Identification et taxonomie des streptocoques
Loubinoux Julien
Déclaration conflits d’intérêt
• Nom prénom : LOUBINOUX Julien • Fonction : MCU-PH, Service de Bactériologie et CNR
Streptocoques, Hôpital Cochin, Paris
• Conflits d’intérêt :
- Bio-Rad (2012) : frais déplacement et congrès RICAI + ECCMID
Congrès SFM 2014 Taxonomie des streptocoques – Session DPC – 31/03/2014
Importance d’une bonne identification
Espèce bactérienne
Habitat = porte d’entrée
Profil de sensibilité aux antibiotiques = traitement
Caractères généraux des streptocoques
• Cocci à Gram positif en chaînettes • Immobiles, asporulés
• Catalase négative • Pas de métabolisme respiratoire
• Anaérobies aéro-tolérants (croissance avec 5% CO2)
• Culture sur milieux gélosés enrichis (5% sang)
Type d’hémolyse
Classification des streptocoques
• Streptocoques β-hémolytiques Streptococcus pyogenes (groupe A) Streptococcus agalactiae (groupe B) Streptococcus dysgalactiae (groupes C, G) Streptococcus anginosus/constellatus/intermedius (« S. milleri ») Streptococcus canis/porcinus/equi subsp. zooepidemicus/suis
• Streptocoques non β-hémolytiques Groupe anginosus : Streptococcus anginosus/constellatus/intermedius Groupe mitis : Streptococcus pneumoniae/pseudopneumoniae/mitis/oralis Groupe sanguinis : Streptococcus sanguinis/parasanguinis/gordonii Groupe mutans : Streptococcus mutans Groupe salivarius : Streptococcus salivarius Groupe bovis : Streptococcus gallolyticus/pasteurianus/lutetiensis/infantarius
Taxonomie des streptocoques 104 espèces en 2014
Streptocoques non β-hémolytiques • Groupe mitis (S. pneumoniae) • Groupe bovis
Espèces très proches, les plus difficiles à identifier Echanges génétiques par transformation
Habitat des streptocoques
Peau et muqueuses de l’homme ou de l’animal Nature du prélèvement aide à l’identification
• Peau S. pyogenes, S. dysgalactiae
• Gorge/muqueuses respiratoires S. pyogenes, S. dysgalactiae, S. anginosus,
S. mitis, S. pneumoniae, S. sanguinis, S. mutans, S. salivarius
• Muqueuses génitales femme S. agalactiae
• Muqueuses digestives/selles S. bovis
« Streptocoques oraux »
« Streptocoques fécaux »
Identification phénotypique des streptocoques
• Gram, catalase - Aspect et taille colonie et caractères culturaux - Aspect et taille hémolyse - Atmosphère de croissance
• Groupe de Lancefield (streptocoques β-hémolytiques)
• Gélose Granada, hippurate, CAMP test (SGB)
• Bacitracine (SGA), pyrrolidonyl arylamidase (SGA, entérocoques)
• Bile esculine, milieu hypersalé (NaCl 6,5%) (SGD, entérocoques)
• Optochine (CO2 ± O2) (Pneumocoque)
• Profil biochimique (Galeries, automates) • Profil de résistance aux antibiotiques • Profil protéique (Spectrométrie de masse MALDI-TOF) +++
Difficultés d’identification (certains streptocoques non β-hémolytiques) Databases incomplètes, peu de caractères biochimiques différentiels, variabilité et mauvaise reproductibilité de certains caractères biochimiques
Sérogroupage des streptocoques
– Basé sur la c lass i f ica t ion de Lancef ie ld qui repose sur les caractères antigéniques du polyoside C et des acides téchoïques
– 18 Groupes : A à V – Les s t reptocoques dépourvus
d’antigène de groupe sont dits non groupables
– Technique d’agglutination sur lame : s é r o g r o u p a g e d e s p r i n c i p a u x antigènes (A, B, C, D, F, G)
plusieurs réactifs commercialisés (bioMérieux, BioRad, Wellcome, Oxoid)
– Existence de réact ion croisée (pneumocoque et groupe C)
Identification des streptocoques β-hémolytiques
Sérogroupage
PYR +
S. pyogenes
B
Camp test + Hip +
S. agalactiae S. porcinus
C, G colonies taille normale
S. dysgalactiae S. canis S. equi subsp. zooepidemicus
C, G, F colonies punctiformes
Streptocoque du Groupe C ou G
Streptocoque du Groupe anginosus
S. anginosus S. constellatus S. intermedius
A
Test PYR
– Recherche de pyrrolidonyl arylamidase – Test rapide sur disque – SGA et entérocoques : PYR + – SGB et autres streptocoques : PYR -
Identification des streptocoques β-hémolytiques
« B »,
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* * *
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(Zone d’hémolyse très petite)
(Zone d’hémolyse grande)
Identification des streptocoques non β-hémolytiques
B,
Si identification phénotypique mauvaise ou non fiable Spectrométrie de masse MALDI-TOF ou biologie moléculaire (sodA)
β-hémolytique sang cheval / α-hémolytique sang mouton (méningites et septicémies)
« Streptocoques oraux »
* *
* *
S. pseudopneumoniae Décrit en 2004
• Pas de capsule • Résistant à l’optochine (< 14 mm) sous 5% CO2
• Sensible à l’optochine (> 14 mm) sous air ambiant • Non soluble dans la bile
Le test de solubilité dans la bile est plus spécifique que l’optochine pour l’identification de S. pneumoniae
• GenProbe AccuProbe S. pneumoniae positif
Identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF
Constitution d’une base (profils protéiques) propre au CNR-Strep (n=457)
• Identification de toutes les souches par tests phénotypiques conventionnels et par biologie moléculaire (séquençage de sodA)
• 113 souches types de collection • 344 souches cliniques
Identification fiable au niveau de l’espèce de la quasi totalité des espèces du genre Streptococcus
Amélioration par rapport à la base existante Bruker : meilleure identification des streptocoques des groupes mitis et bovis
Base du CNR-Strep (n=457)
S. mitis/S. oralis S. pneumoniae S. pseudopneumoniae S. Salivarius groupe Milleri S. mutans…
Evaluation de la base Identification de souches cliniques (n=2987)
S. pneumoniae (n=90)
– 82 souches (91%) identifiées sans ambiguïté en tant que S. pneumoniae • 1er choix: S. pneumoniae • 2ème choix: S. pneumoniae • Scores > 2
– 8 souches (9%) identifiées en tant que S. pneumoniae • 1er choix: S. pneumoniae • 2ème choix: S. mitis ou S. pseudopneumoniae • Scores > 2 et Δscore = 0 ou 0,01 • Analyse des profils = profil spécifique S. pneumoniae
Résultats Streptocoques du groupe mitis
Souches cliniques d’endocardites Identification MALDI-TOF vs séquençage sodA
Species (n) Commercial db1,2 Average score CNR db1,3 Average score
S. gallolyticus (55) 54 (99%) 2,23 55 (100%) 2,52
S. pasteurianus (7) 7 (100%) 2.26 7 (100%) 2,51
S. infantarius (6) 0 (0%) 2,23 6 (100%) 2,53
S. lutetiensis (3) 2 (66%) 2,01 3 (100%) 2,52
Overall (71) 63 (88%) 2,16 71 (100%) 2,52
1 MALDI-TOF MS matching sodA identification
2 Commercial database (Bruker)
3 CNR-Strep database
Résultats Streptocoques du groupe bovis
• Identification parfaite avec la base de données du CNR contrairement à la base commerciale
• Tous les scores étaient > 2
• 88 souches cliniques identifiées • AXIMA Confidence instrument (Shimadzu, Japan) • 100% d’identifications correctes
Résultats Streptocoques du groupe bovis
Identification moléculaire des streptocoques
• PCR spécifique (espèces les plus pathogènes) S. pyogenes speB (Streptococcal pyrogenic exotoxin B) S. agalactiae - cfb (Camp factor) - Xpert® GBS GeneXpert® (Cepheid)
S. pneumoniae lytA (Autolysine) et ply (Pneumolysine) • Amplification et séquençage de gènes d’intérêt
ARNr 16S, sodA, rpoB, gdh, ddl ARNr 16S insuffisant pour les espèces très proches > 99% homologie entre S. pneumoniae et S. mitis Intérêt de gènes plus variables d’une espèce à l’autre (sodA)
Le gène sodA, une cible utile pour l’identification moléculaire des cocci et des
bacilles à gram positif
• Cible monocopie
• Petit gène (606 nt)
• Divergence entre les espèces supérieure à celle des
ADNr 16S
• Avec une paire d’oligonucléotides dégénérés
amplification de 72% du gène (fragment sodAint)
sequençage de l’amplicon
Identification par séquençage de sodA (Superoxyde dismutase Mn dépendante)
Kawamura et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 1995 / Poyart et al., J. Clin. Microbiol. 1998
ADNr 16S sodA
Conclusions Identification des streptocoques
• Streptocoques β-hémolytiques Peu de problèmes d’identification Attention au sérogroupage isolé
• Streptocoques non β-hémolytiques
Groupe mitis (sauf S. pneumoniae) Groupe bovis Intérêt des techniques les plus récentes - Spectrométrie de masse MALDI-TOF - Techniques moléculaires (sodA)