1 תרגיל מס. ביולוגיה מולקולרית, פתרון

8.11.09 תאריך הגשה:

ע"פ עקרון ההשלמה בדנ"א דו-גדילי. 1[A[ = ]T = ]32%[ -ולכן , C[ + ]G = ]100%-64%= 36%[G[ =]C = ]18%

, ולכן C נמצא G, ומול כל T נמצא Aמול כל . בדנ"א דו-גדילי 2 %A=%T % -וG=%C -1והיחסים הבאים יהיו קבועים )ושווים ל(

A+C A+G G+T C+T

3 .

הגנטי החומר %A %G %T %C %U

נ"א חד-גדיליר 20 30 0 20 30  1

-גדילידונ"א ר 30 20 0 20 30 2

דנ"א חד-גדילי 15 30 25 30 0 3

דנ"א חד-גדילי 25 35 25 15 0 4

. ב. שבירת קשר פוספודיאסטרי באחד הגדילים4 או חימום( יכול לגרום לדנטורציה של הדנ"א, אך לא ישנה את ה-pHשינוי תנאים )כמו

linking number

אינן נכונות ד. תשובות א-ג. 5 לעבור לסליליות-על גבוהה– )כדי להכניס פיתולים relaxedהמולקולה תעבור למצב

יותר )שלילית או חיובית( צריך פעילות אנזימתית מתאימה, הדורשת גם אנרגיה(

6. בדנ"א הנתון הוא AAGCTTא. הסיכוי לאתר

1/4 x 1/4 x1/4 x 1/4 x 1/4 x 1/4 = )1/4(6 = 1/4096 bp 4096ולכן המרחק הממוצע בין האתרים יהי ה

בדנ"א הנתון הוא AATGCATTב. הסיכוי לאתר (1/4)8 =1/65536

bp 65536ולכן המרחק הממוצע בין האתרים יהי ה

GA Py Pu , וכך גם לפירימידין. ולכן הסיכוי ל-1/2ההסתברות לפורין היא ג. TCהוא

1/4 x 1/4 x1/2 x 1/2 x 1/4 x 1/4 = 1/1024 bp 1024ולכן המרחק הממוצע בין האתרים יהי ה

1- נוקלאוטיד כלשהו, ההסתברות לכן =Nד. בדנ"א הנתון הוא GANNTCהסיכוי לאתר

1/4 x 1/4 x1x 1 x 1/4 x 1/4 = 1/256 bp 256ולכן המרחק הממוצע בין האתרים יהי ה

כיוון שנתון שהדנ"א הוא של צמח- ברור שהוא דו-גדילי.. 7 , כמו גם ההסתברות שיהיה1/6 הוא Gבמקרה זה ההסתברות שנוקלאוטיד יהיה

C.A+T[[ =2/3 ולכן ההסתברות שהנוקלאוטיד ,A הסתברות שהנוקלאוטיד = T = 1/3.

בדנ"א הנתון הוא AAGCTTהסיכוי לאתר ולכן 1/3 x 1/3 x1/6 x 1/6 x 1/3 x 1/3 = 1/2916

. רצפים ג +ד 8

סדר ההתכה: ג, ב, א.. 9 יציבות קטע הדנ"א תהיה גבוהה יותר ככל שמספר קשרי המימן בין שני הגדילים גדול

קשרי מימן,3 תורם G-C )כל זוג G-Cיותר. מספר הקשרים תלוי באורך הקטע וב-% ה- תורם שני קשרי מימן(. מדד ליציבות קטע דנ"א )קצר( יהיה סך כך קשריA-Tוכל זוג

יותרמאוחרתהמימן בקטע. כמובן, שככל שהיציבות גדולה יותר- ההתכה תהיה )=תידרש טמפ. התכה גבוהה יותר( .

(]2]A+T[+G+C]4 של אוליגונוקלאוטידים הוא, למעשה, Tm)הכלל לחישוב ה-

. ג. לגלאי יש רצף נוקלאוטידים משלים לרצף נוקלאוטידים במולקולת הרנ"א10

11. א. נראה מריחה. גנום העכבר גדול, ולכן יתקבל מספר גדול מאד של קטעי

EcoRI רסטריקציה, שיראה בג'ל כמריחה. )אתר ההכרה של האנזים הרסטריקציה בסיסים(. אתידיום ברומיד צובע את כלל הדנ"א. 6הוא של

והשניKb 1.8ב. רק קטעים אליהם נקשר הגלאי יראו. נראה שני פסים, האחד בגודל . Kb 0.6 בגודל

ג. תוצאות זהות. הדנ"א בכל התאים )הרקמות( זהה.

התבטאות. בבדיקה זאת נבדק רק הרנ"א ולא הדנ"א, המצאות רנ"א מעידה על 12 . בתוצאות ההיברידיזציה ניתן לזהות את רצפי הרנ"אהגנים ברקמה הנבדקת

המשלימים לרצף הגלאי.מתבטא בתאי הכבד, המוח והשריר. Aד. הגן

גבוהה יותר ברקמת המוח מאשר ברקמת השריר. Aה. רמת ההתבטאות של הגן ז. לאורך העמודה "כליה" לא נמצא כל רנ"א בעל רצפים משלימים לרצף הגלאי.

2 תרגיל מס. ביולוגיה מולקולרית, פתרון

לאחר הדנטורציה מתקבלות מולקולות חד גדיליות. בהדגרה בתנאים מתאימים, .1גדילים משלימים )=קומפלמנטריים( יעברו היברידיזציה למולקולות דו-גדיליות.

T4 N14 בלבד. לאחר הדנטורציה יתקבלו גדילים 4Tהניסוי הראשון כולל דנ"א של פאז'

, ולאחר ההיברידיזציה ייתכנו שלושה צירופים, בשלוש צפיפויות שונות: T4 N15ו-T4 N14 /T4 N14 ; T4 N15 /T4 N15 ; T4 N14 /T4 N15.

T4 N14. לאחר הדנטורציה יתקבלו גדילים -5T ו-4Tהניסוי השני כולל שני סוגי פאז'ים-

. ברור שההיברידיזציה בין גדילים של כל פאז' )לבין עצמם( תתרחש, וכיווןT5 N15ו- )אין5T ו-4Tשיש רק שני פסים -ניתן להסיק שלא התרחשה היברידיזציה בין

.T4 N14 /T4 N14 ; T5 N15 /T5 N15קומפלמנטציה(, יתקבלו רק הפסים של

2.

" בפרק "הכפלת דנ"א". להבנה טובה יותר-כדאי1התמונה לקוחה מתוך "אנימציה לצפות באנימציה כולה.

שימו לב: ההכפלה דו-כיוונית: יש כאן למעשה שני מזלגות הכפלה, בכיוונים מנוגדים. כלא.

מזלג הכפלה נפתח ומתקדם בכוון החץ הסגול. הניתוח של כל מזלג הכפלה?(מדועמסודרים כתמונת ראי זה לזה )אינם זהה, אבל הם כמובן

(lagging strand( והגדיל המאחר )leading strandהמונחים: הגדיל המוביל )ב.מתייחסים לגדילים החדשים )הניבנים(, בציור-אלו הגדילים הפנימיים.

. ההיגד נכון, כמודגם באיור הבא. מזלגות ההכפלה מכל מוצא הכפלה מתקדמים3לשני הכיוונים , אם "נפגיש" את את שני המזלגות הסמוכים נקבל את המצב :

4. יסונתז קודם.Eגדיל

קטעי

קטעי

E-ו D,הם קטעי אוקזאקי בגדיל המאחר, כיוון הפתיחה של מזלג ההכפלה הוא ימינה .D נפתח לפני אזור Eולכן אזור

נוקלאוטידים/שניה/מזלג הכפלה.100 הוא שמר בתאי א"הדנ הכפלת קצב. 5x 105 = 100 60 x40 x 2.4 /מזלג:דקות 40 המוכפלים ב-הנוקלאוטידים מספר

שני מזלגות הכפלה )דו-כיווני(, ולכן מספר הנוקלאוטידיםיוצאים הכפלה ממוצא x 2= 4.8 x 105: דקות40 אחד ב-הכפלההמוכפלים ממוצא

2.4 x 105 שיאפשרושמר הא של רפליקונים )מוצאי הכפלה( בדנ"המינימלי -המספר ומכאן

= x 107 / 4.8 x 105 1.2: 25 דקות הוא 40כל הכפלה אחת מלאה 25

: הערות ביןשווה עבודה" חלוקת על ההנחה שיש "מבוסס התרגיל פתרוןא.

לציין כי זהוישהרפליקונים- כלומר, שהמרחק בין מוצאי ההכפלה זהה. נכונה.בהכרחתרגיל בלבד! הנחה זו אינה

מוצאי הכפלה.מאות יש שמר! בבלבד לציין כי זהו תרגיל ישב. הערכים של אורך גנום, ניתנים תמיד לגבי הגנום ההפלואידי. התשובהג.

מתאימה לכן לגנום ההפלואידי.

6. , אנזים זה אחראי לסינתזת הגדיל המוביל - אין סינתזת דנ"אIIIדנ"א פולימראז א.

והמאחר - אחראי להורדת פריימרים, ו"סגירת רווחים" -פעולות הקודמותIדנ"א פולימראז ב.

לחיבור קטעי אוקזקי בגדיל המאחר )הדנ"א ליגאז מאחה רק בין נוקלאוטידים: )א(סמוכים )ב( של דנ"א. בהעדרו- ישארו קטעים שאינם מחוברים ביניהם כשבקצה ה-'

של כל קטע -מספר נוקלאוטידים של רנ"א )פריימר(, בין הקטעים ייתכנו רווחים.5 מאחה את קטעי אוקזקי בגדיל המאחר. בהעדרו ישארו קטעים שאינם - דנ"א ליגאזג.

מחוברים ביניהם )אבל הקטעים יכללו רק דנ"א, ויהיו צמודים זה לזה-ללא רווחים(., בהעדרו-sliding clamp- ה- (III )של דנ"א פולימראז βתת יחידה ד.

processivity.של האנזים יירד מאד, ייאט מאד את קצב הסינתזה - לא תהיה פתיחה של ההליקס- אין סינתזה. (helicaseדנ"א הליקאז )ה.- אין יצירת פריימרים- אין סינתזה.(primaseפרימאז )ו.

. ההבדל היחידdTTP( היא אנאלוג של AZTהמולקולה באיור )צורת הנוקלאוטיד של . 7 ( מכיר אתRT(. האנזים )3N מוחלפת בקבוצת אזיד )OH, בו קבוצת ה-3הוא בפחמן '

בעמדה 'OH(, אבל העדר קבוצת dTTP המסונתז )במקום DNAהאנאלוג ומשלב אותו ב- לא תאפשר את קשירת הנוקלאוטיד הבא- סינתזת הגדיל נפסקת.AZT ב-3

(lagging strand ) ה. האלומראז מאריך את גדיל התבנית של הגדיל המאחר. 8

. ראו הערות בתרגילים.9

3 תרגיל מס. פתרון ביולוגיה מולקולרית,

.3 מהחיידקים בדור 1/4. 1

2.

אין קבוצת אמינו ולכן אינו עובר דאמינציה.תימיןל

בסיסים חנקניים מוכרים -

דאמינציות של בסיסי הדנ"א קורות בתא כל הזמן )לאו דווקא בזמן ההכפלה(. בכל המקרים, ללא תיקון - תיווצר מוטציה כיוון שבמחזור ההכפלה הבא הבסיס שעבר שינוי

AUייצור במחזור ההכפלה הבא את הזוג Uיתקשר לבסיס שונה מהמקור. לדוגמא: . )מולקולת הבת השניהATל- CGבמולקולת-בת אחת וייקבע בכך את המוטציה מ-

(.CGתהיה תקינה- ,Gו- A , וכמוהו גם תוצרי הדאמינציה של U- בתא קיימות מערכות תיקון. ה- אבל

DNAאינם מרכיבים של הדנ"א הרגיל והם יזוהו כבסיסים שגויים ויעברו תיקון ) גליקוזילזות מתאימות מזהות את הבסיסים השגויים ומוציאות אותם וכו'-ראו מערכות

( הוא אחד מהבסיסיםmC5- , לעומת זאת התימין )תוצר הדאמינציה של BERתיקון הרגילים של הדנ"א, ולכן לא יזוהה כשגוי. התוצאה: ללא תיקון תתקבע במחזור

. ATובשניה CGההכפלה הבא מוטציה: במולקולת בת אחת יופיע הערות:

בדנ"א עוברים מתילציה. C מה-חלק הוא מרכיב טבעי של הדנ"א: mC5- א.

-T 5בכל זאת, יש כנראה בתא מערכת הגורמת להעדפת התיקון של ה"זוג" ב.mC-ל CG -ולא לAT העדפה בלבד., אבל זו

(, באזוריםhotspotsישנם אתרים בדנ"א בהם יש תדירות מוטציות מוגברת )ג..mC5- אלו נמצא שיש תדירות גבוהה יותר של

- תיקון ישיר, מערכת המפרידה את הקשר הקוולנטי שנוצר ביןא. פוטוראקטיבציה. 3 ( אינן מתאימות, כיוון שהןNER, BERשני התימינים. שתי המערכות האחרות )

NER ה- כלל אינה מתקנת דימרים של תימין, BERמצריכות דנ"א דו-גדילי. )ה- מתקנת דימרים של תימין, אבל הדנ"א חייב להיות דו-גדילי(.

דנ"א גליקוזילאז. 4אנדונוקלאז

דנ"א פולימראזדנ"א ליגאז

מעלות את רמת המוטציות בדנ"אמערכות תיקון עוקפות . 5

NERמערכת . 6

7 .

E. coli הוא אנזים של DNA polII- דנ"א של חיידקא.הגדיל העליון הוא המקורי )למה?(ב. 3 ל-'5, הסינתזה תמיד מ-'שמאלה ג. מגדיר אזורים– U אלו אזורים שהם דנ"א, וגם – Tה. בגדיל הנבנה יש גם –ד

שהם רנ"א. רנ"א בדנ"א נבנה- חייב להיות הפריימר*. ההסבר לכך: בגדיל הנבנה יש שני קטעי אוקזאקי, קטע אוקאזאקי שסונתז אחרון עדיין מכיל את

הפריימר )רנ"א(, מכאן:עדיין לא פעל על אזור זה Iהדנ"א פולימראז ה. ד. שני הקטעים עדיין אינם מחוברים, ןמכאן שאין קשר פוספודיאסטרי בין המסומנים במסגרת.T וה-Uה-

המופיעים הם חלק מהפריימר )רנ"א(. הם אינם דאוקסינוקלאוטידיםU*- ה- . ב.A מופיעים מול U, ואילו ה-C מתקבל מדאמינציה של Uשעברו דאמינציה, כי א.

בכל מקרה לא סביר היה שיש שלושה שינויים קרובים.

4 תרגיל מס. פתרון ביולוגיה מולקולרית,

1.

3-'CTACTCCTACTCCTCTTC…………………….…………..GTAGTGTTATACAAGTCA -5'

ראשית, כדארי תמיד להוסיף את הגדיל המשלים. כיווני הפריימרים להגברתהקטע הנתון מסומנים באיור.

f- פריימרforwardמשלים לגדיל המשלים לזה המוצג בשאלה )=זהה , לרצף הגדיל הנתון(

g- פריימרreverse.משלים לגדיל הנתון ,

f- Tm = 4X9 + 2X9 = 54 oC g- Tm = 4X6 + 2X12 = 48 oC

2 . רגילה מתקבל אפקט הגברה: גידול אקספוננציאלי של מספרPCRבראקציית

פריימרים, פריימר אחד נצמד לגדיל אחד,שניהעותקים. הגברה זו מתקבלת כאשר יש שהמולקולות המסונתזותוהפריימר השני נצמד לגדיל השני, והסינתזה נעשית כך

. אפקט זה לא מתקבל בנוכחותלסינתזה במחזור הבא במחזור אחד מהוות תבנית.פריימר אחד בלבד

מולקולות-Mנניח שהתחלנו את הראקציה עם א. לא התרחשה הגברה אקספוננציאלית, במקום זאת בכל מחזור התקבל מכל

גדילים. אורך x M30 מחזורים התקבלו 30מולקולה התחלתית גדיל אחד. לאחר בגודל הרצוי.אינו הגדילים שהתקבלו

אם נתעלם מההשפעה של ריכוזי הראקטאנטים על הראקציה:ב. ~ מולקולות,x M 1000= 210 מחזורים ראשונים תקינים- תתקבל הגברה של 10

כמעט כל המולקולות יהיו בגודל אחיד- התחום בין שני הפריימרים. המחזורים הבאים יתנהגו כמתואר בסעיף א'. כלומר, מכל מולקולה התחלתית20

20 ~ מולקולות, לאחר x M 1000יתקבל בכל מחזור גדיל אחד, כיוון שבשלב זה יש גדילים, כמעט כולם יהיו בגודל התחום בין שניx 1000 x M 20מחזורים נקבל

הפריימרים )מדוע?(.

בגן -התוחמים אתלרצפים משני צידי הרצף החוזריוצרים פריימרים המתאימים . 3 הרצף החוזר. )הפריימרים חייבים להיות ספציפיים, כל פריימר- נקשר רק לרצף יחיד

בגן(. על דגימות דנ"א שבודדו מתאי הפרטים הנבדקים, ומריצים אתPCRמריצים ראקצית

במקביל לסמני גודל מתאימים.PCRתוצרי ה- בגן, ולפי זה-CAGלפי גודל הקטעים המתקבלים ניתן לקבוע את מספר החזרות של

האם האדם בריא או עתיד לחלות במחלה.

)אנשים יכולים להיות הומוזיגוטים או הטרוזיגוטיים לגן. במקרה של הטרוזיגוט- יופיעושני פסים. שימו לב שהמחלה דומיננטית. מה המשמעות?(

. זוג התאומים הימני וזוג התאומים השמאלי הם תאומים זהים. קיימת זהות מלאה של4 חלק מהפסים משותף, וחלק–הפסים המתקבלים. הזוג האמצעי הם תאומים לא זהים

שונה )מדוע חלק מהפסים משותף? מדוע חלק מהפסים שונה?(

( גבוה יותר,dNTP במקום נוקלאוטיד רגיל )ddNTPתהיה השפעה. הסיכוי לכניסת . 5ולכן הקטעים שיתקבלו יהיו קצרים יותר. ניתן יהיה לקרוא רק רצף קצר יותר של הדנ"א.

6 .'AGCGTT)T/G(CATTT 3' 5: הנבנהרצף הגדיל

- יש שני רצפים-שני אללים- השוניםG וגם ב-Tבאחת העמדות ברצף מופיע פס גם ב-זה מזה בעמדה זאת- האדם הטרוזיגוט לעמדה זו.

5 תרגיל מס. פתרון ביולוגיה מולקולרית,

. סיכום בתרגיל כיתה.1

. 2פרומוטור מס. .2 דומה יותר לרצף ההסכמה.2רצף פרומוטור

: DNaseIניתן לראות שהרצפים המוגנים מפני החיתוך ע"י ה- .3 קשה לדייק בצד זה כיוון1 לכמה נוקלאוטידים במורד הזרם ל 35-בין( +

שהפסים באזור צפופים( 54- ל 38בין-

כמובן שאילו לא היתה אינפורמציה נוספת- לא ניתן לקבוע האם יש כאן קישור של חלבון אחד או יותר. כיוון שנתון בשאלה שהדנ"א הודגר עם רנ"א פולימראז – כנראה

אלה אזורי הקישור של האנזים לדנ"א הנבדק. של האיור הבא(bהאזור הראשון תואר בהרצאה; יש פרומוטורים )המתוארים בחלק

בהם יש אזור קישור נוסף של הרנ"א פולימראז, במעלה הזרם.

. חלבון א בהכרח נקשר לדנ"א )סעיף א אינו נכון; סעיף ג נכון(4חלבון ב יתכן שנקשר לדנ"א, אבל לא בהכרח )סעיף ב נכון; סעיף ד אינו נכון( לכל אחד אתר קישור שונה )סעיף ה נכון(–אם חלבון א וחלבון ב נקשרים

דיון נוסף בתרגיל כיתה

. המשפטים הנכונים:5

)EMSA )=gel shiftבשיטת ה- מסמנים את הדנ"א בלבד

footprintingבשיטת ה- חייבים להפריד את החלבון מהדנ"א לפני האלקטרופורזה בג'ל

מסמנים את הדנ"א בלבדהסימון חייב להיות בקצה המולקולה המסומנת בלבד

מיקום הסימון אינו gel shiftבשתי השיטות מסמנים את הדנ"א בלבד. בשיטת ה- הסימון חייב להיותfootprintingחשוב, יכול להיות גם לאורך המולקולה. בשיטת ה-

,, באותו הנוקלאוטיד )המסומן( מתחילים בקצה אחדכל הקטעים בקצה- רק כך ומסתיימים במקום החיתוך, וכך , כתוצאה מהחיתוך )האקראי(, נקבל כתוצאה את

)הקטעים האחריםכשכל קטע מארוך מקודמו בנוקלאוטיד אחד."סולם" הקטעים המתקבלים בחיתוך, שאינם מתחילים בקצה המסומן- לא יופיעו כלל.(

חייבים להפריד את החלבון מהדנ"א לפני האלקטרופורזה בג'ל footprintingבשיטת ה- )ולהריץ על ג'ל דנטורטיבי(, כדי לקבל את ה"סולם" של קטעי הדנ"א. לעומת זאת,

מבוססת על כך שהחלבון קשור לדנ"א בזמן ההרצה על הג'ל ולכןgel shift שיטת ה- מאט את נדידתו )ולכן גם ההרצה היא על ג'ל שאינו דנטורטיבי(.

6.EMSAניסוי ה- - ביקורת, דנ"א חפשי, ללא חלבון 1עמודה A נקשר לדנ"א ומאט את נדידתו בג'ל, מופיע פס בגובה TFA-1 - 2עמודה אינו נקשר לדנ"אTFA-2 - 3עמודה : הקומפלקס נודד לאטB יחד גורמת להופעת פס בגובה TF - הוספת שני ה-4עמודה

בלבדTFA-1 יותר מאשר הדנ"א + לבדו אינו יכול להקשר לדנ"א,TFA-2 יכולת קשירה לדנ"א, TFA-1ניתן להסיק של- לא ניתן לדעת ע"פ. TFA1-TFA2 הוא מצטרף לקומפלקס דנ"א-TFA-1אולם בנוכחות

או לדנ"א(.TFA1 )לחלבון TFA2 ניסוי זה לאיזו מולקולה בדיוק נקשר

footprintingניסוי ה- - ביקורת, ללא חלבון 1עמודה TFA2 בניסוי -מתקבל אותו דגם פסים בדיוק כמו בביקורת - TFA-2 - הוספת 2עמודה

אינו נקשר לדנ"א בהשוואה לביקורת רואים אזורים מוגנים )מסומנים– בניסוי TFA-1 - הוספת 3עמודה

נקשר לדנ"א ברצפים אלו TFA-1באיור בכתום(, מכאן ש- יחד גורמת להופעת אזור מוגן נוסף )מסומן באיור בירוק(.TF - הוספת שני ה-4עמודה

? )יש מספר הסבריםTFA2מה יכולות להיות ההסבר על אופי ההתקשרות של אפשריים(.

.

'5' CAA 3' 5' CAG 3(- Glnהקודונים לגלוטמין ) .7 בעמדהG וגם A(– גם 24, שיקופית 6 בחיידקים )מצגת wobbleע"פ טבלת אפשרויות ה-

באנטיקודון.1 בעמדה מס. U בקודון יכולים להיקרא ע"י 3מספר יתאים לשני הקודונים. 'GUU 5' 3עם האנטיקודון gln-tRNA לכן

?tRNAמהם הקודונים המתאימים לכל . 8 בלבד של הקודון! – מתאים לנוקלאוטיד3 היא בנוקלאוטיד ה-wobbleעמדת ה-

( של האנטיקודון.5הראשון )ה-' וטבלת הקוד הגנטי-wobbleע"פ טבלת ההתאמה של ה-

tRNA 5 בעל רצף אנטיקודון 'IAG 3' 5– קודונים 'CUU 3', 5' CUC 3', 5' CUA 3', כולם קודונים של לאוצין.

tRNA 5 בעל רצף אנטיקודון 'IAA 3' 5– קודונים 'UUU 3', 5' UUC 3', 5' UUA 3',שני הראשונים קודונים של פניאלאנין והשלישי של לאוצין.

אחד מתאים לקודונים של שתי חומצות אמינו, לא יתכןtRNAכמובן שמצב זה, בו בתא, היה משבש את קריאת הרנ"א-שליח ואת תקינות החלבון.

6 תרגיל מס. פתרון ביולוגיה מולקולרית,

נוקלאוטידים303 גדול מ- mRNAאורך ה-. 1

נוקלאוטידיםx 3 = 300 100 חומצות אמינו- מקודדות ע"י 100החלבון שבודד )הבוגר( הוא בן יש בנוסף גם רצפים בלתי מקודדים )mRNA נוקלאוטידים. בכל 303+ קודון סיום +

untranslated UT=' )3'-לאזור המקודד.5 ו .בריבוזום Aמתקשר לאתר . 2

הפורומיצין מתחבר לקצה הקרבוקסילי של חומצת האמינו שלפניו, החיבור נעשה ע"י , והפורומיצין נמצאPהפפטידיל טרנספראז, כשחומצת האמינו הקודמת נמצאת באתר

)אחרת לא יתרחש החיבור(.Aבאתר

3 .

( ולהפוךcys-tRNAcys אליו קשור ציסטאין ) tRNA ניתן להפעיל ריאקציה כימית על . 4 את הציסטאין לאלאנין. מה תהיה ההשפעה על סינתזת חלבון במבחנה? )במערכת

(cell-freeסינתזה במקומות בחלבון בהם מופיע ציסטאין יופיע אלאנין

קורא את הקודון של ציסטאין, אבל, כיוון שקשור אליו אלאנין- יכנס בסינתזתtRNAה-החלבון במקום זה אלאנין.

5 .5 הם: היסטידיןהקודונים ל 'CAU 3', 5' CAC 3'

'GUA 5', 3' GUC 5' 3האנטיקודונים בהתאמה:

'CGU 3', 5' CGC 3' 5 הם: ארגיניןהקודונים ל'GCA 5', 3' GCC 5' 3האנטיקודונים בהתאמה:

)יש ארבעה קודונים נוספים של ארגינין, אבל הם שונים ביותר מבסיס אחד מאלו של היסטידין,ולכן אלו שנרשמו הם המתאימים לשאלה(.

1 2 3

'5

'3

N

שימו לב, קצה הפוליפפטיד

המסונתז הואהקצה האמיני.

U של האנטיקודון להיסטידין במקום ה-2בשני המקרים, מוטציה שכתוצאה ממנה , בעמדה , תביא לכך שהאנטיקודון יהפוך לאנטיקודון של ארגינין )כלומר- יתאים לקודונים שלCיופיע

(C. ל-Tארגינין(. )כמובן שכיוון שמוטציה חלה בגן, השינוי יהיה ברמת הדנ"א, מ-

.א. כניסת היסטידין במקום ארגינין בחלבונים שונים כיוון שהאנטיקודון המוטנטי קורא עכשיו קודון של ארגינין ולא היסטידין, ובהנחה )בהמשך(

המכניס, בזמן התרגום tRNA המוטנטי ימשיך להיות מוטען בהיסטידין- יתקבל tRNAשה-בריבוזום, היסטידין בקודונים של ארגינין. זה יקרה בסינתזה של חלבונים שונים.

לא ע"פ tRNA HISמכיר את ה his-tRNA synthetaseההנחה המתחייבת היא שהאנזים כך שלמרות השינוי באנטיקודון הוא ימשיך, tRNAהאנטיקודון, אלא לפי אזורים אחרים ב-

המוטנטי בהיסטידין.tRNAלהטעין את ה- הארגינינים יוחלפו בהיסטידינים? לא. משתי סיבות:האם כל

o-יש מספר קודונים שונים לארגינין, וברור שלא כולם יזוהו ע"י הtRNAהמוטנטי, ולכן לא ייפגעו כלל.

o-גם לגבי קודון הארגינין המזוהה ע"י הtRNA בין ה-תחרות המוטנטי- עדיין תהיה tRNA ARG-התקין )המתאים לעמדה זאת ארגינין( לבין ה tRNA המוטנטי )המתאים

לעמדה זאת היסטידין(.

6. & * #

5' CGAGGGGAAAUCCGAUGGUCGAGACAGUGACCUAAGGCUCA 3'

המלא(. כיוון שנתון שזהו הרצף AUGסינתזת פפטיד בתא מתחילה תמיד במתיונין )קודון יחיד, האזור המקודד + קודון הסיום הם אלוAUG וברצף יש רק צירוף mRNAשל ה-

המסומנים בצהוב, והפפטיד הוא-

AUG GUC GAG ACA GUG ACC Met Val Glu Thr Val Thr

7 .. frameshift mutation מוטצית הסטת מסגרתשינוי במסגרת הקריאה: א.

החל מנקודת המוטציה יווצר רצף שונה לחלוטין של חומצות אמינו, כמובן ששינוי הרצף יכול לגרום גם להופעת קודון סיום )או לכך שקודון הסיום המקורי

"נעלם"(. הפפטיד שיתקבל במקרה זה-AUG UCG AGA CAG

Met Ser Arg Gln

Val Ile ב.missense mutationמוטצית סלף החלפת חומצת אמינו אחת באחרת.

למוטציה זו ,ברוב המקרים, לא תהיה השפעה ניכרת על הפוליפפטיד, בגלל . Neutral mutation מוטציה ניטרלית הדמיון בין שתי חומצות האמינו-

)בניגוד לדוגמא בסעיף ג.(

Val Asp ג.missense mutationמוטצית סלף החלפת חומצת אמינו אחת באחרת.

stop codon Glu ד. קודון לחומצת אמינו הופך לקודון סיום: סיום מוקדם של הסינתזה. nonsense mutation פסק מוטצית

Thr Thr . ה

silent mutation מוטציה שקטהאין שינוי במבנה הפפטיד.

מוטציות א ו-ד הן החמורות ביותר. חומרת מוטציות אלו תלויה, כמובן, במקום המוטציה: ככל שחלה קרוב יותר לתחילת הפפטיד- חמורה יותר.

במוטציות בהן מוחלפת חומצת אמינו אחת באחרת- השפעת המוטציה על פעילות החלבון תלויה במקום המוטציה )שינוי באתר הפעיל, אתר הכרה,

שינוי המשפיע על מבנה מרחבי וכו'-יכול להיות חמור(, ובאופי השינוי: מוטציה ג'-החלפת שייר הידרופובי בשייר טעון חמורה יותר ממוטציה ב': החלפת שייר

הידרופובי אחד באחר..מוטציה ה היא מוטציה שקטה -אינה מתבטאת כלל ברמת החלבון

8 . ( - אין כלל פעילות של האופרון.-bambaR )במוטנטים bambaRכשאין את החלבון המווסת

היא בקרהbambaR להתבטאות האופרון, ומכאן שהבקרה ע"י הכרחימכאן, שהחלבון המווסת חיובית. )כשהחלבון נמצא בתא, בתנאים המתאימים תתכן פעילות.(

9 . לרצף argRאם הבקרה שלילית, סביר להניח שהארגינין מעלה את האפיניות של ב.

הבקרה לרצף argRאם הבקרה חיובית, סביר להניח שהארגינין מוריד את האפיניות של ה.

הבקרה

נתון בשאלה שמולקולות ארגינין מווסתות את התבטאות הגנים במסלול הביוסינתטי של(.argRהארגינין )דרך התקשרות הארגינין לחלבון הבקרה

כיוון שכשיש ארגינין בתא – אין צורך בייצורהארגינין גורם להשתקת גנים אלו, סביר להניח שארגינין נוסף )ולהפך- כשרמת הארגינין בתא נמוכה- הגנים יופעלו(.

.argRנתוני השאלה אינם מגדירים את אופי חלבון הבקרה הוא רפרסור-הוא יופעל בזמן שיש ארגינין בתא )כדיargRאם הבקרה שלילית – כלומר,

להשתיק את הגנים ולמנוע ייצור נוסף של ארגינין(. כלומר הארגינין יעלה את קשירת החלבוןלרצף הבקרה.

הוא אקטיבטור-הוא מפעיל את הגנים לייצור ארגינין. אם ישargRאם הבקרה חיובית – כלומר, ארגינין בתא- לא יהיה צורך בהפעלתם, ולכן סביר שהארגינין יגרום לאקטיבטור להיות בלתי

פעיל- ע"י הורדת האפיניות של החלבון לרצף הבקרה.

10.רמת התבטאות האופרוןהמצע מכיל

גלוקוזלקטוזנמוכה+-נמוכה--גבוהה++גבוהה-+

גורמת לו להיות תמיד קשור לרצף ההכרה שלו )בלי תלותCAPכיוון שהמוטציה בחלבון ה- , במקרה זה(, הבקרה החיובית תופעל תמיד. רמת התבטאות האופרון תהיהcAMPבליגנד-ה-

)שהיא תקינה(- תהיה התבטאות בנוכחות המשרן )לקטוז(,רק בבקרה השלילית תלויה, לכן, והעדר התבטאות ללא המשרן.

7 תרגיל מס. פתרון ביולוגיה מולקולרית,

יסנתז בטא-גלקטוזידאז בצורה קונסטיטוטיבית. 1אינו תורם כלל תוצר, בכל מצב. ה--I+O+Z יכול לסנתז בטא גלקטוזידאז, +Zרק

Z+ קונסטיטוטיבי בתא מבוקר ע"י אופרטור OCהנמצא בסמוך אליו )אופרטור פועל תמיד , רפרסור תקין בתא,מבטיח +Iאמנם ה- קונסטיטוטיבית. תהיה Zולכן ההתבטאות של בציס(

, כיוון שהאופרטור קונסטיטוטיבי. +Z אבל לרפסור אין השפעה על התבטאות ה-

2 .סימון הבארות בהסברים הבאים הוא תמיד משמאל לימין.

ניסוי התעתוק במבחנה )רנ"א פולימראז+ ואת הרנ"א פולימראז המלא ggz כל מבחנות הניסוי הכילו את הגן המבודד

(σהיחידה - ללא תוספות -בנוכחות רנ"א פולימראז מלא בלבד– מתקיים תעתוק: הרנ"א פולימראז1באר

המלא מספיק כדי לקבל תעתוק.- הוספת אוקטן למערכת– אינה משנה את רמת התעתוק.2באר למערכת- גורמת לירידה כמעט מוחלטת של התעתוק.GgmB- הוספת החלבון המווסת 3באר

של הגן )בקרה שלילית( רפרסור הוא GgmB מסקנה: החלבון יחד עם אוקטן למערכת –רמת התעתוק דומה לרמת התעתוק GgmB - הוספת החלבון4באר

, ומונע את פעולת הרפרסור. משרן מסקנה: האוקטן משמש כ(. 1ללא הרפרסור )באר

Gel Shift Assay )EMSA( –.בודק את יכולת הקישור בין חלבון לרצף דנ"א מסומן רדיואקטיבית. ) ggz promoter ) 200 bp כל מבחנות הניסוי הכילו את רצף ה- , כיוון שרק הוא מסומן. החלבונים אינםהדנ"א בלבדשימו לב, בתוצאות ניתן לגלות את

מסומנים. התקשרות חלבון לדנ"א תשפיע על מרחק הנדידה של הדנ"א.הפס התחתון בכל הבארות הוא הדנ"א החפשי, )ללא כל חלבונים קשורים(.

- נראה בתמונת הג'ל פס נוסף, שנודד לאט יותר- כבדGgmB- בהוספת החלבון המווסת 1באר נקשר לרצף הפרומוטור.GgmBיותר מהדנ"א החפשי: החלבון המווסת

יחד עם אוקטן - רואים רק דנ"א חפשי: אין קישור של החלבוןGgmB- בהוספת החלבון 2באר לפרומוטור. המסקנה: האוקטן שינה )=הוריד( את האפיניות של החלבון לפרומוטור.

- בהוספת רנ"א פולימראז מלא -ניתן לראות בתמונת הג'ל פס נוסף, הנודד לאט יותר. פס3באר : הרנ"א פולימראז נקשר לרצף הפרומוטור והוא חלבון גדול יותר1זה גבוה מהפס בבאר

.GgmB מהחלבון : האוקטן3- בהוספת אוקטן לרנ"א פולימראז המלא- מתקבלת תמונה זהה לזו שבבאר 4באר

אינו משפיע על יכולת הקישור של הרנ"א פולימראז לפרומוטור. לרנ"א פולימראז המלא- מתקבל פס נוסף גבוה מאלוGgmB- בהוספת החלבון 5באר

- הנדידה של הדנ"א איטית עוד יותר: הקומפלקס גדול יותר- מכאן ששני4 ו-3 , 1שבבארות נקשרו לדנ"א. )מהי המסקנה לגבי דרך פעילותGgmBהחלבונים, גם הרנ"א פולימראז וגם ה-

הרפרסור?( - בנוכחות שלושת המרכיבים, מרחק הנדידה של הפס מתאים לזה של דנ"א + רנ"א6באר

מהדנ"א. )מצב דומה לזהGgmB(, מכאן: האוקטן גרם ל"ירידת" ה-3פולימארז בלבד )באר .(1/2המתקבל בבארות

.-אפקט מאבד את האפיניות שלו לדנ"א GgmB בנוכחות האוקטן החלבון מהניסוי ניתן להסיק שאלוסטרי.

נסכם עכשיו את תוצאות שני הניסויים: )בקרה שלילית(. הוא נקשר לפרומוטור ומונע אתggz הוא רפרסור של הגן GgmBהחלבון

תעתוק הגן. האוקטן הוא משרן, האוקטן מגיב עם החלבון וגורם לירידת יכולת הקישור שלו לפרומוטור, ובכך מתאפשר תעתוק הגן )ע"י הרנ"א פולימראז, הנמצא, בכל מצב , קשור

לפרומוטור(.

פעילות האוקטן היא רק דרך החלבון המווסת, אין לו פעילות ישירה על הדנ"א או על הרנ"אפולימראז.

3. הגורמת לכך שאפילו בנוכחות משרן, הרפרסור נשאר קשור לדנ"א. אפשרותIמוטציה בגן א.

סבירה- שינוי מבני באתר הרפרסור הקושר בד"כ משרן )הרפרסור המוטנט אינו יכול לקשור.ISמוטציה זאת נקראת "סופר-רפרסור" ונהוג לסמנה כ- משרן(.

קשוריהיהסופר-רפרסור ה לרפרסור התקין.ומיננטיהרפרסור המוטנטי יהיה דניתן להניח שב. לא יתקבל מצב בו האופרטור יהיה "חפשי"ובכל מצב לדנ"א, גם בנוכחות רפרסור תקין בתא,

.מרפרסור ג. המוטציות בפרומוטור הן כאלה שהרנ"א פולימראז )תת יחידה סיגמא( אינו יכול להתקשר

לפרומוטור.

יעבור היברידיזציה עםlac operon( של ה-mRNAרנ''א-שליח ). 4(b-galactosidase )הגן המקודד לאנזים lacZהגן )חלק מהאופרטור של אופרון הלקטוז נמצא במורד הזרם של נקודת lac operatorה -

(mRNAתחילת התעתוק, כלומר באזור שמקודד לתחילת ה-

8 תרגיל מס. פתרון ביולוגיה מולקולרית,

הערות כלליות לפתרון התרגיל:

כדאי להוסיף את הגדיל(, 7, 6, , וכן גם שאלות 2, 1א. בשאלות הבאות )שאלות המשלים, ולצייר לעצמכם בשאלות הרלוונטיות את תוצרי החיתוך הדו-גדיליים.

(5)שאלה כיצד לקבוע מפת הגבלה?ב. כדאי להתחיל :

קביעת הגודל הכללי של המולקולה )סיכום הקטעים בכל שורה; הגודל צריך להיות זהה בכל השורות(

קביעת מספר אתרי ההגבלה )=החיתוך( של כל אנזים :)קביעת צורת המולקולה )מעגלית או קווית

1במולקולה קווית- מספר קטעי ההגבלה = מספר אתרי החיתוך + במולקולה מעגלית- מספר קטעי ההגבלה = מספר אתרי החיתוך

השוואת מספר אתרי ההגבלה/הקטעים המתקבלים ע"י חיתוך בכל אחד מהאנזימיםבנפרד והמספר המתקבל ע"י חיתוך בצרופי אנזימים יעזור בקביעת צורת המולקולה

1 . AAATTT

3קצה דביק הבולט בכוון ה-' . 2

3 .HindIIIאין רצף מתאים -

Sau96I -ברצף המקודד ל - Gly-Pro - GGNCCN..….......

AluI –.:יתכן וחותך, אך לא בהכרח : ,A בקודון לפרולין הוא 3..... אם בסיס ….Pro-Ala - CCNGCNברצף המקודד ל-

, יתקבל רצף ההכרה המתאים.T בקודון לאלנין הוא 3ובסיס

bp 500כ- . 4

5 . PstI אתרי 2 ו- BamHIאתרי 2א. ב.

6 . EcoRI- MfeIהקצוות המתאימים: א.

BglII- MboI ב. EcoRV- PvuIIג.

בשני הראשונים מתקבלים קצוות דביקים זהים, המתאימים לליגציה. ב-ג, מתקבלים קצוות קטומים )=חלקים(, קצוות חלקים ניתנים תמיד לליגציה זה עם

זה.

)כי גם MboIרק את צירוף ב ניתן לחתוך באנזימים המקוריים: ניתן תמיד לחתוך עם MboI נשאר(; במקרה וברצף המולקולה שנחתכה ע"י GATCלאחר הליגציה הרצף

.BglII- ניתן יהיה לחתוך את תוצר הליגציה גם ע"י C לאחר ה-Tמופיע

שני אנזימישימו לב שלמרות הרצף הזהה, מקום החיתוך של כל אחד מ. 7 שונה, ולכן הקצוות המתקבלים שונים ואינם משלימים זה, BmlI ו- NheIהרסטריקציה,

את זה.ניתן לקבל קצוות קטומים מקצוות דביקים, ע"י :

הנוקלאוטידים החסרים בגדיל השני4הפעלת דנ"א פולימראז להשלמת (. )מדוע?(BmlI ולא ל-ב )קצה NheI) )מתאים רק ל-א )קצה החתוך ב-

הפעלת אקזונוקלאזות מתאימות לחיתוך הקצה הדביק : שימוש באדפטור מתאיםCTAGGATC

B BP P

410

2 35

9 תרגיל מס. פתרון ביולוגיה מולקולרית,

.. א1

ב. הקטעים המכילים רצפים משובטים )של דנ"א העכבר(

א. 2

E

E

B

B

3.5

2.53.0

4.0

B

1.0

BamHI

EcoRI

EcoRI

SalI0.5 Kb

0.5 Kb

2.5 Kb

1.5 Kb

ב. הפסים שיראו בהיברידיזציה מסומנים במעוין כחול מעל הפס. כל הפסים ( יראוEcoRI בין שני אתרי ה-Kb 2 - המכילים רצף של דנ"א הזבוב )מקטע ה

בהיברידיזציה.

שובטEcoRIהשיבוט נעשה באתר רסטריקציה יחיד- מקטע דנ"א בעל קצוות של ג. ,בשני הכיוונים(, לכן המקטע יכול היה להכנס EcoRIבפלסמיד בעל קצוות זהים )של

יהיה קרוב SalIלכן תתכן מפת רסטריקציה נוספת בה המחדר נכנס הפוך )אתר ה-ממנו. KB 1, במרחק BamHIיותר לאתר ה-

3 . cornנשא התבטאות של צמחים מכיל מוצא הכפלה צמחי )מסומן בפלסמיד כ- א.

ori( ופרומוטור צמחי, ואלה לא יתאימו כמובן לתאי חיידקים )כלומר, לא יוכרו ע"י מערכות ההכפלה והתעתוק של חיידקים(, כמו כן, כדי לקבל תרגום, צריך להוסיף

מתאיםselection)גם רצף קושר ריבוזום הנמצא רק בחיידקים. גם הגן הבורר )לצמחים וצריך להחליפו בגן בורר המתאים לחיידקים.

(, לחתוך משני צידיXbaI בשלמותו )ולכן לא ניתן להשתמש ב-Rב. יש להוציא את הגן הגן ולהשתמש באנזימים שישמרו על כיוון ההחדרה, כך שהגן יכנס בכיוון הנכון ביחס

לפרומוטור. כיוון שקל יותר לאחות קצוות דביקים- המתאים ביותר הוא צירוף האנזימיםClaI+EcoRI גם הצירופים .ClaI+PvuII -ו SmaI+EcoRI יעבדו. לעומת זאת הצירוף SmaI+PvuIIאינו מתאים, כיוון שנקבל קצוות קטומים בשני האנזימים, ולכן לא נשלוט

בכיוון כניסת הגן לפלסמיד.

גן בורר זה דרוש כיוון שיעילות הטרנספורמציה )=קליטת הדנ"א ע"י התאים( נמוכה . 4