Monika Gontarska

Zastosowanie chromatografii cienkowarstwowej z detekcją

densytometryczną oraz innych instrumentalnych technik

analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych

pochodnych kwasu octowego i kwasu propionowego

(otwarcie przewodu doktorskiego)

Opiekun pracy

Prof zw dr hab T Kowalska

Zakład Chemii Ogoacutelnej i Chromatografii

Instytut Chemii

Uniwersytet Śląski w Katowicach

Instytut Chemii

Uniwersytet Śląski

Katowice 2009

2

Spis treści

1 Wstęp

2 Inwersja chiralna kwasoacutew arylooctowych i arylopropionowych

3 Cel pracy

4 Wyniki badań własnych i ich omoacutewienie

41 Zjawisko racemizacji w układzie chromatograficznym oraz oscylacyjne zmiany

skręcalności właściwej ([]D) S-(+)-flurbiprofenu i R-(-)-flurbiprofenu

411 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

412 Polarymetira

4121Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu

4122Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu

42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym

421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

422 Test biuretowy

423 Polarymetria

4231Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

4232Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

5 Wnioski

6 Dalsze plany badawcze

7 Literatura

8 Lista prac własnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

9 Lista publikacji konferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

10 Życiorys

3

1 Wstęp

Reakcje oscylacyjne to swoista rzadkość wśroacuted reakcji chemicznych Przedmiot

niniejszych badań zarysował się podczas opracowywania metod chromatograficznego

rozdziału par enancjomeroacutew ibuprofenu i naproksenu należących do grupy niesteroidowych

lekoacutew o właściwościach przeciwzapalnych i przeciwgorączkowych (ang non-steroidal anti-

inflammatory drugs NSAIDs) Ustalono woacutewczas iż związki te nie są stabilne podczas

przechowywania ich jako optycznie czystych enancjomeroacutew rozpuszczonych w prostych

niskocząsteczkowych rozpuszczalnikach Niestabilność ta jest związana z oscylacyjną zmianą

stężenia pierwotnie rozpuszczonego enancjomeru badanego związku ktoacutery z czasem

przechodzi w swoacutej własny antymer

Profeny jako leki przeciwboacutelowe są dziś ogromnie popularne i ogoacutelnodostępne Roacutewnież

wiele innych niskocząsteczkowych chiralnych kwasoacutew karboksylowych jest stosowanych

jako substancje lecznicze lub ich prekursory W związku z tym nasuwa się refleksja o

prawdopodobnej powszechności opisanej wyżej labilności sterycznej i o jej znaczeniu dla

biochemii i farmakologii

W ramach niniejszych badań postanowiłam sprawdzić czy zjawisko inwersji chiralnej

dotyczy innych niż ibuprofen i naproksen związkoacutew z grupy profenoacutew tj ketoprofenu i

flurbiprofenu Jednocześnie wytypowałam do badań dwie pochodne kwasu octowego

odgrywające znaczącą rolę w medycynie i kosmetologii tj -fenyloglicynę i kwas

migdałowy Między innymi starałam się znaleźć odpowiedź na pytanie czy wspomniana

wyżej niestabilność steryczna jest zależna od długości łańcucha węglowego

2 Inwersja chiralna kwasoacutew arylooctowych i arylopropionowych

Profeny to kwasy 2-arylopropionowe (ang 2-arylpropionic acids 2-APAs) należące do

niesteroidowych lekoacutew przeciwzapalnych (NLPZ) szerokiej i niejednorodnej grupy lekoacutew o

działaniu przeciwzapalnym przeciwboacutelowym i przeciwgorączkowym [1] Z powodu

obecności w strukturze profenoacutew asymetrycznego atomu węgla występują one w postaci

dwoacutech optycznie czynnych enancjomeroacutew [2] Najprostszym przedstawicielem grupy

profenoacutew jest kwas 2-fenylopropionowy ktoacutery nie posiada jednak właściwości leczniczych w

żadnej z form czynnych optycznie Na rynku farmaceutycznym są one dostępne głoacutewnie w

formie racematu jedynie naproksen od samego początku jest sprzedawany w formie

enancjomeru S Uważa się że działanie terapeutyczne wykazują jedynie enancjomery o

4

konfiguracji S natomiast ich antymery R są obojętne dla organizmu Z tego powodu coraz

więcej profenoacutew zaczyna się sprzedawać w formie S [3] Wykazano natomiast iż pod

wpływem roacuteżnorakich czynnikoacutew działających in vivo a także in vitro może zachodzić

zmiana struktury przestrzennej profenoacutew z izomeru R do formy S czyli inwersja chiralna

Wiele spośroacuted kwasoacutew arylooctowych należy podobnie jak profeny do grupy

niesteroidowych lekoacutew przeciwzapalnych Przykładowo kwas migdałowy stosuje się obecnie

w zwalczaniu zmian skoacuternych a -fenyloglicyna wchodząca w skład wielu peptydoacutew

zwiększa ich zdolności lecznicze Oba te związki charakteryzują się stosunkowo niską masą

cząsteczkową i tym że są one chiralne ndash zatem występują w postaci dwoacutech enancjomeroacutew a

co za tym idzie istnieje możliwość że ulegają konwersji chiralnej

Aktywność terapeutyczna profenoacutew polega na hamowaniu działania cyklooksygenazy

kluczowego enzymu w biosyntezie prostaglandyn (czyli grupy hormonoacutew pochodnych

kwasu arachidonowego będących regulatorami procesoacutew fizjologicznych) Enzym ten

występuje w postaci dwoacutech form izomerycznych a mianowicie COX-1 i COX-2 Pierwszy z

nich odpowiada za syntezę prostaglandyn chroniących błonę wyściełającą żołądek

zmniejszając wytwarzanie kwasu żołądkowego i regulując wydzielanie śluzu oraz prawidłowe

ukrwienie żołądka natomiast enzym COX-2 uczestniczy w procesach zapalnych i przyczynia

się do powstawania boacutelu gorączki i obrzękoacutew Bardzo ważną ścieżką w metabolizmie

kwasoacutew 2-arylopropionowych jest inwersja chiralna podczas ktoacuterej nieaktywny w stosunku

do cyklooksygenazy enancjomer R jest przekształcany w swoacutej własny antymer aktywny

wobec cyklooksygenazy

Dlaczego tylko enancjomer R a nie jego antymer ulega inwersji chiralnej Wspoacutelną

strukturalną właściwością profenoacutew jest tetraedryczna hybrydyzacja chiralnego atomu węgla

do ktoacuterego przyłączony jest łańcuch zawierający grupę arylową Stereospecyficzność może

być zaobserwowana w procesach farmakokinetycznych w ktoacuterych wykorzystywany jest

nośnik białkowy czyli receptor lub enzym Dodatkowo występują roacuteżne stosunki ilościowe

lub jakościowe ze względu na stereoselektywność procesoacutew farmakodynamicznych

Mechanizm inwersji sugeruje że enancjomer R może być aktywowany przez przekształcenie

go w adenylan (soacutel kwasu adenozynomonofosforowego) do dalszej reakcji z koenzymem A

podczas gdy adenylan powstały z S-(+)-profenu nie jest zdolny do takiej reakcji [4] Co

ciekawe hamowanie syntezy prostaglandyn przeprowadzane in vitro pokazuje iż aktywność

w tym względzie wykazuje tylko enancjomer S Jednak ta stereoselektywność działania nie

występuje in vivo z powodu jednokierunkowej metabolicznej inwersji chiralnego centrum

asymetrii z nieaktywnego izomeru R do jego antymeru S [5] Farmakokinetyka absorpcji

5

dystrybucji metabolizmu łączenia się z białkiem czy eliminacji może być roacuteżna dla każdego

z enancjomeroacutew szczegoacutelnie woacutewczas gdy dodatkowo weźmie się pod uwagę indywidualne

cechy każdego organizmu żywego oraz toksyczność lekoacutew [6] Kiedy inwersja chiralna nie

jest obserwowana zakłada się iż po prostu nie zachodzi lub że poprzedza ją eliminacja leku

tak jak to się dzieje w przypadku kwasu tiaprofenowego [7]

Ze względu na zasięg i kierunki zachodzenia inwersji chiralnej in vivo profeny można

podzielić na pięć grup [8]

I Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej

II Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej lub nieulegające jej w

ogoacutele

III Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej lub dwukierunkowej

inwersji chiralnej lub nieulegające jej w ogoacutele

IV Profeny ulegające dwukierunkowej inwersji chiralnej lub nieulegające jej w ogoacutele

V Profeny nieulegające inwersji chiralnej

Grupę I reprezentują min ibuprofen fenoprofen benaksoprofen flunaksoprofen

pranoprofen i indoprofen Grupę II w ktoacuterej profeny mogą ulegać inwersji chiralnej gdzie

enancjomer R może przekształcać się w swoacutej antymer S lub nie ulegać jej wcale

reprezentują flurbiprofen suprofen oraz naproksen Jak do tej pory jedynym reprezentantem

grupy III wydaje się być ketoprofen ktoacutery charakteryzuje się tym iż może ulegać inwersji

chiralnej w jednym lub obu kierunkach a także nie ulegać jej wcale Kwas tiaprofenowy oraz

nie wykazujący właściwości leczniczych kwas 2-fenylopropionowy należą do grupy w ktoacuterej

występuje dwukierunkowa inwersja chiralna lub nie występuje ona w ogoacutele czyli do grupy

IV Grupę V czyli grupę profenoacutew nie ulegających inwersji chiralnej reprezentują pirprofen

oraz karprofen

Enzymy ktoacuterymi dysponuje grzyb Verticilium lecanii sprawiają iż w przypadku

ibuprofenu indoprofenu suprofenu flurbiprofenu i fenoprofenu zachodzi jednokierunkowa

inwersja chiralna gdzie enancjomer R przekształca się w swoacutej antymer S a tylko ketoprofen

wykazuje inwersję w odwrotnym kierunku Te wyniki sugerują iż Verticilium lecanii może

być wykorzystywany do produkcji czystych enancjomeroacutew wymienionych związkoacutew [9]

Innym rodzajem grzyba mogącego służyć do produkcji czystych enancjomeroacutew a konkretnie

optycznie czystego S-(+)-atliprofenu jest Candida rugosa [10] natomiast bakterie z rodzaju

Nocardia diaphanozonaria są wykorzystywane w syntezie kwasu R-2-fenylopropionowego

[11]

6

W przypadku kwasu migdałowego inwersja chiralna in vivo jest powodowana przez

bakterie Pseudomonas putida Jeden z enzymoacutew tych bakterii powoduje chiralną inwersję

kwasu S-(+)-migdałowego do jego antymeru [12] Przechodzenie jednego enancjomeru kwasu

migdałowego w drugi obserwuje się roacutewnież u najliczniejszego rzędu ssakoacutew czyli gryzoni a

w szczeglności u szczuroacutew [13]

Zjawisko inwersji chiralnej in vitro nie jest tak dokładnie poznane jak inwersja in vivo

Zespoacuteł kierowany przez prof T Kowalską po raz pierwszy zetknął się z tym zagadnieniem

podczas opracowywania metod chromatograficznego rozdziału par enancjomeroacutew

ibuprofenu naproksenu i kwasu 2-fenylopropionowego Podczas badań prowadzonych przy

pomocy chromatografii cienkowarstwowej z chiralną fazą stacjonarną jako podstawowej

techniki rozdzielczej odkryto że roztwory trzech chiralnych pochodnych kwasu

propionowego sporządzone w dwoacutech rozpuszczalnikach wodnych oraz w jednym

niskocząsteczkowym rozpuszczalniku niewodnym ulegają samorzutnej oscylacyjnej

konwersji chiralnej Wyniki badań chromatograficznych zostały potwierdzone przy pomocy

pomiaroacutew polarymetrycznych oraz analiz przeprowadzonych z wykorzystaniem

wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) Uzyskane w ramach tych badań wyniki

zostały przedstawione min w pracach [14-19]

Zrozumienie znaczenia konformacyjnej stabilności lekoacutew chiralnych może być niezwykle

pomocne przy interpretacji danych otrzymanych z badań farmaceutycznych

farmakokinetycznych czy też farmakodynamicznych Ocena względnej wartości

marketingowej racematu czy też czystego enancjomeru jest wieloczynnikowa W

szczegoacutelności zależy ona od znaczenia i wielkości korzyści terapeutycznych i finansowych a

dodatkowo musi być ustalona dla każdej substancji leczniczej z osobna Dlatego tak ważną

rolę odgrywają w takich przypadkach badania nad inwersją chiralną lekoacutew racemicznych

Przy produkcji stereochemicznie czystych związkoacutew i racematoacutew inwersja chiralna musi być

brana pod uwagę jako kwestia rozstrzygająca i jest to wystarczającym uzasadnieniem dla

szczegoacutełowego rozważania inwersji na każdym z etapoacutew szczegoacutelnie przy produkcji i ocenie

bezpieczeństwa stosowania lekoacutew [20]

7

3 Cel pracy

Szczegoacutełowe cele badawcze niniejszej rozprawy doktorskiej są następujące

I Przebadanie wybranych profenoacutew jako asymetrycznych pochodnych kwasu

propionowego pod kątem ich zdolności do ulegania samorzutnej oscylacyjnej

inwersji chiralnej in vitro Do badań tych wytypowano ketoprofen i flurbiprofen

II Stwierdzenie czy i w jaki sposoacuteb długość łańcucha węglowego decyduje o

zachodzeniu samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro kwasoacutew

karboksylowych W tym celu do prowadzonych badań wytypowano odpowiednie

asymetryczne pochodne kwasu octowego czyli związki o dwoacutech atomach węgla w

łańcuchu Wytypowanymi związkami zostały -fenyloglicyna i kwas migdałowy

III Pogłębienie dotychczasowego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu reakcji

elementarnych składających się na zachodzący in vitro proces samorzutnej

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych asymetrycznych kwasoacutew

karboksylowych

4 Wyniki badań własnych i ich omoacutewienie

W niniejszym rozdziale zostaną przedstawione i omoacutewione wyniki badań własnych

dotyczących możliwości ulegania procesowi samorzutnej oscylacyjnej konwersji chiralnej in

vitro w abiotycznych roztworach etanolowo-wodnych przez S-(+)-flurbiprofen i R-(-)-

flurbiprofen a także wyniki badań związanych z możliwością zachodzenia samorzutnej

peptyzacji in vitro enancjomeroacutew i racematu -fenyloglicyny w abiotycznych roztworach

etanolowo-wodnych Wyniki te pochodzą z badań przeprowadzonych techniką chiralnej

chromatografii cienkowarstwowej i polarymetrii a w przypadku roztworoacutew -fenyloglicyny

wykonano dodatkowo test biuretowy

8

41 Zjawisko racemizacji w układzie chromatograficznycm oraz oscylacyjne zmiany

skręcalności właściwej ([]D) S-(+)-flurbiprofenu i R-(-)-flurbiprofenu

411 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy enancjomery

flurbiprofenu ulegają konwersji chiralnej to znaczy przemianie antymeru S-(+) w R-(-) i

odwrotnie jak to przedstawiono poniższym roacutewnaniem

S-(+)-profen enol R-(-)-profen (1)

Jak do tej pory nie istnieją żadne doniesienia literaturowe na temat rozdziału

enancjomeroacutew flurbiprofenu metodą chromatografii cienkowarstwowej Warunki rozdziału

dla układu TLC były wzorowane na danych zawartych w publikacji Bhushana i Parshada

[21] ktoacuterzy jako pierwsi opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla antymeroacutew

ibuprofenu Jako fazę stacjonarną wykorzystano gotowe płytki pokryte żelem

krzemionkowym i zaimpregnowane metanolowym roztworem L-argininy Na fazę ruchomą

składał się czysty etanol plus kilka kropli lodowatego kwasu octowego Kwasu octowego

użyto do sprotonowania grupy aminowej L-argininy i dzięki temu rozdział enancjomeroacutew był

oparty na mechanizmie tworzenia par jonowych według następujących roacutewnań

L-arginina+ + S-(+)-profen

-L-arginina

+ S-(+)-profen

- (K1) (2)

L-arginina+ + R-(-)-profen

-L-arginina

+ R-(-)-profen

- (K2) (3)

gdzie K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi reakcji natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest

warunkiem rozdziału chromatograficznego dwu antymeroacutew flurbiprofenu

We wszystkich przeprowadzonych doświadczeniach użyto świeżo sporządzone roztwory

S-(+)-flurbiprofenu oraz R-(-)-flurbiprofenu w mieszaninie etanolu i wody w stosunku

objętościowym 73 o trzech roacuteżnych stężeniach roacutewnych 01 05 i 10 mgmL-1

Przygotowano roacutewnież roztwoacuter testowy tj mieszaninę racemiczną RS-(plusmn)-flurbiprofenu o

stężeniu 02 mgmL-1

dla każdego z enancjomeroacutew przy zastosowaniu tego samego

rozpuszczalnika

9

W celu sprawdzenia czy warunki odpowiednie do rozdziału enancjomeroacutew ibuprofenu

pozwalają na rozdział enancjomeroacutew flurbiprofenu testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej

badanego związku poddano procesowi chromatografowania w wyżej wymienionych

warunkach Zastosowano dwukierunkowe rozwijanie płytek chromatograficznych Wyniki

tego procesu przedstawiają rys 1 i 2

(a)

(b)

Rys 1 Wideoskany (a) całej płytki chromatograficznej rozwijanej w dwoacutech kierunkach oraz (b)

powiększonego obszaru na ktoacuterym nastąpił rozdział antymeroacutew flurbiprofenu

10

(a)

(b)

Rys 2 (a) Dwuwymiarowy i (b) troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający rozdział enancjomeroacutew

flurbiprofenu Obrazy te wygenerowano przez densytometryczne skanowanie chromatogramu 30 liniami w

odstępach 1 mm

Dwie plamki widoczne na rys 1 zostały poddane analizie Pierwszym sposobem

identyfikacji plamek była densytometryczna rejestracja widm UV każdej z nich bezpośrednio

11

z chromatografowanej płytki Obie plamki dały identyczne widmo w ultrafiolecie Co więcej

z płytki zdrapano żel krzemionkowy z umiejscowionymi plamkami a każdą proacutebkę żelu z

osobna zalano etanolem Następnie tak przygotowane roztwory przesączono zagęszczono i

poddano analizie techniką niechiralnej HPLCndashDAD Otrzymane wyniki dla każdej z proacutebek

były takie same Maksima pikoacutew chromatograficznych odpowiadających każdej z dwoacutech

plamek posiadały ten sam czas retencji i w dodatku to samo widmo UV Można zatem

stwierdzić iż doszło do rozdziału mieszaniny racemicznej flurbiprofenu a każda z plamek

reprezentuje jeden z enancjomeroacutew

Następnym etapem eksperymentu była proacuteba określenia każdej z plamek jako

odpowiednio S-(+)- oraz R-(-)-flurbiprofenu W tym celu chromatografowano świeżo

sporządzone etanolowo-wodne roztwory każdego z nich w takich samych warunkach co

testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej Niestety nie udało się zidentyfikować plamek gdyż

chromatogramy otrzymane dla każdego z antymeroacutew flurbiprofenu wyglądały identycznie

jak chromatogram otrzymany dla roztworu testowego co widać na rys 3a i b ktoacutere są

praktycznie identyczne z rys 1b

(a) (b)

Rys 3 Wideoskany chromatogramoacutew uzyskanych dla (a) S-(+)-flurbiprofenu i (b) R-(-)-flurbiprofenu

Ostatnim etapem eksperymentu było wykazanie ilościowej zależności rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia proacutebki W tym celu dla każdego z enancjomeroacutew

flurbiprofenu sporządzono roztwory etanolowo-wodne o trzech roacuteżnych stężeniach o czym

wspomniano już wcześniej a następnie chromatografowano je w identyczny sposoacuteb jak

poprzednio Na rys 4 i 5 przedstawiono wyniki otrzymane jedynie dla R-(-)-flurbiprofenu

ponieważ jego antymer S-(+) zachowuje się w podanych warunkach dokładnie tak samo Jak

widać rys 4a-4c są analogiczne z rys 2a natomiast rys 5a-5c z rys 2b Wynika z nich

12

jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego

enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew

zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają

Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

(a)

(b)

(c)

13

Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się

pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory

pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem

wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej

przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką

rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim

środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i

oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych

zadaniach analitycznych

412 Polarymetria

4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu

Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w

roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew

roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb

nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych

odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6

14

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]

[]D

day 0

44

45

46

47

48

0 1 2 3 4 5 6 7

day 1

43

44

45

46

23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2

41

42

43

44

45

45 50 55

day 5

39

40

41

42

43

116 121 126

day 6

40

41

42

43

141 146 151

day 7

40

41

42

43

44

164 169 174

Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z

natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na

tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D

zmierzają do zera

Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej

chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może

ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę

rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

15

4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu

Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech

seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu

w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC

były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-

minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195

time [hours]

[]D

day 0

-40

-39

-38

-37

-36

0 2 4 6

day 1

-38

-37

-36

-35

-34

24 25 26 27 28 29 30 31

day 2

-36

-35

-34

-33

-32

-31

-30

46 48 50 52 54

day 5

-22

-21

-20

-19

-18

120 122 124 126 128

day 6

-19

-18

-17

-16

144 146 148 150 152

day 7

-14

-13

-12

-11

-10

-9

-8

167 169 171 173

day 8

-8

-7

-6

-5

192 193 194 195

Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury

oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a

długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący

proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8

16

Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter

oscylacyjny

W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu

była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i

22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla

roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu

działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała

niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej

w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie

mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1

OC Na rys 9a i b przedstawiono

wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń

17

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(a)

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(b)

Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze

(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu

działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą

Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu

polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na

przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną

konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się

wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem

jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej

roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny

wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew

wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na

18

bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku

roacuteżnych reakcji oscylacyjnych

Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu

ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu

czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo

nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem

kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie

wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew

Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen

może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających

wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych

Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku

enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje

się być regułą dla profenoacutew

19

42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym

421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna

oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w

D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej

najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji

enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i

wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla

antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano

gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem

zawierającym jony Cu2+

a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z

dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty

na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami

[Cu(L-Pro)2]2+

+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+

+ L-Pro K1 (4)

[Cu(L-Pro)2]2+

+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+

+ L-Pro K2 (5)

gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi

odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału

chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny

Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze

22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz

racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych

antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075

Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne

skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba

enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji

RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej

pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment

ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych

20

starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie

roacuteżnią się między sobą

Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--

fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek

Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z

poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku

prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb

uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na

starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna

zachowała się analogicznie do racematu

21

Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu

W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej

płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)

czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny

(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i

mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki

przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--

fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i

skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-

fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie

prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i

pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)

lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki

22

Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej

D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-

a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny

skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)

Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie

natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu

uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki

Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu

krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie

wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami

Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący

eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako

rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)

4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda

(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny

Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki

pokazano na rys 13

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

2

Spis treści

1 Wstęp

2 Inwersja chiralna kwasoacutew arylooctowych i arylopropionowych

3 Cel pracy

4 Wyniki badań własnych i ich omoacutewienie

41 Zjawisko racemizacji w układzie chromatograficznym oraz oscylacyjne zmiany

skręcalności właściwej ([]D) S-(+)-flurbiprofenu i R-(-)-flurbiprofenu

411 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

412 Polarymetira

4121Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu

4122Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu

42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym

421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

422 Test biuretowy

423 Polarymetria

4231Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

4232Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

5 Wnioski

6 Dalsze plany badawcze

7 Literatura

8 Lista prac własnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

9 Lista publikacji konferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

10 Życiorys

3

1 Wstęp

Reakcje oscylacyjne to swoista rzadkość wśroacuted reakcji chemicznych Przedmiot

niniejszych badań zarysował się podczas opracowywania metod chromatograficznego

rozdziału par enancjomeroacutew ibuprofenu i naproksenu należących do grupy niesteroidowych

lekoacutew o właściwościach przeciwzapalnych i przeciwgorączkowych (ang non-steroidal anti-

inflammatory drugs NSAIDs) Ustalono woacutewczas iż związki te nie są stabilne podczas

przechowywania ich jako optycznie czystych enancjomeroacutew rozpuszczonych w prostych

niskocząsteczkowych rozpuszczalnikach Niestabilność ta jest związana z oscylacyjną zmianą

stężenia pierwotnie rozpuszczonego enancjomeru badanego związku ktoacutery z czasem

przechodzi w swoacutej własny antymer

Profeny jako leki przeciwboacutelowe są dziś ogromnie popularne i ogoacutelnodostępne Roacutewnież

wiele innych niskocząsteczkowych chiralnych kwasoacutew karboksylowych jest stosowanych

jako substancje lecznicze lub ich prekursory W związku z tym nasuwa się refleksja o

prawdopodobnej powszechności opisanej wyżej labilności sterycznej i o jej znaczeniu dla

biochemii i farmakologii

W ramach niniejszych badań postanowiłam sprawdzić czy zjawisko inwersji chiralnej

dotyczy innych niż ibuprofen i naproksen związkoacutew z grupy profenoacutew tj ketoprofenu i

flurbiprofenu Jednocześnie wytypowałam do badań dwie pochodne kwasu octowego

odgrywające znaczącą rolę w medycynie i kosmetologii tj -fenyloglicynę i kwas

migdałowy Między innymi starałam się znaleźć odpowiedź na pytanie czy wspomniana

wyżej niestabilność steryczna jest zależna od długości łańcucha węglowego

2 Inwersja chiralna kwasoacutew arylooctowych i arylopropionowych

Profeny to kwasy 2-arylopropionowe (ang 2-arylpropionic acids 2-APAs) należące do

niesteroidowych lekoacutew przeciwzapalnych (NLPZ) szerokiej i niejednorodnej grupy lekoacutew o

działaniu przeciwzapalnym przeciwboacutelowym i przeciwgorączkowym [1] Z powodu

obecności w strukturze profenoacutew asymetrycznego atomu węgla występują one w postaci

dwoacutech optycznie czynnych enancjomeroacutew [2] Najprostszym przedstawicielem grupy

profenoacutew jest kwas 2-fenylopropionowy ktoacutery nie posiada jednak właściwości leczniczych w

żadnej z form czynnych optycznie Na rynku farmaceutycznym są one dostępne głoacutewnie w

formie racematu jedynie naproksen od samego początku jest sprzedawany w formie

enancjomeru S Uważa się że działanie terapeutyczne wykazują jedynie enancjomery o

4

konfiguracji S natomiast ich antymery R są obojętne dla organizmu Z tego powodu coraz

więcej profenoacutew zaczyna się sprzedawać w formie S [3] Wykazano natomiast iż pod

wpływem roacuteżnorakich czynnikoacutew działających in vivo a także in vitro może zachodzić

zmiana struktury przestrzennej profenoacutew z izomeru R do formy S czyli inwersja chiralna

Wiele spośroacuted kwasoacutew arylooctowych należy podobnie jak profeny do grupy

niesteroidowych lekoacutew przeciwzapalnych Przykładowo kwas migdałowy stosuje się obecnie

w zwalczaniu zmian skoacuternych a -fenyloglicyna wchodząca w skład wielu peptydoacutew

zwiększa ich zdolności lecznicze Oba te związki charakteryzują się stosunkowo niską masą

cząsteczkową i tym że są one chiralne ndash zatem występują w postaci dwoacutech enancjomeroacutew a

co za tym idzie istnieje możliwość że ulegają konwersji chiralnej

Aktywność terapeutyczna profenoacutew polega na hamowaniu działania cyklooksygenazy

kluczowego enzymu w biosyntezie prostaglandyn (czyli grupy hormonoacutew pochodnych

kwasu arachidonowego będących regulatorami procesoacutew fizjologicznych) Enzym ten

występuje w postaci dwoacutech form izomerycznych a mianowicie COX-1 i COX-2 Pierwszy z

nich odpowiada za syntezę prostaglandyn chroniących błonę wyściełającą żołądek

zmniejszając wytwarzanie kwasu żołądkowego i regulując wydzielanie śluzu oraz prawidłowe

ukrwienie żołądka natomiast enzym COX-2 uczestniczy w procesach zapalnych i przyczynia

się do powstawania boacutelu gorączki i obrzękoacutew Bardzo ważną ścieżką w metabolizmie

kwasoacutew 2-arylopropionowych jest inwersja chiralna podczas ktoacuterej nieaktywny w stosunku

do cyklooksygenazy enancjomer R jest przekształcany w swoacutej własny antymer aktywny

wobec cyklooksygenazy

Dlaczego tylko enancjomer R a nie jego antymer ulega inwersji chiralnej Wspoacutelną

strukturalną właściwością profenoacutew jest tetraedryczna hybrydyzacja chiralnego atomu węgla

do ktoacuterego przyłączony jest łańcuch zawierający grupę arylową Stereospecyficzność może

być zaobserwowana w procesach farmakokinetycznych w ktoacuterych wykorzystywany jest

nośnik białkowy czyli receptor lub enzym Dodatkowo występują roacuteżne stosunki ilościowe

lub jakościowe ze względu na stereoselektywność procesoacutew farmakodynamicznych

Mechanizm inwersji sugeruje że enancjomer R może być aktywowany przez przekształcenie

go w adenylan (soacutel kwasu adenozynomonofosforowego) do dalszej reakcji z koenzymem A

podczas gdy adenylan powstały z S-(+)-profenu nie jest zdolny do takiej reakcji [4] Co

ciekawe hamowanie syntezy prostaglandyn przeprowadzane in vitro pokazuje iż aktywność

w tym względzie wykazuje tylko enancjomer S Jednak ta stereoselektywność działania nie

występuje in vivo z powodu jednokierunkowej metabolicznej inwersji chiralnego centrum

asymetrii z nieaktywnego izomeru R do jego antymeru S [5] Farmakokinetyka absorpcji

5

dystrybucji metabolizmu łączenia się z białkiem czy eliminacji może być roacuteżna dla każdego

z enancjomeroacutew szczegoacutelnie woacutewczas gdy dodatkowo weźmie się pod uwagę indywidualne

cechy każdego organizmu żywego oraz toksyczność lekoacutew [6] Kiedy inwersja chiralna nie

jest obserwowana zakłada się iż po prostu nie zachodzi lub że poprzedza ją eliminacja leku

tak jak to się dzieje w przypadku kwasu tiaprofenowego [7]

Ze względu na zasięg i kierunki zachodzenia inwersji chiralnej in vivo profeny można

podzielić na pięć grup [8]

I Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej

II Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej lub nieulegające jej w

ogoacutele

III Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej lub dwukierunkowej

inwersji chiralnej lub nieulegające jej w ogoacutele

IV Profeny ulegające dwukierunkowej inwersji chiralnej lub nieulegające jej w ogoacutele

V Profeny nieulegające inwersji chiralnej

Grupę I reprezentują min ibuprofen fenoprofen benaksoprofen flunaksoprofen

pranoprofen i indoprofen Grupę II w ktoacuterej profeny mogą ulegać inwersji chiralnej gdzie

enancjomer R może przekształcać się w swoacutej antymer S lub nie ulegać jej wcale

reprezentują flurbiprofen suprofen oraz naproksen Jak do tej pory jedynym reprezentantem

grupy III wydaje się być ketoprofen ktoacutery charakteryzuje się tym iż może ulegać inwersji

chiralnej w jednym lub obu kierunkach a także nie ulegać jej wcale Kwas tiaprofenowy oraz

nie wykazujący właściwości leczniczych kwas 2-fenylopropionowy należą do grupy w ktoacuterej

występuje dwukierunkowa inwersja chiralna lub nie występuje ona w ogoacutele czyli do grupy

IV Grupę V czyli grupę profenoacutew nie ulegających inwersji chiralnej reprezentują pirprofen

oraz karprofen

Enzymy ktoacuterymi dysponuje grzyb Verticilium lecanii sprawiają iż w przypadku

ibuprofenu indoprofenu suprofenu flurbiprofenu i fenoprofenu zachodzi jednokierunkowa

inwersja chiralna gdzie enancjomer R przekształca się w swoacutej antymer S a tylko ketoprofen

wykazuje inwersję w odwrotnym kierunku Te wyniki sugerują iż Verticilium lecanii może

być wykorzystywany do produkcji czystych enancjomeroacutew wymienionych związkoacutew [9]

Innym rodzajem grzyba mogącego służyć do produkcji czystych enancjomeroacutew a konkretnie

optycznie czystego S-(+)-atliprofenu jest Candida rugosa [10] natomiast bakterie z rodzaju

Nocardia diaphanozonaria są wykorzystywane w syntezie kwasu R-2-fenylopropionowego

[11]

6

W przypadku kwasu migdałowego inwersja chiralna in vivo jest powodowana przez

bakterie Pseudomonas putida Jeden z enzymoacutew tych bakterii powoduje chiralną inwersję

kwasu S-(+)-migdałowego do jego antymeru [12] Przechodzenie jednego enancjomeru kwasu

migdałowego w drugi obserwuje się roacutewnież u najliczniejszego rzędu ssakoacutew czyli gryzoni a

w szczeglności u szczuroacutew [13]

Zjawisko inwersji chiralnej in vitro nie jest tak dokładnie poznane jak inwersja in vivo

Zespoacuteł kierowany przez prof T Kowalską po raz pierwszy zetknął się z tym zagadnieniem

podczas opracowywania metod chromatograficznego rozdziału par enancjomeroacutew

ibuprofenu naproksenu i kwasu 2-fenylopropionowego Podczas badań prowadzonych przy

pomocy chromatografii cienkowarstwowej z chiralną fazą stacjonarną jako podstawowej

techniki rozdzielczej odkryto że roztwory trzech chiralnych pochodnych kwasu

propionowego sporządzone w dwoacutech rozpuszczalnikach wodnych oraz w jednym

niskocząsteczkowym rozpuszczalniku niewodnym ulegają samorzutnej oscylacyjnej

konwersji chiralnej Wyniki badań chromatograficznych zostały potwierdzone przy pomocy

pomiaroacutew polarymetrycznych oraz analiz przeprowadzonych z wykorzystaniem

wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) Uzyskane w ramach tych badań wyniki

zostały przedstawione min w pracach [14-19]

Zrozumienie znaczenia konformacyjnej stabilności lekoacutew chiralnych może być niezwykle

pomocne przy interpretacji danych otrzymanych z badań farmaceutycznych

farmakokinetycznych czy też farmakodynamicznych Ocena względnej wartości

marketingowej racematu czy też czystego enancjomeru jest wieloczynnikowa W

szczegoacutelności zależy ona od znaczenia i wielkości korzyści terapeutycznych i finansowych a

dodatkowo musi być ustalona dla każdej substancji leczniczej z osobna Dlatego tak ważną

rolę odgrywają w takich przypadkach badania nad inwersją chiralną lekoacutew racemicznych

Przy produkcji stereochemicznie czystych związkoacutew i racematoacutew inwersja chiralna musi być

brana pod uwagę jako kwestia rozstrzygająca i jest to wystarczającym uzasadnieniem dla

szczegoacutełowego rozważania inwersji na każdym z etapoacutew szczegoacutelnie przy produkcji i ocenie

bezpieczeństwa stosowania lekoacutew [20]

7

3 Cel pracy

Szczegoacutełowe cele badawcze niniejszej rozprawy doktorskiej są następujące

I Przebadanie wybranych profenoacutew jako asymetrycznych pochodnych kwasu

propionowego pod kątem ich zdolności do ulegania samorzutnej oscylacyjnej

inwersji chiralnej in vitro Do badań tych wytypowano ketoprofen i flurbiprofen

II Stwierdzenie czy i w jaki sposoacuteb długość łańcucha węglowego decyduje o

zachodzeniu samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro kwasoacutew

karboksylowych W tym celu do prowadzonych badań wytypowano odpowiednie

asymetryczne pochodne kwasu octowego czyli związki o dwoacutech atomach węgla w

łańcuchu Wytypowanymi związkami zostały -fenyloglicyna i kwas migdałowy

III Pogłębienie dotychczasowego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu reakcji

elementarnych składających się na zachodzący in vitro proces samorzutnej

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych asymetrycznych kwasoacutew

karboksylowych

4 Wyniki badań własnych i ich omoacutewienie

W niniejszym rozdziale zostaną przedstawione i omoacutewione wyniki badań własnych

dotyczących możliwości ulegania procesowi samorzutnej oscylacyjnej konwersji chiralnej in

vitro w abiotycznych roztworach etanolowo-wodnych przez S-(+)-flurbiprofen i R-(-)-

flurbiprofen a także wyniki badań związanych z możliwością zachodzenia samorzutnej

peptyzacji in vitro enancjomeroacutew i racematu -fenyloglicyny w abiotycznych roztworach

etanolowo-wodnych Wyniki te pochodzą z badań przeprowadzonych techniką chiralnej

chromatografii cienkowarstwowej i polarymetrii a w przypadku roztworoacutew -fenyloglicyny

wykonano dodatkowo test biuretowy

8

41 Zjawisko racemizacji w układzie chromatograficznycm oraz oscylacyjne zmiany

skręcalności właściwej ([]D) S-(+)-flurbiprofenu i R-(-)-flurbiprofenu

411 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy enancjomery

flurbiprofenu ulegają konwersji chiralnej to znaczy przemianie antymeru S-(+) w R-(-) i

odwrotnie jak to przedstawiono poniższym roacutewnaniem

S-(+)-profen enol R-(-)-profen (1)

Jak do tej pory nie istnieją żadne doniesienia literaturowe na temat rozdziału

enancjomeroacutew flurbiprofenu metodą chromatografii cienkowarstwowej Warunki rozdziału

dla układu TLC były wzorowane na danych zawartych w publikacji Bhushana i Parshada

[21] ktoacuterzy jako pierwsi opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla antymeroacutew

ibuprofenu Jako fazę stacjonarną wykorzystano gotowe płytki pokryte żelem

krzemionkowym i zaimpregnowane metanolowym roztworem L-argininy Na fazę ruchomą

składał się czysty etanol plus kilka kropli lodowatego kwasu octowego Kwasu octowego

użyto do sprotonowania grupy aminowej L-argininy i dzięki temu rozdział enancjomeroacutew był

oparty na mechanizmie tworzenia par jonowych według następujących roacutewnań

L-arginina+ + S-(+)-profen

-L-arginina

+ S-(+)-profen

- (K1) (2)

L-arginina+ + R-(-)-profen

-L-arginina

+ R-(-)-profen

- (K2) (3)

gdzie K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi reakcji natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest

warunkiem rozdziału chromatograficznego dwu antymeroacutew flurbiprofenu

We wszystkich przeprowadzonych doświadczeniach użyto świeżo sporządzone roztwory

S-(+)-flurbiprofenu oraz R-(-)-flurbiprofenu w mieszaninie etanolu i wody w stosunku

objętościowym 73 o trzech roacuteżnych stężeniach roacutewnych 01 05 i 10 mgmL-1

Przygotowano roacutewnież roztwoacuter testowy tj mieszaninę racemiczną RS-(plusmn)-flurbiprofenu o

stężeniu 02 mgmL-1

dla każdego z enancjomeroacutew przy zastosowaniu tego samego

rozpuszczalnika

9

W celu sprawdzenia czy warunki odpowiednie do rozdziału enancjomeroacutew ibuprofenu

pozwalają na rozdział enancjomeroacutew flurbiprofenu testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej

badanego związku poddano procesowi chromatografowania w wyżej wymienionych

warunkach Zastosowano dwukierunkowe rozwijanie płytek chromatograficznych Wyniki

tego procesu przedstawiają rys 1 i 2

(a)

(b)

Rys 1 Wideoskany (a) całej płytki chromatograficznej rozwijanej w dwoacutech kierunkach oraz (b)

powiększonego obszaru na ktoacuterym nastąpił rozdział antymeroacutew flurbiprofenu

10

(a)

(b)

Rys 2 (a) Dwuwymiarowy i (b) troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający rozdział enancjomeroacutew

flurbiprofenu Obrazy te wygenerowano przez densytometryczne skanowanie chromatogramu 30 liniami w

odstępach 1 mm

Dwie plamki widoczne na rys 1 zostały poddane analizie Pierwszym sposobem

identyfikacji plamek była densytometryczna rejestracja widm UV każdej z nich bezpośrednio

11

z chromatografowanej płytki Obie plamki dały identyczne widmo w ultrafiolecie Co więcej

z płytki zdrapano żel krzemionkowy z umiejscowionymi plamkami a każdą proacutebkę żelu z

osobna zalano etanolem Następnie tak przygotowane roztwory przesączono zagęszczono i

poddano analizie techniką niechiralnej HPLCndashDAD Otrzymane wyniki dla każdej z proacutebek

były takie same Maksima pikoacutew chromatograficznych odpowiadających każdej z dwoacutech

plamek posiadały ten sam czas retencji i w dodatku to samo widmo UV Można zatem

stwierdzić iż doszło do rozdziału mieszaniny racemicznej flurbiprofenu a każda z plamek

reprezentuje jeden z enancjomeroacutew

Następnym etapem eksperymentu była proacuteba określenia każdej z plamek jako

odpowiednio S-(+)- oraz R-(-)-flurbiprofenu W tym celu chromatografowano świeżo

sporządzone etanolowo-wodne roztwory każdego z nich w takich samych warunkach co

testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej Niestety nie udało się zidentyfikować plamek gdyż

chromatogramy otrzymane dla każdego z antymeroacutew flurbiprofenu wyglądały identycznie

jak chromatogram otrzymany dla roztworu testowego co widać na rys 3a i b ktoacutere są

praktycznie identyczne z rys 1b

(a) (b)

Rys 3 Wideoskany chromatogramoacutew uzyskanych dla (a) S-(+)-flurbiprofenu i (b) R-(-)-flurbiprofenu

Ostatnim etapem eksperymentu było wykazanie ilościowej zależności rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia proacutebki W tym celu dla każdego z enancjomeroacutew

flurbiprofenu sporządzono roztwory etanolowo-wodne o trzech roacuteżnych stężeniach o czym

wspomniano już wcześniej a następnie chromatografowano je w identyczny sposoacuteb jak

poprzednio Na rys 4 i 5 przedstawiono wyniki otrzymane jedynie dla R-(-)-flurbiprofenu

ponieważ jego antymer S-(+) zachowuje się w podanych warunkach dokładnie tak samo Jak

widać rys 4a-4c są analogiczne z rys 2a natomiast rys 5a-5c z rys 2b Wynika z nich

12

jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego

enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew

zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają

Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

(a)

(b)

(c)

13

Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się

pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory

pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem

wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej

przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką

rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim

środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i

oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych

zadaniach analitycznych

412 Polarymetria

4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu

Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w

roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew

roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb

nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych

odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6

14

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]

[]D

day 0

44

45

46

47

48

0 1 2 3 4 5 6 7

day 1

43

44

45

46

23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2

41

42

43

44

45

45 50 55

day 5

39

40

41

42

43

116 121 126

day 6

40

41

42

43

141 146 151

day 7

40

41

42

43

44

164 169 174

Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z

natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na

tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D

zmierzają do zera

Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej

chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może

ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę

rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

15

4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu

Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech

seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu

w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC

były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-

minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195

time [hours]

[]D

day 0

-40

-39

-38

-37

-36

0 2 4 6

day 1

-38

-37

-36

-35

-34

24 25 26 27 28 29 30 31

day 2

-36

-35

-34

-33

-32

-31

-30

46 48 50 52 54

day 5

-22

-21

-20

-19

-18

120 122 124 126 128

day 6

-19

-18

-17

-16

144 146 148 150 152

day 7

-14

-13

-12

-11

-10

-9

-8

167 169 171 173

day 8

-8

-7

-6

-5

192 193 194 195

Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury

oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a

długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący

proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8

16

Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter

oscylacyjny

W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu

była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i

22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla

roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu

działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała

niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej

w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie

mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1

OC Na rys 9a i b przedstawiono

wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń

17

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(a)

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(b)

Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze

(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu

działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą

Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu

polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na

przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną

konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się

wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem

jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej

roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny

wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew

wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na

18

bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku

roacuteżnych reakcji oscylacyjnych

Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu

ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu

czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo

nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem

kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie

wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew

Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen

może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających

wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych

Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku

enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje

się być regułą dla profenoacutew

19

42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym

421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna

oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w

D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej

najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji

enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i

wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla

antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano

gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem

zawierającym jony Cu2+

a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z

dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty

na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami

[Cu(L-Pro)2]2+

+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+

+ L-Pro K1 (4)

[Cu(L-Pro)2]2+

+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+

+ L-Pro K2 (5)

gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi

odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału

chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny

Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze

22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz

racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych

antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075

Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne

skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba

enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji

RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej

pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment

ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych

20

starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie

roacuteżnią się między sobą

Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--

fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek

Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z

poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku

prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb

uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na

starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna

zachowała się analogicznie do racematu

21

Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu

W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej

płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)

czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny

(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i

mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki

przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--

fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i

skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-

fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie

prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i

pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)

lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki

22

Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej

D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-

a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny

skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)

Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie

natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu

uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki

Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu

krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie

wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami

Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący

eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako

rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)

4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda

(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny

Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki

pokazano na rys 13

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

3

1 Wstęp

Reakcje oscylacyjne to swoista rzadkość wśroacuted reakcji chemicznych Przedmiot

niniejszych badań zarysował się podczas opracowywania metod chromatograficznego

rozdziału par enancjomeroacutew ibuprofenu i naproksenu należących do grupy niesteroidowych

lekoacutew o właściwościach przeciwzapalnych i przeciwgorączkowych (ang non-steroidal anti-

inflammatory drugs NSAIDs) Ustalono woacutewczas iż związki te nie są stabilne podczas

przechowywania ich jako optycznie czystych enancjomeroacutew rozpuszczonych w prostych

niskocząsteczkowych rozpuszczalnikach Niestabilność ta jest związana z oscylacyjną zmianą

stężenia pierwotnie rozpuszczonego enancjomeru badanego związku ktoacutery z czasem

przechodzi w swoacutej własny antymer

Profeny jako leki przeciwboacutelowe są dziś ogromnie popularne i ogoacutelnodostępne Roacutewnież

wiele innych niskocząsteczkowych chiralnych kwasoacutew karboksylowych jest stosowanych

jako substancje lecznicze lub ich prekursory W związku z tym nasuwa się refleksja o

prawdopodobnej powszechności opisanej wyżej labilności sterycznej i o jej znaczeniu dla

biochemii i farmakologii

W ramach niniejszych badań postanowiłam sprawdzić czy zjawisko inwersji chiralnej

dotyczy innych niż ibuprofen i naproksen związkoacutew z grupy profenoacutew tj ketoprofenu i

flurbiprofenu Jednocześnie wytypowałam do badań dwie pochodne kwasu octowego

odgrywające znaczącą rolę w medycynie i kosmetologii tj -fenyloglicynę i kwas

migdałowy Między innymi starałam się znaleźć odpowiedź na pytanie czy wspomniana

wyżej niestabilność steryczna jest zależna od długości łańcucha węglowego

2 Inwersja chiralna kwasoacutew arylooctowych i arylopropionowych

Profeny to kwasy 2-arylopropionowe (ang 2-arylpropionic acids 2-APAs) należące do

niesteroidowych lekoacutew przeciwzapalnych (NLPZ) szerokiej i niejednorodnej grupy lekoacutew o

działaniu przeciwzapalnym przeciwboacutelowym i przeciwgorączkowym [1] Z powodu

obecności w strukturze profenoacutew asymetrycznego atomu węgla występują one w postaci

dwoacutech optycznie czynnych enancjomeroacutew [2] Najprostszym przedstawicielem grupy

profenoacutew jest kwas 2-fenylopropionowy ktoacutery nie posiada jednak właściwości leczniczych w

żadnej z form czynnych optycznie Na rynku farmaceutycznym są one dostępne głoacutewnie w

formie racematu jedynie naproksen od samego początku jest sprzedawany w formie

enancjomeru S Uważa się że działanie terapeutyczne wykazują jedynie enancjomery o

4

konfiguracji S natomiast ich antymery R są obojętne dla organizmu Z tego powodu coraz

więcej profenoacutew zaczyna się sprzedawać w formie S [3] Wykazano natomiast iż pod

wpływem roacuteżnorakich czynnikoacutew działających in vivo a także in vitro może zachodzić

zmiana struktury przestrzennej profenoacutew z izomeru R do formy S czyli inwersja chiralna

Wiele spośroacuted kwasoacutew arylooctowych należy podobnie jak profeny do grupy

niesteroidowych lekoacutew przeciwzapalnych Przykładowo kwas migdałowy stosuje się obecnie

w zwalczaniu zmian skoacuternych a -fenyloglicyna wchodząca w skład wielu peptydoacutew

zwiększa ich zdolności lecznicze Oba te związki charakteryzują się stosunkowo niską masą

cząsteczkową i tym że są one chiralne ndash zatem występują w postaci dwoacutech enancjomeroacutew a

co za tym idzie istnieje możliwość że ulegają konwersji chiralnej

Aktywność terapeutyczna profenoacutew polega na hamowaniu działania cyklooksygenazy

kluczowego enzymu w biosyntezie prostaglandyn (czyli grupy hormonoacutew pochodnych

kwasu arachidonowego będących regulatorami procesoacutew fizjologicznych) Enzym ten

występuje w postaci dwoacutech form izomerycznych a mianowicie COX-1 i COX-2 Pierwszy z

nich odpowiada za syntezę prostaglandyn chroniących błonę wyściełającą żołądek

zmniejszając wytwarzanie kwasu żołądkowego i regulując wydzielanie śluzu oraz prawidłowe

ukrwienie żołądka natomiast enzym COX-2 uczestniczy w procesach zapalnych i przyczynia

się do powstawania boacutelu gorączki i obrzękoacutew Bardzo ważną ścieżką w metabolizmie

kwasoacutew 2-arylopropionowych jest inwersja chiralna podczas ktoacuterej nieaktywny w stosunku

do cyklooksygenazy enancjomer R jest przekształcany w swoacutej własny antymer aktywny

wobec cyklooksygenazy

Dlaczego tylko enancjomer R a nie jego antymer ulega inwersji chiralnej Wspoacutelną

strukturalną właściwością profenoacutew jest tetraedryczna hybrydyzacja chiralnego atomu węgla

do ktoacuterego przyłączony jest łańcuch zawierający grupę arylową Stereospecyficzność może

być zaobserwowana w procesach farmakokinetycznych w ktoacuterych wykorzystywany jest

nośnik białkowy czyli receptor lub enzym Dodatkowo występują roacuteżne stosunki ilościowe

lub jakościowe ze względu na stereoselektywność procesoacutew farmakodynamicznych

Mechanizm inwersji sugeruje że enancjomer R może być aktywowany przez przekształcenie

go w adenylan (soacutel kwasu adenozynomonofosforowego) do dalszej reakcji z koenzymem A

podczas gdy adenylan powstały z S-(+)-profenu nie jest zdolny do takiej reakcji [4] Co

ciekawe hamowanie syntezy prostaglandyn przeprowadzane in vitro pokazuje iż aktywność

w tym względzie wykazuje tylko enancjomer S Jednak ta stereoselektywność działania nie

występuje in vivo z powodu jednokierunkowej metabolicznej inwersji chiralnego centrum

asymetrii z nieaktywnego izomeru R do jego antymeru S [5] Farmakokinetyka absorpcji

5

dystrybucji metabolizmu łączenia się z białkiem czy eliminacji może być roacuteżna dla każdego

z enancjomeroacutew szczegoacutelnie woacutewczas gdy dodatkowo weźmie się pod uwagę indywidualne

cechy każdego organizmu żywego oraz toksyczność lekoacutew [6] Kiedy inwersja chiralna nie

jest obserwowana zakłada się iż po prostu nie zachodzi lub że poprzedza ją eliminacja leku

tak jak to się dzieje w przypadku kwasu tiaprofenowego [7]

Ze względu na zasięg i kierunki zachodzenia inwersji chiralnej in vivo profeny można

podzielić na pięć grup [8]

I Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej

II Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej lub nieulegające jej w

ogoacutele

III Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej lub dwukierunkowej

inwersji chiralnej lub nieulegające jej w ogoacutele

IV Profeny ulegające dwukierunkowej inwersji chiralnej lub nieulegające jej w ogoacutele

V Profeny nieulegające inwersji chiralnej

Grupę I reprezentują min ibuprofen fenoprofen benaksoprofen flunaksoprofen

pranoprofen i indoprofen Grupę II w ktoacuterej profeny mogą ulegać inwersji chiralnej gdzie

enancjomer R może przekształcać się w swoacutej antymer S lub nie ulegać jej wcale

reprezentują flurbiprofen suprofen oraz naproksen Jak do tej pory jedynym reprezentantem

grupy III wydaje się być ketoprofen ktoacutery charakteryzuje się tym iż może ulegać inwersji

chiralnej w jednym lub obu kierunkach a także nie ulegać jej wcale Kwas tiaprofenowy oraz

nie wykazujący właściwości leczniczych kwas 2-fenylopropionowy należą do grupy w ktoacuterej

występuje dwukierunkowa inwersja chiralna lub nie występuje ona w ogoacutele czyli do grupy

IV Grupę V czyli grupę profenoacutew nie ulegających inwersji chiralnej reprezentują pirprofen

oraz karprofen

Enzymy ktoacuterymi dysponuje grzyb Verticilium lecanii sprawiają iż w przypadku

ibuprofenu indoprofenu suprofenu flurbiprofenu i fenoprofenu zachodzi jednokierunkowa

inwersja chiralna gdzie enancjomer R przekształca się w swoacutej antymer S a tylko ketoprofen

wykazuje inwersję w odwrotnym kierunku Te wyniki sugerują iż Verticilium lecanii może

być wykorzystywany do produkcji czystych enancjomeroacutew wymienionych związkoacutew [9]

Innym rodzajem grzyba mogącego służyć do produkcji czystych enancjomeroacutew a konkretnie

optycznie czystego S-(+)-atliprofenu jest Candida rugosa [10] natomiast bakterie z rodzaju

Nocardia diaphanozonaria są wykorzystywane w syntezie kwasu R-2-fenylopropionowego

[11]

6

W przypadku kwasu migdałowego inwersja chiralna in vivo jest powodowana przez

bakterie Pseudomonas putida Jeden z enzymoacutew tych bakterii powoduje chiralną inwersję

kwasu S-(+)-migdałowego do jego antymeru [12] Przechodzenie jednego enancjomeru kwasu

migdałowego w drugi obserwuje się roacutewnież u najliczniejszego rzędu ssakoacutew czyli gryzoni a

w szczeglności u szczuroacutew [13]

Zjawisko inwersji chiralnej in vitro nie jest tak dokładnie poznane jak inwersja in vivo

Zespoacuteł kierowany przez prof T Kowalską po raz pierwszy zetknął się z tym zagadnieniem

podczas opracowywania metod chromatograficznego rozdziału par enancjomeroacutew

ibuprofenu naproksenu i kwasu 2-fenylopropionowego Podczas badań prowadzonych przy

pomocy chromatografii cienkowarstwowej z chiralną fazą stacjonarną jako podstawowej

techniki rozdzielczej odkryto że roztwory trzech chiralnych pochodnych kwasu

propionowego sporządzone w dwoacutech rozpuszczalnikach wodnych oraz w jednym

niskocząsteczkowym rozpuszczalniku niewodnym ulegają samorzutnej oscylacyjnej

konwersji chiralnej Wyniki badań chromatograficznych zostały potwierdzone przy pomocy

pomiaroacutew polarymetrycznych oraz analiz przeprowadzonych z wykorzystaniem

wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) Uzyskane w ramach tych badań wyniki

zostały przedstawione min w pracach [14-19]

Zrozumienie znaczenia konformacyjnej stabilności lekoacutew chiralnych może być niezwykle

pomocne przy interpretacji danych otrzymanych z badań farmaceutycznych

farmakokinetycznych czy też farmakodynamicznych Ocena względnej wartości

marketingowej racematu czy też czystego enancjomeru jest wieloczynnikowa W

szczegoacutelności zależy ona od znaczenia i wielkości korzyści terapeutycznych i finansowych a

dodatkowo musi być ustalona dla każdej substancji leczniczej z osobna Dlatego tak ważną

rolę odgrywają w takich przypadkach badania nad inwersją chiralną lekoacutew racemicznych

Przy produkcji stereochemicznie czystych związkoacutew i racematoacutew inwersja chiralna musi być

brana pod uwagę jako kwestia rozstrzygająca i jest to wystarczającym uzasadnieniem dla

szczegoacutełowego rozważania inwersji na każdym z etapoacutew szczegoacutelnie przy produkcji i ocenie

bezpieczeństwa stosowania lekoacutew [20]

7

3 Cel pracy

Szczegoacutełowe cele badawcze niniejszej rozprawy doktorskiej są następujące

I Przebadanie wybranych profenoacutew jako asymetrycznych pochodnych kwasu

propionowego pod kątem ich zdolności do ulegania samorzutnej oscylacyjnej

inwersji chiralnej in vitro Do badań tych wytypowano ketoprofen i flurbiprofen

II Stwierdzenie czy i w jaki sposoacuteb długość łańcucha węglowego decyduje o

zachodzeniu samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro kwasoacutew

karboksylowych W tym celu do prowadzonych badań wytypowano odpowiednie

asymetryczne pochodne kwasu octowego czyli związki o dwoacutech atomach węgla w

łańcuchu Wytypowanymi związkami zostały -fenyloglicyna i kwas migdałowy

III Pogłębienie dotychczasowego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu reakcji

elementarnych składających się na zachodzący in vitro proces samorzutnej

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych asymetrycznych kwasoacutew

karboksylowych

4 Wyniki badań własnych i ich omoacutewienie

W niniejszym rozdziale zostaną przedstawione i omoacutewione wyniki badań własnych

dotyczących możliwości ulegania procesowi samorzutnej oscylacyjnej konwersji chiralnej in

vitro w abiotycznych roztworach etanolowo-wodnych przez S-(+)-flurbiprofen i R-(-)-

flurbiprofen a także wyniki badań związanych z możliwością zachodzenia samorzutnej

peptyzacji in vitro enancjomeroacutew i racematu -fenyloglicyny w abiotycznych roztworach

etanolowo-wodnych Wyniki te pochodzą z badań przeprowadzonych techniką chiralnej

chromatografii cienkowarstwowej i polarymetrii a w przypadku roztworoacutew -fenyloglicyny

wykonano dodatkowo test biuretowy

8

41 Zjawisko racemizacji w układzie chromatograficznycm oraz oscylacyjne zmiany

skręcalności właściwej ([]D) S-(+)-flurbiprofenu i R-(-)-flurbiprofenu

411 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy enancjomery

flurbiprofenu ulegają konwersji chiralnej to znaczy przemianie antymeru S-(+) w R-(-) i

odwrotnie jak to przedstawiono poniższym roacutewnaniem

S-(+)-profen enol R-(-)-profen (1)

Jak do tej pory nie istnieją żadne doniesienia literaturowe na temat rozdziału

enancjomeroacutew flurbiprofenu metodą chromatografii cienkowarstwowej Warunki rozdziału

dla układu TLC były wzorowane na danych zawartych w publikacji Bhushana i Parshada

[21] ktoacuterzy jako pierwsi opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla antymeroacutew

ibuprofenu Jako fazę stacjonarną wykorzystano gotowe płytki pokryte żelem

krzemionkowym i zaimpregnowane metanolowym roztworem L-argininy Na fazę ruchomą

składał się czysty etanol plus kilka kropli lodowatego kwasu octowego Kwasu octowego

użyto do sprotonowania grupy aminowej L-argininy i dzięki temu rozdział enancjomeroacutew był

oparty na mechanizmie tworzenia par jonowych według następujących roacutewnań

L-arginina+ + S-(+)-profen

-L-arginina

+ S-(+)-profen

- (K1) (2)

L-arginina+ + R-(-)-profen

-L-arginina

+ R-(-)-profen

- (K2) (3)

gdzie K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi reakcji natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest

warunkiem rozdziału chromatograficznego dwu antymeroacutew flurbiprofenu

We wszystkich przeprowadzonych doświadczeniach użyto świeżo sporządzone roztwory

S-(+)-flurbiprofenu oraz R-(-)-flurbiprofenu w mieszaninie etanolu i wody w stosunku

objętościowym 73 o trzech roacuteżnych stężeniach roacutewnych 01 05 i 10 mgmL-1

Przygotowano roacutewnież roztwoacuter testowy tj mieszaninę racemiczną RS-(plusmn)-flurbiprofenu o

stężeniu 02 mgmL-1

dla każdego z enancjomeroacutew przy zastosowaniu tego samego

rozpuszczalnika

9

W celu sprawdzenia czy warunki odpowiednie do rozdziału enancjomeroacutew ibuprofenu

pozwalają na rozdział enancjomeroacutew flurbiprofenu testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej

badanego związku poddano procesowi chromatografowania w wyżej wymienionych

warunkach Zastosowano dwukierunkowe rozwijanie płytek chromatograficznych Wyniki

tego procesu przedstawiają rys 1 i 2

(a)

(b)

Rys 1 Wideoskany (a) całej płytki chromatograficznej rozwijanej w dwoacutech kierunkach oraz (b)

powiększonego obszaru na ktoacuterym nastąpił rozdział antymeroacutew flurbiprofenu

10

(a)

(b)

Rys 2 (a) Dwuwymiarowy i (b) troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający rozdział enancjomeroacutew

flurbiprofenu Obrazy te wygenerowano przez densytometryczne skanowanie chromatogramu 30 liniami w

odstępach 1 mm

Dwie plamki widoczne na rys 1 zostały poddane analizie Pierwszym sposobem

identyfikacji plamek była densytometryczna rejestracja widm UV każdej z nich bezpośrednio

11

z chromatografowanej płytki Obie plamki dały identyczne widmo w ultrafiolecie Co więcej

z płytki zdrapano żel krzemionkowy z umiejscowionymi plamkami a każdą proacutebkę żelu z

osobna zalano etanolem Następnie tak przygotowane roztwory przesączono zagęszczono i

poddano analizie techniką niechiralnej HPLCndashDAD Otrzymane wyniki dla każdej z proacutebek

były takie same Maksima pikoacutew chromatograficznych odpowiadających każdej z dwoacutech

plamek posiadały ten sam czas retencji i w dodatku to samo widmo UV Można zatem

stwierdzić iż doszło do rozdziału mieszaniny racemicznej flurbiprofenu a każda z plamek

reprezentuje jeden z enancjomeroacutew

Następnym etapem eksperymentu była proacuteba określenia każdej z plamek jako

odpowiednio S-(+)- oraz R-(-)-flurbiprofenu W tym celu chromatografowano świeżo

sporządzone etanolowo-wodne roztwory każdego z nich w takich samych warunkach co

testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej Niestety nie udało się zidentyfikować plamek gdyż

chromatogramy otrzymane dla każdego z antymeroacutew flurbiprofenu wyglądały identycznie

jak chromatogram otrzymany dla roztworu testowego co widać na rys 3a i b ktoacutere są

praktycznie identyczne z rys 1b

(a) (b)

Rys 3 Wideoskany chromatogramoacutew uzyskanych dla (a) S-(+)-flurbiprofenu i (b) R-(-)-flurbiprofenu

Ostatnim etapem eksperymentu było wykazanie ilościowej zależności rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia proacutebki W tym celu dla każdego z enancjomeroacutew

flurbiprofenu sporządzono roztwory etanolowo-wodne o trzech roacuteżnych stężeniach o czym

wspomniano już wcześniej a następnie chromatografowano je w identyczny sposoacuteb jak

poprzednio Na rys 4 i 5 przedstawiono wyniki otrzymane jedynie dla R-(-)-flurbiprofenu

ponieważ jego antymer S-(+) zachowuje się w podanych warunkach dokładnie tak samo Jak

widać rys 4a-4c są analogiczne z rys 2a natomiast rys 5a-5c z rys 2b Wynika z nich

12

jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego

enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew

zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają

Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

(a)

(b)

(c)

13

Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się

pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory

pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem

wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej

przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką

rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim

środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i

oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych

zadaniach analitycznych

412 Polarymetria

4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu

Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w

roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew

roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb

nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych

odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6

14

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]

[]D

day 0

44

45

46

47

48

0 1 2 3 4 5 6 7

day 1

43

44

45

46

23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2

41

42

43

44

45

45 50 55

day 5

39

40

41

42

43

116 121 126

day 6

40

41

42

43

141 146 151

day 7

40

41

42

43

44

164 169 174

Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z

natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na

tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D

zmierzają do zera

Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej

chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może

ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę

rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

15

4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu

Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech

seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu

w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC

były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-

minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195

time [hours]

[]D

day 0

-40

-39

-38

-37

-36

0 2 4 6

day 1

-38

-37

-36

-35

-34

24 25 26 27 28 29 30 31

day 2

-36

-35

-34

-33

-32

-31

-30

46 48 50 52 54

day 5

-22

-21

-20

-19

-18

120 122 124 126 128

day 6

-19

-18

-17

-16

144 146 148 150 152

day 7

-14

-13

-12

-11

-10

-9

-8

167 169 171 173

day 8

-8

-7

-6

-5

192 193 194 195

Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury

oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a

długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący

proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8

16

Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter

oscylacyjny

W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu

była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i

22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla

roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu

działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała

niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej

w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie

mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1

OC Na rys 9a i b przedstawiono

wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń

17

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(a)

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(b)

Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze

(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu

działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą

Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu

polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na

przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną

konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się

wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem

jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej

roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny

wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew

wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na

18

bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku

roacuteżnych reakcji oscylacyjnych

Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu

ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu

czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo

nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem

kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie

wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew

Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen

może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających

wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych

Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku

enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje

się być regułą dla profenoacutew

19

42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym

421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna

oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w

D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej

najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji

enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i

wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla

antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano

gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem

zawierającym jony Cu2+

a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z

dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty

na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami

[Cu(L-Pro)2]2+

+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+

+ L-Pro K1 (4)

[Cu(L-Pro)2]2+

+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+

+ L-Pro K2 (5)

gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi

odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału

chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny

Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze

22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz

racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych

antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075

Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne

skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba

enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji

RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej

pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment

ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych

20

starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie

roacuteżnią się między sobą

Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--

fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek

Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z

poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku

prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb

uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na

starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna

zachowała się analogicznie do racematu

21

Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu

W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej

płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)

czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny

(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i

mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki

przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--

fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i

skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-

fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie

prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i

pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)

lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki

22

Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej

D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-

a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny

skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)

Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie

natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu

uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki

Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu

krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie

wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami

Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący

eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako

rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)

4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda

(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny

Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki

pokazano na rys 13

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

4

konfiguracji S natomiast ich antymery R są obojętne dla organizmu Z tego powodu coraz

więcej profenoacutew zaczyna się sprzedawać w formie S [3] Wykazano natomiast iż pod

wpływem roacuteżnorakich czynnikoacutew działających in vivo a także in vitro może zachodzić

zmiana struktury przestrzennej profenoacutew z izomeru R do formy S czyli inwersja chiralna

Wiele spośroacuted kwasoacutew arylooctowych należy podobnie jak profeny do grupy

niesteroidowych lekoacutew przeciwzapalnych Przykładowo kwas migdałowy stosuje się obecnie

w zwalczaniu zmian skoacuternych a -fenyloglicyna wchodząca w skład wielu peptydoacutew

zwiększa ich zdolności lecznicze Oba te związki charakteryzują się stosunkowo niską masą

cząsteczkową i tym że są one chiralne ndash zatem występują w postaci dwoacutech enancjomeroacutew a

co za tym idzie istnieje możliwość że ulegają konwersji chiralnej

Aktywność terapeutyczna profenoacutew polega na hamowaniu działania cyklooksygenazy

kluczowego enzymu w biosyntezie prostaglandyn (czyli grupy hormonoacutew pochodnych

kwasu arachidonowego będących regulatorami procesoacutew fizjologicznych) Enzym ten

występuje w postaci dwoacutech form izomerycznych a mianowicie COX-1 i COX-2 Pierwszy z

nich odpowiada za syntezę prostaglandyn chroniących błonę wyściełającą żołądek

zmniejszając wytwarzanie kwasu żołądkowego i regulując wydzielanie śluzu oraz prawidłowe

ukrwienie żołądka natomiast enzym COX-2 uczestniczy w procesach zapalnych i przyczynia

się do powstawania boacutelu gorączki i obrzękoacutew Bardzo ważną ścieżką w metabolizmie

kwasoacutew 2-arylopropionowych jest inwersja chiralna podczas ktoacuterej nieaktywny w stosunku

do cyklooksygenazy enancjomer R jest przekształcany w swoacutej własny antymer aktywny

wobec cyklooksygenazy

Dlaczego tylko enancjomer R a nie jego antymer ulega inwersji chiralnej Wspoacutelną

strukturalną właściwością profenoacutew jest tetraedryczna hybrydyzacja chiralnego atomu węgla

do ktoacuterego przyłączony jest łańcuch zawierający grupę arylową Stereospecyficzność może

być zaobserwowana w procesach farmakokinetycznych w ktoacuterych wykorzystywany jest

nośnik białkowy czyli receptor lub enzym Dodatkowo występują roacuteżne stosunki ilościowe

lub jakościowe ze względu na stereoselektywność procesoacutew farmakodynamicznych

Mechanizm inwersji sugeruje że enancjomer R może być aktywowany przez przekształcenie

go w adenylan (soacutel kwasu adenozynomonofosforowego) do dalszej reakcji z koenzymem A

podczas gdy adenylan powstały z S-(+)-profenu nie jest zdolny do takiej reakcji [4] Co

ciekawe hamowanie syntezy prostaglandyn przeprowadzane in vitro pokazuje iż aktywność

w tym względzie wykazuje tylko enancjomer S Jednak ta stereoselektywność działania nie

występuje in vivo z powodu jednokierunkowej metabolicznej inwersji chiralnego centrum

asymetrii z nieaktywnego izomeru R do jego antymeru S [5] Farmakokinetyka absorpcji

5

dystrybucji metabolizmu łączenia się z białkiem czy eliminacji może być roacuteżna dla każdego

z enancjomeroacutew szczegoacutelnie woacutewczas gdy dodatkowo weźmie się pod uwagę indywidualne

cechy każdego organizmu żywego oraz toksyczność lekoacutew [6] Kiedy inwersja chiralna nie

jest obserwowana zakłada się iż po prostu nie zachodzi lub że poprzedza ją eliminacja leku

tak jak to się dzieje w przypadku kwasu tiaprofenowego [7]

Ze względu na zasięg i kierunki zachodzenia inwersji chiralnej in vivo profeny można

podzielić na pięć grup [8]

I Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej

II Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej lub nieulegające jej w

ogoacutele

III Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej lub dwukierunkowej

inwersji chiralnej lub nieulegające jej w ogoacutele

IV Profeny ulegające dwukierunkowej inwersji chiralnej lub nieulegające jej w ogoacutele

V Profeny nieulegające inwersji chiralnej

Grupę I reprezentują min ibuprofen fenoprofen benaksoprofen flunaksoprofen

pranoprofen i indoprofen Grupę II w ktoacuterej profeny mogą ulegać inwersji chiralnej gdzie

enancjomer R może przekształcać się w swoacutej antymer S lub nie ulegać jej wcale

reprezentują flurbiprofen suprofen oraz naproksen Jak do tej pory jedynym reprezentantem

grupy III wydaje się być ketoprofen ktoacutery charakteryzuje się tym iż może ulegać inwersji

chiralnej w jednym lub obu kierunkach a także nie ulegać jej wcale Kwas tiaprofenowy oraz

nie wykazujący właściwości leczniczych kwas 2-fenylopropionowy należą do grupy w ktoacuterej

występuje dwukierunkowa inwersja chiralna lub nie występuje ona w ogoacutele czyli do grupy

IV Grupę V czyli grupę profenoacutew nie ulegających inwersji chiralnej reprezentują pirprofen

oraz karprofen

Enzymy ktoacuterymi dysponuje grzyb Verticilium lecanii sprawiają iż w przypadku

ibuprofenu indoprofenu suprofenu flurbiprofenu i fenoprofenu zachodzi jednokierunkowa

inwersja chiralna gdzie enancjomer R przekształca się w swoacutej antymer S a tylko ketoprofen

wykazuje inwersję w odwrotnym kierunku Te wyniki sugerują iż Verticilium lecanii może

być wykorzystywany do produkcji czystych enancjomeroacutew wymienionych związkoacutew [9]

Innym rodzajem grzyba mogącego służyć do produkcji czystych enancjomeroacutew a konkretnie

optycznie czystego S-(+)-atliprofenu jest Candida rugosa [10] natomiast bakterie z rodzaju

Nocardia diaphanozonaria są wykorzystywane w syntezie kwasu R-2-fenylopropionowego

[11]

6

W przypadku kwasu migdałowego inwersja chiralna in vivo jest powodowana przez

bakterie Pseudomonas putida Jeden z enzymoacutew tych bakterii powoduje chiralną inwersję

kwasu S-(+)-migdałowego do jego antymeru [12] Przechodzenie jednego enancjomeru kwasu

migdałowego w drugi obserwuje się roacutewnież u najliczniejszego rzędu ssakoacutew czyli gryzoni a

w szczeglności u szczuroacutew [13]

Zjawisko inwersji chiralnej in vitro nie jest tak dokładnie poznane jak inwersja in vivo

Zespoacuteł kierowany przez prof T Kowalską po raz pierwszy zetknął się z tym zagadnieniem

podczas opracowywania metod chromatograficznego rozdziału par enancjomeroacutew

ibuprofenu naproksenu i kwasu 2-fenylopropionowego Podczas badań prowadzonych przy

pomocy chromatografii cienkowarstwowej z chiralną fazą stacjonarną jako podstawowej

techniki rozdzielczej odkryto że roztwory trzech chiralnych pochodnych kwasu

propionowego sporządzone w dwoacutech rozpuszczalnikach wodnych oraz w jednym

niskocząsteczkowym rozpuszczalniku niewodnym ulegają samorzutnej oscylacyjnej

konwersji chiralnej Wyniki badań chromatograficznych zostały potwierdzone przy pomocy

pomiaroacutew polarymetrycznych oraz analiz przeprowadzonych z wykorzystaniem

wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) Uzyskane w ramach tych badań wyniki

zostały przedstawione min w pracach [14-19]

Zrozumienie znaczenia konformacyjnej stabilności lekoacutew chiralnych może być niezwykle

pomocne przy interpretacji danych otrzymanych z badań farmaceutycznych

farmakokinetycznych czy też farmakodynamicznych Ocena względnej wartości

marketingowej racematu czy też czystego enancjomeru jest wieloczynnikowa W

szczegoacutelności zależy ona od znaczenia i wielkości korzyści terapeutycznych i finansowych a

dodatkowo musi być ustalona dla każdej substancji leczniczej z osobna Dlatego tak ważną

rolę odgrywają w takich przypadkach badania nad inwersją chiralną lekoacutew racemicznych

Przy produkcji stereochemicznie czystych związkoacutew i racematoacutew inwersja chiralna musi być

brana pod uwagę jako kwestia rozstrzygająca i jest to wystarczającym uzasadnieniem dla

szczegoacutełowego rozważania inwersji na każdym z etapoacutew szczegoacutelnie przy produkcji i ocenie

bezpieczeństwa stosowania lekoacutew [20]

7

3 Cel pracy

Szczegoacutełowe cele badawcze niniejszej rozprawy doktorskiej są następujące

I Przebadanie wybranych profenoacutew jako asymetrycznych pochodnych kwasu

propionowego pod kątem ich zdolności do ulegania samorzutnej oscylacyjnej

inwersji chiralnej in vitro Do badań tych wytypowano ketoprofen i flurbiprofen

II Stwierdzenie czy i w jaki sposoacuteb długość łańcucha węglowego decyduje o

zachodzeniu samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro kwasoacutew

karboksylowych W tym celu do prowadzonych badań wytypowano odpowiednie

asymetryczne pochodne kwasu octowego czyli związki o dwoacutech atomach węgla w

łańcuchu Wytypowanymi związkami zostały -fenyloglicyna i kwas migdałowy

III Pogłębienie dotychczasowego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu reakcji

elementarnych składających się na zachodzący in vitro proces samorzutnej

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych asymetrycznych kwasoacutew

karboksylowych

4 Wyniki badań własnych i ich omoacutewienie

W niniejszym rozdziale zostaną przedstawione i omoacutewione wyniki badań własnych

dotyczących możliwości ulegania procesowi samorzutnej oscylacyjnej konwersji chiralnej in

vitro w abiotycznych roztworach etanolowo-wodnych przez S-(+)-flurbiprofen i R-(-)-

flurbiprofen a także wyniki badań związanych z możliwością zachodzenia samorzutnej

peptyzacji in vitro enancjomeroacutew i racematu -fenyloglicyny w abiotycznych roztworach

etanolowo-wodnych Wyniki te pochodzą z badań przeprowadzonych techniką chiralnej

chromatografii cienkowarstwowej i polarymetrii a w przypadku roztworoacutew -fenyloglicyny

wykonano dodatkowo test biuretowy

8

41 Zjawisko racemizacji w układzie chromatograficznycm oraz oscylacyjne zmiany

skręcalności właściwej ([]D) S-(+)-flurbiprofenu i R-(-)-flurbiprofenu

411 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy enancjomery

flurbiprofenu ulegają konwersji chiralnej to znaczy przemianie antymeru S-(+) w R-(-) i

odwrotnie jak to przedstawiono poniższym roacutewnaniem

S-(+)-profen enol R-(-)-profen (1)

Jak do tej pory nie istnieją żadne doniesienia literaturowe na temat rozdziału

enancjomeroacutew flurbiprofenu metodą chromatografii cienkowarstwowej Warunki rozdziału

dla układu TLC były wzorowane na danych zawartych w publikacji Bhushana i Parshada

[21] ktoacuterzy jako pierwsi opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla antymeroacutew

ibuprofenu Jako fazę stacjonarną wykorzystano gotowe płytki pokryte żelem

krzemionkowym i zaimpregnowane metanolowym roztworem L-argininy Na fazę ruchomą

składał się czysty etanol plus kilka kropli lodowatego kwasu octowego Kwasu octowego

użyto do sprotonowania grupy aminowej L-argininy i dzięki temu rozdział enancjomeroacutew był

oparty na mechanizmie tworzenia par jonowych według następujących roacutewnań

L-arginina+ + S-(+)-profen

-L-arginina

+ S-(+)-profen

- (K1) (2)

L-arginina+ + R-(-)-profen

-L-arginina

+ R-(-)-profen

- (K2) (3)

gdzie K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi reakcji natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest

warunkiem rozdziału chromatograficznego dwu antymeroacutew flurbiprofenu

We wszystkich przeprowadzonych doświadczeniach użyto świeżo sporządzone roztwory

S-(+)-flurbiprofenu oraz R-(-)-flurbiprofenu w mieszaninie etanolu i wody w stosunku

objętościowym 73 o trzech roacuteżnych stężeniach roacutewnych 01 05 i 10 mgmL-1

Przygotowano roacutewnież roztwoacuter testowy tj mieszaninę racemiczną RS-(plusmn)-flurbiprofenu o

stężeniu 02 mgmL-1

dla każdego z enancjomeroacutew przy zastosowaniu tego samego

rozpuszczalnika

9

W celu sprawdzenia czy warunki odpowiednie do rozdziału enancjomeroacutew ibuprofenu

pozwalają na rozdział enancjomeroacutew flurbiprofenu testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej

badanego związku poddano procesowi chromatografowania w wyżej wymienionych

warunkach Zastosowano dwukierunkowe rozwijanie płytek chromatograficznych Wyniki

tego procesu przedstawiają rys 1 i 2

(a)

(b)

Rys 1 Wideoskany (a) całej płytki chromatograficznej rozwijanej w dwoacutech kierunkach oraz (b)

powiększonego obszaru na ktoacuterym nastąpił rozdział antymeroacutew flurbiprofenu

10

(a)

(b)

Rys 2 (a) Dwuwymiarowy i (b) troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający rozdział enancjomeroacutew

flurbiprofenu Obrazy te wygenerowano przez densytometryczne skanowanie chromatogramu 30 liniami w

odstępach 1 mm

Dwie plamki widoczne na rys 1 zostały poddane analizie Pierwszym sposobem

identyfikacji plamek była densytometryczna rejestracja widm UV każdej z nich bezpośrednio

11

z chromatografowanej płytki Obie plamki dały identyczne widmo w ultrafiolecie Co więcej

z płytki zdrapano żel krzemionkowy z umiejscowionymi plamkami a każdą proacutebkę żelu z

osobna zalano etanolem Następnie tak przygotowane roztwory przesączono zagęszczono i

poddano analizie techniką niechiralnej HPLCndashDAD Otrzymane wyniki dla każdej z proacutebek

były takie same Maksima pikoacutew chromatograficznych odpowiadających każdej z dwoacutech

plamek posiadały ten sam czas retencji i w dodatku to samo widmo UV Można zatem

stwierdzić iż doszło do rozdziału mieszaniny racemicznej flurbiprofenu a każda z plamek

reprezentuje jeden z enancjomeroacutew

Następnym etapem eksperymentu była proacuteba określenia każdej z plamek jako

odpowiednio S-(+)- oraz R-(-)-flurbiprofenu W tym celu chromatografowano świeżo

sporządzone etanolowo-wodne roztwory każdego z nich w takich samych warunkach co

testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej Niestety nie udało się zidentyfikować plamek gdyż

chromatogramy otrzymane dla każdego z antymeroacutew flurbiprofenu wyglądały identycznie

jak chromatogram otrzymany dla roztworu testowego co widać na rys 3a i b ktoacutere są

praktycznie identyczne z rys 1b

(a) (b)

Rys 3 Wideoskany chromatogramoacutew uzyskanych dla (a) S-(+)-flurbiprofenu i (b) R-(-)-flurbiprofenu

Ostatnim etapem eksperymentu było wykazanie ilościowej zależności rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia proacutebki W tym celu dla każdego z enancjomeroacutew

flurbiprofenu sporządzono roztwory etanolowo-wodne o trzech roacuteżnych stężeniach o czym

wspomniano już wcześniej a następnie chromatografowano je w identyczny sposoacuteb jak

poprzednio Na rys 4 i 5 przedstawiono wyniki otrzymane jedynie dla R-(-)-flurbiprofenu

ponieważ jego antymer S-(+) zachowuje się w podanych warunkach dokładnie tak samo Jak

widać rys 4a-4c są analogiczne z rys 2a natomiast rys 5a-5c z rys 2b Wynika z nich

12

jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego

enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew

zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają

Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

(a)

(b)

(c)

13

Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się

pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory

pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem

wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej

przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką

rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim

środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i

oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych

zadaniach analitycznych

412 Polarymetria

4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu

Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w

roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew

roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb

nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych

odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6

14

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]

[]D

day 0

44

45

46

47

48

0 1 2 3 4 5 6 7

day 1

43

44

45

46

23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2

41

42

43

44

45

45 50 55

day 5

39

40

41

42

43

116 121 126

day 6

40

41

42

43

141 146 151

day 7

40

41

42

43

44

164 169 174

Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z

natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na

tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D

zmierzają do zera

Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej

chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może

ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę

rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

15

4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu

Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech

seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu

w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC

były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-

minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195

time [hours]

[]D

day 0

-40

-39

-38

-37

-36

0 2 4 6

day 1

-38

-37

-36

-35

-34

24 25 26 27 28 29 30 31

day 2

-36

-35

-34

-33

-32

-31

-30

46 48 50 52 54

day 5

-22

-21

-20

-19

-18

120 122 124 126 128

day 6

-19

-18

-17

-16

144 146 148 150 152

day 7

-14

-13

-12

-11

-10

-9

-8

167 169 171 173

day 8

-8

-7

-6

-5

192 193 194 195

Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury

oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a

długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący

proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8

16

Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter

oscylacyjny

W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu

była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i

22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla

roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu

działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała

niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej

w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie

mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1

OC Na rys 9a i b przedstawiono

wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń

17

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(a)

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(b)

Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze

(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu

działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą

Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu

polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na

przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną

konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się

wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem

jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej

roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny

wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew

wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na

18

bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku

roacuteżnych reakcji oscylacyjnych

Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu

ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu

czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo

nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem

kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie

wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew

Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen

może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających

wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych

Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku

enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje

się być regułą dla profenoacutew

19

42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym

421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna

oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w

D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej

najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji

enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i

wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla

antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano

gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem

zawierającym jony Cu2+

a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z

dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty

na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami

[Cu(L-Pro)2]2+

+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+

+ L-Pro K1 (4)

[Cu(L-Pro)2]2+

+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+

+ L-Pro K2 (5)

gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi

odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału

chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny

Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze

22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz

racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych

antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075

Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne

skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba

enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji

RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej

pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment

ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych

20

starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie

roacuteżnią się między sobą

Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--

fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek

Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z

poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku

prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb

uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na

starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna

zachowała się analogicznie do racematu

21

Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu

W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej

płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)

czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny

(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i

mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki

przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--

fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i

skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-

fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie

prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i

pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)

lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki

22

Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej

D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-

a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny

skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)

Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie

natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu

uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki

Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu

krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie

wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami

Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący

eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako

rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)

4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda

(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny

Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki

pokazano na rys 13

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

5

dystrybucji metabolizmu łączenia się z białkiem czy eliminacji może być roacuteżna dla każdego

z enancjomeroacutew szczegoacutelnie woacutewczas gdy dodatkowo weźmie się pod uwagę indywidualne

cechy każdego organizmu żywego oraz toksyczność lekoacutew [6] Kiedy inwersja chiralna nie

jest obserwowana zakłada się iż po prostu nie zachodzi lub że poprzedza ją eliminacja leku

tak jak to się dzieje w przypadku kwasu tiaprofenowego [7]

Ze względu na zasięg i kierunki zachodzenia inwersji chiralnej in vivo profeny można

podzielić na pięć grup [8]

I Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej

II Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej lub nieulegające jej w

ogoacutele

III Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej lub dwukierunkowej

inwersji chiralnej lub nieulegające jej w ogoacutele

IV Profeny ulegające dwukierunkowej inwersji chiralnej lub nieulegające jej w ogoacutele

V Profeny nieulegające inwersji chiralnej

Grupę I reprezentują min ibuprofen fenoprofen benaksoprofen flunaksoprofen

pranoprofen i indoprofen Grupę II w ktoacuterej profeny mogą ulegać inwersji chiralnej gdzie

enancjomer R może przekształcać się w swoacutej antymer S lub nie ulegać jej wcale

reprezentują flurbiprofen suprofen oraz naproksen Jak do tej pory jedynym reprezentantem

grupy III wydaje się być ketoprofen ktoacutery charakteryzuje się tym iż może ulegać inwersji

chiralnej w jednym lub obu kierunkach a także nie ulegać jej wcale Kwas tiaprofenowy oraz

nie wykazujący właściwości leczniczych kwas 2-fenylopropionowy należą do grupy w ktoacuterej

występuje dwukierunkowa inwersja chiralna lub nie występuje ona w ogoacutele czyli do grupy

IV Grupę V czyli grupę profenoacutew nie ulegających inwersji chiralnej reprezentują pirprofen

oraz karprofen

Enzymy ktoacuterymi dysponuje grzyb Verticilium lecanii sprawiają iż w przypadku

ibuprofenu indoprofenu suprofenu flurbiprofenu i fenoprofenu zachodzi jednokierunkowa

inwersja chiralna gdzie enancjomer R przekształca się w swoacutej antymer S a tylko ketoprofen

wykazuje inwersję w odwrotnym kierunku Te wyniki sugerują iż Verticilium lecanii może

być wykorzystywany do produkcji czystych enancjomeroacutew wymienionych związkoacutew [9]

Innym rodzajem grzyba mogącego służyć do produkcji czystych enancjomeroacutew a konkretnie

optycznie czystego S-(+)-atliprofenu jest Candida rugosa [10] natomiast bakterie z rodzaju

Nocardia diaphanozonaria są wykorzystywane w syntezie kwasu R-2-fenylopropionowego

[11]

6

W przypadku kwasu migdałowego inwersja chiralna in vivo jest powodowana przez

bakterie Pseudomonas putida Jeden z enzymoacutew tych bakterii powoduje chiralną inwersję

kwasu S-(+)-migdałowego do jego antymeru [12] Przechodzenie jednego enancjomeru kwasu

migdałowego w drugi obserwuje się roacutewnież u najliczniejszego rzędu ssakoacutew czyli gryzoni a

w szczeglności u szczuroacutew [13]

Zjawisko inwersji chiralnej in vitro nie jest tak dokładnie poznane jak inwersja in vivo

Zespoacuteł kierowany przez prof T Kowalską po raz pierwszy zetknął się z tym zagadnieniem

podczas opracowywania metod chromatograficznego rozdziału par enancjomeroacutew

ibuprofenu naproksenu i kwasu 2-fenylopropionowego Podczas badań prowadzonych przy

pomocy chromatografii cienkowarstwowej z chiralną fazą stacjonarną jako podstawowej

techniki rozdzielczej odkryto że roztwory trzech chiralnych pochodnych kwasu

propionowego sporządzone w dwoacutech rozpuszczalnikach wodnych oraz w jednym

niskocząsteczkowym rozpuszczalniku niewodnym ulegają samorzutnej oscylacyjnej

konwersji chiralnej Wyniki badań chromatograficznych zostały potwierdzone przy pomocy

pomiaroacutew polarymetrycznych oraz analiz przeprowadzonych z wykorzystaniem

wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) Uzyskane w ramach tych badań wyniki

zostały przedstawione min w pracach [14-19]

Zrozumienie znaczenia konformacyjnej stabilności lekoacutew chiralnych może być niezwykle

pomocne przy interpretacji danych otrzymanych z badań farmaceutycznych

farmakokinetycznych czy też farmakodynamicznych Ocena względnej wartości

marketingowej racematu czy też czystego enancjomeru jest wieloczynnikowa W

szczegoacutelności zależy ona od znaczenia i wielkości korzyści terapeutycznych i finansowych a

dodatkowo musi być ustalona dla każdej substancji leczniczej z osobna Dlatego tak ważną

rolę odgrywają w takich przypadkach badania nad inwersją chiralną lekoacutew racemicznych

Przy produkcji stereochemicznie czystych związkoacutew i racematoacutew inwersja chiralna musi być

brana pod uwagę jako kwestia rozstrzygająca i jest to wystarczającym uzasadnieniem dla

szczegoacutełowego rozważania inwersji na każdym z etapoacutew szczegoacutelnie przy produkcji i ocenie

bezpieczeństwa stosowania lekoacutew [20]

7

3 Cel pracy

Szczegoacutełowe cele badawcze niniejszej rozprawy doktorskiej są następujące

I Przebadanie wybranych profenoacutew jako asymetrycznych pochodnych kwasu

propionowego pod kątem ich zdolności do ulegania samorzutnej oscylacyjnej

inwersji chiralnej in vitro Do badań tych wytypowano ketoprofen i flurbiprofen

II Stwierdzenie czy i w jaki sposoacuteb długość łańcucha węglowego decyduje o

zachodzeniu samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro kwasoacutew

karboksylowych W tym celu do prowadzonych badań wytypowano odpowiednie

asymetryczne pochodne kwasu octowego czyli związki o dwoacutech atomach węgla w

łańcuchu Wytypowanymi związkami zostały -fenyloglicyna i kwas migdałowy

III Pogłębienie dotychczasowego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu reakcji

elementarnych składających się na zachodzący in vitro proces samorzutnej

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych asymetrycznych kwasoacutew

karboksylowych

4 Wyniki badań własnych i ich omoacutewienie

W niniejszym rozdziale zostaną przedstawione i omoacutewione wyniki badań własnych

dotyczących możliwości ulegania procesowi samorzutnej oscylacyjnej konwersji chiralnej in

vitro w abiotycznych roztworach etanolowo-wodnych przez S-(+)-flurbiprofen i R-(-)-

flurbiprofen a także wyniki badań związanych z możliwością zachodzenia samorzutnej

peptyzacji in vitro enancjomeroacutew i racematu -fenyloglicyny w abiotycznych roztworach

etanolowo-wodnych Wyniki te pochodzą z badań przeprowadzonych techniką chiralnej

chromatografii cienkowarstwowej i polarymetrii a w przypadku roztworoacutew -fenyloglicyny

wykonano dodatkowo test biuretowy

8

41 Zjawisko racemizacji w układzie chromatograficznycm oraz oscylacyjne zmiany

skręcalności właściwej ([]D) S-(+)-flurbiprofenu i R-(-)-flurbiprofenu

411 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy enancjomery

flurbiprofenu ulegają konwersji chiralnej to znaczy przemianie antymeru S-(+) w R-(-) i

odwrotnie jak to przedstawiono poniższym roacutewnaniem

S-(+)-profen enol R-(-)-profen (1)

Jak do tej pory nie istnieją żadne doniesienia literaturowe na temat rozdziału

enancjomeroacutew flurbiprofenu metodą chromatografii cienkowarstwowej Warunki rozdziału

dla układu TLC były wzorowane na danych zawartych w publikacji Bhushana i Parshada

[21] ktoacuterzy jako pierwsi opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla antymeroacutew

ibuprofenu Jako fazę stacjonarną wykorzystano gotowe płytki pokryte żelem

krzemionkowym i zaimpregnowane metanolowym roztworem L-argininy Na fazę ruchomą

składał się czysty etanol plus kilka kropli lodowatego kwasu octowego Kwasu octowego

użyto do sprotonowania grupy aminowej L-argininy i dzięki temu rozdział enancjomeroacutew był

oparty na mechanizmie tworzenia par jonowych według następujących roacutewnań

L-arginina+ + S-(+)-profen

-L-arginina

+ S-(+)-profen

- (K1) (2)

L-arginina+ + R-(-)-profen

-L-arginina

+ R-(-)-profen

- (K2) (3)

gdzie K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi reakcji natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest

warunkiem rozdziału chromatograficznego dwu antymeroacutew flurbiprofenu

We wszystkich przeprowadzonych doświadczeniach użyto świeżo sporządzone roztwory

S-(+)-flurbiprofenu oraz R-(-)-flurbiprofenu w mieszaninie etanolu i wody w stosunku

objętościowym 73 o trzech roacuteżnych stężeniach roacutewnych 01 05 i 10 mgmL-1

Przygotowano roacutewnież roztwoacuter testowy tj mieszaninę racemiczną RS-(plusmn)-flurbiprofenu o

stężeniu 02 mgmL-1

dla każdego z enancjomeroacutew przy zastosowaniu tego samego

rozpuszczalnika

9

W celu sprawdzenia czy warunki odpowiednie do rozdziału enancjomeroacutew ibuprofenu

pozwalają na rozdział enancjomeroacutew flurbiprofenu testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej

badanego związku poddano procesowi chromatografowania w wyżej wymienionych

warunkach Zastosowano dwukierunkowe rozwijanie płytek chromatograficznych Wyniki

tego procesu przedstawiają rys 1 i 2

(a)

(b)

Rys 1 Wideoskany (a) całej płytki chromatograficznej rozwijanej w dwoacutech kierunkach oraz (b)

powiększonego obszaru na ktoacuterym nastąpił rozdział antymeroacutew flurbiprofenu

10

(a)

(b)

Rys 2 (a) Dwuwymiarowy i (b) troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający rozdział enancjomeroacutew

flurbiprofenu Obrazy te wygenerowano przez densytometryczne skanowanie chromatogramu 30 liniami w

odstępach 1 mm

Dwie plamki widoczne na rys 1 zostały poddane analizie Pierwszym sposobem

identyfikacji plamek była densytometryczna rejestracja widm UV każdej z nich bezpośrednio

11

z chromatografowanej płytki Obie plamki dały identyczne widmo w ultrafiolecie Co więcej

z płytki zdrapano żel krzemionkowy z umiejscowionymi plamkami a każdą proacutebkę żelu z

osobna zalano etanolem Następnie tak przygotowane roztwory przesączono zagęszczono i

poddano analizie techniką niechiralnej HPLCndashDAD Otrzymane wyniki dla każdej z proacutebek

były takie same Maksima pikoacutew chromatograficznych odpowiadających każdej z dwoacutech

plamek posiadały ten sam czas retencji i w dodatku to samo widmo UV Można zatem

stwierdzić iż doszło do rozdziału mieszaniny racemicznej flurbiprofenu a każda z plamek

reprezentuje jeden z enancjomeroacutew

Następnym etapem eksperymentu była proacuteba określenia każdej z plamek jako

odpowiednio S-(+)- oraz R-(-)-flurbiprofenu W tym celu chromatografowano świeżo

sporządzone etanolowo-wodne roztwory każdego z nich w takich samych warunkach co

testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej Niestety nie udało się zidentyfikować plamek gdyż

chromatogramy otrzymane dla każdego z antymeroacutew flurbiprofenu wyglądały identycznie

jak chromatogram otrzymany dla roztworu testowego co widać na rys 3a i b ktoacutere są

praktycznie identyczne z rys 1b

(a) (b)

Rys 3 Wideoskany chromatogramoacutew uzyskanych dla (a) S-(+)-flurbiprofenu i (b) R-(-)-flurbiprofenu

Ostatnim etapem eksperymentu było wykazanie ilościowej zależności rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia proacutebki W tym celu dla każdego z enancjomeroacutew

flurbiprofenu sporządzono roztwory etanolowo-wodne o trzech roacuteżnych stężeniach o czym

wspomniano już wcześniej a następnie chromatografowano je w identyczny sposoacuteb jak

poprzednio Na rys 4 i 5 przedstawiono wyniki otrzymane jedynie dla R-(-)-flurbiprofenu

ponieważ jego antymer S-(+) zachowuje się w podanych warunkach dokładnie tak samo Jak

widać rys 4a-4c są analogiczne z rys 2a natomiast rys 5a-5c z rys 2b Wynika z nich

12

jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego

enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew

zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają

Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

(a)

(b)

(c)

13

Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się

pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory

pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem

wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej

przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką

rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim

środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i

oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych

zadaniach analitycznych

412 Polarymetria

4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu

Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w

roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew

roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb

nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych

odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6

14

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]

[]D

day 0

44

45

46

47

48

0 1 2 3 4 5 6 7

day 1

43

44

45

46

23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2

41

42

43

44

45

45 50 55

day 5

39

40

41

42

43

116 121 126

day 6

40

41

42

43

141 146 151

day 7

40

41

42

43

44

164 169 174

Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z

natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na

tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D

zmierzają do zera

Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej

chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może

ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę

rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

15

4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu

Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech

seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu

w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC

były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-

minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195

time [hours]

[]D

day 0

-40

-39

-38

-37

-36

0 2 4 6

day 1

-38

-37

-36

-35

-34

24 25 26 27 28 29 30 31

day 2

-36

-35

-34

-33

-32

-31

-30

46 48 50 52 54

day 5

-22

-21

-20

-19

-18

120 122 124 126 128

day 6

-19

-18

-17

-16

144 146 148 150 152

day 7

-14

-13

-12

-11

-10

-9

-8

167 169 171 173

day 8

-8

-7

-6

-5

192 193 194 195

Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury

oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a

długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący

proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8

16

Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter

oscylacyjny

W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu

była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i

22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla

roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu

działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała

niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej

w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie

mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1

OC Na rys 9a i b przedstawiono

wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń

17

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(a)

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(b)

Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze

(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu

działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą

Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu

polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na

przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną

konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się

wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem

jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej

roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny

wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew

wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na

18

bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku

roacuteżnych reakcji oscylacyjnych

Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu

ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu

czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo

nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem

kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie

wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew

Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen

może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających

wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych

Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku

enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje

się być regułą dla profenoacutew

19

42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym

421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna

oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w

D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej

najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji

enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i

wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla

antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano

gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem

zawierającym jony Cu2+

a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z

dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty

na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami

[Cu(L-Pro)2]2+

+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+

+ L-Pro K1 (4)

[Cu(L-Pro)2]2+

+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+

+ L-Pro K2 (5)

gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi

odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału

chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny

Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze

22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz

racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych

antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075

Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne

skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba

enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji

RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej

pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment

ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych

20

starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie

roacuteżnią się między sobą

Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--

fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek

Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z

poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku

prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb

uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na

starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna

zachowała się analogicznie do racematu

21

Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu

W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej

płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)

czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny

(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i

mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki

przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--

fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i

skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-

fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie

prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i

pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)

lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki

22

Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej

D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-

a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny

skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)

Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie

natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu

uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki

Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu

krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie

wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami

Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący

eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako

rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)

4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda

(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny

Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki

pokazano na rys 13

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

6

W przypadku kwasu migdałowego inwersja chiralna in vivo jest powodowana przez

bakterie Pseudomonas putida Jeden z enzymoacutew tych bakterii powoduje chiralną inwersję

kwasu S-(+)-migdałowego do jego antymeru [12] Przechodzenie jednego enancjomeru kwasu

migdałowego w drugi obserwuje się roacutewnież u najliczniejszego rzędu ssakoacutew czyli gryzoni a

w szczeglności u szczuroacutew [13]

Zjawisko inwersji chiralnej in vitro nie jest tak dokładnie poznane jak inwersja in vivo

Zespoacuteł kierowany przez prof T Kowalską po raz pierwszy zetknął się z tym zagadnieniem

podczas opracowywania metod chromatograficznego rozdziału par enancjomeroacutew

ibuprofenu naproksenu i kwasu 2-fenylopropionowego Podczas badań prowadzonych przy

pomocy chromatografii cienkowarstwowej z chiralną fazą stacjonarną jako podstawowej

techniki rozdzielczej odkryto że roztwory trzech chiralnych pochodnych kwasu

propionowego sporządzone w dwoacutech rozpuszczalnikach wodnych oraz w jednym

niskocząsteczkowym rozpuszczalniku niewodnym ulegają samorzutnej oscylacyjnej

konwersji chiralnej Wyniki badań chromatograficznych zostały potwierdzone przy pomocy

pomiaroacutew polarymetrycznych oraz analiz przeprowadzonych z wykorzystaniem

wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) Uzyskane w ramach tych badań wyniki

zostały przedstawione min w pracach [14-19]

Zrozumienie znaczenia konformacyjnej stabilności lekoacutew chiralnych może być niezwykle

pomocne przy interpretacji danych otrzymanych z badań farmaceutycznych

farmakokinetycznych czy też farmakodynamicznych Ocena względnej wartości

marketingowej racematu czy też czystego enancjomeru jest wieloczynnikowa W

szczegoacutelności zależy ona od znaczenia i wielkości korzyści terapeutycznych i finansowych a

dodatkowo musi być ustalona dla każdej substancji leczniczej z osobna Dlatego tak ważną

rolę odgrywają w takich przypadkach badania nad inwersją chiralną lekoacutew racemicznych

Przy produkcji stereochemicznie czystych związkoacutew i racematoacutew inwersja chiralna musi być

brana pod uwagę jako kwestia rozstrzygająca i jest to wystarczającym uzasadnieniem dla

szczegoacutełowego rozważania inwersji na każdym z etapoacutew szczegoacutelnie przy produkcji i ocenie

bezpieczeństwa stosowania lekoacutew [20]

7

3 Cel pracy

Szczegoacutełowe cele badawcze niniejszej rozprawy doktorskiej są następujące

I Przebadanie wybranych profenoacutew jako asymetrycznych pochodnych kwasu

propionowego pod kątem ich zdolności do ulegania samorzutnej oscylacyjnej

inwersji chiralnej in vitro Do badań tych wytypowano ketoprofen i flurbiprofen

II Stwierdzenie czy i w jaki sposoacuteb długość łańcucha węglowego decyduje o

zachodzeniu samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro kwasoacutew

karboksylowych W tym celu do prowadzonych badań wytypowano odpowiednie

asymetryczne pochodne kwasu octowego czyli związki o dwoacutech atomach węgla w

łańcuchu Wytypowanymi związkami zostały -fenyloglicyna i kwas migdałowy

III Pogłębienie dotychczasowego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu reakcji

elementarnych składających się na zachodzący in vitro proces samorzutnej

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych asymetrycznych kwasoacutew

karboksylowych

4 Wyniki badań własnych i ich omoacutewienie

W niniejszym rozdziale zostaną przedstawione i omoacutewione wyniki badań własnych

dotyczących możliwości ulegania procesowi samorzutnej oscylacyjnej konwersji chiralnej in

vitro w abiotycznych roztworach etanolowo-wodnych przez S-(+)-flurbiprofen i R-(-)-

flurbiprofen a także wyniki badań związanych z możliwością zachodzenia samorzutnej

peptyzacji in vitro enancjomeroacutew i racematu -fenyloglicyny w abiotycznych roztworach

etanolowo-wodnych Wyniki te pochodzą z badań przeprowadzonych techniką chiralnej

chromatografii cienkowarstwowej i polarymetrii a w przypadku roztworoacutew -fenyloglicyny

wykonano dodatkowo test biuretowy

8

41 Zjawisko racemizacji w układzie chromatograficznycm oraz oscylacyjne zmiany

skręcalności właściwej ([]D) S-(+)-flurbiprofenu i R-(-)-flurbiprofenu

411 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy enancjomery

flurbiprofenu ulegają konwersji chiralnej to znaczy przemianie antymeru S-(+) w R-(-) i

odwrotnie jak to przedstawiono poniższym roacutewnaniem

S-(+)-profen enol R-(-)-profen (1)

Jak do tej pory nie istnieją żadne doniesienia literaturowe na temat rozdziału

enancjomeroacutew flurbiprofenu metodą chromatografii cienkowarstwowej Warunki rozdziału

dla układu TLC były wzorowane na danych zawartych w publikacji Bhushana i Parshada

[21] ktoacuterzy jako pierwsi opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla antymeroacutew

ibuprofenu Jako fazę stacjonarną wykorzystano gotowe płytki pokryte żelem

krzemionkowym i zaimpregnowane metanolowym roztworem L-argininy Na fazę ruchomą

składał się czysty etanol plus kilka kropli lodowatego kwasu octowego Kwasu octowego

użyto do sprotonowania grupy aminowej L-argininy i dzięki temu rozdział enancjomeroacutew był

oparty na mechanizmie tworzenia par jonowych według następujących roacutewnań

L-arginina+ + S-(+)-profen

-L-arginina

+ S-(+)-profen

- (K1) (2)

L-arginina+ + R-(-)-profen

-L-arginina

+ R-(-)-profen

- (K2) (3)

gdzie K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi reakcji natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest

warunkiem rozdziału chromatograficznego dwu antymeroacutew flurbiprofenu

We wszystkich przeprowadzonych doświadczeniach użyto świeżo sporządzone roztwory

S-(+)-flurbiprofenu oraz R-(-)-flurbiprofenu w mieszaninie etanolu i wody w stosunku

objętościowym 73 o trzech roacuteżnych stężeniach roacutewnych 01 05 i 10 mgmL-1

Przygotowano roacutewnież roztwoacuter testowy tj mieszaninę racemiczną RS-(plusmn)-flurbiprofenu o

stężeniu 02 mgmL-1

dla każdego z enancjomeroacutew przy zastosowaniu tego samego

rozpuszczalnika

9

W celu sprawdzenia czy warunki odpowiednie do rozdziału enancjomeroacutew ibuprofenu

pozwalają na rozdział enancjomeroacutew flurbiprofenu testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej

badanego związku poddano procesowi chromatografowania w wyżej wymienionych

warunkach Zastosowano dwukierunkowe rozwijanie płytek chromatograficznych Wyniki

tego procesu przedstawiają rys 1 i 2

(a)

(b)

Rys 1 Wideoskany (a) całej płytki chromatograficznej rozwijanej w dwoacutech kierunkach oraz (b)

powiększonego obszaru na ktoacuterym nastąpił rozdział antymeroacutew flurbiprofenu

10

(a)

(b)

Rys 2 (a) Dwuwymiarowy i (b) troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający rozdział enancjomeroacutew

flurbiprofenu Obrazy te wygenerowano przez densytometryczne skanowanie chromatogramu 30 liniami w

odstępach 1 mm

Dwie plamki widoczne na rys 1 zostały poddane analizie Pierwszym sposobem

identyfikacji plamek była densytometryczna rejestracja widm UV każdej z nich bezpośrednio

11

z chromatografowanej płytki Obie plamki dały identyczne widmo w ultrafiolecie Co więcej

z płytki zdrapano żel krzemionkowy z umiejscowionymi plamkami a każdą proacutebkę żelu z

osobna zalano etanolem Następnie tak przygotowane roztwory przesączono zagęszczono i

poddano analizie techniką niechiralnej HPLCndashDAD Otrzymane wyniki dla każdej z proacutebek

były takie same Maksima pikoacutew chromatograficznych odpowiadających każdej z dwoacutech

plamek posiadały ten sam czas retencji i w dodatku to samo widmo UV Można zatem

stwierdzić iż doszło do rozdziału mieszaniny racemicznej flurbiprofenu a każda z plamek

reprezentuje jeden z enancjomeroacutew

Następnym etapem eksperymentu była proacuteba określenia każdej z plamek jako

odpowiednio S-(+)- oraz R-(-)-flurbiprofenu W tym celu chromatografowano świeżo

sporządzone etanolowo-wodne roztwory każdego z nich w takich samych warunkach co

testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej Niestety nie udało się zidentyfikować plamek gdyż

chromatogramy otrzymane dla każdego z antymeroacutew flurbiprofenu wyglądały identycznie

jak chromatogram otrzymany dla roztworu testowego co widać na rys 3a i b ktoacutere są

praktycznie identyczne z rys 1b

(a) (b)

Rys 3 Wideoskany chromatogramoacutew uzyskanych dla (a) S-(+)-flurbiprofenu i (b) R-(-)-flurbiprofenu

Ostatnim etapem eksperymentu było wykazanie ilościowej zależności rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia proacutebki W tym celu dla każdego z enancjomeroacutew

flurbiprofenu sporządzono roztwory etanolowo-wodne o trzech roacuteżnych stężeniach o czym

wspomniano już wcześniej a następnie chromatografowano je w identyczny sposoacuteb jak

poprzednio Na rys 4 i 5 przedstawiono wyniki otrzymane jedynie dla R-(-)-flurbiprofenu

ponieważ jego antymer S-(+) zachowuje się w podanych warunkach dokładnie tak samo Jak

widać rys 4a-4c są analogiczne z rys 2a natomiast rys 5a-5c z rys 2b Wynika z nich

12

jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego

enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew

zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają

Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

(a)

(b)

(c)

13

Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się

pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory

pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem

wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej

przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką

rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim

środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i

oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych

zadaniach analitycznych

412 Polarymetria

4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu

Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w

roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew

roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb

nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych

odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6

14

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]

[]D

day 0

44

45

46

47

48

0 1 2 3 4 5 6 7

day 1

43

44

45

46

23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2

41

42

43

44

45

45 50 55

day 5

39

40

41

42

43

116 121 126

day 6

40

41

42

43

141 146 151

day 7

40

41

42

43

44

164 169 174

Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z

natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na

tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D

zmierzają do zera

Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej

chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może

ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę

rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

15

4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu

Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech

seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu

w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC

były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-

minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195

time [hours]

[]D

day 0

-40

-39

-38

-37

-36

0 2 4 6

day 1

-38

-37

-36

-35

-34

24 25 26 27 28 29 30 31

day 2

-36

-35

-34

-33

-32

-31

-30

46 48 50 52 54

day 5

-22

-21

-20

-19

-18

120 122 124 126 128

day 6

-19

-18

-17

-16

144 146 148 150 152

day 7

-14

-13

-12

-11

-10

-9

-8

167 169 171 173

day 8

-8

-7

-6

-5

192 193 194 195

Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury

oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a

długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący

proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8

16

Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter

oscylacyjny

W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu

była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i

22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla

roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu

działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała

niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej

w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie

mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1

OC Na rys 9a i b przedstawiono

wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń

17

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(a)

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(b)

Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze

(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu

działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą

Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu

polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na

przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną

konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się

wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem

jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej

roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny

wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew

wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na

18

bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku

roacuteżnych reakcji oscylacyjnych

Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu

ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu

czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo

nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem

kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie

wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew

Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen

może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających

wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych

Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku

enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje

się być regułą dla profenoacutew

19

42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym

421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna

oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w

D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej

najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji

enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i

wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla

antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano

gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem

zawierającym jony Cu2+

a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z

dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty

na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami

[Cu(L-Pro)2]2+

+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+

+ L-Pro K1 (4)

[Cu(L-Pro)2]2+

+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+

+ L-Pro K2 (5)

gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi

odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału

chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny

Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze

22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz

racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych

antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075

Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne

skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba

enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji

RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej

pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment

ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych

20

starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie

roacuteżnią się między sobą

Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--

fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek

Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z

poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku

prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb

uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na

starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna

zachowała się analogicznie do racematu

21

Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu

W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej

płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)

czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny

(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i

mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki

przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--

fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i

skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-

fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie

prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i

pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)

lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki

22

Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej

D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-

a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny

skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)

Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie

natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu

uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki

Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu

krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie

wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami

Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący

eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako

rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)

4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda

(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny

Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki

pokazano na rys 13

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

7

3 Cel pracy

Szczegoacutełowe cele badawcze niniejszej rozprawy doktorskiej są następujące

I Przebadanie wybranych profenoacutew jako asymetrycznych pochodnych kwasu

propionowego pod kątem ich zdolności do ulegania samorzutnej oscylacyjnej

inwersji chiralnej in vitro Do badań tych wytypowano ketoprofen i flurbiprofen

II Stwierdzenie czy i w jaki sposoacuteb długość łańcucha węglowego decyduje o

zachodzeniu samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro kwasoacutew

karboksylowych W tym celu do prowadzonych badań wytypowano odpowiednie

asymetryczne pochodne kwasu octowego czyli związki o dwoacutech atomach węgla w

łańcuchu Wytypowanymi związkami zostały -fenyloglicyna i kwas migdałowy

III Pogłębienie dotychczasowego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu reakcji

elementarnych składających się na zachodzący in vitro proces samorzutnej

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych asymetrycznych kwasoacutew

karboksylowych

4 Wyniki badań własnych i ich omoacutewienie

W niniejszym rozdziale zostaną przedstawione i omoacutewione wyniki badań własnych

dotyczących możliwości ulegania procesowi samorzutnej oscylacyjnej konwersji chiralnej in

vitro w abiotycznych roztworach etanolowo-wodnych przez S-(+)-flurbiprofen i R-(-)-

flurbiprofen a także wyniki badań związanych z możliwością zachodzenia samorzutnej

peptyzacji in vitro enancjomeroacutew i racematu -fenyloglicyny w abiotycznych roztworach

etanolowo-wodnych Wyniki te pochodzą z badań przeprowadzonych techniką chiralnej

chromatografii cienkowarstwowej i polarymetrii a w przypadku roztworoacutew -fenyloglicyny

wykonano dodatkowo test biuretowy

8

41 Zjawisko racemizacji w układzie chromatograficznycm oraz oscylacyjne zmiany

skręcalności właściwej ([]D) S-(+)-flurbiprofenu i R-(-)-flurbiprofenu

411 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy enancjomery

flurbiprofenu ulegają konwersji chiralnej to znaczy przemianie antymeru S-(+) w R-(-) i

odwrotnie jak to przedstawiono poniższym roacutewnaniem

S-(+)-profen enol R-(-)-profen (1)

Jak do tej pory nie istnieją żadne doniesienia literaturowe na temat rozdziału

enancjomeroacutew flurbiprofenu metodą chromatografii cienkowarstwowej Warunki rozdziału

dla układu TLC były wzorowane na danych zawartych w publikacji Bhushana i Parshada

[21] ktoacuterzy jako pierwsi opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla antymeroacutew

ibuprofenu Jako fazę stacjonarną wykorzystano gotowe płytki pokryte żelem

krzemionkowym i zaimpregnowane metanolowym roztworem L-argininy Na fazę ruchomą

składał się czysty etanol plus kilka kropli lodowatego kwasu octowego Kwasu octowego

użyto do sprotonowania grupy aminowej L-argininy i dzięki temu rozdział enancjomeroacutew był

oparty na mechanizmie tworzenia par jonowych według następujących roacutewnań

L-arginina+ + S-(+)-profen

-L-arginina

+ S-(+)-profen

- (K1) (2)

L-arginina+ + R-(-)-profen

-L-arginina

+ R-(-)-profen

- (K2) (3)

gdzie K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi reakcji natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest

warunkiem rozdziału chromatograficznego dwu antymeroacutew flurbiprofenu

We wszystkich przeprowadzonych doświadczeniach użyto świeżo sporządzone roztwory

S-(+)-flurbiprofenu oraz R-(-)-flurbiprofenu w mieszaninie etanolu i wody w stosunku

objętościowym 73 o trzech roacuteżnych stężeniach roacutewnych 01 05 i 10 mgmL-1

Przygotowano roacutewnież roztwoacuter testowy tj mieszaninę racemiczną RS-(plusmn)-flurbiprofenu o

stężeniu 02 mgmL-1

dla każdego z enancjomeroacutew przy zastosowaniu tego samego

rozpuszczalnika

9

W celu sprawdzenia czy warunki odpowiednie do rozdziału enancjomeroacutew ibuprofenu

pozwalają na rozdział enancjomeroacutew flurbiprofenu testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej

badanego związku poddano procesowi chromatografowania w wyżej wymienionych

warunkach Zastosowano dwukierunkowe rozwijanie płytek chromatograficznych Wyniki

tego procesu przedstawiają rys 1 i 2

(a)

(b)

Rys 1 Wideoskany (a) całej płytki chromatograficznej rozwijanej w dwoacutech kierunkach oraz (b)

powiększonego obszaru na ktoacuterym nastąpił rozdział antymeroacutew flurbiprofenu

10

(a)

(b)

Rys 2 (a) Dwuwymiarowy i (b) troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający rozdział enancjomeroacutew

flurbiprofenu Obrazy te wygenerowano przez densytometryczne skanowanie chromatogramu 30 liniami w

odstępach 1 mm

Dwie plamki widoczne na rys 1 zostały poddane analizie Pierwszym sposobem

identyfikacji plamek była densytometryczna rejestracja widm UV każdej z nich bezpośrednio

11

z chromatografowanej płytki Obie plamki dały identyczne widmo w ultrafiolecie Co więcej

z płytki zdrapano żel krzemionkowy z umiejscowionymi plamkami a każdą proacutebkę żelu z

osobna zalano etanolem Następnie tak przygotowane roztwory przesączono zagęszczono i

poddano analizie techniką niechiralnej HPLCndashDAD Otrzymane wyniki dla każdej z proacutebek

były takie same Maksima pikoacutew chromatograficznych odpowiadających każdej z dwoacutech

plamek posiadały ten sam czas retencji i w dodatku to samo widmo UV Można zatem

stwierdzić iż doszło do rozdziału mieszaniny racemicznej flurbiprofenu a każda z plamek

reprezentuje jeden z enancjomeroacutew

Następnym etapem eksperymentu była proacuteba określenia każdej z plamek jako

odpowiednio S-(+)- oraz R-(-)-flurbiprofenu W tym celu chromatografowano świeżo

sporządzone etanolowo-wodne roztwory każdego z nich w takich samych warunkach co

testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej Niestety nie udało się zidentyfikować plamek gdyż

chromatogramy otrzymane dla każdego z antymeroacutew flurbiprofenu wyglądały identycznie

jak chromatogram otrzymany dla roztworu testowego co widać na rys 3a i b ktoacutere są

praktycznie identyczne z rys 1b

(a) (b)

Rys 3 Wideoskany chromatogramoacutew uzyskanych dla (a) S-(+)-flurbiprofenu i (b) R-(-)-flurbiprofenu

Ostatnim etapem eksperymentu było wykazanie ilościowej zależności rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia proacutebki W tym celu dla każdego z enancjomeroacutew

flurbiprofenu sporządzono roztwory etanolowo-wodne o trzech roacuteżnych stężeniach o czym

wspomniano już wcześniej a następnie chromatografowano je w identyczny sposoacuteb jak

poprzednio Na rys 4 i 5 przedstawiono wyniki otrzymane jedynie dla R-(-)-flurbiprofenu

ponieważ jego antymer S-(+) zachowuje się w podanych warunkach dokładnie tak samo Jak

widać rys 4a-4c są analogiczne z rys 2a natomiast rys 5a-5c z rys 2b Wynika z nich

12

jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego

enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew

zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają

Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

(a)

(b)

(c)

13

Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się

pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory

pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem

wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej

przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką

rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim

środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i

oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych

zadaniach analitycznych

412 Polarymetria

4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu

Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w

roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew

roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb

nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych

odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6

14

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]

[]D

day 0

44

45

46

47

48

0 1 2 3 4 5 6 7

day 1

43

44

45

46

23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2

41

42

43

44

45

45 50 55

day 5

39

40

41

42

43

116 121 126

day 6

40

41

42

43

141 146 151

day 7

40

41

42

43

44

164 169 174

Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z

natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na

tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D

zmierzają do zera

Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej

chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może

ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę

rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

15

4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu

Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech

seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu

w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC

były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-

minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195

time [hours]

[]D

day 0

-40

-39

-38

-37

-36

0 2 4 6

day 1

-38

-37

-36

-35

-34

24 25 26 27 28 29 30 31

day 2

-36

-35

-34

-33

-32

-31

-30

46 48 50 52 54

day 5

-22

-21

-20

-19

-18

120 122 124 126 128

day 6

-19

-18

-17

-16

144 146 148 150 152

day 7

-14

-13

-12

-11

-10

-9

-8

167 169 171 173

day 8

-8

-7

-6

-5

192 193 194 195

Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury

oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a

długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący

proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8

16

Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter

oscylacyjny

W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu

była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i

22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla

roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu

działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała

niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej

w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie

mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1

OC Na rys 9a i b przedstawiono

wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń

17

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(a)

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(b)

Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze

(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu

działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą

Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu

polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na

przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną

konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się

wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem

jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej

roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny

wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew

wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na

18

bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku

roacuteżnych reakcji oscylacyjnych

Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu

ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu

czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo

nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem

kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie

wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew

Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen

może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających

wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych

Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku

enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje

się być regułą dla profenoacutew

19

42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym

421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna

oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w

D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej

najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji

enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i

wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla

antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano

gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem

zawierającym jony Cu2+

a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z

dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty

na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami

[Cu(L-Pro)2]2+

+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+

+ L-Pro K1 (4)

[Cu(L-Pro)2]2+

+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+

+ L-Pro K2 (5)

gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi

odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału

chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny

Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze

22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz

racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych

antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075

Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne

skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba

enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji

RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej

pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment

ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych

20

starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie

roacuteżnią się między sobą

Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--

fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek

Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z

poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku

prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb

uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na

starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna

zachowała się analogicznie do racematu

21

Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu

W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej

płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)

czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny

(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i

mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki

przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--

fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i

skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-

fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie

prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i

pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)

lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki

22

Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej

D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-

a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny

skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)

Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie

natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu

uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki

Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu

krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie

wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami

Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący

eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako

rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)

4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda

(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny

Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki

pokazano na rys 13

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

8

41 Zjawisko racemizacji w układzie chromatograficznycm oraz oscylacyjne zmiany

skręcalności właściwej ([]D) S-(+)-flurbiprofenu i R-(-)-flurbiprofenu

411 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy enancjomery

flurbiprofenu ulegają konwersji chiralnej to znaczy przemianie antymeru S-(+) w R-(-) i

odwrotnie jak to przedstawiono poniższym roacutewnaniem

S-(+)-profen enol R-(-)-profen (1)

Jak do tej pory nie istnieją żadne doniesienia literaturowe na temat rozdziału

enancjomeroacutew flurbiprofenu metodą chromatografii cienkowarstwowej Warunki rozdziału

dla układu TLC były wzorowane na danych zawartych w publikacji Bhushana i Parshada

[21] ktoacuterzy jako pierwsi opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla antymeroacutew

ibuprofenu Jako fazę stacjonarną wykorzystano gotowe płytki pokryte żelem

krzemionkowym i zaimpregnowane metanolowym roztworem L-argininy Na fazę ruchomą

składał się czysty etanol plus kilka kropli lodowatego kwasu octowego Kwasu octowego

użyto do sprotonowania grupy aminowej L-argininy i dzięki temu rozdział enancjomeroacutew był

oparty na mechanizmie tworzenia par jonowych według następujących roacutewnań

L-arginina+ + S-(+)-profen

-L-arginina

+ S-(+)-profen

- (K1) (2)

L-arginina+ + R-(-)-profen

-L-arginina

+ R-(-)-profen

- (K2) (3)

gdzie K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi reakcji natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest

warunkiem rozdziału chromatograficznego dwu antymeroacutew flurbiprofenu

We wszystkich przeprowadzonych doświadczeniach użyto świeżo sporządzone roztwory

S-(+)-flurbiprofenu oraz R-(-)-flurbiprofenu w mieszaninie etanolu i wody w stosunku

objętościowym 73 o trzech roacuteżnych stężeniach roacutewnych 01 05 i 10 mgmL-1

Przygotowano roacutewnież roztwoacuter testowy tj mieszaninę racemiczną RS-(plusmn)-flurbiprofenu o

stężeniu 02 mgmL-1

dla każdego z enancjomeroacutew przy zastosowaniu tego samego

rozpuszczalnika

9

W celu sprawdzenia czy warunki odpowiednie do rozdziału enancjomeroacutew ibuprofenu

pozwalają na rozdział enancjomeroacutew flurbiprofenu testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej

badanego związku poddano procesowi chromatografowania w wyżej wymienionych

warunkach Zastosowano dwukierunkowe rozwijanie płytek chromatograficznych Wyniki

tego procesu przedstawiają rys 1 i 2

(a)

(b)

Rys 1 Wideoskany (a) całej płytki chromatograficznej rozwijanej w dwoacutech kierunkach oraz (b)

powiększonego obszaru na ktoacuterym nastąpił rozdział antymeroacutew flurbiprofenu

10

(a)

(b)

Rys 2 (a) Dwuwymiarowy i (b) troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający rozdział enancjomeroacutew

flurbiprofenu Obrazy te wygenerowano przez densytometryczne skanowanie chromatogramu 30 liniami w

odstępach 1 mm

Dwie plamki widoczne na rys 1 zostały poddane analizie Pierwszym sposobem

identyfikacji plamek była densytometryczna rejestracja widm UV każdej z nich bezpośrednio

11

z chromatografowanej płytki Obie plamki dały identyczne widmo w ultrafiolecie Co więcej

z płytki zdrapano żel krzemionkowy z umiejscowionymi plamkami a każdą proacutebkę żelu z

osobna zalano etanolem Następnie tak przygotowane roztwory przesączono zagęszczono i

poddano analizie techniką niechiralnej HPLCndashDAD Otrzymane wyniki dla każdej z proacutebek

były takie same Maksima pikoacutew chromatograficznych odpowiadających każdej z dwoacutech

plamek posiadały ten sam czas retencji i w dodatku to samo widmo UV Można zatem

stwierdzić iż doszło do rozdziału mieszaniny racemicznej flurbiprofenu a każda z plamek

reprezentuje jeden z enancjomeroacutew

Następnym etapem eksperymentu była proacuteba określenia każdej z plamek jako

odpowiednio S-(+)- oraz R-(-)-flurbiprofenu W tym celu chromatografowano świeżo

sporządzone etanolowo-wodne roztwory każdego z nich w takich samych warunkach co

testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej Niestety nie udało się zidentyfikować plamek gdyż

chromatogramy otrzymane dla każdego z antymeroacutew flurbiprofenu wyglądały identycznie

jak chromatogram otrzymany dla roztworu testowego co widać na rys 3a i b ktoacutere są

praktycznie identyczne z rys 1b

(a) (b)

Rys 3 Wideoskany chromatogramoacutew uzyskanych dla (a) S-(+)-flurbiprofenu i (b) R-(-)-flurbiprofenu

Ostatnim etapem eksperymentu było wykazanie ilościowej zależności rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia proacutebki W tym celu dla każdego z enancjomeroacutew

flurbiprofenu sporządzono roztwory etanolowo-wodne o trzech roacuteżnych stężeniach o czym

wspomniano już wcześniej a następnie chromatografowano je w identyczny sposoacuteb jak

poprzednio Na rys 4 i 5 przedstawiono wyniki otrzymane jedynie dla R-(-)-flurbiprofenu

ponieważ jego antymer S-(+) zachowuje się w podanych warunkach dokładnie tak samo Jak

widać rys 4a-4c są analogiczne z rys 2a natomiast rys 5a-5c z rys 2b Wynika z nich

12

jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego

enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew

zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają

Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

(a)

(b)

(c)

13

Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się

pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory

pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem

wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej

przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką

rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim

środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i

oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych

zadaniach analitycznych

412 Polarymetria

4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu

Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w

roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew

roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb

nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych

odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6

14

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]

[]D

day 0

44

45

46

47

48

0 1 2 3 4 5 6 7

day 1

43

44

45

46

23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2

41

42

43

44

45

45 50 55

day 5

39

40

41

42

43

116 121 126

day 6

40

41

42

43

141 146 151

day 7

40

41

42

43

44

164 169 174

Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z

natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na

tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D

zmierzają do zera

Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej

chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może

ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę

rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

15

4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu

Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech

seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu

w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC

były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-

minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195

time [hours]

[]D

day 0

-40

-39

-38

-37

-36

0 2 4 6

day 1

-38

-37

-36

-35

-34

24 25 26 27 28 29 30 31

day 2

-36

-35

-34

-33

-32

-31

-30

46 48 50 52 54

day 5

-22

-21

-20

-19

-18

120 122 124 126 128

day 6

-19

-18

-17

-16

144 146 148 150 152

day 7

-14

-13

-12

-11

-10

-9

-8

167 169 171 173

day 8

-8

-7

-6

-5

192 193 194 195

Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury

oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a

długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący

proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8

16

Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter

oscylacyjny

W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu

była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i

22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla

roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu

działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała

niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej

w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie

mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1

OC Na rys 9a i b przedstawiono

wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń

17

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(a)

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(b)

Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze

(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu

działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą

Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu

polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na

przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną

konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się

wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem

jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej

roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny

wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew

wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na

18

bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku

roacuteżnych reakcji oscylacyjnych

Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu

ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu

czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo

nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem

kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie

wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew

Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen

może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających

wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych

Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku

enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje

się być regułą dla profenoacutew

19

42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym

421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna

oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w

D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej

najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji

enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i

wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla

antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano

gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem

zawierającym jony Cu2+

a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z

dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty

na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami

[Cu(L-Pro)2]2+

+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+

+ L-Pro K1 (4)

[Cu(L-Pro)2]2+

+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+

+ L-Pro K2 (5)

gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi

odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału

chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny

Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze

22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz

racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych

antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075

Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne

skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba

enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji

RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej

pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment

ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych

20

starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie

roacuteżnią się między sobą

Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--

fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek

Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z

poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku

prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb

uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na

starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna

zachowała się analogicznie do racematu

21

Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu

W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej

płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)

czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny

(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i

mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki

przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--

fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i

skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-

fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie

prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i

pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)

lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki

22

Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej

D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-

a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny

skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)

Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie

natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu

uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki

Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu

krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie

wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami

Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący

eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako

rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)

4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda

(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny

Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki

pokazano na rys 13

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

9

W celu sprawdzenia czy warunki odpowiednie do rozdziału enancjomeroacutew ibuprofenu

pozwalają na rozdział enancjomeroacutew flurbiprofenu testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej

badanego związku poddano procesowi chromatografowania w wyżej wymienionych

warunkach Zastosowano dwukierunkowe rozwijanie płytek chromatograficznych Wyniki

tego procesu przedstawiają rys 1 i 2

(a)

(b)

Rys 1 Wideoskany (a) całej płytki chromatograficznej rozwijanej w dwoacutech kierunkach oraz (b)

powiększonego obszaru na ktoacuterym nastąpił rozdział antymeroacutew flurbiprofenu

10

(a)

(b)

Rys 2 (a) Dwuwymiarowy i (b) troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający rozdział enancjomeroacutew

flurbiprofenu Obrazy te wygenerowano przez densytometryczne skanowanie chromatogramu 30 liniami w

odstępach 1 mm

Dwie plamki widoczne na rys 1 zostały poddane analizie Pierwszym sposobem

identyfikacji plamek była densytometryczna rejestracja widm UV każdej z nich bezpośrednio

11

z chromatografowanej płytki Obie plamki dały identyczne widmo w ultrafiolecie Co więcej

z płytki zdrapano żel krzemionkowy z umiejscowionymi plamkami a każdą proacutebkę żelu z

osobna zalano etanolem Następnie tak przygotowane roztwory przesączono zagęszczono i

poddano analizie techniką niechiralnej HPLCndashDAD Otrzymane wyniki dla każdej z proacutebek

były takie same Maksima pikoacutew chromatograficznych odpowiadających każdej z dwoacutech

plamek posiadały ten sam czas retencji i w dodatku to samo widmo UV Można zatem

stwierdzić iż doszło do rozdziału mieszaniny racemicznej flurbiprofenu a każda z plamek

reprezentuje jeden z enancjomeroacutew

Następnym etapem eksperymentu była proacuteba określenia każdej z plamek jako

odpowiednio S-(+)- oraz R-(-)-flurbiprofenu W tym celu chromatografowano świeżo

sporządzone etanolowo-wodne roztwory każdego z nich w takich samych warunkach co

testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej Niestety nie udało się zidentyfikować plamek gdyż

chromatogramy otrzymane dla każdego z antymeroacutew flurbiprofenu wyglądały identycznie

jak chromatogram otrzymany dla roztworu testowego co widać na rys 3a i b ktoacutere są

praktycznie identyczne z rys 1b

(a) (b)

Rys 3 Wideoskany chromatogramoacutew uzyskanych dla (a) S-(+)-flurbiprofenu i (b) R-(-)-flurbiprofenu

Ostatnim etapem eksperymentu było wykazanie ilościowej zależności rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia proacutebki W tym celu dla każdego z enancjomeroacutew

flurbiprofenu sporządzono roztwory etanolowo-wodne o trzech roacuteżnych stężeniach o czym

wspomniano już wcześniej a następnie chromatografowano je w identyczny sposoacuteb jak

poprzednio Na rys 4 i 5 przedstawiono wyniki otrzymane jedynie dla R-(-)-flurbiprofenu

ponieważ jego antymer S-(+) zachowuje się w podanych warunkach dokładnie tak samo Jak

widać rys 4a-4c są analogiczne z rys 2a natomiast rys 5a-5c z rys 2b Wynika z nich

12

jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego

enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew

zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają

Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

(a)

(b)

(c)

13

Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się

pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory

pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem

wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej

przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką

rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim

środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i

oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych

zadaniach analitycznych

412 Polarymetria

4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu

Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w

roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew

roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb

nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych

odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6

14

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]

[]D

day 0

44

45

46

47

48

0 1 2 3 4 5 6 7

day 1

43

44

45

46

23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2

41

42

43

44

45

45 50 55

day 5

39

40

41

42

43

116 121 126

day 6

40

41

42

43

141 146 151

day 7

40

41

42

43

44

164 169 174

Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z

natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na

tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D

zmierzają do zera

Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej

chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może

ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę

rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

15

4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu

Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech

seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu

w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC

były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-

minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195

time [hours]

[]D

day 0

-40

-39

-38

-37

-36

0 2 4 6

day 1

-38

-37

-36

-35

-34

24 25 26 27 28 29 30 31

day 2

-36

-35

-34

-33

-32

-31

-30

46 48 50 52 54

day 5

-22

-21

-20

-19

-18

120 122 124 126 128

day 6

-19

-18

-17

-16

144 146 148 150 152

day 7

-14

-13

-12

-11

-10

-9

-8

167 169 171 173

day 8

-8

-7

-6

-5

192 193 194 195

Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury

oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a

długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący

proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8

16

Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter

oscylacyjny

W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu

była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i

22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla

roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu

działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała

niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej

w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie

mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1

OC Na rys 9a i b przedstawiono

wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń

17

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(a)

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(b)

Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze

(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu

działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą

Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu

polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na

przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną

konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się

wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem

jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej

roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny

wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew

wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na

18

bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku

roacuteżnych reakcji oscylacyjnych

Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu

ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu

czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo

nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem

kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie

wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew

Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen

może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających

wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych

Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku

enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje

się być regułą dla profenoacutew

19

42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym

421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna

oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w

D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej

najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji

enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i

wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla

antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano

gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem

zawierającym jony Cu2+

a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z

dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty

na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami

[Cu(L-Pro)2]2+

+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+

+ L-Pro K1 (4)

[Cu(L-Pro)2]2+

+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+

+ L-Pro K2 (5)

gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi

odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału

chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny

Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze

22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz

racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych

antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075

Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne

skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba

enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji

RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej

pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment

ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych

20

starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie

roacuteżnią się między sobą

Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--

fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek

Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z

poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku

prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb

uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na

starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna

zachowała się analogicznie do racematu

21

Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu

W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej

płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)

czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny

(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i

mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki

przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--

fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i

skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-

fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie

prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i

pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)

lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki

22

Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej

D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-

a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny

skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)

Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie

natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu

uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki

Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu

krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie

wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami

Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący

eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako

rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)

4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda

(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny

Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki

pokazano na rys 13

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

10

(a)

(b)

Rys 2 (a) Dwuwymiarowy i (b) troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający rozdział enancjomeroacutew

flurbiprofenu Obrazy te wygenerowano przez densytometryczne skanowanie chromatogramu 30 liniami w

odstępach 1 mm

Dwie plamki widoczne na rys 1 zostały poddane analizie Pierwszym sposobem

identyfikacji plamek była densytometryczna rejestracja widm UV każdej z nich bezpośrednio

11

z chromatografowanej płytki Obie plamki dały identyczne widmo w ultrafiolecie Co więcej

z płytki zdrapano żel krzemionkowy z umiejscowionymi plamkami a każdą proacutebkę żelu z

osobna zalano etanolem Następnie tak przygotowane roztwory przesączono zagęszczono i

poddano analizie techniką niechiralnej HPLCndashDAD Otrzymane wyniki dla każdej z proacutebek

były takie same Maksima pikoacutew chromatograficznych odpowiadających każdej z dwoacutech

plamek posiadały ten sam czas retencji i w dodatku to samo widmo UV Można zatem

stwierdzić iż doszło do rozdziału mieszaniny racemicznej flurbiprofenu a każda z plamek

reprezentuje jeden z enancjomeroacutew

Następnym etapem eksperymentu była proacuteba określenia każdej z plamek jako

odpowiednio S-(+)- oraz R-(-)-flurbiprofenu W tym celu chromatografowano świeżo

sporządzone etanolowo-wodne roztwory każdego z nich w takich samych warunkach co

testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej Niestety nie udało się zidentyfikować plamek gdyż

chromatogramy otrzymane dla każdego z antymeroacutew flurbiprofenu wyglądały identycznie

jak chromatogram otrzymany dla roztworu testowego co widać na rys 3a i b ktoacutere są

praktycznie identyczne z rys 1b

(a) (b)

Rys 3 Wideoskany chromatogramoacutew uzyskanych dla (a) S-(+)-flurbiprofenu i (b) R-(-)-flurbiprofenu

Ostatnim etapem eksperymentu było wykazanie ilościowej zależności rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia proacutebki W tym celu dla każdego z enancjomeroacutew

flurbiprofenu sporządzono roztwory etanolowo-wodne o trzech roacuteżnych stężeniach o czym

wspomniano już wcześniej a następnie chromatografowano je w identyczny sposoacuteb jak

poprzednio Na rys 4 i 5 przedstawiono wyniki otrzymane jedynie dla R-(-)-flurbiprofenu

ponieważ jego antymer S-(+) zachowuje się w podanych warunkach dokładnie tak samo Jak

widać rys 4a-4c są analogiczne z rys 2a natomiast rys 5a-5c z rys 2b Wynika z nich

12

jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego

enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew

zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają

Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

(a)

(b)

(c)

13

Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się

pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory

pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem

wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej

przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką

rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim

środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i

oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych

zadaniach analitycznych

412 Polarymetria

4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu

Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w

roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew

roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb

nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych

odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6

14

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]

[]D

day 0

44

45

46

47

48

0 1 2 3 4 5 6 7

day 1

43

44

45

46

23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2

41

42

43

44

45

45 50 55

day 5

39

40

41

42

43

116 121 126

day 6

40

41

42

43

141 146 151

day 7

40

41

42

43

44

164 169 174

Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z

natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na

tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D

zmierzają do zera

Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej

chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może

ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę

rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

15

4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu

Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech

seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu

w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC

były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-

minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195

time [hours]

[]D

day 0

-40

-39

-38

-37

-36

0 2 4 6

day 1

-38

-37

-36

-35

-34

24 25 26 27 28 29 30 31

day 2

-36

-35

-34

-33

-32

-31

-30

46 48 50 52 54

day 5

-22

-21

-20

-19

-18

120 122 124 126 128

day 6

-19

-18

-17

-16

144 146 148 150 152

day 7

-14

-13

-12

-11

-10

-9

-8

167 169 171 173

day 8

-8

-7

-6

-5

192 193 194 195

Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury

oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a

długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący

proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8

16

Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter

oscylacyjny

W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu

była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i

22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla

roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu

działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała

niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej

w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie

mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1

OC Na rys 9a i b przedstawiono

wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń

17

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(a)

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(b)

Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze

(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu

działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą

Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu

polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na

przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną

konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się

wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem

jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej

roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny

wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew

wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na

18

bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku

roacuteżnych reakcji oscylacyjnych

Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu

ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu

czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo

nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem

kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie

wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew

Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen

może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających

wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych

Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku

enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje

się być regułą dla profenoacutew

19

42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym

421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna

oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w

D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej

najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji

enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i

wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla

antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano

gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem

zawierającym jony Cu2+

a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z

dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty

na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami

[Cu(L-Pro)2]2+

+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+

+ L-Pro K1 (4)

[Cu(L-Pro)2]2+

+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+

+ L-Pro K2 (5)

gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi

odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału

chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny

Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze

22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz

racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych

antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075

Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne

skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba

enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji

RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej

pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment

ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych

20

starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie

roacuteżnią się między sobą

Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--

fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek

Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z

poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku

prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb

uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na

starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna

zachowała się analogicznie do racematu

21

Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu

W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej

płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)

czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny

(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i

mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki

przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--

fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i

skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-

fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie

prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i

pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)

lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki

22

Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej

D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-

a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny

skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)

Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie

natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu

uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki

Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu

krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie

wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami

Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący

eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako

rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)

4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda

(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny

Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki

pokazano na rys 13

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

11

z chromatografowanej płytki Obie plamki dały identyczne widmo w ultrafiolecie Co więcej

z płytki zdrapano żel krzemionkowy z umiejscowionymi plamkami a każdą proacutebkę żelu z

osobna zalano etanolem Następnie tak przygotowane roztwory przesączono zagęszczono i

poddano analizie techniką niechiralnej HPLCndashDAD Otrzymane wyniki dla każdej z proacutebek

były takie same Maksima pikoacutew chromatograficznych odpowiadających każdej z dwoacutech

plamek posiadały ten sam czas retencji i w dodatku to samo widmo UV Można zatem

stwierdzić iż doszło do rozdziału mieszaniny racemicznej flurbiprofenu a każda z plamek

reprezentuje jeden z enancjomeroacutew

Następnym etapem eksperymentu była proacuteba określenia każdej z plamek jako

odpowiednio S-(+)- oraz R-(-)-flurbiprofenu W tym celu chromatografowano świeżo

sporządzone etanolowo-wodne roztwory każdego z nich w takich samych warunkach co

testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej Niestety nie udało się zidentyfikować plamek gdyż

chromatogramy otrzymane dla każdego z antymeroacutew flurbiprofenu wyglądały identycznie

jak chromatogram otrzymany dla roztworu testowego co widać na rys 3a i b ktoacutere są

praktycznie identyczne z rys 1b

(a) (b)

Rys 3 Wideoskany chromatogramoacutew uzyskanych dla (a) S-(+)-flurbiprofenu i (b) R-(-)-flurbiprofenu

Ostatnim etapem eksperymentu było wykazanie ilościowej zależności rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia proacutebki W tym celu dla każdego z enancjomeroacutew

flurbiprofenu sporządzono roztwory etanolowo-wodne o trzech roacuteżnych stężeniach o czym

wspomniano już wcześniej a następnie chromatografowano je w identyczny sposoacuteb jak

poprzednio Na rys 4 i 5 przedstawiono wyniki otrzymane jedynie dla R-(-)-flurbiprofenu

ponieważ jego antymer S-(+) zachowuje się w podanych warunkach dokładnie tak samo Jak

widać rys 4a-4c są analogiczne z rys 2a natomiast rys 5a-5c z rys 2b Wynika z nich

12

jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego

enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew

zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają

Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

(a)

(b)

(c)

13

Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się

pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory

pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem

wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej

przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką

rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim

środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i

oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych

zadaniach analitycznych

412 Polarymetria

4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu

Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w

roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew

roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb

nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych

odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6

14

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]

[]D

day 0

44

45

46

47

48

0 1 2 3 4 5 6 7

day 1

43

44

45

46

23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2

41

42

43

44

45

45 50 55

day 5

39

40

41

42

43

116 121 126

day 6

40

41

42

43

141 146 151

day 7

40

41

42

43

44

164 169 174

Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z

natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na

tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D

zmierzają do zera

Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej

chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może

ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę

rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

15

4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu

Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech

seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu

w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC

były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-

minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195

time [hours]

[]D

day 0

-40

-39

-38

-37

-36

0 2 4 6

day 1

-38

-37

-36

-35

-34

24 25 26 27 28 29 30 31

day 2

-36

-35

-34

-33

-32

-31

-30

46 48 50 52 54

day 5

-22

-21

-20

-19

-18

120 122 124 126 128

day 6

-19

-18

-17

-16

144 146 148 150 152

day 7

-14

-13

-12

-11

-10

-9

-8

167 169 171 173

day 8

-8

-7

-6

-5

192 193 194 195

Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury

oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a

długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący

proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8

16

Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter

oscylacyjny

W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu

była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i

22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla

roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu

działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała

niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej

w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie

mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1

OC Na rys 9a i b przedstawiono

wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń

17

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(a)

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(b)

Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze

(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu

działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą

Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu

polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na

przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną

konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się

wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem

jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej

roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny

wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew

wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na

18

bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku

roacuteżnych reakcji oscylacyjnych

Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu

ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu

czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo

nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem

kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie

wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew

Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen

może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających

wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych

Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku

enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje

się być regułą dla profenoacutew

19

42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym

421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna

oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w

D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej

najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji

enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i

wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla

antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano

gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem

zawierającym jony Cu2+

a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z

dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty

na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami

[Cu(L-Pro)2]2+

+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+

+ L-Pro K1 (4)

[Cu(L-Pro)2]2+

+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+

+ L-Pro K2 (5)

gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi

odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału

chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny

Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze

22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz

racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych

antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075

Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne

skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba

enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji

RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej

pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment

ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych

20

starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie

roacuteżnią się między sobą

Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--

fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek

Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z

poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku

prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb

uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na

starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna

zachowała się analogicznie do racematu

21

Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu

W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej

płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)

czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny

(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i

mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki

przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--

fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i

skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-

fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie

prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i

pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)

lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki

22

Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej

D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-

a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny

skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)

Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie

natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu

uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki

Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu

krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie

wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami

Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący

eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako

rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)

4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda

(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny

Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki

pokazano na rys 13

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

12

jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego

enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew

zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają

Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych

antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1

(b) 05 mgmL-1

i (c) 10

mgmL-1

Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich

chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm

(a)

(b)

(c)

13

Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się

pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory

pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem

wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej

przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką

rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim

środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i

oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych

zadaniach analitycznych

412 Polarymetria

4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu

Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w

roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew

roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb

nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych

odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6

14

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]

[]D

day 0

44

45

46

47

48

0 1 2 3 4 5 6 7

day 1

43

44

45

46

23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2

41

42

43

44

45

45 50 55

day 5

39

40

41

42

43

116 121 126

day 6

40

41

42

43

141 146 151

day 7

40

41

42

43

44

164 169 174

Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z

natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na

tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D

zmierzają do zera

Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej

chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może

ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę

rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

15

4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu

Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech

seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu

w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC

były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-

minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195

time [hours]

[]D

day 0

-40

-39

-38

-37

-36

0 2 4 6

day 1

-38

-37

-36

-35

-34

24 25 26 27 28 29 30 31

day 2

-36

-35

-34

-33

-32

-31

-30

46 48 50 52 54

day 5

-22

-21

-20

-19

-18

120 122 124 126 128

day 6

-19

-18

-17

-16

144 146 148 150 152

day 7

-14

-13

-12

-11

-10

-9

-8

167 169 171 173

day 8

-8

-7

-6

-5

192 193 194 195

Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury

oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a

długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący

proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8

16

Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter

oscylacyjny

W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu

była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i

22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla

roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu

działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała

niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej

w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie

mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1

OC Na rys 9a i b przedstawiono

wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń

17

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(a)

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(b)

Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze

(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu

działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą

Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu

polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na

przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną

konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się

wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem

jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej

roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny

wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew

wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na

18

bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku

roacuteżnych reakcji oscylacyjnych

Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu

ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu

czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo

nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem

kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie

wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew

Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen

może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających

wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych

Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku

enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje

się być regułą dla profenoacutew

19

42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym

421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna

oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w

D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej

najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji

enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i

wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla

antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano

gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem

zawierającym jony Cu2+

a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z

dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty

na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami

[Cu(L-Pro)2]2+

+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+

+ L-Pro K1 (4)

[Cu(L-Pro)2]2+

+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+

+ L-Pro K2 (5)

gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi

odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału

chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny

Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze

22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz

racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych

antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075

Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne

skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba

enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji

RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej

pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment

ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych

20

starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie

roacuteżnią się między sobą

Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--

fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek

Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z

poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku

prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb

uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na

starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna

zachowała się analogicznie do racematu

21

Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu

W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej

płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)

czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny

(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i

mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki

przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--

fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i

skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-

fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie

prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i

pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)

lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki

22

Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej

D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-

a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny

skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)

Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie

natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu

uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki

Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu

krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie

wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami

Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący

eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako

rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)

4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda

(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny

Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki

pokazano na rys 13

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

13

Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się

pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory

pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem

wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej

przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką

rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim

środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i

oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych

zadaniach analitycznych

412 Polarymetria

4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu

Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w

roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew

roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb

nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych

odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6

14

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]

[]D

day 0

44

45

46

47

48

0 1 2 3 4 5 6 7

day 1

43

44

45

46

23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2

41

42

43

44

45

45 50 55

day 5

39

40

41

42

43

116 121 126

day 6

40

41

42

43

141 146 151

day 7

40

41

42

43

44

164 169 174

Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z

natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na

tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D

zmierzają do zera

Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej

chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może

ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę

rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

15

4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu

Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech

seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu

w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC

były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-

minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195

time [hours]

[]D

day 0

-40

-39

-38

-37

-36

0 2 4 6

day 1

-38

-37

-36

-35

-34

24 25 26 27 28 29 30 31

day 2

-36

-35

-34

-33

-32

-31

-30

46 48 50 52 54

day 5

-22

-21

-20

-19

-18

120 122 124 126 128

day 6

-19

-18

-17

-16

144 146 148 150 152

day 7

-14

-13

-12

-11

-10

-9

-8

167 169 171 173

day 8

-8

-7

-6

-5

192 193 194 195

Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury

oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a

długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący

proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8

16

Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter

oscylacyjny

W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu

była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i

22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla

roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu

działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała

niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej

w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie

mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1

OC Na rys 9a i b przedstawiono

wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń

17

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(a)

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(b)

Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze

(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu

działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą

Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu

polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na

przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną

konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się

wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem

jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej

roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny

wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew

wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na

18

bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku

roacuteżnych reakcji oscylacyjnych

Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu

ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu

czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo

nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem

kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie

wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew

Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen

może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających

wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych

Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku

enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje

się być regułą dla profenoacutew

19

42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym

421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna

oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w

D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej

najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji

enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i

wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla

antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano

gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem

zawierającym jony Cu2+

a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z

dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty

na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami

[Cu(L-Pro)2]2+

+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+

+ L-Pro K1 (4)

[Cu(L-Pro)2]2+

+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+

+ L-Pro K2 (5)

gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi

odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału

chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny

Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze

22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz

racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych

antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075

Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne

skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba

enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji

RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej

pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment

ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych

20

starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie

roacuteżnią się między sobą

Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--

fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek

Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z

poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku

prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb

uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na

starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna

zachowała się analogicznie do racematu

21

Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu

W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej

płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)

czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny

(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i

mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki

przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--

fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i

skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-

fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie

prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i

pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)

lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki

22

Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej

D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-

a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny

skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)

Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie

natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu

uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki

Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu

krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie

wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami

Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący

eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako

rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)

4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda

(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny

Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki

pokazano na rys 13

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

14

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]

[]D

day 0

44

45

46

47

48

0 1 2 3 4 5 6 7

day 1

43

44

45

46

23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2

41

42

43

44

45

45 50 55

day 5

39

40

41

42

43

116 121 126

day 6

40

41

42

43

141 146 151

day 7

40

41

42

43

44

164 169 174

Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z

natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na

tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D

zmierzają do zera

Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej

chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może

ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę

rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

15

4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu

Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech

seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu

w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC

były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-

minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195

time [hours]

[]D

day 0

-40

-39

-38

-37

-36

0 2 4 6

day 1

-38

-37

-36

-35

-34

24 25 26 27 28 29 30 31

day 2

-36

-35

-34

-33

-32

-31

-30

46 48 50 52 54

day 5

-22

-21

-20

-19

-18

120 122 124 126 128

day 6

-19

-18

-17

-16

144 146 148 150 152

day 7

-14

-13

-12

-11

-10

-9

-8

167 169 171 173

day 8

-8

-7

-6

-5

192 193 194 195

Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury

oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a

długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący

proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8

16

Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter

oscylacyjny

W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu

była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i

22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla

roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu

działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała

niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej

w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie

mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1

OC Na rys 9a i b przedstawiono

wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń

17

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(a)

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(b)

Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze

(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu

działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą

Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu

polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na

przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną

konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się

wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem

jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej

roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny

wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew

wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na

18

bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku

roacuteżnych reakcji oscylacyjnych

Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu

ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu

czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo

nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem

kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie

wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew

Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen

może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających

wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych

Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku

enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje

się być regułą dla profenoacutew

19

42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym

421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna

oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w

D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej

najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji

enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i

wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla

antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano

gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem

zawierającym jony Cu2+

a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z

dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty

na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami

[Cu(L-Pro)2]2+

+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+

+ L-Pro K1 (4)

[Cu(L-Pro)2]2+

+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+

+ L-Pro K2 (5)

gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi

odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału

chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny

Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze

22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz

racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych

antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075

Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne

skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba

enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji

RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej

pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment

ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych

20

starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie

roacuteżnią się między sobą

Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--

fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek

Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z

poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku

prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb

uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na

starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna

zachowała się analogicznie do racematu

21

Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu

W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej

płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)

czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny

(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i

mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki

przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--

fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i

skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-

fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie

prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i

pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)

lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki

22

Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej

D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-

a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny

skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)

Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie

natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu

uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki

Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu

krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie

wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami

Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący

eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako

rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)

4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda

(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny

Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki

pokazano na rys 13

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

15

4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu

Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech

seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu

w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC

były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-

minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195

time [hours]

[]D

day 0

-40

-39

-38

-37

-36

0 2 4 6

day 1

-38

-37

-36

-35

-34

24 25 26 27 28 29 30 31

day 2

-36

-35

-34

-33

-32

-31

-30

46 48 50 52 54

day 5

-22

-21

-20

-19

-18

120 122 124 126 128

day 6

-19

-18

-17

-16

144 146 148 150 152

day 7

-14

-13

-12

-11

-10

-9

-8

167 169 171 173

day 8

-8

-7

-6

-5

192 193 194 195

Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny

kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w

wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury

oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a

długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący

proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8

16

Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter

oscylacyjny

W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu

była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i

22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla

roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu

działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała

niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej

w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie

mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1

OC Na rys 9a i b przedstawiono

wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń

17

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(a)

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(b)

Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze

(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu

działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą

Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu

polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na

przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną

konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się

wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem

jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej

roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny

wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew

wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na

18

bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku

roacuteżnych reakcji oscylacyjnych

Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu

ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu

czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo

nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem

kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie

wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew

Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen

może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających

wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych

Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku

enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje

się być regułą dla profenoacutew

19

42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym

421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna

oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w

D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej

najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji

enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i

wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla

antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano

gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem

zawierającym jony Cu2+

a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z

dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty

na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami

[Cu(L-Pro)2]2+

+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+

+ L-Pro K1 (4)

[Cu(L-Pro)2]2+

+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+

+ L-Pro K2 (5)

gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi

odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału

chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny

Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze

22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz

racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych

antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075

Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne

skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba

enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji

RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej

pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment

ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych

20

starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie

roacuteżnią się między sobą

Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--

fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek

Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z

poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku

prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb

uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na

starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna

zachowała się analogicznie do racematu

21

Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu

W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej

płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)

czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny

(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i

mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki

przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--

fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i

skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-

fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie

prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i

pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)

lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki

22

Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej

D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-

a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny

skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)

Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie

natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu

uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki

Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu

krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie

wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami

Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący

eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako

rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)

4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda

(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny

Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki

pokazano na rys 13

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

16

Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w

funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter

oscylacyjny

W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu

była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i

22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla

roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu

działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała

niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej

w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie

mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1

OC Na rys 9a i b przedstawiono

wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń

17

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(a)

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(b)

Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze

(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu

działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą

Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu

polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na

przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną

konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się

wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem

jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej

roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny

wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew

wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na

18

bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku

roacuteżnych reakcji oscylacyjnych

Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu

ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu

czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo

nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem

kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie

wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew

Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen

może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających

wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych

Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku

enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje

się być regułą dla profenoacutew

19

42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym

421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna

oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w

D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej

najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji

enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i

wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla

antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano

gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem

zawierającym jony Cu2+

a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z

dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty

na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami

[Cu(L-Pro)2]2+

+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+

+ L-Pro K1 (4)

[Cu(L-Pro)2]2+

+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+

+ L-Pro K2 (5)

gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi

odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału

chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny

Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze

22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz

racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych

antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075

Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne

skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba

enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji

RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej

pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment

ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych

20

starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie

roacuteżnią się między sobą

Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--

fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek

Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z

poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku

prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb

uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na

starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna

zachowała się analogicznie do racematu

21

Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu

W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej

płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)

czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny

(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i

mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki

przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--

fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i

skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-

fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie

prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i

pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)

lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki

22

Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej

D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-

a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny

skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)

Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie

natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu

uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki

Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu

krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie

wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami

Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący

eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako

rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)

4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda

(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny

Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki

pokazano na rys 13

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

17

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(a)

-160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

[]D

(b)

Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego

w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze

(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu

działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą

Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu

polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na

przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną

konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się

wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem

jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej

roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny

wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew

wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na

18

bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku

roacuteżnych reakcji oscylacyjnych

Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu

ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu

czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo

nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem

kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie

wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew

Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen

może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających

wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych

Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku

enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje

się być regułą dla profenoacutew

19

42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym

421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna

oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w

D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej

najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji

enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i

wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla

antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano

gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem

zawierającym jony Cu2+

a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z

dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty

na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami

[Cu(L-Pro)2]2+

+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+

+ L-Pro K1 (4)

[Cu(L-Pro)2]2+

+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+

+ L-Pro K2 (5)

gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi

odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału

chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny

Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze

22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz

racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych

antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075

Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne

skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba

enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji

RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej

pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment

ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych

20

starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie

roacuteżnią się między sobą

Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--

fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek

Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z

poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku

prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb

uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na

starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna

zachowała się analogicznie do racematu

21

Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu

W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej

płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)

czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny

(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i

mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki

przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--

fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i

skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-

fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie

prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i

pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)

lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki

22

Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej

D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-

a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny

skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)

Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie

natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu

uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki

Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu

krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie

wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami

Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący

eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako

rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)

4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda

(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny

Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki

pokazano na rys 13

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

18

bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku

roacuteżnych reakcji oscylacyjnych

Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu

ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu

czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo

nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem

kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie

wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew

Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen

może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających

wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych

Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku

enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje

się być regułą dla profenoacutew

19

42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym

421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna

oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w

D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej

najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji

enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i

wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla

antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano

gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem

zawierającym jony Cu2+

a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z

dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty

na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami

[Cu(L-Pro)2]2+

+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+

+ L-Pro K1 (4)

[Cu(L-Pro)2]2+

+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+

+ L-Pro K2 (5)

gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi

odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału

chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny

Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze

22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz

racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych

antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075

Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne

skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba

enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji

RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej

pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment

ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych

20

starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie

roacuteżnią się między sobą

Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--

fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek

Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z

poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku

prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb

uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na

starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna

zachowała się analogicznie do racematu

21

Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu

W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej

płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)

czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny

(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i

mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki

przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--

fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i

skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-

fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie

prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i

pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)

lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki

22

Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej

D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-

a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny

skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)

Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie

natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu

uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki

Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu

krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie

wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami

Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący

eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako

rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)

4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda

(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny

Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki

pokazano na rys 13

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

19

42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym

421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa

Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna

oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w

D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej

najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji

enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej

Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i

wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla

antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano

gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem

zawierającym jony Cu2+

a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z

dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty

na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami

[Cu(L-Pro)2]2+

+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+

+ L-Pro K1 (4)

[Cu(L-Pro)2]2+

+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+

+ L-Pro K2 (5)

gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi

odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału

chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny

Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze

22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz

racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych

antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075

Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne

skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba

enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji

RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej

pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment

ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych

20

starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie

roacuteżnią się między sobą

Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--

fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek

Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z

poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku

prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb

uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na

starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna

zachowała się analogicznie do racematu

21

Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu

W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej

płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)

czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny

(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i

mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki

przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--

fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i

skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-

fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie

prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i

pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)

lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki

22

Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej

D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-

a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny

skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)

Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie

natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu

uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki

Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu

krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie

wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami

Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący

eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako

rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)

4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda

(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny

Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki

pokazano na rys 13

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

20

starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie

roacuteżnią się między sobą

Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--

fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek

Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z

poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku

prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb

uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na

starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna

zachowała się analogicznie do racematu

21

Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu

W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej

płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)

czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny

(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i

mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki

przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--

fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i

skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-

fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie

prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i

pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)

lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki

22

Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej

D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-

a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny

skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)

Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie

natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu

uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki

Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu

krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie

wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami

Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący

eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako

rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)

4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda

(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny

Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki

pokazano na rys 13

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

21

Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu

W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej

płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)

czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny

(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i

mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki

przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--

fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i

skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-

fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie

prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i

pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)

lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki

22

Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej

D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-

a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny

skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)

Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie

natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu

uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki

Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu

krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie

wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami

Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący

eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako

rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)

4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda

(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny

Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki

pokazano na rys 13

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

22

Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej

D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-

a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny

skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)

Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie

natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu

uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki

Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu

krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie

wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami

Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący

eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako

rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)

4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda

(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny

Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki

pokazano na rys 13

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

23

Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla

racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana

2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)

etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)

etanol absolutny

Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna

jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]

(7)

Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z

niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak

piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające

właściwości żelu krzemionkowego

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

24

422 Test biuretowy

Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu

krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory

D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny

w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano

z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek

zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania

wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak

inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi

(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się

systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)

(a)

(b)

(c)

Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)

roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach

przechowywania odpowiednich proboacutewek

Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty

chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--

fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie

natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-

α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys

11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

25

wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie

peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew

423 Polarymetria

4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny

Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń

W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--

fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni

w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po

kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono

na rys 15

Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w

przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

26

wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą

konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20

godzinach przechowywania roztworu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16

Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w

funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań

chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega

inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do

samorzutnej polikondensacji

4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

27

Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w

dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru

W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w

temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka

godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys

17

Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany

zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu

Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury

oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu

linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna

nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu

W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian

skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC

przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

28

Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny

rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze

22plusmn1degC

Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w

funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny

Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii

cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to

iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim

rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

29

Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew

aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej

konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego

schematu

(7)

5 Wnioski

Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment

zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach

tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z

nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew

aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania

w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro

Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie

wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one

oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu

Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże

związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i

ogoacutelnodostępnych

Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo

istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

30

zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu

oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione

zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami

badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy

wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie

z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)

Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych

przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności

optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie

stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością

chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest

stosunkowo rzadko prowadzony

6 Dalsze plany badawcze

Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min

zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii

Ramana spektroskopii 13

C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie

naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej

badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

31

7 Literatura

[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G

W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)

[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)

[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)

[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)

[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)

[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4

617 (1990)

[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm

Sci 75 439 (1986)

[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)

[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85

155 (1998)

[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb

Technol 36 232 (2005)

[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)

[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)

[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)

[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych

instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew

2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008

[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)

[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548

(2005)

[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)

[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol

29 2059-2069 (2006)

[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29

2071-2082 (2006)

[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker

New York 2004

[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

32

[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)

[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001

[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

33

8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2185-2192 (2007)

[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat

Technol 30 2193-2208 (2007)

[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska

Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)

[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -

Modern TLC 21 349-353 (2008)

[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-

160 (2009)

[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T

Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J

Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

34

9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską

[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew

organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)

[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska

13th

International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-

29062007 (poster)

[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR

Epstein T Kowalska 1th

International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai

(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)

[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel

A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne

metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A

Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody

badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)

[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th

European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th

European Symposium on

Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii

35

10 Życiorys

Imię i nazwisko Monika Gontarska

Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice

Stan cywilny panna

Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice

Wykształcenie

Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki

Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach

2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem

kierunek chemia

Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie

środowiska

1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew

Katowic w Katowicach

Doświadczenie zawodowe

2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na

Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia

2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu

bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo

(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską

w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)

2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii

Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale

Matematyki Fizyki i Chemii