Wyklad 8

Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA

Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn

Drobnoustroje jako biologiczne źródło nowych potencjalnych leków

Drobnoustroje prokariotyczne i eukariotyczne wytwarzają olbrzymią ilość małocząsteczkowych metabolitów wtórnych, z których wielewykazuje selektywną toksyczność wobec innych drobnoustrojów(antybiotyki przeciwdrobnoustrojowe), działanie przeciwnowotworowe(antybiotyki przeciwnowotworowe), ale także obniżające ciśnienie, hamujące biosyntezę cholesterolu, o działaniu przeciwbólowym, immunosupresyjnym i innym.

- wyizolowano i opisano około 20 000 metabolitów wtórnych;- połowa z nich działa antybiotycznie lub cytostatycznie- zastosowanie medyczne – około 150

Potencjalne dalsze możliwości:- z 40 000 gatunków bakterii poznano około 5 000- z 1,5 mln gatunków grzybów poznano około 70 000- bardzo słabo poznane: drobnoustroje morskie, ekstremofilne

Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: TECHNOLOGIA CHEMICZNA


Metabolizm wtórny – przemiany peryferyjne

Biosynteza metabolitów wtórnych rozpoczyna się w momencie wyczerpania źródeł substratu pokarmowego limitującego wzrost drobnoustrojów



ANTYBIOTYKISubstancje małocząsteczkowewytwarzane przez organizmy żywe(głównie drobnoustroje) hamującewzrost lub zabijające drobnoustroje





Promieniowce są głównymi producentami antybiotyków



NIETYPOWI PRODUCENCI

Wytwarzane przez cis kalifornijski(Taxus brevifolia)

Wytwarzane przez żabę afrykańską(Xenopus laevis)

Wytwarzana przez rekina(Squalus acanthias)



CHEMOTERAPIA – leczenie poprzez działanie chemoterapeutyku, czylisubstancji chemicznej selektywnie toksycznej, tzn. takiej, która hamuje wzrostlub zabija czynniki inwazyjne (baterie, grzyby, komórki nowotworowe, wirusy),czyniąc jednocześnie jak najmniejsze szkody komórkom organizmu leczonego

ANTYBIOTYKI – substancje chemiczne pochodzenia naturalnego, tzn.produkowane przez organizmy, które hamują wzrost lub zabijają inne organizmy

SELEKTYWNOŚĆ DZIAŁANIA – oddziaływanie tylko z jednym rodzajem celu molekularnego w czynniku inwazyjnym

CEL MOLEKULARNY – biomakromolekuła (białko, kwas nukleinowy) lub struktura supramolekularna (błona biologiczna, ściana komórkowa), z którąoddziałuje chemoterapeutyk. Wynikiem tego oddziaływania jest efekt toksycznywobec czynników inwazyjnych zawierających cel molekularny



Paul Ehrlich

Urodzony w roku 1854 w Strzelinie(wówczas Strehlen)

Wprowadził pojęcie „magicznej kuli”

Pierwszy nowoczesny chemoterapeutyk– arsfenamina - stosowany w latach 1910 – 1940 w leczeniu syfilisu, odkryty został przez pracującego w zespole Ehrlicha Japończyka Sachahiro Hata

Arsfenamina produkowana była przez koncern Hoetsch pod nazwą Salvarsan



Penicylina G została odkryta przez Aleksandra Fleminga

1921 – odkrycie lizozymu1929 – odkrycie penicyliny G

Pomnik Aleksandra Fleminga w Madrycie



Główne klasy antybiotyków Cefalosporyny

Penicyliny

Tetracykliny

AminoglikozydyMakrolidy



CEL- ŚCIANA KOMÓRKOWA (biosynteza i organizacja)

Penicyliny

Peptydoglikan



Penicylina G – działa tylko na bakterie gramdodatnie, nie wytwarzające β-laktamazy.Rozpada się w żołądku.

Ampicylina (u góry) i amoksycylina (u dołu)– działają na bakterie gramujemne.

Penicylina V – jak Penicylina G, ale trwała w żołądku



CEL – BIOSYNTEZA BIAŁKA





CEL – DNA



Antybiotyki przeciwnowotworowe

Antybiotyki antracyklinoweDaunorubicyna – producent Streptomyces peuceticus.

Łączą się DNA, hamując replikację

Komórki nowotworowe rozmnażają się intensywnie, w sposób niekontrolowany

Spośród „normalnych: komórek organizmuIntensywnie namnażają się tylko komórkiwłosów i szpiku kostnego.

Chemoterapia antybiotykami przeciwnowotworowymi może prowadzić do uszkodzenia szpiku



CEL – BŁONA KOMÓRKOWA

Walinomycyna



Antybiotyki przeciwgrzybowe

Łączą się z ergosterolem, składnikiem grzybowejbłony cytoplazmatycznej, powodując tworzeniekanałówW błonie komórek ludzkich występuje zamiastergosterolu cholesterol, z którym antybiotykiprzeciwgrzybowe łączą się nieco mniej chętnie

Efekty uboczne chemoterapii Amfoterycyną B

Wymioty, biegunka, bóle głowy, gorączka,uszkodzenie nerek i wątroby, neurotoksyczność,drastyczne obniżenie ilości erytrocytów



Oporność na antybiotyki

•oporność specyficzna – wobec określonego związku

lub grupy podobnych strukturalnie substancji

•oporność wielolekowa (krzyżowa, MDR)

– utrata wrażliwości na działanie

wielu niepodobnych strukturalnie leków



OPORNOŚĆ SWOISTAPrzykład: aktywność enzymu β-laktamazy jest przyczyną oporności swoistej bakterii na działanie penicyliny G

Kwas klawulanowy – inhibitorβ-laktamazy

Floksacylina – półsyntetyczna penicylina działająca na bakterie produkujące β-laktamazę



OPORNOŚĆ WIELOLEKOWA

Do wyrzucania cząstek leku potrzebna jest energia

Rodzaje transporterów wielolekowych

Białka typu ABC Białka typu MFS

Wykorzystują energię hydrolizy ATP Wykorzystują energię do wyrzucania cząsteczek leku gradientu protonowego

do wyrzucania cząsteczek leku



Drobnoustroje jako źródło nowych substancji czynnych



Poszukiwanie antybiotyków

Wysokowydajne techniki przesiewowe(high throughput screening)(próbki ze środowiska, biblioteki związków)- skrining chemiczny- skrining biologiczny- skrining ukierunkowany

Racjonalne projektowanie:- de novo- modyfikacje istniejących związków



Przemysłowymi producentami antybiotyków są szczepy wysokowydajne

Cechy szczepu wysokowydajnego

maksymalna wydajność pożądanego produktuminimalizacja wytwarzania niepożądanych produktów ubocznychstabilność genetycznaodporność na zakażenia wirusowe

Klasyczne metody otrzymywania i hodowli szczepów wysokowydajnych

nieukierunkowane zmiany genetyczne - mutageneza

optymalizacja warunków wzrostuwytwarzanie, fuzja i odnawianie protoplastów

Przykład wyniku optymalizacji szczepu:Penicillium chrysogenum wytwarzający Penicylinę G

oryginalny szczep producencki 0.1 mg/mlszczep zoptymalizowany 30 mg/ml



Mutagenizacja szczepów

genotypwyjściowy

mutagen

(1)

(2)

genotypuszkodzony

(3)

(4)

komórki zabite

genotyptrwale zmutowan

(5)

(6)

populacjamutantów

1 – mutacje pierwotne2 – mechanizm naprawczy; odtworzenie stanu pierwotnego3 – mechanizm naprawczy; mutacje wtórne4 – śmierć komórki5 – śmierć komórki6 – namnażanie zmutowanych komórek

y

Kierunki i skutki zmian genotypu w wyniku mutagenezy





Schemat etapów procesu fermentacyjnego wytwarzania idiolitu



Produkcja penicyliny G lub V

Producent: Penicillum chrysogenumSzczepy produkcyjne wytwarzają do 70 g z litra hodowli. Wydajność szczepu wyjściowego – 60 mg z litraGłówny sposób konstrukcji szczepów wysokowydajnych – powielenie genówbiosyntezy (do 20 kopii)

Prekursor – kwas fenylooctowy lub fenoksyoctowy



Schemat procesu wyodrębniania penicyliny G



Antybiotyki β-laktamowe wytwarzane na drodze fermentacyjnej jako źródłopółproduktów do otrzymywania penicylin i cefalosporyn półsyntetycznych

Półprodukty do otrzymywania penicylin i cefalosporyn półsyntetycznych

kwas 6-aminopenicylanowy (6-APA)

kwas 7-aminocefalosporanowy (7-ACA)



Alternatywne możliwości otrzymywania 6APA z penicyliny G



Wytwarzanie kwasu 6-aminopenicylanowego (6APA)

Możliwe metody: hydroliza chemiczna lub enzymatyczna

Warunki hydrolizy enzymatycznej

Biotransformacja 12-15% (w/v) roztworu soli penicyliny G lub V przez immobilizowaną amidazę penicylinową. Podczas reakcji utrzymuje się pHna poziomie 7 – 8 poprzez dodawanie KOH lub NaOH. Produkty: 6APA oraz odpowiedni kwas (fenylooctowy lub fenoksyoctowy). 6APA izoluje się poprzez zakwaszenie mieszaniny poreakcyjnej do pH = 4.0 w obecności rozpuszczalnika organicznego nie mieszającego się z wodą. W tych warunkach 6APA wytrąca się,a kwas prekursorowy przechodzi do fazy organicznej i jest zwykle zawracanyjako dodatek do nowej fermentacji

Korzyści z zastąpienia chemicznej hydrolizy penicyliny G do 6APA przez hydrolizę enzymatyczną

Eliminacja chlorowcowanych rozpuszczalników organicznych, toksycznych odczynników i odpadów oraz potrzeby stosowania ciekłego azotu do chłodzenia;prowadzenie reakcji w umiarkowanych warunkach; łatwa kontrola pH, temperatury;zwiększenie wydajności, brak produktów ubocznych.



Antybiotyki makrolidowe

Biosynteza erytromycynyProducent: Streptomyces erythreusPodłoża: kwas propionowy lub propanol jako prekursor i induktor

Inne – pochodne półsyntetyczne:klarytromycyna, cykliczny węglan(Davercin, opracowany w Polsce),Roksytromycyna, dirytromycyna

Erytromycyna R = HKlarytromycyna R = CH3



Biosynteza i izolacja erytromycyny

Producent: Streptomyces erythreus

Podłoże produkcyjne: Skład: glukoza i/lub skrobia, mąka sojowa lub kukurydziana, drożdże, siarczan amonu, NaCl, CaCO3, fosforany (5 – 15 mM),propanol lub kwas propionowy (dawki po 5 ml/L podłoża w pierwszej połowie procesu);

Warunki: pH: 7 –7,2, maleje do 6,0, potem rośnie do 8,0; temperatura: 30 – 32 °Cw fazie wzrostu, 28 – 32 °C w fazie produkcji. Proces biosyntezy trwa120 – 144 h, Ograniczenie represji katabolicznej poprzez dozowanieglukozy z mniejszą szybkością w idiofazie i obecność skrobi.Ograniczenie represji azotowej poprzez dodatek zeolitu, dodatek WNK

Wyodrębnianie produktu: produkt jest wydzielany pozakomórkowo; po zakończeniu biosyntezy zawiesinę pohodowlaną alkalizuje się do pH 7,5 – 8,0

lub zakwasza do pH 5,5, następnie oddzielenie grzybni na filtrzepróżniowym z dodatkiem ziemi okrzemkowej; produkt z przesączu ekstrakcją octanem butylu lub ketonem metyloizobutylowymi reekstrakcją wodą o pH 5,5; zatężenie, krystalizacja z roztworuo pH 9,5, rekrystalizacja z roztworu wodno-acetonowego, suszenie.

Alternatywnie wytrącenie z rozpuszczalnika organicznego w postacikompleksu z KNCS.Ew. oczyszczanie – chromatografia jonowymienna lub adsorpcyjna,



Statyny

Statyny – leki obniżające poziom cholesterolu wprowadzono do lecznictwa w latach 90-tych XX wieku. Należą do najczęściej stosowanych leków. Przyjmuje je na świecie około 80 milionów ludzi, a wartość ich sprzedaży wynosi około 30 miliardów dolarów. Powodują one udowodnione korzyści kliniczne, m.in. zmniejszają:

- ryzyko nowych zdarzeń sercowych, - umieralność z przyczyn sercowo-naczyniowych, - umieralność całkowitą,- konieczność wykonywania zabiegów rewaskularyzacji serca oraz częstość hospitalizacji.



N

F

N

O

HO

OHOHO

Atorwastatyna (Lipitor)

Statyny naturalne (szereg górny) i syntetyczne (szereg dolny)



Mikroorganizmy zdolne do biosyntezy statyn

Producenci statyn to grzyby strzępkowe należące do rodzajów:

- Penicillium - Aspergillus

- Monascus

Monascus ruber (lowastatyna)

Aspergillus terreus (lowastatyna)

Penicillium citrinum Penicillium citrinum ((mewastatynamewastatyna) )



Produkt uboczny biosyntezy u Aspergillus terreus - sulochryna– mykotoksyna zanieczyszczająca podłoża hodowlane, utrudniająca odzysk pożądanych metabolitów.

Eliminacja problemu na drodze inżynierii metabolicznej – usunięcie genów odpowiedzialnych za biosyntezę poliketydową antronowej pochodnej emodyny, prekursora sulochryny.

Produkcja i izolacja lowastatyny

Biosynteza w procesie okresowym z zasilaniem: fermentacja wgłębna w podłożu płynnym lub fermentacja powierzchniowa w podłożu stałym (SSF)

L,D-metionina (w różnych czasach hodowli)prekursory

żelazo, miedź, wapń, bor, cynk, magnez, molibden, mangan

mikroelementy

20%natlenienie

(+) z grupy B, np. nikotynamidwitaminy

(+) namok kukurydziany, pasta pomidorowa (podłoże wzrostowe)

(+) mleko odtłuszczone + ekstrakt drożdżowy (podłoże hodowlane)

(-) NH4+ (zakwaszają podłoże)

źródło azotu

(+) mąka owsiana (podłoże wzrostowe)(+) laktoza >100 g/l lub 48g/l, fruktoza, glicerol (podłoże

produkcyjne)(-) glukoza (szybkie przyswajanie, wyczerpywanie)

źródło węgla

L,D-metionina (w różnych czasach hodowli)prekursory

żelazo, miedź, wapń, bor, cynk, magnez, molibden, mangan

mikroelementy

20%natlenienie

(+) z grupy B, np. nikotynamidwitaminy

(+) namok kukurydziany, pasta pomidorowa (podłoże wzrostowe)

(+) mleko odtłuszczone + ekstrakt drożdżowy (podłoże hodowlane)

(-) NH4+ (zakwaszają podłoże)

źródło azotu

(+) mąka owsiana (podłoże wzrostowe)(+) laktoza >100 g/l lub 48g/l, fruktoza, glicerol (podłoże

produkcyjne)(-) glukoza (szybkie przyswajanie, wyczerpywanie)

źródło węgla

Wydajność procesu: od kilkuset mg/l do kilkunastu g/l pożywki

16,65 mg/g „dry solid” – Biocon (Indie) Aspergillus flavipes

16 g/l uzyskuje fińska firma Metkinen OY – mutanty szczepu

A. terreus ATCC20542

Warunki hodowli

Szczepy produkcyjne

Ważny jest wysoki stosunek C:N. Optymalny wynosi 40 - 50




Brzeczka pofermentacyjna pH 3,4-3,6Kwas mineralny

20 Co

Brzeczka pofermentacyjna pH 3,4-3,6

Placek filtracyjny pH 3,4-3,6

Filtracja

Układ dwufazowy

Faza organiczna

Faza organiczna

Rozpuszczalnikorganiczny

Przepuszczenie gazu oboję tnegoPodgrzanie, 50-60oC

Separacja faz

Przemycie roztworem zasadowymPrzemycie wodą

OdparowanieKrystalizacjaFiltracja i suszenie próżniowe

Surowa lowastatyna (94%) Surowa lowastatyna (94%)

OdparowanieKrystalizacjaFiltracja i suszenie próżniowe

Przemycie roztworem zasadowymPrzemycie wodą

Separacja faz

CoPrzepuszczenie gazu oboję tnegoPodgrzanie, 50-60

Faza organiczna

Faza organiczna

Układ dwufazowy




Surowa lowastatyna (94%) dichlorometan/toluen

Mieszanie, 10 min, 8-12Filtracja

Klarowny roztwórRozpuszczalnikorganiczny Węgiel aktywny

Podgrzanie, 30 min, 50-60 C

Klarowny roztwór

OdparowanieSch łodzenieFiltracja i suszenie pró żniowe

Lowastatyna oczyszczona (99%)

o

oC

Produkt poddawany jest jeszcze rekrystalizacji z izopropanolu lub acetonu

Documents

Wyklad 8