X射线晶体衍射分析X射线晶体衍射分析(X-ray Crystallography,

X-ray Diffraction Methods)

梁 毅梁 毅

(武汉大学生命科学学院)(武汉大学生命科学学院)

测定生物大分子三维结构的主要方法测定生物大分子三维结构的主要方法

完整、精确、实时(动态)地测定生物大分子三维结完整、精确、实时(动态)地测定生物大分子三维结

构的主要研究对象包括核酸、蛋白质、寡糖、脂以构的主要研究对象包括核酸、蛋白质、寡糖、脂以

及它们之间的复合物。

直接测定生物大分子三维结构的主要实验方法有:

X射线晶体衍射分析(亦称X射线结晶学或晶体结构

分析 、核磁共振波谱分析 、冷冻电镜、扫分析)、核磁共振波谱分析(NMR)、冷冻电镜、扫

描隧道显微技术(STM)和原子力显微技术(AFM)。描隧道显微技术(STM)和原子力显微技术(AFM)。

Atomic Structure Determination byAtomic Structure Determination by

X ray CrystallographyX-ray Crystallography

d/and/or

N l M i RNuclear Magnetic Resonance

Cryo-Electron MicroscopyCryo-Electron Microscopyy pyy py

X射线晶体衍射分析

X射线晶体衍射分析迄今仍然是蛋白质和核酸

三维结构测定的主要方法。

美国蛋白质数据库(PDB)存入的三维结构数据美国蛋白质数据库(PDB)存入的三维结构数据,截止目前,已经存入国际蛋白质三维结构数据库截止目前,已经存入国际蛋白质三维结构数据库

的蛋白质、核酸和糖类的三维结构已超过

156000套(其中晶体结构超过139000套，NMR结构 套，冷冻电镜结构 套 。结构12800套，冷冻电镜结构3800套)。Protein Data Bank:Protein Data Bank:http://www.rcsb.org/pdb/Welcome.do

伦琴（Röntgen）发现X射线（1895年）g及其后劳埃（Laue）发现晶体的X射线衍

射（1912年），从而开创了晶态物质结构

研究的新纪元。研究的新纪元。

1953年Per t 在当时的同晶置换原理上， 1953年Perutz在当时的同晶置换原理上，

发现了重原子同晶置换法可以解决生物大发现了重原子同晶置换法可以解决生物大

分子晶体结构测定中衍射的相位问题，从

而X射线晶体衍射分析开始踏上了自己发

展的伟大历程。展的伟大历程。

X-ray crystallographyy y g p y The first published observation of the crystallization of a protein,

h l bi f th th d b F L HR f ld i 1840hemoglobin from earthworm, was authored by F.L. HRnefeld in 1840;

The first x-ray crystallographic structural results on a globular protein

The Nobel Prize in Chemistry 1962The Nobel Prize in Chemistry 1962

molecule, myoglobin, were reported by John Kendrew in 1957.

Max Ferdinand Perutz John Cowdery

The Nobel Prize in Chemistry 1962"for their studies of the structures of globular proteins" The Nobel Prize in Chemistry 1962"for their studies of the structures of globular proteins"

Kendrew

1/2 of the prize 1/2 of the prize

United Kingdom United Kingdom

MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom

MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom g

b. 1914(in Vienna, Austria)d. 2002

b. 1917d. 1997

在1957年和1959年Kendrew和Perutz分别获得了肌

红蛋白和血红蛋白的低分辨率（6 Å和5 Å）结构，

在此期间Watson和Crick共同建立了DNA双螺旋的在此期间Watson和Crick共同建立了DNA双螺旋的

结构模型。他们的伟大成就为分子生物学奠定了基

础。础。

上述4位科学家分别获得1962年度Nobel化学奖和生上述 位科学家分别获得 年度 化学奖和生

理或医学奖。

从1957年到1967年的十年里，在溶菌酶结构之后，从1957年到1967年的十年里，在溶菌酶结构之后，

胰凝乳蛋白酶A、核糖核酸酶、核糖核酸酶S和羧

肽酶等也分别获得了高分辨率的晶体结构，表明X射线晶体衍射分析已经成为一门成熟的学科。射线晶体衍射分析已经成为一门成熟的学科。

从六十年代末进入七十年代，X射线晶体衍从六十年代末进入七十年代，X射线晶体衍

射分析从对生物大分子三维结构测定迈入

生物大分子三维结构及其生物学功能之间

关系的研究，从而它既是分子生物学研究

的有力的重要手段，同时也开始为结构生的有力的重要手段，同时也开始为结构生

物学的建立和发展创造着条件。物学的建立和发展创造着条件。

今天的X射线晶体衍射分析已经完全超越单今天的 射线晶体衍射分析已经完全超越单

纯晶体结构测定的本身，而是直接瞄准待测

结构的生物大分子的功能，瞄准那些与功能

紧密联系在一起的生物大分子复合物的晶体紧密联系在一起的生物大分子复合物的晶体

结构，如酶与底物(DNA聚合酶—DNA)、酶结构，如酶与底物(DNA聚合酶 DNA)、酶

与抑制剂(溶菌酶-(NAG)3)、激素与受体(人生长激素与其受体)、抗原与抗体(流感病毒

神经氨酶 单克隆抗体)、 与其结合蛋白神经氨酶-单克隆抗体)、DNA与其结合蛋白

(TATA box与其结合蛋白)等。(TATA box与其结合蛋白)等。

现在，X射线晶体衍射分析已被应用到测定由 现在，X射线晶体衍射分析已被应用到测定由

许多生物大分子组成的极其复杂的大分子组装许多生物大分子组成的极其复杂的大分子组装

体(Macromolecular assembly)的晶体结构，如

组成细胞骨架的微管系统(Microtubules)、由

200多种不同的蛋白质组成的细菌鞭毛(flagella)200多种不同的蛋白质组成的细菌鞭毛(flagella)和由60个不同的蛋白质分子和3条RNA链组成

的分子量高达230万的核糖体等。其中核糖体

大亚基的分析已达2 9埃分辨率，是当前X射线大亚基的分析已达2.9埃分辨率，是当前X射线

晶体结构分析的一个突破。晶体结构分析的一个突破。

现在，X射线晶体衍射分析已不再满足于静态晶体现在，X射线晶体衍射分析已不再满足于静态晶体

结构的测定，而追求与生物大分子发挥生物功能

相伴随的动态晶体结构的测定。生物大分子及其相伴随的动态晶体结构的测定。生物大分子及其

复合体的结构不是刚性的，而是有柔性的，存在复合体的结构不是刚性的，而是有柔性的，存在

着在不同层次的不同自由度的运动，它们是生物

大分子发挥生物功能的基础和条件。另一方面，

生物大分子发挥功能的过程就是和其他分子相互生物大分子发挥功能的过程就是和其他分子相互

作用的过程，也是构象变化的过程．因此生命的

结构必然是运动的结构，晶体结构分析也必须分

析晶体结构的运动。析晶体结构的运动。

射线晶体结构分析正努力在第四维时间X射线晶体结构分析正努力在第四维时间

坐标上跟踪、分辨和描述生物大分子的坐标上跟踪、分辨和描述生物大分子的

结构变化，即所谓四维晶体结构测定。结构变化，即所谓四维晶体结构测定。

由于同步辐射所提供的X射线光源可以达

到很高强度，因而可以在以秒计的时间

范围收集一套完整的衍射数据，使得在范围收集一套完整的衍射数据，使得在

以秒计的时间范围内的结构动态测定成以秒计的时间范围内的结构动态测定成

为可能。

那么，生物大分子在晶体状态下的结 那么，生物大分子在晶体状态下的结

构是否反映了在有机体内的真实结构?构是否反映了在有机体内的真实结构?

回答是肯定的。实验结果表明，大部回答是肯定的。实验结果表明，大部

分生物大分子的晶体结构( t l分生物大分子的晶体结构(crystal structure) 接近于其用核磁共振波谱structure) 接近于其用核磁共振波谱

法测得的溶液结构 (solution法测得的溶液结构 (solution structure)。structure)。

综上所述， 射线晶体衍射分析可在原子或接近原综上所述，X射线晶体衍射分析可在原子或接近原

子的水平上分析蛋白质的精细三维结构，并适用于子的水平上分析蛋白质的精细三维结构，并适用于

研究各种大小蛋白质的结构，甚至可以测定全病毒

和核糖体的结构。晶体结构提供的是静态（在一定

程度上也表现出动态），但是极为精确的一个个蛋程度上也表现出动态），但是极为精确的一个个蛋

白质分子堆积于晶体中的画面。白质分子堆积于晶体中的画面。

X射线晶体衍射曾经是蛋白质结构测定的唯一手段，

并且在现在和可见的将来仍将是原子水平上解析蛋

白质结构的最主要和最有效的手段。白质结构的最主要和最有效的手段。

The X-ray structure is not a true image

Diffraction Pattern

Single Crystal

The X-rays are scattered from a regular repeating array of molecules (a single crystal) to give a pattern,

Structural Model

( g y ) g p ,diffraction pattern that represents the macromolecular order and structure.

X-rays have the proper wavelength to be scattered by the electron cloud of an atom.y p p g y

Experimental SetupExperimental Setup

CCD cameras

最近一些年，X射线晶体衍射分析无论从结最近一些年，X射线晶体衍射分析无论从结

构测定的方法还是从结构测定所用的仪器上构测定的方法还是从结构测定所用的仪器上

都有了飞跃的发展。可变波长的同步辐射加

速器的应用使高分辨率、高质量的衍射数据

变得较为容易获得。

低温技术的广泛应用使冷冻后的蛋白质晶体低温技术的广泛应用使冷冻后的蛋白质晶体

在衍射过程中所受的辐射损害大为减小，从在衍射过程中所受的辐射损害大为减小，从

而降低了对晶体的要求并提高了数据质量。而降低了对晶体的要求并提高了数据质量。

各种形式的面探测器和CCD的出现大幅度提高了各种形式的面探测器和CCD的出现大幅度提高了

数据收集速度及精度。而各种计算机硬件和软件的

发展更为晶体学发展提供了强有力的计算工具。

如今，在相当程度上，X射线晶体衍射分析已成为如今，在相当程度上，X射线晶体衍射分析已成为

一种常规的技术手段，它可在原子或接近原子的水一种常规的技术手段，它可在原子或接近原子的水

平上分析蛋白质的精细三维结构。

3 Å以上分辨率的蛋白质精细结构可提供丰富的信

息 如特定原子的位置 它们之间的相互关系（ 如息, 如特定原子的位置, 它们之间的相互关系（ 如

氢键等）, 溶剂的亲和性及分子内柔性的变化等。氢键等）, 溶剂的亲和性及分子内柔性的变化等。