1
Лекция 3:
•Репарация мтДНК
http://goo.gl/9acqtM
2
•За день в каждой клетке человека происходит 103-106 повреждений ДНК.
•В человеческом организме около ~1013 клеток.
•За сутки каждый из нас получает ~1017
повреждений ДНК.
3
С возрастом частота мутаций в мтДНК увеличивается примерно в 5 раз к 80ти годам.
PMID: 24086148
4
МтДНК мутирует быстрее ядерной
Почему?
•в митохондриях повышенное содержание ROS
• в митохондриях более слабый аппарат репарации
•в митохондриях менее точный аппарат репликации
5
В нормальной человеческой клетке:
0.3-4.2 8oxoG/106 G,
что соответствует
7.7х104 – 1х105 8oxoG
в одной клетке
Наиболее распространенные продукты окислительного стресса: 8охоG и 8охоА
6
Частота трансверсии G ->T практически не увеличивается с возрастом также как и все остальные трансверсий, в отличии от транзиций.
•Транзиция — одно пуриновое основание замещается на другое пуриновое (аденин на гуанин или наоборот), либо происходит аналогичная перестановка пиримидиновых оснований (тимин с цитозином). •Трансверсия — пуриновое основание замещается на пиримидиновое основание или наоборот.
Частота разных типов мутаций в мтДНК
PMID: 24086148
7
Количество мутаций в мтДНК увеличивается с возрастом не за счет образования 8охоG под
действием окислительного стресса.
8
В области D-loop мутаций больше, чем в остальном геноме.
Но относительное количество каждого типа мутаций одинаково по всему мт геному и не меняется с возрастом.
Видимо, уже при рождении мутаций в D-loop больше.
Как распределены мутации по мт
геному?
9
Замены
G ->A и Т ->С
чаще
происходят в
L-цепи, чем в
Н-цепи
по всему
мт-геному,
но не D-loop.
Как распределяются мутации по цепям мт ДНК?
10
Это можно объяснить асинхронной репликацией мтДНК: материнская Н-цепь остается в оц состоянии, когда с oriH идет синтез Н-цепи на матрице L-цепи.
В одноцепочечном состоянии в Н-цепи происходит спонтанное дезаминирование цитозина с образованием тимина и аденина с образованием гуанина.
11
За счет чего растет частота мутаций в митохондриях?
•Возникает спонатнное дезаминирование С и А особенно в одноцепочеченых участках ДНК в ходе репликации
•ДНК полимераза γ ошибается в репликации
•Возможно, 8охоG удаляется до репликации или его репарация усиливается с возрастом
12
Виды репарацииИзменение в одной цепи ДНК:
1. BER – base excision repair: замена измененного в результате окисления, алкилирования, гидролиза или дезаминирования азотистого основания
2. MMR – mismatch repair: удаление неспаренных нуклеотидов
3. NER – nucleotide excision repair: исправление нарушений правильной двуцепочечной структуры ДНК (например, пиримидиновых димеров)
13
1. NHEJ – non-homologous end joining: DNA ligase IV использует ближайшие выступающие концы ДНК для присоединения к месту разрыва и его сшивания. Этот процесс приводит к серьезным нарушениям в геноме
2. HR – homologous recombination: для восстановления структуры ДНК в качестве матрицы используются гомологичные хромосомы
Изменения в обеих цепях ДНК (Double-strand break repair):
14
PMID:20950654
15
Репарация митохондриальной ДНК.•BER – base excision repair
•MMR – mismatch repair
•NER – nucleotide excision repair
• NHEJ – non-homologous end joining
•HR – homologous recombination
PMID: 22138376
16
Base excision repair (BER) в митохондриях:
• SN (single nucleotide) or SP (short patch) BER
– заменяется 1 нуклеотид
• LP (long patch) BER
– заменяется 2-6 нуклеотидов
17
1. Специфичная ДНК-гликозилаза перемещает поврежденное основание ДНК
2. АP-эндонуклеаза (от apurinic or apyrimidinic site) расщепляет цепь ДНК, оставляя единичный разрыв, содержащий 5’-dRP-группу.
3. Вместо удаленного нуклеотида ДНК-полимераза вставляет новый (ые).
4. Лигаза зашивает цепь ДНК.
Base excision repair (BER) в митохондриях:PMID:20950654
18
•SN BER: 5’-dRP- группа удаляется, а gap заполняет DNA pol γ, затем сшивает DNA ligase IIIСкорость dRP-лиазной реакции у DNA pol γ ниже, чем у DNA pol β, осуществляющей BER в ядре.
•LP BER проходит в экстрактах митохондрий в присутствии белков:•Хеликаза DNA2 процессирует расширяющуюся flap-структуру•Flap endonuclease FEN1 удаляет flap-структуру, замененную DNA pol γ •Ligase III сшивает разрыв
19
Основные виды повреждений азотистых оснований:
•Окисление
•Алкилирование
•Дезаминирование
20
Base excision repair (BER) в митохондриях:
Поврежденные азотистые основания удаляются
специфичными гликозилазами
21
Основные продукты окисления азотистых оснований
22
В нормальной человеческой клетке:
0.3-4.2 8oxoG/106 G,
что соответствует
7.7х104 – 1х105 8oxoG
в одной клетке
Наиболее распространенные продукты окислительного стресса: 8охоG и 8охоА
23
Репарацию 8oxoG осуществляет гликозилаза OGG1 (MutM у бактерий).
Альтернативный сплайсинг мРНК hOGG1 дает несколько изоформ фермента, в том числе и митохондриальную.
В ядре есть другие ферменты для репарации 8oxoG, в митохондрии их нет:•В экстрактах митохондрий из ogg1-/- мышей in vitro не вырезается 8oxoG.• У ogg1-/- мышей в ядре содержание 8oxoG увеличивается не сильно, в митохондриях гораздо сильнее.
MYH (MutY у бактерий) перемещает аденин или гуанин, ошибочно вставленные при репликации во вторую цепь ДНК напротив 8oxoG.
Альтернативный сплайсинг дает ядерную и митохондриальную изоформы MYH.
24
Образование тимингликоля из тимина под действием окислительного стресса
блокирует работу РНК- и ДНК-полимеразы
25
Тимингликоль удаляется тимингликоль-гликозилазой.
У дрожжей её кодируют два гена: NTG1 и NTG2. У NTG1 двойная локализация – в ядре и в митохондриях, а NTG2 образует ядерную изоформу.
PMID:10207101
26
Совместно с NTG1 в дрожжевых митохондриях при BER-репарации работает хеликаза PIF1.
Совместное потеря генов NTG1, PIF1 и SOD (супероксиддисмутаза) приводит к потере мтДНК.
Это доказывает, что повреждения от окислительный стресса вносят основной вклад в геномную нестабильность митохондриального генома дрожжей.
PMID:15923634
27
Для тимингликоль-гликозилазы Млекопитающих hNTHL1 данные противоречивы:
•по одним данным она локализована в ядре и митохондриях, по другим – только в ядре.
•удаление тимингликоля не происходит в митохондриях из клеток мышей nth-/-, но в то же время другой группой показано удаление тимингликоля в экстрактах митохондрий мышей nth-/-.
28
Продукты дезаминирования
29
Сущестуют ядерная и митохондриальная формы урацил-ДНК-гликозилазы. Они образуются с двух разных промоторов одного
гена и в результате альтернативного сплайсинга.
У дрожжей одна изоформа этого фермента, в нем есть сигналы как ядерной, так и митохондриальной локализации.
Удаление урацила, образованного при дезаминировании цитозина,
осуществляет урацил-ДНК-гликозилаза
UNG2 UNG1 PMID:9016624
30
Наиболее распространенные продукты алкилирования: О-4-alkylT О-6-alkylG
31
Алкилированные основания удаляет
N-methylpurine-DNA-glycosylase (MPG или AAG – от alkyladenine-DNA-glycosylase или 3-
methyladenine-DNA-glycosylase).
Этот фермент не обнаружен в митохондриях, но в митохондриях репарируются повреждения, обычно служащие
субстратами этого фермента.
32
Base excision repair (BER) в митохондриях:АР эндонуклеазы
Основная АР эндонуклеаза Млекопитающих АРЕХ1 локализована как в ядре, так и в митохондриях. Митохондриальная форма короче ядерной. Есть и другая АР эндонуклеаза АРЕ2, частично транспортируемая в митохондрии, но её каталитическая активность низка, функции требуют дальнейшего изучения.
У дрожжей основная эндонуклеаза Apn1 на N-конце имеет митохондриальную адресную последовательность и сигнал ядерной локализации на C-конце. Apn1 транспортируется в митохондрии, взаимодействуя с Pir1 – белком клеточной стенки дрожжей. Pir1 конкурирует с ядерными белками за связывание с сигналом ядерной организации, что позволяет части Apn1 импортироваться в митохондрии.
33
Base excision repair (BER) в митохондриях:застраивание бреши и лигирование
АР эндонуклеаза освобождает OH-группу на 3’-конце бреши, но механизм дальнейшей репарации зависит того, какая группа расположена на 5’-конце.
В митохондриях застраивание бреши осуществляет ДНКполимераза γ, у неё есть и полимеразная и лиазная активность, но последняя слабее, чем у DNA pol β, осуществляющей BER в ядре.
34
В случае, если АР эндонуклеаза и ДНК-полимераза может оставить на 5’-конце фосфат, репарация идет по механизму short patch BER – вставляется только один нуклеотид.
В случае, если продукт вырезания устойчив к лиазной активности ДНК-полимеразы (например, при образовании 2-deoxyribonolactone) - репарация идет по механизму long patch BER – вставляется 2-6 нуклеотидов.
35
Base excision repair (BER) в митохондриях:PMID:20950654
Считается, что в long patch BER в митохондриях участвуют FEN1 и хеликаза DNA2.
Последняя стадия BER-репарации – лигирование. В митохондриях человека лигирование проводит DNA ligase 3 (LIG3). У дрожжей в митохондриях работает LIG1.
36
•ROS, образованные вне митохондрии или в результате утечки электронов из ЭТЦ повреждают свободные dNTP и мтДНК. •Сигнал о повреждении поступает в цитозоль, белки системы репарации транспортируются в митохондрию (возможно, за счет посттрансляционных модификаций). •Передача сигнала о повреждении мтДНК может дополняться передачей сигнала о повреждении ядерной ДНК для перераспределения факторов репарации. Происходит изменение локализации OGG1, UNG1 и NTH1 и дрожжевого NTG1.
Регуляция BER
Зеленым выделены главные факторы репарации; дополнительные факторы – желтым и фиолетовым; ДНК связывающие белки выделены серым.
PMID:20950654PMID:20950654
37
•Уничтожение окисленных dNTPs (I)
•Short-patch BER (II)
•Long patch BER (III)
•Регуляция репарационных процессов (IV-V)
Зеленым выделены главные факторы репарации; дополнительные факторы – желтым и фиолетовым; ДНК связывающие белки выделены серым.
Основные пути репарации в митохондриях:
38
ROS
Factors from cytoplasmTFAM участвует в
репарации мтДНК. TFAM связывается с поврежденной ДНК прочнее, чем с интактной. У TFAM аффинность к ДНК, содержащей 8-охоG, выше, чем у гликозилаз OGG1 и MYH.
Клетки, устойчивые к циспластину (алкилирующий агент), гиперэксперессируют TFAM и TRX2 (тиоредоксин 2).
TFAM связывается с р53, который тоже может регулировать его связывание с ДНК в зависимости от вида повреждения.3’-5’ экзонуклеазная активность р53 может удалять 8-охоG на 3’-конце, эта реакция усиливается SSB.
39
1. В митохондриях происходит репарация BER двух типов:
• SP (short patch) BER • LP (long patch) BER
2. Основные стадии BER:• Гликозилаза удаляет поврежденное азотистое основание• АР-эндонуклеаза освобождает 3’-конец бреши• В зависимости от группы на 5’-конце бреши ДНК полимераза
ɣ застраивает брешь одним (SP BER) или несколькими (LP BER) нуклеотидами.
• FEN1 и DNA2 участвуют в LP BER• LIG 3 зашивает разрыв
3. Существует регуляция BER в митохондриях:• Многие ферменты переходят в митохондрии в ответ на
сигналы о повреждениях• В репарации BER участвуют TFAM и p53
40
MMR – mismatch repair
Удаление несоответствий и небольших петель. Эффективность невысокая, т.к. не всегда происходит верный выбор материнской цепи, что приводит к мутациям. Удаление несоответствий - некомплементарных пар G:T и G:G показано в лизатах митохондрий млекопитающих.
Одним из основных факторов MMR в ядре служит YB-1, предполагается, что он является ключевым компонентом MMR и в митохондриях.
41
YB-1 в отличие от остальных участников ядерной MMR (MSH1, MSH3, MSH6) частично локализован в митохондриях.
В митохондриальных экстрактах из клеток с отсутствием MSH2 наблюдается MMR => механизм MMR в митохондриях отличается от ядерного.
MMR в экстрактах митохондрий снижается при уменьшении уровня YB-1 (нокдаун siRNA).
PMID:19272840
42
•Вопрос о наличии MMR в митохондриях остается открытым.
•BER тоже может репарировать несоответствия.
• Существует предположение, что MMR необходима для удаления маленьких петель в большей степени, чем несоответствий в парах нуклеотидах.
43
Double-strand break repair
Есть доказательства наличия в митохондриях обоих механизмов: NHEJ (non-homologous end joining) и HR (homologous recombination).
RAD51 – основной фермент HR в ядре – локализован также в человеческих митохондриях
:
44
Rad 51 переходит в митохондрии в ответ на окислительный стресс.
Для перехода Rad 51 необходима репликация.
PMID:23591384
45
Direct repair (без разрезания фосфодиэфирной связи)
Повреждения ДНК УФ излучением в ядре репарирует фотолиаза, её активность не показана в митохондриях Млекопитающих. У дрожжей фотолиаза работает в митохондриях.
O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) – основной фермент прямого репарирования алкилированных оснований в ядерной ДНК. Есть данные, что MGM присутствует в митохондриях, но может репарировать только метилированные и этилированные основания.
46
NER – nucleotide excision repair
Считается, что этот механизм отсутствует в митохондриях.
•В митохондриях дрожжей индуцированные УФ пиримидиновые димеры репарируются эндонуклеазой Rad2. Этот механизм UVER (UV excision repair) одновременно похож и на BER, и на NER.
•Белки, участвующие в ядерной NER CSA (от Cockayne Syndrome) и CSB обнаруживаются в митохондриях Млекопитающих в условиях окислительного стресса. Они связываются с мтДНК и компонентами BER.
Возможно, в митохондриях есть отличный от ядра механизм NER, который еще будет исследован.
47
•В митохондриях происходит репарация двух типов: •BER – base excision repair•MMR – mismatch repair
2. В митохондриях отсутствует NER – nucleotide excision repair
3. Наличие репарации при двуцепочеченых повреждениях мтДНК не изучено, но Rad 51 поступает в митохондрии в условиях окислительного стресса и участвует в репликации.
48
•CSB (от Cockayne Syndrome) рекрутирует факторы BER к мембране;
•CSA and CSB взаимодействуют с SSB и гликозилазой;
•p53 стимулирует гликозилазу и POLγ;
•PARP-1 модулирует BER.
Регуляция и топология репарации в митохондриях
PARP1 – Poly (ADP-ribose) polymerase – ключевой ядерный фермент репарации однонитевых разрывов. Такие разрывы образуются при BER, поэтому PARP1 влияет и на BER.PARP1 локализована в митохондрии и участвует в поддержании целостности мтДНК. PARP1 входит в комплекс, включающий мтДНК и лигазу 3.
49
Мт ДНК связана с внутренней мембраной. Один из белков, связывающих ДНК с мембраной – М19, вероятно, участвуют также РНВ1 (prohibitin1) и ATAD3 (белок внутренней мембраны, ответственный за перемещения D-loop).
Большинство компонентов BER связаны с внутренней мембраной (кроме АР-эндонуклеазы). Но стабильного комплекса компоненты BER не образуют. Есть данные, что CSB вовлечен в сборку и сохранение комплекса мтДНК и компонентов BER: он связывает SSB и OGG1 в один комплекс с мтДНК.
50
Есть две модели:
•мтДНК мобильна и проходит через комплексы, расположенные на внутренней мембране, для репликации, репарации и. т. д.
•мтДНК заякорена на внутренней мембране.
51
Регуляция репарации мтДНКМт изоформы многих ферментов мт репарации образуются с помощью альтернативного сплайсинга, а, значит, возможна посттранскрипционная регуляция.
Есть данные по NTG1 и NTG2 дрожжей. NTG1 динамично перераспределяется между ядром и митохондриями при окислительном стрессе. Переход NTG1 в митохондрии зависит от окислительных повреждений, но не от уровня ROS. Значит, есть специфичные сигналы об этих повреждениях, исходящие из митохондрий.
Некоторые белки с двойной ядерной и митохондриальной локализацией обнаруживаются в митохондриях только в условиях окислительного стресса: Rad51, APEX1, CSA и CSB.
Многие белки имеют сигналы как ядерной, так и митохондриальной локализации: NTG1, UNG1, APE1 у дрожжей и hOGG1a, hNTHL1 у Млекопитающих. Возможно, механизм, показанный для NTG1, является общим.
Окислительный стресс вызывает переход р53 в митохондрии.