WYSOKOSPRAWNA

CHROMATOGRAFIA

CIECZOWA

materiały do ćwiczeń seminaryjno-laboratoryjnych

Materiały zebrała i przygotowała do druku:dr inŜ. Agata Kot-Wasik, Katedra Chemii Analitycznej, Politechnika Gdańska

SPIS TREŚ

CIĆwiczenie 1

Dobór warunków rozdzielania w układzie faz odwróconych dla warunków elucjiizokratycznej i gradientowej.

Dr inŜ . B. Makuch, mgr inŜ . J. Wilga, mgr inŜ . E. Gilgenast,Ćwiczenie 2

Rozwią zywanie problemów technicznych w HPLC. Retencja, selektywnoś ć ,sprawnoś ć i rozdzielczoś ć w układzie faz normalnych.

Prof. dr hab. inŜ . M. Kamiń ski, mgr inŜ . G. RomanikĆwiczenie 3

Walidacja metody analitycznej wykorzystują cej HPLC w praktyce.Dr inŜ . P. Konieczka, Dr M. Ś lebiodaĆ

wiczenie 4Rozdzielanie, identyfikacja i oznaczenie iloś ciowe zwią zków pochodzeniafarmaceutycznego w próbkach.

Dr inŜ . A. Kot-Wasik

ĆWICZENIE 1DOBÓR WARUNKÓW ROZDZIELANIA W UKŁADZIE FAZ ODWRÓCONYCH

DLA WARUNKÓW ELUCJI IZOKRATYCZNEJ I GRADIENTOWEJmgr inŜ . J. Wilga, mgr inŜ . E. Gilgenast

Pani Joanna Wilga, Ewelina Gilgenast są doktorantkami na Studium Doktoranckim przy Wydziale ChemicznymPolitechniki Gdańskiej;

jawil@wp.pl

Cel ćwiczeniaCelem ćwiczenia jest przeprowadzenie dobór optymalnych warunków rozdzielenia substancji w układziefaz odwróconych, na przykładzie ekstraktu z liści z Ginkgo bilobae.

Rysunek 1. Liś cie Ginkgo bilobae

JuŜ przed wiekami odkryto, Ŝe liście Ginkgo bilobae, tej najstarszej na świecie rośliny zawierają związkiflawonoidowe i terpenoidowe, które potrafią stymulować procesy pamięciowe mózgu, wpływająpomocniczo w zwalczaniu zaburzeń obwodu krąŜenia krwi, a takŜe w zaburzeniach pracy mózguspowodowanych zaburzeniami krąŜenia mózgowego, a rozmaite produkty zawierające Ginkgo robiąobecnie zawrotną karierę i są stosowane w postaci tabletek lub w roztworze.Ekstrakty roślinne są złoŜonymi, wieloskładnikowymi mieszaninami związków znacznie róŜniących sięwłaściwościami chemicznymi. Dobór warunków rozdzielania moŜe być procesem trudnym ipracochłonnym. Na ogół bywa, Ŝe nie jest moŜliwe rozdzielenie w układzie izokratycznym (stały składfazy ruchomej) i naleŜy stosować gradient (zmiana skokowa bądź ciągła składu fazy ruchomej).Obecnie najczęściej stosowanymi układami rozdzielania metodą Wysokosprawnej ChromatografiiCieczowej (HPLC) jest tzw. układ faz odwróconych (RP) i moŜna zaryzykować stwierdzenie, Ŝ e90%wszystkich rozdzielań wykonuje się w tych układach z zastosowaniem fazy stacjonarnej typu RP – 18tzn. Ŝel krzemionkowy modyfikowany grupą oktadecylową.

W praktyce laboratoryjnej doboru faz rozdzielania dokonuje się przez:a – zmianę składu fazy ruchomej - zmiana ilościowego udziału rozpuszczalników,b – zmianą pH fazy ruchomej,c- zastosowanie pary jonowej,e – zmiana typu fazy ruchomej.

W trakcie wykonywania ćwiczenia będą uwzględniane punkty a, b, c, e. Rozpuszczalniki stosowane jakofazy ruchomew układach RP wg ich iły elucyjnej to woda (najsłabszy) < MeOH< ACN < EtOH < THF <iPrOH < chlorek metylenu (najsilniejszy). W praktyce najczęściej stosuje się 4 – ry rozpuszczalniki wróŜnych układach tj. wodę, metanol, acetonitryl i tetrahydrofuran, a parametry retencji mogą byćregulowane składem fazy ruchomej.

Podstawowa zaleŜność to wzrost zawartości rozpuszczalnika bardziej polarnego w fazie ruchomej obniŜawartość współczynnika retencji (k).

Bywają takie problemy rozdzielcze, które moŜna rozwiązać poprzez zamianę rozpuszczalnika w fazieruchomej; moŜna np. zamienić metanol na tetrehydrofuran. Przy załoŜeniu stałej siły elucyjnej fazyruchomej korzysta się z prostej zaleŜności:

ST = ΣΣΣΣ Siθθθθigdzie:ST – całkowita siła elucyjna fazy ruchomej,Si – siła elucyjna rozpuszczalnikaθi – udział molowy rozpuszczalnika w fazie ruchomej.

Przykład: mamy skład fazy ruchomej MeOH : H2O w stosunku objętościowym 7:3. Wówczas całkowitąsiłę elucyjną fazy ruchomej liczymy wg powyŜszej zaleŜności otrzymując:

ST = SMeOHθθθθ + SH2Oθθθθ = 2,6 x 0,7 + 0 x 0.3 = 1,82

Gdy zastąpimy metanol tetrahydrofuranem przy załoŜeniu takiej samej siły elucyjnej fazy ruchomej toobliczenie jest następujące: 1,82 = 4,5 x X + 0 x X → ok. 40

czyli nowy skład fazy ruchomej będzie następujący THF : H2O 4: 6 (v/v).

Innym sposobem doboru warunków rozdzielania jest zmiana pH fazy ruchomej. W przypadkurozdzielania związków o charakterze słabych kwasów, fazę ruchomą zakwaszamy, zaś w przypadkurozdzielania słabych zasad fazę ruchomą alkalizujemy. Efektem takich zabiegów jest wzrostwspółczynnika retencji co w konsekwencji prowadzi do rozdzielenia związków, które zbyt szybkoopuszczają kolumnę chromatograficzna. Zmiana pH powoduje cofnięcie dysocjacji.

W układach RP mogą być stosowane równieŜ inne typy faz stacjonarnych np. RP – 8, rzadziej RP– 2, jak równieŜ Ŝel modyfikowany grupa cyjanową lub fenylową. W kaŜdym przypadku kolejność elucjijest następująca: pierwsze eluują substancje polarne (hydrofilowe)a w dalszej kolejności substancjeniepolarne (hydrofobowe). W przypadku rozdzielania węglowodorów czas elucji jest zaleŜny od długościłańcucha fazy związanej z Ŝelem krzemionkowym.

WYKONANIE ĆWICZENIA

W trakcie ćwiczenia dobierane będą optymalne warunki rozdzielenia substancji czynnych w ekstrakcieGinkgo bilobae, w układzie faz odwróconych.

Pomiar wykonany zostanie w warunkach izokratycznych,; przy mierzonej długości fali λ = 330 nm.

Wykorzystywane kolumny chromatograficzne:

- LiChrospher RP-18

- Kolumna cyjanowa

Wykorzystywane fazy ruchome:

- MeOH : H2O (7:3 v/v)

- MeOH : H2O (9:3 v/v)

- MeOH: H2O (7:3 v/v) z dodatkiem H3PO4 (1%)

- THF:H2O (4:6 v/v)

- THF:H2O (4:6 v/v) z dodatkiem H3PO4 (1%)

- MeOH: H2O (7:3 v/v) z dodatkiem H3PO4 (0,1%)

- THF:H2O (4:6 v/v) z dodatkiem H3PO4 (0,1%)

Parametry aparatury

• Detektor UV/DAD L – 7450 firmy Merck HITACHI

• Pętla dozująca 20µl

• Dozownik Rheodyne 7125

• Pompa L – 6200 firmy Merck HITACHI

Notatki własne

ĆWICZENIE 3WALIDACJA METODY ANALITYCZNEJ WYKORZYSTUJĄCEJ HPLCDr M.

Ślebioda, dr inŜ . P. Konieczka

Pan Marek Ślebioda jest pracownikiem Perlan Technologies Polska Sp. z o.o.ul. Puławska 303, 02-785 Warszawa;www.perlan.com.plPan Piotr Konieczka jest pracownikiem Katedry Chemii AnalitycznejWydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;kaczor@chem.pg.gda.pl

Cel ćwiczeniaCelem ćwiczenia jest zapoznanie uczestników z moŜliwością automatyzacji przygotowania, wykonania iopracowania testów związanych z walidacją metody chromatograficznej. Przeprowadzone zostaniewyznaczenia granicy oznaczalności (LOQ) i wykrywalności (LOD) kilku związków zawartych wmieszaninie w oparciu o metodę krzywej wzorcowej. Ogólny opis wymagań dotyczących walidacji metodchromatograficznych moŜna znaleźć w odpowiednich artykułach ciał normalizujących ten proces. Skrótzawarty jest w publikacji [1].

Podstawowe definicje

Granica wykrywalności jest zdefiniowana jako ilość (lub stęŜenie) analitu dająca odpowiedz yDL znacząco róŜną(trzy odchylenia standardowe sB) od szumu tła yB:

(1) BBDL syy 3=−Pomimo moŜliwosci zastosowania obliczeń elektronicznych bezpośredni pomiar yB oraz sB jest zwykle w metodachchromatograficznych niedogodny i niedokładny ze względu na małe wielkości mierzone. Wartość sB moŜe byćzastąpiona przez oszacowanie błędu standardowego se z krzywej regresji ilość analitu względemodpowiedzi:

(2) ( )

η−−=

n

yys estobs

e

2

gdzie yobs jest wartością obserwowanąyest jest wartością obliczoną z krzywej kalibracyjnejn jest liczbą punktów kalibracyjnychη dla regresji liniowej wynosi 2

W punkcie odpowiadającym granicy wykrywalności yDL = A·CDL + yB, gdzie CDL jest ilością analitu odpowiadającągranicy wykrywalności oraz A jest czułością analityczna (nachyleniem prostej regresji). Łączącte równania otrzymuje się:

(3) A

sC e

DL

3=

Jako granicę oznaczalności moŜna uwaŜać najmniejszą ilość analitu, która daje się oznaczyć z wystarczającąprecyzją (dziesięć odchyleń standardowych sB). Stosując oszacowanie błędu na podstawie linii regresji moŜna jąobliczyć jako:

(4) A

sC e

QL

10=

Program obliczeniowy

Do projektowania walidacji, zbierania danych i wykonania obliczeń zastosowany zostanie automatyczny programobliczeniowy Method Validation Pack [i] współpracujący z programem sterującym chromatografem. Po zebraniudanych i ich ocenie moŜna w programie Method Validation Pack wygenerować automatycznie raport końcowyzawierający wyniki analizy statystycznej. Dostępne w programie wzorce walidacji pozwalają na szybkąkonfigurację testów zgodnie z zaleceniami ICH Q2A/2B, USP, EP, DIN oraz FDA. Istnieje moŜliwość dołączeniado raportu z walidacji elektronicznych wersji standardowych procedur operacyjnych oraz innych dokumentówzwiązanych z procesem walidacji. Sposób działania programu przedstawiony jest schematycznie na rysunku 1.

Rysunek 1. Wymiana informacji w programie Method Validation Pack

Sprzę t i odczynniki

Aparatura

• Zestaw do wysokosprawnej chromatografii cieczowej składający się z pompy gradientowej, automatycznegopodajnika próbek, termostatu kolumn i detektora UV-Vis [2].

• Kolumna chromatograficzna ZORBAX Eclipse XDB-C8, dp=5µm, 4.6x150mm [3].• Zestaw sterujący zawierający programy ChemStation [4], ChemStore [5] oraz Method Validation Pack [6].Odczynniki

• Metanol, do HPLC• Woda, Mili-Q• Próbka testowa „Isocratic standard” [7] zawierająca 0.15%w/w ftalanu dimetylowego, 0.15%w/w ftalanu

dietylowego, 0.01%w/w bifenylu i 0.03%w/w orto-terfenylu w metanolu.Metoda analityczna

Oznaczenia zostaną przeprowadzone przy pomocy izokratycznej metody chromatograficznej z detekcją UV-Vis.• Faza ruchoma: metanol + woda (80+30)v/v• Przepływ fazy ruchomej: 1.5 ml/min• Temperatura: 25ºC• Objętość próbki: 5 µl• Detekcja: 254/10 nm (jednowiązkowa)

Przebieg ć wiczenia

Planowanie walidacji

Zakres badań, jakie podejmuje laboratorium w trakcie walidacji nowej, zmodyfikowanej lub nie stosowanejdotychczas metody, zaleŜy od istniejącego statusu metody i kompetencji laboratorium. W trakcie walidacji metodytrzeba zdefiniować parametry, granice akceptacji i częstotliwość rutynowych testów przystawalności lub bieŜącejkontroli jakości analitycznej metody. NaleŜy takŜe określić kryteria wskazujące, kiedy metoda jest poza granicakontroli statystycznej. Laboratorium prowadzące walidacje metody powinno w pełni udokumentować kompletnośćprocesu walidacji.W trakcie ćwiczenia pokazany zostanie sposób dołączania elektronicznych wersji dokumentów do raportu zwalidacji generowanego przez program Method Validation Pack. Jako przykładowy dokument zostanie uŜyty opismetody chromatograficznej wydrukowany z programu sterującego ChemStation do pliku w formacie pdf.

Identyfikacja pików chromatograficznych

Podstawą działania programu Method Validation Pack jest rozpoznanie pików chromatograficznych związków, dlaktórych mają być prowadzone testy walidacyjne. W tym celu zostanie przeprowadzona analiza wzorca onajmniejszym stęŜeniu (wzorzec 1). Chromatogram z tej analizy będzie podstawą do ustalenia parametrów integracjii identyfikacji pików chromatograficznych. Szczegółowe instrukcje dotyczące sprzętu i programu poda prowadzącyćwiczenie.• NaleŜy uruchomić program ChemStation bez podłączenia do bazy danych:

• Następnie naleŜy wczytać metodę chromatograficzą MV_lab.m, wypełnić dane dotyczące próbki wpisująckatalog Grupa_x i nazwę pliku danych Test_x (gdzie x jest numerem grupy ćwiczeniowej).

• Otrzymany chromatogram powinien być zbliŜony do przedstawionego na rysunku 2.

min1 2 3 4 5 6

mAU

0

20

40

60

80

100

DAD1 A, Sig=254,4 Ref=550,100 (DEMO\005-0101.D)

0.7

47

1.0

21

2.5

65

5.8

37

Rysunek 2. Typowy chromatogram próbki „isocratic standard”

• NaleŜy przeprowadzić automatyczny dobór parametrów integracji pików chromatograficznych

Ze wzglę du na ramy czasowe, w trakcie ć wiczenia nie bę dą omawiane sposoby doboru parametrów integracji

i ich wpływ na wyniki iloś ciowe oznaczenia.

• Do tabeli kalibracyjnej trzeba wprowadzić nazwy związków i odpowiadające im ilości.

• Na koniec naleŜy zapisać metodę chromatograficzną pod zmienioną nazwą: File -> Save as... -> Method ->Grupa_x.m

Utworzenie pliku walidacji w programie Method Validation Pack

Przygotowanie testów walidacyjnych oraz dokumentacji zostanie wykonane w programie Method Validation Pack.PoniŜej opisane są skrótowo niezbędne kroki. Dokładnych wskazówek udzieli prowadzący ćwiczenie.• NaleŜy uruchomić program Method Validation Pack podłączając się do bazy danych MV_lab.mdb jako

uŜytkownik admin (hasło admin).

• W następnym kroku trzeba utworzyć nową walidację Grupa_x

• Zaznaczając prawym okiem myszy nazwę walidacji moŜna zmienić jej parametry ogólne. Po pierwsze naleŜyustalić, czy wymagany jest podpis elektroniczny zgodnie z normą 21CFR 11? W ramach ćwiczeń to wymaganienie będzie stosowane.

• Do projektu walidacji zostanie dołączony przykładowy dokument zewnętrzny (parametry metodychromatograficznej wyeksportowane z programu ChemStation). W rzeczywistości powinny to być odpowiedniedokumenty związane z walidacją, takie jak opis projektu, standardowe procedury operacyjne i inne. ProgramMethod Validation Pack dołączy je automatycznie do raportu końcowego i będzie przechowywał elektroniczniepowiązania dokumentów. W tym celu naleŜy wybrać kolejno opcje: External Documents -> Add i wybrać zkatalogu Hpchem / 1 /Temp dokument Metoda.pdf.

• Parametry testów statystycznych stosowanych podczas walidacji moŜna dostosować wybierając opcjęConfiguration i odpowiednią zakładkę. W trakcie ćwiczenia będą uŜywane ustawienia domyślne.

• W oknie dialogowym Properties moŜna równieŜ wpisać domyślne nagłówki, które będą obowiązywały dlacałej walidacji, wybierając opcję Default Header Data.

Wę zły walidacji

Węzłami walidacji są nazwy związków obecnych w analizowanej mieszaninie, do których będą przyporządkowanetesty walidacyjne. Uwaga: nazwy węzłów muszą ściśle odpowiadać nazwom związków w tabeli kalibracyjnejwalidowanej metody zadeklarowanym poprzednio w programie ChemStation.

• Węzeł moŜna utworzyć zaznaczając prawym okiem myszy nazwę walidacji i wybierając opcję AddComponent...

• Po wpisaniu nazwy węzła trzeba wybrać rodzaj testu walidacyjnego, czyli w tym ćwiczeniu Limit of detection /quantitation

• W kolejnych krokach moŜna dodać następne węzły.• Szczegółowe planowanie kaŜdego testu moŜna rozpocząć po zaznaczeniu tego testu prawym okiem myszy i

wybraniu opcji Planning. W czasie ćwiczenia instruktor zasugeruje sposób wypełnienia pojawiającej się tablicydialogowej.

Ustawienia globalne

Przed przystąpieniem do eksportowania zadań z programu Method Validation Pack do programu ChemStationsterującego sprzętem dobrze jest sprawdzić i skorygować ustawienia globalne dotyczące sposobu traktowaniadanych źródłowych oraz wyglądu raportu.• Wybierając menu rozwijalne Utilities -> Options oraz odpowiednie zakładki moŜna edytować ogólny sposób

działania programu Method Validation Pack. W trakcie ćwiczenia zostanie sprawdzony i odpowiednioustawiony sposób traktowania danych źródłowych w zakładce C/S (ChemStore).

Eksport badania do bazy danych

Ostatnim zadaniem podczas planowania walidacji jest eksport zadań do bazy danych, z której mogą być wdogodnym czasie wczytane do programu ChemStation.• Po wybraniu opcji Create Study and MVS for ChemStation Plus w polu MVS Status uruchomiony zostanie

kreator eksportu badania. Odpowiednie kroki działania tego kreatora zostaną omówione w czasie ćwiczenia.

Import zadania do programu ChemStation

Przed rozpoczęciem wczytywania zadania do programu sterującego ChemStation uŜytkownik tego programu musibyć podłączony do odpowiedniej bazy danych.• W programie ChemStation naleŜy wybrać Database Logon... , wybrać bazę danych MV_lab i wpisać hasło

• Po podłączeniu do bazy danych moŜna przeprowadzić import sekwencji wygenerowanej w programie MethodValidation Pack

• Sekwencja jest wykonywana w programie ChemStation, a wyniki są zapisywane w bazie danych.Import danych do programu Method Validation Pack

Program Method Validation Pack moŜe pobierać wyniki oznaczeń z danych programu ChemStation, importować jez róŜnych formatów plików oraz mogą one być wprowadzane ręcznie.W trakcie ćwiczenia zostanie przeprowadzony:• Import danych uzyskanych po wykonaniu sekwencji w programie ChemStation• Import danych z pliku w formacie Excel• Ręczne uzupełnienie danychSzczegóły poda prowadzący ćwiczeniaRaport z walidacji metody

W ramach ćwiczenia zostanie pokazany sposób generowania ogólnego lub częściowego raportu z walidacji metodyw programie Method Validation Pack

Literatura

1. M. Ślebioda, Walidacja metod chromatograficznych, Perlan Technologies (2004)2. Agilent Technologies Inc., numer produktu G2184AA3. Agilent Technologies Inc., seria 11004. Agilent Technologies Inc., numer produktu 993967-9065. Agilent Technologies Inc., numer produktu G2070AA6. Agilent Technologies Inc., numer produktu G2181BA7. Agilent Technologies Inc., numer produktu 01080-68704

Notatki własne

ĆWICZENIE 3WALIDACJA METODY ANALITYCZNEJ WYKORZYSTUJĄCEJ HPLCdr inŜ . P. Konieczka

Pan Piotr Konieczka jest pracownikiem Katedry Chemii AnalitycznejWydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;kaczor@chem.pg.gda.pl

1. Na podstawie wyników pomiarów dla krzywej kalibracyjnej (wykorzystując program

Excel) obliczyć:

a. Wartości średnie wyników dla danego poziomu zawartości wraz z wartościami

odchyleń standardowych, wyniki umieścić w poniŜszej Tabeli 1.

Tabela 1

Roztwórwzorcowy/stęŜenie

Rw 1 Rw 2 Rw 3 Rw 4 Rw 5 Rw 6 Rw 7

12Sygnał3

ŚredniaOdchylenie standardoweCV, %

b. Podać wartości powtarzalności

..................................................................................................................................

..................................................................................................................................

c. Wykreślić krzywą kalibracyjną na podstawie wszystkich punktów pomiarowych

(dane wprowadzić do przygotowanego arkusza).

d. Przedyskutować liniowość.

....................................................................................................................................

e. Na podstawie wykresu wyznaczyć wartość niepewności kalibracji dla średniej

wartości stęŜenia.

..................................................................................................................................

f. Wykreślić krzywą kalibracyjną na podstawie punktów pomiarowych

odpowiadającym trzem najmniejszym stęŜeniom (dane wprowadzić do

przygotowanego arkusza).

g. Wyznaczyć (w oparciu o parametry krzywej kalibracyjnej) wartość LOD na

podstawie odchylenia standardowego:

i. Wyrazu wolnego sa ..............................................................

ii. Resztkowego sxy ...................................................................

iii. Dla roztworów wzorcowych o najmniejszym stęŜeniu ..............................

h. Podać zakres pomiarowy.

..................................................................................................................................

i. Otrzymane wartości parametrów walidacyjnych wprowadzić do Tabeli 2.

Tabela .2

Parametr walidacyjny Warto ść

Powtarzalność

Liniowość

LOD

LOQ

Zakres pomiarowy

Niepewność

0

10

20

30

40

50

60

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

Notatki własne

ĆWICZENIE 2ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW TECHNICZNYCH W HPLC. RETENCJA,SELEKTYWNOŚĆ, SPRAWNOŚĆ I ROZDZIELCZOŚĆ W UKŁADZIE FAZ

NORMALNYCH.Prof. dr hab. inŜ . M. Kamiń ski, mgr inŜ . G. Romanik

Pan Marian Kamiński jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej

Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;

mknkj@wp.plPani GraŜyna Romanik jest doktorantką na Studium Doktoranckim przy Wydziale ChemicznymPolitechniki Gdańskiej.

Cel ćwiczeniaCelem ćwiczenia jest zapoznanie się z najstępującymi zagadnieniami: geneza oraz sposobyrozwiązywania problemów, spotykanych w praktyce i dotyczących kolumny, dozowania, detekcji, elucjigradientowej; zasady postępowania w celu doboru warunków rozdzielania w układach NP-HPLC;metodyka zastosowania chromatografii Ŝelowej (GPC, SEC) do oznaczania rozkładu masy molekularnejpolimerów; obserwacja przebiegu rozdzielania barwnych substancji w kolumnie HPLC.

Streszczenie przebiegu ćwiczenia

1. Zapoznanie Uczestników z alternatywnymi sposobami postępowania, zapewniającymi zapobieganie /eliminację problemów spotykanych w praktyce i dotyczących:

- doboru/oceny selektywności, sprawności, rozdzielczości i przepuszczalności kolumny,- dozowania bardzo małych i bardzo duŜych objętości próbki oraz doboru odpowiedniego

rozpuszczalnika roztworu dozowanego do kolumny,- doboru właściwej metody detekcji oraz najkorzystniejszych warunków pracy najwaŜniejszych

detektorów stosowanych w HPLC (UV-VIS, RI, FLD),- problemów spotykanych w warunkach elucji gradientowej i sposobów ich eliminacji /

minimalizacji : zanieczyszczenie składników eluentu, obecność rozpuszczonego powietrza wcieczach stanowiących składniki eluentu, niedoskonałość systemu synchronizacji pracy zaworówproporcjujących i cyklicznej pracy pompy, nieodpowiednie parametry mieszalnika, „demiksja”składników eluentu w warunkach programowania składu cieczy eluującej, wytrącanie sięskładników próbki w eluencie o niskiej sile elucyjnej i innych.

2. Przykład wpływu składu eluentu na retencję i selektywność rozdzielania: chlorofili i karotenoidówzawartych w ekstrakcie roślinnym, albo produktów naftowych, albo mieszanin innych substancji nisko iśrednio polarnych (do wyboru przez uczestników grupy) oraz przedstawienie i przedyskutowanie zakresuzastosowania detektora UV-VIS/DAD do zastosowań jakościowych oraz do określania tzw. „czystościpików”;

3. Przedstawienie metodyki zastosowania chromatografii Ŝelowej do oznaczenia rozkładu masymolekularnej polimeru - kalibracja „nisko-dyspersyjnymi” standardami polimeru, a następnie oznaczenierozkładu masy cząsteczkowej próbki polimeru (styropian, sztućce, albo fragment obudowystyropianowej).

4. Wizualna obserwacja przebiegu rozdzielania chlorofili i karotenoidów w kolumnie szklanej wwarunkach NP-HPLC z detekcją UV-254, rejestracją w trybie Y-t. oraz kolekcją frakcji – przykładpreparatywnego zastosowania HPLC w skali „modelowej”.

Materiały, aparatura, oprogramowanie

Składniki eluentu: n-heksan, n-heptan, eter metylowo – tertbutylowy (MTBE), czterowodorofuran (THF),acetonitryl (ew.), wszystkie o czystości „do HPLC” („HPLC grade”), albo „do elucji gradientowej”(„gradient grade”);

Próbki i rozpuszczalniki próbek: odwodniony ekstrakt z trawy lub z liści do acetonu, „przeprowadzony”do rozpuszczalnika o składzie eluentu, albo roztwór oleju napędowego lub nafty w n-heptanie, lub w n-heksane o stęŜeniu 0,05g/ml; roztwór polimerów polistyrenowych w THF o stęŜeniach ok. 0.1 g/ml.

Aparatura i wyposaŜenie: A) Modułowy chromatograf cieczowy MERCK – HITACHI serii LaChrom(pompa HPLC, dozownik Rheodyne, kolumna 250x4mm typu CN – 100 7 um, termostat kolumny,detektor UV-VIS/DAD, detektor RI , interface, komputer, oprogramowanie „HSM”; B) Chromatografcieczowy z pompą strzykawkową, dozownik Rheodyne, detektor RI, rejestrator Y-t ; C) Bezpompowyzbiornikowy moduł zasilania kolumny pod wpływem spręŜonego azotu poprzez reduktor ciśnienia, zdozownikiem membranowym, kolumną szklaną HPLC, detektorem UV-254 i rejestratorem Y-t ; D)Chromatograf cieczowy serii „Elite” MERCK HITACHI, sterowany komputerem oraz oprogramowanierejestracji i przetwarzania danych najnowszej generacji.

Przydatne w praktyce zaleŜności obliczeniowe

1. Rozdzielczość (RS) - uzaleŜnia stopień rozdzielenia substancji od sprawności i selektywnościukładu chromatograficznego i jest wyraŜona następującym równaniem:

2

2

1

1

4 k

kNRS +

−=α

α

2. Obliczanie sprawności i innych parametrów na podstawie chromatogramu testowego:

22/1 )(54,5 l

SLH C=

2

2/1

)(54,5S

l

H

LN C ==

a

bAs =1,0

0t

Lu C=

• Obliczanie sprawności osiągalnej teoretycznie w chromatografii cieczowej niezaleŜnie odskali rozdzielania – równanie Knoxa

ννν

CAB

hteor ++= 33,0 , gdzie

pd

Hh = ;

M

p

D

ud=ν (dla dobrze wypełnionych i bardzo sprawnych kolumn: A=1, B=2, C=0,1)

Rys. Schemat, przedstawiający chromatogram testowy i sposób wyznaczania parametrów doobliczenia parametrów sprawności kolumny

Znaczenie symboli:a, b – część szerokości piku w 0,1 wysokości (patrz rys.)α - współczynnik selektywnościAs0,1 – współczynnik asymetrii piku w 0,1 wysokościA, B, C – stałe dla konkretnej kolumnyDM – współczynnik dyfuzji molekularnej substancji rozdzielanej w eluenciedp – średnica ziaren wypełnienia kolumny; wielkość ziaren wypełnienia kolumnyh- tzw. zredukowana wysokość półki teoretycznejH – wysokość wypełnienia równowaŜna półce teoretycznejhteor – wartość h otrzymana z równania Knoxak2 – współczynnik retencji substancji później eluowanejl – odległość mierzona na chromatogramie ( w warunkach elucji izokratycznej i stałego natęŜeniaprzepływu eluentu)LC – długość wypełnienia kolumnyN- liczba półek teoretycznychRS – stopień rozdzieleniaS1/2 – szerokość piku w ½ wysokościt0 – czas martwy kolumnyu - liniowa prędkość przepływu eluentu w kolumnieν - tzw. zredukowana prędkość przepływu eluentu

Uwagi i zaleceniaSugeruję, aby Uczestnicy ćwiczenia wykorzystali czas trwania ćwiczenia takŜe dla przedyskutowania zprowadzącymi i z innymi uczestnikami, problemów, z jakimi spotkali się w swojej praktyce stosowaniaHPLC.

Literatura1. Chromatografia cieczowa – praca zbiorowa pod redakcją M. Kamińskiego, CEEAM, Gdańsk

2004

2. Z. Witkiewicz – Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa 1995

Notatki własne

ĆWICZENIE 4.ROZDZIELANIA , IDENTYFIKACJA I OZNACZANIE ILOŚCIOWE ŚLADOWYCH

ILOŚCI ZWIĄZKÓW POCHODZENIA FARMACEUTYCZNEGO W PRÓBKACH.dr inŜ . A. Kot-Wasik

Pani Agata Kot-Wasik jest pracownikiem Katedry Chemii AnalitycznejWydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;agata@chem.pg.gda.pl

Cel ćwiczeniaCelem ćwiczenia jest przygotowanie krzywej kalibracyjnej metodą wzorca zewnętrznego i wewnetrzengodo oznaczenia zawartości fluoksetyny w próbce.

Charakterystyka fluoksetyny

Produkcja, leków, choć tak poŜyteczna dla ludzi i zwierząt, moŜe stać się teŜ dla nich zagroŜeniem.Stosowanie ogromnej ilości antybiotyków, hormonów, środków przeciwbólowych czy uspokajających,stanowi powaŜny problem w dzisiejszym świecie. Stąd środki farmaceutyczne podawane ludziom są wdalszej kolejności obecne w mierzalnych stęŜeniach w wodach powierzchniowych, podziemnych jakrównieŜ wodzie pitnej. Korzystanie z wody zanieczyszczonej przez pozostałości farmaceutyków,spoŜywanie produktów pochodzenia zwierzęcego zawierających pozostałości śladowe ilości leków, atakŜe ich metabolitów, zaburza równowagę w organizmie, oraz potęguje problem tak juŜ niebezpiecznegozjawiska lekooporności.

Do leków antydepresyjnych najnowszej generacji zaliczane są selektywne inhibitorywychwytu zwrotnego serotoniny. Do leków tych naleŜy m.in. fluoksetyna, którą w1988 roku wprowadziła na rynek firma Eli Lilly pod nazwą handlową Prozac®. Jednakapsułka np.: Prozac®, poza wieloma innymi składnikami, zawiera 20 mgfluoksetyny.

Oznaczenie chromatograficzne.

Techniki chromatograficzne są typowym przykładem technik opartych na pomiarze względnym czyliinaczej mówiąc na porównaniu sygnału detektora uzyskanego dla:

• próbki wzorcowej, w której znane jest stęŜenie analitu;

• próbki badanej.

W związku z tym konieczne jest przygotowanie krzywych kalibracyjnych dla wszystkich analizowanychzwiązków. Krzywe takie wyznacza się w oparciu o analizę próbek wzorcowych.

Analiza jakościowa:� Na podstawie zgodności czasów retencji analitów obecnych w próbce badanej i we

wzorcu

� Na podstawie widma UV lub/i MS

� Na podstawie zgodności stosunku sygnału dla dwóch róŜnych długości fal

A1

A2

A1/A2 = constans dla danego analitu

Analiza ilościowa

� metoda wzorca zewnętrznego

W tym celu naleŜy przygotować szereg rozcieńczeńanalitu, nastrzyknąć do układu chromatograficznego iwyznaczyć zaleŜność powierzchni piku od stęŜenia.

A następnie dokonać analizy chromatograficznej iznaleźć wartość powierzchni piku dla badanegoanalitu, po czym obliczyć stęŜenie (z krzywejkalibracyjnej y = ax + b lub z proporcji

A/C = Ax/Cx gdzie, Cx = C*Ax / A )

Chromatogramy wzorcowych roztworów substancji

o stę Ŝ eniach róznych stę Ŝ eniach.

� metoda dodatku wzorca

� metoda wzorca wewnętrznego

Jest to metoda polegająca na dodaniu do próbki znanej ilości składnika, tzw. wzorcawewnętrznego (IST), który jest jednak inny od substancji oznaczanych i nie moŜe być obecnyw analizowanych próbkach przed jego dodaniem. W celu uzyskania krzywej kalibracyjnej dokilku roztworów wzorcowych o róŜnych stęŜeniach substancji oznaczanej dodaje sięnajczęściej stałą i znaną ilość wzorca wewnętrznego. Na podstawie uzyskanychchromatogramów roztworów wzorcowych wykreśla się zaleŜność stęŜenia analitu w funkcjistosunku powierzchni piku analitu i wzorca wewnętrznego

� metoda normalizacji

y = 129,47x - 3,6134R2 = 0,9998

0

100

200

300

400

500

600

700

0 1 2 3 4 5 6Stę Ŝ enie [C]

Po

le p

ow

ierz

chn

i p

iku

[A

]

Warunki analizy chromatograficznej umozliwiają cej oznaczenie zawartoś ci fluksetyny

Elementy układu pomiarowego Rodzaj elementu i parametry pracy

Chromatograf cieczowy HPLC-UV-DAD, Agilent seria 1100

Składniki fazy ruchomej A: MeOH (0,1% TFAA) oraz B: H2O (0,1% TFAA)

Skład 40% MeOH : 60% H2OFaza ruchoma

Prędkość przepływu 0.5 ml/min

Kolumna Discovery RP Amide 15cm x 3mm, 5µm

Detektor UV – 226nm

Wielkość nastrzyku 20µl

Czas trwania analizy 20 min

Przebieg ćwiczenia:

� Przygotować roztwór wzorcowy fluoksetyny i maprotyliny o stęŜeniu 100mg/mL i nastrzyknąć.

W kolbce miarowej o objętości 50 ml umieścić 5 mg wzorca fluoksetyny [FLU] i maprotyliny

[MAP]. PoniewaŜ oba związki dobrze rozpuszczają się w metanolu, dopełnić kolbkę do kreski

tymŜe rozpuszczalnikiem, a tym samym otrzyma się wzorzec o stęŜeniu 100µg/ml.

Po uzyskaniu chromatogramu zidentyfikować związki (na podtsawie czasu retencji i widm UV).

Chromatogram HPLC-DAD-MS uzyskany w trakcie analizy roztworu wzorcowego fluoksetyny (maprotylinajest tutaj wzorcem wewnę trznym) wraz z widmami UV i MS.

220 240 260 280 300 320 340 360 380

mAU

0

50

100

150

200

250

DAD1, 9.541 (0.6 mAU,Bln) of CHECKV15.D DAD1, 12.074 (1.0 mAU, - ) of CHECKV15.D DAD1, 10.474 (291 mAU, - ) of CHECKV15.D

Długoś ć fali [nm]

A

220 240 260 280 300 320 340 360 380

mAU

0

100

200

300

400

500

600

DAD1, 6.034 (1.5 mAU, - ) of CHECKV15.D DAD1, 7.981 (4.1 mAU, - ) of CHECKV15.D DAD1, 6.714 (686 mAU, - ) of CHECKV15.D

Długo ś ć fali [nm]

B

� Sporządzenie rozcieńczeń roztworu wzorcowego fluoksetyny i maprotyliny (wzorzec

wewnętrzny;

Metodą serii rozcieńczeń w kolbkach o pojemności 10 ml wyposaŜonych w nakrętki z

tworzywa sztucznego przygotować roztwory wzorcowe o stęŜeniach: 30, 20, 10, 5, 2, 0.7,

0.3, 0.2, 0.02, 0.001 µg/ml. Z tak przygotowanych próbek do chromatografu cieczowego

wprowadzić po 20µl kaŜdego roztworu.

� Nastrzyknąć ( 3 razy) roztwór wzorcowy o najwyŜszym stęŜeniu;

� Nastrzyknąć (3 razy) roztwór o niŜszym stęŜeniu;

� Potraktować tą analizę jako analizę próbki i policzyć stęŜenie na podstawie jednego punktu (z

analizy pierwszej); zastanowić się nad źródłami błędu;

� Na podstawie analizy nr 1 oraz analizy nr 2 narysować krzywą kalibracyjną; określic jej

parametry;

� Nastrzyknąć mieszaninę o trzecim stęŜeniu (3 razy) traktując ją jako analizę próbki i policzyć

stęŜenie na podstawie dotąd otrzymanych wyników; zastanowić się nad źródłami błędów;

� Uzupełnić krzywą kalibracyjną o kolejny punkt;

� Powtórzyć schemat postępowania aŜ do uzyskania 5-7 punktowej krzywej kalibracyjnej;

Krzywa wzorcowa dla fluoksetyny otrzymana na podstawie analiz z wykorzystaniem detektora DAD

� Wyznaczyć stęŜenie fluoksetyny w roztworze o nieznanym stęŜeniu.

Notatki własne

Wszelkie prawa zastrze Ŝ one. Nieautoryzowane rozpowszechnianie całoś ci lub fragmentówniniejszych materiałów jest zabronione. Utwór nie mo Ŝ e by ć powielany ani rozpowszechniany

za pomocą urzą dze ń elektronicznych, mechanicznych, kopiuj ą cych, nagrywają cych i innych bezpisemnej zgody posiadacza praw autorskich. Wykonywanie kopii jak ą kolwiek metodą powoduje

naruszenie praw autorskich do niniejszej publikacji.