Zastosowanie chromatografii cieczowej w biotechnologii ... · Jedne składniki s ąwi ęc zatrzymywane w fazie ... Nowoczesne adsorbenty stosowane w HPLC s ąmałymi cz ąstkami o

Projekt wspProjekt wspóółłfinansowany przezfinansowany przez UniUnięę EuropejskEuropejskąą w ramach Europejskiego Funduszu Spow ramach Europejskiego Funduszu Społłecznegoecznego

Zastosowanie Zastosowanie

chromatografii cieczowej chromatografii cieczowej

w biotechnologii w biotechnologii śśrodowiskowejrodowiskowej

„„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia -- ATRINBIOTECHATRINBIOTECH””

Priorytet IV POKL Priorytet IV POKL „„Szkolnictwo wySzkolnictwo wyŜŜsze i naukasze i nauka””

Literatura:Literatura:

1. R. Rosset, H. Kołodziejczyk; Współczesna chromatografia cieczowa, ćwiczenia i zadania., PWN W-wa 2001r.

2. J.J. Kirkland; Współczesna chromatografia cieczowa., PWN W-wa1976 r.

3. B. Walczak, J. Śliwiok; Wysokosprawna chromatografia cieczowa., Skrypt UŚ Katowice 1989 r.

4. W. Szczepaniak; Metody instrumentalne w analizie chemicznej., PWN W-wa 1996 r.

5. J. Minczewski, Z. Marczewski; Chemia analityczna, tom III., PWN W-wa 1986 r.

6. G. W. Ewing; Metody instrumentalne w analizie chemicznej., PWN W-wa 1980 r.

7. Z. Witkiewicz; Podstawy chromatografii., WNT W-wa 2005 r.



Chromatografia

z greckiego:chromatos = barwa + grapho = pisze

technika analityczna lub preparatywna słuŜąca do rozdzielania lub badania składu mieszanin związków chemicznych.



W zaleŜności od rodzaju eluentu czyli substancji w której rozpuszcza się badaną mieszaninę rozróŜnia sięnastępujące techniki chromatograficzne:

• chromatografia cieczowa - w której eluentem jest ciekły rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników

• chromatografia gazowa - w której eluentem jest gaz (zwykle hel, argon lub wodór, czasem azot)

• chromatografia nadkrytyczna - w której eluentem jest gaz w stanie nadkrytycznym





Eluent - czynnik wymywający, jest to płyn (gaz lub ciecz), który pełni funkcję czynnika przenoszącego analizowanąmieszaninę przez złoŜe, na którym następuje jej rozdział na poszczególne związki.

Eluentami są zwykle związki chemiczne o niskiej masie cząsteczkowej, które nie reagują ze złoŜem i przechodząprzez to złoŜe przy jak najmniejszych oporach przepływu. W chromatografii cieczowej eluentem jest rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników. Do najczęściej stosowanych eluentów ciekłych zalicza się:

aceton, acetonitryl, chlorek metylenu, chloroform, etanol, THF, toluen, woda - *(o czystości LC)

Eluat - roztwór zawierający substancje wymyte.



Rozdział substancji następuje w wyniku przepuszczenia roztworu badanej mieszaniny przez specjalnie spreparowaną fazę rozdzielczą (zzłłooŜŜee), zwaną teŜ faząstacjonarną. Fazą rozdzielczą są substancje wykazujące zdolności sorpcyjne lub zdolne do innych oddziaływań na substancje przepływające. Podczas przepływu eluentu(fazy ruchomejfazy ruchomej) przez fazę rozdzielczą następuje proces wymywania zaadsorbowanych substancji. Intensywnośćtego procesu jest róŜna dla poszczególnych składników mieszaniny. Jedne składniki są więc zatrzymywane w fazie dłuŜej, a inne krócej, dzięki czemu moŜe następować ich separacja.



Chromatografia cieczowa - rodzaj chemicznej techniki analitycznej - chromatografia, w której eluentem jest ciecz, zwykle jakiś rozpuszczalnik. Istotą kaŜdej chromatografii cieczowej jest rozdział analizowanej mieszaniny na poszczególne związki chemiczne poprzez przepuszczanie roztworu tej mieszaniny przez stałe lub Ŝelowe złoŜa, co w pewnym sensie przypomina filtrację. Na skutek oddziaływańmiędzycząsteczkowych między związkami tworzącymi mieszaninę a złoŜem jedne z nich przechodzą przez złoŜe szybciej a inne wolniej.

HPLC (ang. High Performance Liquid Chromatography –wysokosprawna chromatografia cieczowa) – to technika analityczna stosowana do badania czystości, oczyszczania i identyfikacji substancji chemicznych stosowana równieŜ jako preparatywna,



Kolumny z odpowiednim wypełnieniem:

• Ŝel krzemionkowy lub jego modyfikacjępolarnymi grupami (faza normalna, NP)

• Ŝel krzemionkowy modyfikowany grupami o niskiej polarności (faza

odwrócona, RP), najczęściej grupami oktadecylowymi, C18

• wypełnienia polimerowe – bardzo odporne chemicznie, umoŜliwiają prace w całym zakresie pH, ale ustępują jak na razie moŜliwościom rozdzielczym wypełnień opartych na Ŝelu krzemionkowym



Aparaty HPLC skAparaty HPLC skłładajadająą sisięę zwykle z:zwykle z:• zbiornika na eluenty, bufory, itp.,• automatycznego odgazowywacza, który usuwa gazy rozpuszczone

w eluentach• zaworów proporcjonujących, w których faza ruchoma osiąga zadany

skład,• pomp zapewniających odpowiednie parametry przepływu eluenta w

układzie. • iniektora umoŜliwiającego wprowadzanie analizowanych próbek bez

rozszczelnienia układu (autosampler)• odpowiednich filtrów, prekolumny, która usuwa z eluenta

zanieczyszczenie mechaniczne. • kolumny z odpowiednim wypełnieniem, • termostatu kolumn,• detektora – którym moŜe być spektrofotometr UV-VIS lub

fluorescencyjny, spektrometr mas (MS), • zbiornika na zuŜyty eluent,





Chromatografia normalnej fazyfaza stacjonarna jest zazwyczaj bardzo polarna (np. Ŝelkrzemionkowy), a faza mobilna jest niepolarna (np. n-heksan, tetrahydrofuran). Rozdzielane substancje im bardziej są polarne tym silniej oddziałują z polarnym nośnikiem.

Chromatografia odwróconej fazyfaza stacjonarna jest zazwyczaj niepolarna, hydrofobowa, a faza mobilna jest polarna (np. mieszanina wody i metanolu). Rozdzielane substancje im mniej są polarne tym silniej oddziałują z niepolarnym nośnikiem.

METODY ROZDZIELCZE W CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ



Detekcja

W wysokosprawnej chromatografii cieczowej stosuje siędetektory o działaniu ciągłym (przepływowe), charakteryzujące się duŜą czułością i małą objętością komórki pomiarowej. Najczęściej w metodzie chromatografii cieczowej wykorzystuje się;• detektor absorpcji w nadfiolecie (UV-Vis),• refraktometr róŜnicowy,• detektor adsorpcyjny mikrokalorymetryczny,• detektor fluorometryczny,• detektor polarograficzny,• detektor konduktometryczny.• detektor masowy (MS)Dobry układem detekcyjnym jest połączenie dwóch detektorów.





WypeWypełłnienia kolumn w HPLCnienia kolumn w HPLCFazy stacjonarne (adsorbenty)Rozdział w HPLC opera się na oddziaływaniu powierzchniowym, które silnie zaleŜy od natury chemicznej centrów adsorpcyjnych. Nowoczesne adsorbenty stosowane w HPLC są małymi cząstkami o bardzo rozwiniętej powierzchni.W HPLC stosuje się praktycznie dwa typy wypełnień: - wypełnienia powierzchniowo porowate i wypełnienia mikroporowatew całej masie (o małej średnicy ziaren).- rozmiar cząstek 3 - 10 µm- rozmiary porów: 70 - 300 Å;- powierzchnia: 50 to 250 m2/g- rodzaje centrów aktywnych:

• odwrócona faza (C8, C18, -fenyl), • normalna faza: (-OH, -NH2),• jonity (NH4

+), (-COO-)





Schemat przekroju ziarna nośnika:

a) ziarno z powierzchniowąwarstwą adsorpcyjną(składa się z nieprzenikliwego rdzenia oraz powierzchniowej warstwy adsorpcyjnej),

b) ziarno porowate w całej masie.





Czasem retencji tR . nazywa się czas. jaki upływa między zadozowaniem próbki a pojawieniem się maksimum piku rozpatrywanego składnika próbki.

Składnik nie zatrzymywany przez fazę stacjonarnąpojawia się w wycieku po czasie tM. nazywanym czasem retencji substancji nie zatrzymywanej (lub zerowym czasem retencji).



Współczynnik retencji k jest to stosunek ilości substancji w fazie

stacjonarnej do ilości substancji w fazie ruchomej. Jeśli cS i cM

oznaczają, odpowiednio, równowagowe stęŜenia substancji w fazach

stacjonarnej i ruchomej, a VS i VM są objętościami tych faz w

kolumnie, to:

M

S

MM

SS

V

VK

Vc

Vck ==

Wielkość K = cS/cM nazywana jest stałą podziału substancji między

dwie fazy. Czas retencji związany jest ze współczynnikiem retencji

podstawową zaleŜnością w chromatografii

tR = tM(1+k)



MR

MR

tt

tt

k

k

K

K

−

−===

1

2

1

2

1

2α

N

tR

22

=σ

Współczynnik rozdzielenia

Współczynnik rozdzielenia jest miarą rozdzielenia pików dwóch

substancji:

Sprawność kolumny chromatograficznej, od której zaleŜy rozdzielenie

pików, mierzy się dla kaŜdej substancji liczbą półek teoretycznych, N, w

kolumnie. Po przebyciu przez próbkę pewnej drogi w kolumnie rozkład jej

stęŜenia w wycieku ma kształt krzywej Gaussa. Odchylenie standardowe

tego piku, σ (wyraŜone w jednostkach czasu), powiązane jest z liczbą

półek zaleŜnością:



22σ⋅= aw

2

=

w

taN R

W przypadku piku gaussowskiego jego szerokość, w na określonej

wysokości jest związana z kwadratem odchylenia standardowego

(wariancją) zaleŜnością

w której współczynnik proporcjonalności a zaleŜy od wysokości, na jakiej

mierzone jest w. Przez połączenie obu powyŜszych zaleŜności otrzymuje się

Wartości tR i w powinny być mierzone na chromatogramie i wyraŜane w

tych samych jednostkach - czasu lub długości.





PowyŜsze równanie stanowi podstawę wielu metod obliczania liczby

półek.

W dwu najczęściej stosowanych metodach wykorzystuje się

szerokość piku przy podstawie, wb, zdefiniowaną jako część

podstawy piku odciętą przez styczne wykreślone w punktach

przegięcia po obu stronach piku (wb = 4σ) , oraz szerokość piku w

połowie wysokości (wh = 2,36σ)

22

54,516

=

=

h

R

b

R

w

t

w

tN

2

=

w

taN R



Pt

NI

R

P∆⋅

=

2

Wskaźnik sprawności

Wskaźnik sprawności to iloczyn liczby półek przypadających na

jednostkę czasu i liczby półek przypadających na jednostkę ciśnienia:

Jeśli ciśnienie wyraŜone jest w barach, a czas analizy w sekundach,

to wskaźnik ten wynosi 103 - 105 w przypadku kolumn dobrze

napełnionych i uŜywanych we właściwych warunkach.





TECHNIKA SPE – Solid Phase Extraction



Ekstrakcja do fazy stałej (SPE - ang. solid-phase extraction) jest jedną z najprostszych a zarazem jedną z najbardziej

efektywnych i uniwersalnych metod chromatografii a zarazem sposobem na wydzielenie/zatęŜenie substancji badanej.

Wykorzystywane w metodzie SPE kolumienki jednorazowego uŜytku z odpowiednim wypełnieniem są wygodne w

stosowaniu i łatwe do utylizacji. W zaleŜności od rodzaju badanej substancji dobiera się stosowne wypełnienie

kolumienek i odpowiednie czynniki wymywające.



Aparat prAparat próóŜŜniowy do techniki SPEniowy do techniki SPE



Kolumienki SPEKolumienki SPE



ZASTOSOWANIE ZASTOSOWANIE

CHROMATOGRAFII CIECZOWEJCHROMATOGRAFII CIECZOWEJ



Nowoczesny chromatograf cieczowy charakteryzuje sięwysoka sprawnością, dobrą rozdzielczością, duŜąszybkością procesu. Te korzystne parametry współczesnej chromatografii cieczowej (HPLC) osiągnięto dzięki instrumentacji metody i wprowadzeniu nowych faz stacjonarnych. Współczesna HPLC, wprowadzona w 1960 r. okazała się najbardziej pręŜnie rozwijającą siętechniką chromatograficzną i znalazła szerokie zastosowanie w analizie preparatów farmaceutycznych, analizie biochemicznej, klinicznej i środowiskowej.



Oznaczanie śladowych ilości substancji chemicznych dodawanych jako konserwanty do produktów spoŜywczych lub kosmetyków





W Głównym Instytucie Górnictwa opracowana została nowoczesna metoda oznaczania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) w glebach z terenów rolniczych zlokalizowanych w pobliŜu zakładów przemysłowych z wykorzystaniem techniki HPLC. Metodyka wykorzystuje metodę technikę szybkiej ekstrakcji i zatęŜania z zastosowaniem ekstrakcji do fazy stałej (SPE) oraz techniki wysokosprawnej chromatografii cieczowej.

* SPE – solid phase extraction



Stosując chromatografię cieczową, w próbkach masła oznaczono jakościowo oraz ilościowo tokoferole(T) i tokotrienole (T3), charakterystyczne dla tłuszczów roślinnych. W przebadanych, losowo zakupionych w handlu detalicznym, kostkach masła Ekstra, Śmietankowego i Osełkowego stwierdzono, Ŝe 33% przebadanych próbek było produkowanych z dodatkiem tłuszczu roślinnego, o czym świadczy obecność tokoferoli, a w szczególności tokotrienoli, które występują jedynie w tłuszczu palmowym lub kokosowym.

Cyt: śYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 2008, 3 (58), 47 – 56



Udział procentowy tych homologów w sumarycznej zawartości T i T3 kształtował się na poziomie od 40 do 82%. Taka ilość oznaczonych tokochromanoli świadczy o róŜnym dodatku tłuszczu roślinnego do tłuszczu mlecznego i wskazuje na obecność na polskim rynku nierzetelnych producentów, którzy deklarują tylko zawartość tłuszczu mlecznego (82 lub 73,5%) na opakowaniach masła.



Zastosowanie HPLC do wykrywanie faZastosowanie HPLC do wykrywanie fałłszerstw.szerstw.

Problem fałszywego czeku:

Po skasowaniu czeku opiewającego na 1100 $, jego wystawca oświadczył, Ŝe wypisał czek jedynie na 100 $. Czek z podejrzeniem fałszerstwa został przekazany do analizy do Instytutu Kryminalistyki w celu dokonania ekspertyzy. Istotną rzeczą dla ekspertów jest, by nie uszkodzić dokumentu, który moŜe się okazać niezbędny w postępowaniu sądowym. W tym więc przypadku pobrana do analizy próbka materiału musi być minimalna.

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest techniką umoŜliwiającą rozwiązanie tego problemu.

Analizę wykonujemy w następujący sposób:za pomocą mikrodziurkarki pobieramy krąŜki dokumentu o średnicy od 0,8 do 1,0 mm. Tusz ekstrahujemy organicznym rozpuszczalnikiem (np. metanolem) z krąŜków w kapilarze szklanej. Następnie otrzymany ekstrakt nastrzykujemyna kolumnę chromatografu cieczowego (HPLC) i wykonujemy analizę.



Otrzymujemy chromatogram tuszu pierwszej i drugiej jedynki z czeku uzyskując skład chemiczny próbek. Składnikami tuszu pierwszej (dopisanej) jedynki są chlorek tetrametylopararozaniliniowy, fiolet krystaliczny i fiolet metylowy. Tusz drugiej jedynki zawiera wyraźnie mniej fioletu krystalicznego niŜ fioletu metylowego i błękit Wiktorii.



Documents

Zastosowanie chromatografii cieczowej w biotechnologii ... · Jedne składniki s ąwi ęc zatrzymywane w fazie ... Nowoczesne adsorbenty stosowane w HPLC s ąmałymi cz ąstkami o