1

Xác định tên một số loài thuộc chi tre

(Bambusa Schreb.) do biến đổi hình thái ở

Việt Nam bằng kỹ thuật phân tích AND

Nguyễn Thị Thúy Hằng

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn ThS chuyên ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70

Người hướng dẫn: PGS.TS Đinh Thị Phòng

Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Nghiên cứu dạng biến đổi hình thái giữa các mẫu trong loài có phải là

của cùng một loài tre Bụng phật hoặc tre Vàng sọc hoặc tre Đùi gà không ? Tre

Bụng phật và tre Vàng sọc có phải là cùng loài B. vulgaris ? Tre Đùi gà (B.

ventricosa) có phải là sự biến danh của loài Hóp nhỏ (B. tuldoides) hay không ?

Giải trình tự nucleotide 01 vùng gen nhân (PIF) và 03 vùng gen lục lạp (trnL-trnF,

psbA-trnH và matK) cho 19 mẫu của ba loài tre Bụng phật (Bambusa vulgaris Schr.

cv Wamin McClure), tre Vàng sọc (Bambusa vulgaris Schr. ex Wendland. cv

Vittata McClure) và tre Đùi gà (Bambusa ventricosa McClure ) có sư biên đ ổi hinh

thái ở Việt Nam.

Keywords: Sinh học; Di truyền học; Phân loại thực vật; ADN

Content

MỞ ĐẦU

Từ bao đời nay cây tre là hình ảnh rất quen thuộc trong tâm trí của người Việt

Nam. Tre có mặt hầu khắp các nẻo đường đất nước và gắn bó với cộng đồng dân tộc Việt

Nam. Đặc biệt trong tâm thức người Việt, cây tre chiếm vị trí sâu sắc và lâu bền hơn cả và

được xem như là biểu tượng của con người Việt Nam. Tre là loại cây dễ trồng, sinh trưởng

nhanh, sớm khai thác, dễ chế biến và có nhiều đặc tính phù hợp với các mục đích sử dụng

khác nhau.

Tre trúc phân bố ở nhiều châu lục, trừ châu Âu. Châu Á là nơi có số lượng loài

nhiều nhất với 65 chi và 900 loài. Việt Nam nằm ở vùng nhiệt đới châu Á, với 25 chi và

216 loài trong đó chi tre (Bambusa Schreb.) có 67 loài [51], có thể nói tre ở Việt Nam rất

2

phong phú và đa dạng. Những nghiên cứu về tre đã được bắt đầu từ lâu nhưng việc phân

loại và định loại tên loài cho chi tre vẫn chưa thống nhất giữa các tác giả vì phương pháp

áp dụng chủ yếu dựa trên phương pháp hình thái. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi

mẫu vật phải có đầy đủ các đặc điểm phân loại, đặc biệt là cơ quan sinh sản mà đối với tre

thì các mẫu vật chỉ có cơ quan dinh dưỡng, hầu hết không có đặc điểm về cơ quan sinh sản

(hoa và quả) vì chu kỳ ra hoa tới vài chục năm, nếu ra hoa thì thường chỉ một lần rồi chết

vì vậy việc phân loại bằng phương pháp này gặp khó khăn. Hơn nữa, trong một số trường

hợp phương pháp phân loại bằng hình thái khó thực hiện hoặc dễ bị nhầm lẫn do mẫu

không còn nguyên vẹn hoặc bị biến đổi trong những điều kiện sinh thái khác nhau.

Hai loài tre Bụng phật (Bambusa vulgaris Schr.cv Wamin McClure) và tre Vàng

sọc (Bambusa vulgaris Schr. ex Wendland.cv Vittata McClure) có chung tên khoa học là

Bambusa vulgaris [15], bởi sự giống nhau cơ bản ở nhiều đặc điểm hình thái, nhưng là các

thứ trồng khác nhau nên giữa hai loài có một số đặc điểm khác nhau như: chiều cao thân

khí sinh (13-15 m đối với tre Vàng sọc, 4 – 6 m đối với tre Bụng phật), độ dài lóng thân

(tre Vàng sọc dài 20 – 30 cm, tre Bụng phật dài 4 – 10 cm), tre Bụng phật có dạng lóng

phồng, lóng thẳng và lóng phồng thẳng (½ thân phía dưới phồng, ½ thân phía trên thẳng),

còn tre Vàng sọc thì chỉ có dạng lóng thẳng và tròn đều. Theo các tác giả Nguyễn Khắc

Khôi (2007), Nguyễn Hoàng Nghĩa (2006) [15, 51] đều đồng ý các dạng này chỉ là biến thể

của một loài dựa trên một số đặc điểm hình thái nhưng vẫn thiếu tính xác thực vì không có

cơ quan sinh sản. Tương tự, đối với tre Đùi gà theo Lê Nguyên (1971), Nguyễn Hoàng

Nghĩa (2006) [16, 51] cho rằng tre Đùi gà có tên khoa học là Bambusa ventricosa McClure

nhưng Nguyễn Khắc Khôi (2007), Vũ Văn Dũng (2000), Dransfield và Widjaja (1995) [15,

4, 34] cho rằng tre Đùi gà là sự biến danh của loài Bambusa tuldoides (tên Việt Nam là

Hóp nhỏ). Khó khăn này không chỉ ở Việt Nam mà ngay cả trên thế giới. Vì vậy việc định

loại tên loài ở chi tre vẫn còn rất nan giải, cần có sự hỗ trợ của kỹ thuật phân tích ADN.

Phương pháp phân loại học phân tử (Molecular taxonomy) là phương pháp phân

loại chủ yếu dựa trên các kỹ thuật phân tích ADN và đã cho những kết quả khá chính xác,

giúp cho việc phát hiện loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá

đầy đủ về tính đa dạng di truyền, chủng loại phát sinh và sự tiến hóa của nhiều loài động

vật, thực vật và vi sinh vật. So với chỉ thị hình thái thì chỉ thị ADN cho độ chính xác cao

mà không lệ thuộc vào các yếu tố môi trường. Đối với thực vật, hai nhóm gen chính

3

thường được sử dụng là vùng gen nhân và hệ gen lục lạp (cpADN) là những gen rất bao

thủ trong tiến hóa. Hiện nay, trong cơ sở dữ liệu ngân hàng gen (Genbank, 2012) đã lưu

giữ 16542 trình tự nucleotide cho phân loại Họ phụ tre (Bambuso ideae), trong đó có 607

trình tự nucleotide cho chi Bambusa Schreb. trong số này rất nhiều loài cũng cớ ở Việt

Nam. Đây là nguồn dữ liệu có giá trị để chúng ta có thể khai thác và ứng dụng cho nghiên

cứu này. Đến nay, ở Việt Nam có khá nhiều công trình công bố về hiệu quả của việc giải

trình tự một số vùng gen giúp cho việc định loại tên loài ở nhiều đối tượng sinh vật [12, 22,

25], nhưng đối với các loài tre mới chỉ có Nguyễn Minh Tâm (2006) [21] đã sử dụng một

số chỉ thị isozyme để nhận dạng cho hai loài tre của Việt Nam. Mặc dù các kết quả thu

nhận chưa được nhiều nhưng cũng là cơ sở để ứng dụng phương pháp phân tích ADN góp

phần làm sáng tỏ tên khoa học cho một số loài thuộc chi tre (Bambusa Schreb.) do có sự

biến đổi hình thái ở Việt Nam.

Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định tên một

số loài thuộc chi tre (Bambusa Schreb.) do biến đổi hình thái ở Việt Nam bằng kỹ

thuật phân tích ADN”. Với các mục tiêu và nội dung nghiên cứu sau:

- Giải trình tự nucleotide 01 vùng gen nhân (PIF) và 03 vùng gen lục lạp (trnL-

trnF, psbA-trnH và matK) cho 19 mẫu của ba loài tre Bụng phật (Bambusa vulgaris Schr.

cv Wamin McClure), tre Vàng sọc (Bambusa vulgaris Schr. ex Wendland. cv Vittata

McClure) và tre Đùi gà (Bambusa ventricosa McClure ) có sư biên đ ổi hinh thai ở Việt

Nam.

- Các dạng biến đổi hình thái giữa các mẫu trong loài có phải là của cùng một loài

tre Bụng phật hoặc tre Vàng sọc hoặc tre Đùi gà không ?

- Tre Bụng phật và tre Vàng sọc có phải là cùng loài B. vulgaris ?

- Tre Đùi gà (B. ventricosa) có phải là sự biến danh của loài Hóp nhỏ (B.

tuldoides) hay không ?

4

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu tổng quát về một số loài thuộc chi tre (Bambusa Schreb.)

1.1.1. Vị trí phân loại của chi Bambusa Schreb.

Cây tre được phân bố rộng rãi trên nhiều vùng ở nước ta. Tre rất quen thuộc đối với

người Việt Nam vì tre được sử dụng rất nhiều trong tất cả các lĩnh vực liên quan đến đời

sống như nông nghiệp, công nghiệp, ngư nghiệp, thủ công mỹ nghệ…Theo phân loại cổ

điển, tre thuộc:

Giới (regnum) : Plantae

Ngành (division) : Magnoliophyta

Lớp (classic) : Liliopsida

Bộ (ordo) : Poales

Họ (familia) : Poaceae

Chi ( genus) : Bambusa Schreb.

1.1.2. Một số đặc điểm sinh học chính và giá trị sử dụng một số loài tre

1.1.2.1. Tre Bụng phật

Tên khoa học: Bambusa vulgaris Schr.cv Wamin McClure

Tên khác: Bambusa wanin Camus

Thân ngầm: mọc cụm thưa, cây cách nhau 10 – 20cm.

Thân khí sinh: cao 4 – 6m

Mo thân: bẹ mo hình thang, mặt ngoài phủ lông mềm, màu hung.

Lá: Phiến lá hình lưỡi mác hay ngọn giáo, dài 24 – 26,5cm, rộng 2,2 – 3cm

Phân bố: Nhiều nơi trong nước và thế giới.

Giá trị: Cây có dáng đẹp, lóng có hình dạng đặc biệt, thân có thể uốn thành các hình

dạng con vật và tạo cảnh theo ý muốn. Vì vậy, thường được trồng làm cảnh trong công

viên, vườn nhà. Đôi khi dùng thân làm đồ thủ công mỹ nghệ.

A B C

5

Hình 1.1. Loài tre Bụng phật dạng lóng thẳng (Bambusa vulgaris) số hiệu K.3005 (A:

đoạn thân; B: lá và C: mo)

Hình 1.2. Loài tre Bụng phật dạng lóng phồng (Bambusa vulgaris) số hiệu K.3005 (A:

đoạn thân; B: lá và C: mo)

1.1.2.2. Tre Vàng sọc

Tên khoa học: Bambusa vulgaris Schr. ex Wendland. cvVittata McClure (1961)

Thân ngầm: Mọc cụm thưa, cây cách nhau 20 – 30cm.

Thân khí sinh: Cao 8 – 15m, đường kính 8 – 12cm.

Mo thân: Bẹ mo hình thang, khi non màu lục tươi, có vân sọc dọc màu vàng, mặt

lưng mọc dày lông gai màu nâu thẫm, dễ rụng.

Lá: Phiến lá hình lưỡi mác hay ngọn giáo, dài 22 – 30cm, rộng 2,3 – 3,6cm

Phân bố: Hầu hết các địa phương trong nước đều trồng. Loài nhập nội.

Giá trị: Cây trồng làm cảnh vì thân nhẵn bóng, có màu vàng tươi, sọc dọc màu xanh

ở các lóng rất đẹp được nhiều người ưa thích. Thường trồng trong công viên, vườn nhà,

chậu cảnh. Thân có thể uốn tạo dáng rất có giá trị, ngoài ra còn làm một số công dụng

trong xây dựng nhà cửa. Mùa măng quanh năm, nhiều nhất là tháng 5, 6.

Tre Vàng sọc là một thứ trồng (cultivar) của tre Mỡ [15]. Do hình thái dễ biến đổi

theo môi trường sống nên tre Mỡ đã tạo thành nhiều thứ trồng trọt khác nhau, trong đó có

tre Vàng sọc, tre Bụng phật. Tuy nhiên, cơ sở khoa học của hiện tượng này chưa có nguồn

gốc chứng minh vững chắc. Cần phân tích ADN để làm rõ hơn (vì cùng nơi sống nhưng

vẫn có cả 3 dạng khác nhau).

A B C

A B C

6

Hình 1.3. Loài tre Vàng sọc (Bambusa vulgaris) số hiệu K.3011 (A: đoạn thân; B: lá và

C: mo)

1.1.2.3. Tre Đùi gà

Tên khoa học: Bambusa ventricosa McClure

Thân ngầm: Mọc cụm dày đặc.

Thân khí sinh: Khi mọc trong tự nhiên cao 9 – 11m, đường kính 4 – 6,2cm

Mo thân: Bẹ mo hình thang. Tai mo phát triển, mép phủ lông dài 2mm.

Lá: Phiến lá hình trứng hay ngọn giáo, dài 22 – 24cm, rộng 2,1 – 2,7cm

Phân bố: Mọc tự nhiên ở Quảng Ninh (Móng Cái), Lạng Sơn. Trồng ở Phú Thọ

(Đoan Hùng), Hà Nội (Ba Vì). Trên thế giới: phân bố ở vùng nam Trung Quốc.

Giá trị: Cây trồng làm cảnh đẹp vì có lóng hình đùi gà, thường trồng trong công

viên, vườn nhà, chậu cây... Thân còn dùng làm gậy chống.

Loài rất hiếm gặp trong tự nhiên cũng như trong trồng trọt. Khi trồng làm cảnh

thường có 2 loại thân trong một bụi cây: Một loại thân có lóng phồng to hình đùi gà ở phía

dưới (1/4 thân), phía trên có lóng thẳng (3/4 thân) và một loại thân có lóng thẳng tròn đều

trên toàn bộ chiều cao. Tỷ lệ loại lóng thẳng tới 70 – 80% trong một bụi, loại lóng đùi gà chỉ

20 – 30%. Trong tự nhiên cây to cao và hoàn toàn chỉ có cây mang lóng thẳng tròn đều, có thể

cùng loài với Hóp nhỏ (Bambusa tuldoides) [15].

Hình 1.4. Loài tre Đùi gà dạng lóng thẳng (Bambusa ventricosa) số hiệu K.3006 (A: đoạn

thân; B: lá và C: mo)

A B C

7

Hình 1.5. Loài tre Đùi gà dạng lóng phồng (Bambusa ventricosa) số hiệu K.3006 (A:

đoạn thân; B: lá và C: mo)

1.1.3. Sự biến đổi hình thái do điều kiện sống của ba loài tre nghiên cứu

Tre Bụng phật và tre Vàng sọc cùng có tên khoa học là Bambusa vulgaris [15] có

một số đặc điểm giống nhau như thân ngầm mọc cụm, thân khí sinh có đường kính 4 –

10cm, kích thước lá 22 – 30cm x 2,2 – 3,6cm; phân cành các đốt có một cành chính và một

số cành nhỏ, vách thân hơi dày (0,7 – 1,7cm). Một số đặc điểm gần giống nhau như mo

thân (hình dạng, kích thước ...). Một số đặc điểm phân biệt nhau giữa chúng là chiều cao

thân khí sinh: tre Vàng sọc cao hơn nhiều (8 – 15m) so với tre Bụng phật (4 – 6m), độ dài

lóng thân: tre Vàng sọc dài hơn nhiều lần (20 – 30cm) so với tre Bụng phật ở lóng phồng

(4 – 10cm). Lóng tre Vàng sọc thẳng, tròn đều; lóng tre Bụng phật phình to và ngắn (trừ

nửa phía trên thân và những thân cây lóng thẳng hoàn toàn). Ngoài ra, những chi tiết khác

có thể giống và khác nhau không nhiều và cơ bản như nhau (hình dạng, kích thước của bẹ

mo, phiến mo, tai mo, lưỡi mo, bẹ lá, tai lá, lưỡi lá... các đặc điểm về lông, màu sắc ...).

Theo các tác giả Nguyễn Khắc Khôi (2007), Nguyễn Hoàng Nghĩa (2006) [15, 51] đều

đồng ý các dạng này chỉ là biến thể của một loài dựa trên một số đặc điểm hình thái, nhưng

vẫn thiếu tính xác thực vì không có cơ quan sinh sản. Do đó cần có kết quả phân tích ADN

để làm sáng tỏ.

Hóp nhỏ (Bambusa tuldoides) và tre Đùi gà (Bambusa ventricosa) dạng lóng phồng

có một số đặc điểm hình thái giống nhau như thân ngầm mọc cụm dày, đường kính thân (3

– 6,2cm), độ dài lóng (28 – 33cm, trừ lóng ở sát gốc cuả tre Đùi gà ngắn hơn). Khác nhau

của 2 loài là kích thước lá (Hóp nhỏ 10 – 18cm x 1,8 – 2cm; tre Đùi gà 22 – 24cm x 2,1 –

2,7cm). Phân biệt cơ bản của tre Đùi gà với Hóp nhỏ là có các lóng phía gốc thân phồng

lên dạng đùi gà và ngắn hơn các lóng thẳng phía trên. Những đặc điểm như bẹ lá, phiến lá,

tai lá, thìa lìa của mo và lá cũng không hoàn toàn khác nhau nhiều. Ở những thân tre Đùi

A B C

8

gà có cả 2 dạng lóng cũng như cả bụi toàn thân có lóng không phồng, chiều dài lóng là như

ở Hóp nhỏ. Tre Đùi gà mọc tự nhiên hoàn toàn thân đều lóng thẳng và có lẽ giống như Hóp

nhỏ [15]. Theo Nguyễn Khắc Khôi (2007), Vũ Văn Dũng (2000), S.Drasfield và E.A.

Widjaja (1995), But & Chia (1995), Ohrnberger (1999) [15, 4, 35, 32, 52] cho rằng B.

ventricosa Mc Clure (1938) (tre Đùi gà) là sự biến danh của loài B. tuldoides Munro

(1868) (Hóp nhỏ) bởi sự giống nhau ở nhiều đặc điểm hình thái nhưng là các thứ trồng

khác nhau nên hai loài cũng có những đặc điểm khác nhau do điều kiện trồng trọt. Trái lại,

một số tác giả như McClure (1938), Lê Nguyên (1971), Nguyễn Hoàng Nghĩa (2006) [46,

16, 51]... vẫn cho 2 loài trên độc lập nhau. Vì không có hoa quả để xác định nên có thể còn

nghi vấn chúng cùng loài hay không. Cần phương pháp ADN xác định dạng Đùi gà thân

phồng và thân thẳng cũng như với Hóp nhỏ về mặt phân loại.

1.1.4. Tình hình phân bố tre trên thế giới và Việt Nam

1.1.4.1. Trên thế giới

Bảng 1. 1. Phân bố của các loài tre trúc trên thế giới [54]

Nƣớc Số chi Số

loài

Diện tích

(ha)

(ha)

Nƣớc-Vùng

lãnh thổ

thổ

Số chi Số loài Diện tích

(ha)

(ha) Trung Quốc 26 300 2.900.000 Singapore 6 23

Nhật Bản 13 237 825.000 Băngladet 8 20 6.000.000

Ấn Độ 23 125 9.600.000 Papua New Guinea 26

Việt Nam 16 92* 1.942.000 Srilanka 7 14

Myanma 20 90 2.200.000 Hàn Quốc 10 13

Indonexia 10 65 50.000 Đài Loan 40 140.000

Phillipnines 8 54 Madagaxca 11 40

Malaysia 7 44 Châu Mỹ 20 45

Thai Lan 12 41 1.000.000 Ôxtralia 4 4

Ghi chú *: Nay khoảng hơn 200 loài

1.1.4.2. Việt Nam

Là đất nước nằm ở trong vùng nhiệt đới gió mùa châu Á, Việt Nam có một hệ thực

vật rất phong phú và đa dạng, trong đó có các loài tre trúc. Ở Việt Nam có thể gặp tre từ độ

cao ngang mực nước biển ở các làng xóm thuộc vùng Tây Nam Bộ, trên các đảo thuộc

Vịnh Hạ Long đến các độ cao gần 3000m (Hoàng Liên Sơn) [33, 44]. Theo Biswas (1995)

[31] thì Việt Nam có khoảng 92 loài tre trúc của 16 chi (Bảng 1.1). Những nghiên cứu gần

đây cho thấy số lượng loài tre trúc phân bố ở Việt Nam lớn hơn rất nhiều. Theo Lê Viết

9

Lâm (2005) [42] thì Việt Nam có trên 140 loài của 29 chi và có thể còn tìm thấy các loài

mới. Năm 2006, Nguyễn Hoàng Nghĩa đã rà soát các kết quả nghiên cứu về phân loại tre

trúc ở Việt Nam kết hợp với một số nghiên cứu, khảo sát ở thực địa đã đưa ra danh sách

của 216 loài thuộc 25 chi tre trúc phân bố tự nhiên ở Việt Nam [51].

Bảng 1 .2. Hiện trạng tre trúc Việt Nam tính tới tháng 12/2004 [2]

Các loại rừng tre trúc Diện tích

(ha)

Phân chia theo chức năng (ha)

Rừng đặc

chủng

Rừng

phòng hộ

Rừng sản

xuất

Rừng tre trúc tự nhiên thuần loài 799.130 82.409 343.035 373.686

Rừng tre trúc tự nhiên hỗn loài 682.642 113.850 319.266 249.526

Rừng tre trúc trồng 81.484 285 10.186 71.013

Tổng cộng 1.563.256 196.544 672.487 694.225

1.2. Giới thiệu một số phƣơng pháp phân loại thực vật

1.2.1. Phƣơng pháp hình thái học (phân loại học truyền thống)

1.2.2. Phƣơng pháp giải phẫu so sánh

1.2.3. Phƣơng pháp hoá học

1.2.4. Phƣơng pháp phân loại phân tử

Phân loại học phân tử là phương pháp phân loại sử dụng sự khác biệt các cấu trúc

phân tử để đạt được các thông tin về mối quan hệ tiến hóa giữa các loài. Các biến đổi phân

tử đơn giản hơn nhiều so với biến đổi hình thái, vì vật chất di truyền ADN chỉ cấu thành từ

4 loại nucleotide (adenine, guanine, thymine và cytosine). Mặt khác các biến đổi phân tử ít

bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường. Vì vậy, ưu thế lớn nhất của phân loại học phân

tử là có thể phân biệt rõ ràng các đặc điểm tương đồng với các đặc điểm tương tự [30, 53].

1.3. Một số thành tựu nghiên cứu về phân loại học phân tử

Ngoài nƣớc

Tre trúc là loại cây được trồng phổ biến ở Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam … có

nhiều công dụng phục vụ cho đời sống con người nên rất được quan tâm nghiên cứu. Vì

thế cho đến nay trong cơ sở dữ liệu gen (Genbank, 2012) đã lưu giữ khoảng 16.542 trình tự

nucleotide cho phân loại Họ phụ tre (Bambusoideae), trong đó có khoảng 607 trình tự

nucleotide cho chi Bambusa, trong số này rất nhiều loài cũng có ở Việt Nam. Đối với thực

10

vật hai nhóm gen chính thường được sử dụng là gen nhân và hệ gen lục lạp (cpADN).

Chẳng hạn, Sun và cộng sự (2005) [61] đã sử dụng trình tự nucleotide ADN vùng ITS nhân

để nghiên cứu 21 loài tre thuộc các chi Bambusa, Dendrocalamopsis, Dendrocalamus,

Guadua, Leleba và Lingnania và đã giải quyết được mối quan hệ di truyền của một số loài

thuộc chi Bambusa (B. subaequalis, B. multiplex, B. emeiensis, B. chungii, B. contracta, B.

hainanensis, B. flexuosa, B. sinospinosa, B. tuldoides, B. surrecta, B. intermedia và B.

valida). Tương tự, Yang và cộng sự (2008) [67] cũng đã sử dụng trình tự ADN vùng ITS

và vùng trnL-F để nghiên cứu nguồn gốc phát sinh chủng loại của 53 loài thuộc phân họ

Bambusoideae. Kết quả nhận được đã làm sáng tỏ mối quan hệ di truyền của một số chi

khác với chi Bambusa. Năm 2010 W.L. Goh và cộng sự [37] đã xác định trình tự

nucleotide vùng gen nhân GBSSI và bốn vùng gen lục lạp: rps16-trnQ; trnC-rpoB; trnH-

psbA; trnD-T để nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa các loài tre (climbing bamboos) ở

Đông Nam Á với các loài trong chi Bambusa. Cũng trong năm 2010, Zhou và cộng sự [68]

đã sử dụng trình tự ADN của PIF để làm rõ mối quan hệ di truyền các loài thuộc phân họ

Bambusoideae. Năm 2009, Wu và cộng sự [66] đã công bố trình tự genome lục lạp đầy đủ

của hai loài tre là Dendrocalamus latiflorus và Bambusa oldhamii, với kích thước tương ứng là

139.350bp và 139.365bp.

Đây là nguồn dữ liệu có giá trị để chúng ta có thể khai thác ứng dụng cho nghiên

cứu chi này của Việt Nam.

Trong nƣớc

Các nghiên cứu về đa dạng di truyền phục vụ công tác bảo tồn đa dạng sinh học và

tái tạo nguồn gen đã được thế giới quan tâm và phát triển. Theo hướng này, các nhà nghiên

cứu trong nước cũng đã từng bước tiếp cận.

Gần đây, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di

truyền, phân loại và nhận dạng mẫu sinh vật ở Việt Nam cũng đã đạt được nhiều kết quả có

giá trị. Đối với một số loài động, thực vật là nhóm nghiên cứu của Nông Văn Hải [25] đã

dùng gen ty thể (18S rRNA) để nghiên cứu phả hệ và giám định ADN một số loài lan Hài,

cây Bình vôi, gà Lôi, cá Bạc má, cá Chim trắng, cá Hố, cá Nục sò, cá Sòng gió và đã phát

hiện ra mức độ tiến hóa của chúng. Hay nhóm tác giả của Đặng Tất Thế (2003 -2006) cũng

sử dụng các nhóm gen này để phân tích sự tiến hóa phân tử và phát sinh chủng loại của

một số loài thú, bò sát quý hiếm của Việt Nam [26]. Nhóm tác giả Vũ Thị Thu Hiền (2009)

[12] đã sử dụng vùng gen tRNA-leu để phân loại cho hai loài gỗ quý thuộc chi

Dalbergia….Tuy nhiên, đối với các loài tre, Việt Nam mới chỉ có tác giả Nguyễn Minh

11

Tâm (2006) [21] sử dụng một số chỉ thị isozyme để nhận dạng cho hai loài tre của Việt

Nam, mặc dù các kết quả thu nhận chưa nhiều nhưng cũng là cơ sở cho công tác bảo tồn đa

dạng di truyền

1.4. Hệ gen sử dụng trong nghiên cứu phân loại phân tử ở thực vật

1.4.1. Cấu trúc hệ gen lục lạp

.

Hình 1.6. Hệ gen lục lạp của hoa Nhài Jasminum nudiflorum [45]

Genome lục lạp (cpADN) thực chất là một phân tử ADN vòng, sợi đơn, mỗi gen

thường không lặp lại. Không giống như các gen nhân, các gen lục lạp chỉ mã hóa cho các

protein cần thiết cho chức năng quang hợp và bộ máy biểu hiện những protein này. Vùng

ADN không mã hóa trên hệ gen lục lạp là rất ít.

- Vùng đệm psbA – trnH

- Gen matK

- Gen trnL

1.4.2. Vùng gen nhân

- Gen PIF (P instability factor): PIF - like transposable elements là đoạn ADN có

khả năng di chuyển độc lập ngay trong nội bộ một thể nhiễm sắc hoặc từ thể nhiễm sắc này

sang thể nhiễm sắc khác, còn gọi là gen nhảy (transposon).

Với khả năng di động di chuyển vị trí, các gen nhảy tạo nên sự tổ hợp lại hệ gen

làm cho hệ gen càng đa dạng. Các gen nhảy có thể được xếp xen kẽ vào các đoạn exon, các

đoạn intron hoặc vào vùng ADN điều chỉnh của gen và tạo nên các đột biến gen rất đa

12

dạng [5, 18]. Trình tự amino acid vùng gen PIF khá bảo thủ trong cả các loài động vật và

thực vật nên thường được dùng để thiết lập mối quan hệ tiến hóa giữa các loài [68]. Trong

công bố mới đây nhất của Zhou và cộng sự (2010) [68] về việc so sánh 139 trình tự gen

PIF tách từ 44 loài tre cho thấy PIF - like transposase gen rất phổ biến, đa dạng và phong

phú ở phân họ tre (Bambusoideae), nhưng lại tương đối bảo thủ ở mức độ loài.

13

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài của luận văn được tiến hành tại Phòng Phân loại học thực nghiệm và Đa

dạng nguồn gen - Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt

Nam từ tháng 4/2011 đến tháng 8/2012.

2.2. Vật liệu nghiên cứu

2.2.1. Vật liệu

Bảng 2.1. Nguồn gốc và ký hiệu mẫu của 3 loài sử dụng trong nghiên cứu

Tên loài Tên khoa

học

Ký hiệu

mẫu

Địa điểm thu

mẫu

Một số đặc điểm

hình thái

Tre Bụng

phật

Bambusa

vulgaris

Schr.cv

Wamin Mc

Clure

K3005/5

Chợ Đồn, Bắc

Kạn

Cả thân khí sinh đều

có lóng phồng (như

Bụng phật). Bẹ mo 10-

13 cm x 10-13 cm x 8-

9 cm.

K3005/15 Tân Sơn, Hòa

Bình

K3005/16 Chí Linh, Hải

Dương

K3005/9 Châu Mộng,

Phú Thọ

Cả thân khí sinh các

lóng đều thẳng. Bẹ mo

dài hơn 15-20 cm. K3005/10 Chợ Đồn, Bắc

Kạn

K3005/12 Hà Nội

K3005/13 Ba Vì Cả thân khí sinh có

lóng phồng và thẳng. K3005/14 Ba Vì

Tre Vàng

sọc

Bambusa

vulgaris

Schr. ex

Wendland.

cvVittata

McClure

K3011/3 Ba Vì, Hà Nội Lóng thẳng và tròn

đều, vỏ thân có màu

vàng tươi xen lẫn sọc

xanh. Bẹ mo 22 cm x

15-17 cm x 8,3 cm.

K3011/4 Chợ Đồn, Bắc

Kạn

K3011/8 Tuyên Quang,

Chiêm Hóa

Tre Đùi gà B.

ventricosa

McClure

K3006/1 Thanh Ba,

Phú Thọ

Dạng thân khí sinh có

lóng phồng đều (như

đùi gà). Bẹ mo 17-19

cm x 7,8cm x 7,8 cm. K3006/2 Thanh Ba,

Phú Thọ

K3006/5 Thanh Ba,

Phú Thọ

Dạng thân có lóng

phồng và thẳng trên

cùng một thân . K3006/6 Chân Mộng,

Phú Thọ

K3006/7 Ba Vì, Hà Nội

K3006/11 Quản Bạ, Hà

Giang

Dạng thân có lóng

thẳng toàn bụi cây. Bẹ

mo dài hơn 10-15 cm K3006/12 Văn Bàn, Lào

14

Cai

K3006/14 Đồng Hỷ,

Thái Nguyên

2.2.2. Hóa chất

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu bao gồm: Các hóa chất tách chiết và tinh sạch

ADN (CTAB, EDTA, Tris-HCl, Isopropanol, ethanol, ARNase, chloroform,…); KIT tinh

sạch genomic (fermentas); bộ hóa chất PCR (Fermentas), KIT tinh sạch sản phẩm PCR

(QIAGEN Quick Gel Extraction Kit QIAGEN, Mỹ); hóa chất điện di agarose (agarose,

đệm TAE…).

2.2.3. Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: Các thiết bị chính sử dụng trong thí nghiệm: Máy PCR System 9700

(Applied Biosystem, Mỹ), máy ly tâm của hãng Hitachi (Nhật Bản), bộ điện di Nytechnich

(Anh), máy chụp ảnh gel (Cleaver, Đức), máy ổn nhiệt (Memmert, Đức). Giải mã trình tự

trên máy ABI PRISM®

3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems)…

Dụng cụ: Cối, chày sứ, thìa vô trùng, giấy thấm vô trùng, ống eppendorf 2ml và

1,5ml, pipetman, đầu côn các loại…

2.2.4. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.2. Thông tin của bốn cặp mồi dùng trong nghiên cứu

Gen Ký hiệu

mồi Trình tự nucleotide (5’– 3’)

Kích

thƣớc

lý

thuyết

(bp)

Nhiệt

độ bắt

cặp

(Tm)0C

Ghi chú

trnL-

trnF

trnLF/

trnFR

CGAAATCGGTAGACGCTACG

ATT TGAACTGGTGACACGAG 1000 55

Theo thiết

kế của

Taberlet et

al. (1990)

[62]

psbA-

trnH

psbA3'f/

trnH

GTTATGCATGAACGTAATGCTC

CGCGCATGGTGGATTCACAATCC 680 55

Mồi

psbA3’f

theo thiết

kế của

Sang et al.

(1997) [57]

Mồi trnH

theo thiết

kế của Tate

et al.

(2003) [64]

15

matK matK19F/

matKR

CGTTCTGACCATATTGCACTATG

TACGAGCTAAAGTTCTAGC 1560 50

Thiết kế

dựa trên

trình tự của

loài tre có

mã

HM448934

trên ngân

hàng

Genbank

PIF PIF5/PIF3 GGGGCTTTGGATGGAACACA

ATGGCGAGGTTGAACAACTC 450 52

Theo thiết

kế của

Zhou at al.

(2010) [68]

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch ADN tổng số

ADN tổng số được tách chiết theo protocol CTAB của Doyle và Doyle (1987) [34]

có cải tiến phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.

Bảng 2.3. Pha đệm rửa (Washing buffer)

Bảng 2.4. Đệm tách chiết (Extration buffer)

2.3.2. Thiết kế cặp mồi

Cặp mồi matK được thiết kế dựa trên trình tự nucleotide đoạn gen matK của loài

Bambusa chungii có mã HM448934 trên ngân hàng Genbank. Quá trình thiết kế được thực

hiện trên phần mềm ADNstar.

2.3.3. Nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR

Mỗi phản ứng PCR có thể tích 25µl với các thành phần: 13 µl H2O deion; 2,5 µl

buffer 10X; 1 µl MgCl2 25mM; 2,5 µl dNTPs 2,5mM; 1,25 µl mồi xuôi (10 pmol); 1,25 µl

mồi ngược (10 pmol); 0,5 µl Taq polymerase (5U/µl); 3 µl ADN (10-20ng). Phản ứng

được thực hiện trên máy PCR model 9700 (GeneAmp PCR System 9700, Mỹ).

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm: 94C trong 3 phút; tiếp sau là 35 chu kỳ

nối tiếp nhau với các bước: 94C trong 50 giây, 50 đến 55C trong 55 giây, 72C trong 45

giây; kết thúc phản ứng nhân gen ở 72C trong 10 phút, giữ sản phẩm ở 4C. Sau khi kết

thúc phản ứng, 5µ sản phẩm PCR mỗi ống sẽ được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,9%

cùng với thang ADN chuẩn 1kb. Gel agarose được nhuộm ethidium bromide 15 phút và

quan sát dưới tia UV.

2.3.5. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR

16

2.3.6. Giải mã trình tự nucleotide các đoạn ADN

2.3.7. Phân tích số liệu

17

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả tách chiết và làm sạch ADN tổng số từ các mẫu tre

Đã tách chiết và làm sạch ADN tổng số từ 19 mẫu lá của 3 loài tre Bụng phật, tre

Đùi gà và tre Vàng sọc với chất lượng ADN cao (hình 3.1) đu tiêu chuân đê thưc hiên cac

bươc tiêp theo . Kết quả đo OD cho thấy chỉ số OD260/OD280 của các mẫu luôn nằm trong

khoảng 1,8 đến 2.

Hình 3.1. Kết quả kiểm tra ADN tổng số đại diện của một số mẫu tre trên gel agarose

0,9% (Giếng 1 – 6: tre Bụng phật; giếng 7 - 9: tre Vàng sọc; giếng 10-15: tre Đùi gà)

3.2. Kết quả nhân bản trình tự ADN đích ở 01 vùng gen nhân và 03 vùng gen lục lạp

3.2.1. Kết quả nhân bản gen PIF

Hình 3.2 là kết quả đại diện cho một số mẫu nghiên cứu của ba loài Bambusa, sản

phẩm PCR có kích thước khoảng 450 bp (đúng như kích thước lý thuyết dự đoán). Chất

lượng của sản phẩm PCR được thể hiện khi điện di trên gel agarose 0,9% chỉ có một băng

duy nhất, sáng đậm, đủ tiêu chuẩn cho tách đoạn gen nhân để giải mã trình tự.

Hình 3.2. Sản phẩm PCR đại diện của một số mẫu tre phân tích với cặp mồi PIF5/PIF3

điện di trên gel agarose 0,9%. (giếng 1: K3005/5; giếng 2: K3005/9; giếng 3: K3005/13;

giếng 4: K3011/3; giếng 5: K3011/4; giếng 6: K3011/8; giếng 7: K3006/1; giếng 8:

K3006/2; giếng 9: K3006/6; giếng 10: K3006/11; M: marker phân tử 1 kb).

500 bp

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M

250bp

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

18

3.2.2. Kết quả nhân bản gen psbA-trnH

Kết quả cho thấy sản phẩm PCR trên gel agarose 0,9 % thu được có kích thước

khoảng 680 bp, kết quả này phù hợp với kích thước lý thuyết, sản phẩm chỉ cho một băng

đặc hiệu và không xuất hiện các băng phụ (hình 3.3), đủ tiêu chuẩn để tiếp tục tinh sạch và

giải mã trình tự nucleotide.

Hình 3.3. Sản phẩm PCR đại diện của một số mẫu tre phân tích với cặp mồi psbA3’f/trnH

điện di trên gel agarose 0,9%. (giếng 1: K3005/5; giếng 2: K3005/9; giếng 3: K3005/13;

giếng 4: K3011/3; giếng 5: K3011/4; giếng 6: K3011/8; giếng 7: K3006/1; giếng 8: K3006/2; giếng 9: K3006/6; giếng 10: K3006/11; M: marker phân tử 1 kb).

3.2.3. Kết quả nhân bản gen matK

Sản phẩm PCR nhân bản gen matK có kích thước đúng như kích thước lý thuyết dự

đoán. Kết quả nhân bản gen matK được thực hiện tốt nhất ở nhiệt độ gắn mồi là 500C.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M

0.75 kb0.5 kb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M

1.5 kb1 kb

19

Hình 3.4. Sản phẩm PCR đại diện của một số mẫu tre phân tích với cặp mồi

matK19F/matKR điện di trên gel agarose 0,9%. (giếng 1: K3005/5; giếng 2: K3005/9;

giếng 3: K3005/13; giếng 4: K3011/3; giếng 5: K3011/4; giếng 6: K3011/8; giếng 7:

K3006/1; giếng 8: K3006/2; giếng 9: K3006/6; giếng 10: K3006/11; M: marker phân tử 1

kb).

3.2.4. Kết quả nhân bản gen trnL - trnF

Phản ứng nhân bản vùng gen trnL-trnF được thực hiện ở nhiệt độ tối ưu là 550C.

Kết quả cho thấy, đã nhân được 1 phân đoạn đặc hiệu đúng với kích thước dự đoán, đủ tiêu

chuẩn cho nghiên cứu giải mã trình tự ADN.

Hình 3.5. Sản phẩm PCR đại diện của một số mẫu tre phân tích với cặp mồi trnL/trnF điện

di trên gel agarose 0,9%. (giếng 1: K3005/5; giếng 2: K3005/9; giếng 3: K3005/13; giếng

4: K3011/3; giếng 5: K3011/4; giếng 6: K3011/8; giếng 7: K3006/1; giếng 8: K3006/2;

giếng 9: K3006/6; giếng 10: K3006/11; M: marker phân tử 1 kb).

3.3. Kết quả giải trình tự 4 vùng gen nghiên cứu

3.3.1. Kết quả giải trình tự gen PIF

Kết quả xác định trình tự vùng gen PIF nhân cho ảnh điện di đồ với các đỉnh huỳnh

quang rõ nét, cường độ mạnh và rõ ràng (kết quả không chỉ ra ở đây). Các trình tự thu

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 kb

0.5 kb

20

được của 19 mẫu nghiên cứu được sắp xếp theo hàng (alignment) bởi phần mềm Bioedit

(hình 3.6). Sau khi loại bỏ trình tự mồi và các nucleotide so le ở hai đầu, chúng tôi đã thu

được trình tự nucleotide của cả ba loài nghiên cứu có độ dài là 444 nucleotide. Kết quả

thống kê ở hình 3.6 đã chỉ ra 7 vị trí (1, 22, 36, 291, 438, 441 và 444) đột biến thay thế hay

mất đi nucleotide khi so sánh giữa ba loài nghiên cứu. Tại vị trí nucleotide thứ 1, 36 và 291

khi so sánh giữa tre Bụng phật với tre Vàng sọc và tre Đùi gà thì (TTT) được thay bằng

(GCC), tương ứng. So sánh trình tự nucleotide giữa tre Bụng phật và tre Vàng sọc với tre

Đùi gà thì tại vị trí nucleotide thứ 22, 438 và 441 (ACT) được thay bằng (CTA), tương

ứng. Tại vị trí 444, tre Đùi gà đã không có nucleotide (A).

3.3.2. Kết quả giải trình tự vùng psbA - trnH

Trình tự vùng psbA - trnH được xác định bằng cặp mồi psbA3’f/trnHf thu được

chiều dài 620 nucleotide đối với hai loài tre Bụng phật, tre Đùi gà và 615 nucleotide đối

với loài tre Vàng sọc. Sở dĩ có sự khác biệt về kích thước giữa ba loài nghiên cứu là do có

các đột biến thay thế, mất nucleotide xảy ra trên vùng gen psbA-trnH. Sự khác nhau giữa

các vị trí nucleotide được thể hiện khi so sánh giữa tre Vàng sọc, tre Đùi gà với tre Bụng

phật thì tại vị trí nucleotide thứ 619 (C) được thay bằng (T). Trong khi đó tại vị trí 128,

129, 130, 131 và 132 thì loài tre Đùi gà đã mất đi 5 nucleotide (GTTTT), tương ứng

3.3.3. Kết quả giải trình tự vùng gen matK

Trình tự nucleotide của gen matK sau khi giải mã đã thu được kích thước là 1539

nucleotide đối với cả ba loài tre Bụng phật, tre Vàng sọc và tre Đùi gà. Đặc biệt, gen matK

là một gen mã hoá cho protein, nên sau khi giải mã trình tự nucleotide vùng gen matK

chúng tôi không tìm thấy vị trí đột biến hay sai khác nucleotide khi so sánh trình tự của cả

ba loài nghiên cứu.

3.3.4. Kết quả giải trình tự vùng gen trnL-trnF

Trình tự gen trnL-trnF được giải mã bằng cặp mồi trnLF/trnFR thu được đoạn nucleotide

có độ dài 935 nucleotide đối với loài tre Đùi gà và 933 nucleotide đối với loài tre Bụng

phật và tre Vàng sọc. Trình tự vùng gen trnL-trnF đã chỉ ra 3 vị trí đột biến chèn vào hay

21

thay thế nucleotide ở các vị trí 790, 821 và 822 (hình 3.9). So sánh giữa loài tre Đùi gà với

tre Bụng phật và tre Vàng sọc thì tại vị trí nucleotide 790 (G) được thay bằng (A). Trong

khi đó, tại vị trí nucleotide thứ 821 và 822, loài tre Đùi gà đã xuất hiện chèn thêm 2

nucleotide (CC), tương ứng.

Từ kết quả giải mã trình tự của 04 vùng gen cho ba loài nghiên cứu thuộc chi Bambusa

chúng tôi có nhận xét như sau:

Đã giải mã được 444 nucleotide thuộc vùng gen nhân (PIF) và 3094 nucleotide

thuộc vùng gen lục lạp (gen matK, gen psbA-trnH và gen trnL-trnF) cho ba loài thuộc chi

Bambusa là tre Bụng phật, tre Vàng sọc và tre Đùi gà. Đây là những nghiên cứu phân tử

đầu tiên cho ba loài thuộc chi Bambusa ở Việt Nam. Phần lớn các vị trí nucleotide thu

được có đỉnh huỳnh quang rõ nét, cường độ mạnh, nên kết quả đọc trình tự mang tính

chính xác cao, mức độ sai sót thấp. Tất cả các mẫu đều được đọc trình tự trực tiếp theo 2

chiều, nên các kết quả nhận được có độ tin cậy cao.

3.4. Mức độ tƣơng đồng nucleotide giữa các mẫu trong một loài tre nghiên cứu

Bảng 3.1. Mức độ tương đồng nucleotide giữa các mẫu của loài tre Vàng sọc phân tích với

bốn vùng gen trnL-trnF, psbA-trnH, matK và PIF

Vùng gen trnL-trnF psbA-trnH matK PIF

TT Tên loài 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

1 K3011/3 100 100 100 100 100 100 100 100

2 K3011/4 0.0 100 0.0 100 0.0 100 0.0 100

3 K3011/8 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

22

Bảng 3.2. Mức độ tương đồng nucleotide của loài tre Bụng phật và tre Đùi gà phân tích với 2 vùng gen trnL-trnF và psbA-trnH

Vùng gen trnL-trnF psbA-trnH

Tre Bụng phật (Bambusa vulgaris)

TT Tên loài 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

1 K3005/5

100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

2 K3005/9 0.0 100 100 100 100 100 100 0.0 100 100 100 100 100 100

3 K3005/10 0.0 0.0 100 100 100 100 100 0.0 0.0 100 100 100 100 100

4 K3005/12 0.0 0.0 0.0 100 100 100 100 0.0 0.0 0.0 100 100 100 100

5 K3005/13 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 100 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 100

6 K3005/14 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100

7 K3005/15 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100

8 K3005/16 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

Tre Đùi gà (Bambusa vulgaris)

TT Tên loài 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

1 K3006/1

100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

2 K3006/2 0.0 100 100 100 100 100 100 0.0 100 100 100 100 100 100

3 K3006/5 0.0 0.0 100 100 100 100 100 0.0 0.0 100 100 100 100 100

4 K3006/6 0.0 0.0 0.0 100 100 100 100 0.0 0.0 0.0 100 100 100 100

5 K3006/7 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 100 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 100

6 K3006/11 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100

7 K3005/12 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100

8 K3005/14 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

23

Bảng 3.3. Mức độ tương đồng nucleotide của loài tre Bụng phật và tre Đùi gà phân tích với 2 vùng gen matK và PIF

Vùng gen matK PIF

Tre Bụng phật (Bambusa vulgaris)

TT Tên loài 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

1 K3005/5

100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

2 K3005/9 0.0 100 100 100 100 100 100 0.0 100 100 100 100 100 100

3 K3005/10 0.0 0.0 100 100 100 100 100 0.0 0.0 100 100 100 100 100

4 K3005/12 0.0 0.0 0.0 100 100 100 100 0.0 0.0 0.0 100 100 100 100

5 K3005/13 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 100 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 100

6 K3005/14 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100

7 K3005/15 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100

8 K3005/16 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

Tre Đùi gà (Bambusa vulgaris)

TT Tên loài 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

1 K3006/1

100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

2 K3006/2 0.0 100 100 100 100 100 100 0.0 100 100 100 100 100 100

3 K3006/5 0.0 0.0 100 100 100 100 100 0.0 0.0 100 100 100 100 100

4 K3006/6 0.0 0.0 0.0 100 100 100 100 0.0 0.0 0.0 100 100 100 100

5 K3006/7 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 100 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 100

6 K3006/11 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100

7 K3005/12 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100

8 K3005/14 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

24

3.5. Kết quả so sánh trình tự nucleotide giữa loài tre Bụng phật, tre Vàng sọc và loài B.

vulgaris đã công bố trình tự trên Genbank

Bảng 3.4. Mức độ tương đồng nucleotide phân tích với cặp mồi trnLF/trnFR giữa loài tre Bụng

phật, tre Vàng sọc và loài B. vulgaris (mã số EF137524)

TT Tên loài 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 K3005/5

100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 98.1

2 K3005/9 0.0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 98.1

3 K3005/10 0.0 0.0 100 100 100 100 100 100 100 100 98.1

4 K3005/12 0.0 0.0 0.0 100 100 100 100 100 100 100 98.1

5 K3005/13 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 100 100 100 100 98.1

6 K3005/14 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 100 100 100 98.1

7 K3005/15 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 100 100 98.1

8 K3005/16 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 100 98.1

9 K3011/3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 98.1

10 K3011/4 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 98.1

11 K3011/5 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 98.1

12 B. vulgaris 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Bảng 3.5. Mức độ tương đồng nucleotide phân tích với cặp mồi psbA3’f/trnH giữa loài tre Bụng

phật, tre Vàng sọc và loài B. vulgaris (mã số GU063097)

TT Tên loài 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 K3005/5

100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

2 K3005/9 0.0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

3 K3005/10 0.0 0.0 100 100 100 100 100 100 100 100 100

4 K3005/12 0.0 0.0 0.0 100 100 100 100 100 100 100 100

5 K3005/13 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 100 100 100 100 100

6 K3005/14 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 100 100 100 100

7 K3005/15 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 100 100 100

8 K3005/16 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 100 100

9 K3011/3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 100

10 K3011/4 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100

11 K3011/5 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100

12 B. vulgaris 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

K3005/5 K3011/3 K3005/14 K3011/4 K3005/10 K3005/12 K3011/8 K3005/9 K3005/13 K3005/15 K3005/16 B. vulgarisA

K3005/5 B. vulgaris K3005/13 K3005/16 K3005/15 K3011/3 K3005/9 K3005/10 K3005/14 K3005/12 K3011/4 K3011/8B

25

Hình 3.10. Mối quan hệ di truyền đươc xây dưng băng phương phap Neighbor -Joining giưa hai

loài tre Bụng phật và tre Vàng sọc vơi loai Bambusa vulgaris trên ngân hang Genbank phân tich

vơi vung gen trnL-trnF (A) và vung gen psbA-trnH (B) ((trình tự được sử dụng để so sánh vùng

gen trnL-trnF có mã hiệu trong ngân hàng GenBank: B. vugaris (EF137524)); ((trình tự được sử

dụng để so sánh vùng gen psbA-trnH có mã hiệu trong ngân hàng GenBank: B. vugaris

(GU063097)).

3.6. Kết quả so sánh trình tự nucleotide giữa loài tre Đùi gà với loài B. ventricosa và loài B.

tuldoides đã công bố trình tự trên Genbank

Bảng 3.6. Mức độ tương đồng nucleotide phân tích với cặp mồi psbA3’f/trnH của loài tre Đùi gà

với loài B. ventricosa (mã số GU063074)

TT Tên loài 1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 K3006/1

100 100 100 100 100 100 100 99.0

2 K3006/2 0.0 100 100 100 100 100 100 99.0

3 K3006/5 0.0 0.0 100 100 100 100 100 99.0

4 K3006/6 0.0 0.0 0.0 100 100 100 100 99.0

5 K3006/7 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 100 99.0

6 K3006/11 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 100 99.0

7 K3005/12 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 99.0

8 K3005/14 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 99.0

9 B. ventricosa 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Hình 3.11. Mối quan hệ di truyền đươc xây dưng băng phương phap Neighbor -Joining giưa loài

tre Đùi gà vơi loai Bambusa ventricosa trên ngân hang Genbank phân tich vơi vung gen psbA-

K3006/2 K3006/6 K3006/14 K3006/1 K3006/5 K3006/11 K3006/12 K3006/7 B. ventricosa

26

trnH ((trình tự được sử dụng để so sánh có mã hiệu trong ngân hàng GenBank: B. ventricosa

(GU063074)).

Để làm làm sáng tỏ tre Đùi gà (B.ventricosa) và Hóp nhỏ (B. tuldoides) có cùng loài hay

2 loài độc lập, chúng tôi so sánh trình tự nucleotide của ba vùng gen trnL-trnF, psbA-trnH và

matK giữa loài tre Đùi gà với loài B. tuldoides (mã số HM448967, GU063083 và HM448937,

tương ứng) đã công bố trình tự trên ngân hàng Genbank (trình tự nucleotide vùng gen PIF cho

loài B.tuldoides hiện vẫn chưa có trên Genbank), kết quả cho thấy mức độ tương đồng nucleotide

giữa 2 loài là 99,7 % đối với vùng gen trnL-trnF (Bảng 3.7), 100% đối với vùng gen psbA-trnH

(Bảng 3.8) và 100% đối với vùng gen matK (Bảng 3.9).

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Đã nhân bản và giải trình tự nucleotide đoạn ADN ở 01 vùng gen nhân và 03 vùng gen

lục lạp cho 19 mẫu thuộc ba loài tre nghiên cứu với độ dài 444 nucleotide đối với vùng gen PIF

(nhân), 935 nucleotide đối với vùng gen trnL-trnF, 620 nucleotide đối với vùng psbA-trnH và

1539 nucleotide cho vùng gen matK.

2. Thông qua kết quả giải mã trình tự 3538 nucleotide của bốn vùng gen cho thấy, giữa

các mẫu trong cùng 1 loài tre giống nhau 100 % khi so sánh trình tự nucleotide. Như vậy cho

phép kết luận sự khác nhau về mặt hình thái giữa các dạng mẫu trong cùng một loài chỉ là do sự

biến thái theo điều kiện sống ở từng địa phương.

3. Mức độ tương đồng nucleotide giữa tre Bụng phật, tre Vàng sọc và loài B. vulgaris

trên Genbank là 98,1 % đối với vùng gen trnL-trnF (khi so sánh với loài B. vulgaris có mã số

EF137524 trên Genbank) và 100 % đối với vùng gen psbA-trnH (loài B. Vulgaris có mã số

GU063097 trên Genbank). Kết quả cho phép nhân đinh tre Bụng phật và tre Vàng sọc là cùng

loài B.vulgaris.

4. Mức độ tương đồng nucleotide giữa tre Đùi gà và B. tuldoides trên Genbank là 99,7%

đối với vùng gen trnL-trnF (HM448967), 100% đối với vùng gen psbA-trnH (GU063083) và

gen matK (HM448937). Cho phép nhận định tre Đùi gà chỉ là tên đồng nghĩa của Hóp nhỏ (B.

tuldoides).

27

KIẾN NGHỊ

1. Tre Vàng sọc và tre Bụng phật cùng thuộc loài Bambusa vulgaris. Có thể thống nhất

hai loài này bằng một tên Việt Nam chung.

2. Tiêp tuc sư dung cac vung gen khac đê co thê khăng đinh chăc chăn sư nghi ngơ giưa

tre Bung phât vơi tre Vang soc , tre Đui ga vơi loai Hop nho .

References

TIẾNG VIỆT

1. Kiều Hữu Ảnh (2007), Nguyên tắc phân loại sinh vật, Nxb khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.

2. Nguyễn Ngọc Bình, Phạm Đức Tuấn (2007), Các loại rừng tre trúc chủ yếu ở Việt Nam. NXB

Nông nghiệp, Hà Nội.

3. Lê Văn Cao (2010), Ứng dụng kỹ thuật phân tích trình tự ADN để định loại một số loài cây gỗ

quý thuộc chi trắc (Dalbergia), Khóa luận tốt nghiệp đại học, Trường Đại học Khoa học tự

nhiên Hà Nội.

4. Vũ Văn Dũng (2000), “Bambusa”, Tên cây rừng Việt Nam, NXB Nông nghiệp, tr. 270-271.

5. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, Hà Nội.

6. Nguyễn Ánh Điệp, Trần Ninh, Nguyễn Xuân Quýnh (2007), Nguyên tắc phân loại sinh vật,

NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.

7. Trịnh Đình Đạt (2003), Bài giảng Phân loại học sinh học (chuyên đề cao học), Trường Đại

học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.

8. Phạm Thành Hổ (2008), Nhập môn công nghệ sinh học, NXB Giáo dục, Hà Nội

9. Phạm Hoàng Hộ (1972), “Bambusoideae”, Cây cỏ miền Nam Việt Nam, Bộ giáo dục, trung

tâm học liệu, Sài Gòn, (2), tr. 844-869.

10. Phạm Hoàng Hộ (1993), “Bambusoideae”, Cây cỏ Việt Nam, (3), tr. 742-774.

28

11. Phạm Hoàng Hộ (2000), “Bambusoideae”, Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, Tp. Hồ Chí Minh,

(3), tr. 600-627.

12. Vũ Thị Thu Hiền, Lưu Đàm Cư, Đinh Thị Phòng (2009), “Xác định trình tự đoạn gen tRNA

–Leu cho hai loài D. tonkinensis và D. conchinchinensis phục vụ việc phân loại mẫu vật

tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam”, Tạp chí Công nghệ sinh học, (4), tr. 471-477.

13. Nguyễn Khắc Khôi, Nguyễn Thị Đỏ (2005), “Bambusoideae”, Danh lục các loài thực vật

Việt Nam, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, tr. 750-773.

14. Nguyễn Khắc Khôi (1996), “Bambusoideae”, Sách đỏ Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ

thuật, Hà Nội, tr. 306-365.

15. Nguyễn Khắc Khôi (2007), “Bambusoideae”, Danh lục đỏ Việt Nam, NXB Khoa học tự

nhiên và Công nghệ, Hà Nội, tr. 346-347.

16. Lê Nguyên (1971), Nhận biết, gây trồng, bảo vệ và khai thác Tre trúc, NXB Nông thôn, Hà

Nội.

17. Nguyễn Hoàng Nghĩa (2005), Tre trúc Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

18. Võ Thị Thương Lan (2009), Sinh học phân tử tế bào và ứng dụng, NXB Giáo dục, Hà Nội.

19. Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2009), Kỹ thuật di truyền và ứng dụng, NXB Đại học quốc

gia Hà Nội.

20. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1994), Cơ sở di truyền học, NXB Giáo dục, Hà Nội.

21. Nguyễn Minh Tâm (2006), Đa dạng di truyền của hai loài tre có giá trị kinh tế cao ở Việt

Nam, Báo cáo tổng kết dự án hợp tác với Nhật (IPGRI), Hà Nội.

22. Dương Văn Tăng (2010), Ứng dụng phương pháp phân tích ADN góp phần vào việc phân

loại một số loài gỗ quý thuộc chi Dalbergia của Việt Nam, Luận văn thạc sỹ sinh học,

Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật, Hà Nội.

23. Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý và ứng dụng, NXB Khoa học và kỹ thuật,

Hà Nội.

29

24. Phan Hải Triều (2009), Điều tra, mô tả giống tre, trúc và sản phẩm làm từ tre, trúc tại

xã Phú An và làng tre Phú An, huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dương, Khóa luận tốt

nghiệp đại học, Trường Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh.

25. Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải, “Những kỹ thuật PCR và ứng dụng trong phân tích ADN”,

Công nghệ sinh học, tập II, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

26. Đặng Tất Thế, Lê Xuân Cảnh, Nông Văn Hải (2004), “Phân tích gen ty thể giả ở voọc vá

Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, 2(1), tr. 25-32.

27. Đặng Tất Thế (2005), Phân loại voọc (colobinae) ở Việt Nam trên cơ sở tiến hóa phân tử,

Luận án tiến sĩ, Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật, Hà Nội

28. Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam (2008), Báo cáo tóm tắt kết quả các nghiên cứu về tre

trúc ở Việt Nam, Hà Nội.

30

TIÊNG ANH

29. Alvarez I, Wendel JF (2003), “Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference”,

Mol Phylogenet Evol, 29(3), pp. 34-417

30. Avise, JC (1993), “Molecular markers natural history and evolution”, Chapman & Hall,

LonDon.

31. Biswas S (1995), “Diversity and genetic resources of Indian bamboos and the strategies for

their conservation”, Rao and Rao (eds), Bamboos and Rattan Genetic Resources and Use,

IPGRI and INBAR, pp. 29-34.

32. But PPH, Chia LC (1995), “Bambusa tuldoides Munro”, In Dransfield S, Widjaja EA, (eds.),

1995, Plant Resources of South-east Asia, Bamboo 7, pp. 72-74.

33. Le Tran Chan, Ty T, Tu NH, Nhung H, Phuong DT, Van TT (1999), “Some basis characters

of Vietnam flora”. Science and Technics Publishing house.

34. Doyle JJ, Doyle JJ (1987), “A rapid ADN isolation procedure for small quantities of fresh

leaf tissue”, Phytochemical Bulletin, 19, pp. 11-15.

35. Dranhsfield S, Widjaja EA (1995), “Bamboos”, Plant Resources of South-East, Asia 7,

Backhuys Pusblishers, Leiden, pp. 189.

36. Gamble JS (1986), “Bambusee of British India”, Annals of the Royal Botanic Garden,

Calcutta, Vol. VII.

37. Goh WL, Chandran S, Lin RS, Xia NH, Wong KM (2010), “Phylogenetic relationships

among Southeast Asian climbing bamboos (Poaceae: Bambusoideae) and the Bambusa

complex”. Biochemical Systematics and Ecology, 38, pp. 764-773.

38. Hillils DM, Moitz C, Mable BK (1996), Molecular Systematics, Sinauer Associates, Inc.,

Second edition.

39. Jae HS, Park KC, Kim TW, Park YJ, Kang JH, Kim NS (2010), “Sequence diversification of

45S rRNA ITS, trnH-psbA spacer, and matK genic regions in several Allium species”,

Genes & Genomics, 32(2), pp. 165-172.

40. Kim SC, Chunghee L, Mejias JA (2007), “Phylogenetic analysis of chloroplast ADN matK

gene and ITS of rADN sequences reveals polyphyly of the genus Sonchus and new

relationships among the subtribe Sonchinae (Asteraceae: Cichorieae)”, Mol Phylogenet

Evol, 44(2), pp. 578-97.

31

41. Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Lee A, Janzen DH (2005), “Use of ADN barcodes to

identify flowering plants”, Proc Natl Acad Sci USA, 102(23), pp. 8369-8374.

42. Le Viet Lam (2005), Taxonomy of bamboo subfamilies in Vietnam, Pages 312-321 in MARD

(ed), Paper for the Conference of forest science and technology for 20 years under

renovation, 8-9/4/2005.

43. Le Viet Lam (2008), A Taxonomic Revision of the genus Bambusa (Poaceae-Bambusoideae)

from North Vietnam, A thesis submitted for the Degree of Doctoral at the graduate school

of the Chinese Academy of Sciences.

44. Vu Ta Lap (1999), Natural Geography of Vietnam, Education Puslishing House, HaNoi.

45. Lee HL, Jansen RK, Timothy W, Kim CKJ (2007), “Gene Relocations within Chloroplast

Genomes of Jasminum and Menodora (Oleaceae) Are Due to Multiple, Overlapping

Inversions”, Molercular Biology and Evolution, 24 (5), pp. 1161-1180.

46. McClure FA (1938), “Bambusa ventricosa, a new species with a teratological bent”,

Lingnan Science Journal, 17, pp. 57-63.

47. Mort ME, Levsen N, Randle RP, Jaarseld EV, Palmer A (2005), “Phylogenetics and

versification of Cotyledon (Crassulaceae) inferred from nuclear and chloroplast ADN

sequences data”, American Journal of Botany, 92 (7), pp. 1170-1176.

48. Mort ME, Soltis DE, Soltis PS, Francisco-Ortega J, Santos-Guerra A (2001), “Phylogenetic

relationships and evolution of Crassulaceae inferred from matK sequence data”,

American Journal of Botany, 88, pp. 76-91.

49. Mort ME, Soltis DE, Soltis PS, Francisco-Ortega J, Santos-Guerra A (2002), “Phylogenetic

and evolution of Macaronesian Clade (Crassulaceae)”, Systematics Botany, 27, pp. 271-

288.

50. Nei M, Kumar S (2000), Molecular evolution and phylogenetic, Oxford University Press.

51. Nguyen Hoang Nghia (2006), Bamboos of Vietnam, Agricultoral publ. House.

52. Ohrnberger D, (1999), The Bamboos of the World. Elsevier.

53. Page DM, Holmes HC (2000), Molecular evolution a Phylogenetic Approach, Blackwell

Science.

54. Rao VR, Rao AN (1995), Bamboo and Rattan, Genetic Resources and Use, Proceedings of

32

the First INBAR Biodiversity, Genetic Resources and Conservation Working.

55. Rao AN, Rao VR (1999), Bamboo and Rattan, Genetic Resources and Use, Proceedings of

the third INBAR-IPGRI Biodiversity, Genetic Resources and Conservation Working

Group, 24-27 August 1997, Sergan, Malaysia, IPGRI: 203.

56. Saitou N, Nei M (1987), “The neighbor-joining method: A new method for reconstructing

phylogenetic trees”, Molecular Biology Evolution, 4, pp. 406-425.

57. Sang T, Crawford DJ, Stuessy TF (1997), “Chloroplast ADN phylogeny, reticulate evolution,

and biogeography of Paeonia (Paeoniaceae)”, American Journal of Botany, 84(8), pp.

1120 – 1136.

58. Shaw JE, Lickey E, Beck JT, Farmer SB, Liu W, Miller KC, Winder CT, Schilling EE, Small

RL (2005), “The tortoise and the hare II: relative utility of 21 noncoding chloroplast

ADN sequences for phylogenetic analysis”, American Journal of Botany, 92, pp. 142-

166.

59. Shaw JE, Small RL (2005), “Chloroplast ADN phylogeny and phylogeography of the North

American plums (Prunus subgenus Prunus section Prunocerasus, Rosaceae)”, American

Journal of Botany, 92, pp. 2011-2030.

60. Schreber JCD (1789), Genera Plantarum, ed. Vol. 1. Frankfurt.

61. Sun Y, Xia N, Lin R (2005), “Phylogenetic analysis of Bambusa (Poaceae: Bambusoideae)

based on internal transcribed spacer sequences of nuclear ribosomal ADN”, Biochemical

Genetics, 43(11-12), pp. 12-603.

62. Taberlet P, Coissac E, Pompanon F, Gielly L, Miguel C, Valentini A, Vermat T, Corthier G,

Brochmann C, Willerslev E (2006), “Power and limitations of the chloroplast trnL

(UAA) intron for plant ADN barcoding”, Nucleic Acid Research, 35, e14.

63. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S (2007), “MEGA4: Molecular Evolutionary Genetic

Analysic (MEGA) sofware version 4.0”, Molecular Biology and Evolution,

10.1093/molbev/msm092.

64. Tate JA, Simpson BB (2003), “Paraphyly of Tarasa (Malvaceae) and diverse origins of the

polyploidy species”, Systemtatic Botany, 28, pp. 723-737.

65. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ (1994), “CLUSTAL X: improving the sensitivity of

progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific

33

gap penalties and weight matrix choice”, Nucleoic Acids Res, 22, pp. 46-80.

66. Wu FH, Kan DP, Lee SB, Daniell H, Lee YW, Lin CC, Lin NS, Lin CS (2009), “Complete

nucleotide sequence of Dendrocalamus latiflorus and Bambusa oldhamii chloroplast

genomes”, Tree Physiology, 29(6): 56 – 847.

67. Yang HQ, Yang JB, Peng ZH, Gao J, Yang YM, Peng S, Li DZ (2008), “A molecular

phylogenetic and fruit evolutionary analysis of the major groups of the paleotropical

woody bamboos (Gramineae: Bambusoideae) based on nuclear ITS, GBSSI gene and

plastid trnL-F ADN sequences”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 48(3), pp. 24-

809.

68. Zhou MB, Lu JJ, Zhong H, Liu XM, Tang DQ (2010), “Distribution and diversity of PIF-like

transposable elements in the Bambusoideae subfamily”, Plant Science, 179, pp. 257-266.