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En este capítulo se procede a la discusión de los resultados presentados en el
capitulo anterior.
5.1 La naturaleza de las interacciones ππππ-catión
Las interacciones con iones son claves para la funcionalidad de los nucleótidos y de
los ácidos nucleicos. En muchos casos estas interacciones involucran contactos salinos
con los fosfatos, pero son cada vez más los sistemas en los que se describen
interacciones de iones con las nucleobases1. En este tipo de interacción el ión ejerce una
marcada influencia sobre la distribución electrónica del heterociclo. Especialmente
importantes son las interacciones ión-heterociclo fuera del plano (la denominada
interacción π-catión) en numerosos procesos, tales como reconocimiento ligando-
receptor, reconocimiento ADN-proteína, canales, etc. Los estudios realizados en el
apartado 4.1 proporcionan una nueva visión de estas importantes interacciones.
En el apartado 4.1.1 se ha explorado la importancia de los efectos de polarización,
catión ! sistema aromático, en las interacciones π-catión. Los perfiles energéticos de la
interacción π-catión (simulados por un ión Na+ y benceno) a diferentes distancias y en
diferentes orientaciones han proporcionado un nuevo enfoque de la naturaleza de estas
interacciones. A cortas distancias el término repulsivo domina la interacción, mientras
que el término electrostático es el que domina a largas distancias. A distancias
intermedias (próximas al hard sphere radius), la magnitud del término electrostático y
del término de polarización, en general, es similar. El término electrostático es positivo
para las orientaciones en el plano, a diferencia de la orientación perpendicular al plano,
donde es negativo y grande. El término de polarización es siempre negativo. Cuando el
ión Na+ se aproxima en el plano aromático, el término de polarización es más grande
que el electrostático. La existencia de mínimos energéticos demuestra que la
polarización aromática estabiliza las aproximaciones en el plano a pesar de la fuerte
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repulsión electrostática. La aproximación del Na+ perpendicular al plano está
claramente favorecida por el término electrostático, aunque sólo a cortas distancias este
término es mayor que el término de polarización. Resumiendo, la polarización favorece
la aproximación en el plano de los cationes, pero las pequeñas diferencias respecto a la
orientación del eje z no pueden revertir la preferencia electrostática por la orientación
perpendicular.
Siguiendo el estudio realizado por Dougherty y colaboradores2,3, se examina la
contribución de la polarización en la interacción del Na+ con una serie de 16
compuestos aromáticos a una distancia fija de 2.47 Å. Los resultados muestran la
importancia de la polarización, que en general es similar al término electrostático e
incluso en algunos casos mayor. La energía de polarización se encuentra relacionada
con el tamaño del sistema aromático. Así, los anillos más grandes proporcionan valores
mayores de polarización, siendo aproximadamente de -9.5, -10.5 y -15.0 kcal/mol para
anillos aromáticos de 5, 6 y 10 miembros, respectivamente. En cambio, la energía de
polarización prácticamente no varía con la naturaleza de los sustituyentes, como se se
aprecia en el benceno y sus derivados sustituidos, donde oscila alrededor de las -10.5
kcal/mol, a diferencia de la energía electrostática que varía marcadamente con la
naturaleza de los sustituyentes, tal y como mencionaba Dougherty y colaboradores2,3. De
acuerdo con estos resultados, la naturaleza de la interacción π-catión tiene una gran
componente debida a los efectos de la polarización. Aún así, aunque un modelo
puramente electrostático no sea capaz de reproducir exactamente este tipo de
interacciones, puede proporcionar buenos valores relativos para una serie de
compuestos con un núcleo aromático común, en concordancia a los resultados obtenidos
previamente2.
El estudio realizado ha permitido explorar la utilidad de la metodología GMIPp4
como alternativa al MEP para describir interacciones π-catión. Para analizar la
confianza del modelo puramente electrostático en sistemas de distinto tamaño, se ha
examinado la correlación entre los valores MEP y los SCF. Los resultados muestran que
dicho modelo funciona bien, aunque peor que cuando se aplica sólo a los derivados del
benceno. Así, el modelo explica el 93% de la varianza de los resultados, con una
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ordenada en el origen de –11.6 kcal/mol y una pendiente de 1.08. Sin embargo, existen
algunas discrepancias entre los valores MEP y SCF, que pueden ser explicados por las
contribuciones de la polarización. Así, los resultados obtenidos ponen de manifiesto la
superioridad del modelo GMIPp, que reproduce el 99% de la varianza de los resultados
SCF, con una ordenada en el origen de –5 kcal/mol y una pendiente de 0.98. El valor de
la ordenada en el origen probablemente refleja el error de superposición de base (BSSE),
que no ha fue corregido en los valores SCF siguiendo las sugerencias de Dougherty2,3,
así como la incertidumbre en la evaluación clásica de efectos de dispersión-repulsión y
los efectos de transferencia de carga (0.05 electrones se transfieren según un análisis de
Bader5). Recapitulando, la mejora del modelo GMIPp respecto al modelo MEP ha
quedado demostrada con un incremento en la capacidad de descripción de la interacción
π-catión, y una reducción en la desviación de la pendiente respecto al valor ideal y en la
ordenada en el origen. Además, el GMIPp corrige todas las limitaciones que presentaba
el MEP cuando se aplicaba a compuestos derivados de núcleos aromáticos diferentes.
Desde un punto de vista computacional, el GMIPp sólo requiere un limitado
incremento de tiempo de cálculo comparado con el MEP, porque no es necesario
recalcular la función de onda y la energía de polarización se evalúa utilizando las
mismas integrales monoelectrónicas involucradas en el cálculo del MEP. Además, el
GMIPp está basado en un tratamiento perturbacional, el cual proporciona una partición
de la energía de interacción en componentes intuitivas, sin la incertidumbre derivada del
error de superposición de base. Todos estos resultados sugieren que el GMIPp es una
alternativa poderosa, precisa y rápida para el análisis cuantitativo de las interacciones π-
catión.
En el apartado 4.1.2 se han examinado las principales características de la
interacción π-catión en términos de las propiedades topológicas de la densidad de carga
electrónica, utilizando la teoría de Bader Atoms in Molecules6,7.
La exploración de los puntos críticos para la interacción de benceno con Na+ revela
la existencia de 6 puntos críticos (3,-1), que se encuentra simétricamente distribuidos y
conectan el catión con los 6 átomos de carbono. El camino de enlace sigue muy de cerca
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la línea geométrica que va del átomo de carbono al ión Na+, puesto que la diferencia
entre la longitud del camino de enlace y la distancia interatómica es inferior a 0.01 Å.
También hay 6 puntos críticos de anillo (3,+1), cada uno localizado a lo largo de la línea
que conecta el catión Na+ con la mitad del enlace C-C, separando cada par de puntos
críticos de enlace (3,-1). Existen pequeñas diferencias entre los valores de la densidad
electrónica en los puntos críticos alternados de enlaces y de anillo. Finalmente, la
interacción esta caracterizada por la existencia de un punto crítico de celda (3,+3)
localizado a lo largo de la línea que conecta el ión Na+ con el centro del anillo.
El patrón de puntos críticos que aparece en la complejación del ión Na+ con el
benceno se ve drásticamente alterado por la introducción de sustituyentes. La diversidad
en la distribución de los puntos críticos refleja la influencia del número y de la
naturaleza de los sustituyentes en la densidad electrónica del anillo de benceno. Así, la
aparición de puntos críticos de enlace en posición para al sustituyente en
fluorobenceno, anilina y fenol, y un punto crítico de anillo próximo al carbono
sustituido, refleja el balance combinado del efecto electroatrayente y resonante de estos
sustituyentes. Asimismo, el patrón encontrado en los derivados mono-, di- y trifluorados
manifiestan el efecto electroatrayente del átomo de flúor. La distribución topológica de
la piridina puede comprenderse en base al efecto desactivante del nitrógeno, que
conduce el punto crítico de enlace próximo a C3 y C5 y el punto crítico de anillo
próximo al N y al C4. Similarmente, la localización de los puntos críticos de enlace en
el naftaleno parece reflejar la tendencia a mantener la resonancia en el anillo de 6
miembros, mientras que el punto crítico (3,-1) en el indol se forma próximo al átomo de
carbono en para al carbono que está unido al nitrógeno.
La influencia de los sustituyentes también se muestra en los valores de la densidad
electrónica en los puntos críticos de enlace y de anillo, que exhiben diferencias notables
respecto a los encontrados en el complejo benceno-Na+. Para profundizar en el estudio
del papel que desempeñan los sustituyentes en el patrón de puntos críticos de enlace, se
han examinado diversas propiedades como la laplaciana de densidad de carga6,7, la
elipticidad de los enlaces C-H, o la concentración de carga8 sobre cada átomo. Si bien
algunas de dichas propiedades han sido empleadas para discutir los efectos activadores-
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desactivadores de sustituyentes en sustituciones aromática electrófilas8, no se observó
ninguna relación directa con la distribución del camino de enlace.
De acuerdo con los estudios realizados sobre otras interacciones intermoleculares9,10,
se ha estudiado la relación entre las propiedades de los puntos críticos y las
características geométricas y energéticas de los complejos. La única característica
común en todos los complejos es la existencia de los puntos críticos de celda (3,+3). La
comparación de la energía de interacción y de las distancias de equilibrio con las
propiedades del punto crítico (3,+3) revelan una serie de tendencias interesantes.
Concretamente, hay una marcada correlación entre la densidad de carga en el punto
crítico (3,+3) con la energía de interacción (r=0.98), así como con la distancia de
equilibrio del anillo al catión Na+ (r=0.99). Finalmente, también hay fuertes
correlaciones entre la energía de interacción (r=0.94) y la distancia de equilibrio
(r=0.98) con la laplaciana de la densidad electrónica en el punto crítico (3,+3). Como ya
se mencionaba en estudios previos11,12, estas relaciones permiten la generalización del
concepto de orden de enlace usado en otros complejos a las interacciones π-Na+.
Se han examinado las características topológicas de la densidad electrónica para la
interacción del Na+ con anillos de 5 miembros. El número y la naturaleza de los puntos
críticos varían considerablemente entre los diferentes complejos. En contraste con la
topología encontrada para los complejos con anillos de 6 miembros, que todos
presentaban un punto crítico de celda, este tipo de punto crítico tan sólo aparece en
furano, imidazol e indol. De nuevo, la naturaleza del heteroátomo y de los anillos
fusionados modula el patrón topológico en los complejos que involucran anillos de
cinco miembros, tal como se manifiesta en las grandes diferencias resultantes de
reemplazar el grupo -NH- del pirrol por el átomo de oxígeno en el furano. Este hecho
refleja la influencia de los efectos resonantes y electroatrayentes. También es
remarcable el efecto del anillo de 6 miembros en el indol, que hace que el punto crítico
de enlace aparezca en la posición que refuerza la conjugación del par de electrones del
nitrógeno con el anillo de benceno fusionado, comparado con los dos puntos críticos de
enlace simétricos en el pirrol. Asimismo, las diferencias observadas entre indol y
azuleno sugieren que los efectos resonantes están más presentes en el primer
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compuesto. De hecho, se conoce que el enlace compartido por los dos anillos en el
azuleno es significativamente más largo que el resto de los enlaces C=C, indicando un
carácter parcial de enlace simple13.
La falta de características topológicas comunes impide establecer relaciones
similares a las examinadas anteriormente para los anillos de 6 miembros. En este
sentido, los anillos de 5 miembros parecen presentar mayor dificultad para acomodar los
cambios en la densidad electrónica suscitados por heteroátomos y sustituyentes, en
contra de lo que se observa en anillos de 6 miembros, tal y como sugiere un estudio
topológico previo de azinas14.
En el último punto se han examinado las características de la interacción π-catión en
complejos con otros cationes, así como con el átomo de hidrógeno de dos moléculas
neutras dadoras de puente de hidrógeno. El patrón topológico de los puntos críticos de
la interacción del benceno con el Na+ es reproducido en todos lo casos, con la única
excepción de la interacción con el H+, donde no se ha detectado ningún punto crítico de
celda. Tampoco se ha encontrado ningún punto crítico de anillo en el plano molecular
del benceno en el complejo benceno-H+, requisito necesario para satisfacer la relación
de Hopf-Poincaré. De hecho, cuando se examina el perfil de la densidad electrónica a lo
largo de la línea que pasa a través del centro del anillo de benceno desde H+, se observa
que la densidad electrónica decrece gradualmente desde el valor máximo, que se da en
la posición del H+.
La inspección de los resultados muestran que, aparte del complejo benceno-H+, hay
una relación entre la energía de interacción y la densidad electrónica en el punto crítico
de celda (3,+3) (r=0.94). Como todos los complejos exhiben el mismo patrón
topológico, el análisis puede extenderse a los puntos críticos de enlace (3,-1). Así,
también se observa una fuerte correlación entre la energía de interacción y la densidad
electrónica en el punto crítico (3,-1) (r=0.96). Además, dicha correlación también
aparece cuando se considera la densidad electrónica en los puntos críticos (3,-1)
localizados en los enlaces C-C del anillo bencénico (r=0.99). Resultados similares se
han obtenido a partir de la laplaciana de densidad electrónica. Es destacable la
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relevancia de dichas relaciones, pues cubren una variación de 2 ordenes de magnitud en
la energía de interacción y permiten el tratamiento simultáneo de la interacción con
cationes y moléculas neutras. La influencia del compuesto interaccionante (catión o
molécula neutra) sobre la densidad electrónica puede seguirse con la elipticidad de la
densidad electrónica en los puntos críticos (3,-1) de los enlaces C-C del anillo
bencénico. De nuevo, con la excepción del complejo benceno-H+, hay una clara relación
entre la energía de interacción y la deformación de la densidad electrónica inducida por
la molécula interaccionante (r=0.99).
Los resultados obtenidos muestran la generalización de las propiedades topológicas
de la densidad electrónica en los complejos π-catión de 6 miembros para cationes e
incluso moléculas neutras. Como se menciona anteriormente, la única excepción es la
interacción del benceno con H+, lo que evidencia la naturaleza específica del protón,
cuya interacción tiene un importante componente de transferencia de carga (entorno a
0.4 electrones comparados con los 0.05 electrones del Na+).
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5.2 La naturaleza de los puentes de hidrógeno impropios
Los puentes de hidrógeno influyen decisivamente en la estructura tridimensional y
función de las biomacromoléculas. Recientemente, se ha sugerido un nuevo tipo de
interacción intermolecular, denominada puente de hidrógeno impropio o blue-shifting,
fenomenológicamente opuestos a los puentes de hidrógeno convencionales15. Los
estudios realizados en el apartado 4.2 proporcionan información sobre la naturaleza de
este nuevo tipo de interacciones.
En el apartado 4.2.1 se ha examinado la naturaleza de las interacciones C-H···π de
una serie de complejos representativos tanto del carácter de puente de hidrógeno normal
como del carácter de puente de hidrógeno impropio, empleando la teoría AIM6,7. Los
resultados muestran una variación en la longitud del enlace C-H (que apunta hacia el
centro del anillo), asociado a un desplazamiento en su frecuencia de vibración. En
contraste con el comportamiento exhibido por los complejos de puentes de hidrógeno
convencionales, se encuentran otros complejos con características inversas
(acortamiento de la longitud de enlace C-H, y desplazamiento de la frecuencia de
vibración al azul) proporcionando las bases para el concepto de puente de hidrógeno
impropio16. Los cálculos energéticos indican que la estabilización de los complejos con
puentes de hidrógeno impropios está dominada por el término de dispersión a diferencia
de los puentes de hidrógeno convencionales, en los que predomina el término
electrostático.
En las estructuras de mínima energía de los complejos benceno-CH4 y benceno-HF,
el enlace C-H (F-H) se encuentra apuntando hacia un átomo de carbono del anillo,
formando un ángulo de ~15º con la línea que pasa por el centro del anillo. La geometría
del benceno-HF difiere de la estructura de mínima energía relatada en estudios previos 17,18, si bien la diferencia energética entre estas estructuras es muy pequeña, lo cual
indica que la superficie de energía es muy plana. A pesar de la diferente disposición
geométrica de los complejos, los cambios en la longitud de enlace y en la frecuencia de
vibración reflejan las tendencias mencionadas anteriormente.
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Para completar el estudio de los puentes de hidrógeno impropios se ha realizado un
análisis exhaustivo de las características electrónicas de los complejos siguiendo la
metodología de Popelier9,10.
Propiedades topológicas:
(1) Topología de la densidad electrónica. La primera condición para la existencia de
un puente de hidrógeno es la identificación de un punto crítico de enlace (3,-1) entre
el átomo de hidrógeno y el aceptor asociado con un camino de enlace que unen los
correspondientes átomos. En los complejos C-H···benceno, el aceptor es el conjunto
de átomos atrayentes formados por los carbonos del anillo de benceno, y la
formación del puente de hidrógeno se ve reflejada en la aparición de 6 puntos
críticos (3,-1) uniendo el átomo de hidrógeno con cada uno de estos átomo de
carbono18. Además, una característica común a todos los complejos es la aparición
de 6 puntos críticos de anillo (3,+1), que se encuentran entre cada par de puntos
críticos de enlace, y de un punto crítico de celda (3,+3). El patrón topológico de la
interacción C-H···π también ha sido descrito en complejos que involucran la
interacción de cationes con el benceno. (Véase el apartado 4.1.2)
El complejo entre cloroformo y fluorobenceno es peculiar porque sólo presenta
un punto crítico (3,-1), y el correspondiente camino de enlace conecta el átomo de
hidrógeno del cloroformo con el carbono en posición para del fluorobenceno. Esta
interacción también se caracteriza por la aparición de un punto crítico de anillo
próximo a C1 y por un punto crítico de celda sobre el centro del anillo aromático.
Esta reordenación topológica también ha sido encontrada en el complejo de
fluorobenceno con el catión Na+ (véase el apartado 4.1.2) y refleja la influencia del
átomo de flúor sobre la densidad electrónica del anillo de benceno. Esto sugiere que
la superficie del punto crítico de anillo se extiende del camino de enlace del C-H en
para alrededor de todo el anillo, y como resultado, la topología de la densidad
electrónica exhibe un punto crítico de celda en el complejo.
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Las estructuras óptimas para los complejos de benceno con CH4 y HF también
exhiben un patrón diferente. En estos casos, un único camino de enlace une el átomo
de hidrógeno con el carbono al cual apunta el enlace C-H (F-H). Además, el
complejo benceno-CH4 también exhibe un punto crítico de anillo y un punto crítico
de celda con una reorganización parecida a la encontrada en el complejo
fluorobenceno-cloroformo. De nuevo, ambas topologías satisfacen la relación de
Hopf-Poincaré. Así, a pesar de que la diferencia de energía entre las geometrías
optimizadas y aquellas que tienen el grupo C-H (F-H) apuntando hacia el centro del
anillo es muy pequeña, hay importantes diferencias topológicas.
(2) Densidad de carga en el punto crítico de enlace. La densidad electrónica en los
puntos críticos de enlace se encuentra en el rango 0.002-0.034 ua característico de
este tipo de interacciones9,10. La comparación de los valores de la densidad en los
puntos críticos (3,-1) con las energías de interacción de los complejos muestra la
existencia de una relación lineal (r=0.91), tal como se ha observado en otros
complejos11,12,19. Dada la existencia de un patrón topológico común, la misma
comparación puede realizarse considerando la densidad en los puntos críticos (3,+1)
y (3,+3). Concretamente, la relación con la densidad en el punto crítico de celda
(r=0.92) concuerda con resultados similares obtenidos para los complejos π-catión
(véase el apartado 4.1.2). Estas relaciones permiten generalizar los conceptos de
orden de enlace descritos para otros tipos de interacciones relacionadas11,12,19.
(3) Laplaciana de la densidad de carga. El valor de la laplaciana de la densidad
electrónica para los puntos críticos (3,-1) en los puentes de hidrógeno es positivo, lo
cual indica una disminución de la densidad electrónica desde la superficie
interatómica hacia los núcleos interaccionantes. Esta característica se encuentra en
todos los complejos y los valores para los puntos críticos de enlace son similares al
rango de valores típicos para las interacciones de puente de hidrógeno9,10. Otra
característica de la laplaciana es la elevada elipticidad de los puntos críticos (3,-1)
formados en la complejación. Ello indica una inestabilidad estructural, también
revelada por la proximidad entre los puntos críticos de enlace y de anillo.
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Finalmente, cabe destacar la relación entre la energía de interacción y la laplaciana
de la densidad electrónica en los puntos críticos de enlace y de celda.
(4) Penetración mutua del hidrógeno y átomos aceptores. La penetración mutua
puede ser determinada por la comparación de los radios (r0) de los átomos de
hidrógeno del dador y de los aceptores no enlazados con los correspondientes radios
(r) en el complejo enlazado. El valor r0 se ha estimado como la distancia desde el
núcleo a un determinado isocontorno de densidad de carga (normalmente se toma
0.001 ua) en la dirección del puente de hidrógeno, mientras que el radio de enlace se
determina en base a la distancia del núcleo al punto crítico de enlace formado en la
complejación. La penetración se define como la diferencia dichos radios (∆r = r0 –
r). En todos los casos las penetraciones son positivas y los átomos de carbono del
anillo bencénico están más penetrados que el átomo de hidrógeno, de acuerdo con
estudios previos de sistemas relacionados20,21.
Propiedades atómicas integradas:
(5) Aumento de la carga neta del átomo de hidrógeno. Los resultados indican que la
formación del complejo desapantalla el átomo de hidrógeno. En todos los casos, hay
una transferencia de carga del anillo aromático a la molécula dadora del protón.
(6) Desestabilización energética del átomo de hidrógeno. Los resultados muestran
un cambio positivo en la energía en todos los casos, concordando con la
desestabilización observada en otras interacciones de puente de hidrógeno9,10,20,21.
(7) Disminución de la polarización dipolar del átomo de hidrógeno. Los resultados
muestran una reducción del primer momento, cuya magnitud es comparable a la
observada en diferentes complejos de puente de hidrógeno9,10.
(8) Disminución del volumen atómico del átomo de hidrógeno. La inspección de los
resultados indica que el volumen del átomo de hidrógeno disminuye al formarse el
complejo. El cambio experimentado por el átomo de hidrógeno es sensiblemente
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mayor que las variaciones observadas en el resto de átomos dentro de la molécula,
conduciendo a una reducción neta del volumen molecular en todos los casos.
Estos resultados indican que el átomo de hidrógeno involucrado en los puentes de
hidrógeno exhibe características topológicas y de propiedades integradas análogas a las
encontradas en puentes de hidrógeno convencionales. Asimismo, sugieren que el
fenómeno del puente de hidrógeno impropio proviene de la redistribución de densidad
electrónica en el enlace C-H inducida por la complejación.
Se han determinado las propiedades del punto crítico (3,-1) asociadas al enlace C-H
de la molécula dadora de puente de hidrógeno en los monómeros y en los complejos.
Como resultado de la complejación, la distancia entre el punto crítico (3,-1) (BCP) y el
carbono aumenta y la separación del punto crítico al hidrógeno decrece. La magnitud de
ambos efectos es bastante comparable. Sin embargo, la magnitud relativa de ambos
efectos es diferente en aquellos compuestos que exhiben comportamiento de puente de
hidrógeno impropio con respecto de aquellos complejos convencionales. Así, el
acortamiento de la distancia BCP-H es mayor que la elongación de la distancia C-BCP
en los complejos con puente de hidrógeno impropio, conduciendo a una reducción neta
de la distancia de enlace. La tendencia inversa se observa en los complejos con puente
de hidrógeno normal, siendo el efecto neto de incremento de la longitud de enlace.
La densidad electrónica en el punto crítico (3,-1) es sensiblemente mayor que el
valor obtenido para los puntos críticos (3,-1) intermoleculares. La densidad electrónica
en el punto crítico de enlace aumenta tras la complejación en todos lo casos, menos para
el HF donde la densidad electrónica en el punto crítico (3,-1) es más baja en el complejo
que en el monómero. Este efecto también se encuentra en las estructuras optimizadas de
los complejos de benceno con CH4 y HF: mientras la densidad electrónica en el punto
crítico (3,-1) del enlace C-H en el complejo con CH4 aumenta, disminuye en el enlace
F-H. Este cambio de la densidad electrónica en el punto crítico de enlace se extiende
sobre una amplia región alrededor del punto crítico de enlace. Los mayores cambios se
encuentran en el complejo cloroformo-fluorobenceno, donde la densidad electrónica en
el punto crítico de enlace aumenta, y en el HF, donde ésta se reduce. Además, hay una
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variación gradual de la densidad electrónica en el BCP para los complejos de benceno
con diferentes átomos de carbono dadores de protones.
Puesto que la densidad electrónica en el punto crítico de enlace proporciona una
medida de orden de enlace9-12,19,20, se puede asumir que el cambio en la densidad
electrónica en el punto crítico (3,-1) tras la complejación da una medida de la variación
de la fuerza del enlace. Según esto, dicho cambio debería reflejar, al menos
cualitativamente, los desplazamientos en la longitud del enlace y en la frecuencia de
vibración para una serie de sistemas químicos relacionados. Esto se observa para los
complejos examinados a partir de las correlaciones significativas entre el cambio en la
densidad electrónica en el punto crítico (3,-1) del enlace C-H y la correspondientes
variaciones en la longitud de enlace (r=0.99) y de sus frecuencias (r=0.94).
En conjunto, pues, la inspección del conjunto de propiedades topológicas empleado
para caracterizar los puentes de hidrógeno convencionales según los criterios de
Popelier no muestra diferencias relevantes para una serie de complejos H···π, siendo
insuficientes para distinguir entre un puente de hidrógeno normal y un puente de
hidrógeno impropio. El análisis de los resultados sugiere que las características
específicas de los puentes de hidrógeno impropios se originan por una sutil
redistribución de la densidad electrónica del enlace covalente C-H tras la complejación,
lo cual evidencia la diferente respuesta –dispersión versus electrostático- del monómero
que interacciona para estabilizar el complejo.
En el apartado 4.2.2 se ha realizado el análisis topológico de la densidad electrónica
para examinar la naturaleza de los puentes de hidrógeno que se establecen entre los
dímeros adenina·uracilo y uracilo·uracilo.
La formación del complejo A·U(WC) conlleva la aparición de 5 puntos críticos. Hay
3 puntos críticos (3,-1) uniendo los átomos H6(A)·O4(U), N1(A)·H3(U) y
H2(A)·O2(U), y otros 2 puntos críticos (3,+1) que aparecen entre los puntos críticos de
enlace. La densidad electrónica en los puntos críticos de enlace (3,-1) varía dentro del
rango determinado para complejos similares que interaccionan por puentes de hidrógeno
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9,10. El valor de la interacción H2·O2 es ligeramente menor al de las interacciones H6·O4
y N1·H3, lo cual concuerda con las diferencias en las distancias geométricas. Los
resultados indican una penetración mutua de los átomos que interaccionan, que es más
importante en los contactos H6·O4 y N1·H3, y claramente menor en H2·O2. De acuerdo
con los criterios de Popelier10,22, los átomos de hidrógeno involucrados en los puentes de
hidrógeno exhiben cambios similares en determinadas propiedades atómicas integradas:
(i) un incremento en la carga neta, (ii) una disminución del valor absoluto de la energía
atómica, (iii) una reducción en el primer momento y (iv) una disminución del volumen
atómico. Para los enlaces N-H estos cambios son notables, pero para el enlace C-H son
claramente menos marcados. Por otra parte, la dimerización decrece la densidad
electrónica en el punto crítico intramolecular (3,-1) de los enlaces N6-H y N3-H, como
ocurre en los puentes de hidrógeno convencionales. Sin embargo, la densidad
electrónica en el enlace C2-H se mantiene prácticamente inalterada.
La formación de los dos dímeros de uracilo conlleva la aparición de 3 puntos
críticos. Hay 2 puntos críticos de enlace (3,-1) entre los átomos O4·H1 y H5·O2 en
U·U(7), O4·H3 y H5·O4 en U·U(C), y otro punto crítico de anillo (3,+1) localizado
entre los 2 puntos críticos (3,-1) intermoleculares. Las propiedades topológicas de la
densidad electrónica en los puntos críticos (3,-1) en ambos dímeros es muy similar, a
pesar de la diferente energía de estabilización de los complejos. La densidad electrónica
en los puntos críticos (3,-1) y la penetración mutua para los dímeros U.U es mayor que
los valores encontrados para H6·O4 y H2·O2 en el par A·U(WC). De nuevo, los
cambios en las propiedades atómicas integradas de los átomos de hidrógeno
involucrados siguen las tendencias apuntadas por Popelier10,22. Sin embargo, dichos
cambios son sensiblemente mayores a los encontrados para el átomo de hidrógeno en el
enlace C-H del dímero A·U. La inspección de los resultados muestra la existencia de
una relación lineal entre la distancia interatómica H···X y el logaritmo de la densidad
electrónica (r=0.99), que concuerda con los resultados obtenidos en complejos
similares9,11,12,19,23,24. (Véase el apartado 4.1.2 y 4.2.1)
La densidad electrónica del enlace N-H de los dímeros U·U se reduce, y la del
enlace C-H se incrementa por efecto de la dimerización. Estos cambios vuelven a ser
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mayores que las correspondientes variaciones observadas en los enlaces N-H y C-H del
par A·U. En el enlace N-H, hay una pérdida de densidad electrónica en el punto crítico
de enlace al formarse el dímero, y ésta se hace mayor a medida que la distancia
interatómica disminuye. Este efecto decrece en el orden: N3-H (A·U) > N1-H (U·U 7) >
N3-H (U·U C) > N6-H (A·U). Cuanto mayor es la pérdida de densidad electrónica, más
grandes son los cambios en la distancia de enlace y el desplazamiento de la frecuencia
hacia el rojo. En los enlaces C-H hay un ligero incremento de la densidad electrónica al
formarse el dímero, siendo mayor a medida que la distancia interatómica disminuye.
Este efecto decrece en el orden: C5-H (U·U 7) > C5-H (U·U 7) > C2-H (A·U). El
comportamiento diferenciado entre los enlaces N-H y C-H refleja probablemente la
diferente naturaleza de las fuerzas estabilizadoras en los contactos intermoleculares
establecidos. En el primero es de esperar que sea dominado por el componente
electrostático, mientras que en el segundo la dispersión es más importante.
El análisis topológico ha permitido confirmar la naturaleza de los contactos
intermoleculares, corroborando los resultados obtenidos en el análisis vibracional.
Todos los contactos entre los pares de base A·U y U·U son puentes de hidrógeno
convencionales siguiendo las tendencias apuntadas por Popelier, con la única excepción
del contacto C2-H···O2 en el par A·U, donde los resultados sugieren que no participa en
la interacción por puente de hidrógeno.
5 Discusión de resultados
- 284 -
5.3 El efecto de las bases modificadas
En los últimos años ha habido un creciente interés por la química de los ácidos
nucleicos y de sus análogos modificados25,26 debido a sus potenciales aplicaciones
biológicas y biotecnológicas. Recientemente, el uso de bases modificadas ha permitido
profundizar en la importancia de los puentes de hidrógeno sobre la estabilidad de los
ácidos nucleicos. Por un lado, una estrategia útil para medir la estabilidad es la
comparación de pares de bases con dobles y triples enlaces de puente de hidrógeno27.
Sin embargo, no hay que olvidar que el contexto estructural influye fuertemente en las
interacciones no covalentes, como son los puentes de hidrógeno28. Por otro lado, una
estrategia alternativa para medir la importancia de los puentes de hidrógeno proviene de
estudios recientes con bases de ADN no polares que mimetizan la forma de las bases
naturales29. Los estudios realizados en el apartado 4.3 proporcionan información sobre
el efecto de las bases modificadas en las propiedades del ADN y sobre la importancia de
los puentes de hidrógeno en su estabilidad.
En el apartado 4.3.1 se han examinado los cambios en la estructura, la reactividad y
la estabilidad de dúplexes y tríplexes de ADN cuando inosina (I) es mutada a guanosina
(G) y 8-aminoinosina (8AI), es decir, el efecto de introducir grupos amino dadores de
puentes de hidrógeno.
Las simulaciones de MD de los dúplexes y tríplexes proporcionan trayectorias
estables, independientemente de la naturaleza del nucleótido en posición X= G, I ó 8AI.
Los análisis estructurales indican que las estructuras encontradas para cada familia son
muy similares entre sí y muestrean regiones típicas del espacio configuracional de tipo
B30-32. No se observan movimientos de respiración ni disrupciones en las hélices,
apoyando la estabilidad de la estructura helicoidal a lo largo de las trayectorias (véase el
apartado 4.3.2). Estos resultados sugieren que el ADN es suficientemente flexible para
acomodar posibles distorsiones locales procedentes de la presencia del grupo 8-amino.
Cabe destacar la estabilidad de las estructuras de triple hélice que contienen 2 pasos
(G·C-C+) contiguos. En estudios previos se sugería que la presencia de 3 pasos (G·C-C+)
5 Discusión de resultados
- 285 -
contiguos desestabilizaba el tríplex31. Las simulaciones presentes sugieren que dos de
ellos no afectan la integridad del tríplex, en concordancia con resultados de RMN33,34.
Parece pues, que la transición de 2 a 3 pasos (G·C-C+) es la causante de la
desestabilización del tríplex.
Los mapas de potencial de interacción molecular clásico (MIP) y de solvatación de
los dúplexes son los típicos de un B-ADN30,35. Las regiones reactivas se localizan en el
surco menor del ADN definiendo claramente la espina de hidratación. Como era de
esperar, la región con mayor potencial electronegativo y mayor solvatación está
parcialmente rota en las proximidades de los pares (G·C). Cuando G es substituido por I
o 8AI, el MIP en la región de la mutación es más negativo y la solvatación aumenta.
Estos resultados apoyan la hipótesis que el grupo amino en la posición 2 de la guanina
es responsable de la debilidad de la espina de hidratación en las proximidades de los
pasos (G·C) en los dúplexes de ADN. Los análisis de MIP y solvatación de los tríplexes
muestran claramente dos regiones capaces de interaccionar con pequeñas moléculas
polares, que son el surco menor (en el plano de las purinas) y la parte menor del surco
mayor (entre planos de tríadas). La presencia de un grupo amino en el surco menor del
tríplex disminuye ligeramente la capacidad de este surco para interaccionar con
pequeños solutos polares. Sin embargo, un grupo amino en la parte menor del surco
mayor no conduce a ninguna alteración detectable en los mapas de MIP y solvatación,
sugiriendo que el entorno de aguas en el surco menor-mayor no está muy alterado. Esto
puede ser entendido considerando que las regiones de mayor MIP negativo y de
solvatación preferencial en este surco no se encuentran localizadas en el mismo plano
de las purinas.
Se han determinado los cambios en la estabilidad inducidos por las mutaciones G!I
y 8AI!I, obteniendo unos perfiles de energía libre para las mutaciones suaves y sin
histéresis. La excelente convergencia de los resultados se muestra claramente en los
pequeños errores estándar de los promedios de simulaciones independientes. Para
comprobar la calidad absoluta de los cálculos MD/TI, se ha calculado la diferencia de
energía libre de solvatación entre los pentámeros que contienen una G, I o 8AI central y
se ha comparado con los estimados obtenidos de las bases aisladas mediante técnicas
5 Discusión de resultados
- 286 -
SCRF/MST. La concordancia de los resultados calculados con ambas técnicas es
destacable, apoyando la calidad de los cálculos MD/TI.
Los cálculos muestran que la presencia de un grupo amino en posición 2 de la I
estabiliza fuertemente los dúplexes respecto a una cadena simple de oligonucleótidos, y
los tríplexes respecto a los dúplexes. Por el contrario, la presencia de un grupo amino en
posición 8 de la I estabiliza los tríplexes respecto a los dúplexes, pero desestabiliza los
dúplexes respecto a una cadena simple de oligonucleótidos. Por lo tanto, un simple
recuento de las interacciones por puente de hidrógeno tan solo explica los efectos del
grupo 2-amino en los apareamientos WC y del grupo 8-amino en los apareamientos H,
pero no explica los efectos del grupo 2-amino en los apareamientos H ni del grupo 8-
amino en los apareamientos WC. Estos resultados han sido verificados
experimentalmente, proporcionando gran confianza a la metodología teórica utilizada.
(Véase el apartado 4.3.1)
Para investigar el efecto de los grupos amino distantes se han realizado cálculos
QM-MIPp en las regiones WC y H de la G, I y 8AI. Los resultados sugieren que este
sorprendente comportamiento procede de una sutil redistribución electrónica que tiene
lugar con la introducción de grupos amino en las purinas. En estudios posteriores36, se
ha confirmado que los grupos amino incorporados en regiones de la purina distantes de
los sitios donde se establecen interacciones por puente de hidrógeno tienen una
influencia notable en la estabilidad de los dímeros.
Los resultados sugieren que la introducción de grupos amino para aumentar las
interacciones por puente de hidrógeno es una estrategia razonable para diseñar
pseudobases estabilizadoras de estructuras de ácidos nucleicos, pero sin olvidar que el
diseño de la pseudobase debe realizarse cuidadosamente y no únicamente por un simple
recuento de interacciones elementales que puede conducir a conclusiones erróneas.
En los apartados 4.3.2 y 4.3.3 se han examinado los cambios en la estructura, la
reactividad, la flexibilidad y la estabilidad inducida en los dúplexes y tríplexes de ADN
por la mutación timina (T)!difluorotolueno (F), es decir, el efecto de introducir una
5 Discusión de resultados
- 287 -
base apolar con muy poca capacidad de establecer puentes de hidrógeno en la posición
de una timina.
Las simulaciones de MD de una familia de dúplexes y una familia de tríplexes que
contienen T o F proporcionan trayectorias estables y muy similares que concuerdan con
los datos de RMN que se disponen37. Las conformaciones de estas estructuras son
próximas a una forma B tanto en dúplex como en tríplex30-32 con azúcares en la región
Sur-Este y surcos de reactividad característica de la forma B.
A pesar de la gran similitud de las estructuras globales del dúplex normal y
modificado, existen algunas sutiles diferencias en la región de la mutación. Así, la
mutación conduce a pequeños cambios en las características de reconocimiento de los
dúplexes, como evidencian los mapas de MIP y de solvatación. Ambos muestran que el
dúplex que contiene F tiene una afinidad por pequeñas moléculas catiónicas y una
hidratación reducida en el surco menor en la región próxima al par A·F. Las
características generales de reconocimiento y solvatación de los tríplexes se mantienen
prácticamente inalteradas por la mutación, pero en la posición WC la mutación T!F
debilita la región de potencial negativo en el surco menor, rompiendo parcialmente la
espina de hidratación, y disminuye ligeramente la densidad de agua aparente en la parte
menor del surco mayor. La misma mutación en la posición Hoogsteen no conduce a
cambios importantes en la electronegatividad de los surcos o en la densidad de agua
aparente ni tan solo en la posición de la mutación. La falta de diferencias en la parte
menor del surco mayor es particularmente interesante, porque éste experimenta una
pérdida parcial en las capacidades de interaccionar por puentes de hidrógeno como
resultado de la mutación. El conjunto de cambios detectados en los análisis de MIP y
solvatación pueden ser explicados considerando la alteración en el MEP debido a la
falta de pares de electrones en la posición 2 de F y la existencia de movimientos de
respiración. Los resultados sugieren que la integridad de las espinas de hidratación es
más sensible a la existencia de movimientos de respiración o apertura que a la pérdida
parcial de las capacidades de interaccionar por puentes de hidrógeno.
5 Discusión de resultados
- 288 -
El aspecto más importante de la diferencia entre el dúplex normal y el mutado recae
en la existencia de movimientos de respiración, los cuales conducen a una apertura
reversible parcial o total del par de bases A·F en la escala del nanosegundo, fenómeno
no observado en el par A·T. Los movimientos de respiración también se han detectado
en los tríplexes que contienen F, y no se han observado en el tríplex de referencia que
contiene T. Ambos tríplexes con la mutación presentan aperturas reversibles parciales y
movimientos de respiración, que conducen a una pérdida parcial o total de los puentes
de hidrógeno debido a un desplazamiento de F hacia el surco mayor. Los resultados
sugieren que la respiración en los pares de bases WC no está dramáticamente
modificada por la presencia de una tercera cadena, y que la respiración Hoogsteen es un
fenómeno menos común que la WC, lo cual sugiere una mayor estabilidad de la tríada
d(A·T-F) comparado con la tríada d(A·F-T).
Un estudio más detallado del fenómeno de respiración indica que: (i) la deformación
estructural está muy localizada, ya que las bases adyacentes a la mutación se encuentran
escasamente afectadas por este fenómeno38, (ii) el movimiento es asimétrico, pues tanto
puede involucrar la A como el F del par A·F y (iii) el origen de la apertura total o parcial
está relacionado con un delicado balance entre las interacciones por puentes de
hidrógeno, stacking y efectos de solvatación39. Los movimientos de respiración pueden
tener importantes implicaciones en modular las interacciones de ADNs que contienen F
con proteínas o fármacos, y pueden estar involucrados en la activación de las señales de
reparación de lesiones en el ADN.
Se han determinado los cambios en la estabilidad inducidos por la mutación en una
cadena simple de oligonucleótidos, un dúplex y un tríplex de ADN, considerando
diferentes conformaciones de partida, ambas direcciones T!F y F!T y usando
trayectorias de diferente longitud. Todos los perfiles de energía son suaves y sin
aparentes discontinuidades. Además, los cambios de energía libre asociados a una
mutación, determinados a partir de diferentes simulaciones, son muy próximos entre sí,
proporcionando confianza en la calidad estadística de los estimados. Las diferencias de
energía libre que se encuentran para la mutación en una cadena simple de ADN
(independientemente del tamaño del oligonucleotido) favorecen la hidratación de T
5 Discusión de resultados
- 289 -
frente la de F. El valor obtenido concuerda con el estimado SCRF calculado a nivel
AM1/MST, lo cual da un mayor grado de confianza a los cálculos MD/TI.
Utilizando simple álgebra con las diferencias de energía libre se obtienen todos los
datos termodinámicos asociados con el efecto de la mutación T!F sobre la estabilidad
de dobles y triples hélices de ADN. Los resultados muestran que la presencia de un
único paso d(A·F) desestabiliza el dúplex, pero el ADN resultante es todavía estable a T
ambiente en buena concordancia con los valores experimentales encontrados por Kool y
colaboradores40,41. En la práctica, las mayores diferencias entre el dúplex de ADN que
contiene el par A·F y el dúplex natural deberían relacionarse al cambio en la reactividad
intrínseca del surco menor, que puede modificar la capacidad del ADN de interaccionar
con pequeñas moléculas o con proteínas con motivos de unión al surco menor, y a la
existencia de fenómenos de respiración. Este último fenómeno puede afectar la
reactividad del ADN y contribuir a la activación de los sistemas de reparación del ADN.
La formación de la mayoría de los tríplexes con motivos paralelos es un proceso de
dos etapas. Primero, un dúplex de ADN se forma, y segundo, una tercera cadena de
oligonucleótidos (TFO) se une al dúplex para dar un tríplex42. La transición de un
dúplex con el par d(A·T) a un tríplex con la tríada d(A·T-T) es más favorable que la
transición del mismo dúplex a un tríplex con la tríada d(A·T-F). Resulta interesante ver
que si el dúplex presenta el par d(A·F), la formación del tríplex con la tríada d(A·F-T)
no está desfavorecida con respecto a la formación del tríplex canónico formado a partir
del dúplex con el par d(A·T). Este resultado puede explicarse considerando que las
características del surco mayor del dúplex que presenta el par d(A·F) son muy similares
a las del dúplex de referencia. La similitud de las características de ambos dúplexes
formadores de tríplexes sugieren que un dúplex de ADN que presente el par d(A·F)
tendría, a priori, una capacidad similar de interaccionar con la mayoría de las proteínas
que se unen al surco mayor del dúplex de referencia.
Los cálculos MD/TI sugieren que la sustitución de T por F en las posiciones WC y
H desestabilizan el tríplex en aproximadamente 5 y 3 kcal/mol con respecto al
correspondiente tríplex canónico. La mutación T!F en la posición WC afecta a la
5 Discusión de resultados
- 290 -
interacción por puentes de hidrógeno en mayor medida que la misma mutación en
posición H, lo cual puede ayudar a explicar la más alta estabilidad global del tríplex
d(A·T-F) comparada con el tríplex d(A·F-T) encontrada en los cálculos MD/TI. La
mejor interacción por puentes de hidrógeno del tríplex d(A·T-F) puede atribuirse a los
efectos del esqueleto que hacen posible un mejor apareamiento A·F Hoogsteen que WC.
Sobre la base de la aproximación empírica de Roberts & Crothers43, se esperaría que
ambos tríplexes fueran estables a T ambiente como sugieren los resultados de la MD.
El conjunto de resultados sugiere que el desarrollo y el uso de bases no estándar
apolares es una estrategia razonable para ser usada en oligonucleótidos formadores de
tríplex para terapias antigene, donde la falta de capacidad para interaccionar por puentes
de hidrógeno puede representar una clara ventaja a la hora de diseñar tríplex estable en
secuencias no homopurínicas.
5 Discusión de resultados
- 291 -
5.4 Apareamientos no canónicos
Los apareamientos no canónicos entre bases dan lugar a toda una serie de posibles
estructuras secundarias de los ácidos nucleicos, como los dúplexes paralelos y
estructuras con más de dos cadenas de oligonucleótidos como los tríplexes o los
cuadrúplexes. Recientemente, se ha estudiado un gran número de estructuras dúplex
paralelas basadas tanto en el modo de reconocimiento WC reverso como en el modo
Hoogsteen44-47. Algunos resultados sugieren que determinados tipos de dúplex paralelo
de ADN pueden ser usados como patrones para la formación de tríplexes48. Los
estudios realizados en el apartado 4.4 proporcionan información sobre las propiedades
de la doble hélice paralela de ADN.
En el apartado 4.4.1 se han examinado las características estructurales, las
propiedades de reconocimiento molecular, la flexibilidad y la estabilidad de una serie de
dúplexes paralelos basados en el motivo d(A·T). Los resultados se han comparado con
los obtenidos para una serie de dúplexes antiparalelos con la misma secuencia.
Las trayectorias de los dúplexes d(A·T)n de los modelos helicoidales WC, rWC y H
son estables. Los análisis estructurales sugieren que las hélices H son ligeramente más
rígidas que las hélices WC o rWC y que están bien preorganizadas para reconocer una
cadena de pirimidina y formar una triple hélice. Este hecho abre un importante abanico
de posibilidades para estos dúplexes en terapias antigene y antisense. Las características
helicoidales de los dúplexes están bien preservadas para todos los oligonucleótidos,
incluidos los más cortos. Los parámetros de hélice dentro de la misma familia de
estructuras son muy similares, independientemente de la longitud del oligonucleotido y
entre las tres familias de dúplexes no muestran grandes diferencias. El rise es de 3.4 Å,
y el x-displacement y el roll son pequeños en todos los casos. El twist en el dúplex H es
menor que en los dúplexes WC y rWC, sugiriendo que el pequeño twist encontrado en
los tríplexes de ADN proviene del bajo twist intrínseco del dúplex H31. Las diferencias
en el twist entre los dúplexes WC y rWC están probablemente dentro del error
estadístico de la simulación. Todos los puckering de los azúcares están en la zona Sur-
5 Discusión de resultados
- 292 -
Este del ciclo pseudorrotacional. Las mayores diferencias entre las hélices se encuentran
en la estructura de los surcos. La hélice WC tiene un surco menor estrecho y un ancho
surco mayor, mientras que la hélice rWC tiene dos surcos similares, pero no idénticos.
Finalmente, la hélice H tiene un patrón de surcos totalmente diferente: un surco menor
muy estrecho, que reproduce el surco menor mayor de un tríplex, y un surco mayor muy
ancho, que se relaciona con el surco mayor mayor de un tríplex31,32.
Se observan diferencias remarcables entre las tres familias de dúplexes en lo
referente a la localización de las regiones más favorables para interaccionar con
pequeños cationes y con moléculas de agua. El mapa del MIP para el dúplex WC exhibe
el perfil de reconocimiento esperado para un B-ADN, con una región amplia y continua
correspondiente a la interacción favorable a lo largo del surco menor. Para una hélice
paralela rWC, las regiones con valores más negativos del MIP se localizan en el surco
menor, aunque también se encuentran regiones de interacción favorables en el surco
mayor. Finalmente, en el dúplex H se genera una región de interacción favorable en el
surco menor. El contorno es discontinuo debido al pequeño tamaño del surco, lo que
puede conducir a un notable impedimento estérico en la interacción con grandes
moléculas catiónicas. Los mapas de solvatación muestran que el surco menor es la
región mejor hidratada en el dúplex WC. Ambos surcos aparecen igual de hidratados en
el dúplex rWC, mientras que el dúplex H muestra una región preferencial mayor de
solvatación a lo largo del surco menor y una región más pequeña repartida a lo largo del
surco mayor.
Se han realizado análisis de componentes principales (PCA) para analizar la
flexibilidad molecular de los tres dúplexes. Como se ha encontrado previamente49, los
modos que corresponden a los movimientos de bajas frecuencias explican una parte
muy significativa de la varianza estructural de las trayectorias. La inspección de los
vectores propios (modos) asociados con los valores propios (frecuencias) muestra que la
dinámica esencial de las tres hélices es similar. Esto sugiere que la estructura general
helicoidal, más que el patrón específico de secuencia, es lo que determina los
movimientos conformacionales más comunes del ADN. Sin embargo, los cálculos de
5 Discusión de resultados
- 293 -
entropía50 dejan claro que las tres hélices tienen diferente flexibilidad, siendo
curiosamente la estructura antiparalela WC más flexible que las estructuras paralelas.
La estabilidad (energía libre total) de las estructuras helicoidales puede ser
determinada como la contribución de un término intramolecular, de un término de
solvatación y de un término entrópico. En este estudio no se ha considerado el término
entrópico porque su cálculo implicaría simulaciones mucho más extendidas en el tiempo
y porque no es de esperar que introduzcan cambios cualitativos en los resultados. Se
encuentra una perfecta correlación lineal entre la longitud de la hélice (sin extremos
terminales) y la energía libre total de las estructuras helicoidales, que permite obtener
estimados precisos de la energía libre relativa de nucleación (las ordenadas al origen de
las ecuaciones) y determinar la estabilidad relativa a medida que la longitud de los
dúplexes aumenta (las pendientes de la ecuaciones). La pequeña magnitud de los errores
en la ordenada al origen y en la pendiente, y la perfecta determinación del coeficiente
garantiza la calidad estadística de las ecuaciones ajustadas. Estos resultados muestran
una imagen cualitativamente correcta de la estabilidad de los dúplexes d(A·T)n, desde la
mayor estabilidad de la hélice antiparalela con respecto a las hélices paralelas, a la
mayor estabilidad de la hélice rWC con respecto la hélice H. Es destacable que una
parte de los resultados está indirectamente apoyado por datos experimentales de
Germann y colaboradores51, quienes encontraron valores similares de nucleación para
las hélices WC y rWC y un mejor factor de crecimiento para la hélice antiparalela.
Cuando se examina el término intramolecular y el término de solvatación resulta
interesante ver la existencia de una dependencia polinomial de segundo orden en ambos
componentes energéticos con la longitud de la hélice. Esto indica fuertes efectos
cooperativos, efectos que se cancelan mutuamente al combinar ambos términos, dando
lugar a la dependencia lineal de la energía libre total con la longitud de la hélice. La
inspección de los resultados muestra la interdependencia entre los términos
intramolecular y solvatación. En general, una hélice muy estable desde un punto de
vista intramolecular no está bien solvatada, y viceversa. La dependencia polinomial de
segundo orden de la energía libre de solvatación con la longitud del dúplex puede ser
fácilmente comprendida considerando la dependencia de la energía libre de solvatación
5 Discusión de resultados
- 294 -
con el cuadrado de la carga52. El origen de la dependencia de la energía intramolecular
con la longitud del dúplex está menos claro, lo que conduce a analizar determinados
componentes de la energía intramolecular.
1. Interacciones por puente de hidrógeno. Se encuentra una dependencia lineal con
la longitud de los dúplexes para todas las estructuras helicoidales. Las interacciones
Hoogsteen son más fuertes que las interacciones WC y rWC, que son muy similares
entre sí, concordando con datos ab initio conocidos en fase gas53,54.
2. Interacciones por stacking. También se encuentra una dependencia lineal con la
longitud de los dúplexes para todas las estructuras helicoidales. La hélice H también
tiene las mejores interacciones de stacking, seguida de la hélice WC y finalmente la
hélice rWC.
Como era de esperar, la dependencia de la energía total de pares de bases con la
longitud del dúplex es lineal, y sugiere el sorprendente orden de estabilidad: H > WC >
rWC. Este orden es diferente al predicho a partir de la energía libre total y a los datos
encontrados experimentalmente. Esto demuestra que la estabilidad de una hélice no sólo
viene determinada por la estabilidad relativa de las interacciones entre bases.
3. Repulsión entre fosfatos. La magnitud de la repulsión fosfato-fosfato es
claramente mayor que la de las interacciones por puente de hidrógeno y stacking, lo
cual indica que cualquier estructura helicoidal debe ser definida para minimizar la
repulsión fosfato-fosfato. La repulsión fosfato-fosfato crece con la longitud del
dúplex siguiendo una dependencia polinomial de segundo orden, indicando que esta
repulsión es la responsable de la cooperatividad negativa de la energía
intramolecular de los dúplexes de ADN. Para el rango de oligonucleótidos estudiado
(de 5 a 15 pasos) la mayor repulsión entre fosfatos se encuentra para la hélice H,
mientras que las hélices WC y rWC presentan valores similares.
En el apartado 4.4.2 y 4.4.3 se han examinado las características estructurales y las
propiedades de reconocimiento molecular de una serie de dúplexes paralelos basados en
5 Discusión de resultados
- 295 -
secuencias mixtas d(A·T) y d(G·C). También se ha examinado el efecto de los 8-amino
derivados sobre la estabilidad de estas estructuras. Los resultados obtenidos se han
comparado con los obtenidos para un dúplex antiparalelo con la misma secuencia.
Las simulaciones de MD de los dúplexes Hoogsteen muestran trayectorias estables.
Las únicas distorsiones apreciables son una ligera curvatura en el extremo terminal
d(G·C) y la existencia de movimientos que conllevan a la pérdida de puentes de
hidrógeno en el extremo terminal d(A·T). Similares características ocurren en la hélice
antiparalela de control. Es destacable la existencia de dos pares protonados d(G·C+)
consecutivos que no introducen grandes alteraciones estructurales a la hélice
confirmando los resultados obtenidos en MD de tríplexes (véase el apartado 4.3.1) y en
concordancia con los datos de RMN33,34. Los análisis estructurales muestran que ambas
simulaciones están convergidas y muestrean regiones similares del espacio
conformacional próximas a la cadena Hoogsteen de un tríplex de ADN. Por lo tanto, las
simulaciones sugieren que la estructura de las cadenas Hoogsteen de un tríplex no está
muy distorsionada cuando la cadena de pirimidinas WC se elimina. En contraste con
estos resultados, las simulaciones de dúplexes rWC partiendo del modelo de RMN55 o
del modelo canónico56 divergen muy rápidamente distorsionando las estructuras, a pesar
de los esfuerzos hechos para reforzar el equilibrado del sistema y los apareamientos
entre bases. La tercera simulación, que parte de un modelo derivado de una trayectoria
previamente equilibrada de un dúplex poli (A·T), permanece estable durante un periodo
más largo, pero la hélice está muy distorsionada al final de la simulación. Los análisis
de las trayectorias sugieren que la repulsión entre los grupos amino de la G y la C es el
principal factor que causa la desestabilización de la hélice, a pesar de los esfuerzos para
reducir la repulsión promoviendo el apareamiento wobble d(G·C)45. Las simulaciones de
MD sugieren que, al menos para la secuencia considerada, el dúplex rWC no es estable,
al contrario que las conformaciones Hoogsteen. Los resultados apoyan la existencia de
motivos Hoogsteen para dúplexes paralelos en ADN con una población similar de pares
d(A·T) y d(G·C).
La estabilidad de las simulaciones con motivos H permiten analizar la estructura
helicoidal de estos dúplexes paralelos por primera vez. La hélice paralela es similar a la
5 Discusión de resultados
- 296 -
estructura de las cadenas Hoogsteen en un tríplex de ADN. El twist promedio es de 31º
y el rise de 3.4 Å. Las bases son bastante perpendiculares al eje de la hélice. Los
azúcares están en las regiones Sur y Sur-Este con un ángulo de fase promedio de 124º,
un valor muy próximo a los encontrados experimentalmente para dúplexes paralelos
rWC55,57 y tríplexes31,32,58,59. Presenta un surco muy estrecho que denominamos menor,
correspondiente a la parte menor del surco mayor en un tríplex de ADN, y un amplio
surco que denominamos mayor correspondiente a la parte mayor del surco mayor en un
tríplex de ADN32. Esto evidencia grandes diferencias con los dúplexes paralelos rWC,
donde se han encontrado dos surcos casi equivalentes54,55.
Los mapas de MIP permiten trazar las regiones donde el ADN tiene mayor
propensión a interaccionar con moléculas catiónicas. Como era de esperar por estudios
previos en tríplexes31,32, el surco menor es la región más reactiva. Es destacable que la
capacidad del dúplex H para interaccionar con moléculas no es diferente de la que
muestra el dúplex antiparalelo de la misma secuencia, a pesar del hecho que todas la
citosinas en posición Hoogsteen estén protonadas. Esta claro que la corta distancia entre
fosfatos en los dúplexes H crea un fuerte potencial negativo en las proximidades de las
citosinas Hoogsteen que apantalla su carga positiva. Los mapas de solvatación muestran
que el dúplex H está muy bien hidratado. La mayor densidad de agua aparente se
encuentra en el surco menor, que es suficientemente ancho para permitir la inserción de
una cadena de aguas ordenadas. Hay también regiones de gran densidad de agua en las
proximidades de los grupos fosfatos en el surco mayor. Las densidades de agua
aparentes alrededor del dúplex H y de la hélice antiparalela son muy similares,
confirmando los resultados obtenidos de los cálculos cMIP. Resumiendo, el dúplex
paralelo H es una nueva estructura que comparte muchas características con los
tríplexes de ADN, pero que también exhibe una serie única de características reactivas
derivadas principalmente de la existencia de dos surcos muy diferentes.
En artículos previos (véase el apartado 4.3.1)58,59, se presenta el diseño, la síntesis y
la evaluación de una serie de 8-amino derivados de bases púricas. Estas moléculas
estabilizaban fuertemente el tríplex de ADN, lo cual estaba relacionado entre otros
factores a la interacción por puente de hidrógeno extra que se establecía entre el grupo
5 Discusión de resultados
- 297 -
8-amino y el grupo carbonilo de la citosina o timina en posición Hoogsteen. También se
ha encontrado que el grupo 8-amino promueve la desestabilización de los apareamientos
WC, al menos en los pares d(G·C) y d(I·C)36. De acuerdo con esto, se podría esperar que
la presencia de los grupos 8-amino desestabilizara el dúplex paralelo rWC e
incrementara la estabilidad del dúplex H. Esta hipótesis se ha estudiado a partir de
cálculos MD/TI realizados en el dúplex H. Desafortunadamente la inestabilidad del
dúplex rWC evita cualquier cálculo con esta metodología.
Tal y como se ha encontrado en otros sistemas relacionados, los perfiles de
mutación son suaves sin ninguna discontinuidad aparente, lo cual señala la inexistencia
de histéresis. Los errores estándar en los valores de energía libre son pequeños
indicando la buena convergencia en los estimados. Los resultados obtenidos indican una
fuerte estabilización del dúplex H tras la introducción de las 8-amino purinas (con
valores similares a los encontrados previamente58,59), sugiriendo que estas moléculas
pueden ayudar a estabilizar horquillas basadas en los dúplexes paralelos H. Sin
embargo, el hecho que la mutación G/I!8AG/8AI estabilice menos el dúplex H que la
mutación A!8AA, lo cual concuerda con cálculos previos en tríplex, no está de
acuerdo con los experimentos de fusión (Tm) en las horquillas Hoogsteen. Esto sugiere
que cuando 8AG (ó 8AI) está presente, el reconocimiento Hoogsteen no tiene porque
estar en el motivo d(8AG·C+), y podría tratarse de un apareamiento wobble
d(8AG·C)w60. La mutación d(G/I·C+)!d(8AG/8AI·C)w es muy difícil técnicamente
debido a la aniquilación de una carga neta. Para investigar esto se han realizado las
mutaciones G!8AG y I!8AI en presencia de una citosina neutra en la posición
complementaria Hoogsteen (el resto de las citosinas están protonadas). Los resultados
sugieren que la presencia de 8-amino derivados estabiliza el apareamiento wobble. La
diferencia de energía libre obtenida para los apareamientos wobble es 0.5 kcal/mol
mayor que la encontrada para la mutación A!8AA y más de 2 kcal/mol que la
estabilización debida a la misma mutación cuando las citosinas Hoogsteen están
protonadas. De acuerdo con estos resultados, se puede sugerir la hipótesis que la
presencia de 8AG y 8AI favorecen la existencia de motivos Hoogsteen neutros en lugar
de las protonadas.
5 Discusión de resultados
- 298 -
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6 Conclusiones
6 Conclusiones
- 304 -
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6 Conclusiones
- 305 -
1. La polarización juega un papel clave en la estabilización de las interacciones
catión ! sistema aromático, particularmente en las interacciones π-catión. El
efecto es especialmente notorio cuando se comparan interacciones en anillos
aromáticos de diferente tamaño.
2. La metodología GMIPp es una herramienta muy poderosa y muy rápida para la
predicción de interacciones no enlazantes, incluida la unión de cationes a
compuestos aromáticos.
3. Los sustituyentes y la presencia de heteroátomos o de anillos fusionados tienen
una profunda influencia en las características topológicas de la densidad
electrónica en sistemas π-catión con el mismo núcleo aromático, como anillos de
5 o 6 miembros. Con la excepción de los complejos que involucran anillos de 5
miembros, hay fuertes relaciones entre la densidad de carga en los puntos
críticos de celda y los parámetros energéticos y geométricos de los complejos.
Estas relaciones permiten generalizar el concepto de orden de enlace-longitud de
enlace encontrados en otras interacciones intermoleculares.
4. El análisis topológico de los puentes de hidrógeno intermoleculares en sistemas
C-H···π no muestra diferencia alguna entre los complejos con puentes de
hidrógeno impropios y con puentes de hidrógeno convencionales. Ambos
cumplen por completo los criterios de Koch y Popelier para este tipo de
interacciones.
5. El análisis de Atoms in Molecules confirma la existencia de los puentes de
hidrógeno N-H···O en el par A·U, pero no es concluyente en el caso de los
contactos C-H···O. Los resultados muestran claramente que los contactos C-
H···O en el par A·U no corresponden ni a un puente de hidrógeno convencional
ni tampoco a un puente de hidrógeno impropio. En los pares U·U, dicho análisis
6 Conclusiones
- 306 -
confirma la existencia de dos puentes de hidrógeno convencionales, N-H···O y
C-H···O.
6. Los grupos amino unidos a la posición 2 y 8 de la hipoxantina no provocan
ningún cambio en la estructura general de dúplexes y tríplexes, pero sí inducen
alteraciones en la estabilidad de las hélices. Un grupo amino en posición 2
estabiliza tanto dúplexes como tríplexes, mientras que un grupo amino en
posición 8 estabiliza tríplexes y desestabiliza dúplexes. Este comportamiento,
que ha sido verificado experimentalmente, se debe a una sutil redistribución
electrónica, y demuestra la peligrosidad de hacer predicciones de la estabilidad
energética a partir de únicamente el recuento de puentes de hidrógeno.
7. La mutación T!F no conduce a modificaciones importantes en la estructura o
en la reactividad de los dúplexes ni de los tríplexes de ADN, pero produce
cambios importantes en la dinámica, concretamente en la aparición de
fenómenos de respiración en el paso mutado. Estos movimientos de respiración
aparecen en todas las estructuras de ADN (dúplex o tríplex) que contienen F,
pero son más comunes cuando la mutación se encuentra en la posición Watson-
Crick.
8. La sustitución T!F desestabiliza las estructuras de los dúplexes y tríplexes de
ADN. Los resultados sugieren que la mutación T!F es más desestabilizadora en
la posición Watson-Crick que en la Hoogsteen. Los resultados cuantitativos
derivados de cálculos MD/TI concuerdan bien con los datos experimentales en
dúplexes, siendo una predicción para los tríplexes.
9. Las dobles hélices de ADN basadas en motivos poli (A·T) son intrínsecamente
estables en soluciones acuosas tanto si son paralelas como antiparalelas. Los
cálculos MM-PB/SA acoplados a dinámicas moleculares detectan que la hélice
antiparalela es la estructura helicoidal más estable y más flexible. La diferencia
de estabilidad entre la hélice antiparalela y las hélices paralelas aumenta
linealmente con la longitud de los oligonucleótidos. Los mismos cálculos
6 Conclusiones
- 307 -
sugieren que la hélice WC reversa es más estable que la hélice Hoogsteen, la
diferencia se relaciona con una mejor energía de nucleación de la hélice WC
reversa.
10. Las simulaciones de dinámica molecular no proporcionan estructuras
helicoidales estables para secuencias que contienen un número similar de pares
d(A·T) y d(G·C) dispuestos en la estructura WC reversa. Por el contrario, se
encuentran trayectorias estables cuando se asume el apareamiento Hoogsteen.
Las estructuras obtenidas en estas trayectorias permiten caracterizar la estructura
de doble hélice paralela Hoogsteen, cuya conformación es próxima a la que
muestran las cadenas Hoogsteen de un tríplex de ADN.
11. Los derivados 8-aminopurina son capaces de aumentar la estabilidad de las
dobles hélices paralelas en conformación Hoogsteen, lo que permite diseñar
nuevas moléculas potencialmente útiles en terapias antigene y antisense.
6 Conclusiones
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Otros trabajos publicados
Otros trabajos publicados
- 310 -
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Otros trabajos publicados
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Otros trabajos publicados
- 312 -
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Agradecimientos
Agradecimientos
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Agradecimientos
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Me gustaría aprovechar este capítulo para expresar mi gratitud a todas aquellas
personas que me han ayudado, de una manera u otra, durante la realización de la tesis.
En primer lugar, al Dr. Modesto Orozco y al Dr. F. Javier Luque por ofrecerme
la oportunidad de trabajar con ellos. Gracias por vuestra confianza, comprensión,
esfuerzo y dedicación. Me siento muy afortunada de formar parte de este gran equipo.
Al Dr. Josep Lluís Gelpí por sus buenos consejos y su ayuda incondicional.
A Bego, Carles, Robert, Xavi y Cristóbal por todo lo que he aprendido a vuestro
lado y, sobretodo, por la amistad que nos ha unido dentro y fuera del laboratorio.
Al resto de compañeros del grupo de Reconeixement Molecular. Gracias por
vuestra colaboración, trabajar con todos vosotros es un placer.
Al Dr. Charlie Laughton y al Dr. Jiali Gao por su hospitalidad durante mi
estancia en sus respectivos grupos. Gracias por vuestros consejos e inestimable ayuda.
A todos aquellos investigadores que han colaborado con sus trabajos científicos
en la realización de esta tesis.
A mi familia por el interés y el apoyo que siempre me estáis transmitiendo.
A Joaquín, con quien tengo la suerte de compartir muchas cosas. Gracias por
hacer que todo parezca más fácil.
Finalmente, me gustaría recordar a todas aquellas personas que no han realizado
ninguna aportación directa en este trabajo, pero que han contribuido diariamente a mi
formación como persona.
El presente trabajo se ha llevado a cabo gracias a la ayuda proporcionada por una
beca predoctoral de Recerca i Docència de la Universitat de Barcelona.
A todos vosotros, GRACIAS.
Agradecimientos
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