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DIPARTIMENTO DI PRODUZIONE VEGETALE
Piattaforma di biotecnologie verdi e di tecniche gestionali per un sistema
agricolo ad elevata sostenibilità ambientale- BIOGESTECAfinanziato dal “Fondo per la promozione di Accordi Istituzionali” della Regione Lombardia.
Dr. Roberto Pilu
8 Giugno 2011
WP4-Biocontrollo
KICK-OFF MEETING
Attività 1 - FLC - RIS
Dr. Piffanelli
- RIS
- MAC
Attività 2Prof. Daffonchio
Attività 3
Dr.Pilu
- MACAttività 4
Dr. Scarafoni
DIGITARE NOME DIPARTIMENTO SECONDA RIGA NOME DIPARTIMENTO
Il biocontrollo in agricoltura (sostenibile) è effettuato con un
insieme di tecniche utilizzate per controllare gli organismi che
danneggiano i raccolti, in particolare i patogeni delle piante, con il
fine di ridurre l’utilizzo di agrofarmaci di sintesi.
Come viene effettuato:
- Scegliendo/modificando i genotipi delle piante
- Utilizzando sostanze naturali
- Utilizzando organismi benefici ad attività antagonista
Pianta
suscettibile
Patogeno
Pianta
resistente - Scelta varietale
- Costituzione nuove varietà tramite incrocio e MAS
- Mutagenesi
- Genomica funzionale
Tecniche di biocontrollo
-Trattamenti con bioestratti
(eg. proteine, alcaloidi, etc)
microrganismi con
attività antagonista
Attività 3
Attività 2
Attività 4
Attività 1
Attività 1
WP4
- grave malattia fungina del riso a distribuzione mondiale
- distrugge totalmente le colture in aree tropicali
- arreca danni superiori al 50% della produzione nei climi temperati
- provocata dal fungo Pyricularia griseaP. grisea X1000Foto Ente Nazionale Risi
Brusone fogliare Mal del collo
MAL DEL COLLO è la sintomatologia più dannosa in campo perché la spiga deperisce e secca nella fase iniziale della fioritura
La patologia si può manifestare sulle foglie, sui nodi e i culmi, provocando il
BRUSONE FOGLIARE e MAL DEL COLLO
BRUSONE
- FLC - RIS
Il patrimonio varietale italiano, caratterizzato da varietà in
gran parte sensibili a questo patogeno.Le soluzioni per il controllo del patogeno sono oggi costituite essenzialmente dall’utilizzo di
prodotti fitosanitari ad azione fungicida. Questi prodotti garantiscono un buon controllo della
malattia, a patto che vengano applicati sulla coltura nel momento giusto.
Le molecole disponibili sono:
triciclazolo (Beam DAS),
Azoxistrobin (Amistar)
flutriafol (Impact 250 SC).
Prevenire il brusone è la difesa più efficaceI fattori predisponenti la malattia sono molteplici. Oltre alle condizioni ambientali è importante
anche la tecnica di coltivazione:
la scelta dei piani di concimazione può determinare in senso positivo o negativo l’evoluzione
della malattia.
L’azoto costituisce infatti il principale elemento nutritivo per il riso, ma concimazioni squilibrate
determinano una maggior permeabilità cuticolare (strato di cere che ricoprono la foglia) e una
scarsa silicizzazione delle pareti cellulari, che rendono la pianta meno resistente alla malattia.
Il BRUSONE E’ ANCHE UN PROBLEMA AMBIENTALE
per l’utilizzo abitudinario di fungicidi di sintesi ad azione preventiva
SISTEMA DI BIOCONTROLLO DEL
BRUSONE
a basso impatto ambientale
per la sostenibilità della produzione
del riso
necessario
VANTAGGI
difesa ad ampio spettro e durevole del riso dal brusone
sostenibilità della produzione del riso nel rispetto dell’ambiente
mantenimento della biodiversità dell’ ecosistema risaia
vantaggio economico per l’agricoltore
competitività sul mercato del riso lombardo
sicurezza alimentare per i consumatori
Attività antifungina di una sostanza naturale contro P. grisea
2) Studio e analisi di sostanze naturali ad attivitàantifungicida da utilizzare nella lotta biologicacontro Pyricularia grisea in riso
1) ricerca dei geni chiave coinvolti nella difesadel riso da brusone e analisi della risposta delriso a elicitori che innalzano o inducono le difeseinnate della pianta a P.grisea
Erba medica (Medicago sativa)
Pianta ricca in saponine
Medicago sativa
SAPONINE
- metaboliti secondari delle piante, soprattutto leguminose
- prodotte per la difesa da stress biotici e abiotici
- nota attività antimicrobica, antimicotica, insetticida,azione nutraceutica (anticolesterolemica) ed azionefarmacologica (coadiuvanti in terapie antitumorali)
- presenti nella pianta in concentrazione variabile
Lo studio implicherà:
- Valutazione in vitro dell’attività antifungina e/o fungistatica di saponine isolate da Medicago versoceppi di P.grisea di collezione storiche e isolati durante il progetto
-- Studio della variabilità allelica in erba medica per i geni coinvolti nella biosintesi di saponine
-Caratterizzazione genotipica e catalogazione di ceppi P.grisea isolati durante il progetto
- Analisi dell’efficacia di queste molecole contro ceppi di P.grisea in planta in condizioni controllate
- Analisi dell’attività fungicida/fungistatica delle saponine in pieno campo
O
O
O
O
O
OH
OH
O
HOHO
HOOC
HO
HO OH
HOHO
HO
H3C
rhamnose
galactose
glucuronic acid
soyasapogenol B
- MAC - RIS
Tra la popolazione dei batteri nel suolo sono presenti promotori di crescita delle piante.
e.g.
In natura sono presenti microrganismi associati alle piante ed in grado di contrastare
lo sviluppo di agenti fitopatogeni esercitando una funzione di biocontrollo attraverso
fenomeni di competizione per nicchie ecologiche e substrati, produzione di inibitori,
antibiotici, cianidi, enzimi litici etc..
Isolamento da campioni di rizosfera e tessuti radicali
Collezione di isolati batterici
con potenziale attività di biocontrollo
Arricchimento per
batteri con attività ACC deaminasica [Penrose and Glick, 2003]
DF + ACCCFU/g
Arricchimento per
batteri con attività ACC deaminasica [Penrose and Glick, 2003]
DF + ACCCFU/g
L’attività prevede dapprima l’ottenimento di un’ampia collezione di isolati batterici dalle radici e
dalla rizosfera delle piante di mais e di riso che non presentano sintomi delle fitopatologie in
oggetto.
(1) Endosfera
(2) Rizosfera
Screening in vitro per attività di biocontrollo
Produzione di endoglucanasi
Sintesi di HCN
Produzione di ammoniaca
Formazione di biofilm
Produzione di chitinasi Produzione di proteasi
Gli isolati saranno quindi valutate con saggi in vitro. L’attività antagonista
diretta nei confronti di colture pure del fitopatogeno verrà valutata con
saggi in vitro.
Metodo “Agar Well Diffusion”Metodo “Cross Streaking”
In una seconda fase si procederà quindi per gli isolati microbici
con attività polivalenti e/o particolarmente intense, verranno
condotti esperimenti in planta, volti a stabilire:
- la competenza dei ceppi nella colonizzazione della rizosfera
- la capacità di crescere come endofiti
- l’attività di biocontrollo in vivo, su piante artificialmente
contaminate dai fitopatogeni in ambiente confinato e in prove
pilota in pieno campo.
Il mais è una delle più importanti colture agrarie, in particolar modo nel territorio
lombardo ed in generale in tutta la Pianura Padana (resa media in Pianura Padana
c.a 11 t/ha); tra i principali fattori che possono diminuire la qualità dei prodotti finali
riscontriamo le micotossine.
le micotossine più diffuse in ambito agrario:
AFLATOSSINE: tossine prodotte da Aspergillus flavus ed A. parasiticus.
OCRATOSSINE: tossine prodotte da A. ochraceus e Penicillum verrucosum.
DESOSSINIVALENOLO E ZEARALENONE: prodotte da Fusarium culmorum e F.
graminearum.
FUMONISINE: tossine prodotte principalmente da F. verticillioides (ex F. moniliforme).
Le micotossine sono metaboliti tossici prodotti da alcune specie fungine
LE FUMONISINELE FUMONISINE sono metaboliti tossici principalmente, prodotte da Fusarium
verticillioides, chimicamente sono composti alifatici a 20 atomi di carbonio, sono
idrofile e non presentano gruppi cromogeni distinguibili ai raggi UV.
Attualmente sono noti 8 tipi di fumonisine: FB 1, 2, 3, 4, 5; FA 1,2; FC 1, 2.
Le più diffuse sono le FB 1 e 2.
FUMONISINE E LIMITI DI LEGGE
- Per granella di mais non trasformata, destinata alla produzione
di prodotti per l’alimentazione umana: sono ammessi 4000
µg / Kg (di granella) di fumonisine, pari a 4000 ppb = 4
ppm (Reg. CE 1126/07).
- Per granella di mais non trasformata, destinata alla produzione
di alimenti per animali: sono ammessi 60 mg / Kg (di
granella) di fumonisine, pari a 60 ppm (Reg. CE 585/06).
fumonisina
0-75% of the mean
75-125% of the mean
125-250% of the mean
>250% of the mean
Distribuzione delle tossine prodotte dal Fusarium in Europa
Tra le micotossine, soprattutto le fumonisine rappresentano il vero
problema in Italia, in quanto risultano essere quelle più diffuse.
PIRALIDE DEL MAIS (Ostrinia nubilalis)
Strategie di controllo del Fusarium
Approccio integrato
Tecniche agronomiche Miglioramento genetico Controllo con agrofarmaci
miscela Nomolt+Contest
Gli antociani sono i pigmenti rossi e
blu presenti in fiori e frutti
- Proteggono dalle malattie cardiovascolari
- Inibiscono la formazione di tumori
- Proteggono da malattie neurodegenerative
- Migliorano la vista
Nel mais la via biosintetica che porta all’accumulo di antocianine nel seme è
attivata da due tipi di geni regolatori: la famiglia dei geni C1/Pl1 e R1/B1.
La presenza di almeno un gene per famiglia consente la trascrizione dei geni
strutturali. P1 è il gene regolatore dei flobafeni, accumulati nel pericarpo.
Campi sperimentali
Azienda Agricola
Angelo Menozzi
Landriano (PV)
Campi sperimentali dove vengono eseguiti
incroci controllati e la produzione di
piccoli quantitativi di materiale per le varie
analisi e collaborazioni
- Costituzione dei materiali genetici
- Caratterizzazione molecolare
- Caratterizzazione chimica
- Prove agronomiche in diverse località
Effetto di geni di resistenza/trattamento antipiralide sulla
contaminazione da Fusarium spp. e Aspergillus spp.
Confrontare stato sanitario dei materiali
(resistente e suscettibile, trattate e non trattate) alla raccolta:
-incidenza marciumi fungini
-infezioni fungine latenti
-accumulo micotossine
0
100
200
300
400
500
600
incolore colorato sel colorato
mg
An
tocia
nin
e/1
00g
fari
na
TLC HPLCObiettivi
- MAC
La concia chimica delle sementi, in particolare quelle di mais, è un trattamento
protettivo effettuato con sostanze biocide (insetticidi e fungicidi) allo scopo di
contrastare preventivamente patogeni presenti nel terreno o negli strati
superficiali del tegumento del seme riducendo i danni che questi possono
arrecare al seme stesso o alla giovane plantula che si svilupperà.
Il ricorso alla concia può avere importanti ripercussioni ambientali, come
recentemente ipotizzato per i principi attivi nicotinoidi. Al di là di casi particolari
di tossicità acuta per l’ambiente, i concianti vanno ad aggiungersi ai presidi
fitosanatiari di sintesi che immessi in agricoltura possono accumularsi nei suoli
e nelle acque superficiali e di falda.(e.g. Gaucho 350FS, Regent, Cruiser 350FS, Poncho, etc.)
Il seme di mais conciato con questi prodotti, si pensa possa
causare mortalità e spopolamenti degli alveari, infatti gli
apicoltori con apiari dislocati in aree maidicole del nord Italia
lamentano nel periodo di semina della coltura,
DIGITARE NOME DIPARTIMENTO SECONDA RIGA NOME DIPARTIMENTO
Un alternativa per un uso più limitato di
concianti potrebbe essere quella di
ricorrere alle naturali resistenze della
pianta, valorizzandole in una ottica
applicativa. E’ noto infatti che durante le
prime fasi della germinazione, i semi, sia
di piante monocotiledoni sia di piante
dicotiledoni, rilasciano nel loro intorno
diversi tipi di molecole, tra cui numerosi
peptidi e proteine.
Time (hours)
0 20 40 60
Pro
tein
co
nce
ntr
atio
n (
g/
l)
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
K+
(m
ola
r)
0
2000
4000
6000
8000
10000
Protein concentration
mol K+
Protein concentration
mol K+Protein concentration
mol K+
Red line: Total
proteins
La spermosfera rappresenta la zona
del suolo che circonda il seme, è di
breve durata, molto variabile e
microbiologicamente dinamica.
Tra queste, quelle maggiormente rappresentate sono proteine (es. defensine, etc)
che mostrano attività antimicrobica in grado di inibire la crescita di specie
patogene (Conceicao and Broekaert, 1999; Ferreira et al., 2007).
Alcuni di questi peptidi si trovano già accumulati nel seme, altri vengono
sintetizzati ex novo durante le prime fasi della germinazione, altri ancora si
originano dalla digestione endogena di proteine di riserva già presenti nei semi,
come ad esempio le viciline, globuline presenti in discrete quantità nel mais.
Durante la germinazione il seme e il suolo circostante
costituiscono un habitat ricco per lo sviluppo e
l’interazione microbica. La principale fonte d’energia
per i microrganismi in questo habitat è il carbonio
rilasciato dal seme nel suolo circostante.
Proteine di deposito
presenti nel seme
Idrolisi delle
proteine con
accumulo di peptidi
Rilascio di proteine e
peptidi nell’ambiente
Germinazione
Attività
antifungina
H2O
Ogni 12 h
Analisi del
mezzo di germinazione
Saggi di inibizione
fungina
Caratterizzazione
molecolare
Germinazione
in vitro
- Esplorazione del germoplasma di mais, verranno
analizzati diversi genotipi collezionati
- Purificazione della frazione proteica da altri
composti (polisaccaridi e molecole organiche a
basso peso molecolare)
- Analisi quantitativa dei peptidi e delle proteine
rilasciate nel mezzo mediante approcci di tipo
proteomico
- Test di attività biologica delle miscele peptiche
ottenute dalle diverse linee saranno saggiate, per la
loro attività biocida nei confronti di specie fungine
potenzialmente patogene per le piante.
Obiettivi