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HIV e AIDS
Acquired Immuno Deficiency Syndrome
• Malattia causata da un agente infettivo:
un retrovirus
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La stragrande maggioranza dei casi (>90%)è nell'Africa sub-Sahariana (tasso di infezione 20-25%) e nel Sud-Est asiatico.
•Circa 6.300 nuove infezioni da HIV al giorno nel mondo 700 di queste avvengono in bambini <15 anni di età Il 47% delle infezioni nell’adulto in donne e 39% in individui <25 anni • Prima dell’introduzione di terapie combinate anti-HIV, l’incidenza dell’AIDS aumentava ad un tasso di quasi il 5% annuo
Persone viventi con HIV/AIDS Casi totali stimati:
35 milioni
Morti totali stimati: 25 milioni
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HIV e AIDS
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Il Virus
Il virus si replica solo in cellule T4 proliferanti in risposta ad uno stimolo immunologico
Trascrittasi inversa in cellule T4 attivate nel sangue di pazienti con AIDS •Robert Gallo : HTLV-3 • Luc Montagnier: LAV
Virioni di HIV al microscopio elettronico. Notare il core centrale e l’envelope
Human Immunodeficiency
Virus (HIV)
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Struttura dell'HIV Env gp120
Glicoproteina di superficie
Env gp41 Glicoproteina transmembrana
Gag p17 Proteina matrice
Gag p24 Capside
RNA (2 molecole)
Pol Proteasi p9
Polimerasi /RNAsi p66 Integrasi p32
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Antigeni di superficie
Envelope di derivazione cellulare Due glicoproteine: gp160 gp120 e gp41
gp120 è antirecettore e variabile gp41 è fusogena e immunosilente
problema per vaccino • gene ENV
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Antigeni Gruppo-Specifici
• gene GAG
p17: superficie interna – miristoilata MATRICE
p24: capside
p9: nucleocapside associata con RNA
Poliproteina
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Enzimi
• Polimerasi/RNAsi
• Integrasi
• Proteasi (taglia le poliproteine)
• gene POL Poliproteina
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Il Genoma di HIV
Tre geni strutturali (GAG, POL, ENV)
Sequenze LTR (promotori, enhancer e siti di legame per fattori trascrizionali cellulari)
Altri open reading frames codificano per piccole proteine regolatrici e accessorie che inducono anticorpi
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Il Genoma di HIV
PRECOCI TAT: Transattivatore di Trascrizione
REV: Regolatore di Espressione delle proteine Virali
(promuove trasporto mRNA non sottoposto a splicing da nucleo a citoplasma)
NEF: Fattore di Regolazione Negativa (erroneamente, sottoregola proteine cell)
TARDIVE VIF: Fattore che aumenta infettività virale in alcune cellule
VPU: (facilita assemblaggio e rilascio)
VPR: (media trasporto genoma nel nucleo cellulare)
mRNA sono fatti con splicing multipli del cDNA
TAT e REV sono essenziali per la replicazione di HIV
Piccole proteine non-strutturali
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HIV-1 e HIV-2
•HIV-1 in tutto il mondo, il più diffuso
•HIV-2 in Africa occidentale, Caraibi, America
meridionale, meno virulento HIV-2 solo 40% di omologia con HIV-1 ma 75% di omologia con SIVmac HIV-1 filogeneticamente simile a SIVcpz
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HIV-1 e HIV-2 Notevole variabilità genetica
HIV-1 Gruppo M (major)
N O Africa centro-occidentale
11 sottotipi (A- K) HIV-2
6 sottotipi (A-F)
Divergenza 25-35% tra i sottotipi e fino al 20% all’interno di un sottotipo.
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HIV Tropismo
Linfociti T CD4+
Macrofagi
• Distruzione specifica dei linfociti CD4+
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Entrata nella cellula Le cellule T4 (CD4+) sono il
bersaglio principale
Cellule umane HeLa
Cellule umane HeLa transfettate con l’antigene CD4
NON INFETTATE INFETTATE
Ma la proteina CD4 NON è sufficiente poichè l’infezione non avviene se CD4 è transfettato in cellule di TOPO
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Corecettore
CD4
CD4 CD4
HIV
CCR5 CCR5
chemochina CCR5 Mutato
macrofago I recettori per le chemochine sono corecettori necessari insieme al CD4
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HIV e AIDS
Persone esposte non infette
Long term non-progressors
La storia del recettore per le chemochine
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Corecettori e infezione da HIV
• CCR5 è un recettore per le chemochine
• Cellule con molecole CCR5 mutanti omozigoti non sono infettate da HIV
• Persone con molecole CCR5 mutanti eterozigoti progrediscono verso l’ AIDS più lentamente
•25% dei long term survivors sono mutanti in CCR5 o CCR2 (delezioni)
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antigene CD4
Corecettore cellula CD4+
HIV gp120 si lega a CD4/corecettore
HIV - Adsorbimento
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antigene CD4
Corecettore
cellula CD4+
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gp120
gp41 antigene CD4
Corecettore
gp41 HIV cellula T4
22 Gp120 si lega a CD4/corecettore
Matrice
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Il legame causa un cambiamento conformazionale nelle molecole gp120
Trascrittasi inversa
Proteasi Integrasi
tRNA
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Gp41 è esposta e si inserisce nella membrane della cellula CD4
25 Le membrane cominciano a fondersi
26 Le membrane fondono
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Il nucleocapside entra nella cellula CD4
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Entrata per fusione • Fusione a pH neutro
• Non ha bisogno degli endosomi per l’entrata
• Sincizi
Importante per la progressione della malattia: diffusione cellula-cellula
Importante per la terapia: gli anticorpi non bloccano questo tipo di diffusione, necessaria immunità cellulo-mediata
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RETROVIRUS - REPLICAZIONE
3 diverse attività enzimatiche •Trascrittasi inversa •RNasi H •DNA pol DNA dipendente
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Uscita per gemmazione
• Il virus esce immaturo dalla cellula
• La proteasi scinde la poliproteina gag
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Trasmissione
Orizzontale Rapporti sessuali Sangue Verticale Transplacentare Perinatale Latte
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HIV Patogenesi Tropismo per linfociti T CD4 (citocida) Cellule della linea macrofagica (persistente) (macrofagi, monociti, cellule microgliali cerebrali, cellule dendritiche della cute) Effetto citopatico per: • accumulo di copie di genoma come DNA circolare non intergrato • aumento di permeabilità della membrana citoplasmatica • formazione di sincizi • induzione di apoptosi
Immunosoppressione per diminuzione di cellule T CD4 da: • citolisi indotta da HIV • citolisi mediata dalle cellule immunitarie T-citotossiche
Patologie neurologiche da: • rilascio di sostanze neurotossiche o fattori chemiotattici da parte di monociti e cellule microgliali infettate risposta infiammatoria nel cervello • effetti citopatici nei neuroni
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HIV e AIDS Andamento della malattia – Quadro cellulare e immunologico
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HIV e AIDS Quadro cellulare e immunologico
Decorso della malattia
1. Infezione acuta
• Alto titolo virale (fino a 107 virioni per ml di sangue)
• Sintomi modesti
• Diminuzione di cellule CD4+ e poi recupero
• Aumento di cellule CD8+ e poi recupero
• Macrofagi infettati I macrofagi portano HIV nell’organismo in caso di trasmissione sessuale
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HIV e AIDS
2. Una forte risposta immune
Il virus scompare in gran parte dal sangue (persiste nei infonodi e nei macrofagi) • Buona risposta di cellule T citotossiche (CTL) • La maggior parte del virus in questa fase viene prodotto da cellule CD4+ recentemente attivate (che si dividono) e infettate • La produzione di nuove cellule CD4+ compensa la perdita dovuta alla lisi per ECP e alla distruzione delle cellule infette da parte dei CTL
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HIV e AIDS
3. La latenza
Latenza del virus e dei sintomi
• Il virus persiste nei tessuti extra-vascolari
• Le cellule CD4+ della memoria (non attivate) albergano il provirus per lungo tempo (anni)
•Quando le cellule si attivano c’è produzione di virus
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HIV e AIDS 4. L’inizio della malattia
Perdita massiva di cellule CD4+ • Le cellule CD4+ sono il bersaglio del virus • Le cellule che proliferano per rispondere al virus sono uccise dal virus • La variabilità antigenica permette al virus di sottrarsi alla risposta immune proprio nel momento in cui questa diminuisce • Apoptosi delle cellule CD4+
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HIV e AIDS 5. Malattia avanzata - AIDS
• La perdita di cellule CD4+ significa assenza di controllo di virus e cellule infette
• Quando il n. di CD4+ è < 200/ml il titolo virale aumenta rapidamente e la risposta immune residua collassa
• Infezioni opportunistiche
• Morte entro ~2 anni in assenza di terapia
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HIV - latenza
L’infezione da HIV non si manifesta come malattia per anni
Durante la latenza clinica apparente, il virus si replica a basso titolo ed è eliminato
Latenza Cellulare
Solo cellule T4 attivate possono replicare il virus
La maggior parte delle cellule T4 infettate sono lisate ma sono rimpiazzate
Alcune cellule T4 revertono a cellule della memoria (quiescenti) di lunga vita
Le cellule T4 di memoria non possono replicare il virus se non diventano attivate
Latenza - Clinica
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Latenza
In assenza di qualsiasi stimolo attivante:
Omeostasi
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Rottura della Latenza
T4 quiescenti
Risposta immune (interazione di citochine o antigeni con recettori sulla
membrana cellulare) T4 attivati
Produzione di HIV
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Terapia – inibitori dell’entrata
Peptidi capaci di legarsi alla gp41
Bloccano l’interazione di gp41 con le proteine della membrana cellulare durante la fusione
T-20: nei trials clinici, quasi 2 log di riduzione nei livelli plasmatici di HIV
ENFUVIRTIDE T-20
MARAVIROC Si lega a CCR5 e lo stabilizza in una
conformazione inattiva
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Terapia – Inibitori nucleosidici della trascrittasi inversa
AZT-azidotimidina e d4T,
analoghi della timidina
Sono analoghi strutturali dei nucleosidi
•La fosforilazione alla forma trifosfata è opera di enzimi
cellulari
ddI-dideossiinosina analogo della inosina
ddC-dideossicitidina E 3TC-lamivudina
analoghi della citidina
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AZT – meccanismo di azione
P
P
P
P
Sintesi normale di cDNA
HIV RNA
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P
P
P
P
P
AZT P-P-P
Termine
Inibisce anche:
• HBV
AZT agisce in 2 modi:
• Compete con TTP
• Terminatore della catena
Selettiva:
• AZT-TP ha affinità 100 volte > per trascrittasi inversa che per polimerasi a e b cellulari
HIV RNA
cDNA
T
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Terapia - Inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa
In genere derivati delle benzodiazepine che, complessandosi direttamente con
l'enzima, ne inibiscono la funzione.
Molto efficaci e ottimamente tollerati, ma selezionano rapidamente mutanti resistenti ==> impiegati solo per rafforzare altre combinazioni di 2-3 farmaci.
Agiscono solo su HIV
Nevirapina, delavirdina e loviride
Terapia - Inibitori dell’integrasi
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RALTEGRAVIR (recentemente introdotto), inibisce l’attività dell’enzima virale INTEGRASI
Causano facilmente lo sviluppo di mutanti
resistenti
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Terapia - Inibitori di proteasi
La proteasi virale consente la maturazione dei virioni
Gli inibitori della proteasi (indinavir, ritonavir, saquinavir , nelfinavir) sono composti a basso peso molecolare capaci di complessarsi con il sito attivo
della proteasi e di inibirne così la attività.
Inducono sintesi di particelle virali difettive che non hanno attività infettante.
Hanno alta attività antivirale e indice di selettività di 1000. In vivo inibiscono la viremia plasmatica di oltre 2 log.
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Strategie Anti-HIV • Educazione
Trasmissione sessuale
Non altamente infettivo
• Chemioterapia Seleziona mutazioni Resistenza
ma
Sopprime la replicazione Incapacità di mutazione
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Strategie Anti-HIV Highly
Active
Anti-
Retroviral
Therapy
HAART: Due analoghi nucleosidici inibitori di RT e 1 inibitore della proteasi
Ora anche: Due analoghi nucleosidici inibitori di RT e 1 inibitore non nucleosidico
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Polimorfismo
Trascrittasi inversa e Pol II hanno un alto tasso di errore: 1/2.000-10.000
Il genoma di HIV ha 9749 nucleotidi Quindi OGNI nuovo virus ha almeno una mutazione!
L’HIV che infetta il paziente è molto diverso da quello che ha prodotto l’infezione primaria
HIV è un retrovirus (trascrittasi inversa) I Retrovirus usano la RNA polimerasi II cellulare per replicare il loro
genoma
Problema per il vaccino
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Polimorfismo Prime fasi dell’infezione:
• Tropismo per macrofagi (corecettore CCR5)
• Non induce sincizi
• Lenta replicazione
Fasi tardive dell’infezione •Tropismo per cellule T4 (corecettore fusina o CXCR4)
• Induce sincizi
• Elevata replicazione Problema per il vaccino
Polimorfismo dovuto all’alto tasso di mutazione risultante dalla mancanza dell’attività di correzione (proof-reading) della
trascrittasi inversa e della RNA pol II
Comparsa di sottopopolazioni con tropismo cellulare alterato
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Polimorfismo • La proteina virale più variabile è la gp120
• La sequenza aminoacidica in un singolo paziente varia dell’1-6%
• Fino al 30% nella popolazione
La co-infezione con diversi virus può portare a ricombinazione
• I carboidrati mascherano i siti conservati
Problema per il vaccino
Problema per il vaccino
Problema per il vaccino
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Polimorfismo
Problema per i farmaci
• Variazioni nella trascrittasi inversa portano a resistenza agli analoghi dei nucleosidi e agli inibitori non nucleosidici
• Variazioni nella proteasi portano a resistenza agli inibitori di proteasi
Problema per i farmaci