kit do izolacji chromosomalnego

DNA bakteryjnego.

1,5 ml zawiesiny świeżej hodowli bakteryjnej wirować 2 min. przy 12-16 tys. rpm. Osad otrzymany

po odrzuceniu supernatantu, rozpuścić w 180 l roztworu lizującego, w celu usunięcia ścian

komórkowych. Dodać 20 ml proteinazy K, intensywnie wytrząsać i inkubować w 55°C przez 30

min. Enzym proteinaza K używany jest do trawienia białek. Dodać 200 l kolejnego roztworu

lizującego, w celu zniszczenia błon komórkowych, intensywnie wytrząsać i inkubować w 55°C

przez 10 min. W tym czasie przygotować kolumienki izolacyjne przez włożenie ich do probówek i

naniesienie na nie 500 l buforu preparacyjnego, a następnie zwirowanie przez 1 min. przy 12-16

tys. rpm. Bufor preparacyjny po odwirowaniu należy odrzucić. Do lizowanych komórek

bakteryjnych dodać 200 l etanolu i intensywnie wytrząsać. Przenieść całą mieszaninę na

kolumienki izolacyjne i wirować 1 min. przy 6,5 tys. rpm. Po wirowaniu otrzymany roztwór należy

odrzucić, a na kolumienki dodać 500 l roztworu przemywającego i wirować 1 min. przy 6,5 tys.

rpm. Odwirowany roztwór odrzucić i dodać kolejny roztwor przemywający, wirować 3 min. przy 12-

16 tys. rpm. Po wirowaniu i odrzuceniu supernatantu, należy odparować etanol z kolumienek

zostawiając je otwarte przez kilka minut. Następnie kolumienki należy przełożyć do czystych

probówek i dodać na nie 200 l buforu elucyjnego. Wirować 1 min. przy 6,5 tys. rpm. Wymywanie

powtórzyć do tej samej probówki. DNA przechowywać w -20°C.

pomiar czystości i stężenia wyizolowanego DNA

Zmierzyć z użyciem kuwet kwarcowych absorpcje roztworu DNA przy długości fali 230, 260 i 280

nm. Wyznaczyć stężenie DNA.


Opis wykonania eksperymentu i ewentualnych trudności oraz wynik pomiaru OD.




Ćwiczenie 14 - Reakcja RAPD-PCR (losowa amplifikacja polimorficznego DNA)

Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z przebiegiem reakcji PCR oraz jej odmianą RAPD-PCR,

przeprowadzenie reakcji RAPD-PCR na DNA wyizolowanym z komórek bakteryjnych.

przygotowanie reakcji RAPD-PCR

Składnik Stężenie wyjściowe Ilość Objętość na 1 próbkę (1µl)

Woda 16,25 µl 16,25

Bufor do PCR 10x 1x 2,5

MgCl2 25mM 1,5mM 1,5

Starter 5µmoli 0,2 µM 2

dNTP 5mM 0,15 nmoli 0,75

Polimeraza Taq 5 jedn./µl 0,5 jedn. 1

DNA 25 ng/µl 25 ng 1

RAZEM 25

Etap Temperatura [°C] Czas [sek.]

Denaturacja wstępna 95 300

Denaturacja 92 90

Wiązanie starterów 35 90

Synteza 72 120

Synteza końcowa 72 300

Przechowywanie 4 Do wyłączenia

Liczba cykli 30

Termocykler

przygotowanie 1% żelu agarozowego (na następnych zajęciach)

W celu wykonania 1% żelu agarozowego należy 2g agarozy rozpuścić w 200ml buforu TBE (45

mM Tris-boran, 1 mM EDTA) i podgrzewać do wysokiej temp. ciągle mieszając. Po całkowitym

rozpuszczeniu dodać 5l bromku etydyny. Tak przygotowany żel wylać do formy (20 x 20 cm),

włożyć grzebień i pozostawić do zastygnięcia. Po spolimeryzowaniu żelu umieścić go w temp.




+4°C na 30 min. Przygotować próbki do analizy elektroforetycznej. W probówkach zmieszać 10 l

badanej próbki po reakcji RAPD-PCR i 5 l barwnika obciążającego (30% sacharoza z oranżem

metylowym). Schłodzoną formę z żelem włożyć do aparatu do elektroforezy z buforem. Na gotowy

żel nakładać próbki kwasów nukleinowych wraz z barwnikiem obciążającym (Rys 39). Prowadzić

elektroforezę w buforze TBE przy napięciu ok. 100V w obecności markera wielkości, aż do

rozdziału produktów reakcji. Po zakończonej elektroforezie żel obejrzeć w świetle UV w zestawie

do wizualizacjo zdjęć i opisać wnioski z przeprowadzonego eksperymentu.

Rys. 39. Schemat nakładania analizowanych próbek na żel agarozowy


Opis wykonania eksperymentu i ewentualnych trudności oraz opis żelu po elektroforezie.




13. Literatura

Różalski A., Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej. Skrypt dla studentów biologii., Wydawnictwo

Uniwersytetu Łodzkiego, 1996

Czerwińska E.,Piotrowski W., Mikrobiologia ogólna Teoria i ćwiczenia., Wydawnictwo

Uczelniane Politechniki Koszalińskiej, 2010

Stryjakowska-Sekulska M., Materiały do ćwiczeń z mikrobiologii., Wydawnictwo Akademii

ekonomicznej w Poznaniu, 2004

Grabińska-Łoniewska A., Ćwiczenia laboratoryjne z mikrobiologii ogólnej., Oficyna Wydawnicza

Politechniki Warszawskiej, 1999

Documents

wiczenia laboratoryjne Inżynieria Środowiska · Na efektywnoś działania środków dezynfekcyjnych mają wpływ: czas stosowania, stężenie, temperatura, pH, wilgotnoś środowiska