CUANTIFICACIÓN DE TIOLES LIBRES Y SUPEROXIDO

DISMUTASA (SOD) EN EXTRACTOS METANOLICOS DE

LAS PLANTAS PERTENECIENTES A LAS FAMILIAS

ASTERACEAE, EUPHORBIACEAE Y PIPERACEAE

Grupo de Biotecnología - Productos Naturales

Universidad Tecnológica de Pereira

YEIMY LIZETH BETANCUR GÓMEZ

1

TABLA DE CONTENIDO

• MARCO TEÓRICO

• JUSTIFICACIÓN

• OBJETIVOS

• METODOLOGÍA

• RESULTADOS Y DISCUSIÓN

• CONCLUCIONES

• RECOMENDACIONES

• BIBLIOGRAFÍA

• AGRADECIMIENTOS

2

1. MARCO TEÓRICO

3

COMPUESTOS ANTIOXIDANTES

Moléculas capaces deneutralizar la acción nocivade los radicales libres

Prevención

Intercepción

Reparación

4

5

Mn-SODGSH GPx

CAT

Cu-Zn SODGPxGSH

2H2O2 2H2O + O2

COMPUESTOS ANTIOXIDANTES

Sistema de defensa antioxidanteEnzimático

CATGPx

SOD 2H2O2 + O22O2●-+ 2H+

H2O2 + 2GSH H2O + GSSG

6

SOD: Superóxido dismutasa.CAT: CatalasaGPx: Glutationa peroxidasa

COMPUESTOS ANTIOXIDANTES

7

Sistema de defensa antioxidante

No Enzimático

Endógenos

Exógenos

Fitocompuestos

O

OH

OH

OH OH

O

N

H

NH

N

H

N

H

O

O

O

OH NHNH

O

NH2

O SH

O

OH

O

Ácido úrico

Glutationa

Ácido ascórbico

COMPUESTOS ANTIOXIDANTES

Antraquinonas

Fenoles

Betalainas

Cumarinas

Lignanos

Carotenoides

8

Esteroides

O

O

R1

R2

R3R6

R8

NH

O

OH O

OH

N+

R3

R2

R1

O O

CH3 CH3

CH3

CH3 CH3

CH3CH3 CH3

CH3 CH3

R1

R2R3

OH

R

R

OH

RADICALES LIBRESRadicales centrados en el Oxígeno (ROS)

Radicales centrados en el Nitrógeno (RNS)

Radicales centrados en el Carbono(RCS)

Radiaciones ionizantes

Radiación UV ContaminaciónBiológicas

Respiración mitocondrial

Oxidación peroximal de ácidos grasos

9

ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO (ROS)

O2●- Radical Superóxido

H2O2 Peróxido de hidrógeno

●OH Radical hidroxilo

10

PUFA: Ácidos grasos poliinsaturadosRCS: Especies reactivas de carbono

O2 O

2. -

1/2O2.

hv

+ e -

H +

+ e -

H +

H2O

2

+ e -

H +

+ e -

H +.OH

+ e -

H +OH

2

RCS

PUFA

INTERACCIÓN ROS Y BIOMOLECULAS

Lípidos ADN Proteínas

• Oxidación demembranascelulares

• Modificación de bases nitrogenadas

• Modificación de laestructura terciaria

• Derivados α-hidroxilados

11

TIOLES COMO AGENTES ANTIOXIDANTES

R – SHTioles

Buenos nucleófilos

Buenos nucleófilos

Importancia biológica

Enlace S-H más débil

12

TIOLES CON IMPORTANCIA BIOLÓGICA

CH3NH

O

SH

H

OH

O

N- acetil-L- Cisteina

NH

S

OH

O

Tiazolodina-4- ácido carboxilico

• Previenen formación

de carcinogénesis

• Previenen desarrollo

de tumores

• Acción antioxidante

frente al radical O2●-

, H2O2

• La destoxificación de

drogas

• Sirve de cofactor en

reacciones enzimáticas

• Evita propagación de

carcinogenesis

13

Glutationa

OH NHNH

O

NH2

O SH

O

OH

O

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD

ANTIOXIDANTE in vitro

Depende del antioxidante y del medio de reacción

Estudia de la capacidad de una molécula para secuestrar un radical libre.

• Transferencia de un átomo de hidrógeno

• Transferencia de electrones

• Secuencial perdida de protón y transferencia de electrón

14

Tabla via de reacción y metodo

ENSAYOS PARA EVALUAR ACTIVIDAD

ANTIOXIDANTEENSAYO VIA

1,1 Difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH)

Basado en la transferencia de electrones (ET)

Ácido 2,2’ azino-bis-3 etilbenzotiazolin-6-sulfonico (ABTS)

Poder reductor antioxidante del hierro (FRAP)

NN- dimetil-p fenilendiamina (DMPD)

Capacidad de reducción antioxidante del cobre (CuPRAC)

Capacidad de absorción del radical oxígeno(ORAC)

Basado en la trasferencia de átomos de hidrógeno (HAT)

Parámetro antioxidante de captura de radicales (TRAP)

Inhibición de la oxidación del ácido linoleico

Inhibición de la oxidación de lípidos de baja densidad (LDL)

15

Fitocompuestos

16

Actividades Biológicas

Actividad Antioxidante

AsteraceaeEuphorbiaceae

Piperaceae

ASTERACEAE

1700 géneros y 24000-30000 especies

Montanoa sp

Baccharis

Aspilia (Tiilesia Baccata)

ATINAS, L., GUTIÉRREZ, D. G., GROSSI, M. A., & CRISCI, J. V. (2007). Panorama de la familia Asteraceae en la Republica de Argentina.

17

EUPHORBIACEAE

317 géneros y cerca de 8100 especies

• 78 Géneros• 390

Especies

COLOMBIA

Hyeronnima macrocarpa

(UTP42)

Crotón Magdalenensis

Maya , C., & Agudelo, C. (2009). Estudio Taxonomico de la Familia Euphorbiaceae en el Quindio

18

PIPERACEAE

10 géneros y 3600 especies

Piperomia acuminata

Piper Eriopodon

Piper umbellatum

http://exa.unne.edu.ar/biologia/diversidadv/documentos/ANGIOSPERMAS/Angiospermas%20Basales%20y%20Clado%20Magnolides/Clado%20Magnolides/Piperales/Piperaceae.pdf

19

2. JUSTIFICACIÓN

20

JUSTIFICACIÓN

Estrés oxidativo

Enfermedades cardiovasculares

17 millones de muertes

Diabetes1.3 millones de

muertes

Cáncer14.1 millones de casos nuevos de cáncer y 8.2

millones muertes

O2

2012

ROS>Sistema antioxidante

21

JUSTIFICACIÓN

AntraquinonaCumarina

Flavonoides

• Tumorigénicos• Carcinogénicos

22

SHR

Tioles

O

O

O

R1

R2

R3R6

R8

O O

OHCH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

Butilhidroxitolueno (BHT)

O

CH3

CH3

CH3

CH3

OH

Butilhidroxianisol (BHA)

O RO

OH

Parabenos

JUSTIFICACIÓN

AsteraceaeEuphorbiaceae

Piperaceae

Tioles

Miméticos de SOD

23

ÁNALISIS CIENSIOMETRICO

24

Cuantificación de tioles en extractos de plantas

3. OBJETIVOS

25

OBJETIVO GENERAL

Cuantificar tioles libres y moléculas enequivalentes de SOD mediante la implementaciónde curvas de calibración con Glutationa (GSH) ySuperóxido Dismutasa (SOD).

26

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Determinar la concentración de tioles libres presentes en losextractos metanólicos de las familias en estudio implementandométodos colorimétrico.

• Evaluar la concentración de moléculas capaces de dismutar elradical Superóxido, en equivalentes de SOD presente en losextractos en estudio, que obtuvieron una concentración detioles libres considerable, mediante la implementación detécnicas fotométricas

• Determinar la capacidad captadora de radicales libres (%AA)mediante el método de DPPH• en los extractos metanólicos delas especies que presenten mayor concentración de tioles.

27

4. METODOLOGÍA

28

MATERIAL VEGETAL

Francisco Javier

Roldan

Parque Regional Natural Ucumarí

Parque Natural Regional Barbas-Bremen

29

MATERIAL VEGETAL

• Se evaluaran 32 especies pertenecientes a lasfamilias Asteraceae, Euphorbiaceae y Piperaceae

30

MATERIAL VEGETAL

FAMILIA ESPECIE FJR UTP

Asteraceae

Mikania bonistenae 3965 124

Mikania lloensis 3977 136

Aspilia (Tilesia baccata) 3974 133

Pentacalya urbanii 3963 122

Vernonia 3976 135

Citroniella 3968 127

Clibadium pentaneaen 3966 125

Baccharis 3972 131

Mikania leiostachya benth 3175 22

Quinqueneruis spp 3750 81

Montanoa sp 3749 80

Citronella acuminata 4049 195

31

MATERIAL VEGETAL

Familia Especie FJR #UTP

Euphorbiaceae

Hyeronima 3971 130

Alchornea grandis 3982 140

Alchornea calophylla 3969 128

Acalypha diversifolia 3967 126

Croton magdalenensis Mull. Arg. 3736 70

Alchornea glandulosa poepp 3742 75

Sapium stylare Mull. Arg. 3160 7

Hyeronima antioquiensis 3905 85

Acalypha paltyphylla 3910 90

Alchormea grandiflora Mull. Arg. 3727 63

Acalypha macrostachya 3738 72

Hyeronnima macrocarpa Mull. Arg 3196 42

32

MATERIAL VEGETAL

Familia Especie FJR #UTP

Piperaceae

Piper crassinervium 4021 167

Piper pesaresanum 3996 148

Piper umbellatum 4012 163

Piperomia acuminata 4002 154

Piper eriopodon 4007 158

Piper glanduligerum 4026 172

Piper calceolarium 4048 194

Piper Daniel-gonzalezii 4051 197

33

OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS

VEGETALES

Parte aérea 50°C x 72 h

Metanol >DCM>Hexano

Polaridad

34

Rotulados y almacenados a 4°C

METODOLOGÍA

35

Blanco fotométrico

Blanco de la muestra

Estrategia de evaluación fotométrica para los ensayos In vitro

CUANTIFICACIÓN IN VITRO DE TIOLES

LIBRES POR EL ENSAYO DE ELLMAN

412 nm

36

N+ O

-O

S

S

O

OHN

+O

-

O

O

OH

S-

R1

N+ O

-O

S

S

R1

S-

O

O-

NOH

OH

S-

R2

S

S

R1

R2

S-

O

O-

NOH

OH

+ + 2

Ácido 5-5' Ditiobis 2-Nitrobenzoico (DTNB)

2-nitro-5-tiobenzoato (TNB)

TNB

37

CUANTIFICACIÓN IN VITRO DE TIOLES

LIBRES POR EL ENSAYO DE ELLMAN

Espectrofotómetro Microplacas

MULTISKAN GO THERMO SCIENTIFIC

𝐴𝑏𝑠𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 = 𝐴𝑏𝑠𝑀𝑒𝑧𝑐𝑙𝑎 − 𝐴𝑏𝑠𝐵𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 𝑀 − 𝐴𝑏𝑠𝐵𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 𝐹

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =𝐴𝑏𝑠𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜

𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒

CUANTIFICACIÓN DE TIOLES CON DTNB

GSH (µL)Buffer de

Na2HPO4 (µL)SSA (µL)

Concentración final

nmol/µLnmol/µL*125µL

(nmol)

0 380 120 0 04 376 120 0.02 2.58 372 120 0.04 5.016 364 120 0.08 10.032 348 120 0.16 20.064 316 120 0.32 40.0128 252 120 0.64 80.0160 220 120 0.8 100.0

Muestra: Tomar 95 µL de extracto + 30µL de buffer de

Na2HPO4 0,5M

Estándar: Preparar los patrones para curva y tomar

125 µL

Adicionar en la celda correspondiente

Adicionar 125 µL DTNB a 10nM

Agitar e incubar 15 min a temperatura

ambiente

Leer Absorbancia a 412 nm

38

CUANTIFICACIÓN DE LA SUPERÓXIDO

DISMUTASA

529 nm

39

p-Sulfobenceno-azo--naftilamina(Rosa)

HNO2 + H2O + HCl

Cloruro de hidroxilamina

Ácido nitroso

NH2

SO3H

+ HNO2

N

SO3H

NH

H2O

NH2

+

N

SO3H

N

NH2

+ H2O

Ácido sulfanilíco Ácido sulfanilíco diazotonizado

-Naftilamina

N

NH

O

O

NH

N N

NH

O

O

NH

N

OH + H2O + O2

°-

Xantina

Xantina oxidasa

Radical Superóxido

H2N OH HCl +O2•-

CUANTIFICACIÓN DE SUPERÓXIDO

DISMUTASA

Espectrofotómetro MicroplacasMULTISKAN GO THERMO

SCIENTIFIC

40

𝐴𝑏𝑠𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 = 𝐴𝑏𝑠𝑀𝑒𝑧𝑐𝑙𝑎 − 𝐴𝑏𝑠𝐵𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 𝑀 − 𝐴𝑏𝑠𝐵𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 𝐹

−𝐿𝑜𝑔 (𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛) =𝐴𝑏𝑠𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 + 𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜

𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 10−

𝐴𝑏𝑠𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎+𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒

CUANTIFICACIÓN CON SOD

Patrón Buffer de fosfatos

(µL)

Agua (µL)

Xantina (µL)

Cloruro de hidroxilami

na (µL)

SOD D2 (µL)

Xantina oxidasa

(µL)1 150 45 15 15 0 752 150 40 15 15 4.5 753 150 36 15 15 9.0 754 150 27 15 15 18.0 755 150 18 15 15 27.0 756 150 9 15 15 36.0 75

Preparación de la muestra150 µL Buffer KH2PO4 , pH 7,85 µL de extracto40 µL de agua des ionizada15 µL de Xantina15 µL Hidroxilamina hidroclorada 1mM75 µL Xantina Oxidasa 0,2mg Prot /mL

Estándares

Preparar los patrones para la curva de

calibración usando SOD

Dejar reaccionar durante 20 minutos a temperatura ambiente y

en lugar oscuro. Detener la reacción en baño de hielo

Adicionar 100 µL de Ácido sulfanílico

19 mM y α-Naftilamina 7 mM

(Antes que las muestras)

Adicionar 100µL de muestra

Incubar 20 min a temperatura ambiente

Medir absorbancia a 529 nm

41

CAPACIDAD ANTIOXIDANTE POR EL

ENSAYO CON DPPH∙

AH A●

517 nm

Morado Amarillo

1,1-Difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH)

1,1-Difenil-2- picril-hidrazilo (DPPH H)

42

CAPACIDAD ANTIOXIDANTE POR EL

ENSAYO CON DPPH∙

Adicionar en la celda correspondiente 25 µL de la

muestra

Adicionar en la celda 100 µL de solución (20mg/L)

de DPPH∙

Incubar por 30 min en lugar oscuro y a temperatura

ambiente

Leer absorbancia a 517 nm

Calcular %AA

Control+: Hidroquinona1000 ppmControl - : 25µL MeOH +100 µL solución DPPH

43

%𝐴𝐴 =𝐴𝑏𝑠𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 − 𝐴𝑏𝑠𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

𝐴𝑏𝑠𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙∗ 100

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

44

CURVA DE CALIBRACIÓN PARA TIOLESEstándar

Concentración STD

(nmol de GSH)Absorción(ABS)

1 0 0,4702

2 2,5 0,5311

3 5 0,6155

4 10 0,7276

5 20 1,1148

6 40 1,7507

7 80 3,0483

8 100 3,5851

45

𝐴𝑏𝑠𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 = 𝐴𝑏𝑠𝑀𝑒𝑧𝑐𝑙𝑎 − 𝐴𝑏𝑠𝐵𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 𝑀 − 𝐴𝑏𝑠𝐵𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 𝐹

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =𝐴𝑏𝑠𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 − 0.4586

0.0317

CUANTIFICACIÓN DE TIOLES EN LOS

EXTRACTOS

Piperomia acuminata

Piper eriopodon

Piper umbellatum

>89 nmol GSH/mg

Montanoa

Baccharis

Aspillia(tilesia

baccata)

Mikania llinensis

>90nmol GSH/mg

Croton

magdalenensis

101.8117

nmolGSH/mg

46

CURVA DE CALIBRACIÓN PARA SOD

y = 0,1991x - 0,1585R² = 0,9989

0,00000

0,02000

0,04000

0,06000

0,08000

0,10000

0,12000

0,14000

0,16000

0,18000

0,20000

0,000000,20000 0,40000 0,60000 0,80000 1,00000 1,20000 1,40000 1,60000 1,80000 2,00000

AB

SOR

BA

NC

IA

-LOGARITMO DE LA CONCENTRACIÓN

StdConcentración

(Units SOD)-log[ ] ABS

2 0,0187 1,7277 0,1858

3 0,0374 1,4267 0,1235

4 0,0749 1,1256 0,0698

5 0,1123 0,9495 0,0295

6 0,1497 0,8247 0,0048

47

𝐴𝑏𝑠𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 = 𝐴𝑏𝑠𝑀𝑒𝑧𝑐𝑙𝑎 − 𝐴𝑏𝑠𝐵𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 𝑀 − 𝐴𝑏𝑠𝐵𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 𝐹

−𝐿𝑜𝑔 (𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛) =𝐴𝑏𝑠𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 + 0.1585

0.1991

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 10−

𝐴𝑏𝑠𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎+0.15850.1991

CUANTIFICACIÓN DE SOD EN LOS

EXTRACTOSMikania bonistenae

3,3045 Units SOD/mg

Lepidaploa lehamannii

1,06885 Units SOD/mg

Hyeronnima macrocarpa

1,4952 Units SOD/mg

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

42 70 72 80 81 124 131 133 135 136 148 154 158 163 167 172 194

Co

nc

en

tra

ció

n d

e S

OD

(U

nit

/mL)

Extractos #UTP

48

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Po

rce

nta

je d

e c

ap

ac

ida

d a

nti

ox

ida

nte

Extractos # UTP

CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS

EXTRACTOSHyeronnimia

macrocarpa

95,9016%

Aspilia (tliesia

baccata)

95,9062%

Piper umbellatum

98,5895%

49

Control + : Hidroquinona a 1000 ppm

CORRELACIÓN %AA Y CONCENTRACIÓN

TIOLES

50

Spearman r 0.08824

CONFRONTACIÓN CONCENTRACIÓN

TIOLES Y EQUIVALENTES SOD

51

Spearman r -0.3848

OBJETIVO METODOLOGIA RESULTADO

Determinar la concentración de tiol

es libres presentes en los extractos

metanólicos de las familias en

estudio, con la implementación del

método colorimétrico.

Método colorimétrico usando

DTNB para la formación del

cromógeno TNB con máximo de

Absorbancia a 412 nm

Croton Magdalenensis, Euphorbiaceae 101.8117

nmolGSH/mg

Montanoa sp, Asteraceae

94.4106 noml GSH/mg

Baccharis, Asteraceae

98.4106 nmol GHS/mg

Aspillia(Tilesia Baccata), Asteraceae

92.3361 nmol GSH/mg

Mikania Llinensis, Asteraceae

97.2336 nmol GSH/mg

Piperomia acuminata , Piperaceae

89.7539 nmol GSH/mg

Piper eriopodon, Piperaceae

89.4622 nmol GSH/mg

Piper umbellatum, Piperaceae

89.5906 nmol/mg

Evaluar la concentración moléculas

en equivalentes de Superóxido

Dismutasa presente en los extracto

s en estudio.

Método fotométrico, generación de

radical superoxiodo el cual oxida la

hidroxilamina a nitrito y formación

de un complejo rosa con máximo

de absorción a 529 nm.

Hyeronnima macrocarpa, Euphorbiaceae

1,4952 Units SOD/mg

Mikania Bonistenae , Asteraceae

3,3045 Units SOD/mg

Lepidaploa Lehamannii , Asteraceae

1,06885 Units SOD/mg

52

OBJETIVO METODOLOGÍA RESULTADO

Determinar la capacidad

captadora de radicales libres

(%AA) mediante el método de

DPPH•.

Método de competencia, captura del

radical por la acción de compuestos con

naturaleza antioxidante.

Coloración amarilla con máximo de

absorbancia a 517nm.

Hyeronnimia macrocarpa ,

Euphorbiaceae 95,9016%

Aspilia (Tilesia baccata), Asteraceae

95,9062%

Piper umbellatum, Piperaceae

98,5895%

53

6. CONCLUSIONES

54

CONCLUSIONES• Las familias Asteraceae y Piperaceae se destacaron por su alta concentraión

de tioles, por su parte, para la familia Euphorbiaceae se destaca la especieCroton magdalenensis (UTP 70) que presento la concentración más alta detodas las especies que fueron estudiadas, con una concentración de101,8117 nmol/mg de extracto.

• Los extractos estudiados obtivieron baja concentración de moléculas enequivalentes SOD, pero se destacan las especies Hyeronnima macrocarpa(UTP 42, Euphorbiaceae) con una concentración de 1.4952 equivalentesSOD/ mg, Mikania Bonistenae (UTP 124) y Vernonia sp (UTP 135) de lafamilia Asteraceae con una concentración de enzima de 3,3045 y 1,0685equivalentes SOD/ mg, estás moléculas se asumen como miméticos de laSOD.

55

CONCLUSIONES

• Los extractos estudiados exhiben un buen perfil de actividad antioxidante,con valores superiores al 90%, por la técnica de DPPH• , valores que nopueden atribuidos únicamente a la acción de los compuestos tipo tiol,debido a que se trabajo con los extractos crudos.

56

7. RECOMENDACIONES

57

RECOMENDACIONES

• Realizar pruebas de cromatografía de capa delgada (TLC) parala identificar la presencia de tioles y caracterización de estosen los extractos metanólicos de las especies estudiadas en esteproyecto, a una concentración de 1000 ppm, mediante latécnica de cromatografía líquida de alta resolución HPLC.

58

8. BIBLIOGRAFÍA

59

BIBLIOGRAFÍA• Antioxidant activity of natural plant sources in dairy dessert (Sandesh)

under thermal treatment. Chakraborty, Runu, Raychaudhuri, Utpal yBandyopadhyay, Mahuya. 2008, Swiss Society of Food Science andTechnology, págs. 816-825.

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• Radicales libres y su papel en las enfermedades crónico-degenerativas.Maldonado Savedra , Octavio, y otros, y otros. 2010.

• Classical catalase: ancient and modern. Nicholls, Peter. 2012, Archives ofbiochemistry and biophysics, págs. 95-101.

60

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61

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CLADO MAGNOLIIDE. [En línea] [Citado el: 14 de Junio de 2013.]Shttp://exa.unne.edu.ar/biologia/diversidadv/documentos/ANGIOSPERMAS/Angiospermas%20Basales%20y%20Clado%20Magnolides/Clado%20Magnolides/Piperales/Piperaceae.pd

• WHO, Organization World Health. Deaths from CVD and diabetes. [Enlínea] 2008. [Citado el: 1 de Septiembre de 2014.]http://www.who.int/gho/ncd/mortality_morbidity/cvd_text/en/.

• GLOBOCAN. World Health Organization. All Cancers (excluding non-melanoma skin cancer)Estimated Incidence, Mortality and PrevalenceWorldwide in 2012. [En línea] 2012. [Citado el: 1 de Septiembre de 2014.]http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx

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• Characterización of antioxidant enzymes and peroxisomes of olive (Oleaeuropaea L) fruits. Lopez-Huertaz, Eduardo y Del Río, Luis A. 2014,Journal Of Plant Physiology, págs. 143-147

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AGRADECIMIENTOS

• Al profesor Oscar Marino Mosquera y JaimeNiño Osorio por su acompañamiento y guía parala realización de este proyecto.

• A la familia GB-PN, por su paciencia y amistadincondicional durante todo el desarrollo de estetrabajo.

• A mis padres por su apoyo, paciencia y esfuerzodurante el trascurso de mi carreara que ahora seve reflejado con la culminación de este proyecto.

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DPPH

• Ensayo rápido.

• No requiere de muchos reactivos

• El más evaluado a nivel mundial

• El radical implementado es estable, esta molécula no se dimeriza debido a la deslocalización de un electrón desapareado sobre la molécula completa

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PRINCIPALES TIOLES EN LAS PLANTAS

• Cisteina• Cistina• Tiocisteina• Cistationina• Homocisteina• Glutationa• Glutationa bisulfito• Glutamilcisteina• Homoglutationa• Hidroximetilglutationa• Cisteinamina• Metanotiol.

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