Aislamiento y caracterizacioacuten parcial de bacterioacutefagos de Salmonella spp con potencial aplicacioacuten en el biocontrol sobre
superficies
RODRIGO HERNAacuteNDEZ SANTIAGO
TESIS DOCTORAL
Doctorado en Ciencias de los Alimentos
Departament de Ciegravencia Animal i dels Aliments
Facultat de Veterinagraveria
Bellaterra Abril 2019
Aislamiento y caracterizacioacuten parcial de bacterioacutefagos de Salmonella spp con potencial aplicacioacuten en el biocontrol sobre
superficies
TESIS DOCTORAL
MC RODRIGO HERNANDEZ SANTIAGO
DIRECTORES
DIRECTOR Dr ZACARIacuteAS JIMEacuteNEZ SALAS Profesor titular del Departamento de laboratorio de geneacutetica y biologiacutea molecular UNIVERSIDAD AUTOacuteNOMA DE NUEVO LEOacuteN DIRECTORA Dra REYES PLA SOLER Catedraacutetica del Departament de ciegravencia animal i dels aliments UNIVERSITAT AUTOgraveNOMA DE BARCELONA
TUTORA Dra MANUELA HERNAacuteNDEZ HERRERO Profesora titular del Departament de ciegravencia animal i dels aliments UNIVERSITAT AUTOgraveNOMA DE BARCELONA
PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS DE LOS ALIMENTOS
Dra Reyes Pla Soler Catedraacutetica de Tecnologia dels Aliments del Departament de
Ciegravencia Animal i dels Aliments de la Universitat Autogravenoma de Barcelona
HACE CONSTAR
Que la memoria titulada ldquoAislamiento y caracterizacioacuten parcial de bacterioacutefagos de
Salmonella spp con potencial aplicacioacuten en el biocontrol sobre superficiesrdquo presentada
por Rodrigo Hernaacutendez Santiago para optar al grado de Doctor por la Universitat
Autogravenoma de Barcelona la cual ha sido realizada bajo su direccioacuten y cumple con los
requisitos para su defensa autoriza su presentacioacuten para que sea juzgada por la
comisioacuten correspondiente
Y para que conste a los efectos oportunos firma el presente certificado en Bellaterra
a 21 abril de 2019
Dra Reyes Pla Soler
Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas Profesor titular de la Facultad de Salud Puacuteblica y
Nutricioacuten de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
HACE CONSTAR
Que la memoria titulada ldquoAislamiento y caracterizacioacuten parcial de bacterioacutefagos de
Salmonella spp con potencial aplicacioacuten en el biocontrol sobre superficiesrdquo presentada
por Rodrigo Hernaacutendez Santiago para optar al grado de doctor por la Universitat
Autogravenoma de Barcelona la cual ha sido realizada bajo su direccioacuten y cumple con los
requisitos para su defensa autoriza su presentacioacuten para que sea juzgada por la
comisioacuten correspondiente
Y para que conste a los efectos oportunos firma el presente certificado en Monterrey
NL a 21 de abril de 2019
Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas
Si no puedes volar corre
Si no puedes correr camina
Si no puedes caminar gatea
Pero hagas lo que hagas siempre sigue hacia adelante
Martin Luther King jr (1929-1968)
Agradecimientos
Este trabajo se ha realizado gracias a la financiacioacuten aportada por el Programa de
mejoramiento del profesorado (PROMEP) PROMEP1035062037 UANL-326 de la
Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) dentro del programa de becas para la
formacioacuten de investigadores y a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para
el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y de
Cooperacioacuten) Programa Extranjeros II-A convocatoria 2010-2011 0000521211
A la Dra Teresa de los Reyes Pla Soler por la confianza depositada en miacute y darme la
oportunidad de ser su estudiante sin sus consejos no hubiera sido posible concluir esta
tesis
Al Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas por ser un guiacutea durante mi formacioacuten como
investigadora por sus ensentildeanzas con palabras y el ejemplo y por su apoyo en el
aspecto profesional y personal
Al Dr Joseacute Juan Rodriacuteguez Jerez por su gran apoyo acadeacutemico y por permitirme
trabajar desinteresadamente en las instalaciones y con el equipo de laboratorio
A la Dra Manuela Hernaacutendez Herrero que es una gran persona que me ha apoyado
desde el peincipio de estos estudios
A la Dra Marta Capellas Puig que me ha alentado todo el tiempo para terminar de
buena manera
Dedicatorias
Con mucho carintildeo a mi Sentildeor padre Bartolomeacute Hernaacutendez Balbuena (dagger) y a mi Sentildeora
madre Lucia Santiago Santos son un ejemplo en mi vida ya que ellos son fundamentales
en mi formacioacuten como persona
A mis hermanos Flavio Viacutector Manuel Guadalupe Hilda (dagger) porque siempre
estuvieron alliacute alentaacutendome en este trabajo con palabras experiencias etc
A mi prometida y futura esposa Dontildea Rosa Salas Martiacutenez desde que inicmos a estar
juntos siempre estaacute apoyaacutendome en todos los aspectos y en todas las cosas que he
emprendido y que con algunas locuras que se nos pueda ocurrir mas adelante nos
llevaraacute a mejores cosas cada diacutea
A mi hija Gabriela Sarahi Hernaacutendez Flores ella es lo que maacutes aprecio y espero vea
en mi un ejemplo que sirva para alentarla a ser cada diacutea mejor y sacar todas las cosas
que se proponga adelante
A mis compantildeeros y amigos Vannesa Fabio Fontecha Abel Rita Jacira Kathy
Genaro Fabio Poliseli Dora Cecilia Diana Angela Sonia Dolors Marco y Cristina por
las convivencias durante mi estancia en Espantildea que de alliacute solo me llevo grandes
recuerdos
A mis compantildeeros Mirna Patty Letty Tere Adelita Luluacute Betty Marco Arnoldo Joseacute
Luis y Gustavo que compartimos buena cantidad de tiempo gracias por las convivencias
y por los muchos trabajos que hicimos en equipo
CONTENIDO RESUMEN 1
SUMMARY 3
RESUM 5
I INTRODUCCIOacuteN 7
Presentacioacuten del proyecto 9
Justificacioacuten 10
II ANTECEDENTES 13
A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos 15
A1 Problemaacutetica 16
A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea 17
B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria 19
B1 Escherichia 19
B2 Campylobacter 20
B3 Enterobacter 21
B4 Listeria 22
B5 Salmonella 23
B51 Origen 23
B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp 25
B53 Manifestaciones cliacutenicas 27
B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis 28
C Crecimiento microbiano 30
C1 Crecimiento de los microorganismos 30
C11 Disponibilidad del agua 31
C12 Acidez y pH 31
C13 Oxiacutegeno 31
C14 Temperatura 32
D Control del crecimiento microbiano 34
D1 Agentes fiacutesicos 34
D2 Agentes quiacutemicos 35
E Fagos 35
E1 Antecedentes 35
E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos 37
E3 Clasificacioacuten de los fagos 37
E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico 39
E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten 39
F Biofilm 40
G Microscopiacutea electroacutenica 41
H Fagoterapia 42
III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 47
A Objetivo general 49
B Objetivos especiacuteficos 49
C Plan de trabajo 49
IV MATERIALES Y MEacuteTODOS 51
A Toma de muestras 53
B Obtencioacuten de fagos 54
B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55
B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55
B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas 56
B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos 56
B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC) 58
B6 Modelo de infeccioacuten 59
B7 Controles utilizados durante los ensayos 60
B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium 60
C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos 61
D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica 63
D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 64
D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM 65
V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 67
A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras 69
B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis 70
B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S Typhimurium 70
B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium 72
B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis 72
B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis 73
B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten 73
C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli 75
D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM 80
D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 81
D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable 83
VI CONCLUSIONES 89
VII BIBLIOGRAFIacuteA 93
Iacutendice de figuras
Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa 16
Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por Salmonella spp 24
Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella 24
Figura 4 Adsorcioacuten del bacterioacutefago T4 e inyeccioacuten del ADN 39
Figura 5 Diagrama general de trabajo 50
Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten bacterioacutefago-hueacutesped 59
Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten 62
Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por bacterioacutefagos 74
Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria 79
Figura 10 Imagen por TEM del bacterioacutefago MRH6 80
Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 81
Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable 82
Figura 13 Secuencia de imaacutegenes del DEM 84
Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 por el fago MRH6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86
Iacutendice de tablas
Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias 19
Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos 25
Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales 33
Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos 38
Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos 44
Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria 45
Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos 54
Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten 57
Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos 70
Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC 71
Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium 72
Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis 73
Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten 75
Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades 77
Lista de abreviaturas y acroacutenimos
ADN Aacutecido desoxirribonucleico
ARN Aacutecido ribonucleico
ADC Agar doble capa
AS Agar suave
AECID Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el
Desarrollo
ATCC American Type Culture Collection
APPCC Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control
aw Actividad del agua
BGA Agar verde brillante
BHI Infusioacuten cerebro corazoacuten
CCUG Culture Collection University of Goumltenborg
CENAVECE Centro Nacional de Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de
Enfermedades
CETC Coleccioacuten Espantildeola de Cultivos Tipo
CINSP Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica
EDTA Etilendiaminotetraceacutetico
DEM Microscoacutepica de epifluorescencia directa
EE UU Estados Unidos de Norteameacuterica
ETA Enfermedades transmitidas por alimentos
FAO Food and Agriculture Organization (Organizacioacuten de las
Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura)
FaSPyN Facultad de Salud Puacuteblica y Nutricioacuten UANL
FAUANL Facultad de Agronomiacutea UANL Unidad Mariacuten NL
FCB Facultad de Ciencias Bioloacutegicas UANL
HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points (Anaacutelisis de
Peligros y Puntos Criacuteticos de Control)
INEGI Instituto Nacional de Estadiacutestica y Geografiacutea de los Estados
Unidos Mexicanos
nd Aparente baja efectividad o halo difuso
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
PANALIMENTOS Instituto Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y
Zoonosis
PEG Polietilenglicol
SDS Dodecilsulfato soacutedico
SIRVETA Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos
SSF Solucioacuten salina fisioloacutegica
SUH o SHU Siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico
TEM Microscopio electroacutenico de transmisioacuten
TSA Agar soya de tripicasa
TSAYE TSA con 06 de extracto de levadura
TSB Caldo de soja trypticasa
UAB Universitat Autogravenoma de Barcelona
UANL Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
ZMM Zona Metropolitana de Monterrey
RESUMEN
La inocuidad alimentaria es un tema amplio y relevante que impacta directamente en todos
los segmentos de la sociedad involucra productores desarrolladores innovadores
consumidores y gobierno ademaacutes de diversos sectores como la industria la ingenieriacutea y hasta
la educacioacuten Sin embargo las nuevas tecnologiacuteas en la cadena de produccioacuten provocan que
eacutesta sea maacutes larga y compleja
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) causan alta morbilidad y varios casos
de mortalidad Entre los agentes infecciosos maacutes comunes se encuentran Salmonella spp
Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus
Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus
Los bacterioacutefagos o fagos son virus bacterianos especiacuteficos de una ceacutelula hueacutesped en la
cual se multiplican invadiendo su maquinaria de material geneacutetico Son los sistemas bioloacutegicos
maacutes abundantes del planeta se encuentran en el medio ambiente y se introducen y conviven
en la flora intestinal de otros seres cuando eacutestos ingieren diversos alimentos ya sean de tipo
animal o vegetal
El objetivo del presente trabajo fue aislar y probar la especificidad de una serie de fagos de
Salmonella spp a partir de aguas residuales para lo cual se utilizaron muestras de agua
recolectadas de diferentes localidades del aacuterea metropolitana de Monterrey N L Meacutexico La
purificacioacuten de fagos se llevoacute a cabo mediante la teacutecnica de agar doble capa (ADC) hasta
obtener placas liacuteticas uniformes y se usaron diferentes cepas de referencia de Salmonella
como cultivos indicadores
Se aislaron un total de 15 fagos putativamente distintos de los cuales al pasar las pruebas
de replicacioacuten soacutelo uno logroacute mantener la capacidad liacutetica Se seleccionoacute y purificoacute para
realizar pruebas in vitro especiacuteficas para Salmonella Se utilizoacute una concentracioacuten de fagos
de 1x1012 UFPmL para analizar al fago mediante su morfologiacutea por microscopiacutea electroacutenica
la cual se identificoacute como miembro de la familia Siphoviridae Asiacute mismo se probaron los fagos
contra Salmonella in situ en discos de acero que simulan las superficies de trabajo y para
analizar el efecto de la infeccioacuten del fago sobre Salmonella en los discos de acero inoxidable
se utilizoacute el microscopio de epifluorescencia
Para el conteo de fagos se utilizoacute los meacutetodos LIVEDEAD Para finalizar para evaluar la
efectividad del fago MRH6 que resulto liacutetico en nuestro ensayo se procedioacute a dar las
condiciones necesarias para la formacioacuten del biofilm de Salmonella sobre superficies de acero
inoxidable El fago MRH6 fue capaz de disgregar los biofilms a temperatura ambiente Las
mayores reducciones de Salmonella en un menor tiempo se obtuvieron con concentraciones
de fago mayores a 1x108 UFPmL El meacutetodo de cultivo mostroacute reducciones del patoacutegeno a
niveles indetectables sin embargo la tincioacuten vital reveloacute la presencia de ceacutelulas viables
(coloracioacuten verde) que podriacutea representar un riesgo de contaminacioacuten cruzada estas
pudieran tambieacuten presentarse por la presencia de material orgaacutenico Este trabajo con un fago
puede proporcionar una medida adyuvante para controlar la contaminacioacuten de superficies de
acero inoxidable con biofilms de Salmonella La DEM resultoacute ser una buena herramienta para
evaluar raacutepida y adecuadamente por observacioacuten y posterior anaacutelisis el efecto de los fagos
SUMMARY
Food safety is a broad and relevant issue that directly affects all aspects of society involving
producers developers innovators consumers and government as well as various sectors
such as industry engineering and even education However new technologies in the
production chain cause it to be longer and more complex
Foodborne diseases (ETA) cause high morbidity and several cases of mortality Among the
most common infectious agents are Salmonella spp Campylobacter spp Escherichia coli
Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus Clostridium botulinum Listeria
monocytogenes and Staphylococcus aureus
Bacteriophages or phages are bacterial viruses specific to a host cell in which they multiply
by invading their machinery of genetic material They are the most abundant biological systems
on the planet they can be found in the environment In organisms they enter and coexist in
the intestinal flora of other beings when they ingest various foods whether animal or vegetable
The objective of this study was to isolate and test the specificity of a series of phages of
Salmonella spp from wastewater for which water samples were collected from different
locations in the metropolitan area of Monterrey N L Meacutexico The purification of phages was
carried out by means of the double layer agar technique (ADC) until uniform lithic plates were
obtained and different Salmonella reference strains were used as indicator cultures
A total of 15 putatively different phages were isolated of which upon passing the replication
tests only one managed to maintain the lytic capacity It was selected and purified to perform
specific in vitro tests for Salmonella A phage concentration of 1x1012 PFUmL was used to
analyze the phage by means of its electron microscopy morphology which was identified as a
member of the Siphoviridae family Likewise the phages against Salmonella were tested in
situ on steel discs simulating the work surfaces and the epifluorescence microscope was used
to analyze the effect of phage infection on Salmonella on the stainless steel discs
For the phage count the LIVE DEAD Finally in order to evaluate the effectiveness of the
phage MRH6 that was lytic in our trial the necessary conditions for the formation of the
Salmonella biofilm on stainless steel surfaces were established The phage MRH6 was able
to disintegrate the biofilms at room temperature The greatest reductions of Salmonella in a
shorter time were obtained with phage concentrations greater than 1x107 PFUmL The culture
method showed reductions of the pathogen to undetectable levels however vital staining
revealed the presence of viable cells (green coloration) which could represent a risk of cross
contamination these could also be presented by the presence of organic material This work
with a phage can provide an adjuvant measure to control contamination of stainless steel
surfaces with Salmonella biofilms The DEM proved to be a dependable tool to quickly and
adequately evaluate the effect of phages by observation and subsequent analysis
RESUM
La innocuiumltat alimentagraveria eacutes un tema ampli i rellevant que impacta directament en tots els
segments de la societat involucra productors desenvolupadors innovadors consumidors i
govern a meacutes de diversos sectors com la induacutestria lenginyeria i fins a leducacioacute No obstant
aixograve les noves tecnologies en la cadena de produccioacute provoquen que aquesta sigui meacutes llarga
i complexa
Les malalties transmeses per aliments (ETA) causen alta morbiditat i diversos casos de
mortalitat Entre els agents infecciosos meacutes comuns es troben Salmonella spp
Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus
Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus
Els bacteriogravefags o fags soacuten virus bacterians especiacutefics duna cegravelmiddotlula hoste en la qual es
multipliquen envaint la seva maquinagraveria de material genegravetic Soacuten els sistemes biologravegics meacutes
abundants del planeta es troben en el medi ambient i sintrodueixen i conviuen en la flora
intestinal daltres eacutessers quan aquests ingereixen diversos aliments ja siguin de tipus animal
o vegetal
Lobjectiu del present treball va ser aiumlllar i provar lespecificitat duna segraverie de fags de
Salmonella spp a partir daiguumles residuals per a aixograve es van utilitzar mostres daigua recollides
de diferents localitats de lagraverea metropolitana de Monterrey N L Megravexic La purificacioacute de fags
es va dur a terme mitjanccedilant la tegravecnica dagar doble capa (ADC) fins a obtenir plaques liacutetiques
uniformes i es van usar diferents soques de referegravencia de Salmonella com a cultius indicadors
Es van aiumlllar un total de 15 fags possiblement diferents dels quals en passar les proves
de replicacioacute nomeacutes un va aconseguir mantenir la capacitat liacutetica Es va seleccionar i va
purificar per realitzar proves in vitro especiacutefiques per Salmonella Es va utilitzar una
concentracioacute de fags de 1x1012 UFPmL per analitzar fag mitjanccedilant la seva morfologia per
microscogravepia electrogravenica la qual es va identificar com a membre de la famiacutelia Siphoviridae Aixiacute
mateix es van provar els fags contra Salmonella in situ en discos dacer que simulen les
superfiacutecies de treball i per analitzar lefecte de la infeccioacute del fag sobre Salmonella en els
discos dacer inoxidable es va utilitzar el microscopi depifluorescegravencia
Per al recompte de fags es va utilitzar els megravetodes LIVE DEAD Per finalitzar per avaluar
lefectivitat del fag MRH6 que va resultar liacutetic en el nostre assaig es va procedir a donar les
condicions necessagraveria per a la formacioacute del biofilm de Salmonella sobre superfiacutecies dacer
inoxidable El fag MRH6 va ser capaccedil de disgregar els biofilms a temperatura ambient Les
majors reduccions de Salmonella en un menor temps es van obtenir amb concentracions de
fag majors a 1x107 UFP mL El megravetode de cultiu va mostrar reduccions del patogen a nivells
indetectables perograve la tincioacute vital revelar la presegravencia de cegravelmiddotlules viables (coloracioacute verda)
que podria representar un risc de contaminacioacute creuada aquestes poguessin tambeacute
presentar-se per la presegravencia de material orgagravenic Aquest treball amb un fag pot proporcionar
una mesura adjuvant per controlar la contaminacioacute de superfiacutecies dacer inoxidable amb
biofilms de Salmonella La DEM va resultar ser una bona eina per avaluar ragravepida i
adequadament per observacioacute i posterior anagravelisi lefecte dels fags
7
I INTRODUCCIOacuteN
Introduccioacuten
8
Introduccioacuten
9
Presentacioacuten del proyecto
Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica sobre las innovaciones en seguridad alimentaria en
Meacutexico la cual puso en evidencia la necesidad de analizar alternativas enmarcadas en el
aacutembito del uso de las tecnologiacuteas verdes lo que presentoacute la posibilidad de desarrollar un
trabajo innovador y que no se estuviera aplicando ya en el sector alimentario local o nacional
De esa manera se inician las actividades experimentales que para este trabajo doctoral se
dividieron en dos partes la primera realizada en Meacutexico y la segunda en Espantildea
En primera instancia se desarrolloacute un anaacutelisis en el Laboratorio de geneacutetica y biologiacutea
molecular del Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica (CINSP) en el Campus
Ciencias de la Salud de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) y gracias al apoyo
de Programa de mejoramiento del profesorado (PROMEP nuacutemero UANL-326) por medio de
una beca se iniciaron los estudios y asiacute se cumplioacute el primer propoacutesito que fue obtener virus
nativos contra cepas de Salmonella y purificarlos
Posteriormente para lograr los demaacutes objetivos que eran realizar la caracterizacioacuten parcial
de los fagos contra Salmonella se solicitoacute una beca a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten
Internacional para el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y
de Cooperacioacuten curso 2010-2011) con el fin de realizar una estancia de investigacioacuten y crear
oportunidades de desarrollo aprovechando las tecnologiacuteas innovadoras disponibles en la
Universitat Autoacutenoma de Barcelona (UAB) considerando ademaacutes que la alta reputacioacuten de la
institucioacuten y la supervisioacuten por parte de sus investigadores impactariacutean positivamente en el
desarrollo del trabajo y en el Curriculum Vitae del investigador y por consiguiente en su futuro
profesional como docente e investigador
Otra finalidad de este proyecto fue dejar un buen referente al concluir la estancia ya que
ello ofreceriacutea nuevas oportunidades para seguir forjando el perfil del investigador cimentaraacute
cualquier trayectoria profesional y facilitariacutea optar por un plan postdoctoral en esta misma
Universidad De esta manera se accedioacute a la beca del Programa Extranjeros II-A
Convocatoria 2010-2011 Nuacutemero 0000521211 del cual se cumplieron los objetivos
establecidos y otros maacutes por ejemplo conocer nuevas tecnologiacuteas
Siendo eacutesta una liacutenea de investigacioacuten relativamente reciente en Meacutexico se espera que
impacte en las posibilidades laborales en diversos contextos y seacutea de utilidad para sentar
precedentes para futuras liacuteneas de trabajo en dicha aacuterea
Introduccioacuten
10
Justificacioacuten
En las uacuteltimas deacutecadas los cambios ocurridos en la produccioacuten y consumo de alimentos
han tenido un impacto sobre la inocuidad alimentaria La industria en la produccioacuten masiva de
alimentos ha evolucionado de ser local a constituirse en otra donde la produccioacuten yo el
procesamiento estaacuten localizados en diferentes partes del paiacutes o del mundo Por otra parte la
poblacioacuten estaacute envejeciendo por lo que se vuelve maacutes vulnerable a problemas de salud
ademaacutes los agentes patoacutegenos son cada vez maacutes virulentos (DeWaal y Barlow 2014)
Los reportes sobre problemas gastrointestinales que recopila el Centro Nacional de
Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades (CENAVECE) indican que Nuevo
Leoacuten ha permanecido dentro de los primeros 12 lugares de casos de fiebre tifoidea y en los
primeros 14 de fiebre paratifoidea y otras salmonelosis A nivel nacional las enfermedades
infecciosas intestinales se ubican entre las primeras 10 causas de mortalidad de nintildeos en
edad escolar entre los 5 y 14 antildeos de edad (CENAVECE 2007)
Los microorganismos del geacutenero Salmonella pertenecen a la familia Enterobacteriaceae
Son bacilos o cilindros con puntas redondeadas y se diferencian de las demaacutes enterobacterias
mediante reacciones bioquiacutemicas y de aglutinacioacuten existen maacutes de 2500 serotipos todos
ellos patoacutegenos Actualmente se considera una sola especie denominada Salmonella
enterica de la cual seguacuten el esquema de Kauffmann-White se clasifican nueve serogrupos
Esta especie tiene importancia cliacutenica debido a que es la uacutenica capaz de infectar animales
homeotermos esta investigacioacuten se centra en cuatro serovariedades Salmonella enterica
serovar Typhimurium (S Typhimurium) S enterica serovar Paratyphi (S Paratyphi) S
enterica serovar Enteritidis (S Enteritidis) y S enterica serovar Typhi (S Typhi) estos
microorganismos se pueden aislar tanto de fuentes alimentarias (carne de res pollo crudo
huevo fresco carne de puerco almejas chorizos vegetales entre otros) como del medio
ambiente (suelo agua materia fecal y superficies) (Chlebicz y Śliżewska 2018 Nguendo
2018)
En Meacutexico S Enteritidis y S Typhimurium son los microorganismos aislados con mayor
frecuencia en las salmonelosis Normalmente S Enteritidis habita en el intestino de los
animales sin causar enfermedad pero puede infectar a humanos y promover diarrea voacutemito
dolor abdominal calambres y ocasionalmente insuficiencia renal y en los peores casos la
muerte (DeWaal y Barlow 2014) La contaminacioacuten de alimentos por Salmonella spp se debe
Introduccioacuten
11
a una combinacioacuten de factores relacionados con la produccioacuten a gran escala o cambios en el
manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los mismos (Uribe y Suarez 2006)
Por otra parte estaacuten los virus que pueden replicarse independientemente de los
cromosomas de una ceacutelula pero no sin su participacioacuten (Madigan y Martinko 2006) El hecho
de descubrir virus que pueden infectar y destruir bacterias fue recibido con optimismo por su
posible aplicacioacuten en usos terapeacuteuticos (McLaughlin et al 2006)
En un estudio realizado en diversos estados de Meacutexico (Coahuila Durango Estado de
Meacutexico Jalisco Morelos Oaxaca Puebla y Quereacutetaro) se ha fagotipado Salmonella spp
proveniente de huevo carne de pollo de engorde y gallinas progenitoras reproductoras de
postura comercial y productoras (Mancera et al 2004) Ademaacutes diversas investigaciones han
utilizado fagos liacuteticos para reducir la contaminacioacuten por Salmonella en pollos (canal y piel)
semillas germinadas y dulces de frutas cortadas (Goode et al 2003)
El uso de aditivos en los alimentos se ha reducido considerablemente debido al rechazo
generalizado por parte de los consumidores lo que podriacutea repercutir en un incremento en los
casos de intoxicaciones alimentarias En este contexto los fagos aportan ventajas sobre los
desinfectantes conocidos y los meacutetodos tradicionales de aplicacioacuten de friacuteo o calor ya que
pueden actuar como agentes de deteccioacuten y control bioloacutegico de bacterias patoacutegenas en
alimentos y su produccioacuten es relativamente raacutepida y econoacutemica (Atterbury et al 2003)
La utilidad de los fagos en el aacuterea de investigacioacuten es amplia una posible utilidad es ser
un instrumento para identificar cepas bacterianas especiacuteficas Tambieacuten se han utilizado para
el estudio de diversos fenoacutemenos moleculares el trabajo con estos virus permitioacute desarrollar
ensayos de placas de lisis conocer la naturaleza del ciclo de vida viral los tipos de mutaciones
geneacuteticas y los genes como segmentos de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) (Muniesa et al
2005)
Las empresas dedicadas a la biotecnologiacutea (Intralytix Omnilytics) se centran en desarrollar
productos utilizando fagos especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan las ETA y estos
productos comerciales de terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones
(Segundo 2010) Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos antildeos debido a sus
caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutefico sin dantildear la microbiota
en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros distribucioacuten de
Introduccioacuten
12
esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla (Oh y Park
2017)
En este sentido el objetivo general de este estudio es el aislamiento y caracterizarizacion
de fagos contra Salmonella a partir de diversas fuentes para su uso potencial en el control
bioloacutegico
13
II ANTECEDENTES
Antecedentes
14
Antecedentes
15
A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos
A nivel internacional la produccioacuten de alimentos y todos los mecanismos tecnoloacutegicos
involucrados en su procesamiento implican ademaacutes de la optimizacioacuten de los tiempos y de
la calidad un riesgo para la adquisicioacuten de enfermedades inherentes a la misma adopcioacuten
de nuevas tecnologiacuteas (Weaver et al 2017)
La OMS (2017) estima que las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de
muerte de nintildeos menores de cinco antildeos matan a 525000 nintildeos menores de cinco antildeos
cada antildeo una proporcioacuten significativa de las enfermedades diarreicas se puede prevenir
mediante el acceso al agua potable y a servicios adecuados de saneamiento e higiene
ademaacutes de que en todo el mundo se producen unos 1700 millones de casos de
enfermedades diarreicas infantiles cada antildeo
Seguacuten la OMS (2017) existen diferentes condiciones que propician el desarrollo de las
ETA Como son las de tipo bioloacutegico producidos por hongos o bacterias causantes de
enfermedades ya sea por sus metabolitos o toxinas virus o huevecillos de paraacutesitos asiacute
como los venenos de algunos peces y plantas Las de tipo quiacutemico como productos de
limpieza o desinfeccioacuten pesticidas toxinas marinas insecticidas o venenos y fiacutesicos cuando
en la materia prima de los alimentos se encuentran objetos como vidrios metal piedras
grapas barniz de untildeas joyeriacutea cabellos o cualquier elemento extrantildeo
De acuerdo con el Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos (SIRVETA) ndashdesarrollado por el Instituto
Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y Zoonosis (PANALIMENTOS)ndash ocurrieron 1683
brotes de ETA en Meacutexico que ocasionaron 53860 casos de enfermedades y provocaron
207 muertes mientras que en los demaacutes paiacuteses de Ameacuterica Latina se produjeron durante el
mismo periacuteodo 6324 brotes que provocaron 228579 casos y 314 muertes (Forsythe y
Hayes 2002) Cabe aclarar que eacutestos son soacutelo los brotes notificados por la autoridad
competente El sistema utilizado internacionalmente para obtener alimentos inocuos es el
APPCC (Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control) o HACCP (por sus siglas en ingleacutes
Hazard Analysis and Critical Control Points) que se puede implementar en cualquier tipo de
industria y permite prevenir controlar y eliminar cualquier peligro antes de consumir los
alimentos (Rodriacuteguez Torrens et al 2015)
En Meacutexico el Distintivo H es un programa implementado por los servicios alimentarios
Antecedentes
16
oficiales mediante el cual se ofrece a los clientes alimentos seguros El Centro Nacional de
Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades de Meacutexico (CENAVECE) advierte
que uno de los problemas de salud maacutes importantes lo constituyen los trastornos
gastrointestinales cuya mortalidad predomina entre los 5 y los 14 antildeos Entre 2006 y 2012
el Estado de Nuevo Leoacuten ha permanecido entre los primeros 7 lugares de casos de diarrea
(CENAVECE 2018)
La figura 1 muestra la distribucioacuten de la incidencia en Meacutexico la cual estaacute asociada a la
densidad demograacutefica y la accesibilidad a servicios de salud que facilitan el registro es asiacute
que son precisamente las entidades federativas con mayor poblacioacuten quienes registran
nuacutemeros maacutes altos
Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa en
Meacutexico 2010-2012 (CENAVECE 2018)
A1 Problemaacutetica
La inocuidad alimentaria es una preocupacioacuten mundial que se refleja en el incremento
de reportes y noticias relacionadas con la contaminacioacuten de los alimentos difundidos en
diversos paiacuteses a su vez estos productos son retirados del mercado lo que provoca
peacuterdidas por varios cientos de millones de doacutelares El Codex Alimentarius indica que las ETA
y los dantildeos provocados por los alimentos son en el mejor de los casos desagradables y
Antecedentes
17
en el peor fatales y pueden influir negativamente en el comercio y la confianza de los
consumidores Por consiguiente es imprescindible un control eficaz de la higiene Todos los
eslabones de la cadena alimentaria ndashfabricantes elaboradores manipuladores y
consumidores de alimentosndash son responsables del control de los riesgos microbioloacutegicos
desde la explotacioacuten agriacutecola o ganadera hasta el consumidor final Desde esta oacuteptica el
anaacutelisis de riesgos deberiacutea aplicarse dentro de un contexto estrateacutegico organizativo y
operacional reconocido si bien en el proceso puede haber elementos comunes establecer
un nivel apropiado de proteccioacuten en esos sectores puede representar las maacuteximas
diferencias (Atterbury et al 2003)
La OMS ha identificado siete microorganismos patoacutegenos ndashC jejuni C perfringens E
coli 0157H7 L monocytogenes Salmonella spp S aureus y T gondiindash que causan entre
123 y 33 millones de casos de infeccioacuten solamente en los EE UU lo que representa
peacuterdidas econoacutemicas de entre 5500 y 34900 millones de doacutelares Ademaacutes resalta que su
incidencia podriacutea ser de 300 a 350 veces mayor de lo que indican las estadiacutesticas dado que
soacutelo se notifica un nuacutemero relativamente pequentildeo de casos de ETA Se estima que 70 de
los 1500 millones de episodios de diarrea son causados por alimentos en mal estado Es
posible que en los paiacuteses en desarrollo se notifique a las autoridades sanitarias una
proporcioacuten de casos auacuten inferior principalmente por pobreza y escasez de recursos a
disposicioacuten de los servicios de gestioacuten de la inocuidad alimentaria e inspeccioacuten de alimentos
(Van de Venter 2000)
A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea
La OMS estima que el 88 de los casos de diarrea a nivel mundial son atribuibles al
agua el saneamiento y la higiene todos los aspectos de inocuidad de los alimentos estaacuten
relacionados con estos factores En menor medida la enfermedad se transmite a traveacutes de
otras viacuteas por ejemplo el aire y alrededor del 94 de los casos son atribuibles al
saneamiento ambiental el total de fallecimientos se calcula en maacutes de 15 millones
principalmente en nintildeos en los paiacuteses desarrollados el promedio es ligeramente menor a
90 La diarrea atribuible al agua y saneamiento inapropiado representa 53 de las
muertes totales y 35 en nintildeos europeos de 0-14 antildeos y es ademaacutes una de las causas
principales de malnutricioacuten (Pruumlss-Uumlstuumln y Corvalaacuten 2006)
Antecedentes
18
Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud puacuteblica en el mundo
especialmente en paiacuteses en desarrollo Su alta incidencia se debe en gran parte a la
ingestioacuten de alimentos contaminados con microorganismos patoacutegenos como Salmonella
que causa episodios de diarrea aguda Salmonella spp es uno de los patoacutegenos enteacutericos
maacutes frecuentes tanto en paiacuteses desarrollados como subdesarrollados Dependiendo de la
especie tamantildeo del inoacuteculo factores de virulencia expresados por la cepa hueacutesped
involucrado estado inmunoloacutegico del paciente e intervencioacuten meacutedica puede ocasionar una
infeccioacuten gastrointestinal de media a severa hasta una infeccioacuten sistemaacutetica que
comprometa la vida del paciente (Fernaacutendez 2008)
Otros microorganismos que tambieacuten pueden contaminar el agua y los alimentos como
bacterias (Bacillus cereus Clostridium botulinum Campylobacter jejuni Vibrio cholera) virus
(Norwalk Rotavirus Hepatitis A) y paraacutesitos (Entamoeba histolytica Cryptosporidium
parvum Toxoplasma gondii) pueden transmitirse tambieacuten de una persona a otra como
resultado de una higiene deficiente (Freedman et al 2015)
Estudios de empresas dedicadas exclusivamente a la crianza de cerdos reportan
epidemias como el virus de la diarrea porcina la cual posteriormente se transmite a los
consumidores de estas carnes contaminadas ya sea por contacto con las heces o por
consumo de carnes contaminadas lo cual implica tambieacuten una peacuterdida econoacutemica para la
industria alimentaria resaltando la necesidad de establecer medidas preventivas y
correctivas seguacuten sea el caso (Huss et al 2017)
Seguacuten la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO
por sus siglas en ingleacutes Food and Agriculture Organization) las toxiinfecciones alimentarias
son la segunda causa de morbilidad pero muchas permanecen sin declarar quizaacutes por su
mediana severidad y recuperacioacuten raacutepida salvo el coacutelera Los alimentos son susceptibles a
contaminacioacuten de todo tipo la fuente de agentes causales suele ser el tracto gastrointestinal
de individuos reservorios o las heces de animales y humanos infectados o bien agua
corrompida que por deficiencias sanitarias contamina carne fresca pescados moluscos
pasteles de crema y leche no pasteurizada entre otros productos (Riacuteos et al 2012) como
se puede observar en la tabla 1
Antecedentes
19
Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias (Riacuteos et al 2012)
Agente Periacuteodo de
incubacioacuten Fuente Agente patoacutegeno
Salmonella spp 8-24 h Aves huevos mascotas
(tortugas lagartos pollos) Bacteria y endotoxina
E coli
enterotoxigeacutenica 24-72 h
Agua y alimentos
contaminados
Enterotoxina
termoestable
V cholerae 24-72 h Alimentos contaminados Enterotoxina termolaacutebil
Shigella spp 24-72 h Agua y alimentos
contaminados Bacteria y endotoxina
C jejuni 1-7 d Leche aves de corral y
agua no potable
Bacteria y Enterotoxina
termolaacutebil
Yersinia spp 1-7 d Carne de cerdo leche Bacteria y Enterotoxina
B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria
La historia referente a las toxiinfecciones alimentarias se comienza a documentar y
legislar en el siglo X con el botulismo en Bizanzio y documentos sobre el ergotismo en el
siglo XVI En el siglo XIX aparecen los alimentos enlatados y Louis Pasteur asocia el
deterioro de los alimentos con las bacterias En el siglo XX se produce un desarrollo
espectacular de la microbiologiacutea de los alimentos con el establecimiento de la etiologiacutea de
las toxiinfecciones alimentarias el comienzo de una nueva era de la quiacutemica e ingenieriacutea
alimentaria Aunado a los movimientos migratorios de las personas la diversificacioacuten de
alimentos la produccioacuten masiva de alimentos y la facilidad de transporte desde puntos
lejanos entre la produccioacuten y preferencia en el consumo de alimentos aunadas a la
capacidad que tienen los microorganismos para evolucionar y adaptarse a su medio
ambiente hacen pensar en estos microorganismos como patoacutegenos emergentes (DeWaal y
Barlow 2014)
B1 Escherichia
Las cepas de E coli se pueden diferenciar seroloacutegicamente por los antiacutegenos somaacuteticos
(O) flagelares (H) y capsulares (K) Ademaacutes pueden hallarse fimbrias y estructuras
Antecedentes
20
emparentadas que desempentildean un papel en la patogenia Actualmente se reconocen cinco
grupos de E coli causantes de diarrea en funcioacuten del siacutendrome que provocan cuyas
diferencias estaacuten codificadas por plaacutesmidos (Wright et al 2017) Los diferentes tipos son
E coli enteropatoacutegeno (EPEC) es responsable de la diarrea acuosa en lactantes
Produce voacutemitos fiebre y diarrea acuosa con mocos pero sin sangre Coloniza las
microvellosidades de todo el intestino produciendo la lesioacuten de ldquoadhesioacuten y erosioacutenrdquo en
el ribete en cepillo de la membrana de la vellosidad Afecta a adultos y nintildeos menores de
dos antildeos siendo este rango de edad el principal factor de riesgo
E coli enterotoxigeacutenico (ETEC) es el causante de la llamada vulgarmente ldquodiarrea
del viajerordquo se manifiesta con diarrea acuosa como agua de arroz y poca fiebre
Coloniza la porcioacuten proximal del intestino delgado Afecta a adultos y nintildeos son una causa
frecuente de diarrea en lactantes de paiacuteses en desarrollo asiacute como la causa maacutes comuacuten
de diarrea en individuos de paiacuteses industrializados que viajan a zonas menos
desarrolladas del mundo
E coli enteroinvasor (EIEC) coloniza el colon origina fiebre y diarrea profusa con
heces que contienen mocos y estriacuteas sanguinolentas Presenta un plaacutesmido de 120-140
mD conocido como plaacutesmido invasivo que lleva todos los genes necesarios para la
virulencia Al igual que ETEC pero afecta principalmente a adultos
E coli enterohemorraacutegico (EHEC) origina diarrea sanguinolenta colitis hemorraacutegica
siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico (SUH o SHU) y puacuterpura trombocitopeacutenica En este grupo se
incluye E coli verotoxigeacutenico (VTEC) serotipos O157 O26 O111 Afecta principalmente
a nintildeos el principal factor de riesgo es el consumo de carne sin la coccioacuten adecuada
E coli enteroagregativo (EAggEC) posee caraacutecter clonal diferenciaacutendose dos clones
relacionados (1 y 2) Dentro de cada grupo estaacute presente una variedad concreta de
antiacutegenos O mientras que los antiacutegenos H se conservan
En los reportes cientiacuteficos sobre E coli se refieren a las plantas como otra fuente de
infeccioacuten especiacuteficamente en la espinaca (Spinacia oleracea) y lechuga (Lactuca sativa) Se
recomienda igualmente estudiar profundamente los cultivos y los tejidos vegetables y
animales ya que se deben considerar como paraacutemetros de riesgo para la inocuidad de los
alimentos (Fernaacutendez Ferran et al 2003 Wright et al 2017)
B2 Campylobacter
Campylobacter spp es un bacilo delgado gram negativo (05-08 microm x 02-05 microm) y
Antecedentes
21
microaeroacutefilo (necesita 3-5 de O2 y 2-10 de CO2) Su morfologiacutea puede variar entre
vibrioacutenica (bacilos curvados) espirilar en forma de rosquilla de S y cocoide de tal forma
que en fase logariacutetmica de crecimiento las ceacutelulas tienen forma espiral o curvada pero a
medida que los cultivos envejecen adquieren formas esfeacutericas Moacutevil con un uacutenico flagelo
polar que presenta de dos a tres veces el largo de la ceacutelula Aunque hay diversas especies
de Campylobacter causantes de enfermedades C jejuni C coli y C lari son las especies
que se aiacuteslan con mayor frecuencia en casos de gastroenteritis humana siendo C jejuni la
responsable de la mayoriacutea de las toxiinfecciones alimentarias 89-93 de las
toxiintoxicaciones (OMS 2017)
Las especies C coli y C lari son semejantes a C jejuni su diferencia se basa en pruebas
bioquiacutemicas C coli no es capaz de hidrolizar el piruvato y C lari es capaz de crecer en
presencia de 30 microgramos de aacutecido nalidiacutexico (Haddad et al 2013) La movilidad la
quimiotaxis y los flagelos son factores importantes en la virulencia pues de ellos depende la
colonizacioacuten del epitelio intestinal Campylobacter produce una enterotoxina parecida a la
toxina coleacuterica que tambieacuten juega un papel importante en la patogenia (Nichols 2005) C
jejuni puede sobrevivir de 2 a 4 semanas en condiciones de baja humedad oxigenacioacuten y
temperaturas de 4ordmC superando muchas veces el tiempo de vida uacutetil del producto Asimismo
puede perdurar de 2 a 5 meses a -20ordmC pero a temperatura ambiente apenas dura algunos
diacuteas (Khan et al 2013)
C jejuni y C coli son sensibles a diversos agentes antimicrobianos como los macroacutelidos
los aminoglucoacutesidos el cloranfenicol y la tetraciclina La eritromicina ha sido el antibioacutetico de
eleccioacuten para tratar las infecciones del tracto intestinal Al igual que en Salmonella el control
de Campylobacter se debe realizar tanto en el sector agropecuario como en los
establecimientos alimentarios por lo que los controles especificados para Salmonella
podriacutean extrapolarse a este microorganismo Un aspecto importante de su control reside en
la refrigeracioacuten de las aves ya que la baja temperatura junto con la desecacioacuten superficial
que se produce reduce significativamente la incidencia y los recuentos de Campylobacter
viables incluso en canales altamente contaminadas (Fernaacutendez 2008)
B3 Enterobacter
Conocido antiguamente como Cronobacter spp incluye varias especies de patoacutegenos
emergentes relacionados con brotes de meningitis septicemia y enterocolitis necrotizante
especialmente en neonatos y nintildeos La tasa de mortalidad de estos brotes es alta entre 20
Antecedentes
22
y 80 y los supervivientes suelen sufrir severos desoacuterdenes neuroloacutegicos (Grimont y
Grimont 2006)
E sakazakii es un bacilo moacutevil no esporulado gram negativo que ha sido encontrado en
alimento para bebeacutes es maacutes resistente a los cambios osmoacuteticos y a la sequiacutea que otros
miembros de la familia Enterobacteriaceae y se asocia con casos esporaacutedicos de sepsis
meningitis cerebritis y enterocolitis necrotizante La mayoriacutea de las infecciones se observan
en bebeacutes con bajo peso al nacer y que son alimentados de forma insalubre La mortalidad
ha disminuido a menos de 20 en los uacuteltimos antildeos Este microorganismo no se ha
encontrado presente en la foacutermula laacutectea tampoco existe evidencia de la transmisioacuten de
persona a persona o un medio general de difusioacuten ambiental (Vanegas et al 2009)
B4 Listeria
L monocytogenes estaacute muy difundida en la naturaleza en la que suele adoptar un ciclo
saprofiacutetico en estrecha relacioacuten con el suelo Ademaacutes se ha encontrado en aguas
continentales sedimentos marinos material vegetal en descomposicioacuten forrajes heces
humanas y animales y aguas residuales de explotaciones animales entre otros ambientes
lo que explica su presencia en alimentos crudos Epidemioloacutegicamente se caracteriza por su
ubicuidad sobreviviendo en tierra huacutemeda hasta 500 diacuteas en funcioacuten de la temperatura En
heces o aguas residuales mantenidas a temperatura de refrigeracioacuten sobrevive maacutes de seis
antildeos este periodo se reduce si se mantiene a temperatura ambiente (Guenther et al 2009)
Listeria spp son bacilos gram positivos de forma regular y con forma de vara corta
Algunas veces pueden tener forma cocoide apareciendo como ceacutelulas individuales o en
cadenas cortas Son moacuteviles entre 20-25ordmC pero no a 37ordmC Existen seis especies de Listeria
descritas L monocytogenes L innocua L welshimeri L seeligeri L grayi y L ivanovii
subespecie ivanovii y subespecie londoniensis Las cepas patoacutegenas de L monocytogenes
producen la listeriolisina O responsable de la hemoacutelisis-β y de la destruccioacuten de las ceacutelulas
fagocitarias es una hemolisina que segrega la bacteria a causa de la disminucioacuten de pH
(Liu 2006)
L monocytogenes tolera y se multiplica en concentraciones altas de NaCl contando con
la posibilidad de sobrevivir durante un antildeo en ambientes con una concentracioacuten de 16 su
tolerancia aumenta al disminuir el pH o la temperatura del medio Los tratamientos para su
inactivacioacuten son de 617ordmC35min 70ordmC20min 78ordmC15min u 80ordmC5min favoreciendo su
Antecedentes
23
resistencia al calor con la presencia de grasas Se multiplica entre 0 y 4ordmC las temperaturas
bajas ejercen un efecto protector de tal manera que en condiciones de acidez su inactivacioacuten
es maacutes lenta en refrigeracioacuten que a temperatura ambiente (Leverentz et al 2003) La acidez
influye en la capacidad de Listeria para sobrevivir a la congelacioacuten (temperaturas inferiores
a -47ordmC) y almacenamiento a menos de -18ordmC en carne mostrando una disminucioacuten en la
recuperacioacuten de ceacutelulas viables que han sido dantildeadas por el friacuteo (Wu et al 2015)
B5 Salmonella
B51 Origen
Salmonella tiene su origen principal en el tracto intestinal de animales fundamentalmente
las aves y los porcinos y pueden acabar contaminando las carnes crudas el pollo crudo los
productos marinos crudos o el huevo Los brotes de Salmonella estaacuten asociados al consumo
de alimentos elaborados con huevo crudo y siguen siendo frecuentes a pesar de conocerse
el riesgo que representa su consumo de las medidas legales adoptadas y de los programas
de educacioacuten sanitaria dirigidos a disminuir su incidencia Este geacutenero pertenece a la familia
Enterobacteriaceae fue descrito a principios del siglo XX por el bacterioacutelogo estadounidense
Theobald Smith (Zaidi et al 2006) En la figura 2 se muestran los factores de virulencia y
en la figura 3 se presenta la clasificacioacuten de Salmonella enterica con las diferentes
subespecies y serovares que se aiacuteslan maacutes frecuentemente
Antecedentes
24
Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por
Salmonella spp (Brenner et al 2000)
Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella (Brenner et al 2000)
Antecedentes
25
B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp
La mayoriacutea de los miembros de este geacutenero se encuentra en el tracto intestinal del
hombre y los animales como bacterias patoacutegenas o comensales Estaacute integrado por bacilos
gram negativos anaerobios facultativos y no esporulados La mayor parte de los serotipos
conocidos son moacuteviles mediante flagelos peritricos Se conocen maacutes de 2460 serotipos
muchos de ellos patoacutegenos para el ser humano (Chlebicz y Śliżewska 2018)
Son bacterias invasoras enterotoxigeacutenicas y estaacuten ampliamente diseminadas en todo el
mundo su temperatura ideal de sobrevivencia entre los 15 y los 35degC (mesoacutefilas) y en una
amplitud de pH de 45 a 9 Los microorganismos de este geacutenero se distribuyen en seis
grupos se han definido mediante biotipado hibridacioacuten DNA-DNA anaacutelisis de la secuencia
del RNA ribosomal 16S y por ldquomultilocus enzyme electrophoresisrdquo (MLEE) (Brenner et al
2000) La serotipificacioacuten se utiliza para diferenciar maacutes allaacute del nivel de subespecie como
puede observarse en la tabla 2
Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos (Brenner et al 2000)
Grupo Microorganismo
A S Paratyphi Al
B S Typhimurium S Bredeney
C1 S Choleraesuis S Montevideo S Oranienburg
C2 S Newport
D S Typhi S Enteritidis S Dublin S Gallinarum
E S Butantan S Anatum S Give
Salmonella serotipo Typhi es la causante de la fiebre tifoidea presentando siacutentomas como
son fiebre de intensidad variable cefalea diarrea estrentildeimiento tos naacuteuseas y voacutemitos
anorexia dolor abdominal y escalofriacuteos Mientras que los demaacutes serotipos considerados no
tifoidicos presentan un estado asintomaacutetico En el antildeo 2000 los serotipos aislados con
mayor frecuencia en EE UU fueron S Typhimurium S Enteritidis y S Newport (Dunkley et
Antecedentes
26
al 2009) En Meacutexico los serotipos de Salmonella spp identificados con mayor frecuencia
en los servicios de salud fueron S Typhimurium (204) y S Enteritidis (183) (Guenther
et al 2009)
La salmonelosis se produce por la ingestioacuten de alimentos o bebidas contaminados por
Salmonella se manifiesta como una enterocolitis aguda y se caracteriza por presentar
siacutendromes febriles asociados a manifestaciones gastrointestinales o sisteacutemicas con
frecuencia severas (Figueroa y Verdugo 2005 Fernaacutendez 2008) El cuadro cliacutenico se
localiza baacutesicamente en el iacuteleo terminal y el intestino grueso La enfermedad se manifiesta
a traveacutes de diferentes fases En la primera fase la infeccioacuten se limita a la mucosa intestinal
en la siguiente la bacteria invade el tejido linfaacutetico local y le sigue una fase de bacteriemia
durante la cual la mayoriacutea de las bacterias son fagocitadas por macroacutefagos del hiacutegado y el
bazo (Calva et al 2006 Bettini et al 2012)
Con frecuencia el meacutedico hace un diagnoacutestico basaacutendose en el cuadro cliacutenico del
paciente pero sin contar con los estudios microbioloacutegicos necesarios para establecer un
diagnoacutestico certero cuando se presenta infeccioacuten por Salmonella inicia una fase de
crecimiento bacteriano intracelular el cual despueacutes de varios diacuteas provoca la liberacioacuten de
gran cantidad de patoacutegenos al torrente sanguiacuteneo (Zaidi et al 2006)
La salmonelosis es una enfermedad aguda de distribucioacuten mundial Afecta a todos los
grupos de edad con mayor incidencia en los extremos de la vida provocando infecciones
en forma endeacutemica o en brotes epideacutemicos de intoxicacioacuten alimentaria que en ocasiones
abarcan amplias zonas geograacuteficas debido a las extensas cadenas de distribucioacuten de
alimentos existentes hoy en diacutea (Fernaacutendez 2008)
Para la salud puacuteblica la salmonelosis tiene un impacto socioeconoacutemico tanto en los paiacuteses
en desarrollo como en los paiacuteses desarrollados Ademaacutes al no recibir tratamiento puede
ser causante del siacutendrome de Reiter el cual se manifiesta por dolor en articulaciones
irritacioacuten en los ojos dolor al orinar y puede durar meses o antildeos desencadenaacutendose una
artritis croacutenica (CFSPH 2005) Desde la deacutecada de los ochenta la incidencia de
salmonelosis de origen alimentario ha aumentado considerablemente en Meacutexico Este
incremento es resultado de una combinacioacuten de factores como la calidad del agua utilizada
para riego y el manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los alimentos (Zaidi
et al 2006)
Antecedentes
27
Un meta-anaacutelisis (revisioacuten sistemaacutetica en la cual se combinan matemaacuteticamente los
resultados de varios estudios para contestar una misma pregunta) realizado recientemente
confirma que Salmonella resiste a antibioacuteticos empleados en los alimentos de origen animal
ya que pueden estar contaminados con este microorganismo es resistente a 3 antibioacuteticos
como la amoxicilina las sulfonamidas y las tetraciclinas ya que son ampliamente usados en
produccioacuten animal (Ejo et al 2016)
B53 Manifestaciones cliacutenicas
El cuadro cliacutenico normalmente es de 2 a 5 diacuteas aunque en ocasiones persiste varias
semanas La gravedad de los siacutentomas variacutea considerablemente siendo mayor en nintildeos y
ancianos Si el microorganismo pasa desde el intestino a la corriente sanguiacutenea y llega a
otras partes del cuerpo puede ocasionar la muerte si la persona afectada no es tratada
raacutepidamente La mayoriacutea de las muertes causadas por esta bacteria han ocurrido entre
ancianos que viven en residencias La tasa de mortalidad es baja inferior a 1 en paiacuteses
desarrollados pero suelen producirse de 40-50 muertes al antildeo especialmente entre nintildeos
ancianos o personas inmunodeprimidas Las excretas de los enfermos contienen gran
cantidad de la especie de Salmonella implicada al comienzo de la enfermedad la cifra inicial
decrece seguacuten transcurre el tiempo (DeWaal y Barlow 2014)
El estado de portador se refiere a la condicioacuten en que las personas curadas pueden
eliminar Salmonella en sus heces durante meses La mitad de los individuos afectados
excretan este patoacutegeno de 2-4 semanas posteriores a su curacioacuten cliacutenica entre 10 y 20
continuacutean durante 4-8 semanas unos pocos durante 3 meses y en raras ocasiones se
prolonga hasta 6 meses El microorganismo puede eliminarse tambieacuten por la orina La dosis
infectante capaz de desencadenar la salmonelosis humana es alrededor de 1times105 UFCmL
dependiendo de factores como tipo de alimento virulencia de la cepa involucrada y
susceptibilidad del individuo Entre las especies altamente virales se encuentran la S Dublin
y sobre todo S Enteritidis (Callaway et al 2008)
El incremento del serotipo de S Enteritidis en los casos de salmonelosis humana al
contrario de otras del geacutenero Salmonella representa un importante problema de salud
puacuteblica en muchos paiacuteses ya que este serotipo infecta a gallinas aparentemente sanas que
posteriormente transmiten las enfermedades al hombre Si se consumen huevos crudos o
Antecedentes
28
poco cocidos el microorganismo podriacutea causar la enfermedad El nuacutemero de casos de
salmonelosis se incrementa durante el verano (Parra et al 2002 Callaway et al 2008
Fernaacutendez 2008)
B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis
Gran parte de las salmonelosis se deben al consumo de alimentos de origen animal
(carnes de abasto pollo mariscos pescado leche y huevos asiacute como ovoproductos y
productos laacutecteos no pasteurizados) o de origen vegetal que se contaminan con productos
en malas condiciones de salubridad o mal manipulados Muchos alimentos sobre todo los
de origen animal o contaminados con aguas residuales han servido como vehiacuteculos en
brotes de salmonelosis La carne de matadero estaacute contaminada habitualmente con
Salmonella su incidencia es mayor en las canales de ganado y otros animales debido por
ejemplo a la contaminacioacuten por el contenido intestinal de la res viva cuyas heces manchan
su piel pelo y patas al llegar al matadero Las canales de cerdo se contaminan durante las
operaciones de escaldado y pelado La contaminacioacuten entre las mismas canales y de eacutestas
a utensilios superficies de trabajo y manos de los que las manipulan es faacutecil Otro de los
principales reservorios de Salmonella es la carne de aves de corral La contaminacioacuten de las
canales de pollo y otras aves procede igualmente del tracto intestinal o del material fecal
de los animales que manchan sus patas y plumas Las etapas criacuteticas de la contaminacioacuten
de las canales aviares estaacuten en el desplumado y la evisceracioacuten tambieacuten es comuacuten la
contaminacioacuten cruzada a traveacutes de las manos de los operarios equipo y utensilios utilizados
en la preparacioacuten y troceado de las canales (Marcus et al 2004)
Son raras las salmonelosis adquiridas directamente de carnes bien cocinadas la mayoriacutea
de los brotes se deben a una coccioacuten insuficiente o por contaminacioacuten posterior a su
preparacioacuten Las carnes elaboradas mediante fermentacioacuten (salami chorizo y salchichoacuten)
pueden ser causa de brotes de salmonelosis teniendo en cuenta que las especies que
integran este geacutenero pueden sobrevivir al proceso de fermentacioacuten (Forsythe y Hayes
2002)
Como se mencionoacute anteriormente otro alimento que se asocia con frecuencia a
Salmonella es el huevo La contaminacioacuten se produce por dos viacuteas a traveacutes de la caacutescara
contaminada y por viacutea transovaacuterica en aves infectadas (gallina pata pava) En el primer
caso la superficie de la caacutescara se contamina siempre a su paso por la cloaca o cuando el
Antecedentes
29
huevo estaacute en un ambiente fecal los huevos rotos o manchados constituyen un peligro en
la propagacioacuten de especies de Salmonella (EFSA 2014)
La contaminacioacuten partiendo de la caacutescara se produce si eacutesta mantiene un grado de
humedad apropiado y existe una temperatura diferencial significativa entre el contenido del
huevo y el ambiente La diferencia de temperaturas entre el huevo maacutes elevada y el
ambiente favorece la absorcioacuten de los microorganismos como Salmonella Tambieacuten se
transmite sobre la caacutescara por contaminacioacuten cruzada a traveacutes de los manipuladores que
han tenido contacto con superficies infectadas durante el transporte y almacenamiento de
los mismos en lugares con precarias condiciones de higiene (Ejo et al 2016) Salmonella
es causal de graves enfermedades que son trasmitidas por productos derivados de huevo
contaminado y la asociacioacuten entre la infeccioacuten del tracto reproductivo de los pollos fue un
fuerte incentivo para desarrollar programas de prevencioacuten (Jawale y Lee 2014)
La leche cruda puede albergar Salmonella y ser causa de brotes de salmonelosis se
contamina a traveacutes del pezoacuten y por las manos del ordentildeador la pasteurizacioacuten elimina la
presencia de la bacteria Entre los productos laacutecteos se han identificado como causa de
brotes de salmonelosis la leche en polvo el queso los helados y maacutes raramente la
mantequilla todos ellos por fallos en su elaboracioacuten Salmonella se destruye o inactiva
durante la fermentacioacuten de alta acidez como el yogur y el queso de pH inferior a 45 En el
caso del queso poco aacutecido (pH superior a 49) la Salmonella puede desarrollarse en
cualquier etapa de su elaboracioacuten (Mastroeni y Maskell 2006)
Entre las verduras cualquiera puede contener Salmonella cuando se cultivan con aguas
residuales contaminadas o son fertilizadas con abonos de origen animal Algunos vegetales
como los berros han sido causa de brotes de salmonelosis Por otro lado los mariscos se
contaminan con Salmonella cuando se criacutean en aguas residuales contaminadas por lo que
han sido la causa de numerosos brotes en todo el mundo la depuracioacuten es la medida
preventiva adecuada Diferentes alimentos se han identificado como portadores de
Salmonella entre ellos coco cebada harina de cereales pimienta blanca y negra pasta
cacao en polvo y chocolate (Fernaacutendez 2008) La FDA (2017) reportoacute el aumento de las
pruebas de las cuales ha identificado papayas de dos granjas que resultaron positivas para
las cepas de Salmonella que coinciden con enfermedades no relacionadas con este brote
Antecedentes
30
C Crecimiento microbiano
El crecimiento microbiano puede definirse como un incremento en los constituyentes
celulares que ocasiona un aumento del nuacutemero de ceacutelulas de los microorganismos que se
multiplican por gemacioacuten y fisioacuten binaria En el uacuteltimo caso las ceacutelulas individuales se
agrandan y dividen para originar dos ceacutelulas hijas de un tamantildeo aproximadamente igual
(Atlas y Bartha 2002)
C1 Crecimiento de los microorganismos
Todos los mamiacuteferos incluyendo los seres humanos se adaptan a la vida del mundo
microbiano Louis Pasteur Robert Koch Eacutelie Metchnikoff y Theodor Escherich entre otros
investigadores sentaron las bases conceptuales sobre las interacciones microbio-hueacutesped
Pasteur postuloacute que los microbios eran necesarios para la vida humana y Metchnikoff afirmoacute
que la composicioacuten de la flora microbiana era esencial para el bienestar del hueacutesped
Igualmente Escherich estaba convencido de que el conocimiento preciso de la flora
endoacutegena era esencial no soacutelo para la comprensioacuten de la fisiologiacutea de la digestioacuten sino para
la comprensioacuten de la patologiacutea y terapia de enfermedades microbianas intestinales A pesar
de estas primeras ideas soacutelo recientemente los cientiacuteficos han desarrollado meacutetodos que
permiten caracterizar directamente los mecanismos moleculares que subyacen a la creacioacuten
y mantenimiento de diversos ecosistemas microbianos (Falk et al1998)
El crecimiento de una poblacioacuten bacteriana resulta de la suma de ciclos celulares de todos
sus individuos y suele ser asincroacutenico puesto que cada microorganismo se encuentra en un
punto diferente del ciclo celular Por consiguiente en un momento determinado en una
poblacioacuten se encuentran ceacutelulas que acaban de dividirse otras estaacuten replicando su ADN y
elongaacutendose y otras estaacuten iniciando la divisioacuten celular (Melbinger et al 2015)
El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza en la mayoriacutea de los
casos mediante la produccioacuten de colonias aisladas en cultivos soacutelidos El crecimiento
explosivo de las bacterias produce un gran nuacutemero a partir de una uacutenica ceacutelula inicial de
forma que tras un periacuteodo de tiempo de incubacioacuten en las condiciones ambientales
adecuadas se produce una colonia de individuos iguales Para que un microorganismo
crezca necesita nutrientes que le aporten energiacutea y elementos quiacutemicos para la siacutentesis de
sus constituyentes celulares De acuerdo a la fuente de carbono que utilizan los
Antecedentes
31
microorganismos se clasifican en autoacutetrofos si es el CO2 atmosfeacuterico (microorganismos que
fotosintetizan) y heteroacutetrofos si utilizan carbono orgaacutenico (Ouyang y Li 2013)
C11 Disponibilidad del agua
El agua es un factor importante para el crecimiento microbiano se requiere para crecer y
llevar a cabo las funciones metaboacutelicas de lo contrario los microorganismos se deshidratan
o mueren La aw depende de la concentracioacuten de solutos y de la cantidad de agua disponible
en el medio ambiente La mayoriacutea de las bacterias y hongos necesitan valores entre 098 y
0995 de aw para su pleno desarrollo (Madigan y Martinko 2006)
Una membrana plasmaacutetica permanentemente selectiva separa el contenido
citoplasmaacutetico del microorganismo de su ambiente por ello las alteraciones en la
concentracioacuten osmoacutetica del medio extracelular pueden afectar incluso la viabilidad de los
mismos Si se coloca un microorganismo en una solucioacuten isotoacutenica el agua entraraacute en la
ceacutelula y causaraacute su estallido salvo que la propia ceacutelula desarrolle alguna estrategia para
evitarlo por ejemplo reducir la concentracioacuten osmoacutetica del citoplasma gracias a los cuerpos
de inclusioacuten Los procariotas tambieacuten pueden contener canales sensibles a la presioacuten
osmoacutetica que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno
se vuelve maacutes baja que la del citoplasma (Madigan y Martinko 2006)
C12 Acidez y pH
El pH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad entre 5 y 8 para impedir la
destruccioacuten de las macromoleacuteculas haacutebiles en condiciones aacutecidas o alcalinas Los aacutecidos
fuertes (inorgaacutenicos) y los aacutecidos deacutebiles (orgaacutenicos) disminuyen el pH externo
posteriormente se disocian en el interior de la ceacutelula inhibiendo la actividad enzimaacutetica y el
transporte de nutrientes por lo tanto los microorganismos no pueden generar energiacutea de
almacenamiento y ocurre la muerte celular (Brooks et al1992)
C13 Oxiacutegeno
El oxiacutegeno molecular (O2) influye en el metabolismo de los microorganismos Durante el
Antecedentes
32
proceso de reduccioacuten del O2 se crean formas reactivas como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2)
superoacutexidos (O2-) y radicales hidroxilos (OH-) que producen dantildeo celular por la oxidacioacuten
de compuestos orgaacutenicos e incluso macromoleacuteculas (Prescott et al1999)
C14 Temperatura
La temperatura afecta el desarrollo y la supervivencia de los microorganismos En bajas
temperaturas la velocidad de crecimiento de algunos microorganismos disminuye y los
periacuteodos de latencia se alargan Por otro lado las temperaturas elevadas aceleran las
reacciones enzimaacuteticas (antes de los 40degC) pero si se intensifica el calor en algunos casos
provocan la desnaturalizacioacuten de las proteiacutenas y por consiguiente la lisis celular (Brooks et
al1992)
Es importante considerar que cada microorganismo tiene una temperatura de desarrollo
adecuada a mayor temperatura se produce un incremento lineal de la velocidad de
crecimiento hasta alcanzar el clima perfecto a velocidad maacutexima Por encima de esta
temperatura oacuteptima la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte
celular (Atlas y Bartha 2002) En la tabla 3 se presentan algunas condiciones ambientales
para el desarrollo de los microorganismos
Antecedentes
33
Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales (Lu et al 2006 Madigan et al 2006 Falk et al 2009)
Factor Tipo de
microorganismo Caracteriacutesticas Microorganismo representativo
NaCI
Osmotolerante Capaz de crecer en un amplio rango de aw o
presioacuten osmoacutetica St aureus Saccharomyces rouxii
Haloacutefilo Requiere altas concentraciones de NaCl para
crecer normalmente por encima de 02 M Halobacterium Dunaliella Ectohiorhodospira
pH
Acidoacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 0 y 55 Sulfolobus Picrophilus Ferroplasma Acontium
Cyanidium caldarium
Neutroacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 55 y 80 Euglena Paramecium
Alcaloacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 85 y 1 15 Badilas alcalophilus NaIronobaciacuteerium
Temperatu
ra
Psicroacutefilo Crece bien a 0degC temperatura oacuteptima de 15degC
o inferior Badilas psychrophilus Chlamydomonas nivalis
Psicroacutetrofo Puede crecer a 0-7degC oacuteptima de 20 a 30degC Listeria monocytogenes
Mesoacutefilo Temperatura maacutexima de 35degC
Temperatura oacuteptima alrededor de 20-45degC
P fluorescens E coli Neisseria gonorrhoeae
Trichomonas vaginalis
Termoacutefilo Puede crecer a 55degC o superior temperatura
oacuteptima a menudo entre 55 y 65degC
Geobacillus stearothermophilus Thermus
aquaticus Cyanidium caldarium
Hipertermoacutefilo Temperatura oacuteptima entre 80 y 113degC Chaetomium thermophile Sulfolobus
Atmoacutesfera
Aerobio obligado Completamente dependiente del O2 para
crecer Pseudomonas Mycobacterium tuberculosis
Anaerobio
facultativo
No requiere O2 pero crece mejor en su
presencia
M luteus St aureus
Streptococcus pneumoniae L monocytogenes
Anaerobio
aerotolerante Crece bien en presencia o en ausencia de O2 Lactobacillus
Anaerobio
obligado No tolera el O2 y muere en su presencia Clostridium botulinum C perfringens
Microaeroacutefilo
Requiere nivel de O2 inferior a 2-10 para
crecer y es dantildeado por el O2 (20) C fetus
Antecedentes
34
D Control del crecimiento microbiano
Los microorganismos toleran determinados factores ambientales Asiacute unas bacterias
pueden tener condiciones para su desarrollo y estas condiciones pueden ser nocivas para una
especie bacteriana El crecimiento de una poblacioacuten microbiana se estudia analizando la curva
de crecimiento de un cultivo La curva del crecimiento microbiano representa la evolucioacuten del
nuacutemero de nuacutemero de ceacutelulas viables presente en un cultivo microbiano liacutequido a lo largo del
tiempo de estudio Se estudia el nuacutemero de ceacutelulas viables por mililitro de un cultivo de
volumen limitado y con una cantidad de nutrientes limitada como por ejemplo un medio de
cultivo liacutequido en un matraz que ha sido inoculado con una cantidad inicial de microorganismos
o inoacuteculo (Hunter-Cevera y Belt 1996) Para llevar a cabo estos estudios se distingue tres
niveles entre los modelos de microbiologiacutea predictiva los que describen los cambios en el
nuacutemero de microorganismos con respecto al tiempo con respecto al efecto de las condiciones
ambientales y los que combinan los dos aspectos anteriores (Larcher y Cattaneo 2006)
Se considera el crecimiento de las bacterias en funcioacuten de su fondo geneacutetico en relacioacuten
con los nutrientes y en unas hipoteacuteticas condiciones ideales (oacuteptimas) Sin embargo el trabajo
experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales es decir
una serie de agentes fiacutesicos y quiacutemicos El anaacutelisis de la curva de crecimiento bacteriano es
muy importante para determinar el potencial de una teacutecnica de control especiacutefica Al igual que
las bacterias los fagos al forman una interaccioacuten con su bacteria hueacutesped se necesita
determinar una cuantificacioacuten del nuacutemero de copias que se generan por la infeccioacuten a esta
condicioacuten se le conoce como fase de eclipse siendo el momento idoacuteneo para realizar la
infeccioacuten fago-bacteria (Lee et al 2016)
D1 Agentes fiacutesicos
La temperatura es uno de los paraacutemetros ambientales maacutes importantes que condicionan el
crecimiento y la supervivencia de los microorganismos La temperatura afecta a la velocidad
de crecimiento y por lo tanto al tiempo de generacioacuten Cada bacteria es diferente y esto se
puede observar en una curva de tasa de crecimiento en funcioacuten de la temperatura Si se suele
utilizar calor en combinacioacuten con otros agentes fiacutesicos (filtracioacuten presioacuten y radiacioacuten) Al
aplicar temperaturas altas se refleja desnaturalizacioacuten e inactivacioacuten de proteiacutenas enzimaacuteticas
esenciales colapsamiento de la membrana citoplaacutesmica y a veces lisis teacutermica de la bacteria
Antecedentes
35
esta condicioacuten se presenta raacutepidamente cuando se aplica presioacuten la cual se utiliza para
esterilizar objetos como lo demuestra el uso universal de la autoclave en todos los
laboratorios de microbiologiacutea (Madigan y Martinko 2006) El calor es auacuten uno de los meacutetodos
maacutes comunes para destruir microorganismos se puede aplicar huacutemedo o seco (Salgado-Nava
y Jimeacutenez-Munguiacutea 2012) Por otro lado ademaacutes de aplicar calor si a las bacterias se le
extrae el calor del medio de manera intensa recurrir a la congelacioacuten con fines de conservacioacuten
de microorganismos por largos periacuteodos si se realiza apropiadamente numerosos
laboratorios disponen de congeladores a -30 o -70degC para la conservacioacuten de colecciones de
cultivos microbianos (Shafiei et al 2014)
D2 Agentes quiacutemicos
Aunque los objetos se desinfectan a veces con agentes fiacutesicos tambieacuten las sustancias
quiacutemicas se utilizan con mucha frecuencia por ejemplo los quimioteraacutepicos son sustancias
con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostaacutetica) En estas sustancias se busca
que sea efectivo contra un amplio espectro de microorganismos Pero no existe (hasta estos
momentos) un solo agente capaz de inhibir a todos los microorganismos Por otro lado existen
quimioteraacutepicos de espectro estrecho pero muy selectivos contra ciertas bacterias que son
patoacutegenas importantes Muchos factores influyen en la eficacia de los desinfectantes hay que
considerar la cepa de microorganismos presentes la concentracioacuten y naturaleza del
desinfectante y la duracioacuten del tratamiento Asimismo es imprescindible que las superficies
sucias se limpien antes de aplicar un desinfectante El uso apropiado de los agentes quiacutemicos
es esencial para la seguridad en los laboratorios y hospitales estos mismos productos se
utilizan tambieacuten para evitar el crecimiento microbiano en los alimentos (Prescott et al 1999)
E Fagos
E1 Antecedentes
Los virus son agentes infecciosos submicroscoacutepicos que pueden replicarse
independientemente de los cromosomas de una ceacutelula pero no independientemente de ella
A fin de multiplicarse deben penetrar la ceacutelula donde puedan replicarse a la cual se le
denomina hueacutesped Presentan una forma infecciosa madura que es tiacutepicamente extracelular
Antecedentes
36
Pueden infectar a diferentes seres vivos por lo que existen virus de animales de plantas y
de forma particular los llamados virus bacterianos o fagos (Madigan y Martinko 2006)
Los bacterioacutefagos o fagos (del griego φαγετον paguumlento ldquoalimentoingestioacutenrdquo) son agentes
virales de las bacterias su descubrimiento se atribuye por un lado al bacterioacutelogo ingleacutes F
W Twort que en 1915 mencionoacute el aclaramiento de un cultivo soacutelido de Micrococcus
provocado por un agente desconocido Por otro lado en 1917 el francocanadiense F
dHerelle descubrioacute un grupo de entidades bioloacutegicas en medios de cultivo que se propagaban
a expensas de las bacterias a los cuales les denominoacute fagos y dentro de sus investigaciones
definioacute su potencial uso e importancia cliacutenica Esto se refuerza a partir de 1940 con el
desarrollo del microscopio electroacutenico con el que se demuestra la naturaleza viral de los fagos
y que la forma de estudiarlos es mediante procedimientos microbioloacutegicos convencionales
facilitando su manejo y estudio (Grabow 2001)
La uacuteltima variedad de fagos se descubrioacute durante la Primera Guerra Mundial los tipos ya
conocidos eran los virus que afectaban a vegetales y animales fue entonces que se pensoacute
en que su aplicacioacuten para eliminar bacterias podriacutea ser utilizada para la prevencioacuten y el
tratamiento de enfermedades bacterianas pero no resultoacute (Merril et al 1996) Sin embargo
los fagos resultaron tener otros beneficios especialmente como modelos o sustitutos de los
virus en humanos en la investigacioacuten geneacutetica baacutesica asiacute como en la evaluacioacuten de la calidad
del agua Ademaacutes demostraron ser una herramienta valiosa en la mayoriacutea de las
investigaciones sobre los virus ya que en comparacioacuten con los humanos animales vegetales
e incluso los insectos anfitriones de otros virus los fagos son faacutecil y raacutepidamente reproducibles
en el laboratorio y no son particularmente exigentes con respecto al espacio instalaciones y
equipos El trabajar con fagos requiere la separacioacuten y purificacioacuten y las dos principales tareas
para realizar esto es utilizar meacutetodos quiacutemicos en los cuales se utilizan solutos como buffer
glicerol bromuro de potasio cloruro de cesio y tartrato de potasio aunque el maacutes comuacuten es
la sacarosa ademaacutes involucra la precipitacioacuten con sulfato de amonio polietilenglicol o cloruro
de cesio y los meacutetodos fiacutesicos que implican la centrifugacioacuten a diferentes velocidades y
gradientes de densidad y con menor frecuencia la cromatografiacutea de particioacuten (Sambrook y
Russell 2001)
La investigacioacuten sobre las propiedades baacutesicas de los fagos se desarrolla en la biologiacutea
molecular que permitioacute avances sin precedentes en toda la biologiacutea y ciencias meacutedicas La
Antecedentes
37
concentracioacuten y purificacioacuten es un factor determinante para llevar a cabo la infeccioacuten
eficientemente sin embargo existe un periacuteodo de adaptacioacuten por parte de los fagos antes
que se desarrollen y se logren tiacutetulos apreciables en ceacutelulas cultivadas (Sambrook y Russell
2001 Breeuwer et al 2003)
E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos
Los virus son paraacutesitos intracelulares obligados no tienen metabolismo intriacutenseco y
requieren la maquinaria metaboacutelica codificada por los cromosomas de ceacutelula que puedan
infectar y reproducirse en ella denominada hueacutesped Su tamantildeo oscila entre 20 y 200 nm y
consiste de un nuacutecleo de aacutecido nucleico (ARN o ADN de cadena simple o doble) rodeado por
una cubierta proteica (caacutepside) y en algunos casos una cubierta de liacutepidos Los microbioacutelogos
que investigan la presencia de virus en haacutebitats marinos y han detectado su presencia creen
que son diez veces maacutes numerosos que las bacterias marinas En la superficie de los mares
se encuentran entre 106 y 109 partiacuteculas viacutericas por mililitro y se estima que en la capa
superficial (1 mm) de los oceacuteanos se encuentran unas 3 x 1030 partiacuteculas viacutericas (Grabow
2001 Atterbury et al 2003)
E3 Clasificacioacuten de los fagos
Las variaciones en los fagos se presentan en forma estructural como apeacutendices en la
cabeza cuello y las fibras de la cola o espigas ademaacutes del genoma que variacutea en cada orden
En 1962 Andreacute Lwoff junto a otros investigadores propuso una clasificacioacuten basada en la
morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico Los nombraron de la siguiente manera los urovirales
que presentaban cola pronunciada los inoviridae eran los filamentosos y los microviridae los
tipo φX Posteriormente Bradley (1967) consideroacute la morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico y
agrupoacute a los fagos en seis morfotipos baacutesicos denominados de la A a la F posteriormente se
clasifico en fagos baacutesicos los de cola los filamentosos y los icosaeacutedricos con ADN de cadena
sencilla o RNA de cadena simple Los fagos han sido investigados debido a su rol como
agentes de biocontrol para el desarrollo de la seguridad alimentaria En el presente varios
miles de fagos en contra de varios objetivos han sido aislados de varios entornos y alimentos
Aproximadamente el 96 de los fagos aislados eran con cola y del tipo liacuteticos en una de las
Antecedentes
38
tres familias Myoviridae (245) Siphoviridae (61) y Podoviridae (14) en el orden de los
caudovirales (Atterbury et al 2003 Oh y Park 2017)
En 1971 el Comiteacute Internacional de Taxonomiacutea de Virus (ICTV por sus siglas en ingleacutes)
clasificoacute en 6 geacuteneros de los cuales 5 corresponden a la clasificacioacuten propuesta por Bradley
los grupos T4 λ φX174 MS2 y fd Los fagos pueden tener cola larga y flexible no contraacutectil
(Siphoviridae) cola larga y contraacutectil (Myoviridae) o cola corta (Podoviridae) como se observa
en la tabla 4 Para la clasificacioacuten de los fagos se aplican propiedades como el rango de
hueacutespedes y las relaciones inmunoloacutegicas sin embargo las maacutes importantes son su
morfologiacutea y las caracteriacutesticas de su aacutecido nucleico el cual se adsorbe a componentes de la
superficie celular que actuacutean como receptores especiacuteficos La zona de adsorcioacuten del virus es
complementaria al receptor celular por lo tanto un determinado fago soacutelo puede infectar un
nuacutemero limitado de cepas celulares que contengan a un determinado receptor La naturaleza
de la zona de adsorcioacuten variacutea con el tipo de fago En el T4 se localiza en el extremo de la cola
en donde se encuentran la placa basal las espiacuteculas y las fibras de la cola Las formas maacutes
complejas corresponden a los fagos con colas contraacutectiles (Atterbury et al 2003)
Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos
(Ackermann 2003)
Antecedentes
39
E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico
La multiplicacioacuten de los fagos (figura 4) ADN produce la destruccioacuten de la ceacutelula hueacutesped
mediante lisis lo que provoca su liberacioacuten El ciclo vital de un fago que culmina con el
estallido de la ceacutelula hueacutesped y la liberacioacuten de viriones recibe el nombre de ciclo liacutetico Los
acontecimientos que tienen lugar durante el ciclo liacutetico se revisaraacuten en esta seccioacuten con
especial atencioacuten a los fagos T-par de E coli Estos son fagos de ADN bicatenario con colas
contraacutectiles complejas de la familia Myoviridae son algunos de los virus maacutes complejos
conocidos (Fernaacutendez 2008)
Figura 4 Adsorcioacuten del fago T4 e inyeccioacuten del ADN (Leverentz et al 2003)
Los fagos podriacutean infectar hasta un 70 de la poblacioacuten de procariotas marinos y ser
responsables de la tercera parte de la mortalidad bacteriana acuaacutetica Tambieacuten se han
detectado virus que infectan diatomeas y otras algas importantes del fitoplancton marino lo
cual es de gran transcendencia ecoloacutegica ya que la multiplicacioacuten de bacterias marinas
supera la capacidad de reproduccioacuten de los protozoos La lisis por virus de ceacutelulas procariotas
y de algas puede tambieacuten contribuir enormemente en los ciclos del carbono y nitroacutegeno en las
cadenas troacuteficas marinas incluso podriacutea reducir el nivel de productividad marina como la de
moluscos y peces (Muniesa et al 2005)
E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten
Los fagos no se unen al azar a la superficie de una ceacutelula hueacutesped por el contrario se fijan
a receptores especiacuteficos La naturaleza de estos receptores variacutea de acuerdo al fago pueden
Antecedentes
40
ser lipopolisacaacuteridos y proteiacutenas de la pared celular aacutecidos teicoicos flagelos y pili Los fagos
T-par de E coli en particular utilizan lipopolisacaacuteridos o proteiacutenas de la pared celular como
receptores Las variaciones en las propiedades del receptor son parcialmente responsables
de las preferencias del fagos por el hueacutesped (Muniesa et al 2005 Leeuw et al 2017)
La adsorcioacuten de fagos T-par estaacute relacionada con diversas estructuras del tallo La fijacioacuten
del fago comienza cuando una fibra del tallo establece contacto con los receptores adecuados
a medida que maacutes fibras contactan con los receptores la placa basal se asienta en la
superficie La unioacuten se debe probablemente a interacciones electrostaacuteticas y se ve influida por
el pH y por la presencia de iones como Mg+2 y Ca+2 Una vez que la placa basal estaacute
firmemente asentada en la superficie celular se producen cambios conformacionales en ella
y en la vaina del tallo Esta uacuteltima se reorganiza de tal forma que se contrae pasando de una
conformacioacuten en cilindro de 24 anillos a otra de 12 anillos de longitud maacutes corta y ancha es
entonces cuando el tubo central es empujado a traveacutes de la pared celular bacteriana
Finalmente el ADN es extruido de la cabeza pasa a traveacutes del tubo del tallo y penetra en la
ceacutelula hueacutesped Parece ser que el tubo interacciona con la membrana plasmaacutetica para formar
un poro a traveacutes del cual pasa el ADN los mecanismos de penetracioacuten de otros fagos difieren
a menudo de los fagos T-par aunque no se han estudiado en detalle (Leverentz et al 2003)
F Biofilm
Las bacterias existen en la naturaleza bajo dos formas o estados a) bacterias planctoacutenicas
de libre flotacioacuten y b) bacterias biofilm en colonias de microorganismos seacutesiles (Nazar 2007)
Un biofilm se define como una agrupacioacuten de comunidades seacutesiles microbianas que se fijan a
superficies las ceacutelulas estaacuten incrustadas en una matriz autoproducida que actuacutea como
proteccioacuten quiacutemica y mecaacutenica del entorno asiacute estas bacterias presentan mayor resistencia
a desinfectantes y el secado (Vestby et al 2009) Las bacterias pueden crear condiciones
para formar biofilms casi en cualquier ambiente liacutequido La interfase soacutelido-liacutequido entre una
superficie y un medio acuoso (vgr leche) proporciona un entorno ideal para la fijacioacuten y
crecimiento de microorganismos (Fakruddin et al 2014)
Antecedentes
41
G Microscopiacutea electroacutenica
Los microscopios electroacutenicos se usan habitualmente para el estudio detallado de
estructuras celulares (Bradley 1967) Para analizar las estructuras internas es esencial el
microscopio electroacutenico de transmisioacuten MET En el MET se utilizan electrones en lugar de rayo
de luz las lentes son electromagneacuteticas y se opera en todo momento a alto vaciacuteo
(Ackermann 2003) El poder de resolucioacuten del microscopio electroacutenico es mucho mayor que
el del microscopio oacuteptico incluso pueden observarse estructuras moleculares como proteiacutenas
y aacutecidos nucleicos Sin embargo los haces de electrones tienen escaso poder de penetracioacuten
y una ceacutelula aislada es demasiado gruesa para poder visualizarse directamente por este
motivo se emplean teacutecnicas especiales para la obtencioacuten de cortes ultrafinos a fin de poder
observar las muestras Una ceacutelula bacteriana por ejemplo se corta con una cuchilla especial
en varios cortes ultrafinos de 20-60 nm de espesor que son posteriormente examinados de
manera individual en el microscopio electroacutenico (Fuster-Valls et al 2008) Para obtener
suficiente contraste las preparaciones se tintildeen previamente mediante tratamiento con
compuestos como aacutecido oacutesmico permanganato sales de uranilo o de lantano o plomo Como
estas sustancias poseen aacutetomos pesados son capaces de desviar los electrones y aumentar
el contraste (Madigan y Martinko 2006)
La microscopiacutea electroacutenica es el mejor meacutetodo para estudiar la forma de las bacterias Los
virus bacterianos por tener un diaacutemetro menor de 1000 Aring estaacuten por debajo del liacutemite de
resolucioacuten del microscopio oacuteptico sin embargo es posible observarlos mediante el
microscopio electroacutenico porque eacuteste utiliza una radiacioacuten de longitud de onda maacutes corta que
permite aumentar 100 mil veces una resolucioacuten de 10 Aring (Kruger et al 2000 Ackermann
2003) Para observar detenidamente la morfologiacutea se requiere el microscopio electroacutenico con
especificaciones precisas como el de barrido lo cual es una herramienta indispensable en
biologia molecular (Guzmaacuten 2015)
Para la observacioacuten las partiacuteculas se suspenden en un medio volaacutetil por lo general una
solucioacuten de acetato de amonio y se colocan sobre una membrana sostenida por una rejilla
metaacutelica que praacutecticamente no absorbe electrones El problema teacutecnico maacutes frecuente es la
falta de contraste como la imagen obtenida es el resultado de la dispersioacuten de electrones por
los aacutetomos de la partiacutecula se necesita una diferencia apreciable de poder dispersivo entre las
partiacuteculas y el medio de soporte generalmente se emplean teacutecnicas tradicionales La maacutes
utilizada se conoce como tincioacuten negativa consiste en mezclar la suspensioacuten del fago con
Antecedentes
42
fosfovolframato de sodio o acetato de uranilo a pH neutro A este pH las sales no se combinan
con el fago al secarse forman una capa uniforme y opaca a los electrones en la cual los fagos
destacan como partiacuteculas maacutes claras Como las sales en solucioacuten penetran las irregularidades
en la superficie de la partiacutecula la micrografiacutea revela los detalles finos de los fagos (Fuster-
Valls et al 2008 Montantildeez et al 2012)
La forma del fago se establece de manera visual que es directa de la placa cuando las
UFP que se observan a simple vista como placas liacuteticas a contraluz (APHA 2005) Y para
estudiar la adhesioacuten y formacioacuten celular en diversas superficies se han desarrollado varias
teacutecnicas de microscopiacutea entre las cuales se distinguen la microscopiacutea electroacutenica de barrido
y de transmisioacuten asiacute como la microscopiacutea de epifluorescencia (Fuster-Valls et al 2008) la
cual se basa en los mismos principios de oacuteptica de la microscopiacutea comuacuten con diferencias en
el manejo y el disentildeo relacionadas con la generacioacuten y transmisioacuten de longitudes de onda
adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar ya sean propios de la muestra o de
la coloracioacuten utilizada (Franco 2005)
El fundamento de la teacutecnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o
compuestos fluorescentes denominados fluorocromos en fijarse a los anticuerpos mediante
un enlace quiacutemico estable que no puede romperse durante el curso de la reaccioacuten
inmunoloacutegica La espectroscopia de fluorescencia es la teacutecnica de deteccioacuten oacuteptica maacutes
sensible En el caso de la deteccioacuten en ceacutelulas se exponen a alta energiacutea utilizando laacutemparas
de xenon excitando por varios nanosegundos y asiacute emitiendo una longitud de onda de baja
energiacutea (Franz y Jendreizik 2015)
H Fagoterapia
Las enfermedades infecciosas estaacuten catalogadas entre las primeras causas de muerte en
el mundo y por lo tanto son consideradas un problema de salud puacuteblica Entre ellas las
infecciones bacterianas causan gran preocupacioacuten dado que las bacterias adquieren diacutea a
diacutea mayor resistencia a los antibioacuteticos esto ocurre por medio de diversos mecanismos
fisioloacutegicos y moleculares que les permiten a estos microorganismos adaptarse raacutepidamente
a condiciones adversas (Prada-Pentildearanda et al 2015)
El descubrimiento de los fagos por dacuteHerelle se desarrolloacute cuando eacuteste buscaba una
Antecedentes
43
vacuna que pudiera combatir la crisis de disenteriacutea hemorraacutegica que se presentoacute en 1915 en
las afueras de Francia dacuteHerelle observoacute que tras aislar lisados libres de bacterias de la
materia fecal de los enfermos las bacterias eran destruidas por un agente desconocido
invisible capaz de destruir cultivos de bacterias o producir pequentildeas aacutereas de color maacutes claro
cuando las bacterias eran crecidas en confluencia en placas de medio soacutelido y publicoacute sus
observaciones en el artiacuteculo titulado ldquoSobre un microbio invisible antagonista de los bacilos
de la disenteriacuteardquo (Szafranski et al 2017)
El uso de los fagos como agentes terapeacuteuticos comenzoacute hace maacutes de 80 antildeos Entre los
ejemplos maacutes destacados y recientes de la utilizacioacuten exitosa de la fagoterapia cabe citar el
uso de fagos especiacuteficos en el control bioloacutegico de E coli O157H7 productora de colitis
hemorraacutegica (en alimentos) Tambieacuten se ha estudiado el uso de fagos en el tratamiento de
infecciones peritoneales y otitis externa en la erradicacioacuten de P aeruginosa en pacientes con
fibrosis quiacutestica en el tratamiento de infecciones urinarias y osteomielitis por S aureus y en
la descolonizacioacuten intestinal para combatir las infecciones por Enterococcus faecium
resistente a vancomicina entre otros Los efectos favorables de la fagoterapia podriacutean
exceder incluso su actividad antibacteriana Hay datos sorprendentes acerca de la actividad
in vivo de los fagos el conocido fago T4 de E coli podriacutea inhibir la adsorcioacuten y la replicacioacuten
de adenovirus en sus ceacutelulas blanco y el fago Pf4 de P aeruginosa habriacutea sido capaz de
inhibir el desarrollo de cepas de Aspergillus por secuestro de hierro (Lopardo 2017)
El estudio y desarrollo de nuevos tratamientos alternativos es de particular intereacutes en la
lucha contra la resistencia bacteriana Los fagos presentan caracteriacutesticas que los hace una
excelente herramienta contra las bacterias patoacutegenas debido a su especificidad y seguridad
ecoloacutegica Los fagos no solo son atractivos desde un punto de vista cliacutenico Se han utilizaacutedo
como potenciales aplicaciones en otras aacutereas como la agricultura el control de alimentos o
la industria como a continuacioacuten se describe en la siguiente tabla 5 Los fagos son una
solucioacuten ecoloacutegica ubicua para desarrollar nuevos tratamientos contra las bacterias aunque
se deben realizar maacutes estudios para comprender mejor la relacioacuten entre ellos y las bacterias
antes de su aplicacioacuten (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)
Antecedentes
44
Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos la naturaleza lugares
urbanizados y cuerpo humano (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)
Fuente Sitio encontrado
Naturaleza
Suelo y superficie terrestre
Agua continental y oceaacutenica
Ambientes extremos hielo marino pared de
algas zonas hipersalinas etc
Lugares artificiales
Hospitales y zonas similares
Planta de tratamiento de aguas negras
Algunas zonas bajo el impacto humano
Cuerpo de animales
Tracto digestivo y vagina
Tracto respiratorio y oral
Piel y epitelio mucoso
Los productos comerciales para terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones
Los fagos se pueden distribuir liofilizados y se disuelven antes de la administracioacuten por viacutea
intravenosa en un soporte adecuado como por ejemplo una solucioacuten acuosa o tampoacuten o
suspenderse en cualquier liacutequido adecuado coloidal o de la matriz de poliacutemeros para crear
bactericidas el principio activo se puede administrar de una manera conveniente como por
inyeccioacuten (subcutaacutenea intravenosa administracioacuten etc) por viacutea oral pulmonar (por ejemplo
aerosoles o por otros dispositivos a los pulmones) spray nasal intramuscular intraperitoneal
intrahecal intraviacutetrea vaginal rectal la puncioacuten lumbar y la aplicacioacuten directa Dependiendo
de la viacutea de administracioacuten el principio activo puede estar recubierto de un material que
preserve la sustancia de la accioacuten de enzimas aacutecidos y otras condiciones naturales que
pueden inactivar la sustancia (por ejemplo comprimidos recubiertos enteacutericos o pastillas)
Empresas dedicadas a la biotecnologiacutea se dedicaron a desarrollar productos utilizando fagos
especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan ETA la Food and Drug Administration de
los EE UU (FDA) incluye a los fagos en la categoriacutea de aditivos alimentarios la FDA ha
publicado la aprobacioacuten de seis fagos para usar en alimentos listos para comer (ready to eat)
efectivos para L monocytogenes de la compantildeiacutea Intralytix La compantildeiacutea Omnilytics ofrece
productos de control bacterial para varias aacutereas como son agricultura agua y alimentos
industrias que se pueden observar en su paacutegina web (httpswwwomnilyticscom) y otras
empresas como Biophage Pharma Inc (Canada) Exponential Biotherapies (EE UU)
(Segundo 2010)
Antecedentes
45
Estas nuevas estrategias de intervencioacuten eco-amigable son requeridas como agente de
biocontrol en contra de Salmonella Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos
antildeos debido a sus caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutef ico sin
dantildear la micro-flora en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros
distribucioacuten de esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla
algunos ejemplos de la aplicacioacuten de los fagos son los descritos en la siguiente tabla 6 (Oh y
Park 2017)
Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria (Oh y
Park 2017)
Compantildeiacutea Producto del fago Organismo hueacutesped
FINK TEC GmbH (Alemania) Secure Shield E1 E coli
Intralytix Inc
(EE UU)
Ecolicidereg (EcolicidePXtrade) E coli O157H7
EcoShieldtrade E coli O157H7
ListShieldtrade L monocytogenes
SalmoFreshtrade Salmonella spp
ShigaShieldtrade
(ShigActivetrade) Shigella spp
Micreos Food Safety
(Holanda)
PhageGuard Listextrade L monocytogenes
PhageGuard Strade Salmonella spp
E coli O157H7
Passport Food Safety Solutions
(EE UU) Finalysereg E coli O157H7
Phagelux (China)
AgriPhag
Xanthomonas campestris pv
vesicatoria Pseudomonas
syringae
pv tomato
SalmoProreg Salmonella spp
Salmonella spp
Antecedentes
46
47
III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO
48
Objetivos y plan de trabajo
49
A Objetivo general
El objetivo general de este estudio es aislar y caracterizar fagos frente Salmonella spp a
partir de diversas fuentes ambientales para su uso potencial en el control bioloacutegico
El control de Salmonella spp es de gran intereacutes para la industria alimentaria por lo que
encontrar alternativas para su eliminacioacuten es de gran impacto en la salud puacuteblica
B Objetivos especiacuteficos
1- Aislar fagos de Salmonella proveniente de muestras de aguas residuales de la ZMM y
muestras de lavado de carne pollo de un establecimiento donde se comercializa esta carne
2- Caracterizar parcialmente los fagos aislados en base a su morfologiacutea por TEM y el
anaacutelisis de sensibilidad frente a diversas cepas bacterianas
3- Estudiar el efecto de los fagos previamente aislados desarrollando un biofilm de
Salmonella spp sobre discos de acero inoxidable utilizando la DEM
C Plan de trabajo
Para alcanzar los objetivos establecidos se considera la ubicacioacuten de las fuentes para la
obtencioacuten de los fagos en este caso el medio seleccionado son riacuteos arroyos asiacute como un
establecimiento donde se procesan canales de pollo en la ZMM y las lagunas de oxidacioacuten
de aguas residuales en Mariacuten ambas localidades en Nuevo Leoacuten Meacutexico
Posteriormentese utilizaraacute la teacutecnica ADC y se verificaraacute en cual de estas muestras se
podriacutean encontrar fagos que sean liacuteticos para Salmonella enterica y posteriormente se
realizaraacuten pruebas de selectividad con la meta de caracterizar los fagos aislados frente a
diferentes hueacutesped (cepas de Salmonella spp y de E coli) y la observacioacuten de la morfologiacutea
se realizaraacute por el TEM
Salmonella spp presenta un periacuteodo de incubacioacuten por lo general entre 12 y 36 horas
tras el cual el derarrollo bacteriano en las superficies puede dar como resultado la formacioacuten
de un biofilm Para este estudio se desarrollaraacute un biofilm de Salmonella spp sobre discos
de acero inoxidable en condiciones de humedad esto es importante por la fase de eclipse
Objetivos y plan de trabajo
50
(momento en el cual atacan y se desarrollan los fagos) Se probaraacuten 3 concentraciones de
fago 6 7 y 8 UFPmL Se realizaraacuten recuentos durante un periacuteodo de incubacioacuten de 72 h
Con el fin de conseguir estos objetivos el presente trabajo se ha estructurado en tres
secciones las cuales se pueden observar en la figura 5 incluyendo las pruebas con DEM
en los discos de acero inoxidable
Figura 5 Diagrama general de trabajo
51
IV MATERIALES Y MEacuteTODOS
52
Materiales y meacutetodos
53
A Toma de muestras
Las muestras para obtencioacuten de fagos se recolectaron en diez sitios del aacuterea metropolitana
de Monterrey y del municipio de Mariacuten Nuevo Leoacuten (tabla 7) El meacutetodo que se utilizoacute para
aislar fagos de diversas fuentes medio ambientales y su posterior traslado al laboratorio fue
el descrito por Higgins et al (2005) Se obtuvieron las muestras provenientes de aguas
residuales y riacuteos se emplearon frascos de 450 mL previamente lavados y secos que
posteriormente se impregnaron con una solucioacuten de tiosulfato de sodio (Na2S2O3bull5H2O) al
10 (pv) (Sigma-Aldrich EE UU) y se esterilizaron en autoclave 121ordmC15min Al momento
de hacer la recoleccioacuten en campo los frascos fueron abiertos cuidadosamente y se llenaron
con el liacutequido se almacenaron en hieleras para su traslado al laboratorio el tiempo que
transcurrioacute desde la toma de la muestra hasta la llegada al laboratorio fue entre 1 y 3 h
posteriormente las muestras se centrifugaron el mismo diacutea y los sobrenadantes se
almacenaron 4oC hasta su uso (Vidales-Contreras et al 2006)
A cada una de las muestras obtenidas en el muestreo se le agregoacute 25 de cloroformo
(grado de reactivo 995 Sigma-Aldrich EE UU) para conservarlas en condiciones oacuteptimas
para su posterior llegar al laboratorio se mantuvieron a 4degC durante toda la noche para
permitir que el material grueso decante Mientras tanto en lo referente a las muestras
obtenidas de aguas provenientes de los establecimientos expendedores de pollos las
muestras se trataron igual pero como el sobrenadante contiene grasa se optoacute por filtrar y
posteriormente se realizoacute el mismo procedimiento antes descrito
Materiales y meacutetodos
54
Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos
B Obtencioacuten de fagos
Para aislar los fagos se utilizoacute la teacutecnica descrita por Sambrook y Russell (2001) la cual se
describe a continuacioacuten En un tubo de ensayo (16150 mm Fisherbrand EE UU)
conteniendo 45 mL de agar suave (AS) (Bioxon Meacutexico) mantenieacutendose a temperatura de
40C (en una cuba hidroneumaacutetica con agua) se colocaron 500 L de un cultivo de S
Enteritidis (provenientes del cepario del CINSP) en fase logariacutetmica y se agregaron 300 L
de las muestras recolectadas en las que se presume conteniacutean los fagos especiacuteficos para
esta cepa Se agitoacute el tubo de ensayo mezclando con movimientos circulares suaves para
evitar la formacioacuten de burbujas este procedimiento se realizoacute aproximadamente por 5
segundos El contenido se vertioacute uniformemente sobre una caja de Petri (10015 mm
Fisherbrand EE UU) conteniendo agar soya tripticasa (AST) (Bioxon Meacutexico) y se dejoacute a
temperatura ambiente hasta solidificar la ADC Se incuboacute a 37C por 24h Al momento de
observar el desarrollo de las placas de lisis (calvas) se procedioacute al aislamiento de los fagos
Su cuantificacioacuten se realizoacute de manera directa e inmediata ya que las calvas son visibles con
una iluminacioacuten de contraste (Breeuwer et al 2003) Posteriormente los fagos que si formaron
halos de inhibicioacuten fueron aislados de manera directa o siguiendo uno de los dos protocolos
(enriquecimiento y sin enriquecer) debido a que depende principalmente de la amplificacioacuten
del fago y las caracteriacutesticas de cada uno se describen a continuacioacuten
Municipio Sitio de la toma
Monterrey
Parque Fundidora
Riacuteo Santa Catarina
Establecimiento de comida
Av Conductores
Mariacuten Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal
Riacuteo La Libertad
Guadalupe Alcantarillas de la colonia La Azteca
Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados
San Nicolaacutes de los Garza Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac
Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea
Materiales y meacutetodos
55
B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos
Con el protocolo de enriquecimiento se proporcionoacute las condiciones oacuteptimas de desarrollo
al cultivo de la bacteria hueacutesped y la muestra al inocular el cultivo en la muestra y de esta
manera amplificar los posibles fagos que presentes en la muestra de agua
Se realizoacute este protocolo de la siguiente manera primero se seleccionoacute la cepa bacteriana
que seraacute el hueacutesped esto se consiguioacute haciendo un cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y
se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por otra parte se prepararon
aliacutecuotas (10 mL cada una) de cada una de las muestras recolectadas (enriquecidas con
cultivo bacteriano) y se centrifugan a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a
4degC despueacutes el sobrenadante se pasoacute por jeringa y con filtros de 022 microm (Millex-GP
polyethersulfone 33 mm radio-sterilized) Estas dos entidades biloacutegicas se unieron en un
matraz de capacidad de 50 mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon
Meacutexico) a doble concentracioacuten (20) En este matraz se agregaron 300 microL de la muestra
previamente filtrada con fagos y 500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incuboacute a 37degC por
24 h posteriormente por medio de la teacutecnica de ADC se pudo observar la formacioacuten de halos
de lisis de los fagos (Vidales-Contreras et al 2006)
B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos
El protocolo se emplea para adicionar directamente de la muestra una aliacutecuota y testarla
con la bacteria hueacutesped Se siguieron los pasos anteriormente descritos a este protocolo
primero se seleccionoacute la cepa bacteriana (hueacutesped) esto se realizoacute haciendo un cultivo fresco
(AST) (Bioxon Meacutexico) y se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por
otra parte se preparoacute aliacutecuotas (10 mL) de cada una de las muestras recolectadas y se
centrifugaron a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a 4degC despueacutes el
sobrenadante se pasoacute por jeringa con filtros de 022 microm (Millex-GP polyethersulfone 33 mm
radio-sterilized) Estas dos entidades bioloacutegicas se unieron en un matraz de capacidad de 50
mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon Meacutexico) a doble
concentracioacuten (20) A este matraz se agregaron 300 microL de la muestra filtrada con fagos y
500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incubaron a 37degC por 24h posteriormente por medio
de la teacutecnica de ADC se observaron la formacioacuten de halos de lisis de los fagos (Vidales-
Materiales y meacutetodos
56
Contreras et al 2006)
B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas
Despueacutes de que los cultivos bacterianos se reactivaron la preparacioacuten para trabajar con
ellos fue la siguiente se tomoacute una asada de una colonia bacteriana bien diferenciada y se
incuboacute en un tubo inclinado (punta de flauta) se dejoacute el cultivo toda la noche y posteriormente
se traspasoacute a un subcultivo en caldo con infusioacuten cerebro-corazoacuten (BHI Merck Alemania) e
incuboacute a 37degC durante 24 h posteriormente se subcultivoacute en BHI en las mismas condiciones
Una colonia aislada en tubo punta de flauta se inoculoacute en 9 mL de agua peptonada (3M
Meacutexico) y se incuboacute a 37degC durante 24 h luego se realizaron mezclas seriadas en diluyente
(1 gL triptona 85 gL NaCl pH 72) (Merck Alemania) y se implantaron en las superficies de
los discos de acero inoxidable tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm con
un volumen inferior a 50 microL Como control del inoacuteculo se prepararon 5 placas de TSA
En el caso del fago obtenido se amplificoacute realizando la infeccioacuten en repetidas ocasiones
hasta alcanzar una concentracioacuten de 1x107 UFPmL
B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos
Para la realizacioacuten de este estudio se utilizaron cepas bacterianas de Salmonella enterica
y E coli provenientes de diversas colecciones de los laboratorios involucrados tambieacuten se
utilizoacute un fago de prueba (PRD1) para ser utilizado como control positivo en los aislamientos
En la tabla 8 se muestran las bacterias y el fago indicando su denominacioacuten y origen asiacute como
las condiciones de conservacioacuten
Materiales y meacutetodos
57
Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten
Origen Cepa bacteriana fagos Clave Condiciones de conservacioacuten
FaSPyN
S Typhimurium ATCC 13311
Glicerol a -20degC S Paratyphi ATCC 9150
S Enteritidis ATCC 13076
FCB S Typhi ATCC 19430 BGA TSA 4degC
FAUANL
S Typhimurium TSA 4degC
Fago PRD1
Tampoacuten fosfato 4degC
E coli CECT 515
E coli K12
E coli ATCC 10536
E coli O157H7 CECT 4783
S bongori ATCC 43975
UAB
S enterica LT2
Vial liofilizado a -20degC
S enterica sub enterica CECT 4138
S enterica sub enterica CECT 4594
S enterica sub enterica CECT409
S enterica sub enterica CECT 698
S Typhimurium CCUG 29478
Para la reactivacioacuten de los cultivos que se almacenan a 4degC se dejaron a temperatura
ambiente igualmente para los congelados Posteriormente para sacarlos del estreacutes se
sembraron en medio de cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y se incubaron a 37degC por 24
horas tras estas condiciones ya se pudieron utilizar en los ensayos (McLaughlin et al 2006)
A continuacioacuten se describe la forma en que se reactivaron los cultivos en este estudio de
acuerdo a la forma en que estaban almacenados
a) Cultivos almacenados en glicerol
Se descongelaron los viales a temperatura ambiente
Materiales y meacutetodos
58
Se transfirieron 5 microL de cultivo en 20 mL de TSB (Becton Dickinson Co) y se incuboacute a
37degC toda la noche
Se sembroacute en tres campos en caja de Petri de 90 mm con TSA (Becton Dickinson Co)
Se incuboacute a 37degC por 24h
Se seleccionoacute una colonia aislada y bien diferenciada
El cultivo (colonia) se incuboacute en 20 mL de TSB a 37degC toda la noche
b) En caso de los cultivos liofilizados
En el vial se hidrataron los cultivos agregando 1 mL de TSB e incubando 1h a 37degC
Se vertioacute el cultivo en 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC toda la noche
Se realizoacute el mismo proceso anteriormente mencionado en a)
B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC)
La siembra o inoculacioacuten consistioacute en introducir artificialmente una porcioacuten de muestra
(inoacuteculo) en un medio adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano para su desarrollo
y multiplicacioacuten Una vez inoculado el medio se incuboacute a una temperatura adecuada para el
oacuteptimo crecimiento en promedio 37degC Los meacutetodos de conteo en placa como capa doble y
capa simple de agar se basan en la determinacioacuten de la concentracioacuten viral mediante el
conteo de UFP las cuales son zonas de aclaramiento circular o halo de inhibicioacuten de
crecimiento bacteriano que se producen en la capa o ceacutesped bacteriano debido a la lisis
producida por los fagos Inicialmente una partiacutecula de fago infecta a su bacteria hueacutesped se
replica y posteriormente se disemina generando una zona circular sin crecimiento de la
bacteria (Solano et al 2012) Por esta razoacuten en nuestro estudio se utilizoacute esta manera de
trabajar considerando las diferentes formas que se puede presentar los halos de inhibicioacuten
(forma tamantildeo densidad)
La teacutecnica se basoacute en mezclar el cultivo bacteriano en fase logariacutetmica y el fago en agar
suave (AS) tambieacuten llamado top agar cuando se aplica a la placa de Petri donde se realizoacute
el proceso de infeccioacuten El AS se preparoacute con TSB y agar bacterioloacutegico (15) para obtener
una consistencia semisoacutelida que permita el desarrollo de las calvas en el ceacutesped bacteriano
Se mantuvo a una temperatura adecuada para conservar el estado liacutequido y se agitoacute
cuidadosamente para dejar interactuar los cultivos fago-hueacutesped en el tubo de ensayo
Materiales y meacutetodos
59
posteriormente se dispersoacute de manera uniforme en placas de Petri de 90 mm de diaacutemetro con
15 mL de TSA La suspensioacuten (ceacutesped bacteriano en ADC) se dejoacute solidificar a temperatura
ambiente unos minutos y posteriormente se incuboacute 24h37degC (Vidales-Contreras et al 2006)
B6 Modelo de infeccioacuten
Las enzimas endolisinas de los fagos provocan la lisis debilitamiento y rompimiento de la
pared celular de las bacterias La lisis depende de la proporcioacuten de fagos y hueacutesped o
multiplicidad de infeccioacuten (Multiplicity of infection MOI) Cuando hay una MOI baja la relacioacuten
de fagos a bacterias no es superior a 21 Cuando la MOI es alta es decir muchos fagos frente
a pocas bacterias las ceacutelulas se lisan directamente (Dimmock et al 2007)
En ese sentido la Norma ISO 10705-11995 indica que durante el ensayo el fago en fase
de multiplicacioacuten experimenta varios ciclos de replicacioacuten lo que resulta en la muerte de la
ceacutelula hueacutesped que ha actuado como faacutebrica para la produccioacuten viral El modelo que se siguioacute
es para observar los halos de inhibicioacuten y contrastar los resultados En la figura 6 se presenta
el modelo de infeccioacuten utilizado con S Typhimurium y el fago PRD1 siguiendo el modelo de
Vidales-Contreras et al (2006) y la puesta a punto propuetas por Sambrook y Russell (2001)
Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten fago-hueacutesped
Materiales y meacutetodos
60
B7 Controles utilizados durante los ensayos
Se utilizoacute la cepa de S Typhimurium y el fago PRD1 como control positivo para observar
la formacioacuten de las calvas para el control negativo se utilizoacute agua esterilizada con esto se
asegurar que si existe infeccioacuten y evitar los falsos positivos que ocurren primordialmente por
contaminacioacuten
Para control negativo el ceacutesped bacteriano se obtuvo de la siguiente manera en un
tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de cultivo de S
Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de agua destilada esteacuteril la mezcla se vertioacute
en placa Petri con TSA
Como control positivo el ceacutesped bacteriano y las placas de lisis se obtuvieron como
sigue en un tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de
cultivo de S Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de fagos PRD1 la mezcla se
vertioacute en placa Petri con TSA
B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium
Para realizar los ensayos microbioloacutegicos se requirioacute trabajar con la misma cantidad de
biomasa en una fase de crecimiento similar El conteo en placa es un meacutetodo de medicioacuten de
biomasa que permite el recuento de ceacutelulas viables y consiste en determinar el nuacutemero de
ceacutelulas capaces de reproducirse y generar colonias sobre un medio soacutelido (cada ceacutelula viable
da origen a una colonia) Para este estudio y ver el efecto de los fagos sobre las bacterias
primeramente se calculoacute la curva de crecimiento celular pues es imprescindible para realizar
la infeccioacuten que la bacteria hueacutesped y se encuentre en fase logariacutetmica Es decir para
determinar la biomasa bacteriana se mide la cineacutetica de crecimiento celular y se considera
que se ha alcanzado la fase de crecimiento exponencial cuando la concentracioacuten es de 10⁸
UFCmL (McLaughlin et al 2006)
Para el conteo bacteriano se utilizoacute el meacutetodo de filtracioacuten por membrana
Se transfirioacute 1 mL del cultivo bacteriano fresco a 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC
Cada 30 minutos se recolectaron 300 microL de cultivo
A cada aliacutecuota recogida se le realizaron diluciones seriadas con 27 mL de agua
Materiales y meacutetodos
61
destilada esteacuteril hasta obtener un factor de 1010
De cada una de estas diluciones se obtuvieron 100 microL que se filtraron por membrana
de celulosa 045 microm (Millipore Corporation Billerica Ma 47 mm esteacuteril Cat No
JMX000089 Millipore) montada en un embudo de filtracioacuten magneacutetico de 47 mm (Pall
GELMAN Laboratory con capacidad de 300 mL) y con bomba de vaciacuteo (GM motors amp
industrial systems Modelo 5kh36kna510x)
Las membranas se colocaron en caja de Petri con TSA y se incubaron 24h a 37degC
C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos
Con excepcioacuten de la microscopiacutea electroacutenica los meacutetodos empleados para determinar el
tamantildeo forma y composicioacuten quiacutemica de los fago requieren una alta pureza de las partiacuteculas
virales El material de partida en cualquier estudio de este tipo para la obtencioacuten del fago es
cuando se presenten los halos de inhibicioacuten en el ADC en general ademaacutes de los fagos
estas zonas claras pueden contener los restos celulares de las bacterias como trozos de
pared membranas ribosomas ADN ARN proteiacutenas y otros componentes de peso molecular
maacutes bajo El contenido de fago en un lisado es del orden de 001 mg mL por lo que para
obtener la cantidad apropiada para su caracterizacioacuten es necesario partir de varios litros
(Leverentz et al 2003 Maestro y Sanz 2016)
Para llevar a cabo la purificacioacuten de los fagos se debe de realizar con concentraciones
superiores a 1010 UFPmL Uno de los meacutetodos maacutes utilizados es la centrifugacioacuten a alta
velocidad y posterior resuspensioacuten de las partiacuteculas sedimentadas en un volumen menor
Cuando es posible esta teacutecnica se reemplaza por un sistema de dos fases basado en la
propiedad que tienen algunos poliacutemeros de alto peso molecular como el polietilenglicol el
dextrasulfato de sodio y el dextrano al separarse estas fases por diferencia de pesos
moleculares los fagos se dispersan en este tipo de medios considerando las concentraciones
empleadas y las condiciones oacuteptimas de pH fuerza ioacutenica y temperatura y al pasar por el
proceso de centrifugacioacuten se concentran en una columna Una vez concentrado el fago en la
columna se puede recuperar faacutecilmente de la interfase Los procesos maacutes comuacutenmente
utilizados para la purificacioacuten posterior se basan en separar las partiacuteculas de fago ya sea por
su tamantildeo o densidad (Sambrook y Russell 2001 Vidales-Contreras et al 2006)
En la figura 7 se presenta el procedimiento para la amplificacioacuten de fagos que nos asegura
Materiales y meacutetodos
62
cultivos puros uniformes y con tiacutetulos altos lo cual es imprescindible para conseguir una
buena imagen en el microscopio electroacutenico
Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten de bacteriofagos aplicando la teacutecnica
de agar doble capa (ADC)
El meacutetodo utilizado para purificar los fagos que despueacutes de utilizaron para analizar su
morfologiacutea implicoacute el uso del kit Montage SEQ96 (Millipore Sequencing Reaction Cleanup Kit
Millipore Corporation EE UU)
En una placa de filtracioacuten (96 well SEQ plate by Millipore) se depositaron en cada
pocillo 15 microL de concentrado de fagos maacutes 5 microL de agua milli-Q (Injection Solution by
Millipore)
Materiales y meacutetodos
63
La separacioacuten se realizoacute por la exclusioacuten de lavados de la columna de gel aplicando
vaciacuteo por medio de una bomba (Millipore EE UU Vacuumpressure 220 V50 Hz 15 mm
Hg)
Posteriormente se resuspendioacute la muestra (Thermomixer comfort by Eppendorf) con
agitacioacuten durante 1 min a 500 rpm
Finalmente se agregoacute 10 microL de agua ultra pura Milli-Q para concentrar la muestra
(Injection Solution by Millipore)
Una de las modificaciones que se realizaron para obtener los fagos con elevada pureza y
concentracioacuten para ser utilizada en la microscopiacutea electroacutenica se realizoacute con el kit Montage
SEQ96 que se utiliza para la purificacioacuten de DNA y en este caso se utilizoacute para concentrar los
fagos (concentracioacuten 1012 UFPmL) El procedimiento se describe a continuacioacuten
Se antildeadieron 20 microL de buffer de inyeccioacuten a la placa donde se teniacutea la suspensioacuten de
fagos se resuspendioacute y transfirioacute todo el volumen a la placa azul de Millipore (kit Montage)
Se colocoacute la placa en la bomba del kit Montage de 2 a 3 min hasta que quedoacute seca
Es aconsejable no dejar maacutes tiempo del necesario para evitar un secado excesivo
Se limpioacute todo el exceso de liacutequido en la placa con papel filtro secando un par de
veces la placa sobre el papel Inmediatamente despueacutes se colocoacute la placa sobre el soporte
de la bomba evitando dejarla sobre el papel
Se antildeadieron 30 microL de buffer de inyeccioacuten
Se colocoacute la placa en la bomba unos 4-5 min hasta secarse
Con papel filtro se limpioacute todo el exceso de liacutequido que quedoacute en la placa y se colocoacute
en el soporte de la bomba
Se antildeadieron 30 microL maacutes de buffer de inyeccioacuten para resuspender
Se colocoacute la placa en agitacioacuten se centrifugoacute a 500 g por 10 min
Se traspasaron los 30 microL a un nuevo pocillo y se recolectoacute el sobrenadante
D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica
Con la concentracioacuten de fagos purificados se preparoacute la muestra para la observacioacuten al
microscopio electroacutenico y se procedioacute utilizando la teacutecnica de tincioacuten negativa tal como se
explica a continuacioacuten
Se depositaron 2 microL de suspensioacuten de fagos en un disco de capa fina de carbono y cobre
Materiales y meacutetodos
64
(200 Mesh Holes 100 microm square Ethene old 200 RU) despueacutes de 2 min de reposo a
temperatura ambiente se eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente Se antildeadieron 2
microL de agente de contraste solucioacuten tampoacuten 1 de acetato de uranilo (UO2middot (CH3COO)2middot2H2O)
(Merck Alemania) Se dejoacute actuar el colorante durante 2 min a temperatura ambiente y se
eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente y despueacutes se dejoacute el disco alrededor de 5
min a temperatura ambiente antes de observar en el microscopio
D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa
(DEM)
La microscopiacutea oacuteptica es el meacutetodo adecuado para la investigacioacuten de procesos celulares
ya que es menos agresivo para el manejo de la muestra Existen teacutecnicas de microscopiacutea con
otras especificaciones donde se aplican para estudiar la adhesioacuten celular y formacioacuten de
biofilms en superficies tales como el espectrofotoacutemetro infrarrojo transformada de Fourier el
laacuteser confocal de barrido y la microscopiacutea de fuerza atoacutemica estos microscopios se
caracterizada por detectar las ceacutelulas viables de las dantildeadas por medio de cromoacuteforos
(Montantildeez et al 2012) La microscopiacutea que estamos trabajando esta basada en fluorescencia
la cual utiliza cromoacuteforos para detectar DNA de ceacutelulas vivas (coloracioacuten verde) y ceacutelulas
muertas (coloracioacuten roja) y ha tenido grandes avances en la observacioacuten de tejidos ceacutelulas
moleacuteculas individuales y por consiguiente algunos restos celulares todos estos con una
excelente resolucioacuten (Pellegrotti et al 2014)
Para la observacioacuten de ceacutelulas mediante el DEM se utilizoacute el kit comercial de viabilidad Bac
Light (LIVEDEAD Bacterial Viability Kit L-13152 Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE
UU) que estaacute compuesto por dos colorantes fluorescentes de aacutecidos nucleicos (SYTOreg9 y
PISYTOreg9) que penetran tanto en las membranas intactas como en las lesionadas lo que
permite evaluar la vitalidad de las ceacutelulas bacterianas basaacutendose en la deteccioacuten de la
actividad de las oxidasas y reductasas bacterianas Se observa una sentildeal fluorescente
mejorada en ceacutelulas bacterianas con procesos metaboacutelicos activos En contraste PISYTOreg9
se manifiesta soacutelo en las ceacutelulas que presentan membranas lesionadas y desplaza el colorante
SYTOreg9 por la transferencia de energiacutea de la resonancia fluorescente Cuando se aplican
estos dos colorantes en proporcioacuten adecuada las ceacutelulas viables con membranas intactas
presentaraacuten fluorescencia verde y en contraste las ceacutelulas muertas o lesionadas tendraacuten
Materiales y meacutetodos
65
coloracioacuten roja (Berney et al 2007)
A continuacioacuten se describe la preparacioacuten de las muestras para ser observadas por el DEM
Se colocaron 2 microL de la concentracioacuten suspensioacuten de la muestra con fagos en una
concentracioacuten de 1x1012 UFCmL sobre un disco de acero inoxidable (tipo 14301 (2 cm de
diaacutemetro y 1 mm de grosor) ligeramente convexos con una altura maacutexima en el centro
de 1 mm
Se dejoacute secar a temperatura ambiente por espacio de 10 min
Posteriormente se aplicaron 2 microL de la solucioacuten vital de fluorescencia (LIVEDEAD Bac
Light Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE UU) que reacciona y da la coloracioacuten
al material geneacutetico de las bacterias
Para la observacioacuten de los discos se utilizoacute el microscopio de fluorescencia Olympus
BX51BX52 (Tokio Japoacuten) con caacutemara digital incorporada (DP 50 Olympus) equipado con
laacutempara de mercurio de 100 W (USH-103 OL Olympus) con filtro de doble paso (U-M51004
FR V2 Olympus)
Para enumerar las ceacutelulas bacterianas en el biofilm que se formo en los discos de
acero inoxidable se trabajoacute con un objetivo de 20X y se ubicaban 10 campos
aleatoriamente y los resultados se expresaron por cm2 Las imaacutegenes se revisaron con el
sistema de anaacutelisis de imagen (anaacutelisis 32 soft Imaging System GMBH Alemania)
El biofilm bacteriano se desarrolloacute en la superficie de discos de acero inoxidable tipo
14301 Antes de usarse deben limpiarse bien por inmersioacuten en una solucioacuten acuosa de
detergente (DINO-dis-Dipol Espantildea) al 5 en agua durante 1 h despueacutes se realizoacute la
inmersioacuten en bantildeo con alcohol isopropiacutelico (2-propanol) (Merck Alemania) al 70 en agua
durante 15 min Una vez secos se esterilizaron en autoclave a 121degC por 15 min
D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM
Se inocularon la superficie de los discos con 50 microL de cultivo de S enterica maacutes medio de
cultivo (TSB) para proporcionar en medio rico para que se forme el biofilm posteriormente se
colocaron en cajas de Petri esteacuteriles y se mantuvieron en condiciones de humedad a
temperatura ambiente durante periacuteodos de 24 48 y 72h realizaacutendoles el conteo
correspondiente para verificar el desarrollo del biofilm
Materiales y meacutetodos
66
Una vez formado el biofilm se inocularon los discos con 3 concentraciones diferentes de
fagos 6 7 y 8 logcm2 en un volumen inferior a 50 microL Las diluciones del fago se hicieron en
solucioacuten salina fisioloacutegica (SSF cloruro de sodio 080) (Merck Alemania) Se realizoacute la
infeccioacuten al inocular a los discos prueba y los discos de control con el mismo volumen de SSF
las condiciones de incubacioacuten se realizaron con humedad y a temperatura ambiente
Los discos de acero inoxidable que fueron inoculados con la infeccioacuten fago-bacteria se
analizaron en periacuteodos de 0 2 8 24 y 48 h Se utilizaron para la valoracioacuten de bacterias y
fagos y se distribuyeron los discos de la siguiente manera 2 para visualizacioacuten microscoacutepica
panoraacutemica 2 para recuento bacteriano por microscopiacutea y 2 para recuento bacteriano dando
un total de 6 discos por caja de Petri por duplicado y por cada concentracioacuten (3) por cada
ensayo (3) y por horarios (5) de dando un total de 540 discos
Para el conteo sobre cada disco se colocaron 20 microL del colorante (LIVEDEAD Pribes) y
se incubaron por 5 min a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad y se tomaron
fotografiacuteas a 10X 20X y 40X Para la microscopiacutea de conteo las fotografiacuteas se realizaron a
un aumento de 40X considerando 10 campos aleatorios
Cuando se formoacute el biofilm se requirioacute hacer los recuentos de bacterias y de fagos en ese
sentido para recuperar las bacterias los discos se colocaron en un frasco con 5 mL de TSB
con Tween 80 (TSBTW) (Merck Alemania) y 3 g de perlas de vidrio se homogeneizoacute la
muestra por 1 min en agitador voacutertex a maacutexima potencia para favorecer el desprendimiento
de los microorganismos y posteriormente se realizaron diluciones seriadas De este mismo
extracto se obtuvo el material necesario para hacer el conteo de fagos utilizando la teacutecnica de
ADC Y para el recuento de las bacterias viables se trabajoacute con cajas de Petri se sembroacute 1
mL en TSA con 06 de extracto de levadura (TSAYE Merck Alemania) y se incuboacute a 37degC
durante 24h (Fuster-Valls et al 2008)
67
V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Resultados y discusioacuten
68
Resultados y discusioacuten
69
A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras
De los 10 sitios de recoleccioacuten se lograron obtener un total de 39 muestras en junio de
2007 En la tabla 9 se presentan los sitios y el nuacutemero de muestras recogidas en cada sitio
En el caso del Riacuteo Santa Catarina se abarcoacute una distancia de 95 km la cual presentaba
diferentes zonas de descarga de aguas residuales y de ahiacute se hicieron las tomas en un periacuteodo
de estiaje En el caso de las lagunas de oxidacioacuten del municipio de Mariacuten esta zona presenta
tres lagunas con un aacuterea total de 16700 m2 se realizoacute el muestreo de manera aleatoria En
cuanto a las muestras que se obtuvieron en el sitio de comercializar carne de pollo se les tratoacute
de igual manera para comprobar si existiacutean fagos
Los lugares elegidos para la recoleccioacuten de muestras son similares a los reportados en la
literatura regularmente para el aislamiento de fagos del ambiente se utilizan aguas residuales
y establecimientos de manipulacioacuten yo venta de alimentos (Leeuw et al 2017) En
investigaciones previas se realizan muestreos de diversos sitios como en la piel y heces de
animales manos de los cuidadores superficies quiruacutergicas e instrumentos o utensilios usados
en los establecimientos hoteles y restaurantes (Ejo et al 2016 Yergeau et al 2016) Los
muestreos de aguas tambieacuten se pueden realizar en sitios cercanos a las salidas de drenaje
de hospitales esto es de gran importancia ya que donde hay bacterias posiblemente esteacuten
sus respectivos fagos (Tomat et al 2014 Mattila et al 2015 McShan y Nguyen 2016)
Resultados y discusioacuten
70
Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos
B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis
Para el aislamiento de los fagos especiacuteficos de Salmonella fue necesario la puesta a punto
de varios procedimientos la teacutecnica de agar doble capa (ADC) determinar la cineacutetica de
crecimiento de cultivos de Salmonella determinar la fase de eclipse en la relacioacuten fago-
bacteria (se utilizoacute como control la cepa S Typhimurium y el fago PRD1) y su puesta a punto
en el laboratorio de bioremediacioacuten de la Facultad de Agronomiacutea de la UANL
B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S
Typhimurium
La accioacuten liacutetica de los fagos sobre Salmonella se analizoacute utilizando la teacutecnica ADC
En este procedimiento es necesario tener un ceacutesped bacteriano uniforme entre dos capas
de medio soacutelido que puede ser agar-agar o agar-agarosa (Sambrook y Rusell 2001)
Con el objetivo de abaratar los costes y mejorar los resultados en este trabajo se empleoacute
esta teacutecnica con algunas modificaciones que se describen a continuacioacuten Asiacute pues se decidioacute
que las capas fueran agar-agar donde la primera capa fue de agar al 15 en medio TS y la
Municipio Sitio de la toma N de muestras
Tipo de agua
Monterrey
Parque Fundidora 3 Estanque y corriente
Riacuteo Santa Catarina 10 Corriente
Establecimiento de comida 2 Lavado del pollo
Av Conductores 2 Corriente
Mariacuten
Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal
10 Estanque y corriente
Riacuteo La Libertad 2 Corriente
Guadalupe
Alcantarillas de la colonia La Azteca
3 Corriente
Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados
2 Lavado del pollo
San Nicolaacutes de los Garza
Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac
2 Corriente
Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea 3 Corriente
Resultados y discusioacuten
71
segunda con agar a una menor concentracioacuten para hacer la capa menos firme por lo que fue
necesario poner a punto la teacutecnica probando diferentes concentraciones de agar en ambos
casos a pH 72 Ademaacutes esta adecuacioacuten es importante por el ahorro que se generoacute al utilizar
un componente maacutes econoacutemico que la agarosa lo cual repercutioacute favorablemente en el coste
de la prueba
Otra variable para poner a punto en la teacutecnica de ADC es el volumen de cultivo bacteriano
a utilizar para generar el ceacutesped de Salmonella y lograr una adecuada interaccioacuten con el fago
Se probaron 3 voluacutemenes diferentes de cultivo de S Typhimurium incubados 24 horas a 37oC
para alcanzar una concentracioacuten de 16 x 108 UFCmL Dependiendo de la cantidad de inoacuteculo
las caracteriacutesticas del ceacutesped bacteriano tienen diferente contraste lo cual puede facilitar o
dificultar la observacioacuten de las placas liacuteticas Finalmente el mejor resultado se obtuvo al
utilizar el volumen de 500 L ya que se logroacute una mejor observacioacuten del aclaramiento del
ceacutesped bacteriano al formar las placas liacuteticas En la tabla 10 se muestran las caracteriacutesticas
de las capas en la caja Petri para un buen manejo y desarrollo de la zona liacutetica producida por
el fago al multiplicarse
Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC
Paraacutemetro Condiciones
Agar suave (con agar) () 08
Temperatura del agar suave (degC) 49
pH del medio de cultivo (soacutelido y liacutequido) 72
Cantidad de agar suave (mL) 45
Cultivo bacteriano (microL) 500
Muestra tratada con fagos (microL) 100
Resultados y discusioacuten
72
B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium
El cultivo hueacutesped debe de encontrarse creciendo en medio liacutequido TS en fase logariacutetmica
al momento de mezclarlo con el fago Para identificar la fase logariacutetmica se probaron
diferentes tiempos de crecimiento Con todo ello se observa que la fase logariacutetmica de S
Typhimurium se encuentra en el minuto 150 coincidiendo con los datos reportados por
Vidales-Contreras et al (2006) Y siguiendo con mi tesis la determinacioacuten de la concentracioacuten
se realizoacute mediante el promedio de la enumeracioacuten de las UFC por placas Petri preparadas
por duplicado multiplicado por el factor de dilucioacuten el cual es el reciacuteproco del producto del
volumen ensayado y la dilucioacuten usada para el anaacutelisis Al final se observa cuando se ha
llegado a la fase estacionaria del desarrollo bacteriano (tabla 11) Se utiliza un factor de
dilucioacuten el cual se obtiene como el reciacuteproco de la multiplicacioacuten de volumen de ensayo y la
dilucioacuten usada en el anaacutelisis
Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium
Tiempo Minutos
(Acumulado) Dilucioacuten
UFCmL Promedio
F (Factor) Concentracioacuten
(UFCmL)
T0 0 1 x 10-5 9 plusmn 25 1 x 106 900 x 106
T1 30 1 x 10-5 13 plusmn 74 1 x 106 130 x 107
T2 60 1 x 10-5 24 plusmn 56 1 x 106 240 x 107
T3 90 1 x 10-5 51 plusmn 32 1 x 106 510 x 107
T4 123 1 x 10-5 211 plusmn 89 1 x 106 211 x 108
T5 150 1 x 10-6 215 plusmn 81 1 x 107 215 x 109
Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)
B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis
Las consideraciones tomadas del modelo infectivo S Typhimurium y el fago PRD1 y
utilizando la teacutecnica ADC se replican para poner a punto a la bacteria que se quiere probar
que en este caso es S Typhi ATCC 19430 Los resultados de estos ensayos se pueden
observar en la tabla 12 en la que se puede observar que es ligeramente mayor la etapa donde
Resultados y discusioacuten
73
se puede realizar la infeccioacuten (fase de eclipse) de los fagos aislados y la bacteria hueacutesped
Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis (108 UFCmL) (37 ordmC24h)
Tiempo Minutos (Acumulado)
Dilucioacuten UFCmL Promedio
F (Factor) Concentracioacuten (UFCmL)
T0 0 1 x 10-5 216 710 1 x 106 20 x 107
T1 60 1 x 10-5 260 608 1 x 106 20 x 107
T2 120 1 x 10-6 160 173 1 x 107 16 x 108
T3 180 1 x 10-6 244 208 1 x 107 24 x 108
T4 240 1 x 10-7 400 100 1 x 107 40 x 109
Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)
B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis
De los sitios muestreados se logro obtener 39 muestras y se obtuvo un total de 15 fagos
aislados a partir de dos fuentes de aguas residuales las del Riacuteo Santa Catarina y las lagunas
de oxidacioacuten de Mariacuten Los 15 fagos se nombraron consecutivamente como MRH 1-15 Los
15 fagos se probaron contra la cepa hueacutesped S Enteritidis (CINSP tabla 4) tras realizar de
3 a 4 amplificaciones la mayoriacutea (14 fagos) no presentoacute actividad liacutetica (formacioacuten de halos
de inhibicioacuten) de manera que fueron descartados para los siguientes estudios siendo
solamente uno proveniente de la muestra del Rio Santa Catarina el que produjo halos bien
definidos en el ceacutesped bacteriano y con eacuteste se continuoacute trabajando El fago que mantuvo la
actividad liacutetica fue el MRH6 Se propuso nombrarle como MRH considerando la M para
muestra la RH por el Rodrigo Hernaacutendez
B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten
La principal caracteriacutestica de los fagos es cuando forman halos de inhibicioacuten (tambieacuten
llamadas zonas liacuteticas o calvas) y en nuestro estudio las muestras de agua recolectadas
fueron tratadas y analizadas mediante la teacutecnica ADC observando los halos de inhibicioacuten
claros y de diferentes diaacutemetros estas observaciones son similares a las observadas por
Ackermann (2003) Tanto la cantidad de UFP que se pueden desarrollar y observar hecha por
Resultados y discusioacuten
74
los fagos y la pureza en que encuentren los bacterioacutefagos de las muestras obtenidas del medio
ambiente estaacuten directamente relacionadas la especificidad contra la bacteria Al sembrar por
vaciado en placa estos lisados sobre la cepa indicadora se obtuvieron diferentes tamantildeos de
placas liacuteticas
En la figura 8 se muestran los halos de inhibicioacuten en ceacutesped de Salmonella al realizar la
infeccioacuten se pueden observar los diferentes tamantildeos y la forma se da por la capacidad de
raacutefaga (nuacutemero de copias al realizar el proceso liacutetico) de los fagos de la progenie los fagos
suelen tener una raacutefaga de maacutes de 100 partiacuteculas infectivas producidas en un lapso de tiempo
de 05 ndash 20 h Algunos halos formados por el fago fueron claros lo que indica que es liacutetico de
acuerdo con diversos autores (Sambrook y Rusell 2001 Vidales-Contreras et al 2006 Wong
et al 2014) En nuestro estudio se batalloacute en encontrar fagos a pesar de buscar sitios
sentildealados por autores antes mencionados
Al intentar obtener fagos puede suceder que se encuentren en concentraciones tan
pequentildeas que al probarlos contra alguna cepa hueacutesped no sirven para trabajar por lo que se
llevoacute a cabo repeticiones seriadas (amplificacioacuten) asegurando que al formar una placa de Petri
en ADC con tamantildeos de los halos de inhibicioacuten iguales lo que nos indica que pertenecen a
una sola especie de fago
Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por fagos con halos de inihibicioacuten de
diferentes tamantildeos
Resultados y discusioacuten
75
C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli
La clasificacioacuten de los fagos se puede establer en base a su morfologiacutea al aacutecido nucleico
al espectro de accioacuten y algunas consideraciones inmunoloacutegicas (Criscuolo et al 2017) Al
realizar la infeccioacuten de fago-bacteria y observar la presencia de halos liacuteticos en las placas de
ceacutesped bacteriano se considera que se ha producido una infeccioacuten exitosa pero previamente
es necesario poner a punto el cultivo puro de ambos cultivos y considerar la concentracioacuten de
cultivos a utilizar
Al seleccionar los fagos que presentaron uniformidad en cuanto a la inhibicioacuten y posterior
evaluacioacuten de los fagos se consideraron varios factores entre ellos el tiempo que tarda la
replicacioacuten viral (lo cual es variable) siendo que en algunos casos se pueden replicar en
cuestioacuten de minutos A simple vista se pueden observar la formacioacuten de halos de lisis en el
ceacutesped bacteriano en las cajas de Petri
Asiacute pues la teacutecnica ADC se repitioacute varias veces hasta obtener placas liacuteticas con ideacutentica
morfologiacutea y tamantildeo En la tabla 13 se observa que hay diferentes tamantildeos de halos En los
primeros ensayos soacutelo cuatro muestras de agua (15 21 26 y 33) dieron halos de inhibicioacuten
pudieacutendose distinguir bien la forma y el tamantildeo Al realizar posteriores siembras los fagos
fueron perdiendo capacidad de infeccioacuten (fagos atemperados) y soacutelo la muestra 21 de las
lagunas de oxidacioacuten provenientes de Mariacuten presentoacute fagos con actividad liacutetica y el resto de
fagos no desarrolloacute actividad constante
Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten de S Enteritidis en ceacutesped
bacteriano
Diaacutemetro de halo grande ge 8mm mediano 8 lt X lt6mm pequentildeo le 5mm
Distribucioacuten de tamantildeos de halo
Muestra de agua Grande Mediano Pequentildeo
15 8 23 15
21 17 11 27
26 10 18 6
33 7 9 13
Diaacutemetro medio halo (mm) 1055 0671 0376
Resultados y discusioacuten
76
En la tabla 14 se presenta el listado de posibles hueacutespedes probados 12 cepas de
Salmonella y 4 de E coli que se probaron contra los 15 fagos aislados previamente Se puede
distinguir que afecta a algunas serovariedades de Salmonella y no tiene efecto en otras
serovariedades entericas No afecta nada a las cepas de E coli Se ve que la cepa maacutes
afectada por el fago es la S Typhi ATCC 19430 y otras cepas de Salmonella son afectadas
ligeramente
Resultados y discusioacuten
77
Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades de Salmonella spp y de E coli
serovariedades Fagos
M
R
H
1
M
R
H
2
M
R
H
3
M
R
H
4
M
R
H
5
M
R
H
6
M
R
H
7
M
R
H
8
M
R
H
9
M
R
H
1
0
M
R
H
1
1
M
R
H
1
2
M
R
H
1
3
M
R
H
1
4
MR
H15
S Typhimurium ATCC 13311
-
-
t
- -
t
- - - - - - - - -
S Paratyphi ATCC 9150 - - - - - - - - - - - - - - -
S Enteritidis ATCC 13076 - - - - - - - - - - - - - - -
S Typhi ATCC 19430 + + + + + t
c
+ + + n
d
n
d
n
d
n
d
nd +
S Typhimurium - - - - - - - - - - - - - - -
S Bongori ATCC 43975 - - - - - - - - - - - - - - -
S enterica LT2 - - - + + + - - - - - - - -
S sub enterica CECT 4138 - - - - + + + - - - - - - - -
S sub enterica CECT 4594
t
t
t
- + + + - - -
t
- - - -
S sub enterica CECT 409 - - - - n
d
- -
t
- - - - - - -
S sub enterica CECT 698 - - - - - t
c
- - - - - - - - -
S Typhimurium CCUG
29478
- - - + + - - - - - - - -
E coli CECT 515 - - - - - - - - - - - - - - -
E coli K12 - - - - - - - - - - - - - - -
E coli ATCC 10536 - - - - - - - - - - - - - -
E coli O157H7 CECT 4783 - - - - - - - - - - - - - - -
+ crecimiento y desarrollo de halo indica desarrollo muy pequentildeo o difuso del halo t indica desarrollo pequentildeo y turbio del halo tc indica turbio o con centro opaco en el centro del halo - no crecimiento o desarrollo de halo nd aparente baja efectividad o halo difuso
Resultados y discusioacuten
78
Resultados y discusioacuten
79
El fago que siacute mostroacute actividad (MRH6) y que mantuvo la capacidad liacutetica durante las
diferentes amplificaciones se trabajoacute de manera continua hasta obtener halos uniformes en el
tamantildeo y asiacute ya se considera como una entidad pura de fago Los resultados obtenidos en
este trabajo son semejantes a los mostrados por Thung et al (2017) En la figura 9 se
presentan las imaacutegenes donde se muestra el desarrollo de halos liacuteticos previamente
mencionados donde se puede observar los halos uniformes contra A) S Enteritidis (CINSP)
y B) S Typhi ATCC 19430 (UAB)
Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria A) S Enteritidis (CINSP) y B) S Typhi ATCC 19430
La especificidad de los fagos se encuentra generalmente a nivel de cepa y tambieacuten de
especie y maacutes raramente a nivel de geacutenero Es de intereacutes el garantizar una eficiente infeccioacuten
de la dupla fago-bacteria de esta manera se toman todas las medidas precautorias para
obtener resultados fiables en este sentido se requiere verificar todos los aspectos como son
los controles (positivo y negativo) En el caso del control negativo se verificoacute el desarrollo
solamente del ceacutesped bacteriano de la cepa hueacutesped con la teacutecnica ADC y como control
positivo se consideroacute el modelo del fago PRD 1 y S Typhimurium los fagos son altamente
especiacuteficos (no afecta a otros cultivos bacterianos) y no se puede descartar falsos positivos
por la presencia de restos celulares bacterianos (Segundo et al 2010 Szafranski et al 2017)
Resultados y discusioacuten
80
D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM
El ICTV clasifica a los fagos en 1 orden13 familias y 31 geacuteneros De los cuales se
observa al orden de los Caudovirales el cual comprende a la mayor parte de los fagos (en
torno a un 95)y estos estaacuten constituidos por 3 familias con cola Myoviridae Podoviridae
y Siphoviridae Con estas caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas mediante el TEM en la
figura 10 se presentan las imaacutegenes del fago MRH6
El anaacutelisis de una suspensioacuten de fagos con una concentracioacuten de 1x1012 UFPmL mediante
microscopiacutea electroacutenica muestra una distintiva morfologiacutea de cabeza icosaeacutedrica estructura
alargada y cola no contraacutectil La caacutepside tiene un diaacutemetro de 55-60 nm y la cola puede
alcanzar los 570 nm Estas caracteriacutesticas se corresponden con la familia Siphoviridae Yang
et al (2017) comentan que esta familia de fagos se encuentra frecuentemente en
enterobacterias
Figura 10 Imagen por TEM del fago MRH6 (X100 000) la barra representa 100nm (Servicio de Microscopiacutea UAB)
Resultados y discusioacuten
81
D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero
inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de
epifluorescencia directa (DEM)
Para corroborar la potencial condicioacuten como agente de desinfeccioacuten del fago MRH6 es
necesario observar su efectividad a traveacutes de la DEM con la que se pueden observar
bacterias viables y no viables Tambieacuten la materia orgaacutenica puede dar falsos positivos y se
debe tener en cuenta al comparar con otros meacutetodos de conteo (Montantildeez et al 2012)
En este trabajo S Typhi ATCC 19430 desarrolloacute biofilms en las superficies de acero
inoxidable (discos tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm) y consiguieron
niveles de 29 plusmn 02 UFCcm2 despueacutes de tener un maacuteximo de 72 h en incubacioacuten en
condiciones de humedad y temperatura ambiente tal como se puede observar en la figura 11
Estos biofilms tienen distinta intensidad seguacuten el tiempo de incubacioacuten siendo los periodos
evaluados de 24 48 y 72h respectivamente En estas condiciones se realizoacute el recuento en
tres zonas de cada disco para cada tiempo de incubacioacuten y los resultados se presentan en la
figura 12 Para tener fiabilidad de los resultados se realizaron los conteos por triplicado porque
el manejo de los discos es muy complejo y para evitar errores de manejo se consideroacute
necesario tener maacutes de una muestra otorgando ademaacutes la oportunidad de comparar
resultados y tener un margen de referencia en cuanto a los resultados obtenidos
Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 en
diferentes tiempos de incubacioacuten (24 48 y 72h) a temperatura ambiente
Resultados y discusioacuten
82
Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable incubados a temperatura ambiente n = 3
En este estudio se compararon 2 meacutetodos de conteo de bacterias despueacutes de ser atacadas
por los fagos eacutestos fueron el recuento en placa de agar y por otro lado la observacioacuten por
microscopiacutea de epifluorescencia y la relacioacuten entre ambos meacutetodos Desafortunadamente se
han perdido los resultados por un problema irresoluble pero si se puede comentar que existe
una relacioacuten ligeramente inferior a 09 (R2 ) Esta observacioacuten ya ha sido presentada
anteriormente por otros autores (Fuster-Valls et al 2008 Engelhardt et al 2014)
El cultivo bacteriano se puede contabilizar por conteo en placa directo (TSA) este meacutetodo
es utilizado generalmente para cultivos de geacutermenes no exigentes o moderadamente
exigentes y cuando se quiere visualizar como afecta el ataque de los fagos las ceacutelulas
bacterianas se visualizan por DEM (cuya coloracioacuten cambia a verde cuando han sido atacadas
por los fagos) y una forma de visualizar este ataque es por medio de TSA con la teacutecnica de
ADC
0
5
10
15
20
25
0 10 20 30 40 50 60
Co
nte
o (
Lo
g U
FC
cm
2)
Tiempo (h)
Crecimiento bacteriano
Resultados y discusioacuten
83
D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable
Se aplicoacute la DEM para evaluar la efectividad del fago MRH6 en el control de S Typhi ATCC
19430 sobre superficies de acero inoxidable en condiciones de humedad El fago MRH6 es
liacutetico capaz de disgregar los biofilms
El analizar la accioacuten liacutetica del fago sobre Salmonella por medio del DEM es muy importante
e innovador pero el material que se utiliza y la manera en que se comportan las diferentes
bacterias hacen que se deba ser muy precavido al considerar el uso de este meacutetodo como
adecuado para realizar conteos (Libuchi et al 2010) Por ejemplo se debe tener en cuenta
que existen bacterias que no forman un biofilm y presentan movimiento esto puede llegar a
complicar el visualizarlas si no estaacuten en el campo por lo que se podriacutea pensar que fueron
atacadas y eliminadas por los fagos o bien que por los diferentes lavados se barrieron
La DEM con la tincioacuten LIVEDEAD reveloacute la presencia de ceacutelulas viables con coloracioacuten
verde En la figura 13 se puede observar el efecto letal del fago MRH6 sobre la poblacioacuten de
S enteacuterica disminuyendo su cantidad considerablemente en base a el tiempo de incubacioacuten
en color verde Se observa que hay disminucioacuten de las ceacutelulas de S Typhi ATCC 19430 al ser
atacadas por el fago MRH6 Recordemos que la infeccioacuten con el MRH6 se realizoacute despueacutes de
formar un biofilm a temperatura ambiente y con humedad por espacio de 72h en 3
concentraciones 6 7 y 8 UFPmL Al paso del tiempo se aprecia que a las 48h hay pocas
ceacutelulas vivas al menos detectadas por la teacutecnica utilizada
Resultados y discusioacuten
84
a)
b)
c)
Figura 13 Secuencia de imaacutegenes de epifluorescencia que ilustran la destruccioacuten de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable causada por el fago MRH6 tras incubacioacuten de 0 8 24 y 48 h y con 3 concentraciones de fagos a) 6 b) 7 y c) 8 UFPmL respectivamente
La DEM es un meacutetodo altamente sensible que se caracteriza por la formacioacuten de imaacutegenes
amplificadas y es considerada una teacutecnica poderosa con altos niveles de sensibilidad y
resolucioacuten Tomando como referencia los resultados se considera que la DEM es una
herramienta eficaz para el conteo bacteriano pero hay que considerar la experiencia del
observador
Resultados y discusioacuten
85
En algunas ocasiones al observar las bacterias atacadas por los fago se pueden encontrar
muestras con material geneacutetico mezclado con restos celulares esta situacioacuten hace que
algunos investigadores recomienden extraer los fagos de la muestra antes de sembrar las
bacterias con el fin de determinar la reduccioacuten bacteriana uacutenicamente debida a la actividad
virulenta del fago sobre la muestra y no a la infeccioacuten por fagos libres presentes en el agar
(Sharma et al 2009) En ese sentido tal como reporta Fuster-Valls et al (2008) en su trabajo
observoacute que el limite de deteccioacuten de esta teacutecnica es de 279 log10 celulas por cm2 en cambio
en nuestro trabajo y tal como se observa en la figura 14 se pudo llegar a una sensibilidad
muy proacutexima a 2 y que coincide con las imaacutegenes de la figura 13 en las que a las 24 y 48
horas apenas se observan algunas manchas que corresponden al crecimiento bacteriano
Los fagos utilizan los recursos de la ceacutelula para hacer muchos fagos nuevos lo que causa
que la ceacutelula lise (estalle) y muera en el proceso La lisis en las uacuteltimas etapas del ciclo liacutetico
el fago expresa los genes para las proteiacutenas que hacen agujeros en la membrana plasmaacutetica
y la pared celular En la figura 14 se puede observar como el recuento de Salmonella Typhi
ATCC 19430 disminuye por el ataque del fago MRH6 El efecto del fago es muy fuerte y al
final los conteos son muy parecidos
Resultados y discusioacuten
86
Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 en superficies de acero inoxidable por el fago MRH6 con diferentes concentraciones y hasta 48 h de incubacioacuten
En este trabajo se buscoacute crear condiciones de infeccioacuten fago-bacteria en el laboratorio
como las que se pudieran presentar en la industria Los resultados de esta relacioacuten del fago
MRH6 y S Typhi ATCC 19430 muestran que la aplicacioacuten del fago es efectiva pero hay que
considerar que funciona mejor a altos tiacutetulos (108 UFCmL) y que deberaacute de potenciarse
cuando se trate de un coctel de fagos
Nuestros resultados sugieren que los fagos pueden ser utilizados como un meacutetodo para
controlar un biofilm formado por un bacteria especiacutefica
Al realizar la buacutesqueda de informacioacuten en diferentes motores de buacutesqueda una de las
plataformas de libre acceso (Pubmed) se obtuvo una relacioacuten de 5 en publicaciones de
00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Salm
on
ella
Typ
hi
AT
CC
19430
(lo
g1
0ceacutelu
las cm
2)
Tiempo (h)
Fago MRH6 a 6 Logml Fago MRH6 a 7 Logml Fago MRH6 a 8 Logml Control sin fago
Resultados y discusioacuten
87
fagos contra diferentes serovariedades de Salmonella spp lo que se puede traducir en que
hay un aacuterea de oportunidad latente
Las consideraciones que se enviacutean como propuesta es que existen en estos momentos
muchos trabajos sobre fagos pero aquiacute en Meacutexico no hay trabajos reportados y los que
existen estaacuten apenas en fases iniciales
Existe un enorme potencial de trabajo en esta aacuterea con los fagos tal es el caso de la
fagoterapia en otros sitos y en otros tiempos estaacuten realizando experimentos para ser
explotada como alternativa para todos los aacutembitos desde hogares industria salud animales
vegetales etc Por lo menos en EE UU tienen grandes avances en estudios relacionados
con la aplicacioacuten en bacterias multiresistentes que por el uso de antibioacuteticos han mutado esto
en el sector salud donde se estaacute perdiendo la batalla
Una de las fortalezas de estudiar a los fagos es que antes de que los antibioacuteticos fueran
descubiertos habiacutea investigacioacuten considerable sobre los fagos como tratamiento para las
enfermedades bacterianas humanas por lo menos en parte de Europa La aplcacion de los
fagos es potencialmente son buenos candidatos para tratar enfermedades bacterianas en
seres humanos inocuidad aliemnaria bioremediacioacuten y cada regioacuten tiene fagos endeacutemicos y
este tabajo representa de los primeros en llevarse en Monterrey
Ciertas limitaciones de los resultados se debiooacute a las condiciones que se presentaron al
realizar el estudio (laboratorio equipo conocimiento del tema) solamente se pudo aislar un
fago y lo recomendable es que sean varios fagos dado que son muy especiacuteficos de especie
o hasta de cepa Se proboacute su accioacuten sobre superficies con un solo cultivo bacteriano y en la
realidad las superficies se contaminan con diferentes bacterias
Lo que se vizualiza para nuestro estudio es sugerir varias liacuteneas de accioacuten a futuro Por
ejemplo el fago aislado podriacutea probarse in vivo sobre carne de pollo o fagoterapia tambieacuten
podriacutea continuar los estudios para aislar maacutes fagos y hacer mezclas (coacutecteles) que tuvieran
un mayor rango de actividad y combatir a diversas especies de Salmonella Con respecto al
tratamiento de superficies podriacutean utilizarse coacutecteles de fagos para tratar biofilms bacterianos
formados por maacutes de dos especies o inclusive podriacutean probarse en biopeliacuteculas industriales
reales
Resultados y discusioacuten
88
89
VI CONCLUSIONES
90
Conclusiones
91
De las 39 muestras de agua analizadas se aislaron tentativamente15 fagos de los que soacutelo 4
mantuvieron en un primer momento su actividad liacutetica estos fagos se correspondieron con las
muestras de agua 15 21 26 y 33 Se siguioacute trabajando con ellos y finalmente solo uno de
ellos el MRH6 mantuvo su actividad liacutetica despueacutes de varias amplificaciones este fago se
aisloacute de las aguas residuales de Mariacuten
Se consiguioacute optimizar la teacutecnica ADC cambiando la agarosa que tiene un alto costo por
agar-agar maacutes econoacutemico sin alterar la fiabilidad de la teacutecnica ademaacutes con este cambio se
facilita el manejo
En relacioacuten con la especificidad de los 15 fagos aislados frente a las 16 cepas de
enterobacterias probadas (12 cepas de Salmonella spp y 4 de E coli) se observa ciertas
tendencias marcadas Ninguno de los fagos ataca a las cepas de E coli probadas En cuanto
a Salmonella se observa una fuerte especificidad frente a S Typhi (ATCC 19430) una ligera
actividad frente a varias cepas de S enterica y no hubo efecto contra las demaacutes cepas de
Salmonella ensayadas lo cual confirma la elevada especificidad fago-hueacutesped
Las imaacutegenes obtenidas mediante DEM muestran una morfologiacutea caracteriacutestica de cabeza
icosaeacutedrica estructura alargada y cola no contraacutectil que sugieren que el fago MRH6 se puede
clasificar en la familia Siphoviridae
Se observa un efecto liacutetico progresivo del fago MRH6 frente a biofilms de Salmonella en
discos de acero inoxidable llegando a valores miacutenimos inferiores a 102 a las 48 horas de
incubacioacuten para todas las concentraciones de fago utilizadas (6 a 8 UFPmL)
Se comprueba que la DEM es un buen meacutetodo para la cuantificacioacuten del crecimiento de S
Typhi (ATCC 19430) sobre discos de acero inoxidable con una gran sensibilidad y resolucioacuten
ya que se observaron claras diferencias en los diversos tiempos de incubacioacuten ensayados y
a diferentes concentraciones del fago MRH6 Esto confirma que la teacutecnica es una herramienta
eficaz para valorar el efecto liacutetico de los fagos sobre biofilms
Ya que en este trabajo solamente se obtuvo un fago liacutetico se sugiere reflexionar acerca de
los factores que han dificultado la obtencioacuten de un nuacutemero maacutes amplio de fagos
Conclusiones
92
Este trabajo refleja el gran intereacutes por iniciar o regresar a trabajar con fagos tal como esta
sucediendo en otras partes del mundo Hasta el momento hay muchas espectaivas sin
embargo todaviacutea se necesita investigacioacuten para saber queacute tan seguros son
93
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Aislamiento y caracterizacioacuten parcial de bacterioacutefagos de Salmonella spp con potencial aplicacioacuten en el biocontrol sobre
superficies
TESIS DOCTORAL
MC RODRIGO HERNANDEZ SANTIAGO
DIRECTORES
DIRECTOR Dr ZACARIacuteAS JIMEacuteNEZ SALAS Profesor titular del Departamento de laboratorio de geneacutetica y biologiacutea molecular UNIVERSIDAD AUTOacuteNOMA DE NUEVO LEOacuteN DIRECTORA Dra REYES PLA SOLER Catedraacutetica del Departament de ciegravencia animal i dels aliments UNIVERSITAT AUTOgraveNOMA DE BARCELONA
TUTORA Dra MANUELA HERNAacuteNDEZ HERRERO Profesora titular del Departament de ciegravencia animal i dels aliments UNIVERSITAT AUTOgraveNOMA DE BARCELONA
PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS DE LOS ALIMENTOS
Dra Reyes Pla Soler Catedraacutetica de Tecnologia dels Aliments del Departament de
Ciegravencia Animal i dels Aliments de la Universitat Autogravenoma de Barcelona
HACE CONSTAR
Que la memoria titulada ldquoAislamiento y caracterizacioacuten parcial de bacterioacutefagos de
Salmonella spp con potencial aplicacioacuten en el biocontrol sobre superficiesrdquo presentada
por Rodrigo Hernaacutendez Santiago para optar al grado de Doctor por la Universitat
Autogravenoma de Barcelona la cual ha sido realizada bajo su direccioacuten y cumple con los
requisitos para su defensa autoriza su presentacioacuten para que sea juzgada por la
comisioacuten correspondiente
Y para que conste a los efectos oportunos firma el presente certificado en Bellaterra
a 21 abril de 2019
Dra Reyes Pla Soler
Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas Profesor titular de la Facultad de Salud Puacuteblica y
Nutricioacuten de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
HACE CONSTAR
Que la memoria titulada ldquoAislamiento y caracterizacioacuten parcial de bacterioacutefagos de
Salmonella spp con potencial aplicacioacuten en el biocontrol sobre superficiesrdquo presentada
por Rodrigo Hernaacutendez Santiago para optar al grado de doctor por la Universitat
Autogravenoma de Barcelona la cual ha sido realizada bajo su direccioacuten y cumple con los
requisitos para su defensa autoriza su presentacioacuten para que sea juzgada por la
comisioacuten correspondiente
Y para que conste a los efectos oportunos firma el presente certificado en Monterrey
NL a 21 de abril de 2019
Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas
Si no puedes volar corre
Si no puedes correr camina
Si no puedes caminar gatea
Pero hagas lo que hagas siempre sigue hacia adelante
Martin Luther King jr (1929-1968)
Agradecimientos
Este trabajo se ha realizado gracias a la financiacioacuten aportada por el Programa de
mejoramiento del profesorado (PROMEP) PROMEP1035062037 UANL-326 de la
Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) dentro del programa de becas para la
formacioacuten de investigadores y a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para
el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y de
Cooperacioacuten) Programa Extranjeros II-A convocatoria 2010-2011 0000521211
A la Dra Teresa de los Reyes Pla Soler por la confianza depositada en miacute y darme la
oportunidad de ser su estudiante sin sus consejos no hubiera sido posible concluir esta
tesis
Al Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas por ser un guiacutea durante mi formacioacuten como
investigadora por sus ensentildeanzas con palabras y el ejemplo y por su apoyo en el
aspecto profesional y personal
Al Dr Joseacute Juan Rodriacuteguez Jerez por su gran apoyo acadeacutemico y por permitirme
trabajar desinteresadamente en las instalaciones y con el equipo de laboratorio
A la Dra Manuela Hernaacutendez Herrero que es una gran persona que me ha apoyado
desde el peincipio de estos estudios
A la Dra Marta Capellas Puig que me ha alentado todo el tiempo para terminar de
buena manera
Dedicatorias
Con mucho carintildeo a mi Sentildeor padre Bartolomeacute Hernaacutendez Balbuena (dagger) y a mi Sentildeora
madre Lucia Santiago Santos son un ejemplo en mi vida ya que ellos son fundamentales
en mi formacioacuten como persona
A mis hermanos Flavio Viacutector Manuel Guadalupe Hilda (dagger) porque siempre
estuvieron alliacute alentaacutendome en este trabajo con palabras experiencias etc
A mi prometida y futura esposa Dontildea Rosa Salas Martiacutenez desde que inicmos a estar
juntos siempre estaacute apoyaacutendome en todos los aspectos y en todas las cosas que he
emprendido y que con algunas locuras que se nos pueda ocurrir mas adelante nos
llevaraacute a mejores cosas cada diacutea
A mi hija Gabriela Sarahi Hernaacutendez Flores ella es lo que maacutes aprecio y espero vea
en mi un ejemplo que sirva para alentarla a ser cada diacutea mejor y sacar todas las cosas
que se proponga adelante
A mis compantildeeros y amigos Vannesa Fabio Fontecha Abel Rita Jacira Kathy
Genaro Fabio Poliseli Dora Cecilia Diana Angela Sonia Dolors Marco y Cristina por
las convivencias durante mi estancia en Espantildea que de alliacute solo me llevo grandes
recuerdos
A mis compantildeeros Mirna Patty Letty Tere Adelita Luluacute Betty Marco Arnoldo Joseacute
Luis y Gustavo que compartimos buena cantidad de tiempo gracias por las convivencias
y por los muchos trabajos que hicimos en equipo
CONTENIDO RESUMEN 1
SUMMARY 3
RESUM 5
I INTRODUCCIOacuteN 7
Presentacioacuten del proyecto 9
Justificacioacuten 10
II ANTECEDENTES 13
A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos 15
A1 Problemaacutetica 16
A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea 17
B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria 19
B1 Escherichia 19
B2 Campylobacter 20
B3 Enterobacter 21
B4 Listeria 22
B5 Salmonella 23
B51 Origen 23
B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp 25
B53 Manifestaciones cliacutenicas 27
B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis 28
C Crecimiento microbiano 30
C1 Crecimiento de los microorganismos 30
C11 Disponibilidad del agua 31
C12 Acidez y pH 31
C13 Oxiacutegeno 31
C14 Temperatura 32
D Control del crecimiento microbiano 34
D1 Agentes fiacutesicos 34
D2 Agentes quiacutemicos 35
E Fagos 35
E1 Antecedentes 35
E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos 37
E3 Clasificacioacuten de los fagos 37
E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico 39
E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten 39
F Biofilm 40
G Microscopiacutea electroacutenica 41
H Fagoterapia 42
III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 47
A Objetivo general 49
B Objetivos especiacuteficos 49
C Plan de trabajo 49
IV MATERIALES Y MEacuteTODOS 51
A Toma de muestras 53
B Obtencioacuten de fagos 54
B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55
B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55
B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas 56
B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos 56
B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC) 58
B6 Modelo de infeccioacuten 59
B7 Controles utilizados durante los ensayos 60
B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium 60
C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos 61
D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica 63
D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 64
D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM 65
V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 67
A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras 69
B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis 70
B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S Typhimurium 70
B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium 72
B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis 72
B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis 73
B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten 73
C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli 75
D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM 80
D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 81
D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable 83
VI CONCLUSIONES 89
VII BIBLIOGRAFIacuteA 93
Iacutendice de figuras
Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa 16
Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por Salmonella spp 24
Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella 24
Figura 4 Adsorcioacuten del bacterioacutefago T4 e inyeccioacuten del ADN 39
Figura 5 Diagrama general de trabajo 50
Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten bacterioacutefago-hueacutesped 59
Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten 62
Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por bacterioacutefagos 74
Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria 79
Figura 10 Imagen por TEM del bacterioacutefago MRH6 80
Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 81
Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable 82
Figura 13 Secuencia de imaacutegenes del DEM 84
Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 por el fago MRH6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86
Iacutendice de tablas
Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias 19
Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos 25
Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales 33
Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos 38
Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos 44
Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria 45
Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos 54
Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten 57
Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos 70
Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC 71
Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium 72
Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis 73
Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten 75
Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades 77
Lista de abreviaturas y acroacutenimos
ADN Aacutecido desoxirribonucleico
ARN Aacutecido ribonucleico
ADC Agar doble capa
AS Agar suave
AECID Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el
Desarrollo
ATCC American Type Culture Collection
APPCC Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control
aw Actividad del agua
BGA Agar verde brillante
BHI Infusioacuten cerebro corazoacuten
CCUG Culture Collection University of Goumltenborg
CENAVECE Centro Nacional de Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de
Enfermedades
CETC Coleccioacuten Espantildeola de Cultivos Tipo
CINSP Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica
EDTA Etilendiaminotetraceacutetico
DEM Microscoacutepica de epifluorescencia directa
EE UU Estados Unidos de Norteameacuterica
ETA Enfermedades transmitidas por alimentos
FAO Food and Agriculture Organization (Organizacioacuten de las
Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura)
FaSPyN Facultad de Salud Puacuteblica y Nutricioacuten UANL
FAUANL Facultad de Agronomiacutea UANL Unidad Mariacuten NL
FCB Facultad de Ciencias Bioloacutegicas UANL
HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points (Anaacutelisis de
Peligros y Puntos Criacuteticos de Control)
INEGI Instituto Nacional de Estadiacutestica y Geografiacutea de los Estados
Unidos Mexicanos
nd Aparente baja efectividad o halo difuso
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
PANALIMENTOS Instituto Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y
Zoonosis
PEG Polietilenglicol
SDS Dodecilsulfato soacutedico
SIRVETA Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos
SSF Solucioacuten salina fisioloacutegica
SUH o SHU Siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico
TEM Microscopio electroacutenico de transmisioacuten
TSA Agar soya de tripicasa
TSAYE TSA con 06 de extracto de levadura
TSB Caldo de soja trypticasa
UAB Universitat Autogravenoma de Barcelona
UANL Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
ZMM Zona Metropolitana de Monterrey
RESUMEN
La inocuidad alimentaria es un tema amplio y relevante que impacta directamente en todos
los segmentos de la sociedad involucra productores desarrolladores innovadores
consumidores y gobierno ademaacutes de diversos sectores como la industria la ingenieriacutea y hasta
la educacioacuten Sin embargo las nuevas tecnologiacuteas en la cadena de produccioacuten provocan que
eacutesta sea maacutes larga y compleja
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) causan alta morbilidad y varios casos
de mortalidad Entre los agentes infecciosos maacutes comunes se encuentran Salmonella spp
Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus
Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus
Los bacterioacutefagos o fagos son virus bacterianos especiacuteficos de una ceacutelula hueacutesped en la
cual se multiplican invadiendo su maquinaria de material geneacutetico Son los sistemas bioloacutegicos
maacutes abundantes del planeta se encuentran en el medio ambiente y se introducen y conviven
en la flora intestinal de otros seres cuando eacutestos ingieren diversos alimentos ya sean de tipo
animal o vegetal
El objetivo del presente trabajo fue aislar y probar la especificidad de una serie de fagos de
Salmonella spp a partir de aguas residuales para lo cual se utilizaron muestras de agua
recolectadas de diferentes localidades del aacuterea metropolitana de Monterrey N L Meacutexico La
purificacioacuten de fagos se llevoacute a cabo mediante la teacutecnica de agar doble capa (ADC) hasta
obtener placas liacuteticas uniformes y se usaron diferentes cepas de referencia de Salmonella
como cultivos indicadores
Se aislaron un total de 15 fagos putativamente distintos de los cuales al pasar las pruebas
de replicacioacuten soacutelo uno logroacute mantener la capacidad liacutetica Se seleccionoacute y purificoacute para
realizar pruebas in vitro especiacuteficas para Salmonella Se utilizoacute una concentracioacuten de fagos
de 1x1012 UFPmL para analizar al fago mediante su morfologiacutea por microscopiacutea electroacutenica
la cual se identificoacute como miembro de la familia Siphoviridae Asiacute mismo se probaron los fagos
contra Salmonella in situ en discos de acero que simulan las superficies de trabajo y para
analizar el efecto de la infeccioacuten del fago sobre Salmonella en los discos de acero inoxidable
se utilizoacute el microscopio de epifluorescencia
Para el conteo de fagos se utilizoacute los meacutetodos LIVEDEAD Para finalizar para evaluar la
efectividad del fago MRH6 que resulto liacutetico en nuestro ensayo se procedioacute a dar las
condiciones necesarias para la formacioacuten del biofilm de Salmonella sobre superficies de acero
inoxidable El fago MRH6 fue capaz de disgregar los biofilms a temperatura ambiente Las
mayores reducciones de Salmonella en un menor tiempo se obtuvieron con concentraciones
de fago mayores a 1x108 UFPmL El meacutetodo de cultivo mostroacute reducciones del patoacutegeno a
niveles indetectables sin embargo la tincioacuten vital reveloacute la presencia de ceacutelulas viables
(coloracioacuten verde) que podriacutea representar un riesgo de contaminacioacuten cruzada estas
pudieran tambieacuten presentarse por la presencia de material orgaacutenico Este trabajo con un fago
puede proporcionar una medida adyuvante para controlar la contaminacioacuten de superficies de
acero inoxidable con biofilms de Salmonella La DEM resultoacute ser una buena herramienta para
evaluar raacutepida y adecuadamente por observacioacuten y posterior anaacutelisis el efecto de los fagos
SUMMARY
Food safety is a broad and relevant issue that directly affects all aspects of society involving
producers developers innovators consumers and government as well as various sectors
such as industry engineering and even education However new technologies in the
production chain cause it to be longer and more complex
Foodborne diseases (ETA) cause high morbidity and several cases of mortality Among the
most common infectious agents are Salmonella spp Campylobacter spp Escherichia coli
Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus Clostridium botulinum Listeria
monocytogenes and Staphylococcus aureus
Bacteriophages or phages are bacterial viruses specific to a host cell in which they multiply
by invading their machinery of genetic material They are the most abundant biological systems
on the planet they can be found in the environment In organisms they enter and coexist in
the intestinal flora of other beings when they ingest various foods whether animal or vegetable
The objective of this study was to isolate and test the specificity of a series of phages of
Salmonella spp from wastewater for which water samples were collected from different
locations in the metropolitan area of Monterrey N L Meacutexico The purification of phages was
carried out by means of the double layer agar technique (ADC) until uniform lithic plates were
obtained and different Salmonella reference strains were used as indicator cultures
A total of 15 putatively different phages were isolated of which upon passing the replication
tests only one managed to maintain the lytic capacity It was selected and purified to perform
specific in vitro tests for Salmonella A phage concentration of 1x1012 PFUmL was used to
analyze the phage by means of its electron microscopy morphology which was identified as a
member of the Siphoviridae family Likewise the phages against Salmonella were tested in
situ on steel discs simulating the work surfaces and the epifluorescence microscope was used
to analyze the effect of phage infection on Salmonella on the stainless steel discs
For the phage count the LIVE DEAD Finally in order to evaluate the effectiveness of the
phage MRH6 that was lytic in our trial the necessary conditions for the formation of the
Salmonella biofilm on stainless steel surfaces were established The phage MRH6 was able
to disintegrate the biofilms at room temperature The greatest reductions of Salmonella in a
shorter time were obtained with phage concentrations greater than 1x107 PFUmL The culture
method showed reductions of the pathogen to undetectable levels however vital staining
revealed the presence of viable cells (green coloration) which could represent a risk of cross
contamination these could also be presented by the presence of organic material This work
with a phage can provide an adjuvant measure to control contamination of stainless steel
surfaces with Salmonella biofilms The DEM proved to be a dependable tool to quickly and
adequately evaluate the effect of phages by observation and subsequent analysis
RESUM
La innocuiumltat alimentagraveria eacutes un tema ampli i rellevant que impacta directament en tots els
segments de la societat involucra productors desenvolupadors innovadors consumidors i
govern a meacutes de diversos sectors com la induacutestria lenginyeria i fins a leducacioacute No obstant
aixograve les noves tecnologies en la cadena de produccioacute provoquen que aquesta sigui meacutes llarga
i complexa
Les malalties transmeses per aliments (ETA) causen alta morbiditat i diversos casos de
mortalitat Entre els agents infecciosos meacutes comuns es troben Salmonella spp
Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus
Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus
Els bacteriogravefags o fags soacuten virus bacterians especiacutefics duna cegravelmiddotlula hoste en la qual es
multipliquen envaint la seva maquinagraveria de material genegravetic Soacuten els sistemes biologravegics meacutes
abundants del planeta es troben en el medi ambient i sintrodueixen i conviuen en la flora
intestinal daltres eacutessers quan aquests ingereixen diversos aliments ja siguin de tipus animal
o vegetal
Lobjectiu del present treball va ser aiumlllar i provar lespecificitat duna segraverie de fags de
Salmonella spp a partir daiguumles residuals per a aixograve es van utilitzar mostres daigua recollides
de diferents localitats de lagraverea metropolitana de Monterrey N L Megravexic La purificacioacute de fags
es va dur a terme mitjanccedilant la tegravecnica dagar doble capa (ADC) fins a obtenir plaques liacutetiques
uniformes i es van usar diferents soques de referegravencia de Salmonella com a cultius indicadors
Es van aiumlllar un total de 15 fags possiblement diferents dels quals en passar les proves
de replicacioacute nomeacutes un va aconseguir mantenir la capacitat liacutetica Es va seleccionar i va
purificar per realitzar proves in vitro especiacutefiques per Salmonella Es va utilitzar una
concentracioacute de fags de 1x1012 UFPmL per analitzar fag mitjanccedilant la seva morfologia per
microscogravepia electrogravenica la qual es va identificar com a membre de la famiacutelia Siphoviridae Aixiacute
mateix es van provar els fags contra Salmonella in situ en discos dacer que simulen les
superfiacutecies de treball i per analitzar lefecte de la infeccioacute del fag sobre Salmonella en els
discos dacer inoxidable es va utilitzar el microscopi depifluorescegravencia
Per al recompte de fags es va utilitzar els megravetodes LIVE DEAD Per finalitzar per avaluar
lefectivitat del fag MRH6 que va resultar liacutetic en el nostre assaig es va procedir a donar les
condicions necessagraveria per a la formacioacute del biofilm de Salmonella sobre superfiacutecies dacer
inoxidable El fag MRH6 va ser capaccedil de disgregar els biofilms a temperatura ambient Les
majors reduccions de Salmonella en un menor temps es van obtenir amb concentracions de
fag majors a 1x107 UFP mL El megravetode de cultiu va mostrar reduccions del patogen a nivells
indetectables perograve la tincioacute vital revelar la presegravencia de cegravelmiddotlules viables (coloracioacute verda)
que podria representar un risc de contaminacioacute creuada aquestes poguessin tambeacute
presentar-se per la presegravencia de material orgagravenic Aquest treball amb un fag pot proporcionar
una mesura adjuvant per controlar la contaminacioacute de superfiacutecies dacer inoxidable amb
biofilms de Salmonella La DEM va resultar ser una bona eina per avaluar ragravepida i
adequadament per observacioacute i posterior anagravelisi lefecte dels fags
7
I INTRODUCCIOacuteN
Introduccioacuten
8
Introduccioacuten
9
Presentacioacuten del proyecto
Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica sobre las innovaciones en seguridad alimentaria en
Meacutexico la cual puso en evidencia la necesidad de analizar alternativas enmarcadas en el
aacutembito del uso de las tecnologiacuteas verdes lo que presentoacute la posibilidad de desarrollar un
trabajo innovador y que no se estuviera aplicando ya en el sector alimentario local o nacional
De esa manera se inician las actividades experimentales que para este trabajo doctoral se
dividieron en dos partes la primera realizada en Meacutexico y la segunda en Espantildea
En primera instancia se desarrolloacute un anaacutelisis en el Laboratorio de geneacutetica y biologiacutea
molecular del Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica (CINSP) en el Campus
Ciencias de la Salud de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) y gracias al apoyo
de Programa de mejoramiento del profesorado (PROMEP nuacutemero UANL-326) por medio de
una beca se iniciaron los estudios y asiacute se cumplioacute el primer propoacutesito que fue obtener virus
nativos contra cepas de Salmonella y purificarlos
Posteriormente para lograr los demaacutes objetivos que eran realizar la caracterizacioacuten parcial
de los fagos contra Salmonella se solicitoacute una beca a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten
Internacional para el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y
de Cooperacioacuten curso 2010-2011) con el fin de realizar una estancia de investigacioacuten y crear
oportunidades de desarrollo aprovechando las tecnologiacuteas innovadoras disponibles en la
Universitat Autoacutenoma de Barcelona (UAB) considerando ademaacutes que la alta reputacioacuten de la
institucioacuten y la supervisioacuten por parte de sus investigadores impactariacutean positivamente en el
desarrollo del trabajo y en el Curriculum Vitae del investigador y por consiguiente en su futuro
profesional como docente e investigador
Otra finalidad de este proyecto fue dejar un buen referente al concluir la estancia ya que
ello ofreceriacutea nuevas oportunidades para seguir forjando el perfil del investigador cimentaraacute
cualquier trayectoria profesional y facilitariacutea optar por un plan postdoctoral en esta misma
Universidad De esta manera se accedioacute a la beca del Programa Extranjeros II-A
Convocatoria 2010-2011 Nuacutemero 0000521211 del cual se cumplieron los objetivos
establecidos y otros maacutes por ejemplo conocer nuevas tecnologiacuteas
Siendo eacutesta una liacutenea de investigacioacuten relativamente reciente en Meacutexico se espera que
impacte en las posibilidades laborales en diversos contextos y seacutea de utilidad para sentar
precedentes para futuras liacuteneas de trabajo en dicha aacuterea
Introduccioacuten
10
Justificacioacuten
En las uacuteltimas deacutecadas los cambios ocurridos en la produccioacuten y consumo de alimentos
han tenido un impacto sobre la inocuidad alimentaria La industria en la produccioacuten masiva de
alimentos ha evolucionado de ser local a constituirse en otra donde la produccioacuten yo el
procesamiento estaacuten localizados en diferentes partes del paiacutes o del mundo Por otra parte la
poblacioacuten estaacute envejeciendo por lo que se vuelve maacutes vulnerable a problemas de salud
ademaacutes los agentes patoacutegenos son cada vez maacutes virulentos (DeWaal y Barlow 2014)
Los reportes sobre problemas gastrointestinales que recopila el Centro Nacional de
Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades (CENAVECE) indican que Nuevo
Leoacuten ha permanecido dentro de los primeros 12 lugares de casos de fiebre tifoidea y en los
primeros 14 de fiebre paratifoidea y otras salmonelosis A nivel nacional las enfermedades
infecciosas intestinales se ubican entre las primeras 10 causas de mortalidad de nintildeos en
edad escolar entre los 5 y 14 antildeos de edad (CENAVECE 2007)
Los microorganismos del geacutenero Salmonella pertenecen a la familia Enterobacteriaceae
Son bacilos o cilindros con puntas redondeadas y se diferencian de las demaacutes enterobacterias
mediante reacciones bioquiacutemicas y de aglutinacioacuten existen maacutes de 2500 serotipos todos
ellos patoacutegenos Actualmente se considera una sola especie denominada Salmonella
enterica de la cual seguacuten el esquema de Kauffmann-White se clasifican nueve serogrupos
Esta especie tiene importancia cliacutenica debido a que es la uacutenica capaz de infectar animales
homeotermos esta investigacioacuten se centra en cuatro serovariedades Salmonella enterica
serovar Typhimurium (S Typhimurium) S enterica serovar Paratyphi (S Paratyphi) S
enterica serovar Enteritidis (S Enteritidis) y S enterica serovar Typhi (S Typhi) estos
microorganismos se pueden aislar tanto de fuentes alimentarias (carne de res pollo crudo
huevo fresco carne de puerco almejas chorizos vegetales entre otros) como del medio
ambiente (suelo agua materia fecal y superficies) (Chlebicz y Śliżewska 2018 Nguendo
2018)
En Meacutexico S Enteritidis y S Typhimurium son los microorganismos aislados con mayor
frecuencia en las salmonelosis Normalmente S Enteritidis habita en el intestino de los
animales sin causar enfermedad pero puede infectar a humanos y promover diarrea voacutemito
dolor abdominal calambres y ocasionalmente insuficiencia renal y en los peores casos la
muerte (DeWaal y Barlow 2014) La contaminacioacuten de alimentos por Salmonella spp se debe
Introduccioacuten
11
a una combinacioacuten de factores relacionados con la produccioacuten a gran escala o cambios en el
manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los mismos (Uribe y Suarez 2006)
Por otra parte estaacuten los virus que pueden replicarse independientemente de los
cromosomas de una ceacutelula pero no sin su participacioacuten (Madigan y Martinko 2006) El hecho
de descubrir virus que pueden infectar y destruir bacterias fue recibido con optimismo por su
posible aplicacioacuten en usos terapeacuteuticos (McLaughlin et al 2006)
En un estudio realizado en diversos estados de Meacutexico (Coahuila Durango Estado de
Meacutexico Jalisco Morelos Oaxaca Puebla y Quereacutetaro) se ha fagotipado Salmonella spp
proveniente de huevo carne de pollo de engorde y gallinas progenitoras reproductoras de
postura comercial y productoras (Mancera et al 2004) Ademaacutes diversas investigaciones han
utilizado fagos liacuteticos para reducir la contaminacioacuten por Salmonella en pollos (canal y piel)
semillas germinadas y dulces de frutas cortadas (Goode et al 2003)
El uso de aditivos en los alimentos se ha reducido considerablemente debido al rechazo
generalizado por parte de los consumidores lo que podriacutea repercutir en un incremento en los
casos de intoxicaciones alimentarias En este contexto los fagos aportan ventajas sobre los
desinfectantes conocidos y los meacutetodos tradicionales de aplicacioacuten de friacuteo o calor ya que
pueden actuar como agentes de deteccioacuten y control bioloacutegico de bacterias patoacutegenas en
alimentos y su produccioacuten es relativamente raacutepida y econoacutemica (Atterbury et al 2003)
La utilidad de los fagos en el aacuterea de investigacioacuten es amplia una posible utilidad es ser
un instrumento para identificar cepas bacterianas especiacuteficas Tambieacuten se han utilizado para
el estudio de diversos fenoacutemenos moleculares el trabajo con estos virus permitioacute desarrollar
ensayos de placas de lisis conocer la naturaleza del ciclo de vida viral los tipos de mutaciones
geneacuteticas y los genes como segmentos de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) (Muniesa et al
2005)
Las empresas dedicadas a la biotecnologiacutea (Intralytix Omnilytics) se centran en desarrollar
productos utilizando fagos especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan las ETA y estos
productos comerciales de terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones
(Segundo 2010) Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos antildeos debido a sus
caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutefico sin dantildear la microbiota
en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros distribucioacuten de
Introduccioacuten
12
esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla (Oh y Park
2017)
En este sentido el objetivo general de este estudio es el aislamiento y caracterizarizacion
de fagos contra Salmonella a partir de diversas fuentes para su uso potencial en el control
bioloacutegico
13
II ANTECEDENTES
Antecedentes
14
Antecedentes
15
A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos
A nivel internacional la produccioacuten de alimentos y todos los mecanismos tecnoloacutegicos
involucrados en su procesamiento implican ademaacutes de la optimizacioacuten de los tiempos y de
la calidad un riesgo para la adquisicioacuten de enfermedades inherentes a la misma adopcioacuten
de nuevas tecnologiacuteas (Weaver et al 2017)
La OMS (2017) estima que las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de
muerte de nintildeos menores de cinco antildeos matan a 525000 nintildeos menores de cinco antildeos
cada antildeo una proporcioacuten significativa de las enfermedades diarreicas se puede prevenir
mediante el acceso al agua potable y a servicios adecuados de saneamiento e higiene
ademaacutes de que en todo el mundo se producen unos 1700 millones de casos de
enfermedades diarreicas infantiles cada antildeo
Seguacuten la OMS (2017) existen diferentes condiciones que propician el desarrollo de las
ETA Como son las de tipo bioloacutegico producidos por hongos o bacterias causantes de
enfermedades ya sea por sus metabolitos o toxinas virus o huevecillos de paraacutesitos asiacute
como los venenos de algunos peces y plantas Las de tipo quiacutemico como productos de
limpieza o desinfeccioacuten pesticidas toxinas marinas insecticidas o venenos y fiacutesicos cuando
en la materia prima de los alimentos se encuentran objetos como vidrios metal piedras
grapas barniz de untildeas joyeriacutea cabellos o cualquier elemento extrantildeo
De acuerdo con el Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos (SIRVETA) ndashdesarrollado por el Instituto
Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y Zoonosis (PANALIMENTOS)ndash ocurrieron 1683
brotes de ETA en Meacutexico que ocasionaron 53860 casos de enfermedades y provocaron
207 muertes mientras que en los demaacutes paiacuteses de Ameacuterica Latina se produjeron durante el
mismo periacuteodo 6324 brotes que provocaron 228579 casos y 314 muertes (Forsythe y
Hayes 2002) Cabe aclarar que eacutestos son soacutelo los brotes notificados por la autoridad
competente El sistema utilizado internacionalmente para obtener alimentos inocuos es el
APPCC (Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control) o HACCP (por sus siglas en ingleacutes
Hazard Analysis and Critical Control Points) que se puede implementar en cualquier tipo de
industria y permite prevenir controlar y eliminar cualquier peligro antes de consumir los
alimentos (Rodriacuteguez Torrens et al 2015)
En Meacutexico el Distintivo H es un programa implementado por los servicios alimentarios
Antecedentes
16
oficiales mediante el cual se ofrece a los clientes alimentos seguros El Centro Nacional de
Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades de Meacutexico (CENAVECE) advierte
que uno de los problemas de salud maacutes importantes lo constituyen los trastornos
gastrointestinales cuya mortalidad predomina entre los 5 y los 14 antildeos Entre 2006 y 2012
el Estado de Nuevo Leoacuten ha permanecido entre los primeros 7 lugares de casos de diarrea
(CENAVECE 2018)
La figura 1 muestra la distribucioacuten de la incidencia en Meacutexico la cual estaacute asociada a la
densidad demograacutefica y la accesibilidad a servicios de salud que facilitan el registro es asiacute
que son precisamente las entidades federativas con mayor poblacioacuten quienes registran
nuacutemeros maacutes altos
Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa en
Meacutexico 2010-2012 (CENAVECE 2018)
A1 Problemaacutetica
La inocuidad alimentaria es una preocupacioacuten mundial que se refleja en el incremento
de reportes y noticias relacionadas con la contaminacioacuten de los alimentos difundidos en
diversos paiacuteses a su vez estos productos son retirados del mercado lo que provoca
peacuterdidas por varios cientos de millones de doacutelares El Codex Alimentarius indica que las ETA
y los dantildeos provocados por los alimentos son en el mejor de los casos desagradables y
Antecedentes
17
en el peor fatales y pueden influir negativamente en el comercio y la confianza de los
consumidores Por consiguiente es imprescindible un control eficaz de la higiene Todos los
eslabones de la cadena alimentaria ndashfabricantes elaboradores manipuladores y
consumidores de alimentosndash son responsables del control de los riesgos microbioloacutegicos
desde la explotacioacuten agriacutecola o ganadera hasta el consumidor final Desde esta oacuteptica el
anaacutelisis de riesgos deberiacutea aplicarse dentro de un contexto estrateacutegico organizativo y
operacional reconocido si bien en el proceso puede haber elementos comunes establecer
un nivel apropiado de proteccioacuten en esos sectores puede representar las maacuteximas
diferencias (Atterbury et al 2003)
La OMS ha identificado siete microorganismos patoacutegenos ndashC jejuni C perfringens E
coli 0157H7 L monocytogenes Salmonella spp S aureus y T gondiindash que causan entre
123 y 33 millones de casos de infeccioacuten solamente en los EE UU lo que representa
peacuterdidas econoacutemicas de entre 5500 y 34900 millones de doacutelares Ademaacutes resalta que su
incidencia podriacutea ser de 300 a 350 veces mayor de lo que indican las estadiacutesticas dado que
soacutelo se notifica un nuacutemero relativamente pequentildeo de casos de ETA Se estima que 70 de
los 1500 millones de episodios de diarrea son causados por alimentos en mal estado Es
posible que en los paiacuteses en desarrollo se notifique a las autoridades sanitarias una
proporcioacuten de casos auacuten inferior principalmente por pobreza y escasez de recursos a
disposicioacuten de los servicios de gestioacuten de la inocuidad alimentaria e inspeccioacuten de alimentos
(Van de Venter 2000)
A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea
La OMS estima que el 88 de los casos de diarrea a nivel mundial son atribuibles al
agua el saneamiento y la higiene todos los aspectos de inocuidad de los alimentos estaacuten
relacionados con estos factores En menor medida la enfermedad se transmite a traveacutes de
otras viacuteas por ejemplo el aire y alrededor del 94 de los casos son atribuibles al
saneamiento ambiental el total de fallecimientos se calcula en maacutes de 15 millones
principalmente en nintildeos en los paiacuteses desarrollados el promedio es ligeramente menor a
90 La diarrea atribuible al agua y saneamiento inapropiado representa 53 de las
muertes totales y 35 en nintildeos europeos de 0-14 antildeos y es ademaacutes una de las causas
principales de malnutricioacuten (Pruumlss-Uumlstuumln y Corvalaacuten 2006)
Antecedentes
18
Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud puacuteblica en el mundo
especialmente en paiacuteses en desarrollo Su alta incidencia se debe en gran parte a la
ingestioacuten de alimentos contaminados con microorganismos patoacutegenos como Salmonella
que causa episodios de diarrea aguda Salmonella spp es uno de los patoacutegenos enteacutericos
maacutes frecuentes tanto en paiacuteses desarrollados como subdesarrollados Dependiendo de la
especie tamantildeo del inoacuteculo factores de virulencia expresados por la cepa hueacutesped
involucrado estado inmunoloacutegico del paciente e intervencioacuten meacutedica puede ocasionar una
infeccioacuten gastrointestinal de media a severa hasta una infeccioacuten sistemaacutetica que
comprometa la vida del paciente (Fernaacutendez 2008)
Otros microorganismos que tambieacuten pueden contaminar el agua y los alimentos como
bacterias (Bacillus cereus Clostridium botulinum Campylobacter jejuni Vibrio cholera) virus
(Norwalk Rotavirus Hepatitis A) y paraacutesitos (Entamoeba histolytica Cryptosporidium
parvum Toxoplasma gondii) pueden transmitirse tambieacuten de una persona a otra como
resultado de una higiene deficiente (Freedman et al 2015)
Estudios de empresas dedicadas exclusivamente a la crianza de cerdos reportan
epidemias como el virus de la diarrea porcina la cual posteriormente se transmite a los
consumidores de estas carnes contaminadas ya sea por contacto con las heces o por
consumo de carnes contaminadas lo cual implica tambieacuten una peacuterdida econoacutemica para la
industria alimentaria resaltando la necesidad de establecer medidas preventivas y
correctivas seguacuten sea el caso (Huss et al 2017)
Seguacuten la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO
por sus siglas en ingleacutes Food and Agriculture Organization) las toxiinfecciones alimentarias
son la segunda causa de morbilidad pero muchas permanecen sin declarar quizaacutes por su
mediana severidad y recuperacioacuten raacutepida salvo el coacutelera Los alimentos son susceptibles a
contaminacioacuten de todo tipo la fuente de agentes causales suele ser el tracto gastrointestinal
de individuos reservorios o las heces de animales y humanos infectados o bien agua
corrompida que por deficiencias sanitarias contamina carne fresca pescados moluscos
pasteles de crema y leche no pasteurizada entre otros productos (Riacuteos et al 2012) como
se puede observar en la tabla 1
Antecedentes
19
Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias (Riacuteos et al 2012)
Agente Periacuteodo de
incubacioacuten Fuente Agente patoacutegeno
Salmonella spp 8-24 h Aves huevos mascotas
(tortugas lagartos pollos) Bacteria y endotoxina
E coli
enterotoxigeacutenica 24-72 h
Agua y alimentos
contaminados
Enterotoxina
termoestable
V cholerae 24-72 h Alimentos contaminados Enterotoxina termolaacutebil
Shigella spp 24-72 h Agua y alimentos
contaminados Bacteria y endotoxina
C jejuni 1-7 d Leche aves de corral y
agua no potable
Bacteria y Enterotoxina
termolaacutebil
Yersinia spp 1-7 d Carne de cerdo leche Bacteria y Enterotoxina
B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria
La historia referente a las toxiinfecciones alimentarias se comienza a documentar y
legislar en el siglo X con el botulismo en Bizanzio y documentos sobre el ergotismo en el
siglo XVI En el siglo XIX aparecen los alimentos enlatados y Louis Pasteur asocia el
deterioro de los alimentos con las bacterias En el siglo XX se produce un desarrollo
espectacular de la microbiologiacutea de los alimentos con el establecimiento de la etiologiacutea de
las toxiinfecciones alimentarias el comienzo de una nueva era de la quiacutemica e ingenieriacutea
alimentaria Aunado a los movimientos migratorios de las personas la diversificacioacuten de
alimentos la produccioacuten masiva de alimentos y la facilidad de transporte desde puntos
lejanos entre la produccioacuten y preferencia en el consumo de alimentos aunadas a la
capacidad que tienen los microorganismos para evolucionar y adaptarse a su medio
ambiente hacen pensar en estos microorganismos como patoacutegenos emergentes (DeWaal y
Barlow 2014)
B1 Escherichia
Las cepas de E coli se pueden diferenciar seroloacutegicamente por los antiacutegenos somaacuteticos
(O) flagelares (H) y capsulares (K) Ademaacutes pueden hallarse fimbrias y estructuras
Antecedentes
20
emparentadas que desempentildean un papel en la patogenia Actualmente se reconocen cinco
grupos de E coli causantes de diarrea en funcioacuten del siacutendrome que provocan cuyas
diferencias estaacuten codificadas por plaacutesmidos (Wright et al 2017) Los diferentes tipos son
E coli enteropatoacutegeno (EPEC) es responsable de la diarrea acuosa en lactantes
Produce voacutemitos fiebre y diarrea acuosa con mocos pero sin sangre Coloniza las
microvellosidades de todo el intestino produciendo la lesioacuten de ldquoadhesioacuten y erosioacutenrdquo en
el ribete en cepillo de la membrana de la vellosidad Afecta a adultos y nintildeos menores de
dos antildeos siendo este rango de edad el principal factor de riesgo
E coli enterotoxigeacutenico (ETEC) es el causante de la llamada vulgarmente ldquodiarrea
del viajerordquo se manifiesta con diarrea acuosa como agua de arroz y poca fiebre
Coloniza la porcioacuten proximal del intestino delgado Afecta a adultos y nintildeos son una causa
frecuente de diarrea en lactantes de paiacuteses en desarrollo asiacute como la causa maacutes comuacuten
de diarrea en individuos de paiacuteses industrializados que viajan a zonas menos
desarrolladas del mundo
E coli enteroinvasor (EIEC) coloniza el colon origina fiebre y diarrea profusa con
heces que contienen mocos y estriacuteas sanguinolentas Presenta un plaacutesmido de 120-140
mD conocido como plaacutesmido invasivo que lleva todos los genes necesarios para la
virulencia Al igual que ETEC pero afecta principalmente a adultos
E coli enterohemorraacutegico (EHEC) origina diarrea sanguinolenta colitis hemorraacutegica
siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico (SUH o SHU) y puacuterpura trombocitopeacutenica En este grupo se
incluye E coli verotoxigeacutenico (VTEC) serotipos O157 O26 O111 Afecta principalmente
a nintildeos el principal factor de riesgo es el consumo de carne sin la coccioacuten adecuada
E coli enteroagregativo (EAggEC) posee caraacutecter clonal diferenciaacutendose dos clones
relacionados (1 y 2) Dentro de cada grupo estaacute presente una variedad concreta de
antiacutegenos O mientras que los antiacutegenos H se conservan
En los reportes cientiacuteficos sobre E coli se refieren a las plantas como otra fuente de
infeccioacuten especiacuteficamente en la espinaca (Spinacia oleracea) y lechuga (Lactuca sativa) Se
recomienda igualmente estudiar profundamente los cultivos y los tejidos vegetables y
animales ya que se deben considerar como paraacutemetros de riesgo para la inocuidad de los
alimentos (Fernaacutendez Ferran et al 2003 Wright et al 2017)
B2 Campylobacter
Campylobacter spp es un bacilo delgado gram negativo (05-08 microm x 02-05 microm) y
Antecedentes
21
microaeroacutefilo (necesita 3-5 de O2 y 2-10 de CO2) Su morfologiacutea puede variar entre
vibrioacutenica (bacilos curvados) espirilar en forma de rosquilla de S y cocoide de tal forma
que en fase logariacutetmica de crecimiento las ceacutelulas tienen forma espiral o curvada pero a
medida que los cultivos envejecen adquieren formas esfeacutericas Moacutevil con un uacutenico flagelo
polar que presenta de dos a tres veces el largo de la ceacutelula Aunque hay diversas especies
de Campylobacter causantes de enfermedades C jejuni C coli y C lari son las especies
que se aiacuteslan con mayor frecuencia en casos de gastroenteritis humana siendo C jejuni la
responsable de la mayoriacutea de las toxiinfecciones alimentarias 89-93 de las
toxiintoxicaciones (OMS 2017)
Las especies C coli y C lari son semejantes a C jejuni su diferencia se basa en pruebas
bioquiacutemicas C coli no es capaz de hidrolizar el piruvato y C lari es capaz de crecer en
presencia de 30 microgramos de aacutecido nalidiacutexico (Haddad et al 2013) La movilidad la
quimiotaxis y los flagelos son factores importantes en la virulencia pues de ellos depende la
colonizacioacuten del epitelio intestinal Campylobacter produce una enterotoxina parecida a la
toxina coleacuterica que tambieacuten juega un papel importante en la patogenia (Nichols 2005) C
jejuni puede sobrevivir de 2 a 4 semanas en condiciones de baja humedad oxigenacioacuten y
temperaturas de 4ordmC superando muchas veces el tiempo de vida uacutetil del producto Asimismo
puede perdurar de 2 a 5 meses a -20ordmC pero a temperatura ambiente apenas dura algunos
diacuteas (Khan et al 2013)
C jejuni y C coli son sensibles a diversos agentes antimicrobianos como los macroacutelidos
los aminoglucoacutesidos el cloranfenicol y la tetraciclina La eritromicina ha sido el antibioacutetico de
eleccioacuten para tratar las infecciones del tracto intestinal Al igual que en Salmonella el control
de Campylobacter se debe realizar tanto en el sector agropecuario como en los
establecimientos alimentarios por lo que los controles especificados para Salmonella
podriacutean extrapolarse a este microorganismo Un aspecto importante de su control reside en
la refrigeracioacuten de las aves ya que la baja temperatura junto con la desecacioacuten superficial
que se produce reduce significativamente la incidencia y los recuentos de Campylobacter
viables incluso en canales altamente contaminadas (Fernaacutendez 2008)
B3 Enterobacter
Conocido antiguamente como Cronobacter spp incluye varias especies de patoacutegenos
emergentes relacionados con brotes de meningitis septicemia y enterocolitis necrotizante
especialmente en neonatos y nintildeos La tasa de mortalidad de estos brotes es alta entre 20
Antecedentes
22
y 80 y los supervivientes suelen sufrir severos desoacuterdenes neuroloacutegicos (Grimont y
Grimont 2006)
E sakazakii es un bacilo moacutevil no esporulado gram negativo que ha sido encontrado en
alimento para bebeacutes es maacutes resistente a los cambios osmoacuteticos y a la sequiacutea que otros
miembros de la familia Enterobacteriaceae y se asocia con casos esporaacutedicos de sepsis
meningitis cerebritis y enterocolitis necrotizante La mayoriacutea de las infecciones se observan
en bebeacutes con bajo peso al nacer y que son alimentados de forma insalubre La mortalidad
ha disminuido a menos de 20 en los uacuteltimos antildeos Este microorganismo no se ha
encontrado presente en la foacutermula laacutectea tampoco existe evidencia de la transmisioacuten de
persona a persona o un medio general de difusioacuten ambiental (Vanegas et al 2009)
B4 Listeria
L monocytogenes estaacute muy difundida en la naturaleza en la que suele adoptar un ciclo
saprofiacutetico en estrecha relacioacuten con el suelo Ademaacutes se ha encontrado en aguas
continentales sedimentos marinos material vegetal en descomposicioacuten forrajes heces
humanas y animales y aguas residuales de explotaciones animales entre otros ambientes
lo que explica su presencia en alimentos crudos Epidemioloacutegicamente se caracteriza por su
ubicuidad sobreviviendo en tierra huacutemeda hasta 500 diacuteas en funcioacuten de la temperatura En
heces o aguas residuales mantenidas a temperatura de refrigeracioacuten sobrevive maacutes de seis
antildeos este periodo se reduce si se mantiene a temperatura ambiente (Guenther et al 2009)
Listeria spp son bacilos gram positivos de forma regular y con forma de vara corta
Algunas veces pueden tener forma cocoide apareciendo como ceacutelulas individuales o en
cadenas cortas Son moacuteviles entre 20-25ordmC pero no a 37ordmC Existen seis especies de Listeria
descritas L monocytogenes L innocua L welshimeri L seeligeri L grayi y L ivanovii
subespecie ivanovii y subespecie londoniensis Las cepas patoacutegenas de L monocytogenes
producen la listeriolisina O responsable de la hemoacutelisis-β y de la destruccioacuten de las ceacutelulas
fagocitarias es una hemolisina que segrega la bacteria a causa de la disminucioacuten de pH
(Liu 2006)
L monocytogenes tolera y se multiplica en concentraciones altas de NaCl contando con
la posibilidad de sobrevivir durante un antildeo en ambientes con una concentracioacuten de 16 su
tolerancia aumenta al disminuir el pH o la temperatura del medio Los tratamientos para su
inactivacioacuten son de 617ordmC35min 70ordmC20min 78ordmC15min u 80ordmC5min favoreciendo su
Antecedentes
23
resistencia al calor con la presencia de grasas Se multiplica entre 0 y 4ordmC las temperaturas
bajas ejercen un efecto protector de tal manera que en condiciones de acidez su inactivacioacuten
es maacutes lenta en refrigeracioacuten que a temperatura ambiente (Leverentz et al 2003) La acidez
influye en la capacidad de Listeria para sobrevivir a la congelacioacuten (temperaturas inferiores
a -47ordmC) y almacenamiento a menos de -18ordmC en carne mostrando una disminucioacuten en la
recuperacioacuten de ceacutelulas viables que han sido dantildeadas por el friacuteo (Wu et al 2015)
B5 Salmonella
B51 Origen
Salmonella tiene su origen principal en el tracto intestinal de animales fundamentalmente
las aves y los porcinos y pueden acabar contaminando las carnes crudas el pollo crudo los
productos marinos crudos o el huevo Los brotes de Salmonella estaacuten asociados al consumo
de alimentos elaborados con huevo crudo y siguen siendo frecuentes a pesar de conocerse
el riesgo que representa su consumo de las medidas legales adoptadas y de los programas
de educacioacuten sanitaria dirigidos a disminuir su incidencia Este geacutenero pertenece a la familia
Enterobacteriaceae fue descrito a principios del siglo XX por el bacterioacutelogo estadounidense
Theobald Smith (Zaidi et al 2006) En la figura 2 se muestran los factores de virulencia y
en la figura 3 se presenta la clasificacioacuten de Salmonella enterica con las diferentes
subespecies y serovares que se aiacuteslan maacutes frecuentemente
Antecedentes
24
Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por
Salmonella spp (Brenner et al 2000)
Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella (Brenner et al 2000)
Antecedentes
25
B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp
La mayoriacutea de los miembros de este geacutenero se encuentra en el tracto intestinal del
hombre y los animales como bacterias patoacutegenas o comensales Estaacute integrado por bacilos
gram negativos anaerobios facultativos y no esporulados La mayor parte de los serotipos
conocidos son moacuteviles mediante flagelos peritricos Se conocen maacutes de 2460 serotipos
muchos de ellos patoacutegenos para el ser humano (Chlebicz y Śliżewska 2018)
Son bacterias invasoras enterotoxigeacutenicas y estaacuten ampliamente diseminadas en todo el
mundo su temperatura ideal de sobrevivencia entre los 15 y los 35degC (mesoacutefilas) y en una
amplitud de pH de 45 a 9 Los microorganismos de este geacutenero se distribuyen en seis
grupos se han definido mediante biotipado hibridacioacuten DNA-DNA anaacutelisis de la secuencia
del RNA ribosomal 16S y por ldquomultilocus enzyme electrophoresisrdquo (MLEE) (Brenner et al
2000) La serotipificacioacuten se utiliza para diferenciar maacutes allaacute del nivel de subespecie como
puede observarse en la tabla 2
Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos (Brenner et al 2000)
Grupo Microorganismo
A S Paratyphi Al
B S Typhimurium S Bredeney
C1 S Choleraesuis S Montevideo S Oranienburg
C2 S Newport
D S Typhi S Enteritidis S Dublin S Gallinarum
E S Butantan S Anatum S Give
Salmonella serotipo Typhi es la causante de la fiebre tifoidea presentando siacutentomas como
son fiebre de intensidad variable cefalea diarrea estrentildeimiento tos naacuteuseas y voacutemitos
anorexia dolor abdominal y escalofriacuteos Mientras que los demaacutes serotipos considerados no
tifoidicos presentan un estado asintomaacutetico En el antildeo 2000 los serotipos aislados con
mayor frecuencia en EE UU fueron S Typhimurium S Enteritidis y S Newport (Dunkley et
Antecedentes
26
al 2009) En Meacutexico los serotipos de Salmonella spp identificados con mayor frecuencia
en los servicios de salud fueron S Typhimurium (204) y S Enteritidis (183) (Guenther
et al 2009)
La salmonelosis se produce por la ingestioacuten de alimentos o bebidas contaminados por
Salmonella se manifiesta como una enterocolitis aguda y se caracteriza por presentar
siacutendromes febriles asociados a manifestaciones gastrointestinales o sisteacutemicas con
frecuencia severas (Figueroa y Verdugo 2005 Fernaacutendez 2008) El cuadro cliacutenico se
localiza baacutesicamente en el iacuteleo terminal y el intestino grueso La enfermedad se manifiesta
a traveacutes de diferentes fases En la primera fase la infeccioacuten se limita a la mucosa intestinal
en la siguiente la bacteria invade el tejido linfaacutetico local y le sigue una fase de bacteriemia
durante la cual la mayoriacutea de las bacterias son fagocitadas por macroacutefagos del hiacutegado y el
bazo (Calva et al 2006 Bettini et al 2012)
Con frecuencia el meacutedico hace un diagnoacutestico basaacutendose en el cuadro cliacutenico del
paciente pero sin contar con los estudios microbioloacutegicos necesarios para establecer un
diagnoacutestico certero cuando se presenta infeccioacuten por Salmonella inicia una fase de
crecimiento bacteriano intracelular el cual despueacutes de varios diacuteas provoca la liberacioacuten de
gran cantidad de patoacutegenos al torrente sanguiacuteneo (Zaidi et al 2006)
La salmonelosis es una enfermedad aguda de distribucioacuten mundial Afecta a todos los
grupos de edad con mayor incidencia en los extremos de la vida provocando infecciones
en forma endeacutemica o en brotes epideacutemicos de intoxicacioacuten alimentaria que en ocasiones
abarcan amplias zonas geograacuteficas debido a las extensas cadenas de distribucioacuten de
alimentos existentes hoy en diacutea (Fernaacutendez 2008)
Para la salud puacuteblica la salmonelosis tiene un impacto socioeconoacutemico tanto en los paiacuteses
en desarrollo como en los paiacuteses desarrollados Ademaacutes al no recibir tratamiento puede
ser causante del siacutendrome de Reiter el cual se manifiesta por dolor en articulaciones
irritacioacuten en los ojos dolor al orinar y puede durar meses o antildeos desencadenaacutendose una
artritis croacutenica (CFSPH 2005) Desde la deacutecada de los ochenta la incidencia de
salmonelosis de origen alimentario ha aumentado considerablemente en Meacutexico Este
incremento es resultado de una combinacioacuten de factores como la calidad del agua utilizada
para riego y el manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los alimentos (Zaidi
et al 2006)
Antecedentes
27
Un meta-anaacutelisis (revisioacuten sistemaacutetica en la cual se combinan matemaacuteticamente los
resultados de varios estudios para contestar una misma pregunta) realizado recientemente
confirma que Salmonella resiste a antibioacuteticos empleados en los alimentos de origen animal
ya que pueden estar contaminados con este microorganismo es resistente a 3 antibioacuteticos
como la amoxicilina las sulfonamidas y las tetraciclinas ya que son ampliamente usados en
produccioacuten animal (Ejo et al 2016)
B53 Manifestaciones cliacutenicas
El cuadro cliacutenico normalmente es de 2 a 5 diacuteas aunque en ocasiones persiste varias
semanas La gravedad de los siacutentomas variacutea considerablemente siendo mayor en nintildeos y
ancianos Si el microorganismo pasa desde el intestino a la corriente sanguiacutenea y llega a
otras partes del cuerpo puede ocasionar la muerte si la persona afectada no es tratada
raacutepidamente La mayoriacutea de las muertes causadas por esta bacteria han ocurrido entre
ancianos que viven en residencias La tasa de mortalidad es baja inferior a 1 en paiacuteses
desarrollados pero suelen producirse de 40-50 muertes al antildeo especialmente entre nintildeos
ancianos o personas inmunodeprimidas Las excretas de los enfermos contienen gran
cantidad de la especie de Salmonella implicada al comienzo de la enfermedad la cifra inicial
decrece seguacuten transcurre el tiempo (DeWaal y Barlow 2014)
El estado de portador se refiere a la condicioacuten en que las personas curadas pueden
eliminar Salmonella en sus heces durante meses La mitad de los individuos afectados
excretan este patoacutegeno de 2-4 semanas posteriores a su curacioacuten cliacutenica entre 10 y 20
continuacutean durante 4-8 semanas unos pocos durante 3 meses y en raras ocasiones se
prolonga hasta 6 meses El microorganismo puede eliminarse tambieacuten por la orina La dosis
infectante capaz de desencadenar la salmonelosis humana es alrededor de 1times105 UFCmL
dependiendo de factores como tipo de alimento virulencia de la cepa involucrada y
susceptibilidad del individuo Entre las especies altamente virales se encuentran la S Dublin
y sobre todo S Enteritidis (Callaway et al 2008)
El incremento del serotipo de S Enteritidis en los casos de salmonelosis humana al
contrario de otras del geacutenero Salmonella representa un importante problema de salud
puacuteblica en muchos paiacuteses ya que este serotipo infecta a gallinas aparentemente sanas que
posteriormente transmiten las enfermedades al hombre Si se consumen huevos crudos o
Antecedentes
28
poco cocidos el microorganismo podriacutea causar la enfermedad El nuacutemero de casos de
salmonelosis se incrementa durante el verano (Parra et al 2002 Callaway et al 2008
Fernaacutendez 2008)
B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis
Gran parte de las salmonelosis se deben al consumo de alimentos de origen animal
(carnes de abasto pollo mariscos pescado leche y huevos asiacute como ovoproductos y
productos laacutecteos no pasteurizados) o de origen vegetal que se contaminan con productos
en malas condiciones de salubridad o mal manipulados Muchos alimentos sobre todo los
de origen animal o contaminados con aguas residuales han servido como vehiacuteculos en
brotes de salmonelosis La carne de matadero estaacute contaminada habitualmente con
Salmonella su incidencia es mayor en las canales de ganado y otros animales debido por
ejemplo a la contaminacioacuten por el contenido intestinal de la res viva cuyas heces manchan
su piel pelo y patas al llegar al matadero Las canales de cerdo se contaminan durante las
operaciones de escaldado y pelado La contaminacioacuten entre las mismas canales y de eacutestas
a utensilios superficies de trabajo y manos de los que las manipulan es faacutecil Otro de los
principales reservorios de Salmonella es la carne de aves de corral La contaminacioacuten de las
canales de pollo y otras aves procede igualmente del tracto intestinal o del material fecal
de los animales que manchan sus patas y plumas Las etapas criacuteticas de la contaminacioacuten
de las canales aviares estaacuten en el desplumado y la evisceracioacuten tambieacuten es comuacuten la
contaminacioacuten cruzada a traveacutes de las manos de los operarios equipo y utensilios utilizados
en la preparacioacuten y troceado de las canales (Marcus et al 2004)
Son raras las salmonelosis adquiridas directamente de carnes bien cocinadas la mayoriacutea
de los brotes se deben a una coccioacuten insuficiente o por contaminacioacuten posterior a su
preparacioacuten Las carnes elaboradas mediante fermentacioacuten (salami chorizo y salchichoacuten)
pueden ser causa de brotes de salmonelosis teniendo en cuenta que las especies que
integran este geacutenero pueden sobrevivir al proceso de fermentacioacuten (Forsythe y Hayes
2002)
Como se mencionoacute anteriormente otro alimento que se asocia con frecuencia a
Salmonella es el huevo La contaminacioacuten se produce por dos viacuteas a traveacutes de la caacutescara
contaminada y por viacutea transovaacuterica en aves infectadas (gallina pata pava) En el primer
caso la superficie de la caacutescara se contamina siempre a su paso por la cloaca o cuando el
Antecedentes
29
huevo estaacute en un ambiente fecal los huevos rotos o manchados constituyen un peligro en
la propagacioacuten de especies de Salmonella (EFSA 2014)
La contaminacioacuten partiendo de la caacutescara se produce si eacutesta mantiene un grado de
humedad apropiado y existe una temperatura diferencial significativa entre el contenido del
huevo y el ambiente La diferencia de temperaturas entre el huevo maacutes elevada y el
ambiente favorece la absorcioacuten de los microorganismos como Salmonella Tambieacuten se
transmite sobre la caacutescara por contaminacioacuten cruzada a traveacutes de los manipuladores que
han tenido contacto con superficies infectadas durante el transporte y almacenamiento de
los mismos en lugares con precarias condiciones de higiene (Ejo et al 2016) Salmonella
es causal de graves enfermedades que son trasmitidas por productos derivados de huevo
contaminado y la asociacioacuten entre la infeccioacuten del tracto reproductivo de los pollos fue un
fuerte incentivo para desarrollar programas de prevencioacuten (Jawale y Lee 2014)
La leche cruda puede albergar Salmonella y ser causa de brotes de salmonelosis se
contamina a traveacutes del pezoacuten y por las manos del ordentildeador la pasteurizacioacuten elimina la
presencia de la bacteria Entre los productos laacutecteos se han identificado como causa de
brotes de salmonelosis la leche en polvo el queso los helados y maacutes raramente la
mantequilla todos ellos por fallos en su elaboracioacuten Salmonella se destruye o inactiva
durante la fermentacioacuten de alta acidez como el yogur y el queso de pH inferior a 45 En el
caso del queso poco aacutecido (pH superior a 49) la Salmonella puede desarrollarse en
cualquier etapa de su elaboracioacuten (Mastroeni y Maskell 2006)
Entre las verduras cualquiera puede contener Salmonella cuando se cultivan con aguas
residuales contaminadas o son fertilizadas con abonos de origen animal Algunos vegetales
como los berros han sido causa de brotes de salmonelosis Por otro lado los mariscos se
contaminan con Salmonella cuando se criacutean en aguas residuales contaminadas por lo que
han sido la causa de numerosos brotes en todo el mundo la depuracioacuten es la medida
preventiva adecuada Diferentes alimentos se han identificado como portadores de
Salmonella entre ellos coco cebada harina de cereales pimienta blanca y negra pasta
cacao en polvo y chocolate (Fernaacutendez 2008) La FDA (2017) reportoacute el aumento de las
pruebas de las cuales ha identificado papayas de dos granjas que resultaron positivas para
las cepas de Salmonella que coinciden con enfermedades no relacionadas con este brote
Antecedentes
30
C Crecimiento microbiano
El crecimiento microbiano puede definirse como un incremento en los constituyentes
celulares que ocasiona un aumento del nuacutemero de ceacutelulas de los microorganismos que se
multiplican por gemacioacuten y fisioacuten binaria En el uacuteltimo caso las ceacutelulas individuales se
agrandan y dividen para originar dos ceacutelulas hijas de un tamantildeo aproximadamente igual
(Atlas y Bartha 2002)
C1 Crecimiento de los microorganismos
Todos los mamiacuteferos incluyendo los seres humanos se adaptan a la vida del mundo
microbiano Louis Pasteur Robert Koch Eacutelie Metchnikoff y Theodor Escherich entre otros
investigadores sentaron las bases conceptuales sobre las interacciones microbio-hueacutesped
Pasteur postuloacute que los microbios eran necesarios para la vida humana y Metchnikoff afirmoacute
que la composicioacuten de la flora microbiana era esencial para el bienestar del hueacutesped
Igualmente Escherich estaba convencido de que el conocimiento preciso de la flora
endoacutegena era esencial no soacutelo para la comprensioacuten de la fisiologiacutea de la digestioacuten sino para
la comprensioacuten de la patologiacutea y terapia de enfermedades microbianas intestinales A pesar
de estas primeras ideas soacutelo recientemente los cientiacuteficos han desarrollado meacutetodos que
permiten caracterizar directamente los mecanismos moleculares que subyacen a la creacioacuten
y mantenimiento de diversos ecosistemas microbianos (Falk et al1998)
El crecimiento de una poblacioacuten bacteriana resulta de la suma de ciclos celulares de todos
sus individuos y suele ser asincroacutenico puesto que cada microorganismo se encuentra en un
punto diferente del ciclo celular Por consiguiente en un momento determinado en una
poblacioacuten se encuentran ceacutelulas que acaban de dividirse otras estaacuten replicando su ADN y
elongaacutendose y otras estaacuten iniciando la divisioacuten celular (Melbinger et al 2015)
El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza en la mayoriacutea de los
casos mediante la produccioacuten de colonias aisladas en cultivos soacutelidos El crecimiento
explosivo de las bacterias produce un gran nuacutemero a partir de una uacutenica ceacutelula inicial de
forma que tras un periacuteodo de tiempo de incubacioacuten en las condiciones ambientales
adecuadas se produce una colonia de individuos iguales Para que un microorganismo
crezca necesita nutrientes que le aporten energiacutea y elementos quiacutemicos para la siacutentesis de
sus constituyentes celulares De acuerdo a la fuente de carbono que utilizan los
Antecedentes
31
microorganismos se clasifican en autoacutetrofos si es el CO2 atmosfeacuterico (microorganismos que
fotosintetizan) y heteroacutetrofos si utilizan carbono orgaacutenico (Ouyang y Li 2013)
C11 Disponibilidad del agua
El agua es un factor importante para el crecimiento microbiano se requiere para crecer y
llevar a cabo las funciones metaboacutelicas de lo contrario los microorganismos se deshidratan
o mueren La aw depende de la concentracioacuten de solutos y de la cantidad de agua disponible
en el medio ambiente La mayoriacutea de las bacterias y hongos necesitan valores entre 098 y
0995 de aw para su pleno desarrollo (Madigan y Martinko 2006)
Una membrana plasmaacutetica permanentemente selectiva separa el contenido
citoplasmaacutetico del microorganismo de su ambiente por ello las alteraciones en la
concentracioacuten osmoacutetica del medio extracelular pueden afectar incluso la viabilidad de los
mismos Si se coloca un microorganismo en una solucioacuten isotoacutenica el agua entraraacute en la
ceacutelula y causaraacute su estallido salvo que la propia ceacutelula desarrolle alguna estrategia para
evitarlo por ejemplo reducir la concentracioacuten osmoacutetica del citoplasma gracias a los cuerpos
de inclusioacuten Los procariotas tambieacuten pueden contener canales sensibles a la presioacuten
osmoacutetica que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno
se vuelve maacutes baja que la del citoplasma (Madigan y Martinko 2006)
C12 Acidez y pH
El pH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad entre 5 y 8 para impedir la
destruccioacuten de las macromoleacuteculas haacutebiles en condiciones aacutecidas o alcalinas Los aacutecidos
fuertes (inorgaacutenicos) y los aacutecidos deacutebiles (orgaacutenicos) disminuyen el pH externo
posteriormente se disocian en el interior de la ceacutelula inhibiendo la actividad enzimaacutetica y el
transporte de nutrientes por lo tanto los microorganismos no pueden generar energiacutea de
almacenamiento y ocurre la muerte celular (Brooks et al1992)
C13 Oxiacutegeno
El oxiacutegeno molecular (O2) influye en el metabolismo de los microorganismos Durante el
Antecedentes
32
proceso de reduccioacuten del O2 se crean formas reactivas como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2)
superoacutexidos (O2-) y radicales hidroxilos (OH-) que producen dantildeo celular por la oxidacioacuten
de compuestos orgaacutenicos e incluso macromoleacuteculas (Prescott et al1999)
C14 Temperatura
La temperatura afecta el desarrollo y la supervivencia de los microorganismos En bajas
temperaturas la velocidad de crecimiento de algunos microorganismos disminuye y los
periacuteodos de latencia se alargan Por otro lado las temperaturas elevadas aceleran las
reacciones enzimaacuteticas (antes de los 40degC) pero si se intensifica el calor en algunos casos
provocan la desnaturalizacioacuten de las proteiacutenas y por consiguiente la lisis celular (Brooks et
al1992)
Es importante considerar que cada microorganismo tiene una temperatura de desarrollo
adecuada a mayor temperatura se produce un incremento lineal de la velocidad de
crecimiento hasta alcanzar el clima perfecto a velocidad maacutexima Por encima de esta
temperatura oacuteptima la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte
celular (Atlas y Bartha 2002) En la tabla 3 se presentan algunas condiciones ambientales
para el desarrollo de los microorganismos
Antecedentes
33
Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales (Lu et al 2006 Madigan et al 2006 Falk et al 2009)
Factor Tipo de
microorganismo Caracteriacutesticas Microorganismo representativo
NaCI
Osmotolerante Capaz de crecer en un amplio rango de aw o
presioacuten osmoacutetica St aureus Saccharomyces rouxii
Haloacutefilo Requiere altas concentraciones de NaCl para
crecer normalmente por encima de 02 M Halobacterium Dunaliella Ectohiorhodospira
pH
Acidoacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 0 y 55 Sulfolobus Picrophilus Ferroplasma Acontium
Cyanidium caldarium
Neutroacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 55 y 80 Euglena Paramecium
Alcaloacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 85 y 1 15 Badilas alcalophilus NaIronobaciacuteerium
Temperatu
ra
Psicroacutefilo Crece bien a 0degC temperatura oacuteptima de 15degC
o inferior Badilas psychrophilus Chlamydomonas nivalis
Psicroacutetrofo Puede crecer a 0-7degC oacuteptima de 20 a 30degC Listeria monocytogenes
Mesoacutefilo Temperatura maacutexima de 35degC
Temperatura oacuteptima alrededor de 20-45degC
P fluorescens E coli Neisseria gonorrhoeae
Trichomonas vaginalis
Termoacutefilo Puede crecer a 55degC o superior temperatura
oacuteptima a menudo entre 55 y 65degC
Geobacillus stearothermophilus Thermus
aquaticus Cyanidium caldarium
Hipertermoacutefilo Temperatura oacuteptima entre 80 y 113degC Chaetomium thermophile Sulfolobus
Atmoacutesfera
Aerobio obligado Completamente dependiente del O2 para
crecer Pseudomonas Mycobacterium tuberculosis
Anaerobio
facultativo
No requiere O2 pero crece mejor en su
presencia
M luteus St aureus
Streptococcus pneumoniae L monocytogenes
Anaerobio
aerotolerante Crece bien en presencia o en ausencia de O2 Lactobacillus
Anaerobio
obligado No tolera el O2 y muere en su presencia Clostridium botulinum C perfringens
Microaeroacutefilo
Requiere nivel de O2 inferior a 2-10 para
crecer y es dantildeado por el O2 (20) C fetus
Antecedentes
34
D Control del crecimiento microbiano
Los microorganismos toleran determinados factores ambientales Asiacute unas bacterias
pueden tener condiciones para su desarrollo y estas condiciones pueden ser nocivas para una
especie bacteriana El crecimiento de una poblacioacuten microbiana se estudia analizando la curva
de crecimiento de un cultivo La curva del crecimiento microbiano representa la evolucioacuten del
nuacutemero de nuacutemero de ceacutelulas viables presente en un cultivo microbiano liacutequido a lo largo del
tiempo de estudio Se estudia el nuacutemero de ceacutelulas viables por mililitro de un cultivo de
volumen limitado y con una cantidad de nutrientes limitada como por ejemplo un medio de
cultivo liacutequido en un matraz que ha sido inoculado con una cantidad inicial de microorganismos
o inoacuteculo (Hunter-Cevera y Belt 1996) Para llevar a cabo estos estudios se distingue tres
niveles entre los modelos de microbiologiacutea predictiva los que describen los cambios en el
nuacutemero de microorganismos con respecto al tiempo con respecto al efecto de las condiciones
ambientales y los que combinan los dos aspectos anteriores (Larcher y Cattaneo 2006)
Se considera el crecimiento de las bacterias en funcioacuten de su fondo geneacutetico en relacioacuten
con los nutrientes y en unas hipoteacuteticas condiciones ideales (oacuteptimas) Sin embargo el trabajo
experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales es decir
una serie de agentes fiacutesicos y quiacutemicos El anaacutelisis de la curva de crecimiento bacteriano es
muy importante para determinar el potencial de una teacutecnica de control especiacutefica Al igual que
las bacterias los fagos al forman una interaccioacuten con su bacteria hueacutesped se necesita
determinar una cuantificacioacuten del nuacutemero de copias que se generan por la infeccioacuten a esta
condicioacuten se le conoce como fase de eclipse siendo el momento idoacuteneo para realizar la
infeccioacuten fago-bacteria (Lee et al 2016)
D1 Agentes fiacutesicos
La temperatura es uno de los paraacutemetros ambientales maacutes importantes que condicionan el
crecimiento y la supervivencia de los microorganismos La temperatura afecta a la velocidad
de crecimiento y por lo tanto al tiempo de generacioacuten Cada bacteria es diferente y esto se
puede observar en una curva de tasa de crecimiento en funcioacuten de la temperatura Si se suele
utilizar calor en combinacioacuten con otros agentes fiacutesicos (filtracioacuten presioacuten y radiacioacuten) Al
aplicar temperaturas altas se refleja desnaturalizacioacuten e inactivacioacuten de proteiacutenas enzimaacuteticas
esenciales colapsamiento de la membrana citoplaacutesmica y a veces lisis teacutermica de la bacteria
Antecedentes
35
esta condicioacuten se presenta raacutepidamente cuando se aplica presioacuten la cual se utiliza para
esterilizar objetos como lo demuestra el uso universal de la autoclave en todos los
laboratorios de microbiologiacutea (Madigan y Martinko 2006) El calor es auacuten uno de los meacutetodos
maacutes comunes para destruir microorganismos se puede aplicar huacutemedo o seco (Salgado-Nava
y Jimeacutenez-Munguiacutea 2012) Por otro lado ademaacutes de aplicar calor si a las bacterias se le
extrae el calor del medio de manera intensa recurrir a la congelacioacuten con fines de conservacioacuten
de microorganismos por largos periacuteodos si se realiza apropiadamente numerosos
laboratorios disponen de congeladores a -30 o -70degC para la conservacioacuten de colecciones de
cultivos microbianos (Shafiei et al 2014)
D2 Agentes quiacutemicos
Aunque los objetos se desinfectan a veces con agentes fiacutesicos tambieacuten las sustancias
quiacutemicas se utilizan con mucha frecuencia por ejemplo los quimioteraacutepicos son sustancias
con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostaacutetica) En estas sustancias se busca
que sea efectivo contra un amplio espectro de microorganismos Pero no existe (hasta estos
momentos) un solo agente capaz de inhibir a todos los microorganismos Por otro lado existen
quimioteraacutepicos de espectro estrecho pero muy selectivos contra ciertas bacterias que son
patoacutegenas importantes Muchos factores influyen en la eficacia de los desinfectantes hay que
considerar la cepa de microorganismos presentes la concentracioacuten y naturaleza del
desinfectante y la duracioacuten del tratamiento Asimismo es imprescindible que las superficies
sucias se limpien antes de aplicar un desinfectante El uso apropiado de los agentes quiacutemicos
es esencial para la seguridad en los laboratorios y hospitales estos mismos productos se
utilizan tambieacuten para evitar el crecimiento microbiano en los alimentos (Prescott et al 1999)
E Fagos
E1 Antecedentes
Los virus son agentes infecciosos submicroscoacutepicos que pueden replicarse
independientemente de los cromosomas de una ceacutelula pero no independientemente de ella
A fin de multiplicarse deben penetrar la ceacutelula donde puedan replicarse a la cual se le
denomina hueacutesped Presentan una forma infecciosa madura que es tiacutepicamente extracelular
Antecedentes
36
Pueden infectar a diferentes seres vivos por lo que existen virus de animales de plantas y
de forma particular los llamados virus bacterianos o fagos (Madigan y Martinko 2006)
Los bacterioacutefagos o fagos (del griego φαγετον paguumlento ldquoalimentoingestioacutenrdquo) son agentes
virales de las bacterias su descubrimiento se atribuye por un lado al bacterioacutelogo ingleacutes F
W Twort que en 1915 mencionoacute el aclaramiento de un cultivo soacutelido de Micrococcus
provocado por un agente desconocido Por otro lado en 1917 el francocanadiense F
dHerelle descubrioacute un grupo de entidades bioloacutegicas en medios de cultivo que se propagaban
a expensas de las bacterias a los cuales les denominoacute fagos y dentro de sus investigaciones
definioacute su potencial uso e importancia cliacutenica Esto se refuerza a partir de 1940 con el
desarrollo del microscopio electroacutenico con el que se demuestra la naturaleza viral de los fagos
y que la forma de estudiarlos es mediante procedimientos microbioloacutegicos convencionales
facilitando su manejo y estudio (Grabow 2001)
La uacuteltima variedad de fagos se descubrioacute durante la Primera Guerra Mundial los tipos ya
conocidos eran los virus que afectaban a vegetales y animales fue entonces que se pensoacute
en que su aplicacioacuten para eliminar bacterias podriacutea ser utilizada para la prevencioacuten y el
tratamiento de enfermedades bacterianas pero no resultoacute (Merril et al 1996) Sin embargo
los fagos resultaron tener otros beneficios especialmente como modelos o sustitutos de los
virus en humanos en la investigacioacuten geneacutetica baacutesica asiacute como en la evaluacioacuten de la calidad
del agua Ademaacutes demostraron ser una herramienta valiosa en la mayoriacutea de las
investigaciones sobre los virus ya que en comparacioacuten con los humanos animales vegetales
e incluso los insectos anfitriones de otros virus los fagos son faacutecil y raacutepidamente reproducibles
en el laboratorio y no son particularmente exigentes con respecto al espacio instalaciones y
equipos El trabajar con fagos requiere la separacioacuten y purificacioacuten y las dos principales tareas
para realizar esto es utilizar meacutetodos quiacutemicos en los cuales se utilizan solutos como buffer
glicerol bromuro de potasio cloruro de cesio y tartrato de potasio aunque el maacutes comuacuten es
la sacarosa ademaacutes involucra la precipitacioacuten con sulfato de amonio polietilenglicol o cloruro
de cesio y los meacutetodos fiacutesicos que implican la centrifugacioacuten a diferentes velocidades y
gradientes de densidad y con menor frecuencia la cromatografiacutea de particioacuten (Sambrook y
Russell 2001)
La investigacioacuten sobre las propiedades baacutesicas de los fagos se desarrolla en la biologiacutea
molecular que permitioacute avances sin precedentes en toda la biologiacutea y ciencias meacutedicas La
Antecedentes
37
concentracioacuten y purificacioacuten es un factor determinante para llevar a cabo la infeccioacuten
eficientemente sin embargo existe un periacuteodo de adaptacioacuten por parte de los fagos antes
que se desarrollen y se logren tiacutetulos apreciables en ceacutelulas cultivadas (Sambrook y Russell
2001 Breeuwer et al 2003)
E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos
Los virus son paraacutesitos intracelulares obligados no tienen metabolismo intriacutenseco y
requieren la maquinaria metaboacutelica codificada por los cromosomas de ceacutelula que puedan
infectar y reproducirse en ella denominada hueacutesped Su tamantildeo oscila entre 20 y 200 nm y
consiste de un nuacutecleo de aacutecido nucleico (ARN o ADN de cadena simple o doble) rodeado por
una cubierta proteica (caacutepside) y en algunos casos una cubierta de liacutepidos Los microbioacutelogos
que investigan la presencia de virus en haacutebitats marinos y han detectado su presencia creen
que son diez veces maacutes numerosos que las bacterias marinas En la superficie de los mares
se encuentran entre 106 y 109 partiacuteculas viacutericas por mililitro y se estima que en la capa
superficial (1 mm) de los oceacuteanos se encuentran unas 3 x 1030 partiacuteculas viacutericas (Grabow
2001 Atterbury et al 2003)
E3 Clasificacioacuten de los fagos
Las variaciones en los fagos se presentan en forma estructural como apeacutendices en la
cabeza cuello y las fibras de la cola o espigas ademaacutes del genoma que variacutea en cada orden
En 1962 Andreacute Lwoff junto a otros investigadores propuso una clasificacioacuten basada en la
morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico Los nombraron de la siguiente manera los urovirales
que presentaban cola pronunciada los inoviridae eran los filamentosos y los microviridae los
tipo φX Posteriormente Bradley (1967) consideroacute la morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico y
agrupoacute a los fagos en seis morfotipos baacutesicos denominados de la A a la F posteriormente se
clasifico en fagos baacutesicos los de cola los filamentosos y los icosaeacutedricos con ADN de cadena
sencilla o RNA de cadena simple Los fagos han sido investigados debido a su rol como
agentes de biocontrol para el desarrollo de la seguridad alimentaria En el presente varios
miles de fagos en contra de varios objetivos han sido aislados de varios entornos y alimentos
Aproximadamente el 96 de los fagos aislados eran con cola y del tipo liacuteticos en una de las
Antecedentes
38
tres familias Myoviridae (245) Siphoviridae (61) y Podoviridae (14) en el orden de los
caudovirales (Atterbury et al 2003 Oh y Park 2017)
En 1971 el Comiteacute Internacional de Taxonomiacutea de Virus (ICTV por sus siglas en ingleacutes)
clasificoacute en 6 geacuteneros de los cuales 5 corresponden a la clasificacioacuten propuesta por Bradley
los grupos T4 λ φX174 MS2 y fd Los fagos pueden tener cola larga y flexible no contraacutectil
(Siphoviridae) cola larga y contraacutectil (Myoviridae) o cola corta (Podoviridae) como se observa
en la tabla 4 Para la clasificacioacuten de los fagos se aplican propiedades como el rango de
hueacutespedes y las relaciones inmunoloacutegicas sin embargo las maacutes importantes son su
morfologiacutea y las caracteriacutesticas de su aacutecido nucleico el cual se adsorbe a componentes de la
superficie celular que actuacutean como receptores especiacuteficos La zona de adsorcioacuten del virus es
complementaria al receptor celular por lo tanto un determinado fago soacutelo puede infectar un
nuacutemero limitado de cepas celulares que contengan a un determinado receptor La naturaleza
de la zona de adsorcioacuten variacutea con el tipo de fago En el T4 se localiza en el extremo de la cola
en donde se encuentran la placa basal las espiacuteculas y las fibras de la cola Las formas maacutes
complejas corresponden a los fagos con colas contraacutectiles (Atterbury et al 2003)
Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos
(Ackermann 2003)
Antecedentes
39
E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico
La multiplicacioacuten de los fagos (figura 4) ADN produce la destruccioacuten de la ceacutelula hueacutesped
mediante lisis lo que provoca su liberacioacuten El ciclo vital de un fago que culmina con el
estallido de la ceacutelula hueacutesped y la liberacioacuten de viriones recibe el nombre de ciclo liacutetico Los
acontecimientos que tienen lugar durante el ciclo liacutetico se revisaraacuten en esta seccioacuten con
especial atencioacuten a los fagos T-par de E coli Estos son fagos de ADN bicatenario con colas
contraacutectiles complejas de la familia Myoviridae son algunos de los virus maacutes complejos
conocidos (Fernaacutendez 2008)
Figura 4 Adsorcioacuten del fago T4 e inyeccioacuten del ADN (Leverentz et al 2003)
Los fagos podriacutean infectar hasta un 70 de la poblacioacuten de procariotas marinos y ser
responsables de la tercera parte de la mortalidad bacteriana acuaacutetica Tambieacuten se han
detectado virus que infectan diatomeas y otras algas importantes del fitoplancton marino lo
cual es de gran transcendencia ecoloacutegica ya que la multiplicacioacuten de bacterias marinas
supera la capacidad de reproduccioacuten de los protozoos La lisis por virus de ceacutelulas procariotas
y de algas puede tambieacuten contribuir enormemente en los ciclos del carbono y nitroacutegeno en las
cadenas troacuteficas marinas incluso podriacutea reducir el nivel de productividad marina como la de
moluscos y peces (Muniesa et al 2005)
E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten
Los fagos no se unen al azar a la superficie de una ceacutelula hueacutesped por el contrario se fijan
a receptores especiacuteficos La naturaleza de estos receptores variacutea de acuerdo al fago pueden
Antecedentes
40
ser lipopolisacaacuteridos y proteiacutenas de la pared celular aacutecidos teicoicos flagelos y pili Los fagos
T-par de E coli en particular utilizan lipopolisacaacuteridos o proteiacutenas de la pared celular como
receptores Las variaciones en las propiedades del receptor son parcialmente responsables
de las preferencias del fagos por el hueacutesped (Muniesa et al 2005 Leeuw et al 2017)
La adsorcioacuten de fagos T-par estaacute relacionada con diversas estructuras del tallo La fijacioacuten
del fago comienza cuando una fibra del tallo establece contacto con los receptores adecuados
a medida que maacutes fibras contactan con los receptores la placa basal se asienta en la
superficie La unioacuten se debe probablemente a interacciones electrostaacuteticas y se ve influida por
el pH y por la presencia de iones como Mg+2 y Ca+2 Una vez que la placa basal estaacute
firmemente asentada en la superficie celular se producen cambios conformacionales en ella
y en la vaina del tallo Esta uacuteltima se reorganiza de tal forma que se contrae pasando de una
conformacioacuten en cilindro de 24 anillos a otra de 12 anillos de longitud maacutes corta y ancha es
entonces cuando el tubo central es empujado a traveacutes de la pared celular bacteriana
Finalmente el ADN es extruido de la cabeza pasa a traveacutes del tubo del tallo y penetra en la
ceacutelula hueacutesped Parece ser que el tubo interacciona con la membrana plasmaacutetica para formar
un poro a traveacutes del cual pasa el ADN los mecanismos de penetracioacuten de otros fagos difieren
a menudo de los fagos T-par aunque no se han estudiado en detalle (Leverentz et al 2003)
F Biofilm
Las bacterias existen en la naturaleza bajo dos formas o estados a) bacterias planctoacutenicas
de libre flotacioacuten y b) bacterias biofilm en colonias de microorganismos seacutesiles (Nazar 2007)
Un biofilm se define como una agrupacioacuten de comunidades seacutesiles microbianas que se fijan a
superficies las ceacutelulas estaacuten incrustadas en una matriz autoproducida que actuacutea como
proteccioacuten quiacutemica y mecaacutenica del entorno asiacute estas bacterias presentan mayor resistencia
a desinfectantes y el secado (Vestby et al 2009) Las bacterias pueden crear condiciones
para formar biofilms casi en cualquier ambiente liacutequido La interfase soacutelido-liacutequido entre una
superficie y un medio acuoso (vgr leche) proporciona un entorno ideal para la fijacioacuten y
crecimiento de microorganismos (Fakruddin et al 2014)
Antecedentes
41
G Microscopiacutea electroacutenica
Los microscopios electroacutenicos se usan habitualmente para el estudio detallado de
estructuras celulares (Bradley 1967) Para analizar las estructuras internas es esencial el
microscopio electroacutenico de transmisioacuten MET En el MET se utilizan electrones en lugar de rayo
de luz las lentes son electromagneacuteticas y se opera en todo momento a alto vaciacuteo
(Ackermann 2003) El poder de resolucioacuten del microscopio electroacutenico es mucho mayor que
el del microscopio oacuteptico incluso pueden observarse estructuras moleculares como proteiacutenas
y aacutecidos nucleicos Sin embargo los haces de electrones tienen escaso poder de penetracioacuten
y una ceacutelula aislada es demasiado gruesa para poder visualizarse directamente por este
motivo se emplean teacutecnicas especiales para la obtencioacuten de cortes ultrafinos a fin de poder
observar las muestras Una ceacutelula bacteriana por ejemplo se corta con una cuchilla especial
en varios cortes ultrafinos de 20-60 nm de espesor que son posteriormente examinados de
manera individual en el microscopio electroacutenico (Fuster-Valls et al 2008) Para obtener
suficiente contraste las preparaciones se tintildeen previamente mediante tratamiento con
compuestos como aacutecido oacutesmico permanganato sales de uranilo o de lantano o plomo Como
estas sustancias poseen aacutetomos pesados son capaces de desviar los electrones y aumentar
el contraste (Madigan y Martinko 2006)
La microscopiacutea electroacutenica es el mejor meacutetodo para estudiar la forma de las bacterias Los
virus bacterianos por tener un diaacutemetro menor de 1000 Aring estaacuten por debajo del liacutemite de
resolucioacuten del microscopio oacuteptico sin embargo es posible observarlos mediante el
microscopio electroacutenico porque eacuteste utiliza una radiacioacuten de longitud de onda maacutes corta que
permite aumentar 100 mil veces una resolucioacuten de 10 Aring (Kruger et al 2000 Ackermann
2003) Para observar detenidamente la morfologiacutea se requiere el microscopio electroacutenico con
especificaciones precisas como el de barrido lo cual es una herramienta indispensable en
biologia molecular (Guzmaacuten 2015)
Para la observacioacuten las partiacuteculas se suspenden en un medio volaacutetil por lo general una
solucioacuten de acetato de amonio y se colocan sobre una membrana sostenida por una rejilla
metaacutelica que praacutecticamente no absorbe electrones El problema teacutecnico maacutes frecuente es la
falta de contraste como la imagen obtenida es el resultado de la dispersioacuten de electrones por
los aacutetomos de la partiacutecula se necesita una diferencia apreciable de poder dispersivo entre las
partiacuteculas y el medio de soporte generalmente se emplean teacutecnicas tradicionales La maacutes
utilizada se conoce como tincioacuten negativa consiste en mezclar la suspensioacuten del fago con
Antecedentes
42
fosfovolframato de sodio o acetato de uranilo a pH neutro A este pH las sales no se combinan
con el fago al secarse forman una capa uniforme y opaca a los electrones en la cual los fagos
destacan como partiacuteculas maacutes claras Como las sales en solucioacuten penetran las irregularidades
en la superficie de la partiacutecula la micrografiacutea revela los detalles finos de los fagos (Fuster-
Valls et al 2008 Montantildeez et al 2012)
La forma del fago se establece de manera visual que es directa de la placa cuando las
UFP que se observan a simple vista como placas liacuteticas a contraluz (APHA 2005) Y para
estudiar la adhesioacuten y formacioacuten celular en diversas superficies se han desarrollado varias
teacutecnicas de microscopiacutea entre las cuales se distinguen la microscopiacutea electroacutenica de barrido
y de transmisioacuten asiacute como la microscopiacutea de epifluorescencia (Fuster-Valls et al 2008) la
cual se basa en los mismos principios de oacuteptica de la microscopiacutea comuacuten con diferencias en
el manejo y el disentildeo relacionadas con la generacioacuten y transmisioacuten de longitudes de onda
adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar ya sean propios de la muestra o de
la coloracioacuten utilizada (Franco 2005)
El fundamento de la teacutecnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o
compuestos fluorescentes denominados fluorocromos en fijarse a los anticuerpos mediante
un enlace quiacutemico estable que no puede romperse durante el curso de la reaccioacuten
inmunoloacutegica La espectroscopia de fluorescencia es la teacutecnica de deteccioacuten oacuteptica maacutes
sensible En el caso de la deteccioacuten en ceacutelulas se exponen a alta energiacutea utilizando laacutemparas
de xenon excitando por varios nanosegundos y asiacute emitiendo una longitud de onda de baja
energiacutea (Franz y Jendreizik 2015)
H Fagoterapia
Las enfermedades infecciosas estaacuten catalogadas entre las primeras causas de muerte en
el mundo y por lo tanto son consideradas un problema de salud puacuteblica Entre ellas las
infecciones bacterianas causan gran preocupacioacuten dado que las bacterias adquieren diacutea a
diacutea mayor resistencia a los antibioacuteticos esto ocurre por medio de diversos mecanismos
fisioloacutegicos y moleculares que les permiten a estos microorganismos adaptarse raacutepidamente
a condiciones adversas (Prada-Pentildearanda et al 2015)
El descubrimiento de los fagos por dacuteHerelle se desarrolloacute cuando eacuteste buscaba una
Antecedentes
43
vacuna que pudiera combatir la crisis de disenteriacutea hemorraacutegica que se presentoacute en 1915 en
las afueras de Francia dacuteHerelle observoacute que tras aislar lisados libres de bacterias de la
materia fecal de los enfermos las bacterias eran destruidas por un agente desconocido
invisible capaz de destruir cultivos de bacterias o producir pequentildeas aacutereas de color maacutes claro
cuando las bacterias eran crecidas en confluencia en placas de medio soacutelido y publicoacute sus
observaciones en el artiacuteculo titulado ldquoSobre un microbio invisible antagonista de los bacilos
de la disenteriacuteardquo (Szafranski et al 2017)
El uso de los fagos como agentes terapeacuteuticos comenzoacute hace maacutes de 80 antildeos Entre los
ejemplos maacutes destacados y recientes de la utilizacioacuten exitosa de la fagoterapia cabe citar el
uso de fagos especiacuteficos en el control bioloacutegico de E coli O157H7 productora de colitis
hemorraacutegica (en alimentos) Tambieacuten se ha estudiado el uso de fagos en el tratamiento de
infecciones peritoneales y otitis externa en la erradicacioacuten de P aeruginosa en pacientes con
fibrosis quiacutestica en el tratamiento de infecciones urinarias y osteomielitis por S aureus y en
la descolonizacioacuten intestinal para combatir las infecciones por Enterococcus faecium
resistente a vancomicina entre otros Los efectos favorables de la fagoterapia podriacutean
exceder incluso su actividad antibacteriana Hay datos sorprendentes acerca de la actividad
in vivo de los fagos el conocido fago T4 de E coli podriacutea inhibir la adsorcioacuten y la replicacioacuten
de adenovirus en sus ceacutelulas blanco y el fago Pf4 de P aeruginosa habriacutea sido capaz de
inhibir el desarrollo de cepas de Aspergillus por secuestro de hierro (Lopardo 2017)
El estudio y desarrollo de nuevos tratamientos alternativos es de particular intereacutes en la
lucha contra la resistencia bacteriana Los fagos presentan caracteriacutesticas que los hace una
excelente herramienta contra las bacterias patoacutegenas debido a su especificidad y seguridad
ecoloacutegica Los fagos no solo son atractivos desde un punto de vista cliacutenico Se han utilizaacutedo
como potenciales aplicaciones en otras aacutereas como la agricultura el control de alimentos o
la industria como a continuacioacuten se describe en la siguiente tabla 5 Los fagos son una
solucioacuten ecoloacutegica ubicua para desarrollar nuevos tratamientos contra las bacterias aunque
se deben realizar maacutes estudios para comprender mejor la relacioacuten entre ellos y las bacterias
antes de su aplicacioacuten (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)
Antecedentes
44
Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos la naturaleza lugares
urbanizados y cuerpo humano (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)
Fuente Sitio encontrado
Naturaleza
Suelo y superficie terrestre
Agua continental y oceaacutenica
Ambientes extremos hielo marino pared de
algas zonas hipersalinas etc
Lugares artificiales
Hospitales y zonas similares
Planta de tratamiento de aguas negras
Algunas zonas bajo el impacto humano
Cuerpo de animales
Tracto digestivo y vagina
Tracto respiratorio y oral
Piel y epitelio mucoso
Los productos comerciales para terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones
Los fagos se pueden distribuir liofilizados y se disuelven antes de la administracioacuten por viacutea
intravenosa en un soporte adecuado como por ejemplo una solucioacuten acuosa o tampoacuten o
suspenderse en cualquier liacutequido adecuado coloidal o de la matriz de poliacutemeros para crear
bactericidas el principio activo se puede administrar de una manera conveniente como por
inyeccioacuten (subcutaacutenea intravenosa administracioacuten etc) por viacutea oral pulmonar (por ejemplo
aerosoles o por otros dispositivos a los pulmones) spray nasal intramuscular intraperitoneal
intrahecal intraviacutetrea vaginal rectal la puncioacuten lumbar y la aplicacioacuten directa Dependiendo
de la viacutea de administracioacuten el principio activo puede estar recubierto de un material que
preserve la sustancia de la accioacuten de enzimas aacutecidos y otras condiciones naturales que
pueden inactivar la sustancia (por ejemplo comprimidos recubiertos enteacutericos o pastillas)
Empresas dedicadas a la biotecnologiacutea se dedicaron a desarrollar productos utilizando fagos
especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan ETA la Food and Drug Administration de
los EE UU (FDA) incluye a los fagos en la categoriacutea de aditivos alimentarios la FDA ha
publicado la aprobacioacuten de seis fagos para usar en alimentos listos para comer (ready to eat)
efectivos para L monocytogenes de la compantildeiacutea Intralytix La compantildeiacutea Omnilytics ofrece
productos de control bacterial para varias aacutereas como son agricultura agua y alimentos
industrias que se pueden observar en su paacutegina web (httpswwwomnilyticscom) y otras
empresas como Biophage Pharma Inc (Canada) Exponential Biotherapies (EE UU)
(Segundo 2010)
Antecedentes
45
Estas nuevas estrategias de intervencioacuten eco-amigable son requeridas como agente de
biocontrol en contra de Salmonella Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos
antildeos debido a sus caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutef ico sin
dantildear la micro-flora en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros
distribucioacuten de esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla
algunos ejemplos de la aplicacioacuten de los fagos son los descritos en la siguiente tabla 6 (Oh y
Park 2017)
Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria (Oh y
Park 2017)
Compantildeiacutea Producto del fago Organismo hueacutesped
FINK TEC GmbH (Alemania) Secure Shield E1 E coli
Intralytix Inc
(EE UU)
Ecolicidereg (EcolicidePXtrade) E coli O157H7
EcoShieldtrade E coli O157H7
ListShieldtrade L monocytogenes
SalmoFreshtrade Salmonella spp
ShigaShieldtrade
(ShigActivetrade) Shigella spp
Micreos Food Safety
(Holanda)
PhageGuard Listextrade L monocytogenes
PhageGuard Strade Salmonella spp
E coli O157H7
Passport Food Safety Solutions
(EE UU) Finalysereg E coli O157H7
Phagelux (China)
AgriPhag
Xanthomonas campestris pv
vesicatoria Pseudomonas
syringae
pv tomato
SalmoProreg Salmonella spp
Salmonella spp
Antecedentes
46
47
III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO
48
Objetivos y plan de trabajo
49
A Objetivo general
El objetivo general de este estudio es aislar y caracterizar fagos frente Salmonella spp a
partir de diversas fuentes ambientales para su uso potencial en el control bioloacutegico
El control de Salmonella spp es de gran intereacutes para la industria alimentaria por lo que
encontrar alternativas para su eliminacioacuten es de gran impacto en la salud puacuteblica
B Objetivos especiacuteficos
1- Aislar fagos de Salmonella proveniente de muestras de aguas residuales de la ZMM y
muestras de lavado de carne pollo de un establecimiento donde se comercializa esta carne
2- Caracterizar parcialmente los fagos aislados en base a su morfologiacutea por TEM y el
anaacutelisis de sensibilidad frente a diversas cepas bacterianas
3- Estudiar el efecto de los fagos previamente aislados desarrollando un biofilm de
Salmonella spp sobre discos de acero inoxidable utilizando la DEM
C Plan de trabajo
Para alcanzar los objetivos establecidos se considera la ubicacioacuten de las fuentes para la
obtencioacuten de los fagos en este caso el medio seleccionado son riacuteos arroyos asiacute como un
establecimiento donde se procesan canales de pollo en la ZMM y las lagunas de oxidacioacuten
de aguas residuales en Mariacuten ambas localidades en Nuevo Leoacuten Meacutexico
Posteriormentese utilizaraacute la teacutecnica ADC y se verificaraacute en cual de estas muestras se
podriacutean encontrar fagos que sean liacuteticos para Salmonella enterica y posteriormente se
realizaraacuten pruebas de selectividad con la meta de caracterizar los fagos aislados frente a
diferentes hueacutesped (cepas de Salmonella spp y de E coli) y la observacioacuten de la morfologiacutea
se realizaraacute por el TEM
Salmonella spp presenta un periacuteodo de incubacioacuten por lo general entre 12 y 36 horas
tras el cual el derarrollo bacteriano en las superficies puede dar como resultado la formacioacuten
de un biofilm Para este estudio se desarrollaraacute un biofilm de Salmonella spp sobre discos
de acero inoxidable en condiciones de humedad esto es importante por la fase de eclipse
Objetivos y plan de trabajo
50
(momento en el cual atacan y se desarrollan los fagos) Se probaraacuten 3 concentraciones de
fago 6 7 y 8 UFPmL Se realizaraacuten recuentos durante un periacuteodo de incubacioacuten de 72 h
Con el fin de conseguir estos objetivos el presente trabajo se ha estructurado en tres
secciones las cuales se pueden observar en la figura 5 incluyendo las pruebas con DEM
en los discos de acero inoxidable
Figura 5 Diagrama general de trabajo
51
IV MATERIALES Y MEacuteTODOS
52
Materiales y meacutetodos
53
A Toma de muestras
Las muestras para obtencioacuten de fagos se recolectaron en diez sitios del aacuterea metropolitana
de Monterrey y del municipio de Mariacuten Nuevo Leoacuten (tabla 7) El meacutetodo que se utilizoacute para
aislar fagos de diversas fuentes medio ambientales y su posterior traslado al laboratorio fue
el descrito por Higgins et al (2005) Se obtuvieron las muestras provenientes de aguas
residuales y riacuteos se emplearon frascos de 450 mL previamente lavados y secos que
posteriormente se impregnaron con una solucioacuten de tiosulfato de sodio (Na2S2O3bull5H2O) al
10 (pv) (Sigma-Aldrich EE UU) y se esterilizaron en autoclave 121ordmC15min Al momento
de hacer la recoleccioacuten en campo los frascos fueron abiertos cuidadosamente y se llenaron
con el liacutequido se almacenaron en hieleras para su traslado al laboratorio el tiempo que
transcurrioacute desde la toma de la muestra hasta la llegada al laboratorio fue entre 1 y 3 h
posteriormente las muestras se centrifugaron el mismo diacutea y los sobrenadantes se
almacenaron 4oC hasta su uso (Vidales-Contreras et al 2006)
A cada una de las muestras obtenidas en el muestreo se le agregoacute 25 de cloroformo
(grado de reactivo 995 Sigma-Aldrich EE UU) para conservarlas en condiciones oacuteptimas
para su posterior llegar al laboratorio se mantuvieron a 4degC durante toda la noche para
permitir que el material grueso decante Mientras tanto en lo referente a las muestras
obtenidas de aguas provenientes de los establecimientos expendedores de pollos las
muestras se trataron igual pero como el sobrenadante contiene grasa se optoacute por filtrar y
posteriormente se realizoacute el mismo procedimiento antes descrito
Materiales y meacutetodos
54
Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos
B Obtencioacuten de fagos
Para aislar los fagos se utilizoacute la teacutecnica descrita por Sambrook y Russell (2001) la cual se
describe a continuacioacuten En un tubo de ensayo (16150 mm Fisherbrand EE UU)
conteniendo 45 mL de agar suave (AS) (Bioxon Meacutexico) mantenieacutendose a temperatura de
40C (en una cuba hidroneumaacutetica con agua) se colocaron 500 L de un cultivo de S
Enteritidis (provenientes del cepario del CINSP) en fase logariacutetmica y se agregaron 300 L
de las muestras recolectadas en las que se presume conteniacutean los fagos especiacuteficos para
esta cepa Se agitoacute el tubo de ensayo mezclando con movimientos circulares suaves para
evitar la formacioacuten de burbujas este procedimiento se realizoacute aproximadamente por 5
segundos El contenido se vertioacute uniformemente sobre una caja de Petri (10015 mm
Fisherbrand EE UU) conteniendo agar soya tripticasa (AST) (Bioxon Meacutexico) y se dejoacute a
temperatura ambiente hasta solidificar la ADC Se incuboacute a 37C por 24h Al momento de
observar el desarrollo de las placas de lisis (calvas) se procedioacute al aislamiento de los fagos
Su cuantificacioacuten se realizoacute de manera directa e inmediata ya que las calvas son visibles con
una iluminacioacuten de contraste (Breeuwer et al 2003) Posteriormente los fagos que si formaron
halos de inhibicioacuten fueron aislados de manera directa o siguiendo uno de los dos protocolos
(enriquecimiento y sin enriquecer) debido a que depende principalmente de la amplificacioacuten
del fago y las caracteriacutesticas de cada uno se describen a continuacioacuten
Municipio Sitio de la toma
Monterrey
Parque Fundidora
Riacuteo Santa Catarina
Establecimiento de comida
Av Conductores
Mariacuten Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal
Riacuteo La Libertad
Guadalupe Alcantarillas de la colonia La Azteca
Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados
San Nicolaacutes de los Garza Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac
Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea
Materiales y meacutetodos
55
B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos
Con el protocolo de enriquecimiento se proporcionoacute las condiciones oacuteptimas de desarrollo
al cultivo de la bacteria hueacutesped y la muestra al inocular el cultivo en la muestra y de esta
manera amplificar los posibles fagos que presentes en la muestra de agua
Se realizoacute este protocolo de la siguiente manera primero se seleccionoacute la cepa bacteriana
que seraacute el hueacutesped esto se consiguioacute haciendo un cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y
se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por otra parte se prepararon
aliacutecuotas (10 mL cada una) de cada una de las muestras recolectadas (enriquecidas con
cultivo bacteriano) y se centrifugan a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a
4degC despueacutes el sobrenadante se pasoacute por jeringa y con filtros de 022 microm (Millex-GP
polyethersulfone 33 mm radio-sterilized) Estas dos entidades biloacutegicas se unieron en un
matraz de capacidad de 50 mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon
Meacutexico) a doble concentracioacuten (20) En este matraz se agregaron 300 microL de la muestra
previamente filtrada con fagos y 500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incuboacute a 37degC por
24 h posteriormente por medio de la teacutecnica de ADC se pudo observar la formacioacuten de halos
de lisis de los fagos (Vidales-Contreras et al 2006)
B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos
El protocolo se emplea para adicionar directamente de la muestra una aliacutecuota y testarla
con la bacteria hueacutesped Se siguieron los pasos anteriormente descritos a este protocolo
primero se seleccionoacute la cepa bacteriana (hueacutesped) esto se realizoacute haciendo un cultivo fresco
(AST) (Bioxon Meacutexico) y se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por
otra parte se preparoacute aliacutecuotas (10 mL) de cada una de las muestras recolectadas y se
centrifugaron a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a 4degC despueacutes el
sobrenadante se pasoacute por jeringa con filtros de 022 microm (Millex-GP polyethersulfone 33 mm
radio-sterilized) Estas dos entidades bioloacutegicas se unieron en un matraz de capacidad de 50
mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon Meacutexico) a doble
concentracioacuten (20) A este matraz se agregaron 300 microL de la muestra filtrada con fagos y
500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incubaron a 37degC por 24h posteriormente por medio
de la teacutecnica de ADC se observaron la formacioacuten de halos de lisis de los fagos (Vidales-
Materiales y meacutetodos
56
Contreras et al 2006)
B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas
Despueacutes de que los cultivos bacterianos se reactivaron la preparacioacuten para trabajar con
ellos fue la siguiente se tomoacute una asada de una colonia bacteriana bien diferenciada y se
incuboacute en un tubo inclinado (punta de flauta) se dejoacute el cultivo toda la noche y posteriormente
se traspasoacute a un subcultivo en caldo con infusioacuten cerebro-corazoacuten (BHI Merck Alemania) e
incuboacute a 37degC durante 24 h posteriormente se subcultivoacute en BHI en las mismas condiciones
Una colonia aislada en tubo punta de flauta se inoculoacute en 9 mL de agua peptonada (3M
Meacutexico) y se incuboacute a 37degC durante 24 h luego se realizaron mezclas seriadas en diluyente
(1 gL triptona 85 gL NaCl pH 72) (Merck Alemania) y se implantaron en las superficies de
los discos de acero inoxidable tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm con
un volumen inferior a 50 microL Como control del inoacuteculo se prepararon 5 placas de TSA
En el caso del fago obtenido se amplificoacute realizando la infeccioacuten en repetidas ocasiones
hasta alcanzar una concentracioacuten de 1x107 UFPmL
B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos
Para la realizacioacuten de este estudio se utilizaron cepas bacterianas de Salmonella enterica
y E coli provenientes de diversas colecciones de los laboratorios involucrados tambieacuten se
utilizoacute un fago de prueba (PRD1) para ser utilizado como control positivo en los aislamientos
En la tabla 8 se muestran las bacterias y el fago indicando su denominacioacuten y origen asiacute como
las condiciones de conservacioacuten
Materiales y meacutetodos
57
Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten
Origen Cepa bacteriana fagos Clave Condiciones de conservacioacuten
FaSPyN
S Typhimurium ATCC 13311
Glicerol a -20degC S Paratyphi ATCC 9150
S Enteritidis ATCC 13076
FCB S Typhi ATCC 19430 BGA TSA 4degC
FAUANL
S Typhimurium TSA 4degC
Fago PRD1
Tampoacuten fosfato 4degC
E coli CECT 515
E coli K12
E coli ATCC 10536
E coli O157H7 CECT 4783
S bongori ATCC 43975
UAB
S enterica LT2
Vial liofilizado a -20degC
S enterica sub enterica CECT 4138
S enterica sub enterica CECT 4594
S enterica sub enterica CECT409
S enterica sub enterica CECT 698
S Typhimurium CCUG 29478
Para la reactivacioacuten de los cultivos que se almacenan a 4degC se dejaron a temperatura
ambiente igualmente para los congelados Posteriormente para sacarlos del estreacutes se
sembraron en medio de cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y se incubaron a 37degC por 24
horas tras estas condiciones ya se pudieron utilizar en los ensayos (McLaughlin et al 2006)
A continuacioacuten se describe la forma en que se reactivaron los cultivos en este estudio de
acuerdo a la forma en que estaban almacenados
a) Cultivos almacenados en glicerol
Se descongelaron los viales a temperatura ambiente
Materiales y meacutetodos
58
Se transfirieron 5 microL de cultivo en 20 mL de TSB (Becton Dickinson Co) y se incuboacute a
37degC toda la noche
Se sembroacute en tres campos en caja de Petri de 90 mm con TSA (Becton Dickinson Co)
Se incuboacute a 37degC por 24h
Se seleccionoacute una colonia aislada y bien diferenciada
El cultivo (colonia) se incuboacute en 20 mL de TSB a 37degC toda la noche
b) En caso de los cultivos liofilizados
En el vial se hidrataron los cultivos agregando 1 mL de TSB e incubando 1h a 37degC
Se vertioacute el cultivo en 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC toda la noche
Se realizoacute el mismo proceso anteriormente mencionado en a)
B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC)
La siembra o inoculacioacuten consistioacute en introducir artificialmente una porcioacuten de muestra
(inoacuteculo) en un medio adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano para su desarrollo
y multiplicacioacuten Una vez inoculado el medio se incuboacute a una temperatura adecuada para el
oacuteptimo crecimiento en promedio 37degC Los meacutetodos de conteo en placa como capa doble y
capa simple de agar se basan en la determinacioacuten de la concentracioacuten viral mediante el
conteo de UFP las cuales son zonas de aclaramiento circular o halo de inhibicioacuten de
crecimiento bacteriano que se producen en la capa o ceacutesped bacteriano debido a la lisis
producida por los fagos Inicialmente una partiacutecula de fago infecta a su bacteria hueacutesped se
replica y posteriormente se disemina generando una zona circular sin crecimiento de la
bacteria (Solano et al 2012) Por esta razoacuten en nuestro estudio se utilizoacute esta manera de
trabajar considerando las diferentes formas que se puede presentar los halos de inhibicioacuten
(forma tamantildeo densidad)
La teacutecnica se basoacute en mezclar el cultivo bacteriano en fase logariacutetmica y el fago en agar
suave (AS) tambieacuten llamado top agar cuando se aplica a la placa de Petri donde se realizoacute
el proceso de infeccioacuten El AS se preparoacute con TSB y agar bacterioloacutegico (15) para obtener
una consistencia semisoacutelida que permita el desarrollo de las calvas en el ceacutesped bacteriano
Se mantuvo a una temperatura adecuada para conservar el estado liacutequido y se agitoacute
cuidadosamente para dejar interactuar los cultivos fago-hueacutesped en el tubo de ensayo
Materiales y meacutetodos
59
posteriormente se dispersoacute de manera uniforme en placas de Petri de 90 mm de diaacutemetro con
15 mL de TSA La suspensioacuten (ceacutesped bacteriano en ADC) se dejoacute solidificar a temperatura
ambiente unos minutos y posteriormente se incuboacute 24h37degC (Vidales-Contreras et al 2006)
B6 Modelo de infeccioacuten
Las enzimas endolisinas de los fagos provocan la lisis debilitamiento y rompimiento de la
pared celular de las bacterias La lisis depende de la proporcioacuten de fagos y hueacutesped o
multiplicidad de infeccioacuten (Multiplicity of infection MOI) Cuando hay una MOI baja la relacioacuten
de fagos a bacterias no es superior a 21 Cuando la MOI es alta es decir muchos fagos frente
a pocas bacterias las ceacutelulas se lisan directamente (Dimmock et al 2007)
En ese sentido la Norma ISO 10705-11995 indica que durante el ensayo el fago en fase
de multiplicacioacuten experimenta varios ciclos de replicacioacuten lo que resulta en la muerte de la
ceacutelula hueacutesped que ha actuado como faacutebrica para la produccioacuten viral El modelo que se siguioacute
es para observar los halos de inhibicioacuten y contrastar los resultados En la figura 6 se presenta
el modelo de infeccioacuten utilizado con S Typhimurium y el fago PRD1 siguiendo el modelo de
Vidales-Contreras et al (2006) y la puesta a punto propuetas por Sambrook y Russell (2001)
Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten fago-hueacutesped
Materiales y meacutetodos
60
B7 Controles utilizados durante los ensayos
Se utilizoacute la cepa de S Typhimurium y el fago PRD1 como control positivo para observar
la formacioacuten de las calvas para el control negativo se utilizoacute agua esterilizada con esto se
asegurar que si existe infeccioacuten y evitar los falsos positivos que ocurren primordialmente por
contaminacioacuten
Para control negativo el ceacutesped bacteriano se obtuvo de la siguiente manera en un
tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de cultivo de S
Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de agua destilada esteacuteril la mezcla se vertioacute
en placa Petri con TSA
Como control positivo el ceacutesped bacteriano y las placas de lisis se obtuvieron como
sigue en un tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de
cultivo de S Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de fagos PRD1 la mezcla se
vertioacute en placa Petri con TSA
B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium
Para realizar los ensayos microbioloacutegicos se requirioacute trabajar con la misma cantidad de
biomasa en una fase de crecimiento similar El conteo en placa es un meacutetodo de medicioacuten de
biomasa que permite el recuento de ceacutelulas viables y consiste en determinar el nuacutemero de
ceacutelulas capaces de reproducirse y generar colonias sobre un medio soacutelido (cada ceacutelula viable
da origen a una colonia) Para este estudio y ver el efecto de los fagos sobre las bacterias
primeramente se calculoacute la curva de crecimiento celular pues es imprescindible para realizar
la infeccioacuten que la bacteria hueacutesped y se encuentre en fase logariacutetmica Es decir para
determinar la biomasa bacteriana se mide la cineacutetica de crecimiento celular y se considera
que se ha alcanzado la fase de crecimiento exponencial cuando la concentracioacuten es de 10⁸
UFCmL (McLaughlin et al 2006)
Para el conteo bacteriano se utilizoacute el meacutetodo de filtracioacuten por membrana
Se transfirioacute 1 mL del cultivo bacteriano fresco a 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC
Cada 30 minutos se recolectaron 300 microL de cultivo
A cada aliacutecuota recogida se le realizaron diluciones seriadas con 27 mL de agua
Materiales y meacutetodos
61
destilada esteacuteril hasta obtener un factor de 1010
De cada una de estas diluciones se obtuvieron 100 microL que se filtraron por membrana
de celulosa 045 microm (Millipore Corporation Billerica Ma 47 mm esteacuteril Cat No
JMX000089 Millipore) montada en un embudo de filtracioacuten magneacutetico de 47 mm (Pall
GELMAN Laboratory con capacidad de 300 mL) y con bomba de vaciacuteo (GM motors amp
industrial systems Modelo 5kh36kna510x)
Las membranas se colocaron en caja de Petri con TSA y se incubaron 24h a 37degC
C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos
Con excepcioacuten de la microscopiacutea electroacutenica los meacutetodos empleados para determinar el
tamantildeo forma y composicioacuten quiacutemica de los fago requieren una alta pureza de las partiacuteculas
virales El material de partida en cualquier estudio de este tipo para la obtencioacuten del fago es
cuando se presenten los halos de inhibicioacuten en el ADC en general ademaacutes de los fagos
estas zonas claras pueden contener los restos celulares de las bacterias como trozos de
pared membranas ribosomas ADN ARN proteiacutenas y otros componentes de peso molecular
maacutes bajo El contenido de fago en un lisado es del orden de 001 mg mL por lo que para
obtener la cantidad apropiada para su caracterizacioacuten es necesario partir de varios litros
(Leverentz et al 2003 Maestro y Sanz 2016)
Para llevar a cabo la purificacioacuten de los fagos se debe de realizar con concentraciones
superiores a 1010 UFPmL Uno de los meacutetodos maacutes utilizados es la centrifugacioacuten a alta
velocidad y posterior resuspensioacuten de las partiacuteculas sedimentadas en un volumen menor
Cuando es posible esta teacutecnica se reemplaza por un sistema de dos fases basado en la
propiedad que tienen algunos poliacutemeros de alto peso molecular como el polietilenglicol el
dextrasulfato de sodio y el dextrano al separarse estas fases por diferencia de pesos
moleculares los fagos se dispersan en este tipo de medios considerando las concentraciones
empleadas y las condiciones oacuteptimas de pH fuerza ioacutenica y temperatura y al pasar por el
proceso de centrifugacioacuten se concentran en una columna Una vez concentrado el fago en la
columna se puede recuperar faacutecilmente de la interfase Los procesos maacutes comuacutenmente
utilizados para la purificacioacuten posterior se basan en separar las partiacuteculas de fago ya sea por
su tamantildeo o densidad (Sambrook y Russell 2001 Vidales-Contreras et al 2006)
En la figura 7 se presenta el procedimiento para la amplificacioacuten de fagos que nos asegura
Materiales y meacutetodos
62
cultivos puros uniformes y con tiacutetulos altos lo cual es imprescindible para conseguir una
buena imagen en el microscopio electroacutenico
Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten de bacteriofagos aplicando la teacutecnica
de agar doble capa (ADC)
El meacutetodo utilizado para purificar los fagos que despueacutes de utilizaron para analizar su
morfologiacutea implicoacute el uso del kit Montage SEQ96 (Millipore Sequencing Reaction Cleanup Kit
Millipore Corporation EE UU)
En una placa de filtracioacuten (96 well SEQ plate by Millipore) se depositaron en cada
pocillo 15 microL de concentrado de fagos maacutes 5 microL de agua milli-Q (Injection Solution by
Millipore)
Materiales y meacutetodos
63
La separacioacuten se realizoacute por la exclusioacuten de lavados de la columna de gel aplicando
vaciacuteo por medio de una bomba (Millipore EE UU Vacuumpressure 220 V50 Hz 15 mm
Hg)
Posteriormente se resuspendioacute la muestra (Thermomixer comfort by Eppendorf) con
agitacioacuten durante 1 min a 500 rpm
Finalmente se agregoacute 10 microL de agua ultra pura Milli-Q para concentrar la muestra
(Injection Solution by Millipore)
Una de las modificaciones que se realizaron para obtener los fagos con elevada pureza y
concentracioacuten para ser utilizada en la microscopiacutea electroacutenica se realizoacute con el kit Montage
SEQ96 que se utiliza para la purificacioacuten de DNA y en este caso se utilizoacute para concentrar los
fagos (concentracioacuten 1012 UFPmL) El procedimiento se describe a continuacioacuten
Se antildeadieron 20 microL de buffer de inyeccioacuten a la placa donde se teniacutea la suspensioacuten de
fagos se resuspendioacute y transfirioacute todo el volumen a la placa azul de Millipore (kit Montage)
Se colocoacute la placa en la bomba del kit Montage de 2 a 3 min hasta que quedoacute seca
Es aconsejable no dejar maacutes tiempo del necesario para evitar un secado excesivo
Se limpioacute todo el exceso de liacutequido en la placa con papel filtro secando un par de
veces la placa sobre el papel Inmediatamente despueacutes se colocoacute la placa sobre el soporte
de la bomba evitando dejarla sobre el papel
Se antildeadieron 30 microL de buffer de inyeccioacuten
Se colocoacute la placa en la bomba unos 4-5 min hasta secarse
Con papel filtro se limpioacute todo el exceso de liacutequido que quedoacute en la placa y se colocoacute
en el soporte de la bomba
Se antildeadieron 30 microL maacutes de buffer de inyeccioacuten para resuspender
Se colocoacute la placa en agitacioacuten se centrifugoacute a 500 g por 10 min
Se traspasaron los 30 microL a un nuevo pocillo y se recolectoacute el sobrenadante
D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica
Con la concentracioacuten de fagos purificados se preparoacute la muestra para la observacioacuten al
microscopio electroacutenico y se procedioacute utilizando la teacutecnica de tincioacuten negativa tal como se
explica a continuacioacuten
Se depositaron 2 microL de suspensioacuten de fagos en un disco de capa fina de carbono y cobre
Materiales y meacutetodos
64
(200 Mesh Holes 100 microm square Ethene old 200 RU) despueacutes de 2 min de reposo a
temperatura ambiente se eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente Se antildeadieron 2
microL de agente de contraste solucioacuten tampoacuten 1 de acetato de uranilo (UO2middot (CH3COO)2middot2H2O)
(Merck Alemania) Se dejoacute actuar el colorante durante 2 min a temperatura ambiente y se
eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente y despueacutes se dejoacute el disco alrededor de 5
min a temperatura ambiente antes de observar en el microscopio
D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa
(DEM)
La microscopiacutea oacuteptica es el meacutetodo adecuado para la investigacioacuten de procesos celulares
ya que es menos agresivo para el manejo de la muestra Existen teacutecnicas de microscopiacutea con
otras especificaciones donde se aplican para estudiar la adhesioacuten celular y formacioacuten de
biofilms en superficies tales como el espectrofotoacutemetro infrarrojo transformada de Fourier el
laacuteser confocal de barrido y la microscopiacutea de fuerza atoacutemica estos microscopios se
caracterizada por detectar las ceacutelulas viables de las dantildeadas por medio de cromoacuteforos
(Montantildeez et al 2012) La microscopiacutea que estamos trabajando esta basada en fluorescencia
la cual utiliza cromoacuteforos para detectar DNA de ceacutelulas vivas (coloracioacuten verde) y ceacutelulas
muertas (coloracioacuten roja) y ha tenido grandes avances en la observacioacuten de tejidos ceacutelulas
moleacuteculas individuales y por consiguiente algunos restos celulares todos estos con una
excelente resolucioacuten (Pellegrotti et al 2014)
Para la observacioacuten de ceacutelulas mediante el DEM se utilizoacute el kit comercial de viabilidad Bac
Light (LIVEDEAD Bacterial Viability Kit L-13152 Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE
UU) que estaacute compuesto por dos colorantes fluorescentes de aacutecidos nucleicos (SYTOreg9 y
PISYTOreg9) que penetran tanto en las membranas intactas como en las lesionadas lo que
permite evaluar la vitalidad de las ceacutelulas bacterianas basaacutendose en la deteccioacuten de la
actividad de las oxidasas y reductasas bacterianas Se observa una sentildeal fluorescente
mejorada en ceacutelulas bacterianas con procesos metaboacutelicos activos En contraste PISYTOreg9
se manifiesta soacutelo en las ceacutelulas que presentan membranas lesionadas y desplaza el colorante
SYTOreg9 por la transferencia de energiacutea de la resonancia fluorescente Cuando se aplican
estos dos colorantes en proporcioacuten adecuada las ceacutelulas viables con membranas intactas
presentaraacuten fluorescencia verde y en contraste las ceacutelulas muertas o lesionadas tendraacuten
Materiales y meacutetodos
65
coloracioacuten roja (Berney et al 2007)
A continuacioacuten se describe la preparacioacuten de las muestras para ser observadas por el DEM
Se colocaron 2 microL de la concentracioacuten suspensioacuten de la muestra con fagos en una
concentracioacuten de 1x1012 UFCmL sobre un disco de acero inoxidable (tipo 14301 (2 cm de
diaacutemetro y 1 mm de grosor) ligeramente convexos con una altura maacutexima en el centro
de 1 mm
Se dejoacute secar a temperatura ambiente por espacio de 10 min
Posteriormente se aplicaron 2 microL de la solucioacuten vital de fluorescencia (LIVEDEAD Bac
Light Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE UU) que reacciona y da la coloracioacuten
al material geneacutetico de las bacterias
Para la observacioacuten de los discos se utilizoacute el microscopio de fluorescencia Olympus
BX51BX52 (Tokio Japoacuten) con caacutemara digital incorporada (DP 50 Olympus) equipado con
laacutempara de mercurio de 100 W (USH-103 OL Olympus) con filtro de doble paso (U-M51004
FR V2 Olympus)
Para enumerar las ceacutelulas bacterianas en el biofilm que se formo en los discos de
acero inoxidable se trabajoacute con un objetivo de 20X y se ubicaban 10 campos
aleatoriamente y los resultados se expresaron por cm2 Las imaacutegenes se revisaron con el
sistema de anaacutelisis de imagen (anaacutelisis 32 soft Imaging System GMBH Alemania)
El biofilm bacteriano se desarrolloacute en la superficie de discos de acero inoxidable tipo
14301 Antes de usarse deben limpiarse bien por inmersioacuten en una solucioacuten acuosa de
detergente (DINO-dis-Dipol Espantildea) al 5 en agua durante 1 h despueacutes se realizoacute la
inmersioacuten en bantildeo con alcohol isopropiacutelico (2-propanol) (Merck Alemania) al 70 en agua
durante 15 min Una vez secos se esterilizaron en autoclave a 121degC por 15 min
D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM
Se inocularon la superficie de los discos con 50 microL de cultivo de S enterica maacutes medio de
cultivo (TSB) para proporcionar en medio rico para que se forme el biofilm posteriormente se
colocaron en cajas de Petri esteacuteriles y se mantuvieron en condiciones de humedad a
temperatura ambiente durante periacuteodos de 24 48 y 72h realizaacutendoles el conteo
correspondiente para verificar el desarrollo del biofilm
Materiales y meacutetodos
66
Una vez formado el biofilm se inocularon los discos con 3 concentraciones diferentes de
fagos 6 7 y 8 logcm2 en un volumen inferior a 50 microL Las diluciones del fago se hicieron en
solucioacuten salina fisioloacutegica (SSF cloruro de sodio 080) (Merck Alemania) Se realizoacute la
infeccioacuten al inocular a los discos prueba y los discos de control con el mismo volumen de SSF
las condiciones de incubacioacuten se realizaron con humedad y a temperatura ambiente
Los discos de acero inoxidable que fueron inoculados con la infeccioacuten fago-bacteria se
analizaron en periacuteodos de 0 2 8 24 y 48 h Se utilizaron para la valoracioacuten de bacterias y
fagos y se distribuyeron los discos de la siguiente manera 2 para visualizacioacuten microscoacutepica
panoraacutemica 2 para recuento bacteriano por microscopiacutea y 2 para recuento bacteriano dando
un total de 6 discos por caja de Petri por duplicado y por cada concentracioacuten (3) por cada
ensayo (3) y por horarios (5) de dando un total de 540 discos
Para el conteo sobre cada disco se colocaron 20 microL del colorante (LIVEDEAD Pribes) y
se incubaron por 5 min a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad y se tomaron
fotografiacuteas a 10X 20X y 40X Para la microscopiacutea de conteo las fotografiacuteas se realizaron a
un aumento de 40X considerando 10 campos aleatorios
Cuando se formoacute el biofilm se requirioacute hacer los recuentos de bacterias y de fagos en ese
sentido para recuperar las bacterias los discos se colocaron en un frasco con 5 mL de TSB
con Tween 80 (TSBTW) (Merck Alemania) y 3 g de perlas de vidrio se homogeneizoacute la
muestra por 1 min en agitador voacutertex a maacutexima potencia para favorecer el desprendimiento
de los microorganismos y posteriormente se realizaron diluciones seriadas De este mismo
extracto se obtuvo el material necesario para hacer el conteo de fagos utilizando la teacutecnica de
ADC Y para el recuento de las bacterias viables se trabajoacute con cajas de Petri se sembroacute 1
mL en TSA con 06 de extracto de levadura (TSAYE Merck Alemania) y se incuboacute a 37degC
durante 24h (Fuster-Valls et al 2008)
67
V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Resultados y discusioacuten
68
Resultados y discusioacuten
69
A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras
De los 10 sitios de recoleccioacuten se lograron obtener un total de 39 muestras en junio de
2007 En la tabla 9 se presentan los sitios y el nuacutemero de muestras recogidas en cada sitio
En el caso del Riacuteo Santa Catarina se abarcoacute una distancia de 95 km la cual presentaba
diferentes zonas de descarga de aguas residuales y de ahiacute se hicieron las tomas en un periacuteodo
de estiaje En el caso de las lagunas de oxidacioacuten del municipio de Mariacuten esta zona presenta
tres lagunas con un aacuterea total de 16700 m2 se realizoacute el muestreo de manera aleatoria En
cuanto a las muestras que se obtuvieron en el sitio de comercializar carne de pollo se les tratoacute
de igual manera para comprobar si existiacutean fagos
Los lugares elegidos para la recoleccioacuten de muestras son similares a los reportados en la
literatura regularmente para el aislamiento de fagos del ambiente se utilizan aguas residuales
y establecimientos de manipulacioacuten yo venta de alimentos (Leeuw et al 2017) En
investigaciones previas se realizan muestreos de diversos sitios como en la piel y heces de
animales manos de los cuidadores superficies quiruacutergicas e instrumentos o utensilios usados
en los establecimientos hoteles y restaurantes (Ejo et al 2016 Yergeau et al 2016) Los
muestreos de aguas tambieacuten se pueden realizar en sitios cercanos a las salidas de drenaje
de hospitales esto es de gran importancia ya que donde hay bacterias posiblemente esteacuten
sus respectivos fagos (Tomat et al 2014 Mattila et al 2015 McShan y Nguyen 2016)
Resultados y discusioacuten
70
Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos
B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis
Para el aislamiento de los fagos especiacuteficos de Salmonella fue necesario la puesta a punto
de varios procedimientos la teacutecnica de agar doble capa (ADC) determinar la cineacutetica de
crecimiento de cultivos de Salmonella determinar la fase de eclipse en la relacioacuten fago-
bacteria (se utilizoacute como control la cepa S Typhimurium y el fago PRD1) y su puesta a punto
en el laboratorio de bioremediacioacuten de la Facultad de Agronomiacutea de la UANL
B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S
Typhimurium
La accioacuten liacutetica de los fagos sobre Salmonella se analizoacute utilizando la teacutecnica ADC
En este procedimiento es necesario tener un ceacutesped bacteriano uniforme entre dos capas
de medio soacutelido que puede ser agar-agar o agar-agarosa (Sambrook y Rusell 2001)
Con el objetivo de abaratar los costes y mejorar los resultados en este trabajo se empleoacute
esta teacutecnica con algunas modificaciones que se describen a continuacioacuten Asiacute pues se decidioacute
que las capas fueran agar-agar donde la primera capa fue de agar al 15 en medio TS y la
Municipio Sitio de la toma N de muestras
Tipo de agua
Monterrey
Parque Fundidora 3 Estanque y corriente
Riacuteo Santa Catarina 10 Corriente
Establecimiento de comida 2 Lavado del pollo
Av Conductores 2 Corriente
Mariacuten
Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal
10 Estanque y corriente
Riacuteo La Libertad 2 Corriente
Guadalupe
Alcantarillas de la colonia La Azteca
3 Corriente
Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados
2 Lavado del pollo
San Nicolaacutes de los Garza
Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac
2 Corriente
Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea 3 Corriente
Resultados y discusioacuten
71
segunda con agar a una menor concentracioacuten para hacer la capa menos firme por lo que fue
necesario poner a punto la teacutecnica probando diferentes concentraciones de agar en ambos
casos a pH 72 Ademaacutes esta adecuacioacuten es importante por el ahorro que se generoacute al utilizar
un componente maacutes econoacutemico que la agarosa lo cual repercutioacute favorablemente en el coste
de la prueba
Otra variable para poner a punto en la teacutecnica de ADC es el volumen de cultivo bacteriano
a utilizar para generar el ceacutesped de Salmonella y lograr una adecuada interaccioacuten con el fago
Se probaron 3 voluacutemenes diferentes de cultivo de S Typhimurium incubados 24 horas a 37oC
para alcanzar una concentracioacuten de 16 x 108 UFCmL Dependiendo de la cantidad de inoacuteculo
las caracteriacutesticas del ceacutesped bacteriano tienen diferente contraste lo cual puede facilitar o
dificultar la observacioacuten de las placas liacuteticas Finalmente el mejor resultado se obtuvo al
utilizar el volumen de 500 L ya que se logroacute una mejor observacioacuten del aclaramiento del
ceacutesped bacteriano al formar las placas liacuteticas En la tabla 10 se muestran las caracteriacutesticas
de las capas en la caja Petri para un buen manejo y desarrollo de la zona liacutetica producida por
el fago al multiplicarse
Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC
Paraacutemetro Condiciones
Agar suave (con agar) () 08
Temperatura del agar suave (degC) 49
pH del medio de cultivo (soacutelido y liacutequido) 72
Cantidad de agar suave (mL) 45
Cultivo bacteriano (microL) 500
Muestra tratada con fagos (microL) 100
Resultados y discusioacuten
72
B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium
El cultivo hueacutesped debe de encontrarse creciendo en medio liacutequido TS en fase logariacutetmica
al momento de mezclarlo con el fago Para identificar la fase logariacutetmica se probaron
diferentes tiempos de crecimiento Con todo ello se observa que la fase logariacutetmica de S
Typhimurium se encuentra en el minuto 150 coincidiendo con los datos reportados por
Vidales-Contreras et al (2006) Y siguiendo con mi tesis la determinacioacuten de la concentracioacuten
se realizoacute mediante el promedio de la enumeracioacuten de las UFC por placas Petri preparadas
por duplicado multiplicado por el factor de dilucioacuten el cual es el reciacuteproco del producto del
volumen ensayado y la dilucioacuten usada para el anaacutelisis Al final se observa cuando se ha
llegado a la fase estacionaria del desarrollo bacteriano (tabla 11) Se utiliza un factor de
dilucioacuten el cual se obtiene como el reciacuteproco de la multiplicacioacuten de volumen de ensayo y la
dilucioacuten usada en el anaacutelisis
Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium
Tiempo Minutos
(Acumulado) Dilucioacuten
UFCmL Promedio
F (Factor) Concentracioacuten
(UFCmL)
T0 0 1 x 10-5 9 plusmn 25 1 x 106 900 x 106
T1 30 1 x 10-5 13 plusmn 74 1 x 106 130 x 107
T2 60 1 x 10-5 24 plusmn 56 1 x 106 240 x 107
T3 90 1 x 10-5 51 plusmn 32 1 x 106 510 x 107
T4 123 1 x 10-5 211 plusmn 89 1 x 106 211 x 108
T5 150 1 x 10-6 215 plusmn 81 1 x 107 215 x 109
Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)
B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis
Las consideraciones tomadas del modelo infectivo S Typhimurium y el fago PRD1 y
utilizando la teacutecnica ADC se replican para poner a punto a la bacteria que se quiere probar
que en este caso es S Typhi ATCC 19430 Los resultados de estos ensayos se pueden
observar en la tabla 12 en la que se puede observar que es ligeramente mayor la etapa donde
Resultados y discusioacuten
73
se puede realizar la infeccioacuten (fase de eclipse) de los fagos aislados y la bacteria hueacutesped
Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis (108 UFCmL) (37 ordmC24h)
Tiempo Minutos (Acumulado)
Dilucioacuten UFCmL Promedio
F (Factor) Concentracioacuten (UFCmL)
T0 0 1 x 10-5 216 710 1 x 106 20 x 107
T1 60 1 x 10-5 260 608 1 x 106 20 x 107
T2 120 1 x 10-6 160 173 1 x 107 16 x 108
T3 180 1 x 10-6 244 208 1 x 107 24 x 108
T4 240 1 x 10-7 400 100 1 x 107 40 x 109
Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)
B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis
De los sitios muestreados se logro obtener 39 muestras y se obtuvo un total de 15 fagos
aislados a partir de dos fuentes de aguas residuales las del Riacuteo Santa Catarina y las lagunas
de oxidacioacuten de Mariacuten Los 15 fagos se nombraron consecutivamente como MRH 1-15 Los
15 fagos se probaron contra la cepa hueacutesped S Enteritidis (CINSP tabla 4) tras realizar de
3 a 4 amplificaciones la mayoriacutea (14 fagos) no presentoacute actividad liacutetica (formacioacuten de halos
de inhibicioacuten) de manera que fueron descartados para los siguientes estudios siendo
solamente uno proveniente de la muestra del Rio Santa Catarina el que produjo halos bien
definidos en el ceacutesped bacteriano y con eacuteste se continuoacute trabajando El fago que mantuvo la
actividad liacutetica fue el MRH6 Se propuso nombrarle como MRH considerando la M para
muestra la RH por el Rodrigo Hernaacutendez
B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten
La principal caracteriacutestica de los fagos es cuando forman halos de inhibicioacuten (tambieacuten
llamadas zonas liacuteticas o calvas) y en nuestro estudio las muestras de agua recolectadas
fueron tratadas y analizadas mediante la teacutecnica ADC observando los halos de inhibicioacuten
claros y de diferentes diaacutemetros estas observaciones son similares a las observadas por
Ackermann (2003) Tanto la cantidad de UFP que se pueden desarrollar y observar hecha por
Resultados y discusioacuten
74
los fagos y la pureza en que encuentren los bacterioacutefagos de las muestras obtenidas del medio
ambiente estaacuten directamente relacionadas la especificidad contra la bacteria Al sembrar por
vaciado en placa estos lisados sobre la cepa indicadora se obtuvieron diferentes tamantildeos de
placas liacuteticas
En la figura 8 se muestran los halos de inhibicioacuten en ceacutesped de Salmonella al realizar la
infeccioacuten se pueden observar los diferentes tamantildeos y la forma se da por la capacidad de
raacutefaga (nuacutemero de copias al realizar el proceso liacutetico) de los fagos de la progenie los fagos
suelen tener una raacutefaga de maacutes de 100 partiacuteculas infectivas producidas en un lapso de tiempo
de 05 ndash 20 h Algunos halos formados por el fago fueron claros lo que indica que es liacutetico de
acuerdo con diversos autores (Sambrook y Rusell 2001 Vidales-Contreras et al 2006 Wong
et al 2014) En nuestro estudio se batalloacute en encontrar fagos a pesar de buscar sitios
sentildealados por autores antes mencionados
Al intentar obtener fagos puede suceder que se encuentren en concentraciones tan
pequentildeas que al probarlos contra alguna cepa hueacutesped no sirven para trabajar por lo que se
llevoacute a cabo repeticiones seriadas (amplificacioacuten) asegurando que al formar una placa de Petri
en ADC con tamantildeos de los halos de inhibicioacuten iguales lo que nos indica que pertenecen a
una sola especie de fago
Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por fagos con halos de inihibicioacuten de
diferentes tamantildeos
Resultados y discusioacuten
75
C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli
La clasificacioacuten de los fagos se puede establer en base a su morfologiacutea al aacutecido nucleico
al espectro de accioacuten y algunas consideraciones inmunoloacutegicas (Criscuolo et al 2017) Al
realizar la infeccioacuten de fago-bacteria y observar la presencia de halos liacuteticos en las placas de
ceacutesped bacteriano se considera que se ha producido una infeccioacuten exitosa pero previamente
es necesario poner a punto el cultivo puro de ambos cultivos y considerar la concentracioacuten de
cultivos a utilizar
Al seleccionar los fagos que presentaron uniformidad en cuanto a la inhibicioacuten y posterior
evaluacioacuten de los fagos se consideraron varios factores entre ellos el tiempo que tarda la
replicacioacuten viral (lo cual es variable) siendo que en algunos casos se pueden replicar en
cuestioacuten de minutos A simple vista se pueden observar la formacioacuten de halos de lisis en el
ceacutesped bacteriano en las cajas de Petri
Asiacute pues la teacutecnica ADC se repitioacute varias veces hasta obtener placas liacuteticas con ideacutentica
morfologiacutea y tamantildeo En la tabla 13 se observa que hay diferentes tamantildeos de halos En los
primeros ensayos soacutelo cuatro muestras de agua (15 21 26 y 33) dieron halos de inhibicioacuten
pudieacutendose distinguir bien la forma y el tamantildeo Al realizar posteriores siembras los fagos
fueron perdiendo capacidad de infeccioacuten (fagos atemperados) y soacutelo la muestra 21 de las
lagunas de oxidacioacuten provenientes de Mariacuten presentoacute fagos con actividad liacutetica y el resto de
fagos no desarrolloacute actividad constante
Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten de S Enteritidis en ceacutesped
bacteriano
Diaacutemetro de halo grande ge 8mm mediano 8 lt X lt6mm pequentildeo le 5mm
Distribucioacuten de tamantildeos de halo
Muestra de agua Grande Mediano Pequentildeo
15 8 23 15
21 17 11 27
26 10 18 6
33 7 9 13
Diaacutemetro medio halo (mm) 1055 0671 0376
Resultados y discusioacuten
76
En la tabla 14 se presenta el listado de posibles hueacutespedes probados 12 cepas de
Salmonella y 4 de E coli que se probaron contra los 15 fagos aislados previamente Se puede
distinguir que afecta a algunas serovariedades de Salmonella y no tiene efecto en otras
serovariedades entericas No afecta nada a las cepas de E coli Se ve que la cepa maacutes
afectada por el fago es la S Typhi ATCC 19430 y otras cepas de Salmonella son afectadas
ligeramente
Resultados y discusioacuten
77
Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades de Salmonella spp y de E coli
serovariedades Fagos
M
R
H
1
M
R
H
2
M
R
H
3
M
R
H
4
M
R
H
5
M
R
H
6
M
R
H
7
M
R
H
8
M
R
H
9
M
R
H
1
0
M
R
H
1
1
M
R
H
1
2
M
R
H
1
3
M
R
H
1
4
MR
H15
S Typhimurium ATCC 13311
-
-
t
- -
t
- - - - - - - - -
S Paratyphi ATCC 9150 - - - - - - - - - - - - - - -
S Enteritidis ATCC 13076 - - - - - - - - - - - - - - -
S Typhi ATCC 19430 + + + + + t
c
+ + + n
d
n
d
n
d
n
d
nd +
S Typhimurium - - - - - - - - - - - - - - -
S Bongori ATCC 43975 - - - - - - - - - - - - - - -
S enterica LT2 - - - + + + - - - - - - - -
S sub enterica CECT 4138 - - - - + + + - - - - - - - -
S sub enterica CECT 4594
t
t
t
- + + + - - -
t
- - - -
S sub enterica CECT 409 - - - - n
d
- -
t
- - - - - - -
S sub enterica CECT 698 - - - - - t
c
- - - - - - - - -
S Typhimurium CCUG
29478
- - - + + - - - - - - - -
E coli CECT 515 - - - - - - - - - - - - - - -
E coli K12 - - - - - - - - - - - - - - -
E coli ATCC 10536 - - - - - - - - - - - - - -
E coli O157H7 CECT 4783 - - - - - - - - - - - - - - -
+ crecimiento y desarrollo de halo indica desarrollo muy pequentildeo o difuso del halo t indica desarrollo pequentildeo y turbio del halo tc indica turbio o con centro opaco en el centro del halo - no crecimiento o desarrollo de halo nd aparente baja efectividad o halo difuso
Resultados y discusioacuten
78
Resultados y discusioacuten
79
El fago que siacute mostroacute actividad (MRH6) y que mantuvo la capacidad liacutetica durante las
diferentes amplificaciones se trabajoacute de manera continua hasta obtener halos uniformes en el
tamantildeo y asiacute ya se considera como una entidad pura de fago Los resultados obtenidos en
este trabajo son semejantes a los mostrados por Thung et al (2017) En la figura 9 se
presentan las imaacutegenes donde se muestra el desarrollo de halos liacuteticos previamente
mencionados donde se puede observar los halos uniformes contra A) S Enteritidis (CINSP)
y B) S Typhi ATCC 19430 (UAB)
Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria A) S Enteritidis (CINSP) y B) S Typhi ATCC 19430
La especificidad de los fagos se encuentra generalmente a nivel de cepa y tambieacuten de
especie y maacutes raramente a nivel de geacutenero Es de intereacutes el garantizar una eficiente infeccioacuten
de la dupla fago-bacteria de esta manera se toman todas las medidas precautorias para
obtener resultados fiables en este sentido se requiere verificar todos los aspectos como son
los controles (positivo y negativo) En el caso del control negativo se verificoacute el desarrollo
solamente del ceacutesped bacteriano de la cepa hueacutesped con la teacutecnica ADC y como control
positivo se consideroacute el modelo del fago PRD 1 y S Typhimurium los fagos son altamente
especiacuteficos (no afecta a otros cultivos bacterianos) y no se puede descartar falsos positivos
por la presencia de restos celulares bacterianos (Segundo et al 2010 Szafranski et al 2017)
Resultados y discusioacuten
80
D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM
El ICTV clasifica a los fagos en 1 orden13 familias y 31 geacuteneros De los cuales se
observa al orden de los Caudovirales el cual comprende a la mayor parte de los fagos (en
torno a un 95)y estos estaacuten constituidos por 3 familias con cola Myoviridae Podoviridae
y Siphoviridae Con estas caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas mediante el TEM en la
figura 10 se presentan las imaacutegenes del fago MRH6
El anaacutelisis de una suspensioacuten de fagos con una concentracioacuten de 1x1012 UFPmL mediante
microscopiacutea electroacutenica muestra una distintiva morfologiacutea de cabeza icosaeacutedrica estructura
alargada y cola no contraacutectil La caacutepside tiene un diaacutemetro de 55-60 nm y la cola puede
alcanzar los 570 nm Estas caracteriacutesticas se corresponden con la familia Siphoviridae Yang
et al (2017) comentan que esta familia de fagos se encuentra frecuentemente en
enterobacterias
Figura 10 Imagen por TEM del fago MRH6 (X100 000) la barra representa 100nm (Servicio de Microscopiacutea UAB)
Resultados y discusioacuten
81
D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero
inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de
epifluorescencia directa (DEM)
Para corroborar la potencial condicioacuten como agente de desinfeccioacuten del fago MRH6 es
necesario observar su efectividad a traveacutes de la DEM con la que se pueden observar
bacterias viables y no viables Tambieacuten la materia orgaacutenica puede dar falsos positivos y se
debe tener en cuenta al comparar con otros meacutetodos de conteo (Montantildeez et al 2012)
En este trabajo S Typhi ATCC 19430 desarrolloacute biofilms en las superficies de acero
inoxidable (discos tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm) y consiguieron
niveles de 29 plusmn 02 UFCcm2 despueacutes de tener un maacuteximo de 72 h en incubacioacuten en
condiciones de humedad y temperatura ambiente tal como se puede observar en la figura 11
Estos biofilms tienen distinta intensidad seguacuten el tiempo de incubacioacuten siendo los periodos
evaluados de 24 48 y 72h respectivamente En estas condiciones se realizoacute el recuento en
tres zonas de cada disco para cada tiempo de incubacioacuten y los resultados se presentan en la
figura 12 Para tener fiabilidad de los resultados se realizaron los conteos por triplicado porque
el manejo de los discos es muy complejo y para evitar errores de manejo se consideroacute
necesario tener maacutes de una muestra otorgando ademaacutes la oportunidad de comparar
resultados y tener un margen de referencia en cuanto a los resultados obtenidos
Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 en
diferentes tiempos de incubacioacuten (24 48 y 72h) a temperatura ambiente
Resultados y discusioacuten
82
Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable incubados a temperatura ambiente n = 3
En este estudio se compararon 2 meacutetodos de conteo de bacterias despueacutes de ser atacadas
por los fagos eacutestos fueron el recuento en placa de agar y por otro lado la observacioacuten por
microscopiacutea de epifluorescencia y la relacioacuten entre ambos meacutetodos Desafortunadamente se
han perdido los resultados por un problema irresoluble pero si se puede comentar que existe
una relacioacuten ligeramente inferior a 09 (R2 ) Esta observacioacuten ya ha sido presentada
anteriormente por otros autores (Fuster-Valls et al 2008 Engelhardt et al 2014)
El cultivo bacteriano se puede contabilizar por conteo en placa directo (TSA) este meacutetodo
es utilizado generalmente para cultivos de geacutermenes no exigentes o moderadamente
exigentes y cuando se quiere visualizar como afecta el ataque de los fagos las ceacutelulas
bacterianas se visualizan por DEM (cuya coloracioacuten cambia a verde cuando han sido atacadas
por los fagos) y una forma de visualizar este ataque es por medio de TSA con la teacutecnica de
ADC
0
5
10
15
20
25
0 10 20 30 40 50 60
Co
nte
o (
Lo
g U
FC
cm
2)
Tiempo (h)
Crecimiento bacteriano
Resultados y discusioacuten
83
D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable
Se aplicoacute la DEM para evaluar la efectividad del fago MRH6 en el control de S Typhi ATCC
19430 sobre superficies de acero inoxidable en condiciones de humedad El fago MRH6 es
liacutetico capaz de disgregar los biofilms
El analizar la accioacuten liacutetica del fago sobre Salmonella por medio del DEM es muy importante
e innovador pero el material que se utiliza y la manera en que se comportan las diferentes
bacterias hacen que se deba ser muy precavido al considerar el uso de este meacutetodo como
adecuado para realizar conteos (Libuchi et al 2010) Por ejemplo se debe tener en cuenta
que existen bacterias que no forman un biofilm y presentan movimiento esto puede llegar a
complicar el visualizarlas si no estaacuten en el campo por lo que se podriacutea pensar que fueron
atacadas y eliminadas por los fagos o bien que por los diferentes lavados se barrieron
La DEM con la tincioacuten LIVEDEAD reveloacute la presencia de ceacutelulas viables con coloracioacuten
verde En la figura 13 se puede observar el efecto letal del fago MRH6 sobre la poblacioacuten de
S enteacuterica disminuyendo su cantidad considerablemente en base a el tiempo de incubacioacuten
en color verde Se observa que hay disminucioacuten de las ceacutelulas de S Typhi ATCC 19430 al ser
atacadas por el fago MRH6 Recordemos que la infeccioacuten con el MRH6 se realizoacute despueacutes de
formar un biofilm a temperatura ambiente y con humedad por espacio de 72h en 3
concentraciones 6 7 y 8 UFPmL Al paso del tiempo se aprecia que a las 48h hay pocas
ceacutelulas vivas al menos detectadas por la teacutecnica utilizada
Resultados y discusioacuten
84
a)
b)
c)
Figura 13 Secuencia de imaacutegenes de epifluorescencia que ilustran la destruccioacuten de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable causada por el fago MRH6 tras incubacioacuten de 0 8 24 y 48 h y con 3 concentraciones de fagos a) 6 b) 7 y c) 8 UFPmL respectivamente
La DEM es un meacutetodo altamente sensible que se caracteriza por la formacioacuten de imaacutegenes
amplificadas y es considerada una teacutecnica poderosa con altos niveles de sensibilidad y
resolucioacuten Tomando como referencia los resultados se considera que la DEM es una
herramienta eficaz para el conteo bacteriano pero hay que considerar la experiencia del
observador
Resultados y discusioacuten
85
En algunas ocasiones al observar las bacterias atacadas por los fago se pueden encontrar
muestras con material geneacutetico mezclado con restos celulares esta situacioacuten hace que
algunos investigadores recomienden extraer los fagos de la muestra antes de sembrar las
bacterias con el fin de determinar la reduccioacuten bacteriana uacutenicamente debida a la actividad
virulenta del fago sobre la muestra y no a la infeccioacuten por fagos libres presentes en el agar
(Sharma et al 2009) En ese sentido tal como reporta Fuster-Valls et al (2008) en su trabajo
observoacute que el limite de deteccioacuten de esta teacutecnica es de 279 log10 celulas por cm2 en cambio
en nuestro trabajo y tal como se observa en la figura 14 se pudo llegar a una sensibilidad
muy proacutexima a 2 y que coincide con las imaacutegenes de la figura 13 en las que a las 24 y 48
horas apenas se observan algunas manchas que corresponden al crecimiento bacteriano
Los fagos utilizan los recursos de la ceacutelula para hacer muchos fagos nuevos lo que causa
que la ceacutelula lise (estalle) y muera en el proceso La lisis en las uacuteltimas etapas del ciclo liacutetico
el fago expresa los genes para las proteiacutenas que hacen agujeros en la membrana plasmaacutetica
y la pared celular En la figura 14 se puede observar como el recuento de Salmonella Typhi
ATCC 19430 disminuye por el ataque del fago MRH6 El efecto del fago es muy fuerte y al
final los conteos son muy parecidos
Resultados y discusioacuten
86
Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 en superficies de acero inoxidable por el fago MRH6 con diferentes concentraciones y hasta 48 h de incubacioacuten
En este trabajo se buscoacute crear condiciones de infeccioacuten fago-bacteria en el laboratorio
como las que se pudieran presentar en la industria Los resultados de esta relacioacuten del fago
MRH6 y S Typhi ATCC 19430 muestran que la aplicacioacuten del fago es efectiva pero hay que
considerar que funciona mejor a altos tiacutetulos (108 UFCmL) y que deberaacute de potenciarse
cuando se trate de un coctel de fagos
Nuestros resultados sugieren que los fagos pueden ser utilizados como un meacutetodo para
controlar un biofilm formado por un bacteria especiacutefica
Al realizar la buacutesqueda de informacioacuten en diferentes motores de buacutesqueda una de las
plataformas de libre acceso (Pubmed) se obtuvo una relacioacuten de 5 en publicaciones de
00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Salm
on
ella
Typ
hi
AT
CC
19430
(lo
g1
0ceacutelu
las cm
2)
Tiempo (h)
Fago MRH6 a 6 Logml Fago MRH6 a 7 Logml Fago MRH6 a 8 Logml Control sin fago
Resultados y discusioacuten
87
fagos contra diferentes serovariedades de Salmonella spp lo que se puede traducir en que
hay un aacuterea de oportunidad latente
Las consideraciones que se enviacutean como propuesta es que existen en estos momentos
muchos trabajos sobre fagos pero aquiacute en Meacutexico no hay trabajos reportados y los que
existen estaacuten apenas en fases iniciales
Existe un enorme potencial de trabajo en esta aacuterea con los fagos tal es el caso de la
fagoterapia en otros sitos y en otros tiempos estaacuten realizando experimentos para ser
explotada como alternativa para todos los aacutembitos desde hogares industria salud animales
vegetales etc Por lo menos en EE UU tienen grandes avances en estudios relacionados
con la aplicacioacuten en bacterias multiresistentes que por el uso de antibioacuteticos han mutado esto
en el sector salud donde se estaacute perdiendo la batalla
Una de las fortalezas de estudiar a los fagos es que antes de que los antibioacuteticos fueran
descubiertos habiacutea investigacioacuten considerable sobre los fagos como tratamiento para las
enfermedades bacterianas humanas por lo menos en parte de Europa La aplcacion de los
fagos es potencialmente son buenos candidatos para tratar enfermedades bacterianas en
seres humanos inocuidad aliemnaria bioremediacioacuten y cada regioacuten tiene fagos endeacutemicos y
este tabajo representa de los primeros en llevarse en Monterrey
Ciertas limitaciones de los resultados se debiooacute a las condiciones que se presentaron al
realizar el estudio (laboratorio equipo conocimiento del tema) solamente se pudo aislar un
fago y lo recomendable es que sean varios fagos dado que son muy especiacuteficos de especie
o hasta de cepa Se proboacute su accioacuten sobre superficies con un solo cultivo bacteriano y en la
realidad las superficies se contaminan con diferentes bacterias
Lo que se vizualiza para nuestro estudio es sugerir varias liacuteneas de accioacuten a futuro Por
ejemplo el fago aislado podriacutea probarse in vivo sobre carne de pollo o fagoterapia tambieacuten
podriacutea continuar los estudios para aislar maacutes fagos y hacer mezclas (coacutecteles) que tuvieran
un mayor rango de actividad y combatir a diversas especies de Salmonella Con respecto al
tratamiento de superficies podriacutean utilizarse coacutecteles de fagos para tratar biofilms bacterianos
formados por maacutes de dos especies o inclusive podriacutean probarse en biopeliacuteculas industriales
reales
Resultados y discusioacuten
88
89
VI CONCLUSIONES
90
Conclusiones
91
De las 39 muestras de agua analizadas se aislaron tentativamente15 fagos de los que soacutelo 4
mantuvieron en un primer momento su actividad liacutetica estos fagos se correspondieron con las
muestras de agua 15 21 26 y 33 Se siguioacute trabajando con ellos y finalmente solo uno de
ellos el MRH6 mantuvo su actividad liacutetica despueacutes de varias amplificaciones este fago se
aisloacute de las aguas residuales de Mariacuten
Se consiguioacute optimizar la teacutecnica ADC cambiando la agarosa que tiene un alto costo por
agar-agar maacutes econoacutemico sin alterar la fiabilidad de la teacutecnica ademaacutes con este cambio se
facilita el manejo
En relacioacuten con la especificidad de los 15 fagos aislados frente a las 16 cepas de
enterobacterias probadas (12 cepas de Salmonella spp y 4 de E coli) se observa ciertas
tendencias marcadas Ninguno de los fagos ataca a las cepas de E coli probadas En cuanto
a Salmonella se observa una fuerte especificidad frente a S Typhi (ATCC 19430) una ligera
actividad frente a varias cepas de S enterica y no hubo efecto contra las demaacutes cepas de
Salmonella ensayadas lo cual confirma la elevada especificidad fago-hueacutesped
Las imaacutegenes obtenidas mediante DEM muestran una morfologiacutea caracteriacutestica de cabeza
icosaeacutedrica estructura alargada y cola no contraacutectil que sugieren que el fago MRH6 se puede
clasificar en la familia Siphoviridae
Se observa un efecto liacutetico progresivo del fago MRH6 frente a biofilms de Salmonella en
discos de acero inoxidable llegando a valores miacutenimos inferiores a 102 a las 48 horas de
incubacioacuten para todas las concentraciones de fago utilizadas (6 a 8 UFPmL)
Se comprueba que la DEM es un buen meacutetodo para la cuantificacioacuten del crecimiento de S
Typhi (ATCC 19430) sobre discos de acero inoxidable con una gran sensibilidad y resolucioacuten
ya que se observaron claras diferencias en los diversos tiempos de incubacioacuten ensayados y
a diferentes concentraciones del fago MRH6 Esto confirma que la teacutecnica es una herramienta
eficaz para valorar el efecto liacutetico de los fagos sobre biofilms
Ya que en este trabajo solamente se obtuvo un fago liacutetico se sugiere reflexionar acerca de
los factores que han dificultado la obtencioacuten de un nuacutemero maacutes amplio de fagos
Conclusiones
92
Este trabajo refleja el gran intereacutes por iniciar o regresar a trabajar con fagos tal como esta
sucediendo en otras partes del mundo Hasta el momento hay muchas espectaivas sin
embargo todaviacutea se necesita investigacioacuten para saber queacute tan seguros son
93
VII BIBLIOGRAFIacuteA
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Dra Reyes Pla Soler Catedraacutetica de Tecnologia dels Aliments del Departament de
Ciegravencia Animal i dels Aliments de la Universitat Autogravenoma de Barcelona
HACE CONSTAR
Que la memoria titulada ldquoAislamiento y caracterizacioacuten parcial de bacterioacutefagos de
Salmonella spp con potencial aplicacioacuten en el biocontrol sobre superficiesrdquo presentada
por Rodrigo Hernaacutendez Santiago para optar al grado de Doctor por la Universitat
Autogravenoma de Barcelona la cual ha sido realizada bajo su direccioacuten y cumple con los
requisitos para su defensa autoriza su presentacioacuten para que sea juzgada por la
comisioacuten correspondiente
Y para que conste a los efectos oportunos firma el presente certificado en Bellaterra
a 21 abril de 2019
Dra Reyes Pla Soler
Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas Profesor titular de la Facultad de Salud Puacuteblica y
Nutricioacuten de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
HACE CONSTAR
Que la memoria titulada ldquoAislamiento y caracterizacioacuten parcial de bacterioacutefagos de
Salmonella spp con potencial aplicacioacuten en el biocontrol sobre superficiesrdquo presentada
por Rodrigo Hernaacutendez Santiago para optar al grado de doctor por la Universitat
Autogravenoma de Barcelona la cual ha sido realizada bajo su direccioacuten y cumple con los
requisitos para su defensa autoriza su presentacioacuten para que sea juzgada por la
comisioacuten correspondiente
Y para que conste a los efectos oportunos firma el presente certificado en Monterrey
NL a 21 de abril de 2019
Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas
Si no puedes volar corre
Si no puedes correr camina
Si no puedes caminar gatea
Pero hagas lo que hagas siempre sigue hacia adelante
Martin Luther King jr (1929-1968)
Agradecimientos
Este trabajo se ha realizado gracias a la financiacioacuten aportada por el Programa de
mejoramiento del profesorado (PROMEP) PROMEP1035062037 UANL-326 de la
Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) dentro del programa de becas para la
formacioacuten de investigadores y a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para
el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y de
Cooperacioacuten) Programa Extranjeros II-A convocatoria 2010-2011 0000521211
A la Dra Teresa de los Reyes Pla Soler por la confianza depositada en miacute y darme la
oportunidad de ser su estudiante sin sus consejos no hubiera sido posible concluir esta
tesis
Al Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas por ser un guiacutea durante mi formacioacuten como
investigadora por sus ensentildeanzas con palabras y el ejemplo y por su apoyo en el
aspecto profesional y personal
Al Dr Joseacute Juan Rodriacuteguez Jerez por su gran apoyo acadeacutemico y por permitirme
trabajar desinteresadamente en las instalaciones y con el equipo de laboratorio
A la Dra Manuela Hernaacutendez Herrero que es una gran persona que me ha apoyado
desde el peincipio de estos estudios
A la Dra Marta Capellas Puig que me ha alentado todo el tiempo para terminar de
buena manera
Dedicatorias
Con mucho carintildeo a mi Sentildeor padre Bartolomeacute Hernaacutendez Balbuena (dagger) y a mi Sentildeora
madre Lucia Santiago Santos son un ejemplo en mi vida ya que ellos son fundamentales
en mi formacioacuten como persona
A mis hermanos Flavio Viacutector Manuel Guadalupe Hilda (dagger) porque siempre
estuvieron alliacute alentaacutendome en este trabajo con palabras experiencias etc
A mi prometida y futura esposa Dontildea Rosa Salas Martiacutenez desde que inicmos a estar
juntos siempre estaacute apoyaacutendome en todos los aspectos y en todas las cosas que he
emprendido y que con algunas locuras que se nos pueda ocurrir mas adelante nos
llevaraacute a mejores cosas cada diacutea
A mi hija Gabriela Sarahi Hernaacutendez Flores ella es lo que maacutes aprecio y espero vea
en mi un ejemplo que sirva para alentarla a ser cada diacutea mejor y sacar todas las cosas
que se proponga adelante
A mis compantildeeros y amigos Vannesa Fabio Fontecha Abel Rita Jacira Kathy
Genaro Fabio Poliseli Dora Cecilia Diana Angela Sonia Dolors Marco y Cristina por
las convivencias durante mi estancia en Espantildea que de alliacute solo me llevo grandes
recuerdos
A mis compantildeeros Mirna Patty Letty Tere Adelita Luluacute Betty Marco Arnoldo Joseacute
Luis y Gustavo que compartimos buena cantidad de tiempo gracias por las convivencias
y por los muchos trabajos que hicimos en equipo
CONTENIDO RESUMEN 1
SUMMARY 3
RESUM 5
I INTRODUCCIOacuteN 7
Presentacioacuten del proyecto 9
Justificacioacuten 10
II ANTECEDENTES 13
A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos 15
A1 Problemaacutetica 16
A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea 17
B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria 19
B1 Escherichia 19
B2 Campylobacter 20
B3 Enterobacter 21
B4 Listeria 22
B5 Salmonella 23
B51 Origen 23
B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp 25
B53 Manifestaciones cliacutenicas 27
B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis 28
C Crecimiento microbiano 30
C1 Crecimiento de los microorganismos 30
C11 Disponibilidad del agua 31
C12 Acidez y pH 31
C13 Oxiacutegeno 31
C14 Temperatura 32
D Control del crecimiento microbiano 34
D1 Agentes fiacutesicos 34
D2 Agentes quiacutemicos 35
E Fagos 35
E1 Antecedentes 35
E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos 37
E3 Clasificacioacuten de los fagos 37
E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico 39
E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten 39
F Biofilm 40
G Microscopiacutea electroacutenica 41
H Fagoterapia 42
III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 47
A Objetivo general 49
B Objetivos especiacuteficos 49
C Plan de trabajo 49
IV MATERIALES Y MEacuteTODOS 51
A Toma de muestras 53
B Obtencioacuten de fagos 54
B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55
B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55
B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas 56
B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos 56
B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC) 58
B6 Modelo de infeccioacuten 59
B7 Controles utilizados durante los ensayos 60
B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium 60
C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos 61
D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica 63
D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 64
D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM 65
V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 67
A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras 69
B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis 70
B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S Typhimurium 70
B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium 72
B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis 72
B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis 73
B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten 73
C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli 75
D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM 80
D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 81
D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable 83
VI CONCLUSIONES 89
VII BIBLIOGRAFIacuteA 93
Iacutendice de figuras
Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa 16
Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por Salmonella spp 24
Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella 24
Figura 4 Adsorcioacuten del bacterioacutefago T4 e inyeccioacuten del ADN 39
Figura 5 Diagrama general de trabajo 50
Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten bacterioacutefago-hueacutesped 59
Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten 62
Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por bacterioacutefagos 74
Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria 79
Figura 10 Imagen por TEM del bacterioacutefago MRH6 80
Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 81
Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable 82
Figura 13 Secuencia de imaacutegenes del DEM 84
Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 por el fago MRH6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86
Iacutendice de tablas
Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias 19
Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos 25
Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales 33
Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos 38
Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos 44
Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria 45
Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos 54
Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten 57
Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos 70
Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC 71
Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium 72
Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis 73
Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten 75
Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades 77
Lista de abreviaturas y acroacutenimos
ADN Aacutecido desoxirribonucleico
ARN Aacutecido ribonucleico
ADC Agar doble capa
AS Agar suave
AECID Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el
Desarrollo
ATCC American Type Culture Collection
APPCC Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control
aw Actividad del agua
BGA Agar verde brillante
BHI Infusioacuten cerebro corazoacuten
CCUG Culture Collection University of Goumltenborg
CENAVECE Centro Nacional de Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de
Enfermedades
CETC Coleccioacuten Espantildeola de Cultivos Tipo
CINSP Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica
EDTA Etilendiaminotetraceacutetico
DEM Microscoacutepica de epifluorescencia directa
EE UU Estados Unidos de Norteameacuterica
ETA Enfermedades transmitidas por alimentos
FAO Food and Agriculture Organization (Organizacioacuten de las
Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura)
FaSPyN Facultad de Salud Puacuteblica y Nutricioacuten UANL
FAUANL Facultad de Agronomiacutea UANL Unidad Mariacuten NL
FCB Facultad de Ciencias Bioloacutegicas UANL
HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points (Anaacutelisis de
Peligros y Puntos Criacuteticos de Control)
INEGI Instituto Nacional de Estadiacutestica y Geografiacutea de los Estados
Unidos Mexicanos
nd Aparente baja efectividad o halo difuso
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
PANALIMENTOS Instituto Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y
Zoonosis
PEG Polietilenglicol
SDS Dodecilsulfato soacutedico
SIRVETA Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos
SSF Solucioacuten salina fisioloacutegica
SUH o SHU Siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico
TEM Microscopio electroacutenico de transmisioacuten
TSA Agar soya de tripicasa
TSAYE TSA con 06 de extracto de levadura
TSB Caldo de soja trypticasa
UAB Universitat Autogravenoma de Barcelona
UANL Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
ZMM Zona Metropolitana de Monterrey
RESUMEN
La inocuidad alimentaria es un tema amplio y relevante que impacta directamente en todos
los segmentos de la sociedad involucra productores desarrolladores innovadores
consumidores y gobierno ademaacutes de diversos sectores como la industria la ingenieriacutea y hasta
la educacioacuten Sin embargo las nuevas tecnologiacuteas en la cadena de produccioacuten provocan que
eacutesta sea maacutes larga y compleja
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) causan alta morbilidad y varios casos
de mortalidad Entre los agentes infecciosos maacutes comunes se encuentran Salmonella spp
Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus
Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus
Los bacterioacutefagos o fagos son virus bacterianos especiacuteficos de una ceacutelula hueacutesped en la
cual se multiplican invadiendo su maquinaria de material geneacutetico Son los sistemas bioloacutegicos
maacutes abundantes del planeta se encuentran en el medio ambiente y se introducen y conviven
en la flora intestinal de otros seres cuando eacutestos ingieren diversos alimentos ya sean de tipo
animal o vegetal
El objetivo del presente trabajo fue aislar y probar la especificidad de una serie de fagos de
Salmonella spp a partir de aguas residuales para lo cual se utilizaron muestras de agua
recolectadas de diferentes localidades del aacuterea metropolitana de Monterrey N L Meacutexico La
purificacioacuten de fagos se llevoacute a cabo mediante la teacutecnica de agar doble capa (ADC) hasta
obtener placas liacuteticas uniformes y se usaron diferentes cepas de referencia de Salmonella
como cultivos indicadores
Se aislaron un total de 15 fagos putativamente distintos de los cuales al pasar las pruebas
de replicacioacuten soacutelo uno logroacute mantener la capacidad liacutetica Se seleccionoacute y purificoacute para
realizar pruebas in vitro especiacuteficas para Salmonella Se utilizoacute una concentracioacuten de fagos
de 1x1012 UFPmL para analizar al fago mediante su morfologiacutea por microscopiacutea electroacutenica
la cual se identificoacute como miembro de la familia Siphoviridae Asiacute mismo se probaron los fagos
contra Salmonella in situ en discos de acero que simulan las superficies de trabajo y para
analizar el efecto de la infeccioacuten del fago sobre Salmonella en los discos de acero inoxidable
se utilizoacute el microscopio de epifluorescencia
Para el conteo de fagos se utilizoacute los meacutetodos LIVEDEAD Para finalizar para evaluar la
efectividad del fago MRH6 que resulto liacutetico en nuestro ensayo se procedioacute a dar las
condiciones necesarias para la formacioacuten del biofilm de Salmonella sobre superficies de acero
inoxidable El fago MRH6 fue capaz de disgregar los biofilms a temperatura ambiente Las
mayores reducciones de Salmonella en un menor tiempo se obtuvieron con concentraciones
de fago mayores a 1x108 UFPmL El meacutetodo de cultivo mostroacute reducciones del patoacutegeno a
niveles indetectables sin embargo la tincioacuten vital reveloacute la presencia de ceacutelulas viables
(coloracioacuten verde) que podriacutea representar un riesgo de contaminacioacuten cruzada estas
pudieran tambieacuten presentarse por la presencia de material orgaacutenico Este trabajo con un fago
puede proporcionar una medida adyuvante para controlar la contaminacioacuten de superficies de
acero inoxidable con biofilms de Salmonella La DEM resultoacute ser una buena herramienta para
evaluar raacutepida y adecuadamente por observacioacuten y posterior anaacutelisis el efecto de los fagos
SUMMARY
Food safety is a broad and relevant issue that directly affects all aspects of society involving
producers developers innovators consumers and government as well as various sectors
such as industry engineering and even education However new technologies in the
production chain cause it to be longer and more complex
Foodborne diseases (ETA) cause high morbidity and several cases of mortality Among the
most common infectious agents are Salmonella spp Campylobacter spp Escherichia coli
Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus Clostridium botulinum Listeria
monocytogenes and Staphylococcus aureus
Bacteriophages or phages are bacterial viruses specific to a host cell in which they multiply
by invading their machinery of genetic material They are the most abundant biological systems
on the planet they can be found in the environment In organisms they enter and coexist in
the intestinal flora of other beings when they ingest various foods whether animal or vegetable
The objective of this study was to isolate and test the specificity of a series of phages of
Salmonella spp from wastewater for which water samples were collected from different
locations in the metropolitan area of Monterrey N L Meacutexico The purification of phages was
carried out by means of the double layer agar technique (ADC) until uniform lithic plates were
obtained and different Salmonella reference strains were used as indicator cultures
A total of 15 putatively different phages were isolated of which upon passing the replication
tests only one managed to maintain the lytic capacity It was selected and purified to perform
specific in vitro tests for Salmonella A phage concentration of 1x1012 PFUmL was used to
analyze the phage by means of its electron microscopy morphology which was identified as a
member of the Siphoviridae family Likewise the phages against Salmonella were tested in
situ on steel discs simulating the work surfaces and the epifluorescence microscope was used
to analyze the effect of phage infection on Salmonella on the stainless steel discs
For the phage count the LIVE DEAD Finally in order to evaluate the effectiveness of the
phage MRH6 that was lytic in our trial the necessary conditions for the formation of the
Salmonella biofilm on stainless steel surfaces were established The phage MRH6 was able
to disintegrate the biofilms at room temperature The greatest reductions of Salmonella in a
shorter time were obtained with phage concentrations greater than 1x107 PFUmL The culture
method showed reductions of the pathogen to undetectable levels however vital staining
revealed the presence of viable cells (green coloration) which could represent a risk of cross
contamination these could also be presented by the presence of organic material This work
with a phage can provide an adjuvant measure to control contamination of stainless steel
surfaces with Salmonella biofilms The DEM proved to be a dependable tool to quickly and
adequately evaluate the effect of phages by observation and subsequent analysis
RESUM
La innocuiumltat alimentagraveria eacutes un tema ampli i rellevant que impacta directament en tots els
segments de la societat involucra productors desenvolupadors innovadors consumidors i
govern a meacutes de diversos sectors com la induacutestria lenginyeria i fins a leducacioacute No obstant
aixograve les noves tecnologies en la cadena de produccioacute provoquen que aquesta sigui meacutes llarga
i complexa
Les malalties transmeses per aliments (ETA) causen alta morbiditat i diversos casos de
mortalitat Entre els agents infecciosos meacutes comuns es troben Salmonella spp
Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus
Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus
Els bacteriogravefags o fags soacuten virus bacterians especiacutefics duna cegravelmiddotlula hoste en la qual es
multipliquen envaint la seva maquinagraveria de material genegravetic Soacuten els sistemes biologravegics meacutes
abundants del planeta es troben en el medi ambient i sintrodueixen i conviuen en la flora
intestinal daltres eacutessers quan aquests ingereixen diversos aliments ja siguin de tipus animal
o vegetal
Lobjectiu del present treball va ser aiumlllar i provar lespecificitat duna segraverie de fags de
Salmonella spp a partir daiguumles residuals per a aixograve es van utilitzar mostres daigua recollides
de diferents localitats de lagraverea metropolitana de Monterrey N L Megravexic La purificacioacute de fags
es va dur a terme mitjanccedilant la tegravecnica dagar doble capa (ADC) fins a obtenir plaques liacutetiques
uniformes i es van usar diferents soques de referegravencia de Salmonella com a cultius indicadors
Es van aiumlllar un total de 15 fags possiblement diferents dels quals en passar les proves
de replicacioacute nomeacutes un va aconseguir mantenir la capacitat liacutetica Es va seleccionar i va
purificar per realitzar proves in vitro especiacutefiques per Salmonella Es va utilitzar una
concentracioacute de fags de 1x1012 UFPmL per analitzar fag mitjanccedilant la seva morfologia per
microscogravepia electrogravenica la qual es va identificar com a membre de la famiacutelia Siphoviridae Aixiacute
mateix es van provar els fags contra Salmonella in situ en discos dacer que simulen les
superfiacutecies de treball i per analitzar lefecte de la infeccioacute del fag sobre Salmonella en els
discos dacer inoxidable es va utilitzar el microscopi depifluorescegravencia
Per al recompte de fags es va utilitzar els megravetodes LIVE DEAD Per finalitzar per avaluar
lefectivitat del fag MRH6 que va resultar liacutetic en el nostre assaig es va procedir a donar les
condicions necessagraveria per a la formacioacute del biofilm de Salmonella sobre superfiacutecies dacer
inoxidable El fag MRH6 va ser capaccedil de disgregar els biofilms a temperatura ambient Les
majors reduccions de Salmonella en un menor temps es van obtenir amb concentracions de
fag majors a 1x107 UFP mL El megravetode de cultiu va mostrar reduccions del patogen a nivells
indetectables perograve la tincioacute vital revelar la presegravencia de cegravelmiddotlules viables (coloracioacute verda)
que podria representar un risc de contaminacioacute creuada aquestes poguessin tambeacute
presentar-se per la presegravencia de material orgagravenic Aquest treball amb un fag pot proporcionar
una mesura adjuvant per controlar la contaminacioacute de superfiacutecies dacer inoxidable amb
biofilms de Salmonella La DEM va resultar ser una bona eina per avaluar ragravepida i
adequadament per observacioacute i posterior anagravelisi lefecte dels fags
7
I INTRODUCCIOacuteN
Introduccioacuten
8
Introduccioacuten
9
Presentacioacuten del proyecto
Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica sobre las innovaciones en seguridad alimentaria en
Meacutexico la cual puso en evidencia la necesidad de analizar alternativas enmarcadas en el
aacutembito del uso de las tecnologiacuteas verdes lo que presentoacute la posibilidad de desarrollar un
trabajo innovador y que no se estuviera aplicando ya en el sector alimentario local o nacional
De esa manera se inician las actividades experimentales que para este trabajo doctoral se
dividieron en dos partes la primera realizada en Meacutexico y la segunda en Espantildea
En primera instancia se desarrolloacute un anaacutelisis en el Laboratorio de geneacutetica y biologiacutea
molecular del Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica (CINSP) en el Campus
Ciencias de la Salud de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) y gracias al apoyo
de Programa de mejoramiento del profesorado (PROMEP nuacutemero UANL-326) por medio de
una beca se iniciaron los estudios y asiacute se cumplioacute el primer propoacutesito que fue obtener virus
nativos contra cepas de Salmonella y purificarlos
Posteriormente para lograr los demaacutes objetivos que eran realizar la caracterizacioacuten parcial
de los fagos contra Salmonella se solicitoacute una beca a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten
Internacional para el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y
de Cooperacioacuten curso 2010-2011) con el fin de realizar una estancia de investigacioacuten y crear
oportunidades de desarrollo aprovechando las tecnologiacuteas innovadoras disponibles en la
Universitat Autoacutenoma de Barcelona (UAB) considerando ademaacutes que la alta reputacioacuten de la
institucioacuten y la supervisioacuten por parte de sus investigadores impactariacutean positivamente en el
desarrollo del trabajo y en el Curriculum Vitae del investigador y por consiguiente en su futuro
profesional como docente e investigador
Otra finalidad de este proyecto fue dejar un buen referente al concluir la estancia ya que
ello ofreceriacutea nuevas oportunidades para seguir forjando el perfil del investigador cimentaraacute
cualquier trayectoria profesional y facilitariacutea optar por un plan postdoctoral en esta misma
Universidad De esta manera se accedioacute a la beca del Programa Extranjeros II-A
Convocatoria 2010-2011 Nuacutemero 0000521211 del cual se cumplieron los objetivos
establecidos y otros maacutes por ejemplo conocer nuevas tecnologiacuteas
Siendo eacutesta una liacutenea de investigacioacuten relativamente reciente en Meacutexico se espera que
impacte en las posibilidades laborales en diversos contextos y seacutea de utilidad para sentar
precedentes para futuras liacuteneas de trabajo en dicha aacuterea
Introduccioacuten
10
Justificacioacuten
En las uacuteltimas deacutecadas los cambios ocurridos en la produccioacuten y consumo de alimentos
han tenido un impacto sobre la inocuidad alimentaria La industria en la produccioacuten masiva de
alimentos ha evolucionado de ser local a constituirse en otra donde la produccioacuten yo el
procesamiento estaacuten localizados en diferentes partes del paiacutes o del mundo Por otra parte la
poblacioacuten estaacute envejeciendo por lo que se vuelve maacutes vulnerable a problemas de salud
ademaacutes los agentes patoacutegenos son cada vez maacutes virulentos (DeWaal y Barlow 2014)
Los reportes sobre problemas gastrointestinales que recopila el Centro Nacional de
Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades (CENAVECE) indican que Nuevo
Leoacuten ha permanecido dentro de los primeros 12 lugares de casos de fiebre tifoidea y en los
primeros 14 de fiebre paratifoidea y otras salmonelosis A nivel nacional las enfermedades
infecciosas intestinales se ubican entre las primeras 10 causas de mortalidad de nintildeos en
edad escolar entre los 5 y 14 antildeos de edad (CENAVECE 2007)
Los microorganismos del geacutenero Salmonella pertenecen a la familia Enterobacteriaceae
Son bacilos o cilindros con puntas redondeadas y se diferencian de las demaacutes enterobacterias
mediante reacciones bioquiacutemicas y de aglutinacioacuten existen maacutes de 2500 serotipos todos
ellos patoacutegenos Actualmente se considera una sola especie denominada Salmonella
enterica de la cual seguacuten el esquema de Kauffmann-White se clasifican nueve serogrupos
Esta especie tiene importancia cliacutenica debido a que es la uacutenica capaz de infectar animales
homeotermos esta investigacioacuten se centra en cuatro serovariedades Salmonella enterica
serovar Typhimurium (S Typhimurium) S enterica serovar Paratyphi (S Paratyphi) S
enterica serovar Enteritidis (S Enteritidis) y S enterica serovar Typhi (S Typhi) estos
microorganismos se pueden aislar tanto de fuentes alimentarias (carne de res pollo crudo
huevo fresco carne de puerco almejas chorizos vegetales entre otros) como del medio
ambiente (suelo agua materia fecal y superficies) (Chlebicz y Śliżewska 2018 Nguendo
2018)
En Meacutexico S Enteritidis y S Typhimurium son los microorganismos aislados con mayor
frecuencia en las salmonelosis Normalmente S Enteritidis habita en el intestino de los
animales sin causar enfermedad pero puede infectar a humanos y promover diarrea voacutemito
dolor abdominal calambres y ocasionalmente insuficiencia renal y en los peores casos la
muerte (DeWaal y Barlow 2014) La contaminacioacuten de alimentos por Salmonella spp se debe
Introduccioacuten
11
a una combinacioacuten de factores relacionados con la produccioacuten a gran escala o cambios en el
manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los mismos (Uribe y Suarez 2006)
Por otra parte estaacuten los virus que pueden replicarse independientemente de los
cromosomas de una ceacutelula pero no sin su participacioacuten (Madigan y Martinko 2006) El hecho
de descubrir virus que pueden infectar y destruir bacterias fue recibido con optimismo por su
posible aplicacioacuten en usos terapeacuteuticos (McLaughlin et al 2006)
En un estudio realizado en diversos estados de Meacutexico (Coahuila Durango Estado de
Meacutexico Jalisco Morelos Oaxaca Puebla y Quereacutetaro) se ha fagotipado Salmonella spp
proveniente de huevo carne de pollo de engorde y gallinas progenitoras reproductoras de
postura comercial y productoras (Mancera et al 2004) Ademaacutes diversas investigaciones han
utilizado fagos liacuteticos para reducir la contaminacioacuten por Salmonella en pollos (canal y piel)
semillas germinadas y dulces de frutas cortadas (Goode et al 2003)
El uso de aditivos en los alimentos se ha reducido considerablemente debido al rechazo
generalizado por parte de los consumidores lo que podriacutea repercutir en un incremento en los
casos de intoxicaciones alimentarias En este contexto los fagos aportan ventajas sobre los
desinfectantes conocidos y los meacutetodos tradicionales de aplicacioacuten de friacuteo o calor ya que
pueden actuar como agentes de deteccioacuten y control bioloacutegico de bacterias patoacutegenas en
alimentos y su produccioacuten es relativamente raacutepida y econoacutemica (Atterbury et al 2003)
La utilidad de los fagos en el aacuterea de investigacioacuten es amplia una posible utilidad es ser
un instrumento para identificar cepas bacterianas especiacuteficas Tambieacuten se han utilizado para
el estudio de diversos fenoacutemenos moleculares el trabajo con estos virus permitioacute desarrollar
ensayos de placas de lisis conocer la naturaleza del ciclo de vida viral los tipos de mutaciones
geneacuteticas y los genes como segmentos de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) (Muniesa et al
2005)
Las empresas dedicadas a la biotecnologiacutea (Intralytix Omnilytics) se centran en desarrollar
productos utilizando fagos especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan las ETA y estos
productos comerciales de terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones
(Segundo 2010) Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos antildeos debido a sus
caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutefico sin dantildear la microbiota
en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros distribucioacuten de
Introduccioacuten
12
esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla (Oh y Park
2017)
En este sentido el objetivo general de este estudio es el aislamiento y caracterizarizacion
de fagos contra Salmonella a partir de diversas fuentes para su uso potencial en el control
bioloacutegico
13
II ANTECEDENTES
Antecedentes
14
Antecedentes
15
A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos
A nivel internacional la produccioacuten de alimentos y todos los mecanismos tecnoloacutegicos
involucrados en su procesamiento implican ademaacutes de la optimizacioacuten de los tiempos y de
la calidad un riesgo para la adquisicioacuten de enfermedades inherentes a la misma adopcioacuten
de nuevas tecnologiacuteas (Weaver et al 2017)
La OMS (2017) estima que las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de
muerte de nintildeos menores de cinco antildeos matan a 525000 nintildeos menores de cinco antildeos
cada antildeo una proporcioacuten significativa de las enfermedades diarreicas se puede prevenir
mediante el acceso al agua potable y a servicios adecuados de saneamiento e higiene
ademaacutes de que en todo el mundo se producen unos 1700 millones de casos de
enfermedades diarreicas infantiles cada antildeo
Seguacuten la OMS (2017) existen diferentes condiciones que propician el desarrollo de las
ETA Como son las de tipo bioloacutegico producidos por hongos o bacterias causantes de
enfermedades ya sea por sus metabolitos o toxinas virus o huevecillos de paraacutesitos asiacute
como los venenos de algunos peces y plantas Las de tipo quiacutemico como productos de
limpieza o desinfeccioacuten pesticidas toxinas marinas insecticidas o venenos y fiacutesicos cuando
en la materia prima de los alimentos se encuentran objetos como vidrios metal piedras
grapas barniz de untildeas joyeriacutea cabellos o cualquier elemento extrantildeo
De acuerdo con el Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos (SIRVETA) ndashdesarrollado por el Instituto
Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y Zoonosis (PANALIMENTOS)ndash ocurrieron 1683
brotes de ETA en Meacutexico que ocasionaron 53860 casos de enfermedades y provocaron
207 muertes mientras que en los demaacutes paiacuteses de Ameacuterica Latina se produjeron durante el
mismo periacuteodo 6324 brotes que provocaron 228579 casos y 314 muertes (Forsythe y
Hayes 2002) Cabe aclarar que eacutestos son soacutelo los brotes notificados por la autoridad
competente El sistema utilizado internacionalmente para obtener alimentos inocuos es el
APPCC (Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control) o HACCP (por sus siglas en ingleacutes
Hazard Analysis and Critical Control Points) que se puede implementar en cualquier tipo de
industria y permite prevenir controlar y eliminar cualquier peligro antes de consumir los
alimentos (Rodriacuteguez Torrens et al 2015)
En Meacutexico el Distintivo H es un programa implementado por los servicios alimentarios
Antecedentes
16
oficiales mediante el cual se ofrece a los clientes alimentos seguros El Centro Nacional de
Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades de Meacutexico (CENAVECE) advierte
que uno de los problemas de salud maacutes importantes lo constituyen los trastornos
gastrointestinales cuya mortalidad predomina entre los 5 y los 14 antildeos Entre 2006 y 2012
el Estado de Nuevo Leoacuten ha permanecido entre los primeros 7 lugares de casos de diarrea
(CENAVECE 2018)
La figura 1 muestra la distribucioacuten de la incidencia en Meacutexico la cual estaacute asociada a la
densidad demograacutefica y la accesibilidad a servicios de salud que facilitan el registro es asiacute
que son precisamente las entidades federativas con mayor poblacioacuten quienes registran
nuacutemeros maacutes altos
Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa en
Meacutexico 2010-2012 (CENAVECE 2018)
A1 Problemaacutetica
La inocuidad alimentaria es una preocupacioacuten mundial que se refleja en el incremento
de reportes y noticias relacionadas con la contaminacioacuten de los alimentos difundidos en
diversos paiacuteses a su vez estos productos son retirados del mercado lo que provoca
peacuterdidas por varios cientos de millones de doacutelares El Codex Alimentarius indica que las ETA
y los dantildeos provocados por los alimentos son en el mejor de los casos desagradables y
Antecedentes
17
en el peor fatales y pueden influir negativamente en el comercio y la confianza de los
consumidores Por consiguiente es imprescindible un control eficaz de la higiene Todos los
eslabones de la cadena alimentaria ndashfabricantes elaboradores manipuladores y
consumidores de alimentosndash son responsables del control de los riesgos microbioloacutegicos
desde la explotacioacuten agriacutecola o ganadera hasta el consumidor final Desde esta oacuteptica el
anaacutelisis de riesgos deberiacutea aplicarse dentro de un contexto estrateacutegico organizativo y
operacional reconocido si bien en el proceso puede haber elementos comunes establecer
un nivel apropiado de proteccioacuten en esos sectores puede representar las maacuteximas
diferencias (Atterbury et al 2003)
La OMS ha identificado siete microorganismos patoacutegenos ndashC jejuni C perfringens E
coli 0157H7 L monocytogenes Salmonella spp S aureus y T gondiindash que causan entre
123 y 33 millones de casos de infeccioacuten solamente en los EE UU lo que representa
peacuterdidas econoacutemicas de entre 5500 y 34900 millones de doacutelares Ademaacutes resalta que su
incidencia podriacutea ser de 300 a 350 veces mayor de lo que indican las estadiacutesticas dado que
soacutelo se notifica un nuacutemero relativamente pequentildeo de casos de ETA Se estima que 70 de
los 1500 millones de episodios de diarrea son causados por alimentos en mal estado Es
posible que en los paiacuteses en desarrollo se notifique a las autoridades sanitarias una
proporcioacuten de casos auacuten inferior principalmente por pobreza y escasez de recursos a
disposicioacuten de los servicios de gestioacuten de la inocuidad alimentaria e inspeccioacuten de alimentos
(Van de Venter 2000)
A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea
La OMS estima que el 88 de los casos de diarrea a nivel mundial son atribuibles al
agua el saneamiento y la higiene todos los aspectos de inocuidad de los alimentos estaacuten
relacionados con estos factores En menor medida la enfermedad se transmite a traveacutes de
otras viacuteas por ejemplo el aire y alrededor del 94 de los casos son atribuibles al
saneamiento ambiental el total de fallecimientos se calcula en maacutes de 15 millones
principalmente en nintildeos en los paiacuteses desarrollados el promedio es ligeramente menor a
90 La diarrea atribuible al agua y saneamiento inapropiado representa 53 de las
muertes totales y 35 en nintildeos europeos de 0-14 antildeos y es ademaacutes una de las causas
principales de malnutricioacuten (Pruumlss-Uumlstuumln y Corvalaacuten 2006)
Antecedentes
18
Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud puacuteblica en el mundo
especialmente en paiacuteses en desarrollo Su alta incidencia se debe en gran parte a la
ingestioacuten de alimentos contaminados con microorganismos patoacutegenos como Salmonella
que causa episodios de diarrea aguda Salmonella spp es uno de los patoacutegenos enteacutericos
maacutes frecuentes tanto en paiacuteses desarrollados como subdesarrollados Dependiendo de la
especie tamantildeo del inoacuteculo factores de virulencia expresados por la cepa hueacutesped
involucrado estado inmunoloacutegico del paciente e intervencioacuten meacutedica puede ocasionar una
infeccioacuten gastrointestinal de media a severa hasta una infeccioacuten sistemaacutetica que
comprometa la vida del paciente (Fernaacutendez 2008)
Otros microorganismos que tambieacuten pueden contaminar el agua y los alimentos como
bacterias (Bacillus cereus Clostridium botulinum Campylobacter jejuni Vibrio cholera) virus
(Norwalk Rotavirus Hepatitis A) y paraacutesitos (Entamoeba histolytica Cryptosporidium
parvum Toxoplasma gondii) pueden transmitirse tambieacuten de una persona a otra como
resultado de una higiene deficiente (Freedman et al 2015)
Estudios de empresas dedicadas exclusivamente a la crianza de cerdos reportan
epidemias como el virus de la diarrea porcina la cual posteriormente se transmite a los
consumidores de estas carnes contaminadas ya sea por contacto con las heces o por
consumo de carnes contaminadas lo cual implica tambieacuten una peacuterdida econoacutemica para la
industria alimentaria resaltando la necesidad de establecer medidas preventivas y
correctivas seguacuten sea el caso (Huss et al 2017)
Seguacuten la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO
por sus siglas en ingleacutes Food and Agriculture Organization) las toxiinfecciones alimentarias
son la segunda causa de morbilidad pero muchas permanecen sin declarar quizaacutes por su
mediana severidad y recuperacioacuten raacutepida salvo el coacutelera Los alimentos son susceptibles a
contaminacioacuten de todo tipo la fuente de agentes causales suele ser el tracto gastrointestinal
de individuos reservorios o las heces de animales y humanos infectados o bien agua
corrompida que por deficiencias sanitarias contamina carne fresca pescados moluscos
pasteles de crema y leche no pasteurizada entre otros productos (Riacuteos et al 2012) como
se puede observar en la tabla 1
Antecedentes
19
Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias (Riacuteos et al 2012)
Agente Periacuteodo de
incubacioacuten Fuente Agente patoacutegeno
Salmonella spp 8-24 h Aves huevos mascotas
(tortugas lagartos pollos) Bacteria y endotoxina
E coli
enterotoxigeacutenica 24-72 h
Agua y alimentos
contaminados
Enterotoxina
termoestable
V cholerae 24-72 h Alimentos contaminados Enterotoxina termolaacutebil
Shigella spp 24-72 h Agua y alimentos
contaminados Bacteria y endotoxina
C jejuni 1-7 d Leche aves de corral y
agua no potable
Bacteria y Enterotoxina
termolaacutebil
Yersinia spp 1-7 d Carne de cerdo leche Bacteria y Enterotoxina
B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria
La historia referente a las toxiinfecciones alimentarias se comienza a documentar y
legislar en el siglo X con el botulismo en Bizanzio y documentos sobre el ergotismo en el
siglo XVI En el siglo XIX aparecen los alimentos enlatados y Louis Pasteur asocia el
deterioro de los alimentos con las bacterias En el siglo XX se produce un desarrollo
espectacular de la microbiologiacutea de los alimentos con el establecimiento de la etiologiacutea de
las toxiinfecciones alimentarias el comienzo de una nueva era de la quiacutemica e ingenieriacutea
alimentaria Aunado a los movimientos migratorios de las personas la diversificacioacuten de
alimentos la produccioacuten masiva de alimentos y la facilidad de transporte desde puntos
lejanos entre la produccioacuten y preferencia en el consumo de alimentos aunadas a la
capacidad que tienen los microorganismos para evolucionar y adaptarse a su medio
ambiente hacen pensar en estos microorganismos como patoacutegenos emergentes (DeWaal y
Barlow 2014)
B1 Escherichia
Las cepas de E coli se pueden diferenciar seroloacutegicamente por los antiacutegenos somaacuteticos
(O) flagelares (H) y capsulares (K) Ademaacutes pueden hallarse fimbrias y estructuras
Antecedentes
20
emparentadas que desempentildean un papel en la patogenia Actualmente se reconocen cinco
grupos de E coli causantes de diarrea en funcioacuten del siacutendrome que provocan cuyas
diferencias estaacuten codificadas por plaacutesmidos (Wright et al 2017) Los diferentes tipos son
E coli enteropatoacutegeno (EPEC) es responsable de la diarrea acuosa en lactantes
Produce voacutemitos fiebre y diarrea acuosa con mocos pero sin sangre Coloniza las
microvellosidades de todo el intestino produciendo la lesioacuten de ldquoadhesioacuten y erosioacutenrdquo en
el ribete en cepillo de la membrana de la vellosidad Afecta a adultos y nintildeos menores de
dos antildeos siendo este rango de edad el principal factor de riesgo
E coli enterotoxigeacutenico (ETEC) es el causante de la llamada vulgarmente ldquodiarrea
del viajerordquo se manifiesta con diarrea acuosa como agua de arroz y poca fiebre
Coloniza la porcioacuten proximal del intestino delgado Afecta a adultos y nintildeos son una causa
frecuente de diarrea en lactantes de paiacuteses en desarrollo asiacute como la causa maacutes comuacuten
de diarrea en individuos de paiacuteses industrializados que viajan a zonas menos
desarrolladas del mundo
E coli enteroinvasor (EIEC) coloniza el colon origina fiebre y diarrea profusa con
heces que contienen mocos y estriacuteas sanguinolentas Presenta un plaacutesmido de 120-140
mD conocido como plaacutesmido invasivo que lleva todos los genes necesarios para la
virulencia Al igual que ETEC pero afecta principalmente a adultos
E coli enterohemorraacutegico (EHEC) origina diarrea sanguinolenta colitis hemorraacutegica
siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico (SUH o SHU) y puacuterpura trombocitopeacutenica En este grupo se
incluye E coli verotoxigeacutenico (VTEC) serotipos O157 O26 O111 Afecta principalmente
a nintildeos el principal factor de riesgo es el consumo de carne sin la coccioacuten adecuada
E coli enteroagregativo (EAggEC) posee caraacutecter clonal diferenciaacutendose dos clones
relacionados (1 y 2) Dentro de cada grupo estaacute presente una variedad concreta de
antiacutegenos O mientras que los antiacutegenos H se conservan
En los reportes cientiacuteficos sobre E coli se refieren a las plantas como otra fuente de
infeccioacuten especiacuteficamente en la espinaca (Spinacia oleracea) y lechuga (Lactuca sativa) Se
recomienda igualmente estudiar profundamente los cultivos y los tejidos vegetables y
animales ya que se deben considerar como paraacutemetros de riesgo para la inocuidad de los
alimentos (Fernaacutendez Ferran et al 2003 Wright et al 2017)
B2 Campylobacter
Campylobacter spp es un bacilo delgado gram negativo (05-08 microm x 02-05 microm) y
Antecedentes
21
microaeroacutefilo (necesita 3-5 de O2 y 2-10 de CO2) Su morfologiacutea puede variar entre
vibrioacutenica (bacilos curvados) espirilar en forma de rosquilla de S y cocoide de tal forma
que en fase logariacutetmica de crecimiento las ceacutelulas tienen forma espiral o curvada pero a
medida que los cultivos envejecen adquieren formas esfeacutericas Moacutevil con un uacutenico flagelo
polar que presenta de dos a tres veces el largo de la ceacutelula Aunque hay diversas especies
de Campylobacter causantes de enfermedades C jejuni C coli y C lari son las especies
que se aiacuteslan con mayor frecuencia en casos de gastroenteritis humana siendo C jejuni la
responsable de la mayoriacutea de las toxiinfecciones alimentarias 89-93 de las
toxiintoxicaciones (OMS 2017)
Las especies C coli y C lari son semejantes a C jejuni su diferencia se basa en pruebas
bioquiacutemicas C coli no es capaz de hidrolizar el piruvato y C lari es capaz de crecer en
presencia de 30 microgramos de aacutecido nalidiacutexico (Haddad et al 2013) La movilidad la
quimiotaxis y los flagelos son factores importantes en la virulencia pues de ellos depende la
colonizacioacuten del epitelio intestinal Campylobacter produce una enterotoxina parecida a la
toxina coleacuterica que tambieacuten juega un papel importante en la patogenia (Nichols 2005) C
jejuni puede sobrevivir de 2 a 4 semanas en condiciones de baja humedad oxigenacioacuten y
temperaturas de 4ordmC superando muchas veces el tiempo de vida uacutetil del producto Asimismo
puede perdurar de 2 a 5 meses a -20ordmC pero a temperatura ambiente apenas dura algunos
diacuteas (Khan et al 2013)
C jejuni y C coli son sensibles a diversos agentes antimicrobianos como los macroacutelidos
los aminoglucoacutesidos el cloranfenicol y la tetraciclina La eritromicina ha sido el antibioacutetico de
eleccioacuten para tratar las infecciones del tracto intestinal Al igual que en Salmonella el control
de Campylobacter se debe realizar tanto en el sector agropecuario como en los
establecimientos alimentarios por lo que los controles especificados para Salmonella
podriacutean extrapolarse a este microorganismo Un aspecto importante de su control reside en
la refrigeracioacuten de las aves ya que la baja temperatura junto con la desecacioacuten superficial
que se produce reduce significativamente la incidencia y los recuentos de Campylobacter
viables incluso en canales altamente contaminadas (Fernaacutendez 2008)
B3 Enterobacter
Conocido antiguamente como Cronobacter spp incluye varias especies de patoacutegenos
emergentes relacionados con brotes de meningitis septicemia y enterocolitis necrotizante
especialmente en neonatos y nintildeos La tasa de mortalidad de estos brotes es alta entre 20
Antecedentes
22
y 80 y los supervivientes suelen sufrir severos desoacuterdenes neuroloacutegicos (Grimont y
Grimont 2006)
E sakazakii es un bacilo moacutevil no esporulado gram negativo que ha sido encontrado en
alimento para bebeacutes es maacutes resistente a los cambios osmoacuteticos y a la sequiacutea que otros
miembros de la familia Enterobacteriaceae y se asocia con casos esporaacutedicos de sepsis
meningitis cerebritis y enterocolitis necrotizante La mayoriacutea de las infecciones se observan
en bebeacutes con bajo peso al nacer y que son alimentados de forma insalubre La mortalidad
ha disminuido a menos de 20 en los uacuteltimos antildeos Este microorganismo no se ha
encontrado presente en la foacutermula laacutectea tampoco existe evidencia de la transmisioacuten de
persona a persona o un medio general de difusioacuten ambiental (Vanegas et al 2009)
B4 Listeria
L monocytogenes estaacute muy difundida en la naturaleza en la que suele adoptar un ciclo
saprofiacutetico en estrecha relacioacuten con el suelo Ademaacutes se ha encontrado en aguas
continentales sedimentos marinos material vegetal en descomposicioacuten forrajes heces
humanas y animales y aguas residuales de explotaciones animales entre otros ambientes
lo que explica su presencia en alimentos crudos Epidemioloacutegicamente se caracteriza por su
ubicuidad sobreviviendo en tierra huacutemeda hasta 500 diacuteas en funcioacuten de la temperatura En
heces o aguas residuales mantenidas a temperatura de refrigeracioacuten sobrevive maacutes de seis
antildeos este periodo se reduce si se mantiene a temperatura ambiente (Guenther et al 2009)
Listeria spp son bacilos gram positivos de forma regular y con forma de vara corta
Algunas veces pueden tener forma cocoide apareciendo como ceacutelulas individuales o en
cadenas cortas Son moacuteviles entre 20-25ordmC pero no a 37ordmC Existen seis especies de Listeria
descritas L monocytogenes L innocua L welshimeri L seeligeri L grayi y L ivanovii
subespecie ivanovii y subespecie londoniensis Las cepas patoacutegenas de L monocytogenes
producen la listeriolisina O responsable de la hemoacutelisis-β y de la destruccioacuten de las ceacutelulas
fagocitarias es una hemolisina que segrega la bacteria a causa de la disminucioacuten de pH
(Liu 2006)
L monocytogenes tolera y se multiplica en concentraciones altas de NaCl contando con
la posibilidad de sobrevivir durante un antildeo en ambientes con una concentracioacuten de 16 su
tolerancia aumenta al disminuir el pH o la temperatura del medio Los tratamientos para su
inactivacioacuten son de 617ordmC35min 70ordmC20min 78ordmC15min u 80ordmC5min favoreciendo su
Antecedentes
23
resistencia al calor con la presencia de grasas Se multiplica entre 0 y 4ordmC las temperaturas
bajas ejercen un efecto protector de tal manera que en condiciones de acidez su inactivacioacuten
es maacutes lenta en refrigeracioacuten que a temperatura ambiente (Leverentz et al 2003) La acidez
influye en la capacidad de Listeria para sobrevivir a la congelacioacuten (temperaturas inferiores
a -47ordmC) y almacenamiento a menos de -18ordmC en carne mostrando una disminucioacuten en la
recuperacioacuten de ceacutelulas viables que han sido dantildeadas por el friacuteo (Wu et al 2015)
B5 Salmonella
B51 Origen
Salmonella tiene su origen principal en el tracto intestinal de animales fundamentalmente
las aves y los porcinos y pueden acabar contaminando las carnes crudas el pollo crudo los
productos marinos crudos o el huevo Los brotes de Salmonella estaacuten asociados al consumo
de alimentos elaborados con huevo crudo y siguen siendo frecuentes a pesar de conocerse
el riesgo que representa su consumo de las medidas legales adoptadas y de los programas
de educacioacuten sanitaria dirigidos a disminuir su incidencia Este geacutenero pertenece a la familia
Enterobacteriaceae fue descrito a principios del siglo XX por el bacterioacutelogo estadounidense
Theobald Smith (Zaidi et al 2006) En la figura 2 se muestran los factores de virulencia y
en la figura 3 se presenta la clasificacioacuten de Salmonella enterica con las diferentes
subespecies y serovares que se aiacuteslan maacutes frecuentemente
Antecedentes
24
Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por
Salmonella spp (Brenner et al 2000)
Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella (Brenner et al 2000)
Antecedentes
25
B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp
La mayoriacutea de los miembros de este geacutenero se encuentra en el tracto intestinal del
hombre y los animales como bacterias patoacutegenas o comensales Estaacute integrado por bacilos
gram negativos anaerobios facultativos y no esporulados La mayor parte de los serotipos
conocidos son moacuteviles mediante flagelos peritricos Se conocen maacutes de 2460 serotipos
muchos de ellos patoacutegenos para el ser humano (Chlebicz y Śliżewska 2018)
Son bacterias invasoras enterotoxigeacutenicas y estaacuten ampliamente diseminadas en todo el
mundo su temperatura ideal de sobrevivencia entre los 15 y los 35degC (mesoacutefilas) y en una
amplitud de pH de 45 a 9 Los microorganismos de este geacutenero se distribuyen en seis
grupos se han definido mediante biotipado hibridacioacuten DNA-DNA anaacutelisis de la secuencia
del RNA ribosomal 16S y por ldquomultilocus enzyme electrophoresisrdquo (MLEE) (Brenner et al
2000) La serotipificacioacuten se utiliza para diferenciar maacutes allaacute del nivel de subespecie como
puede observarse en la tabla 2
Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos (Brenner et al 2000)
Grupo Microorganismo
A S Paratyphi Al
B S Typhimurium S Bredeney
C1 S Choleraesuis S Montevideo S Oranienburg
C2 S Newport
D S Typhi S Enteritidis S Dublin S Gallinarum
E S Butantan S Anatum S Give
Salmonella serotipo Typhi es la causante de la fiebre tifoidea presentando siacutentomas como
son fiebre de intensidad variable cefalea diarrea estrentildeimiento tos naacuteuseas y voacutemitos
anorexia dolor abdominal y escalofriacuteos Mientras que los demaacutes serotipos considerados no
tifoidicos presentan un estado asintomaacutetico En el antildeo 2000 los serotipos aislados con
mayor frecuencia en EE UU fueron S Typhimurium S Enteritidis y S Newport (Dunkley et
Antecedentes
26
al 2009) En Meacutexico los serotipos de Salmonella spp identificados con mayor frecuencia
en los servicios de salud fueron S Typhimurium (204) y S Enteritidis (183) (Guenther
et al 2009)
La salmonelosis se produce por la ingestioacuten de alimentos o bebidas contaminados por
Salmonella se manifiesta como una enterocolitis aguda y se caracteriza por presentar
siacutendromes febriles asociados a manifestaciones gastrointestinales o sisteacutemicas con
frecuencia severas (Figueroa y Verdugo 2005 Fernaacutendez 2008) El cuadro cliacutenico se
localiza baacutesicamente en el iacuteleo terminal y el intestino grueso La enfermedad se manifiesta
a traveacutes de diferentes fases En la primera fase la infeccioacuten se limita a la mucosa intestinal
en la siguiente la bacteria invade el tejido linfaacutetico local y le sigue una fase de bacteriemia
durante la cual la mayoriacutea de las bacterias son fagocitadas por macroacutefagos del hiacutegado y el
bazo (Calva et al 2006 Bettini et al 2012)
Con frecuencia el meacutedico hace un diagnoacutestico basaacutendose en el cuadro cliacutenico del
paciente pero sin contar con los estudios microbioloacutegicos necesarios para establecer un
diagnoacutestico certero cuando se presenta infeccioacuten por Salmonella inicia una fase de
crecimiento bacteriano intracelular el cual despueacutes de varios diacuteas provoca la liberacioacuten de
gran cantidad de patoacutegenos al torrente sanguiacuteneo (Zaidi et al 2006)
La salmonelosis es una enfermedad aguda de distribucioacuten mundial Afecta a todos los
grupos de edad con mayor incidencia en los extremos de la vida provocando infecciones
en forma endeacutemica o en brotes epideacutemicos de intoxicacioacuten alimentaria que en ocasiones
abarcan amplias zonas geograacuteficas debido a las extensas cadenas de distribucioacuten de
alimentos existentes hoy en diacutea (Fernaacutendez 2008)
Para la salud puacuteblica la salmonelosis tiene un impacto socioeconoacutemico tanto en los paiacuteses
en desarrollo como en los paiacuteses desarrollados Ademaacutes al no recibir tratamiento puede
ser causante del siacutendrome de Reiter el cual se manifiesta por dolor en articulaciones
irritacioacuten en los ojos dolor al orinar y puede durar meses o antildeos desencadenaacutendose una
artritis croacutenica (CFSPH 2005) Desde la deacutecada de los ochenta la incidencia de
salmonelosis de origen alimentario ha aumentado considerablemente en Meacutexico Este
incremento es resultado de una combinacioacuten de factores como la calidad del agua utilizada
para riego y el manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los alimentos (Zaidi
et al 2006)
Antecedentes
27
Un meta-anaacutelisis (revisioacuten sistemaacutetica en la cual se combinan matemaacuteticamente los
resultados de varios estudios para contestar una misma pregunta) realizado recientemente
confirma que Salmonella resiste a antibioacuteticos empleados en los alimentos de origen animal
ya que pueden estar contaminados con este microorganismo es resistente a 3 antibioacuteticos
como la amoxicilina las sulfonamidas y las tetraciclinas ya que son ampliamente usados en
produccioacuten animal (Ejo et al 2016)
B53 Manifestaciones cliacutenicas
El cuadro cliacutenico normalmente es de 2 a 5 diacuteas aunque en ocasiones persiste varias
semanas La gravedad de los siacutentomas variacutea considerablemente siendo mayor en nintildeos y
ancianos Si el microorganismo pasa desde el intestino a la corriente sanguiacutenea y llega a
otras partes del cuerpo puede ocasionar la muerte si la persona afectada no es tratada
raacutepidamente La mayoriacutea de las muertes causadas por esta bacteria han ocurrido entre
ancianos que viven en residencias La tasa de mortalidad es baja inferior a 1 en paiacuteses
desarrollados pero suelen producirse de 40-50 muertes al antildeo especialmente entre nintildeos
ancianos o personas inmunodeprimidas Las excretas de los enfermos contienen gran
cantidad de la especie de Salmonella implicada al comienzo de la enfermedad la cifra inicial
decrece seguacuten transcurre el tiempo (DeWaal y Barlow 2014)
El estado de portador se refiere a la condicioacuten en que las personas curadas pueden
eliminar Salmonella en sus heces durante meses La mitad de los individuos afectados
excretan este patoacutegeno de 2-4 semanas posteriores a su curacioacuten cliacutenica entre 10 y 20
continuacutean durante 4-8 semanas unos pocos durante 3 meses y en raras ocasiones se
prolonga hasta 6 meses El microorganismo puede eliminarse tambieacuten por la orina La dosis
infectante capaz de desencadenar la salmonelosis humana es alrededor de 1times105 UFCmL
dependiendo de factores como tipo de alimento virulencia de la cepa involucrada y
susceptibilidad del individuo Entre las especies altamente virales se encuentran la S Dublin
y sobre todo S Enteritidis (Callaway et al 2008)
El incremento del serotipo de S Enteritidis en los casos de salmonelosis humana al
contrario de otras del geacutenero Salmonella representa un importante problema de salud
puacuteblica en muchos paiacuteses ya que este serotipo infecta a gallinas aparentemente sanas que
posteriormente transmiten las enfermedades al hombre Si se consumen huevos crudos o
Antecedentes
28
poco cocidos el microorganismo podriacutea causar la enfermedad El nuacutemero de casos de
salmonelosis se incrementa durante el verano (Parra et al 2002 Callaway et al 2008
Fernaacutendez 2008)
B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis
Gran parte de las salmonelosis se deben al consumo de alimentos de origen animal
(carnes de abasto pollo mariscos pescado leche y huevos asiacute como ovoproductos y
productos laacutecteos no pasteurizados) o de origen vegetal que se contaminan con productos
en malas condiciones de salubridad o mal manipulados Muchos alimentos sobre todo los
de origen animal o contaminados con aguas residuales han servido como vehiacuteculos en
brotes de salmonelosis La carne de matadero estaacute contaminada habitualmente con
Salmonella su incidencia es mayor en las canales de ganado y otros animales debido por
ejemplo a la contaminacioacuten por el contenido intestinal de la res viva cuyas heces manchan
su piel pelo y patas al llegar al matadero Las canales de cerdo se contaminan durante las
operaciones de escaldado y pelado La contaminacioacuten entre las mismas canales y de eacutestas
a utensilios superficies de trabajo y manos de los que las manipulan es faacutecil Otro de los
principales reservorios de Salmonella es la carne de aves de corral La contaminacioacuten de las
canales de pollo y otras aves procede igualmente del tracto intestinal o del material fecal
de los animales que manchan sus patas y plumas Las etapas criacuteticas de la contaminacioacuten
de las canales aviares estaacuten en el desplumado y la evisceracioacuten tambieacuten es comuacuten la
contaminacioacuten cruzada a traveacutes de las manos de los operarios equipo y utensilios utilizados
en la preparacioacuten y troceado de las canales (Marcus et al 2004)
Son raras las salmonelosis adquiridas directamente de carnes bien cocinadas la mayoriacutea
de los brotes se deben a una coccioacuten insuficiente o por contaminacioacuten posterior a su
preparacioacuten Las carnes elaboradas mediante fermentacioacuten (salami chorizo y salchichoacuten)
pueden ser causa de brotes de salmonelosis teniendo en cuenta que las especies que
integran este geacutenero pueden sobrevivir al proceso de fermentacioacuten (Forsythe y Hayes
2002)
Como se mencionoacute anteriormente otro alimento que se asocia con frecuencia a
Salmonella es el huevo La contaminacioacuten se produce por dos viacuteas a traveacutes de la caacutescara
contaminada y por viacutea transovaacuterica en aves infectadas (gallina pata pava) En el primer
caso la superficie de la caacutescara se contamina siempre a su paso por la cloaca o cuando el
Antecedentes
29
huevo estaacute en un ambiente fecal los huevos rotos o manchados constituyen un peligro en
la propagacioacuten de especies de Salmonella (EFSA 2014)
La contaminacioacuten partiendo de la caacutescara se produce si eacutesta mantiene un grado de
humedad apropiado y existe una temperatura diferencial significativa entre el contenido del
huevo y el ambiente La diferencia de temperaturas entre el huevo maacutes elevada y el
ambiente favorece la absorcioacuten de los microorganismos como Salmonella Tambieacuten se
transmite sobre la caacutescara por contaminacioacuten cruzada a traveacutes de los manipuladores que
han tenido contacto con superficies infectadas durante el transporte y almacenamiento de
los mismos en lugares con precarias condiciones de higiene (Ejo et al 2016) Salmonella
es causal de graves enfermedades que son trasmitidas por productos derivados de huevo
contaminado y la asociacioacuten entre la infeccioacuten del tracto reproductivo de los pollos fue un
fuerte incentivo para desarrollar programas de prevencioacuten (Jawale y Lee 2014)
La leche cruda puede albergar Salmonella y ser causa de brotes de salmonelosis se
contamina a traveacutes del pezoacuten y por las manos del ordentildeador la pasteurizacioacuten elimina la
presencia de la bacteria Entre los productos laacutecteos se han identificado como causa de
brotes de salmonelosis la leche en polvo el queso los helados y maacutes raramente la
mantequilla todos ellos por fallos en su elaboracioacuten Salmonella se destruye o inactiva
durante la fermentacioacuten de alta acidez como el yogur y el queso de pH inferior a 45 En el
caso del queso poco aacutecido (pH superior a 49) la Salmonella puede desarrollarse en
cualquier etapa de su elaboracioacuten (Mastroeni y Maskell 2006)
Entre las verduras cualquiera puede contener Salmonella cuando se cultivan con aguas
residuales contaminadas o son fertilizadas con abonos de origen animal Algunos vegetales
como los berros han sido causa de brotes de salmonelosis Por otro lado los mariscos se
contaminan con Salmonella cuando se criacutean en aguas residuales contaminadas por lo que
han sido la causa de numerosos brotes en todo el mundo la depuracioacuten es la medida
preventiva adecuada Diferentes alimentos se han identificado como portadores de
Salmonella entre ellos coco cebada harina de cereales pimienta blanca y negra pasta
cacao en polvo y chocolate (Fernaacutendez 2008) La FDA (2017) reportoacute el aumento de las
pruebas de las cuales ha identificado papayas de dos granjas que resultaron positivas para
las cepas de Salmonella que coinciden con enfermedades no relacionadas con este brote
Antecedentes
30
C Crecimiento microbiano
El crecimiento microbiano puede definirse como un incremento en los constituyentes
celulares que ocasiona un aumento del nuacutemero de ceacutelulas de los microorganismos que se
multiplican por gemacioacuten y fisioacuten binaria En el uacuteltimo caso las ceacutelulas individuales se
agrandan y dividen para originar dos ceacutelulas hijas de un tamantildeo aproximadamente igual
(Atlas y Bartha 2002)
C1 Crecimiento de los microorganismos
Todos los mamiacuteferos incluyendo los seres humanos se adaptan a la vida del mundo
microbiano Louis Pasteur Robert Koch Eacutelie Metchnikoff y Theodor Escherich entre otros
investigadores sentaron las bases conceptuales sobre las interacciones microbio-hueacutesped
Pasteur postuloacute que los microbios eran necesarios para la vida humana y Metchnikoff afirmoacute
que la composicioacuten de la flora microbiana era esencial para el bienestar del hueacutesped
Igualmente Escherich estaba convencido de que el conocimiento preciso de la flora
endoacutegena era esencial no soacutelo para la comprensioacuten de la fisiologiacutea de la digestioacuten sino para
la comprensioacuten de la patologiacutea y terapia de enfermedades microbianas intestinales A pesar
de estas primeras ideas soacutelo recientemente los cientiacuteficos han desarrollado meacutetodos que
permiten caracterizar directamente los mecanismos moleculares que subyacen a la creacioacuten
y mantenimiento de diversos ecosistemas microbianos (Falk et al1998)
El crecimiento de una poblacioacuten bacteriana resulta de la suma de ciclos celulares de todos
sus individuos y suele ser asincroacutenico puesto que cada microorganismo se encuentra en un
punto diferente del ciclo celular Por consiguiente en un momento determinado en una
poblacioacuten se encuentran ceacutelulas que acaban de dividirse otras estaacuten replicando su ADN y
elongaacutendose y otras estaacuten iniciando la divisioacuten celular (Melbinger et al 2015)
El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza en la mayoriacutea de los
casos mediante la produccioacuten de colonias aisladas en cultivos soacutelidos El crecimiento
explosivo de las bacterias produce un gran nuacutemero a partir de una uacutenica ceacutelula inicial de
forma que tras un periacuteodo de tiempo de incubacioacuten en las condiciones ambientales
adecuadas se produce una colonia de individuos iguales Para que un microorganismo
crezca necesita nutrientes que le aporten energiacutea y elementos quiacutemicos para la siacutentesis de
sus constituyentes celulares De acuerdo a la fuente de carbono que utilizan los
Antecedentes
31
microorganismos se clasifican en autoacutetrofos si es el CO2 atmosfeacuterico (microorganismos que
fotosintetizan) y heteroacutetrofos si utilizan carbono orgaacutenico (Ouyang y Li 2013)
C11 Disponibilidad del agua
El agua es un factor importante para el crecimiento microbiano se requiere para crecer y
llevar a cabo las funciones metaboacutelicas de lo contrario los microorganismos se deshidratan
o mueren La aw depende de la concentracioacuten de solutos y de la cantidad de agua disponible
en el medio ambiente La mayoriacutea de las bacterias y hongos necesitan valores entre 098 y
0995 de aw para su pleno desarrollo (Madigan y Martinko 2006)
Una membrana plasmaacutetica permanentemente selectiva separa el contenido
citoplasmaacutetico del microorganismo de su ambiente por ello las alteraciones en la
concentracioacuten osmoacutetica del medio extracelular pueden afectar incluso la viabilidad de los
mismos Si se coloca un microorganismo en una solucioacuten isotoacutenica el agua entraraacute en la
ceacutelula y causaraacute su estallido salvo que la propia ceacutelula desarrolle alguna estrategia para
evitarlo por ejemplo reducir la concentracioacuten osmoacutetica del citoplasma gracias a los cuerpos
de inclusioacuten Los procariotas tambieacuten pueden contener canales sensibles a la presioacuten
osmoacutetica que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno
se vuelve maacutes baja que la del citoplasma (Madigan y Martinko 2006)
C12 Acidez y pH
El pH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad entre 5 y 8 para impedir la
destruccioacuten de las macromoleacuteculas haacutebiles en condiciones aacutecidas o alcalinas Los aacutecidos
fuertes (inorgaacutenicos) y los aacutecidos deacutebiles (orgaacutenicos) disminuyen el pH externo
posteriormente se disocian en el interior de la ceacutelula inhibiendo la actividad enzimaacutetica y el
transporte de nutrientes por lo tanto los microorganismos no pueden generar energiacutea de
almacenamiento y ocurre la muerte celular (Brooks et al1992)
C13 Oxiacutegeno
El oxiacutegeno molecular (O2) influye en el metabolismo de los microorganismos Durante el
Antecedentes
32
proceso de reduccioacuten del O2 se crean formas reactivas como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2)
superoacutexidos (O2-) y radicales hidroxilos (OH-) que producen dantildeo celular por la oxidacioacuten
de compuestos orgaacutenicos e incluso macromoleacuteculas (Prescott et al1999)
C14 Temperatura
La temperatura afecta el desarrollo y la supervivencia de los microorganismos En bajas
temperaturas la velocidad de crecimiento de algunos microorganismos disminuye y los
periacuteodos de latencia se alargan Por otro lado las temperaturas elevadas aceleran las
reacciones enzimaacuteticas (antes de los 40degC) pero si se intensifica el calor en algunos casos
provocan la desnaturalizacioacuten de las proteiacutenas y por consiguiente la lisis celular (Brooks et
al1992)
Es importante considerar que cada microorganismo tiene una temperatura de desarrollo
adecuada a mayor temperatura se produce un incremento lineal de la velocidad de
crecimiento hasta alcanzar el clima perfecto a velocidad maacutexima Por encima de esta
temperatura oacuteptima la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte
celular (Atlas y Bartha 2002) En la tabla 3 se presentan algunas condiciones ambientales
para el desarrollo de los microorganismos
Antecedentes
33
Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales (Lu et al 2006 Madigan et al 2006 Falk et al 2009)
Factor Tipo de
microorganismo Caracteriacutesticas Microorganismo representativo
NaCI
Osmotolerante Capaz de crecer en un amplio rango de aw o
presioacuten osmoacutetica St aureus Saccharomyces rouxii
Haloacutefilo Requiere altas concentraciones de NaCl para
crecer normalmente por encima de 02 M Halobacterium Dunaliella Ectohiorhodospira
pH
Acidoacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 0 y 55 Sulfolobus Picrophilus Ferroplasma Acontium
Cyanidium caldarium
Neutroacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 55 y 80 Euglena Paramecium
Alcaloacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 85 y 1 15 Badilas alcalophilus NaIronobaciacuteerium
Temperatu
ra
Psicroacutefilo Crece bien a 0degC temperatura oacuteptima de 15degC
o inferior Badilas psychrophilus Chlamydomonas nivalis
Psicroacutetrofo Puede crecer a 0-7degC oacuteptima de 20 a 30degC Listeria monocytogenes
Mesoacutefilo Temperatura maacutexima de 35degC
Temperatura oacuteptima alrededor de 20-45degC
P fluorescens E coli Neisseria gonorrhoeae
Trichomonas vaginalis
Termoacutefilo Puede crecer a 55degC o superior temperatura
oacuteptima a menudo entre 55 y 65degC
Geobacillus stearothermophilus Thermus
aquaticus Cyanidium caldarium
Hipertermoacutefilo Temperatura oacuteptima entre 80 y 113degC Chaetomium thermophile Sulfolobus
Atmoacutesfera
Aerobio obligado Completamente dependiente del O2 para
crecer Pseudomonas Mycobacterium tuberculosis
Anaerobio
facultativo
No requiere O2 pero crece mejor en su
presencia
M luteus St aureus
Streptococcus pneumoniae L monocytogenes
Anaerobio
aerotolerante Crece bien en presencia o en ausencia de O2 Lactobacillus
Anaerobio
obligado No tolera el O2 y muere en su presencia Clostridium botulinum C perfringens
Microaeroacutefilo
Requiere nivel de O2 inferior a 2-10 para
crecer y es dantildeado por el O2 (20) C fetus
Antecedentes
34
D Control del crecimiento microbiano
Los microorganismos toleran determinados factores ambientales Asiacute unas bacterias
pueden tener condiciones para su desarrollo y estas condiciones pueden ser nocivas para una
especie bacteriana El crecimiento de una poblacioacuten microbiana se estudia analizando la curva
de crecimiento de un cultivo La curva del crecimiento microbiano representa la evolucioacuten del
nuacutemero de nuacutemero de ceacutelulas viables presente en un cultivo microbiano liacutequido a lo largo del
tiempo de estudio Se estudia el nuacutemero de ceacutelulas viables por mililitro de un cultivo de
volumen limitado y con una cantidad de nutrientes limitada como por ejemplo un medio de
cultivo liacutequido en un matraz que ha sido inoculado con una cantidad inicial de microorganismos
o inoacuteculo (Hunter-Cevera y Belt 1996) Para llevar a cabo estos estudios se distingue tres
niveles entre los modelos de microbiologiacutea predictiva los que describen los cambios en el
nuacutemero de microorganismos con respecto al tiempo con respecto al efecto de las condiciones
ambientales y los que combinan los dos aspectos anteriores (Larcher y Cattaneo 2006)
Se considera el crecimiento de las bacterias en funcioacuten de su fondo geneacutetico en relacioacuten
con los nutrientes y en unas hipoteacuteticas condiciones ideales (oacuteptimas) Sin embargo el trabajo
experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales es decir
una serie de agentes fiacutesicos y quiacutemicos El anaacutelisis de la curva de crecimiento bacteriano es
muy importante para determinar el potencial de una teacutecnica de control especiacutefica Al igual que
las bacterias los fagos al forman una interaccioacuten con su bacteria hueacutesped se necesita
determinar una cuantificacioacuten del nuacutemero de copias que se generan por la infeccioacuten a esta
condicioacuten se le conoce como fase de eclipse siendo el momento idoacuteneo para realizar la
infeccioacuten fago-bacteria (Lee et al 2016)
D1 Agentes fiacutesicos
La temperatura es uno de los paraacutemetros ambientales maacutes importantes que condicionan el
crecimiento y la supervivencia de los microorganismos La temperatura afecta a la velocidad
de crecimiento y por lo tanto al tiempo de generacioacuten Cada bacteria es diferente y esto se
puede observar en una curva de tasa de crecimiento en funcioacuten de la temperatura Si se suele
utilizar calor en combinacioacuten con otros agentes fiacutesicos (filtracioacuten presioacuten y radiacioacuten) Al
aplicar temperaturas altas se refleja desnaturalizacioacuten e inactivacioacuten de proteiacutenas enzimaacuteticas
esenciales colapsamiento de la membrana citoplaacutesmica y a veces lisis teacutermica de la bacteria
Antecedentes
35
esta condicioacuten se presenta raacutepidamente cuando se aplica presioacuten la cual se utiliza para
esterilizar objetos como lo demuestra el uso universal de la autoclave en todos los
laboratorios de microbiologiacutea (Madigan y Martinko 2006) El calor es auacuten uno de los meacutetodos
maacutes comunes para destruir microorganismos se puede aplicar huacutemedo o seco (Salgado-Nava
y Jimeacutenez-Munguiacutea 2012) Por otro lado ademaacutes de aplicar calor si a las bacterias se le
extrae el calor del medio de manera intensa recurrir a la congelacioacuten con fines de conservacioacuten
de microorganismos por largos periacuteodos si se realiza apropiadamente numerosos
laboratorios disponen de congeladores a -30 o -70degC para la conservacioacuten de colecciones de
cultivos microbianos (Shafiei et al 2014)
D2 Agentes quiacutemicos
Aunque los objetos se desinfectan a veces con agentes fiacutesicos tambieacuten las sustancias
quiacutemicas se utilizan con mucha frecuencia por ejemplo los quimioteraacutepicos son sustancias
con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostaacutetica) En estas sustancias se busca
que sea efectivo contra un amplio espectro de microorganismos Pero no existe (hasta estos
momentos) un solo agente capaz de inhibir a todos los microorganismos Por otro lado existen
quimioteraacutepicos de espectro estrecho pero muy selectivos contra ciertas bacterias que son
patoacutegenas importantes Muchos factores influyen en la eficacia de los desinfectantes hay que
considerar la cepa de microorganismos presentes la concentracioacuten y naturaleza del
desinfectante y la duracioacuten del tratamiento Asimismo es imprescindible que las superficies
sucias se limpien antes de aplicar un desinfectante El uso apropiado de los agentes quiacutemicos
es esencial para la seguridad en los laboratorios y hospitales estos mismos productos se
utilizan tambieacuten para evitar el crecimiento microbiano en los alimentos (Prescott et al 1999)
E Fagos
E1 Antecedentes
Los virus son agentes infecciosos submicroscoacutepicos que pueden replicarse
independientemente de los cromosomas de una ceacutelula pero no independientemente de ella
A fin de multiplicarse deben penetrar la ceacutelula donde puedan replicarse a la cual se le
denomina hueacutesped Presentan una forma infecciosa madura que es tiacutepicamente extracelular
Antecedentes
36
Pueden infectar a diferentes seres vivos por lo que existen virus de animales de plantas y
de forma particular los llamados virus bacterianos o fagos (Madigan y Martinko 2006)
Los bacterioacutefagos o fagos (del griego φαγετον paguumlento ldquoalimentoingestioacutenrdquo) son agentes
virales de las bacterias su descubrimiento se atribuye por un lado al bacterioacutelogo ingleacutes F
W Twort que en 1915 mencionoacute el aclaramiento de un cultivo soacutelido de Micrococcus
provocado por un agente desconocido Por otro lado en 1917 el francocanadiense F
dHerelle descubrioacute un grupo de entidades bioloacutegicas en medios de cultivo que se propagaban
a expensas de las bacterias a los cuales les denominoacute fagos y dentro de sus investigaciones
definioacute su potencial uso e importancia cliacutenica Esto se refuerza a partir de 1940 con el
desarrollo del microscopio electroacutenico con el que se demuestra la naturaleza viral de los fagos
y que la forma de estudiarlos es mediante procedimientos microbioloacutegicos convencionales
facilitando su manejo y estudio (Grabow 2001)
La uacuteltima variedad de fagos se descubrioacute durante la Primera Guerra Mundial los tipos ya
conocidos eran los virus que afectaban a vegetales y animales fue entonces que se pensoacute
en que su aplicacioacuten para eliminar bacterias podriacutea ser utilizada para la prevencioacuten y el
tratamiento de enfermedades bacterianas pero no resultoacute (Merril et al 1996) Sin embargo
los fagos resultaron tener otros beneficios especialmente como modelos o sustitutos de los
virus en humanos en la investigacioacuten geneacutetica baacutesica asiacute como en la evaluacioacuten de la calidad
del agua Ademaacutes demostraron ser una herramienta valiosa en la mayoriacutea de las
investigaciones sobre los virus ya que en comparacioacuten con los humanos animales vegetales
e incluso los insectos anfitriones de otros virus los fagos son faacutecil y raacutepidamente reproducibles
en el laboratorio y no son particularmente exigentes con respecto al espacio instalaciones y
equipos El trabajar con fagos requiere la separacioacuten y purificacioacuten y las dos principales tareas
para realizar esto es utilizar meacutetodos quiacutemicos en los cuales se utilizan solutos como buffer
glicerol bromuro de potasio cloruro de cesio y tartrato de potasio aunque el maacutes comuacuten es
la sacarosa ademaacutes involucra la precipitacioacuten con sulfato de amonio polietilenglicol o cloruro
de cesio y los meacutetodos fiacutesicos que implican la centrifugacioacuten a diferentes velocidades y
gradientes de densidad y con menor frecuencia la cromatografiacutea de particioacuten (Sambrook y
Russell 2001)
La investigacioacuten sobre las propiedades baacutesicas de los fagos se desarrolla en la biologiacutea
molecular que permitioacute avances sin precedentes en toda la biologiacutea y ciencias meacutedicas La
Antecedentes
37
concentracioacuten y purificacioacuten es un factor determinante para llevar a cabo la infeccioacuten
eficientemente sin embargo existe un periacuteodo de adaptacioacuten por parte de los fagos antes
que se desarrollen y se logren tiacutetulos apreciables en ceacutelulas cultivadas (Sambrook y Russell
2001 Breeuwer et al 2003)
E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos
Los virus son paraacutesitos intracelulares obligados no tienen metabolismo intriacutenseco y
requieren la maquinaria metaboacutelica codificada por los cromosomas de ceacutelula que puedan
infectar y reproducirse en ella denominada hueacutesped Su tamantildeo oscila entre 20 y 200 nm y
consiste de un nuacutecleo de aacutecido nucleico (ARN o ADN de cadena simple o doble) rodeado por
una cubierta proteica (caacutepside) y en algunos casos una cubierta de liacutepidos Los microbioacutelogos
que investigan la presencia de virus en haacutebitats marinos y han detectado su presencia creen
que son diez veces maacutes numerosos que las bacterias marinas En la superficie de los mares
se encuentran entre 106 y 109 partiacuteculas viacutericas por mililitro y se estima que en la capa
superficial (1 mm) de los oceacuteanos se encuentran unas 3 x 1030 partiacuteculas viacutericas (Grabow
2001 Atterbury et al 2003)
E3 Clasificacioacuten de los fagos
Las variaciones en los fagos se presentan en forma estructural como apeacutendices en la
cabeza cuello y las fibras de la cola o espigas ademaacutes del genoma que variacutea en cada orden
En 1962 Andreacute Lwoff junto a otros investigadores propuso una clasificacioacuten basada en la
morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico Los nombraron de la siguiente manera los urovirales
que presentaban cola pronunciada los inoviridae eran los filamentosos y los microviridae los
tipo φX Posteriormente Bradley (1967) consideroacute la morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico y
agrupoacute a los fagos en seis morfotipos baacutesicos denominados de la A a la F posteriormente se
clasifico en fagos baacutesicos los de cola los filamentosos y los icosaeacutedricos con ADN de cadena
sencilla o RNA de cadena simple Los fagos han sido investigados debido a su rol como
agentes de biocontrol para el desarrollo de la seguridad alimentaria En el presente varios
miles de fagos en contra de varios objetivos han sido aislados de varios entornos y alimentos
Aproximadamente el 96 de los fagos aislados eran con cola y del tipo liacuteticos en una de las
Antecedentes
38
tres familias Myoviridae (245) Siphoviridae (61) y Podoviridae (14) en el orden de los
caudovirales (Atterbury et al 2003 Oh y Park 2017)
En 1971 el Comiteacute Internacional de Taxonomiacutea de Virus (ICTV por sus siglas en ingleacutes)
clasificoacute en 6 geacuteneros de los cuales 5 corresponden a la clasificacioacuten propuesta por Bradley
los grupos T4 λ φX174 MS2 y fd Los fagos pueden tener cola larga y flexible no contraacutectil
(Siphoviridae) cola larga y contraacutectil (Myoviridae) o cola corta (Podoviridae) como se observa
en la tabla 4 Para la clasificacioacuten de los fagos se aplican propiedades como el rango de
hueacutespedes y las relaciones inmunoloacutegicas sin embargo las maacutes importantes son su
morfologiacutea y las caracteriacutesticas de su aacutecido nucleico el cual se adsorbe a componentes de la
superficie celular que actuacutean como receptores especiacuteficos La zona de adsorcioacuten del virus es
complementaria al receptor celular por lo tanto un determinado fago soacutelo puede infectar un
nuacutemero limitado de cepas celulares que contengan a un determinado receptor La naturaleza
de la zona de adsorcioacuten variacutea con el tipo de fago En el T4 se localiza en el extremo de la cola
en donde se encuentran la placa basal las espiacuteculas y las fibras de la cola Las formas maacutes
complejas corresponden a los fagos con colas contraacutectiles (Atterbury et al 2003)
Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos
(Ackermann 2003)
Antecedentes
39
E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico
La multiplicacioacuten de los fagos (figura 4) ADN produce la destruccioacuten de la ceacutelula hueacutesped
mediante lisis lo que provoca su liberacioacuten El ciclo vital de un fago que culmina con el
estallido de la ceacutelula hueacutesped y la liberacioacuten de viriones recibe el nombre de ciclo liacutetico Los
acontecimientos que tienen lugar durante el ciclo liacutetico se revisaraacuten en esta seccioacuten con
especial atencioacuten a los fagos T-par de E coli Estos son fagos de ADN bicatenario con colas
contraacutectiles complejas de la familia Myoviridae son algunos de los virus maacutes complejos
conocidos (Fernaacutendez 2008)
Figura 4 Adsorcioacuten del fago T4 e inyeccioacuten del ADN (Leverentz et al 2003)
Los fagos podriacutean infectar hasta un 70 de la poblacioacuten de procariotas marinos y ser
responsables de la tercera parte de la mortalidad bacteriana acuaacutetica Tambieacuten se han
detectado virus que infectan diatomeas y otras algas importantes del fitoplancton marino lo
cual es de gran transcendencia ecoloacutegica ya que la multiplicacioacuten de bacterias marinas
supera la capacidad de reproduccioacuten de los protozoos La lisis por virus de ceacutelulas procariotas
y de algas puede tambieacuten contribuir enormemente en los ciclos del carbono y nitroacutegeno en las
cadenas troacuteficas marinas incluso podriacutea reducir el nivel de productividad marina como la de
moluscos y peces (Muniesa et al 2005)
E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten
Los fagos no se unen al azar a la superficie de una ceacutelula hueacutesped por el contrario se fijan
a receptores especiacuteficos La naturaleza de estos receptores variacutea de acuerdo al fago pueden
Antecedentes
40
ser lipopolisacaacuteridos y proteiacutenas de la pared celular aacutecidos teicoicos flagelos y pili Los fagos
T-par de E coli en particular utilizan lipopolisacaacuteridos o proteiacutenas de la pared celular como
receptores Las variaciones en las propiedades del receptor son parcialmente responsables
de las preferencias del fagos por el hueacutesped (Muniesa et al 2005 Leeuw et al 2017)
La adsorcioacuten de fagos T-par estaacute relacionada con diversas estructuras del tallo La fijacioacuten
del fago comienza cuando una fibra del tallo establece contacto con los receptores adecuados
a medida que maacutes fibras contactan con los receptores la placa basal se asienta en la
superficie La unioacuten se debe probablemente a interacciones electrostaacuteticas y se ve influida por
el pH y por la presencia de iones como Mg+2 y Ca+2 Una vez que la placa basal estaacute
firmemente asentada en la superficie celular se producen cambios conformacionales en ella
y en la vaina del tallo Esta uacuteltima se reorganiza de tal forma que se contrae pasando de una
conformacioacuten en cilindro de 24 anillos a otra de 12 anillos de longitud maacutes corta y ancha es
entonces cuando el tubo central es empujado a traveacutes de la pared celular bacteriana
Finalmente el ADN es extruido de la cabeza pasa a traveacutes del tubo del tallo y penetra en la
ceacutelula hueacutesped Parece ser que el tubo interacciona con la membrana plasmaacutetica para formar
un poro a traveacutes del cual pasa el ADN los mecanismos de penetracioacuten de otros fagos difieren
a menudo de los fagos T-par aunque no se han estudiado en detalle (Leverentz et al 2003)
F Biofilm
Las bacterias existen en la naturaleza bajo dos formas o estados a) bacterias planctoacutenicas
de libre flotacioacuten y b) bacterias biofilm en colonias de microorganismos seacutesiles (Nazar 2007)
Un biofilm se define como una agrupacioacuten de comunidades seacutesiles microbianas que se fijan a
superficies las ceacutelulas estaacuten incrustadas en una matriz autoproducida que actuacutea como
proteccioacuten quiacutemica y mecaacutenica del entorno asiacute estas bacterias presentan mayor resistencia
a desinfectantes y el secado (Vestby et al 2009) Las bacterias pueden crear condiciones
para formar biofilms casi en cualquier ambiente liacutequido La interfase soacutelido-liacutequido entre una
superficie y un medio acuoso (vgr leche) proporciona un entorno ideal para la fijacioacuten y
crecimiento de microorganismos (Fakruddin et al 2014)
Antecedentes
41
G Microscopiacutea electroacutenica
Los microscopios electroacutenicos se usan habitualmente para el estudio detallado de
estructuras celulares (Bradley 1967) Para analizar las estructuras internas es esencial el
microscopio electroacutenico de transmisioacuten MET En el MET se utilizan electrones en lugar de rayo
de luz las lentes son electromagneacuteticas y se opera en todo momento a alto vaciacuteo
(Ackermann 2003) El poder de resolucioacuten del microscopio electroacutenico es mucho mayor que
el del microscopio oacuteptico incluso pueden observarse estructuras moleculares como proteiacutenas
y aacutecidos nucleicos Sin embargo los haces de electrones tienen escaso poder de penetracioacuten
y una ceacutelula aislada es demasiado gruesa para poder visualizarse directamente por este
motivo se emplean teacutecnicas especiales para la obtencioacuten de cortes ultrafinos a fin de poder
observar las muestras Una ceacutelula bacteriana por ejemplo se corta con una cuchilla especial
en varios cortes ultrafinos de 20-60 nm de espesor que son posteriormente examinados de
manera individual en el microscopio electroacutenico (Fuster-Valls et al 2008) Para obtener
suficiente contraste las preparaciones se tintildeen previamente mediante tratamiento con
compuestos como aacutecido oacutesmico permanganato sales de uranilo o de lantano o plomo Como
estas sustancias poseen aacutetomos pesados son capaces de desviar los electrones y aumentar
el contraste (Madigan y Martinko 2006)
La microscopiacutea electroacutenica es el mejor meacutetodo para estudiar la forma de las bacterias Los
virus bacterianos por tener un diaacutemetro menor de 1000 Aring estaacuten por debajo del liacutemite de
resolucioacuten del microscopio oacuteptico sin embargo es posible observarlos mediante el
microscopio electroacutenico porque eacuteste utiliza una radiacioacuten de longitud de onda maacutes corta que
permite aumentar 100 mil veces una resolucioacuten de 10 Aring (Kruger et al 2000 Ackermann
2003) Para observar detenidamente la morfologiacutea se requiere el microscopio electroacutenico con
especificaciones precisas como el de barrido lo cual es una herramienta indispensable en
biologia molecular (Guzmaacuten 2015)
Para la observacioacuten las partiacuteculas se suspenden en un medio volaacutetil por lo general una
solucioacuten de acetato de amonio y se colocan sobre una membrana sostenida por una rejilla
metaacutelica que praacutecticamente no absorbe electrones El problema teacutecnico maacutes frecuente es la
falta de contraste como la imagen obtenida es el resultado de la dispersioacuten de electrones por
los aacutetomos de la partiacutecula se necesita una diferencia apreciable de poder dispersivo entre las
partiacuteculas y el medio de soporte generalmente se emplean teacutecnicas tradicionales La maacutes
utilizada se conoce como tincioacuten negativa consiste en mezclar la suspensioacuten del fago con
Antecedentes
42
fosfovolframato de sodio o acetato de uranilo a pH neutro A este pH las sales no se combinan
con el fago al secarse forman una capa uniforme y opaca a los electrones en la cual los fagos
destacan como partiacuteculas maacutes claras Como las sales en solucioacuten penetran las irregularidades
en la superficie de la partiacutecula la micrografiacutea revela los detalles finos de los fagos (Fuster-
Valls et al 2008 Montantildeez et al 2012)
La forma del fago se establece de manera visual que es directa de la placa cuando las
UFP que se observan a simple vista como placas liacuteticas a contraluz (APHA 2005) Y para
estudiar la adhesioacuten y formacioacuten celular en diversas superficies se han desarrollado varias
teacutecnicas de microscopiacutea entre las cuales se distinguen la microscopiacutea electroacutenica de barrido
y de transmisioacuten asiacute como la microscopiacutea de epifluorescencia (Fuster-Valls et al 2008) la
cual se basa en los mismos principios de oacuteptica de la microscopiacutea comuacuten con diferencias en
el manejo y el disentildeo relacionadas con la generacioacuten y transmisioacuten de longitudes de onda
adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar ya sean propios de la muestra o de
la coloracioacuten utilizada (Franco 2005)
El fundamento de la teacutecnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o
compuestos fluorescentes denominados fluorocromos en fijarse a los anticuerpos mediante
un enlace quiacutemico estable que no puede romperse durante el curso de la reaccioacuten
inmunoloacutegica La espectroscopia de fluorescencia es la teacutecnica de deteccioacuten oacuteptica maacutes
sensible En el caso de la deteccioacuten en ceacutelulas se exponen a alta energiacutea utilizando laacutemparas
de xenon excitando por varios nanosegundos y asiacute emitiendo una longitud de onda de baja
energiacutea (Franz y Jendreizik 2015)
H Fagoterapia
Las enfermedades infecciosas estaacuten catalogadas entre las primeras causas de muerte en
el mundo y por lo tanto son consideradas un problema de salud puacuteblica Entre ellas las
infecciones bacterianas causan gran preocupacioacuten dado que las bacterias adquieren diacutea a
diacutea mayor resistencia a los antibioacuteticos esto ocurre por medio de diversos mecanismos
fisioloacutegicos y moleculares que les permiten a estos microorganismos adaptarse raacutepidamente
a condiciones adversas (Prada-Pentildearanda et al 2015)
El descubrimiento de los fagos por dacuteHerelle se desarrolloacute cuando eacuteste buscaba una
Antecedentes
43
vacuna que pudiera combatir la crisis de disenteriacutea hemorraacutegica que se presentoacute en 1915 en
las afueras de Francia dacuteHerelle observoacute que tras aislar lisados libres de bacterias de la
materia fecal de los enfermos las bacterias eran destruidas por un agente desconocido
invisible capaz de destruir cultivos de bacterias o producir pequentildeas aacutereas de color maacutes claro
cuando las bacterias eran crecidas en confluencia en placas de medio soacutelido y publicoacute sus
observaciones en el artiacuteculo titulado ldquoSobre un microbio invisible antagonista de los bacilos
de la disenteriacuteardquo (Szafranski et al 2017)
El uso de los fagos como agentes terapeacuteuticos comenzoacute hace maacutes de 80 antildeos Entre los
ejemplos maacutes destacados y recientes de la utilizacioacuten exitosa de la fagoterapia cabe citar el
uso de fagos especiacuteficos en el control bioloacutegico de E coli O157H7 productora de colitis
hemorraacutegica (en alimentos) Tambieacuten se ha estudiado el uso de fagos en el tratamiento de
infecciones peritoneales y otitis externa en la erradicacioacuten de P aeruginosa en pacientes con
fibrosis quiacutestica en el tratamiento de infecciones urinarias y osteomielitis por S aureus y en
la descolonizacioacuten intestinal para combatir las infecciones por Enterococcus faecium
resistente a vancomicina entre otros Los efectos favorables de la fagoterapia podriacutean
exceder incluso su actividad antibacteriana Hay datos sorprendentes acerca de la actividad
in vivo de los fagos el conocido fago T4 de E coli podriacutea inhibir la adsorcioacuten y la replicacioacuten
de adenovirus en sus ceacutelulas blanco y el fago Pf4 de P aeruginosa habriacutea sido capaz de
inhibir el desarrollo de cepas de Aspergillus por secuestro de hierro (Lopardo 2017)
El estudio y desarrollo de nuevos tratamientos alternativos es de particular intereacutes en la
lucha contra la resistencia bacteriana Los fagos presentan caracteriacutesticas que los hace una
excelente herramienta contra las bacterias patoacutegenas debido a su especificidad y seguridad
ecoloacutegica Los fagos no solo son atractivos desde un punto de vista cliacutenico Se han utilizaacutedo
como potenciales aplicaciones en otras aacutereas como la agricultura el control de alimentos o
la industria como a continuacioacuten se describe en la siguiente tabla 5 Los fagos son una
solucioacuten ecoloacutegica ubicua para desarrollar nuevos tratamientos contra las bacterias aunque
se deben realizar maacutes estudios para comprender mejor la relacioacuten entre ellos y las bacterias
antes de su aplicacioacuten (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)
Antecedentes
44
Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos la naturaleza lugares
urbanizados y cuerpo humano (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)
Fuente Sitio encontrado
Naturaleza
Suelo y superficie terrestre
Agua continental y oceaacutenica
Ambientes extremos hielo marino pared de
algas zonas hipersalinas etc
Lugares artificiales
Hospitales y zonas similares
Planta de tratamiento de aguas negras
Algunas zonas bajo el impacto humano
Cuerpo de animales
Tracto digestivo y vagina
Tracto respiratorio y oral
Piel y epitelio mucoso
Los productos comerciales para terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones
Los fagos se pueden distribuir liofilizados y se disuelven antes de la administracioacuten por viacutea
intravenosa en un soporte adecuado como por ejemplo una solucioacuten acuosa o tampoacuten o
suspenderse en cualquier liacutequido adecuado coloidal o de la matriz de poliacutemeros para crear
bactericidas el principio activo se puede administrar de una manera conveniente como por
inyeccioacuten (subcutaacutenea intravenosa administracioacuten etc) por viacutea oral pulmonar (por ejemplo
aerosoles o por otros dispositivos a los pulmones) spray nasal intramuscular intraperitoneal
intrahecal intraviacutetrea vaginal rectal la puncioacuten lumbar y la aplicacioacuten directa Dependiendo
de la viacutea de administracioacuten el principio activo puede estar recubierto de un material que
preserve la sustancia de la accioacuten de enzimas aacutecidos y otras condiciones naturales que
pueden inactivar la sustancia (por ejemplo comprimidos recubiertos enteacutericos o pastillas)
Empresas dedicadas a la biotecnologiacutea se dedicaron a desarrollar productos utilizando fagos
especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan ETA la Food and Drug Administration de
los EE UU (FDA) incluye a los fagos en la categoriacutea de aditivos alimentarios la FDA ha
publicado la aprobacioacuten de seis fagos para usar en alimentos listos para comer (ready to eat)
efectivos para L monocytogenes de la compantildeiacutea Intralytix La compantildeiacutea Omnilytics ofrece
productos de control bacterial para varias aacutereas como son agricultura agua y alimentos
industrias que se pueden observar en su paacutegina web (httpswwwomnilyticscom) y otras
empresas como Biophage Pharma Inc (Canada) Exponential Biotherapies (EE UU)
(Segundo 2010)
Antecedentes
45
Estas nuevas estrategias de intervencioacuten eco-amigable son requeridas como agente de
biocontrol en contra de Salmonella Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos
antildeos debido a sus caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutef ico sin
dantildear la micro-flora en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros
distribucioacuten de esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla
algunos ejemplos de la aplicacioacuten de los fagos son los descritos en la siguiente tabla 6 (Oh y
Park 2017)
Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria (Oh y
Park 2017)
Compantildeiacutea Producto del fago Organismo hueacutesped
FINK TEC GmbH (Alemania) Secure Shield E1 E coli
Intralytix Inc
(EE UU)
Ecolicidereg (EcolicidePXtrade) E coli O157H7
EcoShieldtrade E coli O157H7
ListShieldtrade L monocytogenes
SalmoFreshtrade Salmonella spp
ShigaShieldtrade
(ShigActivetrade) Shigella spp
Micreos Food Safety
(Holanda)
PhageGuard Listextrade L monocytogenes
PhageGuard Strade Salmonella spp
E coli O157H7
Passport Food Safety Solutions
(EE UU) Finalysereg E coli O157H7
Phagelux (China)
AgriPhag
Xanthomonas campestris pv
vesicatoria Pseudomonas
syringae
pv tomato
SalmoProreg Salmonella spp
Salmonella spp
Antecedentes
46
47
III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO
48
Objetivos y plan de trabajo
49
A Objetivo general
El objetivo general de este estudio es aislar y caracterizar fagos frente Salmonella spp a
partir de diversas fuentes ambientales para su uso potencial en el control bioloacutegico
El control de Salmonella spp es de gran intereacutes para la industria alimentaria por lo que
encontrar alternativas para su eliminacioacuten es de gran impacto en la salud puacuteblica
B Objetivos especiacuteficos
1- Aislar fagos de Salmonella proveniente de muestras de aguas residuales de la ZMM y
muestras de lavado de carne pollo de un establecimiento donde se comercializa esta carne
2- Caracterizar parcialmente los fagos aislados en base a su morfologiacutea por TEM y el
anaacutelisis de sensibilidad frente a diversas cepas bacterianas
3- Estudiar el efecto de los fagos previamente aislados desarrollando un biofilm de
Salmonella spp sobre discos de acero inoxidable utilizando la DEM
C Plan de trabajo
Para alcanzar los objetivos establecidos se considera la ubicacioacuten de las fuentes para la
obtencioacuten de los fagos en este caso el medio seleccionado son riacuteos arroyos asiacute como un
establecimiento donde se procesan canales de pollo en la ZMM y las lagunas de oxidacioacuten
de aguas residuales en Mariacuten ambas localidades en Nuevo Leoacuten Meacutexico
Posteriormentese utilizaraacute la teacutecnica ADC y se verificaraacute en cual de estas muestras se
podriacutean encontrar fagos que sean liacuteticos para Salmonella enterica y posteriormente se
realizaraacuten pruebas de selectividad con la meta de caracterizar los fagos aislados frente a
diferentes hueacutesped (cepas de Salmonella spp y de E coli) y la observacioacuten de la morfologiacutea
se realizaraacute por el TEM
Salmonella spp presenta un periacuteodo de incubacioacuten por lo general entre 12 y 36 horas
tras el cual el derarrollo bacteriano en las superficies puede dar como resultado la formacioacuten
de un biofilm Para este estudio se desarrollaraacute un biofilm de Salmonella spp sobre discos
de acero inoxidable en condiciones de humedad esto es importante por la fase de eclipse
Objetivos y plan de trabajo
50
(momento en el cual atacan y se desarrollan los fagos) Se probaraacuten 3 concentraciones de
fago 6 7 y 8 UFPmL Se realizaraacuten recuentos durante un periacuteodo de incubacioacuten de 72 h
Con el fin de conseguir estos objetivos el presente trabajo se ha estructurado en tres
secciones las cuales se pueden observar en la figura 5 incluyendo las pruebas con DEM
en los discos de acero inoxidable
Figura 5 Diagrama general de trabajo
51
IV MATERIALES Y MEacuteTODOS
52
Materiales y meacutetodos
53
A Toma de muestras
Las muestras para obtencioacuten de fagos se recolectaron en diez sitios del aacuterea metropolitana
de Monterrey y del municipio de Mariacuten Nuevo Leoacuten (tabla 7) El meacutetodo que se utilizoacute para
aislar fagos de diversas fuentes medio ambientales y su posterior traslado al laboratorio fue
el descrito por Higgins et al (2005) Se obtuvieron las muestras provenientes de aguas
residuales y riacuteos se emplearon frascos de 450 mL previamente lavados y secos que
posteriormente se impregnaron con una solucioacuten de tiosulfato de sodio (Na2S2O3bull5H2O) al
10 (pv) (Sigma-Aldrich EE UU) y se esterilizaron en autoclave 121ordmC15min Al momento
de hacer la recoleccioacuten en campo los frascos fueron abiertos cuidadosamente y se llenaron
con el liacutequido se almacenaron en hieleras para su traslado al laboratorio el tiempo que
transcurrioacute desde la toma de la muestra hasta la llegada al laboratorio fue entre 1 y 3 h
posteriormente las muestras se centrifugaron el mismo diacutea y los sobrenadantes se
almacenaron 4oC hasta su uso (Vidales-Contreras et al 2006)
A cada una de las muestras obtenidas en el muestreo se le agregoacute 25 de cloroformo
(grado de reactivo 995 Sigma-Aldrich EE UU) para conservarlas en condiciones oacuteptimas
para su posterior llegar al laboratorio se mantuvieron a 4degC durante toda la noche para
permitir que el material grueso decante Mientras tanto en lo referente a las muestras
obtenidas de aguas provenientes de los establecimientos expendedores de pollos las
muestras se trataron igual pero como el sobrenadante contiene grasa se optoacute por filtrar y
posteriormente se realizoacute el mismo procedimiento antes descrito
Materiales y meacutetodos
54
Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos
B Obtencioacuten de fagos
Para aislar los fagos se utilizoacute la teacutecnica descrita por Sambrook y Russell (2001) la cual se
describe a continuacioacuten En un tubo de ensayo (16150 mm Fisherbrand EE UU)
conteniendo 45 mL de agar suave (AS) (Bioxon Meacutexico) mantenieacutendose a temperatura de
40C (en una cuba hidroneumaacutetica con agua) se colocaron 500 L de un cultivo de S
Enteritidis (provenientes del cepario del CINSP) en fase logariacutetmica y se agregaron 300 L
de las muestras recolectadas en las que se presume conteniacutean los fagos especiacuteficos para
esta cepa Se agitoacute el tubo de ensayo mezclando con movimientos circulares suaves para
evitar la formacioacuten de burbujas este procedimiento se realizoacute aproximadamente por 5
segundos El contenido se vertioacute uniformemente sobre una caja de Petri (10015 mm
Fisherbrand EE UU) conteniendo agar soya tripticasa (AST) (Bioxon Meacutexico) y se dejoacute a
temperatura ambiente hasta solidificar la ADC Se incuboacute a 37C por 24h Al momento de
observar el desarrollo de las placas de lisis (calvas) se procedioacute al aislamiento de los fagos
Su cuantificacioacuten se realizoacute de manera directa e inmediata ya que las calvas son visibles con
una iluminacioacuten de contraste (Breeuwer et al 2003) Posteriormente los fagos que si formaron
halos de inhibicioacuten fueron aislados de manera directa o siguiendo uno de los dos protocolos
(enriquecimiento y sin enriquecer) debido a que depende principalmente de la amplificacioacuten
del fago y las caracteriacutesticas de cada uno se describen a continuacioacuten
Municipio Sitio de la toma
Monterrey
Parque Fundidora
Riacuteo Santa Catarina
Establecimiento de comida
Av Conductores
Mariacuten Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal
Riacuteo La Libertad
Guadalupe Alcantarillas de la colonia La Azteca
Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados
San Nicolaacutes de los Garza Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac
Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea
Materiales y meacutetodos
55
B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos
Con el protocolo de enriquecimiento se proporcionoacute las condiciones oacuteptimas de desarrollo
al cultivo de la bacteria hueacutesped y la muestra al inocular el cultivo en la muestra y de esta
manera amplificar los posibles fagos que presentes en la muestra de agua
Se realizoacute este protocolo de la siguiente manera primero se seleccionoacute la cepa bacteriana
que seraacute el hueacutesped esto se consiguioacute haciendo un cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y
se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por otra parte se prepararon
aliacutecuotas (10 mL cada una) de cada una de las muestras recolectadas (enriquecidas con
cultivo bacteriano) y se centrifugan a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a
4degC despueacutes el sobrenadante se pasoacute por jeringa y con filtros de 022 microm (Millex-GP
polyethersulfone 33 mm radio-sterilized) Estas dos entidades biloacutegicas se unieron en un
matraz de capacidad de 50 mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon
Meacutexico) a doble concentracioacuten (20) En este matraz se agregaron 300 microL de la muestra
previamente filtrada con fagos y 500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incuboacute a 37degC por
24 h posteriormente por medio de la teacutecnica de ADC se pudo observar la formacioacuten de halos
de lisis de los fagos (Vidales-Contreras et al 2006)
B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos
El protocolo se emplea para adicionar directamente de la muestra una aliacutecuota y testarla
con la bacteria hueacutesped Se siguieron los pasos anteriormente descritos a este protocolo
primero se seleccionoacute la cepa bacteriana (hueacutesped) esto se realizoacute haciendo un cultivo fresco
(AST) (Bioxon Meacutexico) y se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por
otra parte se preparoacute aliacutecuotas (10 mL) de cada una de las muestras recolectadas y se
centrifugaron a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a 4degC despueacutes el
sobrenadante se pasoacute por jeringa con filtros de 022 microm (Millex-GP polyethersulfone 33 mm
radio-sterilized) Estas dos entidades bioloacutegicas se unieron en un matraz de capacidad de 50
mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon Meacutexico) a doble
concentracioacuten (20) A este matraz se agregaron 300 microL de la muestra filtrada con fagos y
500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incubaron a 37degC por 24h posteriormente por medio
de la teacutecnica de ADC se observaron la formacioacuten de halos de lisis de los fagos (Vidales-
Materiales y meacutetodos
56
Contreras et al 2006)
B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas
Despueacutes de que los cultivos bacterianos se reactivaron la preparacioacuten para trabajar con
ellos fue la siguiente se tomoacute una asada de una colonia bacteriana bien diferenciada y se
incuboacute en un tubo inclinado (punta de flauta) se dejoacute el cultivo toda la noche y posteriormente
se traspasoacute a un subcultivo en caldo con infusioacuten cerebro-corazoacuten (BHI Merck Alemania) e
incuboacute a 37degC durante 24 h posteriormente se subcultivoacute en BHI en las mismas condiciones
Una colonia aislada en tubo punta de flauta se inoculoacute en 9 mL de agua peptonada (3M
Meacutexico) y se incuboacute a 37degC durante 24 h luego se realizaron mezclas seriadas en diluyente
(1 gL triptona 85 gL NaCl pH 72) (Merck Alemania) y se implantaron en las superficies de
los discos de acero inoxidable tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm con
un volumen inferior a 50 microL Como control del inoacuteculo se prepararon 5 placas de TSA
En el caso del fago obtenido se amplificoacute realizando la infeccioacuten en repetidas ocasiones
hasta alcanzar una concentracioacuten de 1x107 UFPmL
B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos
Para la realizacioacuten de este estudio se utilizaron cepas bacterianas de Salmonella enterica
y E coli provenientes de diversas colecciones de los laboratorios involucrados tambieacuten se
utilizoacute un fago de prueba (PRD1) para ser utilizado como control positivo en los aislamientos
En la tabla 8 se muestran las bacterias y el fago indicando su denominacioacuten y origen asiacute como
las condiciones de conservacioacuten
Materiales y meacutetodos
57
Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten
Origen Cepa bacteriana fagos Clave Condiciones de conservacioacuten
FaSPyN
S Typhimurium ATCC 13311
Glicerol a -20degC S Paratyphi ATCC 9150
S Enteritidis ATCC 13076
FCB S Typhi ATCC 19430 BGA TSA 4degC
FAUANL
S Typhimurium TSA 4degC
Fago PRD1
Tampoacuten fosfato 4degC
E coli CECT 515
E coli K12
E coli ATCC 10536
E coli O157H7 CECT 4783
S bongori ATCC 43975
UAB
S enterica LT2
Vial liofilizado a -20degC
S enterica sub enterica CECT 4138
S enterica sub enterica CECT 4594
S enterica sub enterica CECT409
S enterica sub enterica CECT 698
S Typhimurium CCUG 29478
Para la reactivacioacuten de los cultivos que se almacenan a 4degC se dejaron a temperatura
ambiente igualmente para los congelados Posteriormente para sacarlos del estreacutes se
sembraron en medio de cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y se incubaron a 37degC por 24
horas tras estas condiciones ya se pudieron utilizar en los ensayos (McLaughlin et al 2006)
A continuacioacuten se describe la forma en que se reactivaron los cultivos en este estudio de
acuerdo a la forma en que estaban almacenados
a) Cultivos almacenados en glicerol
Se descongelaron los viales a temperatura ambiente
Materiales y meacutetodos
58
Se transfirieron 5 microL de cultivo en 20 mL de TSB (Becton Dickinson Co) y se incuboacute a
37degC toda la noche
Se sembroacute en tres campos en caja de Petri de 90 mm con TSA (Becton Dickinson Co)
Se incuboacute a 37degC por 24h
Se seleccionoacute una colonia aislada y bien diferenciada
El cultivo (colonia) se incuboacute en 20 mL de TSB a 37degC toda la noche
b) En caso de los cultivos liofilizados
En el vial se hidrataron los cultivos agregando 1 mL de TSB e incubando 1h a 37degC
Se vertioacute el cultivo en 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC toda la noche
Se realizoacute el mismo proceso anteriormente mencionado en a)
B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC)
La siembra o inoculacioacuten consistioacute en introducir artificialmente una porcioacuten de muestra
(inoacuteculo) en un medio adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano para su desarrollo
y multiplicacioacuten Una vez inoculado el medio se incuboacute a una temperatura adecuada para el
oacuteptimo crecimiento en promedio 37degC Los meacutetodos de conteo en placa como capa doble y
capa simple de agar se basan en la determinacioacuten de la concentracioacuten viral mediante el
conteo de UFP las cuales son zonas de aclaramiento circular o halo de inhibicioacuten de
crecimiento bacteriano que se producen en la capa o ceacutesped bacteriano debido a la lisis
producida por los fagos Inicialmente una partiacutecula de fago infecta a su bacteria hueacutesped se
replica y posteriormente se disemina generando una zona circular sin crecimiento de la
bacteria (Solano et al 2012) Por esta razoacuten en nuestro estudio se utilizoacute esta manera de
trabajar considerando las diferentes formas que se puede presentar los halos de inhibicioacuten
(forma tamantildeo densidad)
La teacutecnica se basoacute en mezclar el cultivo bacteriano en fase logariacutetmica y el fago en agar
suave (AS) tambieacuten llamado top agar cuando se aplica a la placa de Petri donde se realizoacute
el proceso de infeccioacuten El AS se preparoacute con TSB y agar bacterioloacutegico (15) para obtener
una consistencia semisoacutelida que permita el desarrollo de las calvas en el ceacutesped bacteriano
Se mantuvo a una temperatura adecuada para conservar el estado liacutequido y se agitoacute
cuidadosamente para dejar interactuar los cultivos fago-hueacutesped en el tubo de ensayo
Materiales y meacutetodos
59
posteriormente se dispersoacute de manera uniforme en placas de Petri de 90 mm de diaacutemetro con
15 mL de TSA La suspensioacuten (ceacutesped bacteriano en ADC) se dejoacute solidificar a temperatura
ambiente unos minutos y posteriormente se incuboacute 24h37degC (Vidales-Contreras et al 2006)
B6 Modelo de infeccioacuten
Las enzimas endolisinas de los fagos provocan la lisis debilitamiento y rompimiento de la
pared celular de las bacterias La lisis depende de la proporcioacuten de fagos y hueacutesped o
multiplicidad de infeccioacuten (Multiplicity of infection MOI) Cuando hay una MOI baja la relacioacuten
de fagos a bacterias no es superior a 21 Cuando la MOI es alta es decir muchos fagos frente
a pocas bacterias las ceacutelulas se lisan directamente (Dimmock et al 2007)
En ese sentido la Norma ISO 10705-11995 indica que durante el ensayo el fago en fase
de multiplicacioacuten experimenta varios ciclos de replicacioacuten lo que resulta en la muerte de la
ceacutelula hueacutesped que ha actuado como faacutebrica para la produccioacuten viral El modelo que se siguioacute
es para observar los halos de inhibicioacuten y contrastar los resultados En la figura 6 se presenta
el modelo de infeccioacuten utilizado con S Typhimurium y el fago PRD1 siguiendo el modelo de
Vidales-Contreras et al (2006) y la puesta a punto propuetas por Sambrook y Russell (2001)
Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten fago-hueacutesped
Materiales y meacutetodos
60
B7 Controles utilizados durante los ensayos
Se utilizoacute la cepa de S Typhimurium y el fago PRD1 como control positivo para observar
la formacioacuten de las calvas para el control negativo se utilizoacute agua esterilizada con esto se
asegurar que si existe infeccioacuten y evitar los falsos positivos que ocurren primordialmente por
contaminacioacuten
Para control negativo el ceacutesped bacteriano se obtuvo de la siguiente manera en un
tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de cultivo de S
Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de agua destilada esteacuteril la mezcla se vertioacute
en placa Petri con TSA
Como control positivo el ceacutesped bacteriano y las placas de lisis se obtuvieron como
sigue en un tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de
cultivo de S Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de fagos PRD1 la mezcla se
vertioacute en placa Petri con TSA
B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium
Para realizar los ensayos microbioloacutegicos se requirioacute trabajar con la misma cantidad de
biomasa en una fase de crecimiento similar El conteo en placa es un meacutetodo de medicioacuten de
biomasa que permite el recuento de ceacutelulas viables y consiste en determinar el nuacutemero de
ceacutelulas capaces de reproducirse y generar colonias sobre un medio soacutelido (cada ceacutelula viable
da origen a una colonia) Para este estudio y ver el efecto de los fagos sobre las bacterias
primeramente se calculoacute la curva de crecimiento celular pues es imprescindible para realizar
la infeccioacuten que la bacteria hueacutesped y se encuentre en fase logariacutetmica Es decir para
determinar la biomasa bacteriana se mide la cineacutetica de crecimiento celular y se considera
que se ha alcanzado la fase de crecimiento exponencial cuando la concentracioacuten es de 10⁸
UFCmL (McLaughlin et al 2006)
Para el conteo bacteriano se utilizoacute el meacutetodo de filtracioacuten por membrana
Se transfirioacute 1 mL del cultivo bacteriano fresco a 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC
Cada 30 minutos se recolectaron 300 microL de cultivo
A cada aliacutecuota recogida se le realizaron diluciones seriadas con 27 mL de agua
Materiales y meacutetodos
61
destilada esteacuteril hasta obtener un factor de 1010
De cada una de estas diluciones se obtuvieron 100 microL que se filtraron por membrana
de celulosa 045 microm (Millipore Corporation Billerica Ma 47 mm esteacuteril Cat No
JMX000089 Millipore) montada en un embudo de filtracioacuten magneacutetico de 47 mm (Pall
GELMAN Laboratory con capacidad de 300 mL) y con bomba de vaciacuteo (GM motors amp
industrial systems Modelo 5kh36kna510x)
Las membranas se colocaron en caja de Petri con TSA y se incubaron 24h a 37degC
C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos
Con excepcioacuten de la microscopiacutea electroacutenica los meacutetodos empleados para determinar el
tamantildeo forma y composicioacuten quiacutemica de los fago requieren una alta pureza de las partiacuteculas
virales El material de partida en cualquier estudio de este tipo para la obtencioacuten del fago es
cuando se presenten los halos de inhibicioacuten en el ADC en general ademaacutes de los fagos
estas zonas claras pueden contener los restos celulares de las bacterias como trozos de
pared membranas ribosomas ADN ARN proteiacutenas y otros componentes de peso molecular
maacutes bajo El contenido de fago en un lisado es del orden de 001 mg mL por lo que para
obtener la cantidad apropiada para su caracterizacioacuten es necesario partir de varios litros
(Leverentz et al 2003 Maestro y Sanz 2016)
Para llevar a cabo la purificacioacuten de los fagos se debe de realizar con concentraciones
superiores a 1010 UFPmL Uno de los meacutetodos maacutes utilizados es la centrifugacioacuten a alta
velocidad y posterior resuspensioacuten de las partiacuteculas sedimentadas en un volumen menor
Cuando es posible esta teacutecnica se reemplaza por un sistema de dos fases basado en la
propiedad que tienen algunos poliacutemeros de alto peso molecular como el polietilenglicol el
dextrasulfato de sodio y el dextrano al separarse estas fases por diferencia de pesos
moleculares los fagos se dispersan en este tipo de medios considerando las concentraciones
empleadas y las condiciones oacuteptimas de pH fuerza ioacutenica y temperatura y al pasar por el
proceso de centrifugacioacuten se concentran en una columna Una vez concentrado el fago en la
columna se puede recuperar faacutecilmente de la interfase Los procesos maacutes comuacutenmente
utilizados para la purificacioacuten posterior se basan en separar las partiacuteculas de fago ya sea por
su tamantildeo o densidad (Sambrook y Russell 2001 Vidales-Contreras et al 2006)
En la figura 7 se presenta el procedimiento para la amplificacioacuten de fagos que nos asegura
Materiales y meacutetodos
62
cultivos puros uniformes y con tiacutetulos altos lo cual es imprescindible para conseguir una
buena imagen en el microscopio electroacutenico
Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten de bacteriofagos aplicando la teacutecnica
de agar doble capa (ADC)
El meacutetodo utilizado para purificar los fagos que despueacutes de utilizaron para analizar su
morfologiacutea implicoacute el uso del kit Montage SEQ96 (Millipore Sequencing Reaction Cleanup Kit
Millipore Corporation EE UU)
En una placa de filtracioacuten (96 well SEQ plate by Millipore) se depositaron en cada
pocillo 15 microL de concentrado de fagos maacutes 5 microL de agua milli-Q (Injection Solution by
Millipore)
Materiales y meacutetodos
63
La separacioacuten se realizoacute por la exclusioacuten de lavados de la columna de gel aplicando
vaciacuteo por medio de una bomba (Millipore EE UU Vacuumpressure 220 V50 Hz 15 mm
Hg)
Posteriormente se resuspendioacute la muestra (Thermomixer comfort by Eppendorf) con
agitacioacuten durante 1 min a 500 rpm
Finalmente se agregoacute 10 microL de agua ultra pura Milli-Q para concentrar la muestra
(Injection Solution by Millipore)
Una de las modificaciones que se realizaron para obtener los fagos con elevada pureza y
concentracioacuten para ser utilizada en la microscopiacutea electroacutenica se realizoacute con el kit Montage
SEQ96 que se utiliza para la purificacioacuten de DNA y en este caso se utilizoacute para concentrar los
fagos (concentracioacuten 1012 UFPmL) El procedimiento se describe a continuacioacuten
Se antildeadieron 20 microL de buffer de inyeccioacuten a la placa donde se teniacutea la suspensioacuten de
fagos se resuspendioacute y transfirioacute todo el volumen a la placa azul de Millipore (kit Montage)
Se colocoacute la placa en la bomba del kit Montage de 2 a 3 min hasta que quedoacute seca
Es aconsejable no dejar maacutes tiempo del necesario para evitar un secado excesivo
Se limpioacute todo el exceso de liacutequido en la placa con papel filtro secando un par de
veces la placa sobre el papel Inmediatamente despueacutes se colocoacute la placa sobre el soporte
de la bomba evitando dejarla sobre el papel
Se antildeadieron 30 microL de buffer de inyeccioacuten
Se colocoacute la placa en la bomba unos 4-5 min hasta secarse
Con papel filtro se limpioacute todo el exceso de liacutequido que quedoacute en la placa y se colocoacute
en el soporte de la bomba
Se antildeadieron 30 microL maacutes de buffer de inyeccioacuten para resuspender
Se colocoacute la placa en agitacioacuten se centrifugoacute a 500 g por 10 min
Se traspasaron los 30 microL a un nuevo pocillo y se recolectoacute el sobrenadante
D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica
Con la concentracioacuten de fagos purificados se preparoacute la muestra para la observacioacuten al
microscopio electroacutenico y se procedioacute utilizando la teacutecnica de tincioacuten negativa tal como se
explica a continuacioacuten
Se depositaron 2 microL de suspensioacuten de fagos en un disco de capa fina de carbono y cobre
Materiales y meacutetodos
64
(200 Mesh Holes 100 microm square Ethene old 200 RU) despueacutes de 2 min de reposo a
temperatura ambiente se eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente Se antildeadieron 2
microL de agente de contraste solucioacuten tampoacuten 1 de acetato de uranilo (UO2middot (CH3COO)2middot2H2O)
(Merck Alemania) Se dejoacute actuar el colorante durante 2 min a temperatura ambiente y se
eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente y despueacutes se dejoacute el disco alrededor de 5
min a temperatura ambiente antes de observar en el microscopio
D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa
(DEM)
La microscopiacutea oacuteptica es el meacutetodo adecuado para la investigacioacuten de procesos celulares
ya que es menos agresivo para el manejo de la muestra Existen teacutecnicas de microscopiacutea con
otras especificaciones donde se aplican para estudiar la adhesioacuten celular y formacioacuten de
biofilms en superficies tales como el espectrofotoacutemetro infrarrojo transformada de Fourier el
laacuteser confocal de barrido y la microscopiacutea de fuerza atoacutemica estos microscopios se
caracterizada por detectar las ceacutelulas viables de las dantildeadas por medio de cromoacuteforos
(Montantildeez et al 2012) La microscopiacutea que estamos trabajando esta basada en fluorescencia
la cual utiliza cromoacuteforos para detectar DNA de ceacutelulas vivas (coloracioacuten verde) y ceacutelulas
muertas (coloracioacuten roja) y ha tenido grandes avances en la observacioacuten de tejidos ceacutelulas
moleacuteculas individuales y por consiguiente algunos restos celulares todos estos con una
excelente resolucioacuten (Pellegrotti et al 2014)
Para la observacioacuten de ceacutelulas mediante el DEM se utilizoacute el kit comercial de viabilidad Bac
Light (LIVEDEAD Bacterial Viability Kit L-13152 Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE
UU) que estaacute compuesto por dos colorantes fluorescentes de aacutecidos nucleicos (SYTOreg9 y
PISYTOreg9) que penetran tanto en las membranas intactas como en las lesionadas lo que
permite evaluar la vitalidad de las ceacutelulas bacterianas basaacutendose en la deteccioacuten de la
actividad de las oxidasas y reductasas bacterianas Se observa una sentildeal fluorescente
mejorada en ceacutelulas bacterianas con procesos metaboacutelicos activos En contraste PISYTOreg9
se manifiesta soacutelo en las ceacutelulas que presentan membranas lesionadas y desplaza el colorante
SYTOreg9 por la transferencia de energiacutea de la resonancia fluorescente Cuando se aplican
estos dos colorantes en proporcioacuten adecuada las ceacutelulas viables con membranas intactas
presentaraacuten fluorescencia verde y en contraste las ceacutelulas muertas o lesionadas tendraacuten
Materiales y meacutetodos
65
coloracioacuten roja (Berney et al 2007)
A continuacioacuten se describe la preparacioacuten de las muestras para ser observadas por el DEM
Se colocaron 2 microL de la concentracioacuten suspensioacuten de la muestra con fagos en una
concentracioacuten de 1x1012 UFCmL sobre un disco de acero inoxidable (tipo 14301 (2 cm de
diaacutemetro y 1 mm de grosor) ligeramente convexos con una altura maacutexima en el centro
de 1 mm
Se dejoacute secar a temperatura ambiente por espacio de 10 min
Posteriormente se aplicaron 2 microL de la solucioacuten vital de fluorescencia (LIVEDEAD Bac
Light Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE UU) que reacciona y da la coloracioacuten
al material geneacutetico de las bacterias
Para la observacioacuten de los discos se utilizoacute el microscopio de fluorescencia Olympus
BX51BX52 (Tokio Japoacuten) con caacutemara digital incorporada (DP 50 Olympus) equipado con
laacutempara de mercurio de 100 W (USH-103 OL Olympus) con filtro de doble paso (U-M51004
FR V2 Olympus)
Para enumerar las ceacutelulas bacterianas en el biofilm que se formo en los discos de
acero inoxidable se trabajoacute con un objetivo de 20X y se ubicaban 10 campos
aleatoriamente y los resultados se expresaron por cm2 Las imaacutegenes se revisaron con el
sistema de anaacutelisis de imagen (anaacutelisis 32 soft Imaging System GMBH Alemania)
El biofilm bacteriano se desarrolloacute en la superficie de discos de acero inoxidable tipo
14301 Antes de usarse deben limpiarse bien por inmersioacuten en una solucioacuten acuosa de
detergente (DINO-dis-Dipol Espantildea) al 5 en agua durante 1 h despueacutes se realizoacute la
inmersioacuten en bantildeo con alcohol isopropiacutelico (2-propanol) (Merck Alemania) al 70 en agua
durante 15 min Una vez secos se esterilizaron en autoclave a 121degC por 15 min
D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM
Se inocularon la superficie de los discos con 50 microL de cultivo de S enterica maacutes medio de
cultivo (TSB) para proporcionar en medio rico para que se forme el biofilm posteriormente se
colocaron en cajas de Petri esteacuteriles y se mantuvieron en condiciones de humedad a
temperatura ambiente durante periacuteodos de 24 48 y 72h realizaacutendoles el conteo
correspondiente para verificar el desarrollo del biofilm
Materiales y meacutetodos
66
Una vez formado el biofilm se inocularon los discos con 3 concentraciones diferentes de
fagos 6 7 y 8 logcm2 en un volumen inferior a 50 microL Las diluciones del fago se hicieron en
solucioacuten salina fisioloacutegica (SSF cloruro de sodio 080) (Merck Alemania) Se realizoacute la
infeccioacuten al inocular a los discos prueba y los discos de control con el mismo volumen de SSF
las condiciones de incubacioacuten se realizaron con humedad y a temperatura ambiente
Los discos de acero inoxidable que fueron inoculados con la infeccioacuten fago-bacteria se
analizaron en periacuteodos de 0 2 8 24 y 48 h Se utilizaron para la valoracioacuten de bacterias y
fagos y se distribuyeron los discos de la siguiente manera 2 para visualizacioacuten microscoacutepica
panoraacutemica 2 para recuento bacteriano por microscopiacutea y 2 para recuento bacteriano dando
un total de 6 discos por caja de Petri por duplicado y por cada concentracioacuten (3) por cada
ensayo (3) y por horarios (5) de dando un total de 540 discos
Para el conteo sobre cada disco se colocaron 20 microL del colorante (LIVEDEAD Pribes) y
se incubaron por 5 min a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad y se tomaron
fotografiacuteas a 10X 20X y 40X Para la microscopiacutea de conteo las fotografiacuteas se realizaron a
un aumento de 40X considerando 10 campos aleatorios
Cuando se formoacute el biofilm se requirioacute hacer los recuentos de bacterias y de fagos en ese
sentido para recuperar las bacterias los discos se colocaron en un frasco con 5 mL de TSB
con Tween 80 (TSBTW) (Merck Alemania) y 3 g de perlas de vidrio se homogeneizoacute la
muestra por 1 min en agitador voacutertex a maacutexima potencia para favorecer el desprendimiento
de los microorganismos y posteriormente se realizaron diluciones seriadas De este mismo
extracto se obtuvo el material necesario para hacer el conteo de fagos utilizando la teacutecnica de
ADC Y para el recuento de las bacterias viables se trabajoacute con cajas de Petri se sembroacute 1
mL en TSA con 06 de extracto de levadura (TSAYE Merck Alemania) y se incuboacute a 37degC
durante 24h (Fuster-Valls et al 2008)
67
V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Resultados y discusioacuten
68
Resultados y discusioacuten
69
A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras
De los 10 sitios de recoleccioacuten se lograron obtener un total de 39 muestras en junio de
2007 En la tabla 9 se presentan los sitios y el nuacutemero de muestras recogidas en cada sitio
En el caso del Riacuteo Santa Catarina se abarcoacute una distancia de 95 km la cual presentaba
diferentes zonas de descarga de aguas residuales y de ahiacute se hicieron las tomas en un periacuteodo
de estiaje En el caso de las lagunas de oxidacioacuten del municipio de Mariacuten esta zona presenta
tres lagunas con un aacuterea total de 16700 m2 se realizoacute el muestreo de manera aleatoria En
cuanto a las muestras que se obtuvieron en el sitio de comercializar carne de pollo se les tratoacute
de igual manera para comprobar si existiacutean fagos
Los lugares elegidos para la recoleccioacuten de muestras son similares a los reportados en la
literatura regularmente para el aislamiento de fagos del ambiente se utilizan aguas residuales
y establecimientos de manipulacioacuten yo venta de alimentos (Leeuw et al 2017) En
investigaciones previas se realizan muestreos de diversos sitios como en la piel y heces de
animales manos de los cuidadores superficies quiruacutergicas e instrumentos o utensilios usados
en los establecimientos hoteles y restaurantes (Ejo et al 2016 Yergeau et al 2016) Los
muestreos de aguas tambieacuten se pueden realizar en sitios cercanos a las salidas de drenaje
de hospitales esto es de gran importancia ya que donde hay bacterias posiblemente esteacuten
sus respectivos fagos (Tomat et al 2014 Mattila et al 2015 McShan y Nguyen 2016)
Resultados y discusioacuten
70
Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos
B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis
Para el aislamiento de los fagos especiacuteficos de Salmonella fue necesario la puesta a punto
de varios procedimientos la teacutecnica de agar doble capa (ADC) determinar la cineacutetica de
crecimiento de cultivos de Salmonella determinar la fase de eclipse en la relacioacuten fago-
bacteria (se utilizoacute como control la cepa S Typhimurium y el fago PRD1) y su puesta a punto
en el laboratorio de bioremediacioacuten de la Facultad de Agronomiacutea de la UANL
B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S
Typhimurium
La accioacuten liacutetica de los fagos sobre Salmonella se analizoacute utilizando la teacutecnica ADC
En este procedimiento es necesario tener un ceacutesped bacteriano uniforme entre dos capas
de medio soacutelido que puede ser agar-agar o agar-agarosa (Sambrook y Rusell 2001)
Con el objetivo de abaratar los costes y mejorar los resultados en este trabajo se empleoacute
esta teacutecnica con algunas modificaciones que se describen a continuacioacuten Asiacute pues se decidioacute
que las capas fueran agar-agar donde la primera capa fue de agar al 15 en medio TS y la
Municipio Sitio de la toma N de muestras
Tipo de agua
Monterrey
Parque Fundidora 3 Estanque y corriente
Riacuteo Santa Catarina 10 Corriente
Establecimiento de comida 2 Lavado del pollo
Av Conductores 2 Corriente
Mariacuten
Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal
10 Estanque y corriente
Riacuteo La Libertad 2 Corriente
Guadalupe
Alcantarillas de la colonia La Azteca
3 Corriente
Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados
2 Lavado del pollo
San Nicolaacutes de los Garza
Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac
2 Corriente
Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea 3 Corriente
Resultados y discusioacuten
71
segunda con agar a una menor concentracioacuten para hacer la capa menos firme por lo que fue
necesario poner a punto la teacutecnica probando diferentes concentraciones de agar en ambos
casos a pH 72 Ademaacutes esta adecuacioacuten es importante por el ahorro que se generoacute al utilizar
un componente maacutes econoacutemico que la agarosa lo cual repercutioacute favorablemente en el coste
de la prueba
Otra variable para poner a punto en la teacutecnica de ADC es el volumen de cultivo bacteriano
a utilizar para generar el ceacutesped de Salmonella y lograr una adecuada interaccioacuten con el fago
Se probaron 3 voluacutemenes diferentes de cultivo de S Typhimurium incubados 24 horas a 37oC
para alcanzar una concentracioacuten de 16 x 108 UFCmL Dependiendo de la cantidad de inoacuteculo
las caracteriacutesticas del ceacutesped bacteriano tienen diferente contraste lo cual puede facilitar o
dificultar la observacioacuten de las placas liacuteticas Finalmente el mejor resultado se obtuvo al
utilizar el volumen de 500 L ya que se logroacute una mejor observacioacuten del aclaramiento del
ceacutesped bacteriano al formar las placas liacuteticas En la tabla 10 se muestran las caracteriacutesticas
de las capas en la caja Petri para un buen manejo y desarrollo de la zona liacutetica producida por
el fago al multiplicarse
Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC
Paraacutemetro Condiciones
Agar suave (con agar) () 08
Temperatura del agar suave (degC) 49
pH del medio de cultivo (soacutelido y liacutequido) 72
Cantidad de agar suave (mL) 45
Cultivo bacteriano (microL) 500
Muestra tratada con fagos (microL) 100
Resultados y discusioacuten
72
B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium
El cultivo hueacutesped debe de encontrarse creciendo en medio liacutequido TS en fase logariacutetmica
al momento de mezclarlo con el fago Para identificar la fase logariacutetmica se probaron
diferentes tiempos de crecimiento Con todo ello se observa que la fase logariacutetmica de S
Typhimurium se encuentra en el minuto 150 coincidiendo con los datos reportados por
Vidales-Contreras et al (2006) Y siguiendo con mi tesis la determinacioacuten de la concentracioacuten
se realizoacute mediante el promedio de la enumeracioacuten de las UFC por placas Petri preparadas
por duplicado multiplicado por el factor de dilucioacuten el cual es el reciacuteproco del producto del
volumen ensayado y la dilucioacuten usada para el anaacutelisis Al final se observa cuando se ha
llegado a la fase estacionaria del desarrollo bacteriano (tabla 11) Se utiliza un factor de
dilucioacuten el cual se obtiene como el reciacuteproco de la multiplicacioacuten de volumen de ensayo y la
dilucioacuten usada en el anaacutelisis
Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium
Tiempo Minutos
(Acumulado) Dilucioacuten
UFCmL Promedio
F (Factor) Concentracioacuten
(UFCmL)
T0 0 1 x 10-5 9 plusmn 25 1 x 106 900 x 106
T1 30 1 x 10-5 13 plusmn 74 1 x 106 130 x 107
T2 60 1 x 10-5 24 plusmn 56 1 x 106 240 x 107
T3 90 1 x 10-5 51 plusmn 32 1 x 106 510 x 107
T4 123 1 x 10-5 211 plusmn 89 1 x 106 211 x 108
T5 150 1 x 10-6 215 plusmn 81 1 x 107 215 x 109
Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)
B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis
Las consideraciones tomadas del modelo infectivo S Typhimurium y el fago PRD1 y
utilizando la teacutecnica ADC se replican para poner a punto a la bacteria que se quiere probar
que en este caso es S Typhi ATCC 19430 Los resultados de estos ensayos se pueden
observar en la tabla 12 en la que se puede observar que es ligeramente mayor la etapa donde
Resultados y discusioacuten
73
se puede realizar la infeccioacuten (fase de eclipse) de los fagos aislados y la bacteria hueacutesped
Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis (108 UFCmL) (37 ordmC24h)
Tiempo Minutos (Acumulado)
Dilucioacuten UFCmL Promedio
F (Factor) Concentracioacuten (UFCmL)
T0 0 1 x 10-5 216 710 1 x 106 20 x 107
T1 60 1 x 10-5 260 608 1 x 106 20 x 107
T2 120 1 x 10-6 160 173 1 x 107 16 x 108
T3 180 1 x 10-6 244 208 1 x 107 24 x 108
T4 240 1 x 10-7 400 100 1 x 107 40 x 109
Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)
B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis
De los sitios muestreados se logro obtener 39 muestras y se obtuvo un total de 15 fagos
aislados a partir de dos fuentes de aguas residuales las del Riacuteo Santa Catarina y las lagunas
de oxidacioacuten de Mariacuten Los 15 fagos se nombraron consecutivamente como MRH 1-15 Los
15 fagos se probaron contra la cepa hueacutesped S Enteritidis (CINSP tabla 4) tras realizar de
3 a 4 amplificaciones la mayoriacutea (14 fagos) no presentoacute actividad liacutetica (formacioacuten de halos
de inhibicioacuten) de manera que fueron descartados para los siguientes estudios siendo
solamente uno proveniente de la muestra del Rio Santa Catarina el que produjo halos bien
definidos en el ceacutesped bacteriano y con eacuteste se continuoacute trabajando El fago que mantuvo la
actividad liacutetica fue el MRH6 Se propuso nombrarle como MRH considerando la M para
muestra la RH por el Rodrigo Hernaacutendez
B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten
La principal caracteriacutestica de los fagos es cuando forman halos de inhibicioacuten (tambieacuten
llamadas zonas liacuteticas o calvas) y en nuestro estudio las muestras de agua recolectadas
fueron tratadas y analizadas mediante la teacutecnica ADC observando los halos de inhibicioacuten
claros y de diferentes diaacutemetros estas observaciones son similares a las observadas por
Ackermann (2003) Tanto la cantidad de UFP que se pueden desarrollar y observar hecha por
Resultados y discusioacuten
74
los fagos y la pureza en que encuentren los bacterioacutefagos de las muestras obtenidas del medio
ambiente estaacuten directamente relacionadas la especificidad contra la bacteria Al sembrar por
vaciado en placa estos lisados sobre la cepa indicadora se obtuvieron diferentes tamantildeos de
placas liacuteticas
En la figura 8 se muestran los halos de inhibicioacuten en ceacutesped de Salmonella al realizar la
infeccioacuten se pueden observar los diferentes tamantildeos y la forma se da por la capacidad de
raacutefaga (nuacutemero de copias al realizar el proceso liacutetico) de los fagos de la progenie los fagos
suelen tener una raacutefaga de maacutes de 100 partiacuteculas infectivas producidas en un lapso de tiempo
de 05 ndash 20 h Algunos halos formados por el fago fueron claros lo que indica que es liacutetico de
acuerdo con diversos autores (Sambrook y Rusell 2001 Vidales-Contreras et al 2006 Wong
et al 2014) En nuestro estudio se batalloacute en encontrar fagos a pesar de buscar sitios
sentildealados por autores antes mencionados
Al intentar obtener fagos puede suceder que se encuentren en concentraciones tan
pequentildeas que al probarlos contra alguna cepa hueacutesped no sirven para trabajar por lo que se
llevoacute a cabo repeticiones seriadas (amplificacioacuten) asegurando que al formar una placa de Petri
en ADC con tamantildeos de los halos de inhibicioacuten iguales lo que nos indica que pertenecen a
una sola especie de fago
Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por fagos con halos de inihibicioacuten de
diferentes tamantildeos
Resultados y discusioacuten
75
C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli
La clasificacioacuten de los fagos se puede establer en base a su morfologiacutea al aacutecido nucleico
al espectro de accioacuten y algunas consideraciones inmunoloacutegicas (Criscuolo et al 2017) Al
realizar la infeccioacuten de fago-bacteria y observar la presencia de halos liacuteticos en las placas de
ceacutesped bacteriano se considera que se ha producido una infeccioacuten exitosa pero previamente
es necesario poner a punto el cultivo puro de ambos cultivos y considerar la concentracioacuten de
cultivos a utilizar
Al seleccionar los fagos que presentaron uniformidad en cuanto a la inhibicioacuten y posterior
evaluacioacuten de los fagos se consideraron varios factores entre ellos el tiempo que tarda la
replicacioacuten viral (lo cual es variable) siendo que en algunos casos se pueden replicar en
cuestioacuten de minutos A simple vista se pueden observar la formacioacuten de halos de lisis en el
ceacutesped bacteriano en las cajas de Petri
Asiacute pues la teacutecnica ADC se repitioacute varias veces hasta obtener placas liacuteticas con ideacutentica
morfologiacutea y tamantildeo En la tabla 13 se observa que hay diferentes tamantildeos de halos En los
primeros ensayos soacutelo cuatro muestras de agua (15 21 26 y 33) dieron halos de inhibicioacuten
pudieacutendose distinguir bien la forma y el tamantildeo Al realizar posteriores siembras los fagos
fueron perdiendo capacidad de infeccioacuten (fagos atemperados) y soacutelo la muestra 21 de las
lagunas de oxidacioacuten provenientes de Mariacuten presentoacute fagos con actividad liacutetica y el resto de
fagos no desarrolloacute actividad constante
Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten de S Enteritidis en ceacutesped
bacteriano
Diaacutemetro de halo grande ge 8mm mediano 8 lt X lt6mm pequentildeo le 5mm
Distribucioacuten de tamantildeos de halo
Muestra de agua Grande Mediano Pequentildeo
15 8 23 15
21 17 11 27
26 10 18 6
33 7 9 13
Diaacutemetro medio halo (mm) 1055 0671 0376
Resultados y discusioacuten
76
En la tabla 14 se presenta el listado de posibles hueacutespedes probados 12 cepas de
Salmonella y 4 de E coli que se probaron contra los 15 fagos aislados previamente Se puede
distinguir que afecta a algunas serovariedades de Salmonella y no tiene efecto en otras
serovariedades entericas No afecta nada a las cepas de E coli Se ve que la cepa maacutes
afectada por el fago es la S Typhi ATCC 19430 y otras cepas de Salmonella son afectadas
ligeramente
Resultados y discusioacuten
77
Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades de Salmonella spp y de E coli
serovariedades Fagos
M
R
H
1
M
R
H
2
M
R
H
3
M
R
H
4
M
R
H
5
M
R
H
6
M
R
H
7
M
R
H
8
M
R
H
9
M
R
H
1
0
M
R
H
1
1
M
R
H
1
2
M
R
H
1
3
M
R
H
1
4
MR
H15
S Typhimurium ATCC 13311
-
-
t
- -
t
- - - - - - - - -
S Paratyphi ATCC 9150 - - - - - - - - - - - - - - -
S Enteritidis ATCC 13076 - - - - - - - - - - - - - - -
S Typhi ATCC 19430 + + + + + t
c
+ + + n
d
n
d
n
d
n
d
nd +
S Typhimurium - - - - - - - - - - - - - - -
S Bongori ATCC 43975 - - - - - - - - - - - - - - -
S enterica LT2 - - - + + + - - - - - - - -
S sub enterica CECT 4138 - - - - + + + - - - - - - - -
S sub enterica CECT 4594
t
t
t
- + + + - - -
t
- - - -
S sub enterica CECT 409 - - - - n
d
- -
t
- - - - - - -
S sub enterica CECT 698 - - - - - t
c
- - - - - - - - -
S Typhimurium CCUG
29478
- - - + + - - - - - - - -
E coli CECT 515 - - - - - - - - - - - - - - -
E coli K12 - - - - - - - - - - - - - - -
E coli ATCC 10536 - - - - - - - - - - - - - -
E coli O157H7 CECT 4783 - - - - - - - - - - - - - - -
+ crecimiento y desarrollo de halo indica desarrollo muy pequentildeo o difuso del halo t indica desarrollo pequentildeo y turbio del halo tc indica turbio o con centro opaco en el centro del halo - no crecimiento o desarrollo de halo nd aparente baja efectividad o halo difuso
Resultados y discusioacuten
78
Resultados y discusioacuten
79
El fago que siacute mostroacute actividad (MRH6) y que mantuvo la capacidad liacutetica durante las
diferentes amplificaciones se trabajoacute de manera continua hasta obtener halos uniformes en el
tamantildeo y asiacute ya se considera como una entidad pura de fago Los resultados obtenidos en
este trabajo son semejantes a los mostrados por Thung et al (2017) En la figura 9 se
presentan las imaacutegenes donde se muestra el desarrollo de halos liacuteticos previamente
mencionados donde se puede observar los halos uniformes contra A) S Enteritidis (CINSP)
y B) S Typhi ATCC 19430 (UAB)
Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria A) S Enteritidis (CINSP) y B) S Typhi ATCC 19430
La especificidad de los fagos se encuentra generalmente a nivel de cepa y tambieacuten de
especie y maacutes raramente a nivel de geacutenero Es de intereacutes el garantizar una eficiente infeccioacuten
de la dupla fago-bacteria de esta manera se toman todas las medidas precautorias para
obtener resultados fiables en este sentido se requiere verificar todos los aspectos como son
los controles (positivo y negativo) En el caso del control negativo se verificoacute el desarrollo
solamente del ceacutesped bacteriano de la cepa hueacutesped con la teacutecnica ADC y como control
positivo se consideroacute el modelo del fago PRD 1 y S Typhimurium los fagos son altamente
especiacuteficos (no afecta a otros cultivos bacterianos) y no se puede descartar falsos positivos
por la presencia de restos celulares bacterianos (Segundo et al 2010 Szafranski et al 2017)
Resultados y discusioacuten
80
D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM
El ICTV clasifica a los fagos en 1 orden13 familias y 31 geacuteneros De los cuales se
observa al orden de los Caudovirales el cual comprende a la mayor parte de los fagos (en
torno a un 95)y estos estaacuten constituidos por 3 familias con cola Myoviridae Podoviridae
y Siphoviridae Con estas caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas mediante el TEM en la
figura 10 se presentan las imaacutegenes del fago MRH6
El anaacutelisis de una suspensioacuten de fagos con una concentracioacuten de 1x1012 UFPmL mediante
microscopiacutea electroacutenica muestra una distintiva morfologiacutea de cabeza icosaeacutedrica estructura
alargada y cola no contraacutectil La caacutepside tiene un diaacutemetro de 55-60 nm y la cola puede
alcanzar los 570 nm Estas caracteriacutesticas se corresponden con la familia Siphoviridae Yang
et al (2017) comentan que esta familia de fagos se encuentra frecuentemente en
enterobacterias
Figura 10 Imagen por TEM del fago MRH6 (X100 000) la barra representa 100nm (Servicio de Microscopiacutea UAB)
Resultados y discusioacuten
81
D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero
inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de
epifluorescencia directa (DEM)
Para corroborar la potencial condicioacuten como agente de desinfeccioacuten del fago MRH6 es
necesario observar su efectividad a traveacutes de la DEM con la que se pueden observar
bacterias viables y no viables Tambieacuten la materia orgaacutenica puede dar falsos positivos y se
debe tener en cuenta al comparar con otros meacutetodos de conteo (Montantildeez et al 2012)
En este trabajo S Typhi ATCC 19430 desarrolloacute biofilms en las superficies de acero
inoxidable (discos tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm) y consiguieron
niveles de 29 plusmn 02 UFCcm2 despueacutes de tener un maacuteximo de 72 h en incubacioacuten en
condiciones de humedad y temperatura ambiente tal como se puede observar en la figura 11
Estos biofilms tienen distinta intensidad seguacuten el tiempo de incubacioacuten siendo los periodos
evaluados de 24 48 y 72h respectivamente En estas condiciones se realizoacute el recuento en
tres zonas de cada disco para cada tiempo de incubacioacuten y los resultados se presentan en la
figura 12 Para tener fiabilidad de los resultados se realizaron los conteos por triplicado porque
el manejo de los discos es muy complejo y para evitar errores de manejo se consideroacute
necesario tener maacutes de una muestra otorgando ademaacutes la oportunidad de comparar
resultados y tener un margen de referencia en cuanto a los resultados obtenidos
Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 en
diferentes tiempos de incubacioacuten (24 48 y 72h) a temperatura ambiente
Resultados y discusioacuten
82
Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable incubados a temperatura ambiente n = 3
En este estudio se compararon 2 meacutetodos de conteo de bacterias despueacutes de ser atacadas
por los fagos eacutestos fueron el recuento en placa de agar y por otro lado la observacioacuten por
microscopiacutea de epifluorescencia y la relacioacuten entre ambos meacutetodos Desafortunadamente se
han perdido los resultados por un problema irresoluble pero si se puede comentar que existe
una relacioacuten ligeramente inferior a 09 (R2 ) Esta observacioacuten ya ha sido presentada
anteriormente por otros autores (Fuster-Valls et al 2008 Engelhardt et al 2014)
El cultivo bacteriano se puede contabilizar por conteo en placa directo (TSA) este meacutetodo
es utilizado generalmente para cultivos de geacutermenes no exigentes o moderadamente
exigentes y cuando se quiere visualizar como afecta el ataque de los fagos las ceacutelulas
bacterianas se visualizan por DEM (cuya coloracioacuten cambia a verde cuando han sido atacadas
por los fagos) y una forma de visualizar este ataque es por medio de TSA con la teacutecnica de
ADC
0
5
10
15
20
25
0 10 20 30 40 50 60
Co
nte
o (
Lo
g U
FC
cm
2)
Tiempo (h)
Crecimiento bacteriano
Resultados y discusioacuten
83
D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable
Se aplicoacute la DEM para evaluar la efectividad del fago MRH6 en el control de S Typhi ATCC
19430 sobre superficies de acero inoxidable en condiciones de humedad El fago MRH6 es
liacutetico capaz de disgregar los biofilms
El analizar la accioacuten liacutetica del fago sobre Salmonella por medio del DEM es muy importante
e innovador pero el material que se utiliza y la manera en que se comportan las diferentes
bacterias hacen que se deba ser muy precavido al considerar el uso de este meacutetodo como
adecuado para realizar conteos (Libuchi et al 2010) Por ejemplo se debe tener en cuenta
que existen bacterias que no forman un biofilm y presentan movimiento esto puede llegar a
complicar el visualizarlas si no estaacuten en el campo por lo que se podriacutea pensar que fueron
atacadas y eliminadas por los fagos o bien que por los diferentes lavados se barrieron
La DEM con la tincioacuten LIVEDEAD reveloacute la presencia de ceacutelulas viables con coloracioacuten
verde En la figura 13 se puede observar el efecto letal del fago MRH6 sobre la poblacioacuten de
S enteacuterica disminuyendo su cantidad considerablemente en base a el tiempo de incubacioacuten
en color verde Se observa que hay disminucioacuten de las ceacutelulas de S Typhi ATCC 19430 al ser
atacadas por el fago MRH6 Recordemos que la infeccioacuten con el MRH6 se realizoacute despueacutes de
formar un biofilm a temperatura ambiente y con humedad por espacio de 72h en 3
concentraciones 6 7 y 8 UFPmL Al paso del tiempo se aprecia que a las 48h hay pocas
ceacutelulas vivas al menos detectadas por la teacutecnica utilizada
Resultados y discusioacuten
84
a)
b)
c)
Figura 13 Secuencia de imaacutegenes de epifluorescencia que ilustran la destruccioacuten de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable causada por el fago MRH6 tras incubacioacuten de 0 8 24 y 48 h y con 3 concentraciones de fagos a) 6 b) 7 y c) 8 UFPmL respectivamente
La DEM es un meacutetodo altamente sensible que se caracteriza por la formacioacuten de imaacutegenes
amplificadas y es considerada una teacutecnica poderosa con altos niveles de sensibilidad y
resolucioacuten Tomando como referencia los resultados se considera que la DEM es una
herramienta eficaz para el conteo bacteriano pero hay que considerar la experiencia del
observador
Resultados y discusioacuten
85
En algunas ocasiones al observar las bacterias atacadas por los fago se pueden encontrar
muestras con material geneacutetico mezclado con restos celulares esta situacioacuten hace que
algunos investigadores recomienden extraer los fagos de la muestra antes de sembrar las
bacterias con el fin de determinar la reduccioacuten bacteriana uacutenicamente debida a la actividad
virulenta del fago sobre la muestra y no a la infeccioacuten por fagos libres presentes en el agar
(Sharma et al 2009) En ese sentido tal como reporta Fuster-Valls et al (2008) en su trabajo
observoacute que el limite de deteccioacuten de esta teacutecnica es de 279 log10 celulas por cm2 en cambio
en nuestro trabajo y tal como se observa en la figura 14 se pudo llegar a una sensibilidad
muy proacutexima a 2 y que coincide con las imaacutegenes de la figura 13 en las que a las 24 y 48
horas apenas se observan algunas manchas que corresponden al crecimiento bacteriano
Los fagos utilizan los recursos de la ceacutelula para hacer muchos fagos nuevos lo que causa
que la ceacutelula lise (estalle) y muera en el proceso La lisis en las uacuteltimas etapas del ciclo liacutetico
el fago expresa los genes para las proteiacutenas que hacen agujeros en la membrana plasmaacutetica
y la pared celular En la figura 14 se puede observar como el recuento de Salmonella Typhi
ATCC 19430 disminuye por el ataque del fago MRH6 El efecto del fago es muy fuerte y al
final los conteos son muy parecidos
Resultados y discusioacuten
86
Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 en superficies de acero inoxidable por el fago MRH6 con diferentes concentraciones y hasta 48 h de incubacioacuten
En este trabajo se buscoacute crear condiciones de infeccioacuten fago-bacteria en el laboratorio
como las que se pudieran presentar en la industria Los resultados de esta relacioacuten del fago
MRH6 y S Typhi ATCC 19430 muestran que la aplicacioacuten del fago es efectiva pero hay que
considerar que funciona mejor a altos tiacutetulos (108 UFCmL) y que deberaacute de potenciarse
cuando se trate de un coctel de fagos
Nuestros resultados sugieren que los fagos pueden ser utilizados como un meacutetodo para
controlar un biofilm formado por un bacteria especiacutefica
Al realizar la buacutesqueda de informacioacuten en diferentes motores de buacutesqueda una de las
plataformas de libre acceso (Pubmed) se obtuvo una relacioacuten de 5 en publicaciones de
00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Salm
on
ella
Typ
hi
AT
CC
19430
(lo
g1
0ceacutelu
las cm
2)
Tiempo (h)
Fago MRH6 a 6 Logml Fago MRH6 a 7 Logml Fago MRH6 a 8 Logml Control sin fago
Resultados y discusioacuten
87
fagos contra diferentes serovariedades de Salmonella spp lo que se puede traducir en que
hay un aacuterea de oportunidad latente
Las consideraciones que se enviacutean como propuesta es que existen en estos momentos
muchos trabajos sobre fagos pero aquiacute en Meacutexico no hay trabajos reportados y los que
existen estaacuten apenas en fases iniciales
Existe un enorme potencial de trabajo en esta aacuterea con los fagos tal es el caso de la
fagoterapia en otros sitos y en otros tiempos estaacuten realizando experimentos para ser
explotada como alternativa para todos los aacutembitos desde hogares industria salud animales
vegetales etc Por lo menos en EE UU tienen grandes avances en estudios relacionados
con la aplicacioacuten en bacterias multiresistentes que por el uso de antibioacuteticos han mutado esto
en el sector salud donde se estaacute perdiendo la batalla
Una de las fortalezas de estudiar a los fagos es que antes de que los antibioacuteticos fueran
descubiertos habiacutea investigacioacuten considerable sobre los fagos como tratamiento para las
enfermedades bacterianas humanas por lo menos en parte de Europa La aplcacion de los
fagos es potencialmente son buenos candidatos para tratar enfermedades bacterianas en
seres humanos inocuidad aliemnaria bioremediacioacuten y cada regioacuten tiene fagos endeacutemicos y
este tabajo representa de los primeros en llevarse en Monterrey
Ciertas limitaciones de los resultados se debiooacute a las condiciones que se presentaron al
realizar el estudio (laboratorio equipo conocimiento del tema) solamente se pudo aislar un
fago y lo recomendable es que sean varios fagos dado que son muy especiacuteficos de especie
o hasta de cepa Se proboacute su accioacuten sobre superficies con un solo cultivo bacteriano y en la
realidad las superficies se contaminan con diferentes bacterias
Lo que se vizualiza para nuestro estudio es sugerir varias liacuteneas de accioacuten a futuro Por
ejemplo el fago aislado podriacutea probarse in vivo sobre carne de pollo o fagoterapia tambieacuten
podriacutea continuar los estudios para aislar maacutes fagos y hacer mezclas (coacutecteles) que tuvieran
un mayor rango de actividad y combatir a diversas especies de Salmonella Con respecto al
tratamiento de superficies podriacutean utilizarse coacutecteles de fagos para tratar biofilms bacterianos
formados por maacutes de dos especies o inclusive podriacutean probarse en biopeliacuteculas industriales
reales
Resultados y discusioacuten
88
89
VI CONCLUSIONES
90
Conclusiones
91
De las 39 muestras de agua analizadas se aislaron tentativamente15 fagos de los que soacutelo 4
mantuvieron en un primer momento su actividad liacutetica estos fagos se correspondieron con las
muestras de agua 15 21 26 y 33 Se siguioacute trabajando con ellos y finalmente solo uno de
ellos el MRH6 mantuvo su actividad liacutetica despueacutes de varias amplificaciones este fago se
aisloacute de las aguas residuales de Mariacuten
Se consiguioacute optimizar la teacutecnica ADC cambiando la agarosa que tiene un alto costo por
agar-agar maacutes econoacutemico sin alterar la fiabilidad de la teacutecnica ademaacutes con este cambio se
facilita el manejo
En relacioacuten con la especificidad de los 15 fagos aislados frente a las 16 cepas de
enterobacterias probadas (12 cepas de Salmonella spp y 4 de E coli) se observa ciertas
tendencias marcadas Ninguno de los fagos ataca a las cepas de E coli probadas En cuanto
a Salmonella se observa una fuerte especificidad frente a S Typhi (ATCC 19430) una ligera
actividad frente a varias cepas de S enterica y no hubo efecto contra las demaacutes cepas de
Salmonella ensayadas lo cual confirma la elevada especificidad fago-hueacutesped
Las imaacutegenes obtenidas mediante DEM muestran una morfologiacutea caracteriacutestica de cabeza
icosaeacutedrica estructura alargada y cola no contraacutectil que sugieren que el fago MRH6 se puede
clasificar en la familia Siphoviridae
Se observa un efecto liacutetico progresivo del fago MRH6 frente a biofilms de Salmonella en
discos de acero inoxidable llegando a valores miacutenimos inferiores a 102 a las 48 horas de
incubacioacuten para todas las concentraciones de fago utilizadas (6 a 8 UFPmL)
Se comprueba que la DEM es un buen meacutetodo para la cuantificacioacuten del crecimiento de S
Typhi (ATCC 19430) sobre discos de acero inoxidable con una gran sensibilidad y resolucioacuten
ya que se observaron claras diferencias en los diversos tiempos de incubacioacuten ensayados y
a diferentes concentraciones del fago MRH6 Esto confirma que la teacutecnica es una herramienta
eficaz para valorar el efecto liacutetico de los fagos sobre biofilms
Ya que en este trabajo solamente se obtuvo un fago liacutetico se sugiere reflexionar acerca de
los factores que han dificultado la obtencioacuten de un nuacutemero maacutes amplio de fagos
Conclusiones
92
Este trabajo refleja el gran intereacutes por iniciar o regresar a trabajar con fagos tal como esta
sucediendo en otras partes del mundo Hasta el momento hay muchas espectaivas sin
embargo todaviacutea se necesita investigacioacuten para saber queacute tan seguros son
93
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Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas Profesor titular de la Facultad de Salud Puacuteblica y
Nutricioacuten de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
HACE CONSTAR
Que la memoria titulada ldquoAislamiento y caracterizacioacuten parcial de bacterioacutefagos de
Salmonella spp con potencial aplicacioacuten en el biocontrol sobre superficiesrdquo presentada
por Rodrigo Hernaacutendez Santiago para optar al grado de doctor por la Universitat
Autogravenoma de Barcelona la cual ha sido realizada bajo su direccioacuten y cumple con los
requisitos para su defensa autoriza su presentacioacuten para que sea juzgada por la
comisioacuten correspondiente
Y para que conste a los efectos oportunos firma el presente certificado en Monterrey
NL a 21 de abril de 2019
Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas
Si no puedes volar corre
Si no puedes correr camina
Si no puedes caminar gatea
Pero hagas lo que hagas siempre sigue hacia adelante
Martin Luther King jr (1929-1968)
Agradecimientos
Este trabajo se ha realizado gracias a la financiacioacuten aportada por el Programa de
mejoramiento del profesorado (PROMEP) PROMEP1035062037 UANL-326 de la
Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) dentro del programa de becas para la
formacioacuten de investigadores y a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para
el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y de
Cooperacioacuten) Programa Extranjeros II-A convocatoria 2010-2011 0000521211
A la Dra Teresa de los Reyes Pla Soler por la confianza depositada en miacute y darme la
oportunidad de ser su estudiante sin sus consejos no hubiera sido posible concluir esta
tesis
Al Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas por ser un guiacutea durante mi formacioacuten como
investigadora por sus ensentildeanzas con palabras y el ejemplo y por su apoyo en el
aspecto profesional y personal
Al Dr Joseacute Juan Rodriacuteguez Jerez por su gran apoyo acadeacutemico y por permitirme
trabajar desinteresadamente en las instalaciones y con el equipo de laboratorio
A la Dra Manuela Hernaacutendez Herrero que es una gran persona que me ha apoyado
desde el peincipio de estos estudios
A la Dra Marta Capellas Puig que me ha alentado todo el tiempo para terminar de
buena manera
Dedicatorias
Con mucho carintildeo a mi Sentildeor padre Bartolomeacute Hernaacutendez Balbuena (dagger) y a mi Sentildeora
madre Lucia Santiago Santos son un ejemplo en mi vida ya que ellos son fundamentales
en mi formacioacuten como persona
A mis hermanos Flavio Viacutector Manuel Guadalupe Hilda (dagger) porque siempre
estuvieron alliacute alentaacutendome en este trabajo con palabras experiencias etc
A mi prometida y futura esposa Dontildea Rosa Salas Martiacutenez desde que inicmos a estar
juntos siempre estaacute apoyaacutendome en todos los aspectos y en todas las cosas que he
emprendido y que con algunas locuras que se nos pueda ocurrir mas adelante nos
llevaraacute a mejores cosas cada diacutea
A mi hija Gabriela Sarahi Hernaacutendez Flores ella es lo que maacutes aprecio y espero vea
en mi un ejemplo que sirva para alentarla a ser cada diacutea mejor y sacar todas las cosas
que se proponga adelante
A mis compantildeeros y amigos Vannesa Fabio Fontecha Abel Rita Jacira Kathy
Genaro Fabio Poliseli Dora Cecilia Diana Angela Sonia Dolors Marco y Cristina por
las convivencias durante mi estancia en Espantildea que de alliacute solo me llevo grandes
recuerdos
A mis compantildeeros Mirna Patty Letty Tere Adelita Luluacute Betty Marco Arnoldo Joseacute
Luis y Gustavo que compartimos buena cantidad de tiempo gracias por las convivencias
y por los muchos trabajos que hicimos en equipo
CONTENIDO RESUMEN 1
SUMMARY 3
RESUM 5
I INTRODUCCIOacuteN 7
Presentacioacuten del proyecto 9
Justificacioacuten 10
II ANTECEDENTES 13
A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos 15
A1 Problemaacutetica 16
A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea 17
B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria 19
B1 Escherichia 19
B2 Campylobacter 20
B3 Enterobacter 21
B4 Listeria 22
B5 Salmonella 23
B51 Origen 23
B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp 25
B53 Manifestaciones cliacutenicas 27
B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis 28
C Crecimiento microbiano 30
C1 Crecimiento de los microorganismos 30
C11 Disponibilidad del agua 31
C12 Acidez y pH 31
C13 Oxiacutegeno 31
C14 Temperatura 32
D Control del crecimiento microbiano 34
D1 Agentes fiacutesicos 34
D2 Agentes quiacutemicos 35
E Fagos 35
E1 Antecedentes 35
E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos 37
E3 Clasificacioacuten de los fagos 37
E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico 39
E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten 39
F Biofilm 40
G Microscopiacutea electroacutenica 41
H Fagoterapia 42
III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 47
A Objetivo general 49
B Objetivos especiacuteficos 49
C Plan de trabajo 49
IV MATERIALES Y MEacuteTODOS 51
A Toma de muestras 53
B Obtencioacuten de fagos 54
B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55
B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55
B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas 56
B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos 56
B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC) 58
B6 Modelo de infeccioacuten 59
B7 Controles utilizados durante los ensayos 60
B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium 60
C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos 61
D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica 63
D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 64
D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM 65
V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 67
A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras 69
B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis 70
B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S Typhimurium 70
B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium 72
B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis 72
B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis 73
B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten 73
C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli 75
D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM 80
D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 81
D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable 83
VI CONCLUSIONES 89
VII BIBLIOGRAFIacuteA 93
Iacutendice de figuras
Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa 16
Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por Salmonella spp 24
Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella 24
Figura 4 Adsorcioacuten del bacterioacutefago T4 e inyeccioacuten del ADN 39
Figura 5 Diagrama general de trabajo 50
Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten bacterioacutefago-hueacutesped 59
Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten 62
Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por bacterioacutefagos 74
Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria 79
Figura 10 Imagen por TEM del bacterioacutefago MRH6 80
Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 81
Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable 82
Figura 13 Secuencia de imaacutegenes del DEM 84
Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 por el fago MRH6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86
Iacutendice de tablas
Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias 19
Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos 25
Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales 33
Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos 38
Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos 44
Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria 45
Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos 54
Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten 57
Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos 70
Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC 71
Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium 72
Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis 73
Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten 75
Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades 77
Lista de abreviaturas y acroacutenimos
ADN Aacutecido desoxirribonucleico
ARN Aacutecido ribonucleico
ADC Agar doble capa
AS Agar suave
AECID Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el
Desarrollo
ATCC American Type Culture Collection
APPCC Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control
aw Actividad del agua
BGA Agar verde brillante
BHI Infusioacuten cerebro corazoacuten
CCUG Culture Collection University of Goumltenborg
CENAVECE Centro Nacional de Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de
Enfermedades
CETC Coleccioacuten Espantildeola de Cultivos Tipo
CINSP Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica
EDTA Etilendiaminotetraceacutetico
DEM Microscoacutepica de epifluorescencia directa
EE UU Estados Unidos de Norteameacuterica
ETA Enfermedades transmitidas por alimentos
FAO Food and Agriculture Organization (Organizacioacuten de las
Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura)
FaSPyN Facultad de Salud Puacuteblica y Nutricioacuten UANL
FAUANL Facultad de Agronomiacutea UANL Unidad Mariacuten NL
FCB Facultad de Ciencias Bioloacutegicas UANL
HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points (Anaacutelisis de
Peligros y Puntos Criacuteticos de Control)
INEGI Instituto Nacional de Estadiacutestica y Geografiacutea de los Estados
Unidos Mexicanos
nd Aparente baja efectividad o halo difuso
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
PANALIMENTOS Instituto Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y
Zoonosis
PEG Polietilenglicol
SDS Dodecilsulfato soacutedico
SIRVETA Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos
SSF Solucioacuten salina fisioloacutegica
SUH o SHU Siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico
TEM Microscopio electroacutenico de transmisioacuten
TSA Agar soya de tripicasa
TSAYE TSA con 06 de extracto de levadura
TSB Caldo de soja trypticasa
UAB Universitat Autogravenoma de Barcelona
UANL Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
ZMM Zona Metropolitana de Monterrey
RESUMEN
La inocuidad alimentaria es un tema amplio y relevante que impacta directamente en todos
los segmentos de la sociedad involucra productores desarrolladores innovadores
consumidores y gobierno ademaacutes de diversos sectores como la industria la ingenieriacutea y hasta
la educacioacuten Sin embargo las nuevas tecnologiacuteas en la cadena de produccioacuten provocan que
eacutesta sea maacutes larga y compleja
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) causan alta morbilidad y varios casos
de mortalidad Entre los agentes infecciosos maacutes comunes se encuentran Salmonella spp
Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus
Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus
Los bacterioacutefagos o fagos son virus bacterianos especiacuteficos de una ceacutelula hueacutesped en la
cual se multiplican invadiendo su maquinaria de material geneacutetico Son los sistemas bioloacutegicos
maacutes abundantes del planeta se encuentran en el medio ambiente y se introducen y conviven
en la flora intestinal de otros seres cuando eacutestos ingieren diversos alimentos ya sean de tipo
animal o vegetal
El objetivo del presente trabajo fue aislar y probar la especificidad de una serie de fagos de
Salmonella spp a partir de aguas residuales para lo cual se utilizaron muestras de agua
recolectadas de diferentes localidades del aacuterea metropolitana de Monterrey N L Meacutexico La
purificacioacuten de fagos se llevoacute a cabo mediante la teacutecnica de agar doble capa (ADC) hasta
obtener placas liacuteticas uniformes y se usaron diferentes cepas de referencia de Salmonella
como cultivos indicadores
Se aislaron un total de 15 fagos putativamente distintos de los cuales al pasar las pruebas
de replicacioacuten soacutelo uno logroacute mantener la capacidad liacutetica Se seleccionoacute y purificoacute para
realizar pruebas in vitro especiacuteficas para Salmonella Se utilizoacute una concentracioacuten de fagos
de 1x1012 UFPmL para analizar al fago mediante su morfologiacutea por microscopiacutea electroacutenica
la cual se identificoacute como miembro de la familia Siphoviridae Asiacute mismo se probaron los fagos
contra Salmonella in situ en discos de acero que simulan las superficies de trabajo y para
analizar el efecto de la infeccioacuten del fago sobre Salmonella en los discos de acero inoxidable
se utilizoacute el microscopio de epifluorescencia
Para el conteo de fagos se utilizoacute los meacutetodos LIVEDEAD Para finalizar para evaluar la
efectividad del fago MRH6 que resulto liacutetico en nuestro ensayo se procedioacute a dar las
condiciones necesarias para la formacioacuten del biofilm de Salmonella sobre superficies de acero
inoxidable El fago MRH6 fue capaz de disgregar los biofilms a temperatura ambiente Las
mayores reducciones de Salmonella en un menor tiempo se obtuvieron con concentraciones
de fago mayores a 1x108 UFPmL El meacutetodo de cultivo mostroacute reducciones del patoacutegeno a
niveles indetectables sin embargo la tincioacuten vital reveloacute la presencia de ceacutelulas viables
(coloracioacuten verde) que podriacutea representar un riesgo de contaminacioacuten cruzada estas
pudieran tambieacuten presentarse por la presencia de material orgaacutenico Este trabajo con un fago
puede proporcionar una medida adyuvante para controlar la contaminacioacuten de superficies de
acero inoxidable con biofilms de Salmonella La DEM resultoacute ser una buena herramienta para
evaluar raacutepida y adecuadamente por observacioacuten y posterior anaacutelisis el efecto de los fagos
SUMMARY
Food safety is a broad and relevant issue that directly affects all aspects of society involving
producers developers innovators consumers and government as well as various sectors
such as industry engineering and even education However new technologies in the
production chain cause it to be longer and more complex
Foodborne diseases (ETA) cause high morbidity and several cases of mortality Among the
most common infectious agents are Salmonella spp Campylobacter spp Escherichia coli
Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus Clostridium botulinum Listeria
monocytogenes and Staphylococcus aureus
Bacteriophages or phages are bacterial viruses specific to a host cell in which they multiply
by invading their machinery of genetic material They are the most abundant biological systems
on the planet they can be found in the environment In organisms they enter and coexist in
the intestinal flora of other beings when they ingest various foods whether animal or vegetable
The objective of this study was to isolate and test the specificity of a series of phages of
Salmonella spp from wastewater for which water samples were collected from different
locations in the metropolitan area of Monterrey N L Meacutexico The purification of phages was
carried out by means of the double layer agar technique (ADC) until uniform lithic plates were
obtained and different Salmonella reference strains were used as indicator cultures
A total of 15 putatively different phages were isolated of which upon passing the replication
tests only one managed to maintain the lytic capacity It was selected and purified to perform
specific in vitro tests for Salmonella A phage concentration of 1x1012 PFUmL was used to
analyze the phage by means of its electron microscopy morphology which was identified as a
member of the Siphoviridae family Likewise the phages against Salmonella were tested in
situ on steel discs simulating the work surfaces and the epifluorescence microscope was used
to analyze the effect of phage infection on Salmonella on the stainless steel discs
For the phage count the LIVE DEAD Finally in order to evaluate the effectiveness of the
phage MRH6 that was lytic in our trial the necessary conditions for the formation of the
Salmonella biofilm on stainless steel surfaces were established The phage MRH6 was able
to disintegrate the biofilms at room temperature The greatest reductions of Salmonella in a
shorter time were obtained with phage concentrations greater than 1x107 PFUmL The culture
method showed reductions of the pathogen to undetectable levels however vital staining
revealed the presence of viable cells (green coloration) which could represent a risk of cross
contamination these could also be presented by the presence of organic material This work
with a phage can provide an adjuvant measure to control contamination of stainless steel
surfaces with Salmonella biofilms The DEM proved to be a dependable tool to quickly and
adequately evaluate the effect of phages by observation and subsequent analysis
RESUM
La innocuiumltat alimentagraveria eacutes un tema ampli i rellevant que impacta directament en tots els
segments de la societat involucra productors desenvolupadors innovadors consumidors i
govern a meacutes de diversos sectors com la induacutestria lenginyeria i fins a leducacioacute No obstant
aixograve les noves tecnologies en la cadena de produccioacute provoquen que aquesta sigui meacutes llarga
i complexa
Les malalties transmeses per aliments (ETA) causen alta morbiditat i diversos casos de
mortalitat Entre els agents infecciosos meacutes comuns es troben Salmonella spp
Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus
Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus
Els bacteriogravefags o fags soacuten virus bacterians especiacutefics duna cegravelmiddotlula hoste en la qual es
multipliquen envaint la seva maquinagraveria de material genegravetic Soacuten els sistemes biologravegics meacutes
abundants del planeta es troben en el medi ambient i sintrodueixen i conviuen en la flora
intestinal daltres eacutessers quan aquests ingereixen diversos aliments ja siguin de tipus animal
o vegetal
Lobjectiu del present treball va ser aiumlllar i provar lespecificitat duna segraverie de fags de
Salmonella spp a partir daiguumles residuals per a aixograve es van utilitzar mostres daigua recollides
de diferents localitats de lagraverea metropolitana de Monterrey N L Megravexic La purificacioacute de fags
es va dur a terme mitjanccedilant la tegravecnica dagar doble capa (ADC) fins a obtenir plaques liacutetiques
uniformes i es van usar diferents soques de referegravencia de Salmonella com a cultius indicadors
Es van aiumlllar un total de 15 fags possiblement diferents dels quals en passar les proves
de replicacioacute nomeacutes un va aconseguir mantenir la capacitat liacutetica Es va seleccionar i va
purificar per realitzar proves in vitro especiacutefiques per Salmonella Es va utilitzar una
concentracioacute de fags de 1x1012 UFPmL per analitzar fag mitjanccedilant la seva morfologia per
microscogravepia electrogravenica la qual es va identificar com a membre de la famiacutelia Siphoviridae Aixiacute
mateix es van provar els fags contra Salmonella in situ en discos dacer que simulen les
superfiacutecies de treball i per analitzar lefecte de la infeccioacute del fag sobre Salmonella en els
discos dacer inoxidable es va utilitzar el microscopi depifluorescegravencia
Per al recompte de fags es va utilitzar els megravetodes LIVE DEAD Per finalitzar per avaluar
lefectivitat del fag MRH6 que va resultar liacutetic en el nostre assaig es va procedir a donar les
condicions necessagraveria per a la formacioacute del biofilm de Salmonella sobre superfiacutecies dacer
inoxidable El fag MRH6 va ser capaccedil de disgregar els biofilms a temperatura ambient Les
majors reduccions de Salmonella en un menor temps es van obtenir amb concentracions de
fag majors a 1x107 UFP mL El megravetode de cultiu va mostrar reduccions del patogen a nivells
indetectables perograve la tincioacute vital revelar la presegravencia de cegravelmiddotlules viables (coloracioacute verda)
que podria representar un risc de contaminacioacute creuada aquestes poguessin tambeacute
presentar-se per la presegravencia de material orgagravenic Aquest treball amb un fag pot proporcionar
una mesura adjuvant per controlar la contaminacioacute de superfiacutecies dacer inoxidable amb
biofilms de Salmonella La DEM va resultar ser una bona eina per avaluar ragravepida i
adequadament per observacioacute i posterior anagravelisi lefecte dels fags
7
I INTRODUCCIOacuteN
Introduccioacuten
8
Introduccioacuten
9
Presentacioacuten del proyecto
Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica sobre las innovaciones en seguridad alimentaria en
Meacutexico la cual puso en evidencia la necesidad de analizar alternativas enmarcadas en el
aacutembito del uso de las tecnologiacuteas verdes lo que presentoacute la posibilidad de desarrollar un
trabajo innovador y que no se estuviera aplicando ya en el sector alimentario local o nacional
De esa manera se inician las actividades experimentales que para este trabajo doctoral se
dividieron en dos partes la primera realizada en Meacutexico y la segunda en Espantildea
En primera instancia se desarrolloacute un anaacutelisis en el Laboratorio de geneacutetica y biologiacutea
molecular del Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica (CINSP) en el Campus
Ciencias de la Salud de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) y gracias al apoyo
de Programa de mejoramiento del profesorado (PROMEP nuacutemero UANL-326) por medio de
una beca se iniciaron los estudios y asiacute se cumplioacute el primer propoacutesito que fue obtener virus
nativos contra cepas de Salmonella y purificarlos
Posteriormente para lograr los demaacutes objetivos que eran realizar la caracterizacioacuten parcial
de los fagos contra Salmonella se solicitoacute una beca a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten
Internacional para el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y
de Cooperacioacuten curso 2010-2011) con el fin de realizar una estancia de investigacioacuten y crear
oportunidades de desarrollo aprovechando las tecnologiacuteas innovadoras disponibles en la
Universitat Autoacutenoma de Barcelona (UAB) considerando ademaacutes que la alta reputacioacuten de la
institucioacuten y la supervisioacuten por parte de sus investigadores impactariacutean positivamente en el
desarrollo del trabajo y en el Curriculum Vitae del investigador y por consiguiente en su futuro
profesional como docente e investigador
Otra finalidad de este proyecto fue dejar un buen referente al concluir la estancia ya que
ello ofreceriacutea nuevas oportunidades para seguir forjando el perfil del investigador cimentaraacute
cualquier trayectoria profesional y facilitariacutea optar por un plan postdoctoral en esta misma
Universidad De esta manera se accedioacute a la beca del Programa Extranjeros II-A
Convocatoria 2010-2011 Nuacutemero 0000521211 del cual se cumplieron los objetivos
establecidos y otros maacutes por ejemplo conocer nuevas tecnologiacuteas
Siendo eacutesta una liacutenea de investigacioacuten relativamente reciente en Meacutexico se espera que
impacte en las posibilidades laborales en diversos contextos y seacutea de utilidad para sentar
precedentes para futuras liacuteneas de trabajo en dicha aacuterea
Introduccioacuten
10
Justificacioacuten
En las uacuteltimas deacutecadas los cambios ocurridos en la produccioacuten y consumo de alimentos
han tenido un impacto sobre la inocuidad alimentaria La industria en la produccioacuten masiva de
alimentos ha evolucionado de ser local a constituirse en otra donde la produccioacuten yo el
procesamiento estaacuten localizados en diferentes partes del paiacutes o del mundo Por otra parte la
poblacioacuten estaacute envejeciendo por lo que se vuelve maacutes vulnerable a problemas de salud
ademaacutes los agentes patoacutegenos son cada vez maacutes virulentos (DeWaal y Barlow 2014)
Los reportes sobre problemas gastrointestinales que recopila el Centro Nacional de
Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades (CENAVECE) indican que Nuevo
Leoacuten ha permanecido dentro de los primeros 12 lugares de casos de fiebre tifoidea y en los
primeros 14 de fiebre paratifoidea y otras salmonelosis A nivel nacional las enfermedades
infecciosas intestinales se ubican entre las primeras 10 causas de mortalidad de nintildeos en
edad escolar entre los 5 y 14 antildeos de edad (CENAVECE 2007)
Los microorganismos del geacutenero Salmonella pertenecen a la familia Enterobacteriaceae
Son bacilos o cilindros con puntas redondeadas y se diferencian de las demaacutes enterobacterias
mediante reacciones bioquiacutemicas y de aglutinacioacuten existen maacutes de 2500 serotipos todos
ellos patoacutegenos Actualmente se considera una sola especie denominada Salmonella
enterica de la cual seguacuten el esquema de Kauffmann-White se clasifican nueve serogrupos
Esta especie tiene importancia cliacutenica debido a que es la uacutenica capaz de infectar animales
homeotermos esta investigacioacuten se centra en cuatro serovariedades Salmonella enterica
serovar Typhimurium (S Typhimurium) S enterica serovar Paratyphi (S Paratyphi) S
enterica serovar Enteritidis (S Enteritidis) y S enterica serovar Typhi (S Typhi) estos
microorganismos se pueden aislar tanto de fuentes alimentarias (carne de res pollo crudo
huevo fresco carne de puerco almejas chorizos vegetales entre otros) como del medio
ambiente (suelo agua materia fecal y superficies) (Chlebicz y Śliżewska 2018 Nguendo
2018)
En Meacutexico S Enteritidis y S Typhimurium son los microorganismos aislados con mayor
frecuencia en las salmonelosis Normalmente S Enteritidis habita en el intestino de los
animales sin causar enfermedad pero puede infectar a humanos y promover diarrea voacutemito
dolor abdominal calambres y ocasionalmente insuficiencia renal y en los peores casos la
muerte (DeWaal y Barlow 2014) La contaminacioacuten de alimentos por Salmonella spp se debe
Introduccioacuten
11
a una combinacioacuten de factores relacionados con la produccioacuten a gran escala o cambios en el
manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los mismos (Uribe y Suarez 2006)
Por otra parte estaacuten los virus que pueden replicarse independientemente de los
cromosomas de una ceacutelula pero no sin su participacioacuten (Madigan y Martinko 2006) El hecho
de descubrir virus que pueden infectar y destruir bacterias fue recibido con optimismo por su
posible aplicacioacuten en usos terapeacuteuticos (McLaughlin et al 2006)
En un estudio realizado en diversos estados de Meacutexico (Coahuila Durango Estado de
Meacutexico Jalisco Morelos Oaxaca Puebla y Quereacutetaro) se ha fagotipado Salmonella spp
proveniente de huevo carne de pollo de engorde y gallinas progenitoras reproductoras de
postura comercial y productoras (Mancera et al 2004) Ademaacutes diversas investigaciones han
utilizado fagos liacuteticos para reducir la contaminacioacuten por Salmonella en pollos (canal y piel)
semillas germinadas y dulces de frutas cortadas (Goode et al 2003)
El uso de aditivos en los alimentos se ha reducido considerablemente debido al rechazo
generalizado por parte de los consumidores lo que podriacutea repercutir en un incremento en los
casos de intoxicaciones alimentarias En este contexto los fagos aportan ventajas sobre los
desinfectantes conocidos y los meacutetodos tradicionales de aplicacioacuten de friacuteo o calor ya que
pueden actuar como agentes de deteccioacuten y control bioloacutegico de bacterias patoacutegenas en
alimentos y su produccioacuten es relativamente raacutepida y econoacutemica (Atterbury et al 2003)
La utilidad de los fagos en el aacuterea de investigacioacuten es amplia una posible utilidad es ser
un instrumento para identificar cepas bacterianas especiacuteficas Tambieacuten se han utilizado para
el estudio de diversos fenoacutemenos moleculares el trabajo con estos virus permitioacute desarrollar
ensayos de placas de lisis conocer la naturaleza del ciclo de vida viral los tipos de mutaciones
geneacuteticas y los genes como segmentos de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) (Muniesa et al
2005)
Las empresas dedicadas a la biotecnologiacutea (Intralytix Omnilytics) se centran en desarrollar
productos utilizando fagos especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan las ETA y estos
productos comerciales de terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones
(Segundo 2010) Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos antildeos debido a sus
caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutefico sin dantildear la microbiota
en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros distribucioacuten de
Introduccioacuten
12
esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla (Oh y Park
2017)
En este sentido el objetivo general de este estudio es el aislamiento y caracterizarizacion
de fagos contra Salmonella a partir de diversas fuentes para su uso potencial en el control
bioloacutegico
13
II ANTECEDENTES
Antecedentes
14
Antecedentes
15
A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos
A nivel internacional la produccioacuten de alimentos y todos los mecanismos tecnoloacutegicos
involucrados en su procesamiento implican ademaacutes de la optimizacioacuten de los tiempos y de
la calidad un riesgo para la adquisicioacuten de enfermedades inherentes a la misma adopcioacuten
de nuevas tecnologiacuteas (Weaver et al 2017)
La OMS (2017) estima que las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de
muerte de nintildeos menores de cinco antildeos matan a 525000 nintildeos menores de cinco antildeos
cada antildeo una proporcioacuten significativa de las enfermedades diarreicas se puede prevenir
mediante el acceso al agua potable y a servicios adecuados de saneamiento e higiene
ademaacutes de que en todo el mundo se producen unos 1700 millones de casos de
enfermedades diarreicas infantiles cada antildeo
Seguacuten la OMS (2017) existen diferentes condiciones que propician el desarrollo de las
ETA Como son las de tipo bioloacutegico producidos por hongos o bacterias causantes de
enfermedades ya sea por sus metabolitos o toxinas virus o huevecillos de paraacutesitos asiacute
como los venenos de algunos peces y plantas Las de tipo quiacutemico como productos de
limpieza o desinfeccioacuten pesticidas toxinas marinas insecticidas o venenos y fiacutesicos cuando
en la materia prima de los alimentos se encuentran objetos como vidrios metal piedras
grapas barniz de untildeas joyeriacutea cabellos o cualquier elemento extrantildeo
De acuerdo con el Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos (SIRVETA) ndashdesarrollado por el Instituto
Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y Zoonosis (PANALIMENTOS)ndash ocurrieron 1683
brotes de ETA en Meacutexico que ocasionaron 53860 casos de enfermedades y provocaron
207 muertes mientras que en los demaacutes paiacuteses de Ameacuterica Latina se produjeron durante el
mismo periacuteodo 6324 brotes que provocaron 228579 casos y 314 muertes (Forsythe y
Hayes 2002) Cabe aclarar que eacutestos son soacutelo los brotes notificados por la autoridad
competente El sistema utilizado internacionalmente para obtener alimentos inocuos es el
APPCC (Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control) o HACCP (por sus siglas en ingleacutes
Hazard Analysis and Critical Control Points) que se puede implementar en cualquier tipo de
industria y permite prevenir controlar y eliminar cualquier peligro antes de consumir los
alimentos (Rodriacuteguez Torrens et al 2015)
En Meacutexico el Distintivo H es un programa implementado por los servicios alimentarios
Antecedentes
16
oficiales mediante el cual se ofrece a los clientes alimentos seguros El Centro Nacional de
Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades de Meacutexico (CENAVECE) advierte
que uno de los problemas de salud maacutes importantes lo constituyen los trastornos
gastrointestinales cuya mortalidad predomina entre los 5 y los 14 antildeos Entre 2006 y 2012
el Estado de Nuevo Leoacuten ha permanecido entre los primeros 7 lugares de casos de diarrea
(CENAVECE 2018)
La figura 1 muestra la distribucioacuten de la incidencia en Meacutexico la cual estaacute asociada a la
densidad demograacutefica y la accesibilidad a servicios de salud que facilitan el registro es asiacute
que son precisamente las entidades federativas con mayor poblacioacuten quienes registran
nuacutemeros maacutes altos
Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa en
Meacutexico 2010-2012 (CENAVECE 2018)
A1 Problemaacutetica
La inocuidad alimentaria es una preocupacioacuten mundial que se refleja en el incremento
de reportes y noticias relacionadas con la contaminacioacuten de los alimentos difundidos en
diversos paiacuteses a su vez estos productos son retirados del mercado lo que provoca
peacuterdidas por varios cientos de millones de doacutelares El Codex Alimentarius indica que las ETA
y los dantildeos provocados por los alimentos son en el mejor de los casos desagradables y
Antecedentes
17
en el peor fatales y pueden influir negativamente en el comercio y la confianza de los
consumidores Por consiguiente es imprescindible un control eficaz de la higiene Todos los
eslabones de la cadena alimentaria ndashfabricantes elaboradores manipuladores y
consumidores de alimentosndash son responsables del control de los riesgos microbioloacutegicos
desde la explotacioacuten agriacutecola o ganadera hasta el consumidor final Desde esta oacuteptica el
anaacutelisis de riesgos deberiacutea aplicarse dentro de un contexto estrateacutegico organizativo y
operacional reconocido si bien en el proceso puede haber elementos comunes establecer
un nivel apropiado de proteccioacuten en esos sectores puede representar las maacuteximas
diferencias (Atterbury et al 2003)
La OMS ha identificado siete microorganismos patoacutegenos ndashC jejuni C perfringens E
coli 0157H7 L monocytogenes Salmonella spp S aureus y T gondiindash que causan entre
123 y 33 millones de casos de infeccioacuten solamente en los EE UU lo que representa
peacuterdidas econoacutemicas de entre 5500 y 34900 millones de doacutelares Ademaacutes resalta que su
incidencia podriacutea ser de 300 a 350 veces mayor de lo que indican las estadiacutesticas dado que
soacutelo se notifica un nuacutemero relativamente pequentildeo de casos de ETA Se estima que 70 de
los 1500 millones de episodios de diarrea son causados por alimentos en mal estado Es
posible que en los paiacuteses en desarrollo se notifique a las autoridades sanitarias una
proporcioacuten de casos auacuten inferior principalmente por pobreza y escasez de recursos a
disposicioacuten de los servicios de gestioacuten de la inocuidad alimentaria e inspeccioacuten de alimentos
(Van de Venter 2000)
A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea
La OMS estima que el 88 de los casos de diarrea a nivel mundial son atribuibles al
agua el saneamiento y la higiene todos los aspectos de inocuidad de los alimentos estaacuten
relacionados con estos factores En menor medida la enfermedad se transmite a traveacutes de
otras viacuteas por ejemplo el aire y alrededor del 94 de los casos son atribuibles al
saneamiento ambiental el total de fallecimientos se calcula en maacutes de 15 millones
principalmente en nintildeos en los paiacuteses desarrollados el promedio es ligeramente menor a
90 La diarrea atribuible al agua y saneamiento inapropiado representa 53 de las
muertes totales y 35 en nintildeos europeos de 0-14 antildeos y es ademaacutes una de las causas
principales de malnutricioacuten (Pruumlss-Uumlstuumln y Corvalaacuten 2006)
Antecedentes
18
Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud puacuteblica en el mundo
especialmente en paiacuteses en desarrollo Su alta incidencia se debe en gran parte a la
ingestioacuten de alimentos contaminados con microorganismos patoacutegenos como Salmonella
que causa episodios de diarrea aguda Salmonella spp es uno de los patoacutegenos enteacutericos
maacutes frecuentes tanto en paiacuteses desarrollados como subdesarrollados Dependiendo de la
especie tamantildeo del inoacuteculo factores de virulencia expresados por la cepa hueacutesped
involucrado estado inmunoloacutegico del paciente e intervencioacuten meacutedica puede ocasionar una
infeccioacuten gastrointestinal de media a severa hasta una infeccioacuten sistemaacutetica que
comprometa la vida del paciente (Fernaacutendez 2008)
Otros microorganismos que tambieacuten pueden contaminar el agua y los alimentos como
bacterias (Bacillus cereus Clostridium botulinum Campylobacter jejuni Vibrio cholera) virus
(Norwalk Rotavirus Hepatitis A) y paraacutesitos (Entamoeba histolytica Cryptosporidium
parvum Toxoplasma gondii) pueden transmitirse tambieacuten de una persona a otra como
resultado de una higiene deficiente (Freedman et al 2015)
Estudios de empresas dedicadas exclusivamente a la crianza de cerdos reportan
epidemias como el virus de la diarrea porcina la cual posteriormente se transmite a los
consumidores de estas carnes contaminadas ya sea por contacto con las heces o por
consumo de carnes contaminadas lo cual implica tambieacuten una peacuterdida econoacutemica para la
industria alimentaria resaltando la necesidad de establecer medidas preventivas y
correctivas seguacuten sea el caso (Huss et al 2017)
Seguacuten la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO
por sus siglas en ingleacutes Food and Agriculture Organization) las toxiinfecciones alimentarias
son la segunda causa de morbilidad pero muchas permanecen sin declarar quizaacutes por su
mediana severidad y recuperacioacuten raacutepida salvo el coacutelera Los alimentos son susceptibles a
contaminacioacuten de todo tipo la fuente de agentes causales suele ser el tracto gastrointestinal
de individuos reservorios o las heces de animales y humanos infectados o bien agua
corrompida que por deficiencias sanitarias contamina carne fresca pescados moluscos
pasteles de crema y leche no pasteurizada entre otros productos (Riacuteos et al 2012) como
se puede observar en la tabla 1
Antecedentes
19
Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias (Riacuteos et al 2012)
Agente Periacuteodo de
incubacioacuten Fuente Agente patoacutegeno
Salmonella spp 8-24 h Aves huevos mascotas
(tortugas lagartos pollos) Bacteria y endotoxina
E coli
enterotoxigeacutenica 24-72 h
Agua y alimentos
contaminados
Enterotoxina
termoestable
V cholerae 24-72 h Alimentos contaminados Enterotoxina termolaacutebil
Shigella spp 24-72 h Agua y alimentos
contaminados Bacteria y endotoxina
C jejuni 1-7 d Leche aves de corral y
agua no potable
Bacteria y Enterotoxina
termolaacutebil
Yersinia spp 1-7 d Carne de cerdo leche Bacteria y Enterotoxina
B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria
La historia referente a las toxiinfecciones alimentarias se comienza a documentar y
legislar en el siglo X con el botulismo en Bizanzio y documentos sobre el ergotismo en el
siglo XVI En el siglo XIX aparecen los alimentos enlatados y Louis Pasteur asocia el
deterioro de los alimentos con las bacterias En el siglo XX se produce un desarrollo
espectacular de la microbiologiacutea de los alimentos con el establecimiento de la etiologiacutea de
las toxiinfecciones alimentarias el comienzo de una nueva era de la quiacutemica e ingenieriacutea
alimentaria Aunado a los movimientos migratorios de las personas la diversificacioacuten de
alimentos la produccioacuten masiva de alimentos y la facilidad de transporte desde puntos
lejanos entre la produccioacuten y preferencia en el consumo de alimentos aunadas a la
capacidad que tienen los microorganismos para evolucionar y adaptarse a su medio
ambiente hacen pensar en estos microorganismos como patoacutegenos emergentes (DeWaal y
Barlow 2014)
B1 Escherichia
Las cepas de E coli se pueden diferenciar seroloacutegicamente por los antiacutegenos somaacuteticos
(O) flagelares (H) y capsulares (K) Ademaacutes pueden hallarse fimbrias y estructuras
Antecedentes
20
emparentadas que desempentildean un papel en la patogenia Actualmente se reconocen cinco
grupos de E coli causantes de diarrea en funcioacuten del siacutendrome que provocan cuyas
diferencias estaacuten codificadas por plaacutesmidos (Wright et al 2017) Los diferentes tipos son
E coli enteropatoacutegeno (EPEC) es responsable de la diarrea acuosa en lactantes
Produce voacutemitos fiebre y diarrea acuosa con mocos pero sin sangre Coloniza las
microvellosidades de todo el intestino produciendo la lesioacuten de ldquoadhesioacuten y erosioacutenrdquo en
el ribete en cepillo de la membrana de la vellosidad Afecta a adultos y nintildeos menores de
dos antildeos siendo este rango de edad el principal factor de riesgo
E coli enterotoxigeacutenico (ETEC) es el causante de la llamada vulgarmente ldquodiarrea
del viajerordquo se manifiesta con diarrea acuosa como agua de arroz y poca fiebre
Coloniza la porcioacuten proximal del intestino delgado Afecta a adultos y nintildeos son una causa
frecuente de diarrea en lactantes de paiacuteses en desarrollo asiacute como la causa maacutes comuacuten
de diarrea en individuos de paiacuteses industrializados que viajan a zonas menos
desarrolladas del mundo
E coli enteroinvasor (EIEC) coloniza el colon origina fiebre y diarrea profusa con
heces que contienen mocos y estriacuteas sanguinolentas Presenta un plaacutesmido de 120-140
mD conocido como plaacutesmido invasivo que lleva todos los genes necesarios para la
virulencia Al igual que ETEC pero afecta principalmente a adultos
E coli enterohemorraacutegico (EHEC) origina diarrea sanguinolenta colitis hemorraacutegica
siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico (SUH o SHU) y puacuterpura trombocitopeacutenica En este grupo se
incluye E coli verotoxigeacutenico (VTEC) serotipos O157 O26 O111 Afecta principalmente
a nintildeos el principal factor de riesgo es el consumo de carne sin la coccioacuten adecuada
E coli enteroagregativo (EAggEC) posee caraacutecter clonal diferenciaacutendose dos clones
relacionados (1 y 2) Dentro de cada grupo estaacute presente una variedad concreta de
antiacutegenos O mientras que los antiacutegenos H se conservan
En los reportes cientiacuteficos sobre E coli se refieren a las plantas como otra fuente de
infeccioacuten especiacuteficamente en la espinaca (Spinacia oleracea) y lechuga (Lactuca sativa) Se
recomienda igualmente estudiar profundamente los cultivos y los tejidos vegetables y
animales ya que se deben considerar como paraacutemetros de riesgo para la inocuidad de los
alimentos (Fernaacutendez Ferran et al 2003 Wright et al 2017)
B2 Campylobacter
Campylobacter spp es un bacilo delgado gram negativo (05-08 microm x 02-05 microm) y
Antecedentes
21
microaeroacutefilo (necesita 3-5 de O2 y 2-10 de CO2) Su morfologiacutea puede variar entre
vibrioacutenica (bacilos curvados) espirilar en forma de rosquilla de S y cocoide de tal forma
que en fase logariacutetmica de crecimiento las ceacutelulas tienen forma espiral o curvada pero a
medida que los cultivos envejecen adquieren formas esfeacutericas Moacutevil con un uacutenico flagelo
polar que presenta de dos a tres veces el largo de la ceacutelula Aunque hay diversas especies
de Campylobacter causantes de enfermedades C jejuni C coli y C lari son las especies
que se aiacuteslan con mayor frecuencia en casos de gastroenteritis humana siendo C jejuni la
responsable de la mayoriacutea de las toxiinfecciones alimentarias 89-93 de las
toxiintoxicaciones (OMS 2017)
Las especies C coli y C lari son semejantes a C jejuni su diferencia se basa en pruebas
bioquiacutemicas C coli no es capaz de hidrolizar el piruvato y C lari es capaz de crecer en
presencia de 30 microgramos de aacutecido nalidiacutexico (Haddad et al 2013) La movilidad la
quimiotaxis y los flagelos son factores importantes en la virulencia pues de ellos depende la
colonizacioacuten del epitelio intestinal Campylobacter produce una enterotoxina parecida a la
toxina coleacuterica que tambieacuten juega un papel importante en la patogenia (Nichols 2005) C
jejuni puede sobrevivir de 2 a 4 semanas en condiciones de baja humedad oxigenacioacuten y
temperaturas de 4ordmC superando muchas veces el tiempo de vida uacutetil del producto Asimismo
puede perdurar de 2 a 5 meses a -20ordmC pero a temperatura ambiente apenas dura algunos
diacuteas (Khan et al 2013)
C jejuni y C coli son sensibles a diversos agentes antimicrobianos como los macroacutelidos
los aminoglucoacutesidos el cloranfenicol y la tetraciclina La eritromicina ha sido el antibioacutetico de
eleccioacuten para tratar las infecciones del tracto intestinal Al igual que en Salmonella el control
de Campylobacter se debe realizar tanto en el sector agropecuario como en los
establecimientos alimentarios por lo que los controles especificados para Salmonella
podriacutean extrapolarse a este microorganismo Un aspecto importante de su control reside en
la refrigeracioacuten de las aves ya que la baja temperatura junto con la desecacioacuten superficial
que se produce reduce significativamente la incidencia y los recuentos de Campylobacter
viables incluso en canales altamente contaminadas (Fernaacutendez 2008)
B3 Enterobacter
Conocido antiguamente como Cronobacter spp incluye varias especies de patoacutegenos
emergentes relacionados con brotes de meningitis septicemia y enterocolitis necrotizante
especialmente en neonatos y nintildeos La tasa de mortalidad de estos brotes es alta entre 20
Antecedentes
22
y 80 y los supervivientes suelen sufrir severos desoacuterdenes neuroloacutegicos (Grimont y
Grimont 2006)
E sakazakii es un bacilo moacutevil no esporulado gram negativo que ha sido encontrado en
alimento para bebeacutes es maacutes resistente a los cambios osmoacuteticos y a la sequiacutea que otros
miembros de la familia Enterobacteriaceae y se asocia con casos esporaacutedicos de sepsis
meningitis cerebritis y enterocolitis necrotizante La mayoriacutea de las infecciones se observan
en bebeacutes con bajo peso al nacer y que son alimentados de forma insalubre La mortalidad
ha disminuido a menos de 20 en los uacuteltimos antildeos Este microorganismo no se ha
encontrado presente en la foacutermula laacutectea tampoco existe evidencia de la transmisioacuten de
persona a persona o un medio general de difusioacuten ambiental (Vanegas et al 2009)
B4 Listeria
L monocytogenes estaacute muy difundida en la naturaleza en la que suele adoptar un ciclo
saprofiacutetico en estrecha relacioacuten con el suelo Ademaacutes se ha encontrado en aguas
continentales sedimentos marinos material vegetal en descomposicioacuten forrajes heces
humanas y animales y aguas residuales de explotaciones animales entre otros ambientes
lo que explica su presencia en alimentos crudos Epidemioloacutegicamente se caracteriza por su
ubicuidad sobreviviendo en tierra huacutemeda hasta 500 diacuteas en funcioacuten de la temperatura En
heces o aguas residuales mantenidas a temperatura de refrigeracioacuten sobrevive maacutes de seis
antildeos este periodo se reduce si se mantiene a temperatura ambiente (Guenther et al 2009)
Listeria spp son bacilos gram positivos de forma regular y con forma de vara corta
Algunas veces pueden tener forma cocoide apareciendo como ceacutelulas individuales o en
cadenas cortas Son moacuteviles entre 20-25ordmC pero no a 37ordmC Existen seis especies de Listeria
descritas L monocytogenes L innocua L welshimeri L seeligeri L grayi y L ivanovii
subespecie ivanovii y subespecie londoniensis Las cepas patoacutegenas de L monocytogenes
producen la listeriolisina O responsable de la hemoacutelisis-β y de la destruccioacuten de las ceacutelulas
fagocitarias es una hemolisina que segrega la bacteria a causa de la disminucioacuten de pH
(Liu 2006)
L monocytogenes tolera y se multiplica en concentraciones altas de NaCl contando con
la posibilidad de sobrevivir durante un antildeo en ambientes con una concentracioacuten de 16 su
tolerancia aumenta al disminuir el pH o la temperatura del medio Los tratamientos para su
inactivacioacuten son de 617ordmC35min 70ordmC20min 78ordmC15min u 80ordmC5min favoreciendo su
Antecedentes
23
resistencia al calor con la presencia de grasas Se multiplica entre 0 y 4ordmC las temperaturas
bajas ejercen un efecto protector de tal manera que en condiciones de acidez su inactivacioacuten
es maacutes lenta en refrigeracioacuten que a temperatura ambiente (Leverentz et al 2003) La acidez
influye en la capacidad de Listeria para sobrevivir a la congelacioacuten (temperaturas inferiores
a -47ordmC) y almacenamiento a menos de -18ordmC en carne mostrando una disminucioacuten en la
recuperacioacuten de ceacutelulas viables que han sido dantildeadas por el friacuteo (Wu et al 2015)
B5 Salmonella
B51 Origen
Salmonella tiene su origen principal en el tracto intestinal de animales fundamentalmente
las aves y los porcinos y pueden acabar contaminando las carnes crudas el pollo crudo los
productos marinos crudos o el huevo Los brotes de Salmonella estaacuten asociados al consumo
de alimentos elaborados con huevo crudo y siguen siendo frecuentes a pesar de conocerse
el riesgo que representa su consumo de las medidas legales adoptadas y de los programas
de educacioacuten sanitaria dirigidos a disminuir su incidencia Este geacutenero pertenece a la familia
Enterobacteriaceae fue descrito a principios del siglo XX por el bacterioacutelogo estadounidense
Theobald Smith (Zaidi et al 2006) En la figura 2 se muestran los factores de virulencia y
en la figura 3 se presenta la clasificacioacuten de Salmonella enterica con las diferentes
subespecies y serovares que se aiacuteslan maacutes frecuentemente
Antecedentes
24
Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por
Salmonella spp (Brenner et al 2000)
Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella (Brenner et al 2000)
Antecedentes
25
B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp
La mayoriacutea de los miembros de este geacutenero se encuentra en el tracto intestinal del
hombre y los animales como bacterias patoacutegenas o comensales Estaacute integrado por bacilos
gram negativos anaerobios facultativos y no esporulados La mayor parte de los serotipos
conocidos son moacuteviles mediante flagelos peritricos Se conocen maacutes de 2460 serotipos
muchos de ellos patoacutegenos para el ser humano (Chlebicz y Śliżewska 2018)
Son bacterias invasoras enterotoxigeacutenicas y estaacuten ampliamente diseminadas en todo el
mundo su temperatura ideal de sobrevivencia entre los 15 y los 35degC (mesoacutefilas) y en una
amplitud de pH de 45 a 9 Los microorganismos de este geacutenero se distribuyen en seis
grupos se han definido mediante biotipado hibridacioacuten DNA-DNA anaacutelisis de la secuencia
del RNA ribosomal 16S y por ldquomultilocus enzyme electrophoresisrdquo (MLEE) (Brenner et al
2000) La serotipificacioacuten se utiliza para diferenciar maacutes allaacute del nivel de subespecie como
puede observarse en la tabla 2
Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos (Brenner et al 2000)
Grupo Microorganismo
A S Paratyphi Al
B S Typhimurium S Bredeney
C1 S Choleraesuis S Montevideo S Oranienburg
C2 S Newport
D S Typhi S Enteritidis S Dublin S Gallinarum
E S Butantan S Anatum S Give
Salmonella serotipo Typhi es la causante de la fiebre tifoidea presentando siacutentomas como
son fiebre de intensidad variable cefalea diarrea estrentildeimiento tos naacuteuseas y voacutemitos
anorexia dolor abdominal y escalofriacuteos Mientras que los demaacutes serotipos considerados no
tifoidicos presentan un estado asintomaacutetico En el antildeo 2000 los serotipos aislados con
mayor frecuencia en EE UU fueron S Typhimurium S Enteritidis y S Newport (Dunkley et
Antecedentes
26
al 2009) En Meacutexico los serotipos de Salmonella spp identificados con mayor frecuencia
en los servicios de salud fueron S Typhimurium (204) y S Enteritidis (183) (Guenther
et al 2009)
La salmonelosis se produce por la ingestioacuten de alimentos o bebidas contaminados por
Salmonella se manifiesta como una enterocolitis aguda y se caracteriza por presentar
siacutendromes febriles asociados a manifestaciones gastrointestinales o sisteacutemicas con
frecuencia severas (Figueroa y Verdugo 2005 Fernaacutendez 2008) El cuadro cliacutenico se
localiza baacutesicamente en el iacuteleo terminal y el intestino grueso La enfermedad se manifiesta
a traveacutes de diferentes fases En la primera fase la infeccioacuten se limita a la mucosa intestinal
en la siguiente la bacteria invade el tejido linfaacutetico local y le sigue una fase de bacteriemia
durante la cual la mayoriacutea de las bacterias son fagocitadas por macroacutefagos del hiacutegado y el
bazo (Calva et al 2006 Bettini et al 2012)
Con frecuencia el meacutedico hace un diagnoacutestico basaacutendose en el cuadro cliacutenico del
paciente pero sin contar con los estudios microbioloacutegicos necesarios para establecer un
diagnoacutestico certero cuando se presenta infeccioacuten por Salmonella inicia una fase de
crecimiento bacteriano intracelular el cual despueacutes de varios diacuteas provoca la liberacioacuten de
gran cantidad de patoacutegenos al torrente sanguiacuteneo (Zaidi et al 2006)
La salmonelosis es una enfermedad aguda de distribucioacuten mundial Afecta a todos los
grupos de edad con mayor incidencia en los extremos de la vida provocando infecciones
en forma endeacutemica o en brotes epideacutemicos de intoxicacioacuten alimentaria que en ocasiones
abarcan amplias zonas geograacuteficas debido a las extensas cadenas de distribucioacuten de
alimentos existentes hoy en diacutea (Fernaacutendez 2008)
Para la salud puacuteblica la salmonelosis tiene un impacto socioeconoacutemico tanto en los paiacuteses
en desarrollo como en los paiacuteses desarrollados Ademaacutes al no recibir tratamiento puede
ser causante del siacutendrome de Reiter el cual se manifiesta por dolor en articulaciones
irritacioacuten en los ojos dolor al orinar y puede durar meses o antildeos desencadenaacutendose una
artritis croacutenica (CFSPH 2005) Desde la deacutecada de los ochenta la incidencia de
salmonelosis de origen alimentario ha aumentado considerablemente en Meacutexico Este
incremento es resultado de una combinacioacuten de factores como la calidad del agua utilizada
para riego y el manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los alimentos (Zaidi
et al 2006)
Antecedentes
27
Un meta-anaacutelisis (revisioacuten sistemaacutetica en la cual se combinan matemaacuteticamente los
resultados de varios estudios para contestar una misma pregunta) realizado recientemente
confirma que Salmonella resiste a antibioacuteticos empleados en los alimentos de origen animal
ya que pueden estar contaminados con este microorganismo es resistente a 3 antibioacuteticos
como la amoxicilina las sulfonamidas y las tetraciclinas ya que son ampliamente usados en
produccioacuten animal (Ejo et al 2016)
B53 Manifestaciones cliacutenicas
El cuadro cliacutenico normalmente es de 2 a 5 diacuteas aunque en ocasiones persiste varias
semanas La gravedad de los siacutentomas variacutea considerablemente siendo mayor en nintildeos y
ancianos Si el microorganismo pasa desde el intestino a la corriente sanguiacutenea y llega a
otras partes del cuerpo puede ocasionar la muerte si la persona afectada no es tratada
raacutepidamente La mayoriacutea de las muertes causadas por esta bacteria han ocurrido entre
ancianos que viven en residencias La tasa de mortalidad es baja inferior a 1 en paiacuteses
desarrollados pero suelen producirse de 40-50 muertes al antildeo especialmente entre nintildeos
ancianos o personas inmunodeprimidas Las excretas de los enfermos contienen gran
cantidad de la especie de Salmonella implicada al comienzo de la enfermedad la cifra inicial
decrece seguacuten transcurre el tiempo (DeWaal y Barlow 2014)
El estado de portador se refiere a la condicioacuten en que las personas curadas pueden
eliminar Salmonella en sus heces durante meses La mitad de los individuos afectados
excretan este patoacutegeno de 2-4 semanas posteriores a su curacioacuten cliacutenica entre 10 y 20
continuacutean durante 4-8 semanas unos pocos durante 3 meses y en raras ocasiones se
prolonga hasta 6 meses El microorganismo puede eliminarse tambieacuten por la orina La dosis
infectante capaz de desencadenar la salmonelosis humana es alrededor de 1times105 UFCmL
dependiendo de factores como tipo de alimento virulencia de la cepa involucrada y
susceptibilidad del individuo Entre las especies altamente virales se encuentran la S Dublin
y sobre todo S Enteritidis (Callaway et al 2008)
El incremento del serotipo de S Enteritidis en los casos de salmonelosis humana al
contrario de otras del geacutenero Salmonella representa un importante problema de salud
puacuteblica en muchos paiacuteses ya que este serotipo infecta a gallinas aparentemente sanas que
posteriormente transmiten las enfermedades al hombre Si se consumen huevos crudos o
Antecedentes
28
poco cocidos el microorganismo podriacutea causar la enfermedad El nuacutemero de casos de
salmonelosis se incrementa durante el verano (Parra et al 2002 Callaway et al 2008
Fernaacutendez 2008)
B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis
Gran parte de las salmonelosis se deben al consumo de alimentos de origen animal
(carnes de abasto pollo mariscos pescado leche y huevos asiacute como ovoproductos y
productos laacutecteos no pasteurizados) o de origen vegetal que se contaminan con productos
en malas condiciones de salubridad o mal manipulados Muchos alimentos sobre todo los
de origen animal o contaminados con aguas residuales han servido como vehiacuteculos en
brotes de salmonelosis La carne de matadero estaacute contaminada habitualmente con
Salmonella su incidencia es mayor en las canales de ganado y otros animales debido por
ejemplo a la contaminacioacuten por el contenido intestinal de la res viva cuyas heces manchan
su piel pelo y patas al llegar al matadero Las canales de cerdo se contaminan durante las
operaciones de escaldado y pelado La contaminacioacuten entre las mismas canales y de eacutestas
a utensilios superficies de trabajo y manos de los que las manipulan es faacutecil Otro de los
principales reservorios de Salmonella es la carne de aves de corral La contaminacioacuten de las
canales de pollo y otras aves procede igualmente del tracto intestinal o del material fecal
de los animales que manchan sus patas y plumas Las etapas criacuteticas de la contaminacioacuten
de las canales aviares estaacuten en el desplumado y la evisceracioacuten tambieacuten es comuacuten la
contaminacioacuten cruzada a traveacutes de las manos de los operarios equipo y utensilios utilizados
en la preparacioacuten y troceado de las canales (Marcus et al 2004)
Son raras las salmonelosis adquiridas directamente de carnes bien cocinadas la mayoriacutea
de los brotes se deben a una coccioacuten insuficiente o por contaminacioacuten posterior a su
preparacioacuten Las carnes elaboradas mediante fermentacioacuten (salami chorizo y salchichoacuten)
pueden ser causa de brotes de salmonelosis teniendo en cuenta que las especies que
integran este geacutenero pueden sobrevivir al proceso de fermentacioacuten (Forsythe y Hayes
2002)
Como se mencionoacute anteriormente otro alimento que se asocia con frecuencia a
Salmonella es el huevo La contaminacioacuten se produce por dos viacuteas a traveacutes de la caacutescara
contaminada y por viacutea transovaacuterica en aves infectadas (gallina pata pava) En el primer
caso la superficie de la caacutescara se contamina siempre a su paso por la cloaca o cuando el
Antecedentes
29
huevo estaacute en un ambiente fecal los huevos rotos o manchados constituyen un peligro en
la propagacioacuten de especies de Salmonella (EFSA 2014)
La contaminacioacuten partiendo de la caacutescara se produce si eacutesta mantiene un grado de
humedad apropiado y existe una temperatura diferencial significativa entre el contenido del
huevo y el ambiente La diferencia de temperaturas entre el huevo maacutes elevada y el
ambiente favorece la absorcioacuten de los microorganismos como Salmonella Tambieacuten se
transmite sobre la caacutescara por contaminacioacuten cruzada a traveacutes de los manipuladores que
han tenido contacto con superficies infectadas durante el transporte y almacenamiento de
los mismos en lugares con precarias condiciones de higiene (Ejo et al 2016) Salmonella
es causal de graves enfermedades que son trasmitidas por productos derivados de huevo
contaminado y la asociacioacuten entre la infeccioacuten del tracto reproductivo de los pollos fue un
fuerte incentivo para desarrollar programas de prevencioacuten (Jawale y Lee 2014)
La leche cruda puede albergar Salmonella y ser causa de brotes de salmonelosis se
contamina a traveacutes del pezoacuten y por las manos del ordentildeador la pasteurizacioacuten elimina la
presencia de la bacteria Entre los productos laacutecteos se han identificado como causa de
brotes de salmonelosis la leche en polvo el queso los helados y maacutes raramente la
mantequilla todos ellos por fallos en su elaboracioacuten Salmonella se destruye o inactiva
durante la fermentacioacuten de alta acidez como el yogur y el queso de pH inferior a 45 En el
caso del queso poco aacutecido (pH superior a 49) la Salmonella puede desarrollarse en
cualquier etapa de su elaboracioacuten (Mastroeni y Maskell 2006)
Entre las verduras cualquiera puede contener Salmonella cuando se cultivan con aguas
residuales contaminadas o son fertilizadas con abonos de origen animal Algunos vegetales
como los berros han sido causa de brotes de salmonelosis Por otro lado los mariscos se
contaminan con Salmonella cuando se criacutean en aguas residuales contaminadas por lo que
han sido la causa de numerosos brotes en todo el mundo la depuracioacuten es la medida
preventiva adecuada Diferentes alimentos se han identificado como portadores de
Salmonella entre ellos coco cebada harina de cereales pimienta blanca y negra pasta
cacao en polvo y chocolate (Fernaacutendez 2008) La FDA (2017) reportoacute el aumento de las
pruebas de las cuales ha identificado papayas de dos granjas que resultaron positivas para
las cepas de Salmonella que coinciden con enfermedades no relacionadas con este brote
Antecedentes
30
C Crecimiento microbiano
El crecimiento microbiano puede definirse como un incremento en los constituyentes
celulares que ocasiona un aumento del nuacutemero de ceacutelulas de los microorganismos que se
multiplican por gemacioacuten y fisioacuten binaria En el uacuteltimo caso las ceacutelulas individuales se
agrandan y dividen para originar dos ceacutelulas hijas de un tamantildeo aproximadamente igual
(Atlas y Bartha 2002)
C1 Crecimiento de los microorganismos
Todos los mamiacuteferos incluyendo los seres humanos se adaptan a la vida del mundo
microbiano Louis Pasteur Robert Koch Eacutelie Metchnikoff y Theodor Escherich entre otros
investigadores sentaron las bases conceptuales sobre las interacciones microbio-hueacutesped
Pasteur postuloacute que los microbios eran necesarios para la vida humana y Metchnikoff afirmoacute
que la composicioacuten de la flora microbiana era esencial para el bienestar del hueacutesped
Igualmente Escherich estaba convencido de que el conocimiento preciso de la flora
endoacutegena era esencial no soacutelo para la comprensioacuten de la fisiologiacutea de la digestioacuten sino para
la comprensioacuten de la patologiacutea y terapia de enfermedades microbianas intestinales A pesar
de estas primeras ideas soacutelo recientemente los cientiacuteficos han desarrollado meacutetodos que
permiten caracterizar directamente los mecanismos moleculares que subyacen a la creacioacuten
y mantenimiento de diversos ecosistemas microbianos (Falk et al1998)
El crecimiento de una poblacioacuten bacteriana resulta de la suma de ciclos celulares de todos
sus individuos y suele ser asincroacutenico puesto que cada microorganismo se encuentra en un
punto diferente del ciclo celular Por consiguiente en un momento determinado en una
poblacioacuten se encuentran ceacutelulas que acaban de dividirse otras estaacuten replicando su ADN y
elongaacutendose y otras estaacuten iniciando la divisioacuten celular (Melbinger et al 2015)
El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza en la mayoriacutea de los
casos mediante la produccioacuten de colonias aisladas en cultivos soacutelidos El crecimiento
explosivo de las bacterias produce un gran nuacutemero a partir de una uacutenica ceacutelula inicial de
forma que tras un periacuteodo de tiempo de incubacioacuten en las condiciones ambientales
adecuadas se produce una colonia de individuos iguales Para que un microorganismo
crezca necesita nutrientes que le aporten energiacutea y elementos quiacutemicos para la siacutentesis de
sus constituyentes celulares De acuerdo a la fuente de carbono que utilizan los
Antecedentes
31
microorganismos se clasifican en autoacutetrofos si es el CO2 atmosfeacuterico (microorganismos que
fotosintetizan) y heteroacutetrofos si utilizan carbono orgaacutenico (Ouyang y Li 2013)
C11 Disponibilidad del agua
El agua es un factor importante para el crecimiento microbiano se requiere para crecer y
llevar a cabo las funciones metaboacutelicas de lo contrario los microorganismos se deshidratan
o mueren La aw depende de la concentracioacuten de solutos y de la cantidad de agua disponible
en el medio ambiente La mayoriacutea de las bacterias y hongos necesitan valores entre 098 y
0995 de aw para su pleno desarrollo (Madigan y Martinko 2006)
Una membrana plasmaacutetica permanentemente selectiva separa el contenido
citoplasmaacutetico del microorganismo de su ambiente por ello las alteraciones en la
concentracioacuten osmoacutetica del medio extracelular pueden afectar incluso la viabilidad de los
mismos Si se coloca un microorganismo en una solucioacuten isotoacutenica el agua entraraacute en la
ceacutelula y causaraacute su estallido salvo que la propia ceacutelula desarrolle alguna estrategia para
evitarlo por ejemplo reducir la concentracioacuten osmoacutetica del citoplasma gracias a los cuerpos
de inclusioacuten Los procariotas tambieacuten pueden contener canales sensibles a la presioacuten
osmoacutetica que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno
se vuelve maacutes baja que la del citoplasma (Madigan y Martinko 2006)
C12 Acidez y pH
El pH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad entre 5 y 8 para impedir la
destruccioacuten de las macromoleacuteculas haacutebiles en condiciones aacutecidas o alcalinas Los aacutecidos
fuertes (inorgaacutenicos) y los aacutecidos deacutebiles (orgaacutenicos) disminuyen el pH externo
posteriormente se disocian en el interior de la ceacutelula inhibiendo la actividad enzimaacutetica y el
transporte de nutrientes por lo tanto los microorganismos no pueden generar energiacutea de
almacenamiento y ocurre la muerte celular (Brooks et al1992)
C13 Oxiacutegeno
El oxiacutegeno molecular (O2) influye en el metabolismo de los microorganismos Durante el
Antecedentes
32
proceso de reduccioacuten del O2 se crean formas reactivas como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2)
superoacutexidos (O2-) y radicales hidroxilos (OH-) que producen dantildeo celular por la oxidacioacuten
de compuestos orgaacutenicos e incluso macromoleacuteculas (Prescott et al1999)
C14 Temperatura
La temperatura afecta el desarrollo y la supervivencia de los microorganismos En bajas
temperaturas la velocidad de crecimiento de algunos microorganismos disminuye y los
periacuteodos de latencia se alargan Por otro lado las temperaturas elevadas aceleran las
reacciones enzimaacuteticas (antes de los 40degC) pero si se intensifica el calor en algunos casos
provocan la desnaturalizacioacuten de las proteiacutenas y por consiguiente la lisis celular (Brooks et
al1992)
Es importante considerar que cada microorganismo tiene una temperatura de desarrollo
adecuada a mayor temperatura se produce un incremento lineal de la velocidad de
crecimiento hasta alcanzar el clima perfecto a velocidad maacutexima Por encima de esta
temperatura oacuteptima la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte
celular (Atlas y Bartha 2002) En la tabla 3 se presentan algunas condiciones ambientales
para el desarrollo de los microorganismos
Antecedentes
33
Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales (Lu et al 2006 Madigan et al 2006 Falk et al 2009)
Factor Tipo de
microorganismo Caracteriacutesticas Microorganismo representativo
NaCI
Osmotolerante Capaz de crecer en un amplio rango de aw o
presioacuten osmoacutetica St aureus Saccharomyces rouxii
Haloacutefilo Requiere altas concentraciones de NaCl para
crecer normalmente por encima de 02 M Halobacterium Dunaliella Ectohiorhodospira
pH
Acidoacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 0 y 55 Sulfolobus Picrophilus Ferroplasma Acontium
Cyanidium caldarium
Neutroacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 55 y 80 Euglena Paramecium
Alcaloacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 85 y 1 15 Badilas alcalophilus NaIronobaciacuteerium
Temperatu
ra
Psicroacutefilo Crece bien a 0degC temperatura oacuteptima de 15degC
o inferior Badilas psychrophilus Chlamydomonas nivalis
Psicroacutetrofo Puede crecer a 0-7degC oacuteptima de 20 a 30degC Listeria monocytogenes
Mesoacutefilo Temperatura maacutexima de 35degC
Temperatura oacuteptima alrededor de 20-45degC
P fluorescens E coli Neisseria gonorrhoeae
Trichomonas vaginalis
Termoacutefilo Puede crecer a 55degC o superior temperatura
oacuteptima a menudo entre 55 y 65degC
Geobacillus stearothermophilus Thermus
aquaticus Cyanidium caldarium
Hipertermoacutefilo Temperatura oacuteptima entre 80 y 113degC Chaetomium thermophile Sulfolobus
Atmoacutesfera
Aerobio obligado Completamente dependiente del O2 para
crecer Pseudomonas Mycobacterium tuberculosis
Anaerobio
facultativo
No requiere O2 pero crece mejor en su
presencia
M luteus St aureus
Streptococcus pneumoniae L monocytogenes
Anaerobio
aerotolerante Crece bien en presencia o en ausencia de O2 Lactobacillus
Anaerobio
obligado No tolera el O2 y muere en su presencia Clostridium botulinum C perfringens
Microaeroacutefilo
Requiere nivel de O2 inferior a 2-10 para
crecer y es dantildeado por el O2 (20) C fetus
Antecedentes
34
D Control del crecimiento microbiano
Los microorganismos toleran determinados factores ambientales Asiacute unas bacterias
pueden tener condiciones para su desarrollo y estas condiciones pueden ser nocivas para una
especie bacteriana El crecimiento de una poblacioacuten microbiana se estudia analizando la curva
de crecimiento de un cultivo La curva del crecimiento microbiano representa la evolucioacuten del
nuacutemero de nuacutemero de ceacutelulas viables presente en un cultivo microbiano liacutequido a lo largo del
tiempo de estudio Se estudia el nuacutemero de ceacutelulas viables por mililitro de un cultivo de
volumen limitado y con una cantidad de nutrientes limitada como por ejemplo un medio de
cultivo liacutequido en un matraz que ha sido inoculado con una cantidad inicial de microorganismos
o inoacuteculo (Hunter-Cevera y Belt 1996) Para llevar a cabo estos estudios se distingue tres
niveles entre los modelos de microbiologiacutea predictiva los que describen los cambios en el
nuacutemero de microorganismos con respecto al tiempo con respecto al efecto de las condiciones
ambientales y los que combinan los dos aspectos anteriores (Larcher y Cattaneo 2006)
Se considera el crecimiento de las bacterias en funcioacuten de su fondo geneacutetico en relacioacuten
con los nutrientes y en unas hipoteacuteticas condiciones ideales (oacuteptimas) Sin embargo el trabajo
experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales es decir
una serie de agentes fiacutesicos y quiacutemicos El anaacutelisis de la curva de crecimiento bacteriano es
muy importante para determinar el potencial de una teacutecnica de control especiacutefica Al igual que
las bacterias los fagos al forman una interaccioacuten con su bacteria hueacutesped se necesita
determinar una cuantificacioacuten del nuacutemero de copias que se generan por la infeccioacuten a esta
condicioacuten se le conoce como fase de eclipse siendo el momento idoacuteneo para realizar la
infeccioacuten fago-bacteria (Lee et al 2016)
D1 Agentes fiacutesicos
La temperatura es uno de los paraacutemetros ambientales maacutes importantes que condicionan el
crecimiento y la supervivencia de los microorganismos La temperatura afecta a la velocidad
de crecimiento y por lo tanto al tiempo de generacioacuten Cada bacteria es diferente y esto se
puede observar en una curva de tasa de crecimiento en funcioacuten de la temperatura Si se suele
utilizar calor en combinacioacuten con otros agentes fiacutesicos (filtracioacuten presioacuten y radiacioacuten) Al
aplicar temperaturas altas se refleja desnaturalizacioacuten e inactivacioacuten de proteiacutenas enzimaacuteticas
esenciales colapsamiento de la membrana citoplaacutesmica y a veces lisis teacutermica de la bacteria
Antecedentes
35
esta condicioacuten se presenta raacutepidamente cuando se aplica presioacuten la cual se utiliza para
esterilizar objetos como lo demuestra el uso universal de la autoclave en todos los
laboratorios de microbiologiacutea (Madigan y Martinko 2006) El calor es auacuten uno de los meacutetodos
maacutes comunes para destruir microorganismos se puede aplicar huacutemedo o seco (Salgado-Nava
y Jimeacutenez-Munguiacutea 2012) Por otro lado ademaacutes de aplicar calor si a las bacterias se le
extrae el calor del medio de manera intensa recurrir a la congelacioacuten con fines de conservacioacuten
de microorganismos por largos periacuteodos si se realiza apropiadamente numerosos
laboratorios disponen de congeladores a -30 o -70degC para la conservacioacuten de colecciones de
cultivos microbianos (Shafiei et al 2014)
D2 Agentes quiacutemicos
Aunque los objetos se desinfectan a veces con agentes fiacutesicos tambieacuten las sustancias
quiacutemicas se utilizan con mucha frecuencia por ejemplo los quimioteraacutepicos son sustancias
con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostaacutetica) En estas sustancias se busca
que sea efectivo contra un amplio espectro de microorganismos Pero no existe (hasta estos
momentos) un solo agente capaz de inhibir a todos los microorganismos Por otro lado existen
quimioteraacutepicos de espectro estrecho pero muy selectivos contra ciertas bacterias que son
patoacutegenas importantes Muchos factores influyen en la eficacia de los desinfectantes hay que
considerar la cepa de microorganismos presentes la concentracioacuten y naturaleza del
desinfectante y la duracioacuten del tratamiento Asimismo es imprescindible que las superficies
sucias se limpien antes de aplicar un desinfectante El uso apropiado de los agentes quiacutemicos
es esencial para la seguridad en los laboratorios y hospitales estos mismos productos se
utilizan tambieacuten para evitar el crecimiento microbiano en los alimentos (Prescott et al 1999)
E Fagos
E1 Antecedentes
Los virus son agentes infecciosos submicroscoacutepicos que pueden replicarse
independientemente de los cromosomas de una ceacutelula pero no independientemente de ella
A fin de multiplicarse deben penetrar la ceacutelula donde puedan replicarse a la cual se le
denomina hueacutesped Presentan una forma infecciosa madura que es tiacutepicamente extracelular
Antecedentes
36
Pueden infectar a diferentes seres vivos por lo que existen virus de animales de plantas y
de forma particular los llamados virus bacterianos o fagos (Madigan y Martinko 2006)
Los bacterioacutefagos o fagos (del griego φαγετον paguumlento ldquoalimentoingestioacutenrdquo) son agentes
virales de las bacterias su descubrimiento se atribuye por un lado al bacterioacutelogo ingleacutes F
W Twort que en 1915 mencionoacute el aclaramiento de un cultivo soacutelido de Micrococcus
provocado por un agente desconocido Por otro lado en 1917 el francocanadiense F
dHerelle descubrioacute un grupo de entidades bioloacutegicas en medios de cultivo que se propagaban
a expensas de las bacterias a los cuales les denominoacute fagos y dentro de sus investigaciones
definioacute su potencial uso e importancia cliacutenica Esto se refuerza a partir de 1940 con el
desarrollo del microscopio electroacutenico con el que se demuestra la naturaleza viral de los fagos
y que la forma de estudiarlos es mediante procedimientos microbioloacutegicos convencionales
facilitando su manejo y estudio (Grabow 2001)
La uacuteltima variedad de fagos se descubrioacute durante la Primera Guerra Mundial los tipos ya
conocidos eran los virus que afectaban a vegetales y animales fue entonces que se pensoacute
en que su aplicacioacuten para eliminar bacterias podriacutea ser utilizada para la prevencioacuten y el
tratamiento de enfermedades bacterianas pero no resultoacute (Merril et al 1996) Sin embargo
los fagos resultaron tener otros beneficios especialmente como modelos o sustitutos de los
virus en humanos en la investigacioacuten geneacutetica baacutesica asiacute como en la evaluacioacuten de la calidad
del agua Ademaacutes demostraron ser una herramienta valiosa en la mayoriacutea de las
investigaciones sobre los virus ya que en comparacioacuten con los humanos animales vegetales
e incluso los insectos anfitriones de otros virus los fagos son faacutecil y raacutepidamente reproducibles
en el laboratorio y no son particularmente exigentes con respecto al espacio instalaciones y
equipos El trabajar con fagos requiere la separacioacuten y purificacioacuten y las dos principales tareas
para realizar esto es utilizar meacutetodos quiacutemicos en los cuales se utilizan solutos como buffer
glicerol bromuro de potasio cloruro de cesio y tartrato de potasio aunque el maacutes comuacuten es
la sacarosa ademaacutes involucra la precipitacioacuten con sulfato de amonio polietilenglicol o cloruro
de cesio y los meacutetodos fiacutesicos que implican la centrifugacioacuten a diferentes velocidades y
gradientes de densidad y con menor frecuencia la cromatografiacutea de particioacuten (Sambrook y
Russell 2001)
La investigacioacuten sobre las propiedades baacutesicas de los fagos se desarrolla en la biologiacutea
molecular que permitioacute avances sin precedentes en toda la biologiacutea y ciencias meacutedicas La
Antecedentes
37
concentracioacuten y purificacioacuten es un factor determinante para llevar a cabo la infeccioacuten
eficientemente sin embargo existe un periacuteodo de adaptacioacuten por parte de los fagos antes
que se desarrollen y se logren tiacutetulos apreciables en ceacutelulas cultivadas (Sambrook y Russell
2001 Breeuwer et al 2003)
E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos
Los virus son paraacutesitos intracelulares obligados no tienen metabolismo intriacutenseco y
requieren la maquinaria metaboacutelica codificada por los cromosomas de ceacutelula que puedan
infectar y reproducirse en ella denominada hueacutesped Su tamantildeo oscila entre 20 y 200 nm y
consiste de un nuacutecleo de aacutecido nucleico (ARN o ADN de cadena simple o doble) rodeado por
una cubierta proteica (caacutepside) y en algunos casos una cubierta de liacutepidos Los microbioacutelogos
que investigan la presencia de virus en haacutebitats marinos y han detectado su presencia creen
que son diez veces maacutes numerosos que las bacterias marinas En la superficie de los mares
se encuentran entre 106 y 109 partiacuteculas viacutericas por mililitro y se estima que en la capa
superficial (1 mm) de los oceacuteanos se encuentran unas 3 x 1030 partiacuteculas viacutericas (Grabow
2001 Atterbury et al 2003)
E3 Clasificacioacuten de los fagos
Las variaciones en los fagos se presentan en forma estructural como apeacutendices en la
cabeza cuello y las fibras de la cola o espigas ademaacutes del genoma que variacutea en cada orden
En 1962 Andreacute Lwoff junto a otros investigadores propuso una clasificacioacuten basada en la
morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico Los nombraron de la siguiente manera los urovirales
que presentaban cola pronunciada los inoviridae eran los filamentosos y los microviridae los
tipo φX Posteriormente Bradley (1967) consideroacute la morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico y
agrupoacute a los fagos en seis morfotipos baacutesicos denominados de la A a la F posteriormente se
clasifico en fagos baacutesicos los de cola los filamentosos y los icosaeacutedricos con ADN de cadena
sencilla o RNA de cadena simple Los fagos han sido investigados debido a su rol como
agentes de biocontrol para el desarrollo de la seguridad alimentaria En el presente varios
miles de fagos en contra de varios objetivos han sido aislados de varios entornos y alimentos
Aproximadamente el 96 de los fagos aislados eran con cola y del tipo liacuteticos en una de las
Antecedentes
38
tres familias Myoviridae (245) Siphoviridae (61) y Podoviridae (14) en el orden de los
caudovirales (Atterbury et al 2003 Oh y Park 2017)
En 1971 el Comiteacute Internacional de Taxonomiacutea de Virus (ICTV por sus siglas en ingleacutes)
clasificoacute en 6 geacuteneros de los cuales 5 corresponden a la clasificacioacuten propuesta por Bradley
los grupos T4 λ φX174 MS2 y fd Los fagos pueden tener cola larga y flexible no contraacutectil
(Siphoviridae) cola larga y contraacutectil (Myoviridae) o cola corta (Podoviridae) como se observa
en la tabla 4 Para la clasificacioacuten de los fagos se aplican propiedades como el rango de
hueacutespedes y las relaciones inmunoloacutegicas sin embargo las maacutes importantes son su
morfologiacutea y las caracteriacutesticas de su aacutecido nucleico el cual se adsorbe a componentes de la
superficie celular que actuacutean como receptores especiacuteficos La zona de adsorcioacuten del virus es
complementaria al receptor celular por lo tanto un determinado fago soacutelo puede infectar un
nuacutemero limitado de cepas celulares que contengan a un determinado receptor La naturaleza
de la zona de adsorcioacuten variacutea con el tipo de fago En el T4 se localiza en el extremo de la cola
en donde se encuentran la placa basal las espiacuteculas y las fibras de la cola Las formas maacutes
complejas corresponden a los fagos con colas contraacutectiles (Atterbury et al 2003)
Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos
(Ackermann 2003)
Antecedentes
39
E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico
La multiplicacioacuten de los fagos (figura 4) ADN produce la destruccioacuten de la ceacutelula hueacutesped
mediante lisis lo que provoca su liberacioacuten El ciclo vital de un fago que culmina con el
estallido de la ceacutelula hueacutesped y la liberacioacuten de viriones recibe el nombre de ciclo liacutetico Los
acontecimientos que tienen lugar durante el ciclo liacutetico se revisaraacuten en esta seccioacuten con
especial atencioacuten a los fagos T-par de E coli Estos son fagos de ADN bicatenario con colas
contraacutectiles complejas de la familia Myoviridae son algunos de los virus maacutes complejos
conocidos (Fernaacutendez 2008)
Figura 4 Adsorcioacuten del fago T4 e inyeccioacuten del ADN (Leverentz et al 2003)
Los fagos podriacutean infectar hasta un 70 de la poblacioacuten de procariotas marinos y ser
responsables de la tercera parte de la mortalidad bacteriana acuaacutetica Tambieacuten se han
detectado virus que infectan diatomeas y otras algas importantes del fitoplancton marino lo
cual es de gran transcendencia ecoloacutegica ya que la multiplicacioacuten de bacterias marinas
supera la capacidad de reproduccioacuten de los protozoos La lisis por virus de ceacutelulas procariotas
y de algas puede tambieacuten contribuir enormemente en los ciclos del carbono y nitroacutegeno en las
cadenas troacuteficas marinas incluso podriacutea reducir el nivel de productividad marina como la de
moluscos y peces (Muniesa et al 2005)
E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten
Los fagos no se unen al azar a la superficie de una ceacutelula hueacutesped por el contrario se fijan
a receptores especiacuteficos La naturaleza de estos receptores variacutea de acuerdo al fago pueden
Antecedentes
40
ser lipopolisacaacuteridos y proteiacutenas de la pared celular aacutecidos teicoicos flagelos y pili Los fagos
T-par de E coli en particular utilizan lipopolisacaacuteridos o proteiacutenas de la pared celular como
receptores Las variaciones en las propiedades del receptor son parcialmente responsables
de las preferencias del fagos por el hueacutesped (Muniesa et al 2005 Leeuw et al 2017)
La adsorcioacuten de fagos T-par estaacute relacionada con diversas estructuras del tallo La fijacioacuten
del fago comienza cuando una fibra del tallo establece contacto con los receptores adecuados
a medida que maacutes fibras contactan con los receptores la placa basal se asienta en la
superficie La unioacuten se debe probablemente a interacciones electrostaacuteticas y se ve influida por
el pH y por la presencia de iones como Mg+2 y Ca+2 Una vez que la placa basal estaacute
firmemente asentada en la superficie celular se producen cambios conformacionales en ella
y en la vaina del tallo Esta uacuteltima se reorganiza de tal forma que se contrae pasando de una
conformacioacuten en cilindro de 24 anillos a otra de 12 anillos de longitud maacutes corta y ancha es
entonces cuando el tubo central es empujado a traveacutes de la pared celular bacteriana
Finalmente el ADN es extruido de la cabeza pasa a traveacutes del tubo del tallo y penetra en la
ceacutelula hueacutesped Parece ser que el tubo interacciona con la membrana plasmaacutetica para formar
un poro a traveacutes del cual pasa el ADN los mecanismos de penetracioacuten de otros fagos difieren
a menudo de los fagos T-par aunque no se han estudiado en detalle (Leverentz et al 2003)
F Biofilm
Las bacterias existen en la naturaleza bajo dos formas o estados a) bacterias planctoacutenicas
de libre flotacioacuten y b) bacterias biofilm en colonias de microorganismos seacutesiles (Nazar 2007)
Un biofilm se define como una agrupacioacuten de comunidades seacutesiles microbianas que se fijan a
superficies las ceacutelulas estaacuten incrustadas en una matriz autoproducida que actuacutea como
proteccioacuten quiacutemica y mecaacutenica del entorno asiacute estas bacterias presentan mayor resistencia
a desinfectantes y el secado (Vestby et al 2009) Las bacterias pueden crear condiciones
para formar biofilms casi en cualquier ambiente liacutequido La interfase soacutelido-liacutequido entre una
superficie y un medio acuoso (vgr leche) proporciona un entorno ideal para la fijacioacuten y
crecimiento de microorganismos (Fakruddin et al 2014)
Antecedentes
41
G Microscopiacutea electroacutenica
Los microscopios electroacutenicos se usan habitualmente para el estudio detallado de
estructuras celulares (Bradley 1967) Para analizar las estructuras internas es esencial el
microscopio electroacutenico de transmisioacuten MET En el MET se utilizan electrones en lugar de rayo
de luz las lentes son electromagneacuteticas y se opera en todo momento a alto vaciacuteo
(Ackermann 2003) El poder de resolucioacuten del microscopio electroacutenico es mucho mayor que
el del microscopio oacuteptico incluso pueden observarse estructuras moleculares como proteiacutenas
y aacutecidos nucleicos Sin embargo los haces de electrones tienen escaso poder de penetracioacuten
y una ceacutelula aislada es demasiado gruesa para poder visualizarse directamente por este
motivo se emplean teacutecnicas especiales para la obtencioacuten de cortes ultrafinos a fin de poder
observar las muestras Una ceacutelula bacteriana por ejemplo se corta con una cuchilla especial
en varios cortes ultrafinos de 20-60 nm de espesor que son posteriormente examinados de
manera individual en el microscopio electroacutenico (Fuster-Valls et al 2008) Para obtener
suficiente contraste las preparaciones se tintildeen previamente mediante tratamiento con
compuestos como aacutecido oacutesmico permanganato sales de uranilo o de lantano o plomo Como
estas sustancias poseen aacutetomos pesados son capaces de desviar los electrones y aumentar
el contraste (Madigan y Martinko 2006)
La microscopiacutea electroacutenica es el mejor meacutetodo para estudiar la forma de las bacterias Los
virus bacterianos por tener un diaacutemetro menor de 1000 Aring estaacuten por debajo del liacutemite de
resolucioacuten del microscopio oacuteptico sin embargo es posible observarlos mediante el
microscopio electroacutenico porque eacuteste utiliza una radiacioacuten de longitud de onda maacutes corta que
permite aumentar 100 mil veces una resolucioacuten de 10 Aring (Kruger et al 2000 Ackermann
2003) Para observar detenidamente la morfologiacutea se requiere el microscopio electroacutenico con
especificaciones precisas como el de barrido lo cual es una herramienta indispensable en
biologia molecular (Guzmaacuten 2015)
Para la observacioacuten las partiacuteculas se suspenden en un medio volaacutetil por lo general una
solucioacuten de acetato de amonio y se colocan sobre una membrana sostenida por una rejilla
metaacutelica que praacutecticamente no absorbe electrones El problema teacutecnico maacutes frecuente es la
falta de contraste como la imagen obtenida es el resultado de la dispersioacuten de electrones por
los aacutetomos de la partiacutecula se necesita una diferencia apreciable de poder dispersivo entre las
partiacuteculas y el medio de soporte generalmente se emplean teacutecnicas tradicionales La maacutes
utilizada se conoce como tincioacuten negativa consiste en mezclar la suspensioacuten del fago con
Antecedentes
42
fosfovolframato de sodio o acetato de uranilo a pH neutro A este pH las sales no se combinan
con el fago al secarse forman una capa uniforme y opaca a los electrones en la cual los fagos
destacan como partiacuteculas maacutes claras Como las sales en solucioacuten penetran las irregularidades
en la superficie de la partiacutecula la micrografiacutea revela los detalles finos de los fagos (Fuster-
Valls et al 2008 Montantildeez et al 2012)
La forma del fago se establece de manera visual que es directa de la placa cuando las
UFP que se observan a simple vista como placas liacuteticas a contraluz (APHA 2005) Y para
estudiar la adhesioacuten y formacioacuten celular en diversas superficies se han desarrollado varias
teacutecnicas de microscopiacutea entre las cuales se distinguen la microscopiacutea electroacutenica de barrido
y de transmisioacuten asiacute como la microscopiacutea de epifluorescencia (Fuster-Valls et al 2008) la
cual se basa en los mismos principios de oacuteptica de la microscopiacutea comuacuten con diferencias en
el manejo y el disentildeo relacionadas con la generacioacuten y transmisioacuten de longitudes de onda
adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar ya sean propios de la muestra o de
la coloracioacuten utilizada (Franco 2005)
El fundamento de la teacutecnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o
compuestos fluorescentes denominados fluorocromos en fijarse a los anticuerpos mediante
un enlace quiacutemico estable que no puede romperse durante el curso de la reaccioacuten
inmunoloacutegica La espectroscopia de fluorescencia es la teacutecnica de deteccioacuten oacuteptica maacutes
sensible En el caso de la deteccioacuten en ceacutelulas se exponen a alta energiacutea utilizando laacutemparas
de xenon excitando por varios nanosegundos y asiacute emitiendo una longitud de onda de baja
energiacutea (Franz y Jendreizik 2015)
H Fagoterapia
Las enfermedades infecciosas estaacuten catalogadas entre las primeras causas de muerte en
el mundo y por lo tanto son consideradas un problema de salud puacuteblica Entre ellas las
infecciones bacterianas causan gran preocupacioacuten dado que las bacterias adquieren diacutea a
diacutea mayor resistencia a los antibioacuteticos esto ocurre por medio de diversos mecanismos
fisioloacutegicos y moleculares que les permiten a estos microorganismos adaptarse raacutepidamente
a condiciones adversas (Prada-Pentildearanda et al 2015)
El descubrimiento de los fagos por dacuteHerelle se desarrolloacute cuando eacuteste buscaba una
Antecedentes
43
vacuna que pudiera combatir la crisis de disenteriacutea hemorraacutegica que se presentoacute en 1915 en
las afueras de Francia dacuteHerelle observoacute que tras aislar lisados libres de bacterias de la
materia fecal de los enfermos las bacterias eran destruidas por un agente desconocido
invisible capaz de destruir cultivos de bacterias o producir pequentildeas aacutereas de color maacutes claro
cuando las bacterias eran crecidas en confluencia en placas de medio soacutelido y publicoacute sus
observaciones en el artiacuteculo titulado ldquoSobre un microbio invisible antagonista de los bacilos
de la disenteriacuteardquo (Szafranski et al 2017)
El uso de los fagos como agentes terapeacuteuticos comenzoacute hace maacutes de 80 antildeos Entre los
ejemplos maacutes destacados y recientes de la utilizacioacuten exitosa de la fagoterapia cabe citar el
uso de fagos especiacuteficos en el control bioloacutegico de E coli O157H7 productora de colitis
hemorraacutegica (en alimentos) Tambieacuten se ha estudiado el uso de fagos en el tratamiento de
infecciones peritoneales y otitis externa en la erradicacioacuten de P aeruginosa en pacientes con
fibrosis quiacutestica en el tratamiento de infecciones urinarias y osteomielitis por S aureus y en
la descolonizacioacuten intestinal para combatir las infecciones por Enterococcus faecium
resistente a vancomicina entre otros Los efectos favorables de la fagoterapia podriacutean
exceder incluso su actividad antibacteriana Hay datos sorprendentes acerca de la actividad
in vivo de los fagos el conocido fago T4 de E coli podriacutea inhibir la adsorcioacuten y la replicacioacuten
de adenovirus en sus ceacutelulas blanco y el fago Pf4 de P aeruginosa habriacutea sido capaz de
inhibir el desarrollo de cepas de Aspergillus por secuestro de hierro (Lopardo 2017)
El estudio y desarrollo de nuevos tratamientos alternativos es de particular intereacutes en la
lucha contra la resistencia bacteriana Los fagos presentan caracteriacutesticas que los hace una
excelente herramienta contra las bacterias patoacutegenas debido a su especificidad y seguridad
ecoloacutegica Los fagos no solo son atractivos desde un punto de vista cliacutenico Se han utilizaacutedo
como potenciales aplicaciones en otras aacutereas como la agricultura el control de alimentos o
la industria como a continuacioacuten se describe en la siguiente tabla 5 Los fagos son una
solucioacuten ecoloacutegica ubicua para desarrollar nuevos tratamientos contra las bacterias aunque
se deben realizar maacutes estudios para comprender mejor la relacioacuten entre ellos y las bacterias
antes de su aplicacioacuten (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)
Antecedentes
44
Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos la naturaleza lugares
urbanizados y cuerpo humano (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)
Fuente Sitio encontrado
Naturaleza
Suelo y superficie terrestre
Agua continental y oceaacutenica
Ambientes extremos hielo marino pared de
algas zonas hipersalinas etc
Lugares artificiales
Hospitales y zonas similares
Planta de tratamiento de aguas negras
Algunas zonas bajo el impacto humano
Cuerpo de animales
Tracto digestivo y vagina
Tracto respiratorio y oral
Piel y epitelio mucoso
Los productos comerciales para terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones
Los fagos se pueden distribuir liofilizados y se disuelven antes de la administracioacuten por viacutea
intravenosa en un soporte adecuado como por ejemplo una solucioacuten acuosa o tampoacuten o
suspenderse en cualquier liacutequido adecuado coloidal o de la matriz de poliacutemeros para crear
bactericidas el principio activo se puede administrar de una manera conveniente como por
inyeccioacuten (subcutaacutenea intravenosa administracioacuten etc) por viacutea oral pulmonar (por ejemplo
aerosoles o por otros dispositivos a los pulmones) spray nasal intramuscular intraperitoneal
intrahecal intraviacutetrea vaginal rectal la puncioacuten lumbar y la aplicacioacuten directa Dependiendo
de la viacutea de administracioacuten el principio activo puede estar recubierto de un material que
preserve la sustancia de la accioacuten de enzimas aacutecidos y otras condiciones naturales que
pueden inactivar la sustancia (por ejemplo comprimidos recubiertos enteacutericos o pastillas)
Empresas dedicadas a la biotecnologiacutea se dedicaron a desarrollar productos utilizando fagos
especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan ETA la Food and Drug Administration de
los EE UU (FDA) incluye a los fagos en la categoriacutea de aditivos alimentarios la FDA ha
publicado la aprobacioacuten de seis fagos para usar en alimentos listos para comer (ready to eat)
efectivos para L monocytogenes de la compantildeiacutea Intralytix La compantildeiacutea Omnilytics ofrece
productos de control bacterial para varias aacutereas como son agricultura agua y alimentos
industrias que se pueden observar en su paacutegina web (httpswwwomnilyticscom) y otras
empresas como Biophage Pharma Inc (Canada) Exponential Biotherapies (EE UU)
(Segundo 2010)
Antecedentes
45
Estas nuevas estrategias de intervencioacuten eco-amigable son requeridas como agente de
biocontrol en contra de Salmonella Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos
antildeos debido a sus caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutef ico sin
dantildear la micro-flora en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros
distribucioacuten de esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla
algunos ejemplos de la aplicacioacuten de los fagos son los descritos en la siguiente tabla 6 (Oh y
Park 2017)
Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria (Oh y
Park 2017)
Compantildeiacutea Producto del fago Organismo hueacutesped
FINK TEC GmbH (Alemania) Secure Shield E1 E coli
Intralytix Inc
(EE UU)
Ecolicidereg (EcolicidePXtrade) E coli O157H7
EcoShieldtrade E coli O157H7
ListShieldtrade L monocytogenes
SalmoFreshtrade Salmonella spp
ShigaShieldtrade
(ShigActivetrade) Shigella spp
Micreos Food Safety
(Holanda)
PhageGuard Listextrade L monocytogenes
PhageGuard Strade Salmonella spp
E coli O157H7
Passport Food Safety Solutions
(EE UU) Finalysereg E coli O157H7
Phagelux (China)
AgriPhag
Xanthomonas campestris pv
vesicatoria Pseudomonas
syringae
pv tomato
SalmoProreg Salmonella spp
Salmonella spp
Antecedentes
46
47
III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO
48
Objetivos y plan de trabajo
49
A Objetivo general
El objetivo general de este estudio es aislar y caracterizar fagos frente Salmonella spp a
partir de diversas fuentes ambientales para su uso potencial en el control bioloacutegico
El control de Salmonella spp es de gran intereacutes para la industria alimentaria por lo que
encontrar alternativas para su eliminacioacuten es de gran impacto en la salud puacuteblica
B Objetivos especiacuteficos
1- Aislar fagos de Salmonella proveniente de muestras de aguas residuales de la ZMM y
muestras de lavado de carne pollo de un establecimiento donde se comercializa esta carne
2- Caracterizar parcialmente los fagos aislados en base a su morfologiacutea por TEM y el
anaacutelisis de sensibilidad frente a diversas cepas bacterianas
3- Estudiar el efecto de los fagos previamente aislados desarrollando un biofilm de
Salmonella spp sobre discos de acero inoxidable utilizando la DEM
C Plan de trabajo
Para alcanzar los objetivos establecidos se considera la ubicacioacuten de las fuentes para la
obtencioacuten de los fagos en este caso el medio seleccionado son riacuteos arroyos asiacute como un
establecimiento donde se procesan canales de pollo en la ZMM y las lagunas de oxidacioacuten
de aguas residuales en Mariacuten ambas localidades en Nuevo Leoacuten Meacutexico
Posteriormentese utilizaraacute la teacutecnica ADC y se verificaraacute en cual de estas muestras se
podriacutean encontrar fagos que sean liacuteticos para Salmonella enterica y posteriormente se
realizaraacuten pruebas de selectividad con la meta de caracterizar los fagos aislados frente a
diferentes hueacutesped (cepas de Salmonella spp y de E coli) y la observacioacuten de la morfologiacutea
se realizaraacute por el TEM
Salmonella spp presenta un periacuteodo de incubacioacuten por lo general entre 12 y 36 horas
tras el cual el derarrollo bacteriano en las superficies puede dar como resultado la formacioacuten
de un biofilm Para este estudio se desarrollaraacute un biofilm de Salmonella spp sobre discos
de acero inoxidable en condiciones de humedad esto es importante por la fase de eclipse
Objetivos y plan de trabajo
50
(momento en el cual atacan y se desarrollan los fagos) Se probaraacuten 3 concentraciones de
fago 6 7 y 8 UFPmL Se realizaraacuten recuentos durante un periacuteodo de incubacioacuten de 72 h
Con el fin de conseguir estos objetivos el presente trabajo se ha estructurado en tres
secciones las cuales se pueden observar en la figura 5 incluyendo las pruebas con DEM
en los discos de acero inoxidable
Figura 5 Diagrama general de trabajo
51
IV MATERIALES Y MEacuteTODOS
52
Materiales y meacutetodos
53
A Toma de muestras
Las muestras para obtencioacuten de fagos se recolectaron en diez sitios del aacuterea metropolitana
de Monterrey y del municipio de Mariacuten Nuevo Leoacuten (tabla 7) El meacutetodo que se utilizoacute para
aislar fagos de diversas fuentes medio ambientales y su posterior traslado al laboratorio fue
el descrito por Higgins et al (2005) Se obtuvieron las muestras provenientes de aguas
residuales y riacuteos se emplearon frascos de 450 mL previamente lavados y secos que
posteriormente se impregnaron con una solucioacuten de tiosulfato de sodio (Na2S2O3bull5H2O) al
10 (pv) (Sigma-Aldrich EE UU) y se esterilizaron en autoclave 121ordmC15min Al momento
de hacer la recoleccioacuten en campo los frascos fueron abiertos cuidadosamente y se llenaron
con el liacutequido se almacenaron en hieleras para su traslado al laboratorio el tiempo que
transcurrioacute desde la toma de la muestra hasta la llegada al laboratorio fue entre 1 y 3 h
posteriormente las muestras se centrifugaron el mismo diacutea y los sobrenadantes se
almacenaron 4oC hasta su uso (Vidales-Contreras et al 2006)
A cada una de las muestras obtenidas en el muestreo se le agregoacute 25 de cloroformo
(grado de reactivo 995 Sigma-Aldrich EE UU) para conservarlas en condiciones oacuteptimas
para su posterior llegar al laboratorio se mantuvieron a 4degC durante toda la noche para
permitir que el material grueso decante Mientras tanto en lo referente a las muestras
obtenidas de aguas provenientes de los establecimientos expendedores de pollos las
muestras se trataron igual pero como el sobrenadante contiene grasa se optoacute por filtrar y
posteriormente se realizoacute el mismo procedimiento antes descrito
Materiales y meacutetodos
54
Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos
B Obtencioacuten de fagos
Para aislar los fagos se utilizoacute la teacutecnica descrita por Sambrook y Russell (2001) la cual se
describe a continuacioacuten En un tubo de ensayo (16150 mm Fisherbrand EE UU)
conteniendo 45 mL de agar suave (AS) (Bioxon Meacutexico) mantenieacutendose a temperatura de
40C (en una cuba hidroneumaacutetica con agua) se colocaron 500 L de un cultivo de S
Enteritidis (provenientes del cepario del CINSP) en fase logariacutetmica y se agregaron 300 L
de las muestras recolectadas en las que se presume conteniacutean los fagos especiacuteficos para
esta cepa Se agitoacute el tubo de ensayo mezclando con movimientos circulares suaves para
evitar la formacioacuten de burbujas este procedimiento se realizoacute aproximadamente por 5
segundos El contenido se vertioacute uniformemente sobre una caja de Petri (10015 mm
Fisherbrand EE UU) conteniendo agar soya tripticasa (AST) (Bioxon Meacutexico) y se dejoacute a
temperatura ambiente hasta solidificar la ADC Se incuboacute a 37C por 24h Al momento de
observar el desarrollo de las placas de lisis (calvas) se procedioacute al aislamiento de los fagos
Su cuantificacioacuten se realizoacute de manera directa e inmediata ya que las calvas son visibles con
una iluminacioacuten de contraste (Breeuwer et al 2003) Posteriormente los fagos que si formaron
halos de inhibicioacuten fueron aislados de manera directa o siguiendo uno de los dos protocolos
(enriquecimiento y sin enriquecer) debido a que depende principalmente de la amplificacioacuten
del fago y las caracteriacutesticas de cada uno se describen a continuacioacuten
Municipio Sitio de la toma
Monterrey
Parque Fundidora
Riacuteo Santa Catarina
Establecimiento de comida
Av Conductores
Mariacuten Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal
Riacuteo La Libertad
Guadalupe Alcantarillas de la colonia La Azteca
Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados
San Nicolaacutes de los Garza Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac
Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea
Materiales y meacutetodos
55
B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos
Con el protocolo de enriquecimiento se proporcionoacute las condiciones oacuteptimas de desarrollo
al cultivo de la bacteria hueacutesped y la muestra al inocular el cultivo en la muestra y de esta
manera amplificar los posibles fagos que presentes en la muestra de agua
Se realizoacute este protocolo de la siguiente manera primero se seleccionoacute la cepa bacteriana
que seraacute el hueacutesped esto se consiguioacute haciendo un cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y
se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por otra parte se prepararon
aliacutecuotas (10 mL cada una) de cada una de las muestras recolectadas (enriquecidas con
cultivo bacteriano) y se centrifugan a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a
4degC despueacutes el sobrenadante se pasoacute por jeringa y con filtros de 022 microm (Millex-GP
polyethersulfone 33 mm radio-sterilized) Estas dos entidades biloacutegicas se unieron en un
matraz de capacidad de 50 mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon
Meacutexico) a doble concentracioacuten (20) En este matraz se agregaron 300 microL de la muestra
previamente filtrada con fagos y 500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incuboacute a 37degC por
24 h posteriormente por medio de la teacutecnica de ADC se pudo observar la formacioacuten de halos
de lisis de los fagos (Vidales-Contreras et al 2006)
B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos
El protocolo se emplea para adicionar directamente de la muestra una aliacutecuota y testarla
con la bacteria hueacutesped Se siguieron los pasos anteriormente descritos a este protocolo
primero se seleccionoacute la cepa bacteriana (hueacutesped) esto se realizoacute haciendo un cultivo fresco
(AST) (Bioxon Meacutexico) y se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por
otra parte se preparoacute aliacutecuotas (10 mL) de cada una de las muestras recolectadas y se
centrifugaron a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a 4degC despueacutes el
sobrenadante se pasoacute por jeringa con filtros de 022 microm (Millex-GP polyethersulfone 33 mm
radio-sterilized) Estas dos entidades bioloacutegicas se unieron en un matraz de capacidad de 50
mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon Meacutexico) a doble
concentracioacuten (20) A este matraz se agregaron 300 microL de la muestra filtrada con fagos y
500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incubaron a 37degC por 24h posteriormente por medio
de la teacutecnica de ADC se observaron la formacioacuten de halos de lisis de los fagos (Vidales-
Materiales y meacutetodos
56
Contreras et al 2006)
B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas
Despueacutes de que los cultivos bacterianos se reactivaron la preparacioacuten para trabajar con
ellos fue la siguiente se tomoacute una asada de una colonia bacteriana bien diferenciada y se
incuboacute en un tubo inclinado (punta de flauta) se dejoacute el cultivo toda la noche y posteriormente
se traspasoacute a un subcultivo en caldo con infusioacuten cerebro-corazoacuten (BHI Merck Alemania) e
incuboacute a 37degC durante 24 h posteriormente se subcultivoacute en BHI en las mismas condiciones
Una colonia aislada en tubo punta de flauta se inoculoacute en 9 mL de agua peptonada (3M
Meacutexico) y se incuboacute a 37degC durante 24 h luego se realizaron mezclas seriadas en diluyente
(1 gL triptona 85 gL NaCl pH 72) (Merck Alemania) y se implantaron en las superficies de
los discos de acero inoxidable tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm con
un volumen inferior a 50 microL Como control del inoacuteculo se prepararon 5 placas de TSA
En el caso del fago obtenido se amplificoacute realizando la infeccioacuten en repetidas ocasiones
hasta alcanzar una concentracioacuten de 1x107 UFPmL
B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos
Para la realizacioacuten de este estudio se utilizaron cepas bacterianas de Salmonella enterica
y E coli provenientes de diversas colecciones de los laboratorios involucrados tambieacuten se
utilizoacute un fago de prueba (PRD1) para ser utilizado como control positivo en los aislamientos
En la tabla 8 se muestran las bacterias y el fago indicando su denominacioacuten y origen asiacute como
las condiciones de conservacioacuten
Materiales y meacutetodos
57
Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten
Origen Cepa bacteriana fagos Clave Condiciones de conservacioacuten
FaSPyN
S Typhimurium ATCC 13311
Glicerol a -20degC S Paratyphi ATCC 9150
S Enteritidis ATCC 13076
FCB S Typhi ATCC 19430 BGA TSA 4degC
FAUANL
S Typhimurium TSA 4degC
Fago PRD1
Tampoacuten fosfato 4degC
E coli CECT 515
E coli K12
E coli ATCC 10536
E coli O157H7 CECT 4783
S bongori ATCC 43975
UAB
S enterica LT2
Vial liofilizado a -20degC
S enterica sub enterica CECT 4138
S enterica sub enterica CECT 4594
S enterica sub enterica CECT409
S enterica sub enterica CECT 698
S Typhimurium CCUG 29478
Para la reactivacioacuten de los cultivos que se almacenan a 4degC se dejaron a temperatura
ambiente igualmente para los congelados Posteriormente para sacarlos del estreacutes se
sembraron en medio de cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y se incubaron a 37degC por 24
horas tras estas condiciones ya se pudieron utilizar en los ensayos (McLaughlin et al 2006)
A continuacioacuten se describe la forma en que se reactivaron los cultivos en este estudio de
acuerdo a la forma en que estaban almacenados
a) Cultivos almacenados en glicerol
Se descongelaron los viales a temperatura ambiente
Materiales y meacutetodos
58
Se transfirieron 5 microL de cultivo en 20 mL de TSB (Becton Dickinson Co) y se incuboacute a
37degC toda la noche
Se sembroacute en tres campos en caja de Petri de 90 mm con TSA (Becton Dickinson Co)
Se incuboacute a 37degC por 24h
Se seleccionoacute una colonia aislada y bien diferenciada
El cultivo (colonia) se incuboacute en 20 mL de TSB a 37degC toda la noche
b) En caso de los cultivos liofilizados
En el vial se hidrataron los cultivos agregando 1 mL de TSB e incubando 1h a 37degC
Se vertioacute el cultivo en 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC toda la noche
Se realizoacute el mismo proceso anteriormente mencionado en a)
B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC)
La siembra o inoculacioacuten consistioacute en introducir artificialmente una porcioacuten de muestra
(inoacuteculo) en un medio adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano para su desarrollo
y multiplicacioacuten Una vez inoculado el medio se incuboacute a una temperatura adecuada para el
oacuteptimo crecimiento en promedio 37degC Los meacutetodos de conteo en placa como capa doble y
capa simple de agar se basan en la determinacioacuten de la concentracioacuten viral mediante el
conteo de UFP las cuales son zonas de aclaramiento circular o halo de inhibicioacuten de
crecimiento bacteriano que se producen en la capa o ceacutesped bacteriano debido a la lisis
producida por los fagos Inicialmente una partiacutecula de fago infecta a su bacteria hueacutesped se
replica y posteriormente se disemina generando una zona circular sin crecimiento de la
bacteria (Solano et al 2012) Por esta razoacuten en nuestro estudio se utilizoacute esta manera de
trabajar considerando las diferentes formas que se puede presentar los halos de inhibicioacuten
(forma tamantildeo densidad)
La teacutecnica se basoacute en mezclar el cultivo bacteriano en fase logariacutetmica y el fago en agar
suave (AS) tambieacuten llamado top agar cuando se aplica a la placa de Petri donde se realizoacute
el proceso de infeccioacuten El AS se preparoacute con TSB y agar bacterioloacutegico (15) para obtener
una consistencia semisoacutelida que permita el desarrollo de las calvas en el ceacutesped bacteriano
Se mantuvo a una temperatura adecuada para conservar el estado liacutequido y se agitoacute
cuidadosamente para dejar interactuar los cultivos fago-hueacutesped en el tubo de ensayo
Materiales y meacutetodos
59
posteriormente se dispersoacute de manera uniforme en placas de Petri de 90 mm de diaacutemetro con
15 mL de TSA La suspensioacuten (ceacutesped bacteriano en ADC) se dejoacute solidificar a temperatura
ambiente unos minutos y posteriormente se incuboacute 24h37degC (Vidales-Contreras et al 2006)
B6 Modelo de infeccioacuten
Las enzimas endolisinas de los fagos provocan la lisis debilitamiento y rompimiento de la
pared celular de las bacterias La lisis depende de la proporcioacuten de fagos y hueacutesped o
multiplicidad de infeccioacuten (Multiplicity of infection MOI) Cuando hay una MOI baja la relacioacuten
de fagos a bacterias no es superior a 21 Cuando la MOI es alta es decir muchos fagos frente
a pocas bacterias las ceacutelulas se lisan directamente (Dimmock et al 2007)
En ese sentido la Norma ISO 10705-11995 indica que durante el ensayo el fago en fase
de multiplicacioacuten experimenta varios ciclos de replicacioacuten lo que resulta en la muerte de la
ceacutelula hueacutesped que ha actuado como faacutebrica para la produccioacuten viral El modelo que se siguioacute
es para observar los halos de inhibicioacuten y contrastar los resultados En la figura 6 se presenta
el modelo de infeccioacuten utilizado con S Typhimurium y el fago PRD1 siguiendo el modelo de
Vidales-Contreras et al (2006) y la puesta a punto propuetas por Sambrook y Russell (2001)
Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten fago-hueacutesped
Materiales y meacutetodos
60
B7 Controles utilizados durante los ensayos
Se utilizoacute la cepa de S Typhimurium y el fago PRD1 como control positivo para observar
la formacioacuten de las calvas para el control negativo se utilizoacute agua esterilizada con esto se
asegurar que si existe infeccioacuten y evitar los falsos positivos que ocurren primordialmente por
contaminacioacuten
Para control negativo el ceacutesped bacteriano se obtuvo de la siguiente manera en un
tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de cultivo de S
Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de agua destilada esteacuteril la mezcla se vertioacute
en placa Petri con TSA
Como control positivo el ceacutesped bacteriano y las placas de lisis se obtuvieron como
sigue en un tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de
cultivo de S Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de fagos PRD1 la mezcla se
vertioacute en placa Petri con TSA
B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium
Para realizar los ensayos microbioloacutegicos se requirioacute trabajar con la misma cantidad de
biomasa en una fase de crecimiento similar El conteo en placa es un meacutetodo de medicioacuten de
biomasa que permite el recuento de ceacutelulas viables y consiste en determinar el nuacutemero de
ceacutelulas capaces de reproducirse y generar colonias sobre un medio soacutelido (cada ceacutelula viable
da origen a una colonia) Para este estudio y ver el efecto de los fagos sobre las bacterias
primeramente se calculoacute la curva de crecimiento celular pues es imprescindible para realizar
la infeccioacuten que la bacteria hueacutesped y se encuentre en fase logariacutetmica Es decir para
determinar la biomasa bacteriana se mide la cineacutetica de crecimiento celular y se considera
que se ha alcanzado la fase de crecimiento exponencial cuando la concentracioacuten es de 10⁸
UFCmL (McLaughlin et al 2006)
Para el conteo bacteriano se utilizoacute el meacutetodo de filtracioacuten por membrana
Se transfirioacute 1 mL del cultivo bacteriano fresco a 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC
Cada 30 minutos se recolectaron 300 microL de cultivo
A cada aliacutecuota recogida se le realizaron diluciones seriadas con 27 mL de agua
Materiales y meacutetodos
61
destilada esteacuteril hasta obtener un factor de 1010
De cada una de estas diluciones se obtuvieron 100 microL que se filtraron por membrana
de celulosa 045 microm (Millipore Corporation Billerica Ma 47 mm esteacuteril Cat No
JMX000089 Millipore) montada en un embudo de filtracioacuten magneacutetico de 47 mm (Pall
GELMAN Laboratory con capacidad de 300 mL) y con bomba de vaciacuteo (GM motors amp
industrial systems Modelo 5kh36kna510x)
Las membranas se colocaron en caja de Petri con TSA y se incubaron 24h a 37degC
C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos
Con excepcioacuten de la microscopiacutea electroacutenica los meacutetodos empleados para determinar el
tamantildeo forma y composicioacuten quiacutemica de los fago requieren una alta pureza de las partiacuteculas
virales El material de partida en cualquier estudio de este tipo para la obtencioacuten del fago es
cuando se presenten los halos de inhibicioacuten en el ADC en general ademaacutes de los fagos
estas zonas claras pueden contener los restos celulares de las bacterias como trozos de
pared membranas ribosomas ADN ARN proteiacutenas y otros componentes de peso molecular
maacutes bajo El contenido de fago en un lisado es del orden de 001 mg mL por lo que para
obtener la cantidad apropiada para su caracterizacioacuten es necesario partir de varios litros
(Leverentz et al 2003 Maestro y Sanz 2016)
Para llevar a cabo la purificacioacuten de los fagos se debe de realizar con concentraciones
superiores a 1010 UFPmL Uno de los meacutetodos maacutes utilizados es la centrifugacioacuten a alta
velocidad y posterior resuspensioacuten de las partiacuteculas sedimentadas en un volumen menor
Cuando es posible esta teacutecnica se reemplaza por un sistema de dos fases basado en la
propiedad que tienen algunos poliacutemeros de alto peso molecular como el polietilenglicol el
dextrasulfato de sodio y el dextrano al separarse estas fases por diferencia de pesos
moleculares los fagos se dispersan en este tipo de medios considerando las concentraciones
empleadas y las condiciones oacuteptimas de pH fuerza ioacutenica y temperatura y al pasar por el
proceso de centrifugacioacuten se concentran en una columna Una vez concentrado el fago en la
columna se puede recuperar faacutecilmente de la interfase Los procesos maacutes comuacutenmente
utilizados para la purificacioacuten posterior se basan en separar las partiacuteculas de fago ya sea por
su tamantildeo o densidad (Sambrook y Russell 2001 Vidales-Contreras et al 2006)
En la figura 7 se presenta el procedimiento para la amplificacioacuten de fagos que nos asegura
Materiales y meacutetodos
62
cultivos puros uniformes y con tiacutetulos altos lo cual es imprescindible para conseguir una
buena imagen en el microscopio electroacutenico
Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten de bacteriofagos aplicando la teacutecnica
de agar doble capa (ADC)
El meacutetodo utilizado para purificar los fagos que despueacutes de utilizaron para analizar su
morfologiacutea implicoacute el uso del kit Montage SEQ96 (Millipore Sequencing Reaction Cleanup Kit
Millipore Corporation EE UU)
En una placa de filtracioacuten (96 well SEQ plate by Millipore) se depositaron en cada
pocillo 15 microL de concentrado de fagos maacutes 5 microL de agua milli-Q (Injection Solution by
Millipore)
Materiales y meacutetodos
63
La separacioacuten se realizoacute por la exclusioacuten de lavados de la columna de gel aplicando
vaciacuteo por medio de una bomba (Millipore EE UU Vacuumpressure 220 V50 Hz 15 mm
Hg)
Posteriormente se resuspendioacute la muestra (Thermomixer comfort by Eppendorf) con
agitacioacuten durante 1 min a 500 rpm
Finalmente se agregoacute 10 microL de agua ultra pura Milli-Q para concentrar la muestra
(Injection Solution by Millipore)
Una de las modificaciones que se realizaron para obtener los fagos con elevada pureza y
concentracioacuten para ser utilizada en la microscopiacutea electroacutenica se realizoacute con el kit Montage
SEQ96 que se utiliza para la purificacioacuten de DNA y en este caso se utilizoacute para concentrar los
fagos (concentracioacuten 1012 UFPmL) El procedimiento se describe a continuacioacuten
Se antildeadieron 20 microL de buffer de inyeccioacuten a la placa donde se teniacutea la suspensioacuten de
fagos se resuspendioacute y transfirioacute todo el volumen a la placa azul de Millipore (kit Montage)
Se colocoacute la placa en la bomba del kit Montage de 2 a 3 min hasta que quedoacute seca
Es aconsejable no dejar maacutes tiempo del necesario para evitar un secado excesivo
Se limpioacute todo el exceso de liacutequido en la placa con papel filtro secando un par de
veces la placa sobre el papel Inmediatamente despueacutes se colocoacute la placa sobre el soporte
de la bomba evitando dejarla sobre el papel
Se antildeadieron 30 microL de buffer de inyeccioacuten
Se colocoacute la placa en la bomba unos 4-5 min hasta secarse
Con papel filtro se limpioacute todo el exceso de liacutequido que quedoacute en la placa y se colocoacute
en el soporte de la bomba
Se antildeadieron 30 microL maacutes de buffer de inyeccioacuten para resuspender
Se colocoacute la placa en agitacioacuten se centrifugoacute a 500 g por 10 min
Se traspasaron los 30 microL a un nuevo pocillo y se recolectoacute el sobrenadante
D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica
Con la concentracioacuten de fagos purificados se preparoacute la muestra para la observacioacuten al
microscopio electroacutenico y se procedioacute utilizando la teacutecnica de tincioacuten negativa tal como se
explica a continuacioacuten
Se depositaron 2 microL de suspensioacuten de fagos en un disco de capa fina de carbono y cobre
Materiales y meacutetodos
64
(200 Mesh Holes 100 microm square Ethene old 200 RU) despueacutes de 2 min de reposo a
temperatura ambiente se eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente Se antildeadieron 2
microL de agente de contraste solucioacuten tampoacuten 1 de acetato de uranilo (UO2middot (CH3COO)2middot2H2O)
(Merck Alemania) Se dejoacute actuar el colorante durante 2 min a temperatura ambiente y se
eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente y despueacutes se dejoacute el disco alrededor de 5
min a temperatura ambiente antes de observar en el microscopio
D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa
(DEM)
La microscopiacutea oacuteptica es el meacutetodo adecuado para la investigacioacuten de procesos celulares
ya que es menos agresivo para el manejo de la muestra Existen teacutecnicas de microscopiacutea con
otras especificaciones donde se aplican para estudiar la adhesioacuten celular y formacioacuten de
biofilms en superficies tales como el espectrofotoacutemetro infrarrojo transformada de Fourier el
laacuteser confocal de barrido y la microscopiacutea de fuerza atoacutemica estos microscopios se
caracterizada por detectar las ceacutelulas viables de las dantildeadas por medio de cromoacuteforos
(Montantildeez et al 2012) La microscopiacutea que estamos trabajando esta basada en fluorescencia
la cual utiliza cromoacuteforos para detectar DNA de ceacutelulas vivas (coloracioacuten verde) y ceacutelulas
muertas (coloracioacuten roja) y ha tenido grandes avances en la observacioacuten de tejidos ceacutelulas
moleacuteculas individuales y por consiguiente algunos restos celulares todos estos con una
excelente resolucioacuten (Pellegrotti et al 2014)
Para la observacioacuten de ceacutelulas mediante el DEM se utilizoacute el kit comercial de viabilidad Bac
Light (LIVEDEAD Bacterial Viability Kit L-13152 Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE
UU) que estaacute compuesto por dos colorantes fluorescentes de aacutecidos nucleicos (SYTOreg9 y
PISYTOreg9) que penetran tanto en las membranas intactas como en las lesionadas lo que
permite evaluar la vitalidad de las ceacutelulas bacterianas basaacutendose en la deteccioacuten de la
actividad de las oxidasas y reductasas bacterianas Se observa una sentildeal fluorescente
mejorada en ceacutelulas bacterianas con procesos metaboacutelicos activos En contraste PISYTOreg9
se manifiesta soacutelo en las ceacutelulas que presentan membranas lesionadas y desplaza el colorante
SYTOreg9 por la transferencia de energiacutea de la resonancia fluorescente Cuando se aplican
estos dos colorantes en proporcioacuten adecuada las ceacutelulas viables con membranas intactas
presentaraacuten fluorescencia verde y en contraste las ceacutelulas muertas o lesionadas tendraacuten
Materiales y meacutetodos
65
coloracioacuten roja (Berney et al 2007)
A continuacioacuten se describe la preparacioacuten de las muestras para ser observadas por el DEM
Se colocaron 2 microL de la concentracioacuten suspensioacuten de la muestra con fagos en una
concentracioacuten de 1x1012 UFCmL sobre un disco de acero inoxidable (tipo 14301 (2 cm de
diaacutemetro y 1 mm de grosor) ligeramente convexos con una altura maacutexima en el centro
de 1 mm
Se dejoacute secar a temperatura ambiente por espacio de 10 min
Posteriormente se aplicaron 2 microL de la solucioacuten vital de fluorescencia (LIVEDEAD Bac
Light Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE UU) que reacciona y da la coloracioacuten
al material geneacutetico de las bacterias
Para la observacioacuten de los discos se utilizoacute el microscopio de fluorescencia Olympus
BX51BX52 (Tokio Japoacuten) con caacutemara digital incorporada (DP 50 Olympus) equipado con
laacutempara de mercurio de 100 W (USH-103 OL Olympus) con filtro de doble paso (U-M51004
FR V2 Olympus)
Para enumerar las ceacutelulas bacterianas en el biofilm que se formo en los discos de
acero inoxidable se trabajoacute con un objetivo de 20X y se ubicaban 10 campos
aleatoriamente y los resultados se expresaron por cm2 Las imaacutegenes se revisaron con el
sistema de anaacutelisis de imagen (anaacutelisis 32 soft Imaging System GMBH Alemania)
El biofilm bacteriano se desarrolloacute en la superficie de discos de acero inoxidable tipo
14301 Antes de usarse deben limpiarse bien por inmersioacuten en una solucioacuten acuosa de
detergente (DINO-dis-Dipol Espantildea) al 5 en agua durante 1 h despueacutes se realizoacute la
inmersioacuten en bantildeo con alcohol isopropiacutelico (2-propanol) (Merck Alemania) al 70 en agua
durante 15 min Una vez secos se esterilizaron en autoclave a 121degC por 15 min
D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM
Se inocularon la superficie de los discos con 50 microL de cultivo de S enterica maacutes medio de
cultivo (TSB) para proporcionar en medio rico para que se forme el biofilm posteriormente se
colocaron en cajas de Petri esteacuteriles y se mantuvieron en condiciones de humedad a
temperatura ambiente durante periacuteodos de 24 48 y 72h realizaacutendoles el conteo
correspondiente para verificar el desarrollo del biofilm
Materiales y meacutetodos
66
Una vez formado el biofilm se inocularon los discos con 3 concentraciones diferentes de
fagos 6 7 y 8 logcm2 en un volumen inferior a 50 microL Las diluciones del fago se hicieron en
solucioacuten salina fisioloacutegica (SSF cloruro de sodio 080) (Merck Alemania) Se realizoacute la
infeccioacuten al inocular a los discos prueba y los discos de control con el mismo volumen de SSF
las condiciones de incubacioacuten se realizaron con humedad y a temperatura ambiente
Los discos de acero inoxidable que fueron inoculados con la infeccioacuten fago-bacteria se
analizaron en periacuteodos de 0 2 8 24 y 48 h Se utilizaron para la valoracioacuten de bacterias y
fagos y se distribuyeron los discos de la siguiente manera 2 para visualizacioacuten microscoacutepica
panoraacutemica 2 para recuento bacteriano por microscopiacutea y 2 para recuento bacteriano dando
un total de 6 discos por caja de Petri por duplicado y por cada concentracioacuten (3) por cada
ensayo (3) y por horarios (5) de dando un total de 540 discos
Para el conteo sobre cada disco se colocaron 20 microL del colorante (LIVEDEAD Pribes) y
se incubaron por 5 min a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad y se tomaron
fotografiacuteas a 10X 20X y 40X Para la microscopiacutea de conteo las fotografiacuteas se realizaron a
un aumento de 40X considerando 10 campos aleatorios
Cuando se formoacute el biofilm se requirioacute hacer los recuentos de bacterias y de fagos en ese
sentido para recuperar las bacterias los discos se colocaron en un frasco con 5 mL de TSB
con Tween 80 (TSBTW) (Merck Alemania) y 3 g de perlas de vidrio se homogeneizoacute la
muestra por 1 min en agitador voacutertex a maacutexima potencia para favorecer el desprendimiento
de los microorganismos y posteriormente se realizaron diluciones seriadas De este mismo
extracto se obtuvo el material necesario para hacer el conteo de fagos utilizando la teacutecnica de
ADC Y para el recuento de las bacterias viables se trabajoacute con cajas de Petri se sembroacute 1
mL en TSA con 06 de extracto de levadura (TSAYE Merck Alemania) y se incuboacute a 37degC
durante 24h (Fuster-Valls et al 2008)
67
V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Resultados y discusioacuten
68
Resultados y discusioacuten
69
A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras
De los 10 sitios de recoleccioacuten se lograron obtener un total de 39 muestras en junio de
2007 En la tabla 9 se presentan los sitios y el nuacutemero de muestras recogidas en cada sitio
En el caso del Riacuteo Santa Catarina se abarcoacute una distancia de 95 km la cual presentaba
diferentes zonas de descarga de aguas residuales y de ahiacute se hicieron las tomas en un periacuteodo
de estiaje En el caso de las lagunas de oxidacioacuten del municipio de Mariacuten esta zona presenta
tres lagunas con un aacuterea total de 16700 m2 se realizoacute el muestreo de manera aleatoria En
cuanto a las muestras que se obtuvieron en el sitio de comercializar carne de pollo se les tratoacute
de igual manera para comprobar si existiacutean fagos
Los lugares elegidos para la recoleccioacuten de muestras son similares a los reportados en la
literatura regularmente para el aislamiento de fagos del ambiente se utilizan aguas residuales
y establecimientos de manipulacioacuten yo venta de alimentos (Leeuw et al 2017) En
investigaciones previas se realizan muestreos de diversos sitios como en la piel y heces de
animales manos de los cuidadores superficies quiruacutergicas e instrumentos o utensilios usados
en los establecimientos hoteles y restaurantes (Ejo et al 2016 Yergeau et al 2016) Los
muestreos de aguas tambieacuten se pueden realizar en sitios cercanos a las salidas de drenaje
de hospitales esto es de gran importancia ya que donde hay bacterias posiblemente esteacuten
sus respectivos fagos (Tomat et al 2014 Mattila et al 2015 McShan y Nguyen 2016)
Resultados y discusioacuten
70
Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos
B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis
Para el aislamiento de los fagos especiacuteficos de Salmonella fue necesario la puesta a punto
de varios procedimientos la teacutecnica de agar doble capa (ADC) determinar la cineacutetica de
crecimiento de cultivos de Salmonella determinar la fase de eclipse en la relacioacuten fago-
bacteria (se utilizoacute como control la cepa S Typhimurium y el fago PRD1) y su puesta a punto
en el laboratorio de bioremediacioacuten de la Facultad de Agronomiacutea de la UANL
B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S
Typhimurium
La accioacuten liacutetica de los fagos sobre Salmonella se analizoacute utilizando la teacutecnica ADC
En este procedimiento es necesario tener un ceacutesped bacteriano uniforme entre dos capas
de medio soacutelido que puede ser agar-agar o agar-agarosa (Sambrook y Rusell 2001)
Con el objetivo de abaratar los costes y mejorar los resultados en este trabajo se empleoacute
esta teacutecnica con algunas modificaciones que se describen a continuacioacuten Asiacute pues se decidioacute
que las capas fueran agar-agar donde la primera capa fue de agar al 15 en medio TS y la
Municipio Sitio de la toma N de muestras
Tipo de agua
Monterrey
Parque Fundidora 3 Estanque y corriente
Riacuteo Santa Catarina 10 Corriente
Establecimiento de comida 2 Lavado del pollo
Av Conductores 2 Corriente
Mariacuten
Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal
10 Estanque y corriente
Riacuteo La Libertad 2 Corriente
Guadalupe
Alcantarillas de la colonia La Azteca
3 Corriente
Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados
2 Lavado del pollo
San Nicolaacutes de los Garza
Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac
2 Corriente
Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea 3 Corriente
Resultados y discusioacuten
71
segunda con agar a una menor concentracioacuten para hacer la capa menos firme por lo que fue
necesario poner a punto la teacutecnica probando diferentes concentraciones de agar en ambos
casos a pH 72 Ademaacutes esta adecuacioacuten es importante por el ahorro que se generoacute al utilizar
un componente maacutes econoacutemico que la agarosa lo cual repercutioacute favorablemente en el coste
de la prueba
Otra variable para poner a punto en la teacutecnica de ADC es el volumen de cultivo bacteriano
a utilizar para generar el ceacutesped de Salmonella y lograr una adecuada interaccioacuten con el fago
Se probaron 3 voluacutemenes diferentes de cultivo de S Typhimurium incubados 24 horas a 37oC
para alcanzar una concentracioacuten de 16 x 108 UFCmL Dependiendo de la cantidad de inoacuteculo
las caracteriacutesticas del ceacutesped bacteriano tienen diferente contraste lo cual puede facilitar o
dificultar la observacioacuten de las placas liacuteticas Finalmente el mejor resultado se obtuvo al
utilizar el volumen de 500 L ya que se logroacute una mejor observacioacuten del aclaramiento del
ceacutesped bacteriano al formar las placas liacuteticas En la tabla 10 se muestran las caracteriacutesticas
de las capas en la caja Petri para un buen manejo y desarrollo de la zona liacutetica producida por
el fago al multiplicarse
Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC
Paraacutemetro Condiciones
Agar suave (con agar) () 08
Temperatura del agar suave (degC) 49
pH del medio de cultivo (soacutelido y liacutequido) 72
Cantidad de agar suave (mL) 45
Cultivo bacteriano (microL) 500
Muestra tratada con fagos (microL) 100
Resultados y discusioacuten
72
B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium
El cultivo hueacutesped debe de encontrarse creciendo en medio liacutequido TS en fase logariacutetmica
al momento de mezclarlo con el fago Para identificar la fase logariacutetmica se probaron
diferentes tiempos de crecimiento Con todo ello se observa que la fase logariacutetmica de S
Typhimurium se encuentra en el minuto 150 coincidiendo con los datos reportados por
Vidales-Contreras et al (2006) Y siguiendo con mi tesis la determinacioacuten de la concentracioacuten
se realizoacute mediante el promedio de la enumeracioacuten de las UFC por placas Petri preparadas
por duplicado multiplicado por el factor de dilucioacuten el cual es el reciacuteproco del producto del
volumen ensayado y la dilucioacuten usada para el anaacutelisis Al final se observa cuando se ha
llegado a la fase estacionaria del desarrollo bacteriano (tabla 11) Se utiliza un factor de
dilucioacuten el cual se obtiene como el reciacuteproco de la multiplicacioacuten de volumen de ensayo y la
dilucioacuten usada en el anaacutelisis
Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium
Tiempo Minutos
(Acumulado) Dilucioacuten
UFCmL Promedio
F (Factor) Concentracioacuten
(UFCmL)
T0 0 1 x 10-5 9 plusmn 25 1 x 106 900 x 106
T1 30 1 x 10-5 13 plusmn 74 1 x 106 130 x 107
T2 60 1 x 10-5 24 plusmn 56 1 x 106 240 x 107
T3 90 1 x 10-5 51 plusmn 32 1 x 106 510 x 107
T4 123 1 x 10-5 211 plusmn 89 1 x 106 211 x 108
T5 150 1 x 10-6 215 plusmn 81 1 x 107 215 x 109
Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)
B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis
Las consideraciones tomadas del modelo infectivo S Typhimurium y el fago PRD1 y
utilizando la teacutecnica ADC se replican para poner a punto a la bacteria que se quiere probar
que en este caso es S Typhi ATCC 19430 Los resultados de estos ensayos se pueden
observar en la tabla 12 en la que se puede observar que es ligeramente mayor la etapa donde
Resultados y discusioacuten
73
se puede realizar la infeccioacuten (fase de eclipse) de los fagos aislados y la bacteria hueacutesped
Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis (108 UFCmL) (37 ordmC24h)
Tiempo Minutos (Acumulado)
Dilucioacuten UFCmL Promedio
F (Factor) Concentracioacuten (UFCmL)
T0 0 1 x 10-5 216 710 1 x 106 20 x 107
T1 60 1 x 10-5 260 608 1 x 106 20 x 107
T2 120 1 x 10-6 160 173 1 x 107 16 x 108
T3 180 1 x 10-6 244 208 1 x 107 24 x 108
T4 240 1 x 10-7 400 100 1 x 107 40 x 109
Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)
B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis
De los sitios muestreados se logro obtener 39 muestras y se obtuvo un total de 15 fagos
aislados a partir de dos fuentes de aguas residuales las del Riacuteo Santa Catarina y las lagunas
de oxidacioacuten de Mariacuten Los 15 fagos se nombraron consecutivamente como MRH 1-15 Los
15 fagos se probaron contra la cepa hueacutesped S Enteritidis (CINSP tabla 4) tras realizar de
3 a 4 amplificaciones la mayoriacutea (14 fagos) no presentoacute actividad liacutetica (formacioacuten de halos
de inhibicioacuten) de manera que fueron descartados para los siguientes estudios siendo
solamente uno proveniente de la muestra del Rio Santa Catarina el que produjo halos bien
definidos en el ceacutesped bacteriano y con eacuteste se continuoacute trabajando El fago que mantuvo la
actividad liacutetica fue el MRH6 Se propuso nombrarle como MRH considerando la M para
muestra la RH por el Rodrigo Hernaacutendez
B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten
La principal caracteriacutestica de los fagos es cuando forman halos de inhibicioacuten (tambieacuten
llamadas zonas liacuteticas o calvas) y en nuestro estudio las muestras de agua recolectadas
fueron tratadas y analizadas mediante la teacutecnica ADC observando los halos de inhibicioacuten
claros y de diferentes diaacutemetros estas observaciones son similares a las observadas por
Ackermann (2003) Tanto la cantidad de UFP que se pueden desarrollar y observar hecha por
Resultados y discusioacuten
74
los fagos y la pureza en que encuentren los bacterioacutefagos de las muestras obtenidas del medio
ambiente estaacuten directamente relacionadas la especificidad contra la bacteria Al sembrar por
vaciado en placa estos lisados sobre la cepa indicadora se obtuvieron diferentes tamantildeos de
placas liacuteticas
En la figura 8 se muestran los halos de inhibicioacuten en ceacutesped de Salmonella al realizar la
infeccioacuten se pueden observar los diferentes tamantildeos y la forma se da por la capacidad de
raacutefaga (nuacutemero de copias al realizar el proceso liacutetico) de los fagos de la progenie los fagos
suelen tener una raacutefaga de maacutes de 100 partiacuteculas infectivas producidas en un lapso de tiempo
de 05 ndash 20 h Algunos halos formados por el fago fueron claros lo que indica que es liacutetico de
acuerdo con diversos autores (Sambrook y Rusell 2001 Vidales-Contreras et al 2006 Wong
et al 2014) En nuestro estudio se batalloacute en encontrar fagos a pesar de buscar sitios
sentildealados por autores antes mencionados
Al intentar obtener fagos puede suceder que se encuentren en concentraciones tan
pequentildeas que al probarlos contra alguna cepa hueacutesped no sirven para trabajar por lo que se
llevoacute a cabo repeticiones seriadas (amplificacioacuten) asegurando que al formar una placa de Petri
en ADC con tamantildeos de los halos de inhibicioacuten iguales lo que nos indica que pertenecen a
una sola especie de fago
Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por fagos con halos de inihibicioacuten de
diferentes tamantildeos
Resultados y discusioacuten
75
C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli
La clasificacioacuten de los fagos se puede establer en base a su morfologiacutea al aacutecido nucleico
al espectro de accioacuten y algunas consideraciones inmunoloacutegicas (Criscuolo et al 2017) Al
realizar la infeccioacuten de fago-bacteria y observar la presencia de halos liacuteticos en las placas de
ceacutesped bacteriano se considera que se ha producido una infeccioacuten exitosa pero previamente
es necesario poner a punto el cultivo puro de ambos cultivos y considerar la concentracioacuten de
cultivos a utilizar
Al seleccionar los fagos que presentaron uniformidad en cuanto a la inhibicioacuten y posterior
evaluacioacuten de los fagos se consideraron varios factores entre ellos el tiempo que tarda la
replicacioacuten viral (lo cual es variable) siendo que en algunos casos se pueden replicar en
cuestioacuten de minutos A simple vista se pueden observar la formacioacuten de halos de lisis en el
ceacutesped bacteriano en las cajas de Petri
Asiacute pues la teacutecnica ADC se repitioacute varias veces hasta obtener placas liacuteticas con ideacutentica
morfologiacutea y tamantildeo En la tabla 13 se observa que hay diferentes tamantildeos de halos En los
primeros ensayos soacutelo cuatro muestras de agua (15 21 26 y 33) dieron halos de inhibicioacuten
pudieacutendose distinguir bien la forma y el tamantildeo Al realizar posteriores siembras los fagos
fueron perdiendo capacidad de infeccioacuten (fagos atemperados) y soacutelo la muestra 21 de las
lagunas de oxidacioacuten provenientes de Mariacuten presentoacute fagos con actividad liacutetica y el resto de
fagos no desarrolloacute actividad constante
Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten de S Enteritidis en ceacutesped
bacteriano
Diaacutemetro de halo grande ge 8mm mediano 8 lt X lt6mm pequentildeo le 5mm
Distribucioacuten de tamantildeos de halo
Muestra de agua Grande Mediano Pequentildeo
15 8 23 15
21 17 11 27
26 10 18 6
33 7 9 13
Diaacutemetro medio halo (mm) 1055 0671 0376
Resultados y discusioacuten
76
En la tabla 14 se presenta el listado de posibles hueacutespedes probados 12 cepas de
Salmonella y 4 de E coli que se probaron contra los 15 fagos aislados previamente Se puede
distinguir que afecta a algunas serovariedades de Salmonella y no tiene efecto en otras
serovariedades entericas No afecta nada a las cepas de E coli Se ve que la cepa maacutes
afectada por el fago es la S Typhi ATCC 19430 y otras cepas de Salmonella son afectadas
ligeramente
Resultados y discusioacuten
77
Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades de Salmonella spp y de E coli
serovariedades Fagos
M
R
H
1
M
R
H
2
M
R
H
3
M
R
H
4
M
R
H
5
M
R
H
6
M
R
H
7
M
R
H
8
M
R
H
9
M
R
H
1
0
M
R
H
1
1
M
R
H
1
2
M
R
H
1
3
M
R
H
1
4
MR
H15
S Typhimurium ATCC 13311
-
-
t
- -
t
- - - - - - - - -
S Paratyphi ATCC 9150 - - - - - - - - - - - - - - -
S Enteritidis ATCC 13076 - - - - - - - - - - - - - - -
S Typhi ATCC 19430 + + + + + t
c
+ + + n
d
n
d
n
d
n
d
nd +
S Typhimurium - - - - - - - - - - - - - - -
S Bongori ATCC 43975 - - - - - - - - - - - - - - -
S enterica LT2 - - - + + + - - - - - - - -
S sub enterica CECT 4138 - - - - + + + - - - - - - - -
S sub enterica CECT 4594
t
t
t
- + + + - - -
t
- - - -
S sub enterica CECT 409 - - - - n
d
- -
t
- - - - - - -
S sub enterica CECT 698 - - - - - t
c
- - - - - - - - -
S Typhimurium CCUG
29478
- - - + + - - - - - - - -
E coli CECT 515 - - - - - - - - - - - - - - -
E coli K12 - - - - - - - - - - - - - - -
E coli ATCC 10536 - - - - - - - - - - - - - -
E coli O157H7 CECT 4783 - - - - - - - - - - - - - - -
+ crecimiento y desarrollo de halo indica desarrollo muy pequentildeo o difuso del halo t indica desarrollo pequentildeo y turbio del halo tc indica turbio o con centro opaco en el centro del halo - no crecimiento o desarrollo de halo nd aparente baja efectividad o halo difuso
Resultados y discusioacuten
78
Resultados y discusioacuten
79
El fago que siacute mostroacute actividad (MRH6) y que mantuvo la capacidad liacutetica durante las
diferentes amplificaciones se trabajoacute de manera continua hasta obtener halos uniformes en el
tamantildeo y asiacute ya se considera como una entidad pura de fago Los resultados obtenidos en
este trabajo son semejantes a los mostrados por Thung et al (2017) En la figura 9 se
presentan las imaacutegenes donde se muestra el desarrollo de halos liacuteticos previamente
mencionados donde se puede observar los halos uniformes contra A) S Enteritidis (CINSP)
y B) S Typhi ATCC 19430 (UAB)
Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria A) S Enteritidis (CINSP) y B) S Typhi ATCC 19430
La especificidad de los fagos se encuentra generalmente a nivel de cepa y tambieacuten de
especie y maacutes raramente a nivel de geacutenero Es de intereacutes el garantizar una eficiente infeccioacuten
de la dupla fago-bacteria de esta manera se toman todas las medidas precautorias para
obtener resultados fiables en este sentido se requiere verificar todos los aspectos como son
los controles (positivo y negativo) En el caso del control negativo se verificoacute el desarrollo
solamente del ceacutesped bacteriano de la cepa hueacutesped con la teacutecnica ADC y como control
positivo se consideroacute el modelo del fago PRD 1 y S Typhimurium los fagos son altamente
especiacuteficos (no afecta a otros cultivos bacterianos) y no se puede descartar falsos positivos
por la presencia de restos celulares bacterianos (Segundo et al 2010 Szafranski et al 2017)
Resultados y discusioacuten
80
D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM
El ICTV clasifica a los fagos en 1 orden13 familias y 31 geacuteneros De los cuales se
observa al orden de los Caudovirales el cual comprende a la mayor parte de los fagos (en
torno a un 95)y estos estaacuten constituidos por 3 familias con cola Myoviridae Podoviridae
y Siphoviridae Con estas caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas mediante el TEM en la
figura 10 se presentan las imaacutegenes del fago MRH6
El anaacutelisis de una suspensioacuten de fagos con una concentracioacuten de 1x1012 UFPmL mediante
microscopiacutea electroacutenica muestra una distintiva morfologiacutea de cabeza icosaeacutedrica estructura
alargada y cola no contraacutectil La caacutepside tiene un diaacutemetro de 55-60 nm y la cola puede
alcanzar los 570 nm Estas caracteriacutesticas se corresponden con la familia Siphoviridae Yang
et al (2017) comentan que esta familia de fagos se encuentra frecuentemente en
enterobacterias
Figura 10 Imagen por TEM del fago MRH6 (X100 000) la barra representa 100nm (Servicio de Microscopiacutea UAB)
Resultados y discusioacuten
81
D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero
inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de
epifluorescencia directa (DEM)
Para corroborar la potencial condicioacuten como agente de desinfeccioacuten del fago MRH6 es
necesario observar su efectividad a traveacutes de la DEM con la que se pueden observar
bacterias viables y no viables Tambieacuten la materia orgaacutenica puede dar falsos positivos y se
debe tener en cuenta al comparar con otros meacutetodos de conteo (Montantildeez et al 2012)
En este trabajo S Typhi ATCC 19430 desarrolloacute biofilms en las superficies de acero
inoxidable (discos tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm) y consiguieron
niveles de 29 plusmn 02 UFCcm2 despueacutes de tener un maacuteximo de 72 h en incubacioacuten en
condiciones de humedad y temperatura ambiente tal como se puede observar en la figura 11
Estos biofilms tienen distinta intensidad seguacuten el tiempo de incubacioacuten siendo los periodos
evaluados de 24 48 y 72h respectivamente En estas condiciones se realizoacute el recuento en
tres zonas de cada disco para cada tiempo de incubacioacuten y los resultados se presentan en la
figura 12 Para tener fiabilidad de los resultados se realizaron los conteos por triplicado porque
el manejo de los discos es muy complejo y para evitar errores de manejo se consideroacute
necesario tener maacutes de una muestra otorgando ademaacutes la oportunidad de comparar
resultados y tener un margen de referencia en cuanto a los resultados obtenidos
Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 en
diferentes tiempos de incubacioacuten (24 48 y 72h) a temperatura ambiente
Resultados y discusioacuten
82
Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable incubados a temperatura ambiente n = 3
En este estudio se compararon 2 meacutetodos de conteo de bacterias despueacutes de ser atacadas
por los fagos eacutestos fueron el recuento en placa de agar y por otro lado la observacioacuten por
microscopiacutea de epifluorescencia y la relacioacuten entre ambos meacutetodos Desafortunadamente se
han perdido los resultados por un problema irresoluble pero si se puede comentar que existe
una relacioacuten ligeramente inferior a 09 (R2 ) Esta observacioacuten ya ha sido presentada
anteriormente por otros autores (Fuster-Valls et al 2008 Engelhardt et al 2014)
El cultivo bacteriano se puede contabilizar por conteo en placa directo (TSA) este meacutetodo
es utilizado generalmente para cultivos de geacutermenes no exigentes o moderadamente
exigentes y cuando se quiere visualizar como afecta el ataque de los fagos las ceacutelulas
bacterianas se visualizan por DEM (cuya coloracioacuten cambia a verde cuando han sido atacadas
por los fagos) y una forma de visualizar este ataque es por medio de TSA con la teacutecnica de
ADC
0
5
10
15
20
25
0 10 20 30 40 50 60
Co
nte
o (
Lo
g U
FC
cm
2)
Tiempo (h)
Crecimiento bacteriano
Resultados y discusioacuten
83
D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable
Se aplicoacute la DEM para evaluar la efectividad del fago MRH6 en el control de S Typhi ATCC
19430 sobre superficies de acero inoxidable en condiciones de humedad El fago MRH6 es
liacutetico capaz de disgregar los biofilms
El analizar la accioacuten liacutetica del fago sobre Salmonella por medio del DEM es muy importante
e innovador pero el material que se utiliza y la manera en que se comportan las diferentes
bacterias hacen que se deba ser muy precavido al considerar el uso de este meacutetodo como
adecuado para realizar conteos (Libuchi et al 2010) Por ejemplo se debe tener en cuenta
que existen bacterias que no forman un biofilm y presentan movimiento esto puede llegar a
complicar el visualizarlas si no estaacuten en el campo por lo que se podriacutea pensar que fueron
atacadas y eliminadas por los fagos o bien que por los diferentes lavados se barrieron
La DEM con la tincioacuten LIVEDEAD reveloacute la presencia de ceacutelulas viables con coloracioacuten
verde En la figura 13 se puede observar el efecto letal del fago MRH6 sobre la poblacioacuten de
S enteacuterica disminuyendo su cantidad considerablemente en base a el tiempo de incubacioacuten
en color verde Se observa que hay disminucioacuten de las ceacutelulas de S Typhi ATCC 19430 al ser
atacadas por el fago MRH6 Recordemos que la infeccioacuten con el MRH6 se realizoacute despueacutes de
formar un biofilm a temperatura ambiente y con humedad por espacio de 72h en 3
concentraciones 6 7 y 8 UFPmL Al paso del tiempo se aprecia que a las 48h hay pocas
ceacutelulas vivas al menos detectadas por la teacutecnica utilizada
Resultados y discusioacuten
84
a)
b)
c)
Figura 13 Secuencia de imaacutegenes de epifluorescencia que ilustran la destruccioacuten de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable causada por el fago MRH6 tras incubacioacuten de 0 8 24 y 48 h y con 3 concentraciones de fagos a) 6 b) 7 y c) 8 UFPmL respectivamente
La DEM es un meacutetodo altamente sensible que se caracteriza por la formacioacuten de imaacutegenes
amplificadas y es considerada una teacutecnica poderosa con altos niveles de sensibilidad y
resolucioacuten Tomando como referencia los resultados se considera que la DEM es una
herramienta eficaz para el conteo bacteriano pero hay que considerar la experiencia del
observador
Resultados y discusioacuten
85
En algunas ocasiones al observar las bacterias atacadas por los fago se pueden encontrar
muestras con material geneacutetico mezclado con restos celulares esta situacioacuten hace que
algunos investigadores recomienden extraer los fagos de la muestra antes de sembrar las
bacterias con el fin de determinar la reduccioacuten bacteriana uacutenicamente debida a la actividad
virulenta del fago sobre la muestra y no a la infeccioacuten por fagos libres presentes en el agar
(Sharma et al 2009) En ese sentido tal como reporta Fuster-Valls et al (2008) en su trabajo
observoacute que el limite de deteccioacuten de esta teacutecnica es de 279 log10 celulas por cm2 en cambio
en nuestro trabajo y tal como se observa en la figura 14 se pudo llegar a una sensibilidad
muy proacutexima a 2 y que coincide con las imaacutegenes de la figura 13 en las que a las 24 y 48
horas apenas se observan algunas manchas que corresponden al crecimiento bacteriano
Los fagos utilizan los recursos de la ceacutelula para hacer muchos fagos nuevos lo que causa
que la ceacutelula lise (estalle) y muera en el proceso La lisis en las uacuteltimas etapas del ciclo liacutetico
el fago expresa los genes para las proteiacutenas que hacen agujeros en la membrana plasmaacutetica
y la pared celular En la figura 14 se puede observar como el recuento de Salmonella Typhi
ATCC 19430 disminuye por el ataque del fago MRH6 El efecto del fago es muy fuerte y al
final los conteos son muy parecidos
Resultados y discusioacuten
86
Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 en superficies de acero inoxidable por el fago MRH6 con diferentes concentraciones y hasta 48 h de incubacioacuten
En este trabajo se buscoacute crear condiciones de infeccioacuten fago-bacteria en el laboratorio
como las que se pudieran presentar en la industria Los resultados de esta relacioacuten del fago
MRH6 y S Typhi ATCC 19430 muestran que la aplicacioacuten del fago es efectiva pero hay que
considerar que funciona mejor a altos tiacutetulos (108 UFCmL) y que deberaacute de potenciarse
cuando se trate de un coctel de fagos
Nuestros resultados sugieren que los fagos pueden ser utilizados como un meacutetodo para
controlar un biofilm formado por un bacteria especiacutefica
Al realizar la buacutesqueda de informacioacuten en diferentes motores de buacutesqueda una de las
plataformas de libre acceso (Pubmed) se obtuvo una relacioacuten de 5 en publicaciones de
00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Salm
on
ella
Typ
hi
AT
CC
19430
(lo
g1
0ceacutelu
las cm
2)
Tiempo (h)
Fago MRH6 a 6 Logml Fago MRH6 a 7 Logml Fago MRH6 a 8 Logml Control sin fago
Resultados y discusioacuten
87
fagos contra diferentes serovariedades de Salmonella spp lo que se puede traducir en que
hay un aacuterea de oportunidad latente
Las consideraciones que se enviacutean como propuesta es que existen en estos momentos
muchos trabajos sobre fagos pero aquiacute en Meacutexico no hay trabajos reportados y los que
existen estaacuten apenas en fases iniciales
Existe un enorme potencial de trabajo en esta aacuterea con los fagos tal es el caso de la
fagoterapia en otros sitos y en otros tiempos estaacuten realizando experimentos para ser
explotada como alternativa para todos los aacutembitos desde hogares industria salud animales
vegetales etc Por lo menos en EE UU tienen grandes avances en estudios relacionados
con la aplicacioacuten en bacterias multiresistentes que por el uso de antibioacuteticos han mutado esto
en el sector salud donde se estaacute perdiendo la batalla
Una de las fortalezas de estudiar a los fagos es que antes de que los antibioacuteticos fueran
descubiertos habiacutea investigacioacuten considerable sobre los fagos como tratamiento para las
enfermedades bacterianas humanas por lo menos en parte de Europa La aplcacion de los
fagos es potencialmente son buenos candidatos para tratar enfermedades bacterianas en
seres humanos inocuidad aliemnaria bioremediacioacuten y cada regioacuten tiene fagos endeacutemicos y
este tabajo representa de los primeros en llevarse en Monterrey
Ciertas limitaciones de los resultados se debiooacute a las condiciones que se presentaron al
realizar el estudio (laboratorio equipo conocimiento del tema) solamente se pudo aislar un
fago y lo recomendable es que sean varios fagos dado que son muy especiacuteficos de especie
o hasta de cepa Se proboacute su accioacuten sobre superficies con un solo cultivo bacteriano y en la
realidad las superficies se contaminan con diferentes bacterias
Lo que se vizualiza para nuestro estudio es sugerir varias liacuteneas de accioacuten a futuro Por
ejemplo el fago aislado podriacutea probarse in vivo sobre carne de pollo o fagoterapia tambieacuten
podriacutea continuar los estudios para aislar maacutes fagos y hacer mezclas (coacutecteles) que tuvieran
un mayor rango de actividad y combatir a diversas especies de Salmonella Con respecto al
tratamiento de superficies podriacutean utilizarse coacutecteles de fagos para tratar biofilms bacterianos
formados por maacutes de dos especies o inclusive podriacutean probarse en biopeliacuteculas industriales
reales
Resultados y discusioacuten
88
89
VI CONCLUSIONES
90
Conclusiones
91
De las 39 muestras de agua analizadas se aislaron tentativamente15 fagos de los que soacutelo 4
mantuvieron en un primer momento su actividad liacutetica estos fagos se correspondieron con las
muestras de agua 15 21 26 y 33 Se siguioacute trabajando con ellos y finalmente solo uno de
ellos el MRH6 mantuvo su actividad liacutetica despueacutes de varias amplificaciones este fago se
aisloacute de las aguas residuales de Mariacuten
Se consiguioacute optimizar la teacutecnica ADC cambiando la agarosa que tiene un alto costo por
agar-agar maacutes econoacutemico sin alterar la fiabilidad de la teacutecnica ademaacutes con este cambio se
facilita el manejo
En relacioacuten con la especificidad de los 15 fagos aislados frente a las 16 cepas de
enterobacterias probadas (12 cepas de Salmonella spp y 4 de E coli) se observa ciertas
tendencias marcadas Ninguno de los fagos ataca a las cepas de E coli probadas En cuanto
a Salmonella se observa una fuerte especificidad frente a S Typhi (ATCC 19430) una ligera
actividad frente a varias cepas de S enterica y no hubo efecto contra las demaacutes cepas de
Salmonella ensayadas lo cual confirma la elevada especificidad fago-hueacutesped
Las imaacutegenes obtenidas mediante DEM muestran una morfologiacutea caracteriacutestica de cabeza
icosaeacutedrica estructura alargada y cola no contraacutectil que sugieren que el fago MRH6 se puede
clasificar en la familia Siphoviridae
Se observa un efecto liacutetico progresivo del fago MRH6 frente a biofilms de Salmonella en
discos de acero inoxidable llegando a valores miacutenimos inferiores a 102 a las 48 horas de
incubacioacuten para todas las concentraciones de fago utilizadas (6 a 8 UFPmL)
Se comprueba que la DEM es un buen meacutetodo para la cuantificacioacuten del crecimiento de S
Typhi (ATCC 19430) sobre discos de acero inoxidable con una gran sensibilidad y resolucioacuten
ya que se observaron claras diferencias en los diversos tiempos de incubacioacuten ensayados y
a diferentes concentraciones del fago MRH6 Esto confirma que la teacutecnica es una herramienta
eficaz para valorar el efecto liacutetico de los fagos sobre biofilms
Ya que en este trabajo solamente se obtuvo un fago liacutetico se sugiere reflexionar acerca de
los factores que han dificultado la obtencioacuten de un nuacutemero maacutes amplio de fagos
Conclusiones
92
Este trabajo refleja el gran intereacutes por iniciar o regresar a trabajar con fagos tal como esta
sucediendo en otras partes del mundo Hasta el momento hay muchas espectaivas sin
embargo todaviacutea se necesita investigacioacuten para saber queacute tan seguros son
93
VII BIBLIOGRAFIacuteA
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Si no puedes volar corre
Si no puedes correr camina
Si no puedes caminar gatea
Pero hagas lo que hagas siempre sigue hacia adelante
Martin Luther King jr (1929-1968)
Agradecimientos
Este trabajo se ha realizado gracias a la financiacioacuten aportada por el Programa de
mejoramiento del profesorado (PROMEP) PROMEP1035062037 UANL-326 de la
Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) dentro del programa de becas para la
formacioacuten de investigadores y a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para
el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y de
Cooperacioacuten) Programa Extranjeros II-A convocatoria 2010-2011 0000521211
A la Dra Teresa de los Reyes Pla Soler por la confianza depositada en miacute y darme la
oportunidad de ser su estudiante sin sus consejos no hubiera sido posible concluir esta
tesis
Al Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas por ser un guiacutea durante mi formacioacuten como
investigadora por sus ensentildeanzas con palabras y el ejemplo y por su apoyo en el
aspecto profesional y personal
Al Dr Joseacute Juan Rodriacuteguez Jerez por su gran apoyo acadeacutemico y por permitirme
trabajar desinteresadamente en las instalaciones y con el equipo de laboratorio
A la Dra Manuela Hernaacutendez Herrero que es una gran persona que me ha apoyado
desde el peincipio de estos estudios
A la Dra Marta Capellas Puig que me ha alentado todo el tiempo para terminar de
buena manera
Dedicatorias
Con mucho carintildeo a mi Sentildeor padre Bartolomeacute Hernaacutendez Balbuena (dagger) y a mi Sentildeora
madre Lucia Santiago Santos son un ejemplo en mi vida ya que ellos son fundamentales
en mi formacioacuten como persona
A mis hermanos Flavio Viacutector Manuel Guadalupe Hilda (dagger) porque siempre
estuvieron alliacute alentaacutendome en este trabajo con palabras experiencias etc
A mi prometida y futura esposa Dontildea Rosa Salas Martiacutenez desde que inicmos a estar
juntos siempre estaacute apoyaacutendome en todos los aspectos y en todas las cosas que he
emprendido y que con algunas locuras que se nos pueda ocurrir mas adelante nos
llevaraacute a mejores cosas cada diacutea
A mi hija Gabriela Sarahi Hernaacutendez Flores ella es lo que maacutes aprecio y espero vea
en mi un ejemplo que sirva para alentarla a ser cada diacutea mejor y sacar todas las cosas
que se proponga adelante
A mis compantildeeros y amigos Vannesa Fabio Fontecha Abel Rita Jacira Kathy
Genaro Fabio Poliseli Dora Cecilia Diana Angela Sonia Dolors Marco y Cristina por
las convivencias durante mi estancia en Espantildea que de alliacute solo me llevo grandes
recuerdos
A mis compantildeeros Mirna Patty Letty Tere Adelita Luluacute Betty Marco Arnoldo Joseacute
Luis y Gustavo que compartimos buena cantidad de tiempo gracias por las convivencias
y por los muchos trabajos que hicimos en equipo
CONTENIDO RESUMEN 1
SUMMARY 3
RESUM 5
I INTRODUCCIOacuteN 7
Presentacioacuten del proyecto 9
Justificacioacuten 10
II ANTECEDENTES 13
A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos 15
A1 Problemaacutetica 16
A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea 17
B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria 19
B1 Escherichia 19
B2 Campylobacter 20
B3 Enterobacter 21
B4 Listeria 22
B5 Salmonella 23
B51 Origen 23
B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp 25
B53 Manifestaciones cliacutenicas 27
B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis 28
C Crecimiento microbiano 30
C1 Crecimiento de los microorganismos 30
C11 Disponibilidad del agua 31
C12 Acidez y pH 31
C13 Oxiacutegeno 31
C14 Temperatura 32
D Control del crecimiento microbiano 34
D1 Agentes fiacutesicos 34
D2 Agentes quiacutemicos 35
E Fagos 35
E1 Antecedentes 35
E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos 37
E3 Clasificacioacuten de los fagos 37
E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico 39
E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten 39
F Biofilm 40
G Microscopiacutea electroacutenica 41
H Fagoterapia 42
III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 47
A Objetivo general 49
B Objetivos especiacuteficos 49
C Plan de trabajo 49
IV MATERIALES Y MEacuteTODOS 51
A Toma de muestras 53
B Obtencioacuten de fagos 54
B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55
B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55
B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas 56
B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos 56
B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC) 58
B6 Modelo de infeccioacuten 59
B7 Controles utilizados durante los ensayos 60
B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium 60
C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos 61
D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica 63
D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 64
D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM 65
V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 67
A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras 69
B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis 70
B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S Typhimurium 70
B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium 72
B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis 72
B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis 73
B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten 73
C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli 75
D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM 80
D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 81
D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable 83
VI CONCLUSIONES 89
VII BIBLIOGRAFIacuteA 93
Iacutendice de figuras
Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa 16
Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por Salmonella spp 24
Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella 24
Figura 4 Adsorcioacuten del bacterioacutefago T4 e inyeccioacuten del ADN 39
Figura 5 Diagrama general de trabajo 50
Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten bacterioacutefago-hueacutesped 59
Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten 62
Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por bacterioacutefagos 74
Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria 79
Figura 10 Imagen por TEM del bacterioacutefago MRH6 80
Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 81
Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable 82
Figura 13 Secuencia de imaacutegenes del DEM 84
Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 por el fago MRH6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86
Iacutendice de tablas
Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias 19
Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos 25
Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales 33
Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos 38
Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos 44
Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria 45
Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos 54
Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten 57
Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos 70
Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC 71
Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium 72
Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis 73
Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten 75
Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades 77
Lista de abreviaturas y acroacutenimos
ADN Aacutecido desoxirribonucleico
ARN Aacutecido ribonucleico
ADC Agar doble capa
AS Agar suave
AECID Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el
Desarrollo
ATCC American Type Culture Collection
APPCC Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control
aw Actividad del agua
BGA Agar verde brillante
BHI Infusioacuten cerebro corazoacuten
CCUG Culture Collection University of Goumltenborg
CENAVECE Centro Nacional de Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de
Enfermedades
CETC Coleccioacuten Espantildeola de Cultivos Tipo
CINSP Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica
EDTA Etilendiaminotetraceacutetico
DEM Microscoacutepica de epifluorescencia directa
EE UU Estados Unidos de Norteameacuterica
ETA Enfermedades transmitidas por alimentos
FAO Food and Agriculture Organization (Organizacioacuten de las
Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura)
FaSPyN Facultad de Salud Puacuteblica y Nutricioacuten UANL
FAUANL Facultad de Agronomiacutea UANL Unidad Mariacuten NL
FCB Facultad de Ciencias Bioloacutegicas UANL
HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points (Anaacutelisis de
Peligros y Puntos Criacuteticos de Control)
INEGI Instituto Nacional de Estadiacutestica y Geografiacutea de los Estados
Unidos Mexicanos
nd Aparente baja efectividad o halo difuso
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
PANALIMENTOS Instituto Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y
Zoonosis
PEG Polietilenglicol
SDS Dodecilsulfato soacutedico
SIRVETA Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos
SSF Solucioacuten salina fisioloacutegica
SUH o SHU Siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico
TEM Microscopio electroacutenico de transmisioacuten
TSA Agar soya de tripicasa
TSAYE TSA con 06 de extracto de levadura
TSB Caldo de soja trypticasa
UAB Universitat Autogravenoma de Barcelona
UANL Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
ZMM Zona Metropolitana de Monterrey
RESUMEN
La inocuidad alimentaria es un tema amplio y relevante que impacta directamente en todos
los segmentos de la sociedad involucra productores desarrolladores innovadores
consumidores y gobierno ademaacutes de diversos sectores como la industria la ingenieriacutea y hasta
la educacioacuten Sin embargo las nuevas tecnologiacuteas en la cadena de produccioacuten provocan que
eacutesta sea maacutes larga y compleja
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) causan alta morbilidad y varios casos
de mortalidad Entre los agentes infecciosos maacutes comunes se encuentran Salmonella spp
Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus
Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus
Los bacterioacutefagos o fagos son virus bacterianos especiacuteficos de una ceacutelula hueacutesped en la
cual se multiplican invadiendo su maquinaria de material geneacutetico Son los sistemas bioloacutegicos
maacutes abundantes del planeta se encuentran en el medio ambiente y se introducen y conviven
en la flora intestinal de otros seres cuando eacutestos ingieren diversos alimentos ya sean de tipo
animal o vegetal
El objetivo del presente trabajo fue aislar y probar la especificidad de una serie de fagos de
Salmonella spp a partir de aguas residuales para lo cual se utilizaron muestras de agua
recolectadas de diferentes localidades del aacuterea metropolitana de Monterrey N L Meacutexico La
purificacioacuten de fagos se llevoacute a cabo mediante la teacutecnica de agar doble capa (ADC) hasta
obtener placas liacuteticas uniformes y se usaron diferentes cepas de referencia de Salmonella
como cultivos indicadores
Se aislaron un total de 15 fagos putativamente distintos de los cuales al pasar las pruebas
de replicacioacuten soacutelo uno logroacute mantener la capacidad liacutetica Se seleccionoacute y purificoacute para
realizar pruebas in vitro especiacuteficas para Salmonella Se utilizoacute una concentracioacuten de fagos
de 1x1012 UFPmL para analizar al fago mediante su morfologiacutea por microscopiacutea electroacutenica
la cual se identificoacute como miembro de la familia Siphoviridae Asiacute mismo se probaron los fagos
contra Salmonella in situ en discos de acero que simulan las superficies de trabajo y para
analizar el efecto de la infeccioacuten del fago sobre Salmonella en los discos de acero inoxidable
se utilizoacute el microscopio de epifluorescencia
Para el conteo de fagos se utilizoacute los meacutetodos LIVEDEAD Para finalizar para evaluar la
efectividad del fago MRH6 que resulto liacutetico en nuestro ensayo se procedioacute a dar las
condiciones necesarias para la formacioacuten del biofilm de Salmonella sobre superficies de acero
inoxidable El fago MRH6 fue capaz de disgregar los biofilms a temperatura ambiente Las
mayores reducciones de Salmonella en un menor tiempo se obtuvieron con concentraciones
de fago mayores a 1x108 UFPmL El meacutetodo de cultivo mostroacute reducciones del patoacutegeno a
niveles indetectables sin embargo la tincioacuten vital reveloacute la presencia de ceacutelulas viables
(coloracioacuten verde) que podriacutea representar un riesgo de contaminacioacuten cruzada estas
pudieran tambieacuten presentarse por la presencia de material orgaacutenico Este trabajo con un fago
puede proporcionar una medida adyuvante para controlar la contaminacioacuten de superficies de
acero inoxidable con biofilms de Salmonella La DEM resultoacute ser una buena herramienta para
evaluar raacutepida y adecuadamente por observacioacuten y posterior anaacutelisis el efecto de los fagos
SUMMARY
Food safety is a broad and relevant issue that directly affects all aspects of society involving
producers developers innovators consumers and government as well as various sectors
such as industry engineering and even education However new technologies in the
production chain cause it to be longer and more complex
Foodborne diseases (ETA) cause high morbidity and several cases of mortality Among the
most common infectious agents are Salmonella spp Campylobacter spp Escherichia coli
Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus Clostridium botulinum Listeria
monocytogenes and Staphylococcus aureus
Bacteriophages or phages are bacterial viruses specific to a host cell in which they multiply
by invading their machinery of genetic material They are the most abundant biological systems
on the planet they can be found in the environment In organisms they enter and coexist in
the intestinal flora of other beings when they ingest various foods whether animal or vegetable
The objective of this study was to isolate and test the specificity of a series of phages of
Salmonella spp from wastewater for which water samples were collected from different
locations in the metropolitan area of Monterrey N L Meacutexico The purification of phages was
carried out by means of the double layer agar technique (ADC) until uniform lithic plates were
obtained and different Salmonella reference strains were used as indicator cultures
A total of 15 putatively different phages were isolated of which upon passing the replication
tests only one managed to maintain the lytic capacity It was selected and purified to perform
specific in vitro tests for Salmonella A phage concentration of 1x1012 PFUmL was used to
analyze the phage by means of its electron microscopy morphology which was identified as a
member of the Siphoviridae family Likewise the phages against Salmonella were tested in
situ on steel discs simulating the work surfaces and the epifluorescence microscope was used
to analyze the effect of phage infection on Salmonella on the stainless steel discs
For the phage count the LIVE DEAD Finally in order to evaluate the effectiveness of the
phage MRH6 that was lytic in our trial the necessary conditions for the formation of the
Salmonella biofilm on stainless steel surfaces were established The phage MRH6 was able
to disintegrate the biofilms at room temperature The greatest reductions of Salmonella in a
shorter time were obtained with phage concentrations greater than 1x107 PFUmL The culture
method showed reductions of the pathogen to undetectable levels however vital staining
revealed the presence of viable cells (green coloration) which could represent a risk of cross
contamination these could also be presented by the presence of organic material This work
with a phage can provide an adjuvant measure to control contamination of stainless steel
surfaces with Salmonella biofilms The DEM proved to be a dependable tool to quickly and
adequately evaluate the effect of phages by observation and subsequent analysis
RESUM
La innocuiumltat alimentagraveria eacutes un tema ampli i rellevant que impacta directament en tots els
segments de la societat involucra productors desenvolupadors innovadors consumidors i
govern a meacutes de diversos sectors com la induacutestria lenginyeria i fins a leducacioacute No obstant
aixograve les noves tecnologies en la cadena de produccioacute provoquen que aquesta sigui meacutes llarga
i complexa
Les malalties transmeses per aliments (ETA) causen alta morbiditat i diversos casos de
mortalitat Entre els agents infecciosos meacutes comuns es troben Salmonella spp
Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus
Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus
Els bacteriogravefags o fags soacuten virus bacterians especiacutefics duna cegravelmiddotlula hoste en la qual es
multipliquen envaint la seva maquinagraveria de material genegravetic Soacuten els sistemes biologravegics meacutes
abundants del planeta es troben en el medi ambient i sintrodueixen i conviuen en la flora
intestinal daltres eacutessers quan aquests ingereixen diversos aliments ja siguin de tipus animal
o vegetal
Lobjectiu del present treball va ser aiumlllar i provar lespecificitat duna segraverie de fags de
Salmonella spp a partir daiguumles residuals per a aixograve es van utilitzar mostres daigua recollides
de diferents localitats de lagraverea metropolitana de Monterrey N L Megravexic La purificacioacute de fags
es va dur a terme mitjanccedilant la tegravecnica dagar doble capa (ADC) fins a obtenir plaques liacutetiques
uniformes i es van usar diferents soques de referegravencia de Salmonella com a cultius indicadors
Es van aiumlllar un total de 15 fags possiblement diferents dels quals en passar les proves
de replicacioacute nomeacutes un va aconseguir mantenir la capacitat liacutetica Es va seleccionar i va
purificar per realitzar proves in vitro especiacutefiques per Salmonella Es va utilitzar una
concentracioacute de fags de 1x1012 UFPmL per analitzar fag mitjanccedilant la seva morfologia per
microscogravepia electrogravenica la qual es va identificar com a membre de la famiacutelia Siphoviridae Aixiacute
mateix es van provar els fags contra Salmonella in situ en discos dacer que simulen les
superfiacutecies de treball i per analitzar lefecte de la infeccioacute del fag sobre Salmonella en els
discos dacer inoxidable es va utilitzar el microscopi depifluorescegravencia
Per al recompte de fags es va utilitzar els megravetodes LIVE DEAD Per finalitzar per avaluar
lefectivitat del fag MRH6 que va resultar liacutetic en el nostre assaig es va procedir a donar les
condicions necessagraveria per a la formacioacute del biofilm de Salmonella sobre superfiacutecies dacer
inoxidable El fag MRH6 va ser capaccedil de disgregar els biofilms a temperatura ambient Les
majors reduccions de Salmonella en un menor temps es van obtenir amb concentracions de
fag majors a 1x107 UFP mL El megravetode de cultiu va mostrar reduccions del patogen a nivells
indetectables perograve la tincioacute vital revelar la presegravencia de cegravelmiddotlules viables (coloracioacute verda)
que podria representar un risc de contaminacioacute creuada aquestes poguessin tambeacute
presentar-se per la presegravencia de material orgagravenic Aquest treball amb un fag pot proporcionar
una mesura adjuvant per controlar la contaminacioacute de superfiacutecies dacer inoxidable amb
biofilms de Salmonella La DEM va resultar ser una bona eina per avaluar ragravepida i
adequadament per observacioacute i posterior anagravelisi lefecte dels fags
7
I INTRODUCCIOacuteN
Introduccioacuten
8
Introduccioacuten
9
Presentacioacuten del proyecto
Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica sobre las innovaciones en seguridad alimentaria en
Meacutexico la cual puso en evidencia la necesidad de analizar alternativas enmarcadas en el
aacutembito del uso de las tecnologiacuteas verdes lo que presentoacute la posibilidad de desarrollar un
trabajo innovador y que no se estuviera aplicando ya en el sector alimentario local o nacional
De esa manera se inician las actividades experimentales que para este trabajo doctoral se
dividieron en dos partes la primera realizada en Meacutexico y la segunda en Espantildea
En primera instancia se desarrolloacute un anaacutelisis en el Laboratorio de geneacutetica y biologiacutea
molecular del Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica (CINSP) en el Campus
Ciencias de la Salud de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) y gracias al apoyo
de Programa de mejoramiento del profesorado (PROMEP nuacutemero UANL-326) por medio de
una beca se iniciaron los estudios y asiacute se cumplioacute el primer propoacutesito que fue obtener virus
nativos contra cepas de Salmonella y purificarlos
Posteriormente para lograr los demaacutes objetivos que eran realizar la caracterizacioacuten parcial
de los fagos contra Salmonella se solicitoacute una beca a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten
Internacional para el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y
de Cooperacioacuten curso 2010-2011) con el fin de realizar una estancia de investigacioacuten y crear
oportunidades de desarrollo aprovechando las tecnologiacuteas innovadoras disponibles en la
Universitat Autoacutenoma de Barcelona (UAB) considerando ademaacutes que la alta reputacioacuten de la
institucioacuten y la supervisioacuten por parte de sus investigadores impactariacutean positivamente en el
desarrollo del trabajo y en el Curriculum Vitae del investigador y por consiguiente en su futuro
profesional como docente e investigador
Otra finalidad de este proyecto fue dejar un buen referente al concluir la estancia ya que
ello ofreceriacutea nuevas oportunidades para seguir forjando el perfil del investigador cimentaraacute
cualquier trayectoria profesional y facilitariacutea optar por un plan postdoctoral en esta misma
Universidad De esta manera se accedioacute a la beca del Programa Extranjeros II-A
Convocatoria 2010-2011 Nuacutemero 0000521211 del cual se cumplieron los objetivos
establecidos y otros maacutes por ejemplo conocer nuevas tecnologiacuteas
Siendo eacutesta una liacutenea de investigacioacuten relativamente reciente en Meacutexico se espera que
impacte en las posibilidades laborales en diversos contextos y seacutea de utilidad para sentar
precedentes para futuras liacuteneas de trabajo en dicha aacuterea
Introduccioacuten
10
Justificacioacuten
En las uacuteltimas deacutecadas los cambios ocurridos en la produccioacuten y consumo de alimentos
han tenido un impacto sobre la inocuidad alimentaria La industria en la produccioacuten masiva de
alimentos ha evolucionado de ser local a constituirse en otra donde la produccioacuten yo el
procesamiento estaacuten localizados en diferentes partes del paiacutes o del mundo Por otra parte la
poblacioacuten estaacute envejeciendo por lo que se vuelve maacutes vulnerable a problemas de salud
ademaacutes los agentes patoacutegenos son cada vez maacutes virulentos (DeWaal y Barlow 2014)
Los reportes sobre problemas gastrointestinales que recopila el Centro Nacional de
Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades (CENAVECE) indican que Nuevo
Leoacuten ha permanecido dentro de los primeros 12 lugares de casos de fiebre tifoidea y en los
primeros 14 de fiebre paratifoidea y otras salmonelosis A nivel nacional las enfermedades
infecciosas intestinales se ubican entre las primeras 10 causas de mortalidad de nintildeos en
edad escolar entre los 5 y 14 antildeos de edad (CENAVECE 2007)
Los microorganismos del geacutenero Salmonella pertenecen a la familia Enterobacteriaceae
Son bacilos o cilindros con puntas redondeadas y se diferencian de las demaacutes enterobacterias
mediante reacciones bioquiacutemicas y de aglutinacioacuten existen maacutes de 2500 serotipos todos
ellos patoacutegenos Actualmente se considera una sola especie denominada Salmonella
enterica de la cual seguacuten el esquema de Kauffmann-White se clasifican nueve serogrupos
Esta especie tiene importancia cliacutenica debido a que es la uacutenica capaz de infectar animales
homeotermos esta investigacioacuten se centra en cuatro serovariedades Salmonella enterica
serovar Typhimurium (S Typhimurium) S enterica serovar Paratyphi (S Paratyphi) S
enterica serovar Enteritidis (S Enteritidis) y S enterica serovar Typhi (S Typhi) estos
microorganismos se pueden aislar tanto de fuentes alimentarias (carne de res pollo crudo
huevo fresco carne de puerco almejas chorizos vegetales entre otros) como del medio
ambiente (suelo agua materia fecal y superficies) (Chlebicz y Śliżewska 2018 Nguendo
2018)
En Meacutexico S Enteritidis y S Typhimurium son los microorganismos aislados con mayor
frecuencia en las salmonelosis Normalmente S Enteritidis habita en el intestino de los
animales sin causar enfermedad pero puede infectar a humanos y promover diarrea voacutemito
dolor abdominal calambres y ocasionalmente insuficiencia renal y en los peores casos la
muerte (DeWaal y Barlow 2014) La contaminacioacuten de alimentos por Salmonella spp se debe
Introduccioacuten
11
a una combinacioacuten de factores relacionados con la produccioacuten a gran escala o cambios en el
manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los mismos (Uribe y Suarez 2006)
Por otra parte estaacuten los virus que pueden replicarse independientemente de los
cromosomas de una ceacutelula pero no sin su participacioacuten (Madigan y Martinko 2006) El hecho
de descubrir virus que pueden infectar y destruir bacterias fue recibido con optimismo por su
posible aplicacioacuten en usos terapeacuteuticos (McLaughlin et al 2006)
En un estudio realizado en diversos estados de Meacutexico (Coahuila Durango Estado de
Meacutexico Jalisco Morelos Oaxaca Puebla y Quereacutetaro) se ha fagotipado Salmonella spp
proveniente de huevo carne de pollo de engorde y gallinas progenitoras reproductoras de
postura comercial y productoras (Mancera et al 2004) Ademaacutes diversas investigaciones han
utilizado fagos liacuteticos para reducir la contaminacioacuten por Salmonella en pollos (canal y piel)
semillas germinadas y dulces de frutas cortadas (Goode et al 2003)
El uso de aditivos en los alimentos se ha reducido considerablemente debido al rechazo
generalizado por parte de los consumidores lo que podriacutea repercutir en un incremento en los
casos de intoxicaciones alimentarias En este contexto los fagos aportan ventajas sobre los
desinfectantes conocidos y los meacutetodos tradicionales de aplicacioacuten de friacuteo o calor ya que
pueden actuar como agentes de deteccioacuten y control bioloacutegico de bacterias patoacutegenas en
alimentos y su produccioacuten es relativamente raacutepida y econoacutemica (Atterbury et al 2003)
La utilidad de los fagos en el aacuterea de investigacioacuten es amplia una posible utilidad es ser
un instrumento para identificar cepas bacterianas especiacuteficas Tambieacuten se han utilizado para
el estudio de diversos fenoacutemenos moleculares el trabajo con estos virus permitioacute desarrollar
ensayos de placas de lisis conocer la naturaleza del ciclo de vida viral los tipos de mutaciones
geneacuteticas y los genes como segmentos de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) (Muniesa et al
2005)
Las empresas dedicadas a la biotecnologiacutea (Intralytix Omnilytics) se centran en desarrollar
productos utilizando fagos especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan las ETA y estos
productos comerciales de terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones
(Segundo 2010) Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos antildeos debido a sus
caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutefico sin dantildear la microbiota
en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros distribucioacuten de
Introduccioacuten
12
esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla (Oh y Park
2017)
En este sentido el objetivo general de este estudio es el aislamiento y caracterizarizacion
de fagos contra Salmonella a partir de diversas fuentes para su uso potencial en el control
bioloacutegico
13
II ANTECEDENTES
Antecedentes
14
Antecedentes
15
A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos
A nivel internacional la produccioacuten de alimentos y todos los mecanismos tecnoloacutegicos
involucrados en su procesamiento implican ademaacutes de la optimizacioacuten de los tiempos y de
la calidad un riesgo para la adquisicioacuten de enfermedades inherentes a la misma adopcioacuten
de nuevas tecnologiacuteas (Weaver et al 2017)
La OMS (2017) estima que las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de
muerte de nintildeos menores de cinco antildeos matan a 525000 nintildeos menores de cinco antildeos
cada antildeo una proporcioacuten significativa de las enfermedades diarreicas se puede prevenir
mediante el acceso al agua potable y a servicios adecuados de saneamiento e higiene
ademaacutes de que en todo el mundo se producen unos 1700 millones de casos de
enfermedades diarreicas infantiles cada antildeo
Seguacuten la OMS (2017) existen diferentes condiciones que propician el desarrollo de las
ETA Como son las de tipo bioloacutegico producidos por hongos o bacterias causantes de
enfermedades ya sea por sus metabolitos o toxinas virus o huevecillos de paraacutesitos asiacute
como los venenos de algunos peces y plantas Las de tipo quiacutemico como productos de
limpieza o desinfeccioacuten pesticidas toxinas marinas insecticidas o venenos y fiacutesicos cuando
en la materia prima de los alimentos se encuentran objetos como vidrios metal piedras
grapas barniz de untildeas joyeriacutea cabellos o cualquier elemento extrantildeo
De acuerdo con el Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos (SIRVETA) ndashdesarrollado por el Instituto
Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y Zoonosis (PANALIMENTOS)ndash ocurrieron 1683
brotes de ETA en Meacutexico que ocasionaron 53860 casos de enfermedades y provocaron
207 muertes mientras que en los demaacutes paiacuteses de Ameacuterica Latina se produjeron durante el
mismo periacuteodo 6324 brotes que provocaron 228579 casos y 314 muertes (Forsythe y
Hayes 2002) Cabe aclarar que eacutestos son soacutelo los brotes notificados por la autoridad
competente El sistema utilizado internacionalmente para obtener alimentos inocuos es el
APPCC (Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control) o HACCP (por sus siglas en ingleacutes
Hazard Analysis and Critical Control Points) que se puede implementar en cualquier tipo de
industria y permite prevenir controlar y eliminar cualquier peligro antes de consumir los
alimentos (Rodriacuteguez Torrens et al 2015)
En Meacutexico el Distintivo H es un programa implementado por los servicios alimentarios
Antecedentes
16
oficiales mediante el cual se ofrece a los clientes alimentos seguros El Centro Nacional de
Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades de Meacutexico (CENAVECE) advierte
que uno de los problemas de salud maacutes importantes lo constituyen los trastornos
gastrointestinales cuya mortalidad predomina entre los 5 y los 14 antildeos Entre 2006 y 2012
el Estado de Nuevo Leoacuten ha permanecido entre los primeros 7 lugares de casos de diarrea
(CENAVECE 2018)
La figura 1 muestra la distribucioacuten de la incidencia en Meacutexico la cual estaacute asociada a la
densidad demograacutefica y la accesibilidad a servicios de salud que facilitan el registro es asiacute
que son precisamente las entidades federativas con mayor poblacioacuten quienes registran
nuacutemeros maacutes altos
Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa en
Meacutexico 2010-2012 (CENAVECE 2018)
A1 Problemaacutetica
La inocuidad alimentaria es una preocupacioacuten mundial que se refleja en el incremento
de reportes y noticias relacionadas con la contaminacioacuten de los alimentos difundidos en
diversos paiacuteses a su vez estos productos son retirados del mercado lo que provoca
peacuterdidas por varios cientos de millones de doacutelares El Codex Alimentarius indica que las ETA
y los dantildeos provocados por los alimentos son en el mejor de los casos desagradables y
Antecedentes
17
en el peor fatales y pueden influir negativamente en el comercio y la confianza de los
consumidores Por consiguiente es imprescindible un control eficaz de la higiene Todos los
eslabones de la cadena alimentaria ndashfabricantes elaboradores manipuladores y
consumidores de alimentosndash son responsables del control de los riesgos microbioloacutegicos
desde la explotacioacuten agriacutecola o ganadera hasta el consumidor final Desde esta oacuteptica el
anaacutelisis de riesgos deberiacutea aplicarse dentro de un contexto estrateacutegico organizativo y
operacional reconocido si bien en el proceso puede haber elementos comunes establecer
un nivel apropiado de proteccioacuten en esos sectores puede representar las maacuteximas
diferencias (Atterbury et al 2003)
La OMS ha identificado siete microorganismos patoacutegenos ndashC jejuni C perfringens E
coli 0157H7 L monocytogenes Salmonella spp S aureus y T gondiindash que causan entre
123 y 33 millones de casos de infeccioacuten solamente en los EE UU lo que representa
peacuterdidas econoacutemicas de entre 5500 y 34900 millones de doacutelares Ademaacutes resalta que su
incidencia podriacutea ser de 300 a 350 veces mayor de lo que indican las estadiacutesticas dado que
soacutelo se notifica un nuacutemero relativamente pequentildeo de casos de ETA Se estima que 70 de
los 1500 millones de episodios de diarrea son causados por alimentos en mal estado Es
posible que en los paiacuteses en desarrollo se notifique a las autoridades sanitarias una
proporcioacuten de casos auacuten inferior principalmente por pobreza y escasez de recursos a
disposicioacuten de los servicios de gestioacuten de la inocuidad alimentaria e inspeccioacuten de alimentos
(Van de Venter 2000)
A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea
La OMS estima que el 88 de los casos de diarrea a nivel mundial son atribuibles al
agua el saneamiento y la higiene todos los aspectos de inocuidad de los alimentos estaacuten
relacionados con estos factores En menor medida la enfermedad se transmite a traveacutes de
otras viacuteas por ejemplo el aire y alrededor del 94 de los casos son atribuibles al
saneamiento ambiental el total de fallecimientos se calcula en maacutes de 15 millones
principalmente en nintildeos en los paiacuteses desarrollados el promedio es ligeramente menor a
90 La diarrea atribuible al agua y saneamiento inapropiado representa 53 de las
muertes totales y 35 en nintildeos europeos de 0-14 antildeos y es ademaacutes una de las causas
principales de malnutricioacuten (Pruumlss-Uumlstuumln y Corvalaacuten 2006)
Antecedentes
18
Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud puacuteblica en el mundo
especialmente en paiacuteses en desarrollo Su alta incidencia se debe en gran parte a la
ingestioacuten de alimentos contaminados con microorganismos patoacutegenos como Salmonella
que causa episodios de diarrea aguda Salmonella spp es uno de los patoacutegenos enteacutericos
maacutes frecuentes tanto en paiacuteses desarrollados como subdesarrollados Dependiendo de la
especie tamantildeo del inoacuteculo factores de virulencia expresados por la cepa hueacutesped
involucrado estado inmunoloacutegico del paciente e intervencioacuten meacutedica puede ocasionar una
infeccioacuten gastrointestinal de media a severa hasta una infeccioacuten sistemaacutetica que
comprometa la vida del paciente (Fernaacutendez 2008)
Otros microorganismos que tambieacuten pueden contaminar el agua y los alimentos como
bacterias (Bacillus cereus Clostridium botulinum Campylobacter jejuni Vibrio cholera) virus
(Norwalk Rotavirus Hepatitis A) y paraacutesitos (Entamoeba histolytica Cryptosporidium
parvum Toxoplasma gondii) pueden transmitirse tambieacuten de una persona a otra como
resultado de una higiene deficiente (Freedman et al 2015)
Estudios de empresas dedicadas exclusivamente a la crianza de cerdos reportan
epidemias como el virus de la diarrea porcina la cual posteriormente se transmite a los
consumidores de estas carnes contaminadas ya sea por contacto con las heces o por
consumo de carnes contaminadas lo cual implica tambieacuten una peacuterdida econoacutemica para la
industria alimentaria resaltando la necesidad de establecer medidas preventivas y
correctivas seguacuten sea el caso (Huss et al 2017)
Seguacuten la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO
por sus siglas en ingleacutes Food and Agriculture Organization) las toxiinfecciones alimentarias
son la segunda causa de morbilidad pero muchas permanecen sin declarar quizaacutes por su
mediana severidad y recuperacioacuten raacutepida salvo el coacutelera Los alimentos son susceptibles a
contaminacioacuten de todo tipo la fuente de agentes causales suele ser el tracto gastrointestinal
de individuos reservorios o las heces de animales y humanos infectados o bien agua
corrompida que por deficiencias sanitarias contamina carne fresca pescados moluscos
pasteles de crema y leche no pasteurizada entre otros productos (Riacuteos et al 2012) como
se puede observar en la tabla 1
Antecedentes
19
Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias (Riacuteos et al 2012)
Agente Periacuteodo de
incubacioacuten Fuente Agente patoacutegeno
Salmonella spp 8-24 h Aves huevos mascotas
(tortugas lagartos pollos) Bacteria y endotoxina
E coli
enterotoxigeacutenica 24-72 h
Agua y alimentos
contaminados
Enterotoxina
termoestable
V cholerae 24-72 h Alimentos contaminados Enterotoxina termolaacutebil
Shigella spp 24-72 h Agua y alimentos
contaminados Bacteria y endotoxina
C jejuni 1-7 d Leche aves de corral y
agua no potable
Bacteria y Enterotoxina
termolaacutebil
Yersinia spp 1-7 d Carne de cerdo leche Bacteria y Enterotoxina
B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria
La historia referente a las toxiinfecciones alimentarias se comienza a documentar y
legislar en el siglo X con el botulismo en Bizanzio y documentos sobre el ergotismo en el
siglo XVI En el siglo XIX aparecen los alimentos enlatados y Louis Pasteur asocia el
deterioro de los alimentos con las bacterias En el siglo XX se produce un desarrollo
espectacular de la microbiologiacutea de los alimentos con el establecimiento de la etiologiacutea de
las toxiinfecciones alimentarias el comienzo de una nueva era de la quiacutemica e ingenieriacutea
alimentaria Aunado a los movimientos migratorios de las personas la diversificacioacuten de
alimentos la produccioacuten masiva de alimentos y la facilidad de transporte desde puntos
lejanos entre la produccioacuten y preferencia en el consumo de alimentos aunadas a la
capacidad que tienen los microorganismos para evolucionar y adaptarse a su medio
ambiente hacen pensar en estos microorganismos como patoacutegenos emergentes (DeWaal y
Barlow 2014)
B1 Escherichia
Las cepas de E coli se pueden diferenciar seroloacutegicamente por los antiacutegenos somaacuteticos
(O) flagelares (H) y capsulares (K) Ademaacutes pueden hallarse fimbrias y estructuras
Antecedentes
20
emparentadas que desempentildean un papel en la patogenia Actualmente se reconocen cinco
grupos de E coli causantes de diarrea en funcioacuten del siacutendrome que provocan cuyas
diferencias estaacuten codificadas por plaacutesmidos (Wright et al 2017) Los diferentes tipos son
E coli enteropatoacutegeno (EPEC) es responsable de la diarrea acuosa en lactantes
Produce voacutemitos fiebre y diarrea acuosa con mocos pero sin sangre Coloniza las
microvellosidades de todo el intestino produciendo la lesioacuten de ldquoadhesioacuten y erosioacutenrdquo en
el ribete en cepillo de la membrana de la vellosidad Afecta a adultos y nintildeos menores de
dos antildeos siendo este rango de edad el principal factor de riesgo
E coli enterotoxigeacutenico (ETEC) es el causante de la llamada vulgarmente ldquodiarrea
del viajerordquo se manifiesta con diarrea acuosa como agua de arroz y poca fiebre
Coloniza la porcioacuten proximal del intestino delgado Afecta a adultos y nintildeos son una causa
frecuente de diarrea en lactantes de paiacuteses en desarrollo asiacute como la causa maacutes comuacuten
de diarrea en individuos de paiacuteses industrializados que viajan a zonas menos
desarrolladas del mundo
E coli enteroinvasor (EIEC) coloniza el colon origina fiebre y diarrea profusa con
heces que contienen mocos y estriacuteas sanguinolentas Presenta un plaacutesmido de 120-140
mD conocido como plaacutesmido invasivo que lleva todos los genes necesarios para la
virulencia Al igual que ETEC pero afecta principalmente a adultos
E coli enterohemorraacutegico (EHEC) origina diarrea sanguinolenta colitis hemorraacutegica
siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico (SUH o SHU) y puacuterpura trombocitopeacutenica En este grupo se
incluye E coli verotoxigeacutenico (VTEC) serotipos O157 O26 O111 Afecta principalmente
a nintildeos el principal factor de riesgo es el consumo de carne sin la coccioacuten adecuada
E coli enteroagregativo (EAggEC) posee caraacutecter clonal diferenciaacutendose dos clones
relacionados (1 y 2) Dentro de cada grupo estaacute presente una variedad concreta de
antiacutegenos O mientras que los antiacutegenos H se conservan
En los reportes cientiacuteficos sobre E coli se refieren a las plantas como otra fuente de
infeccioacuten especiacuteficamente en la espinaca (Spinacia oleracea) y lechuga (Lactuca sativa) Se
recomienda igualmente estudiar profundamente los cultivos y los tejidos vegetables y
animales ya que se deben considerar como paraacutemetros de riesgo para la inocuidad de los
alimentos (Fernaacutendez Ferran et al 2003 Wright et al 2017)
B2 Campylobacter
Campylobacter spp es un bacilo delgado gram negativo (05-08 microm x 02-05 microm) y
Antecedentes
21
microaeroacutefilo (necesita 3-5 de O2 y 2-10 de CO2) Su morfologiacutea puede variar entre
vibrioacutenica (bacilos curvados) espirilar en forma de rosquilla de S y cocoide de tal forma
que en fase logariacutetmica de crecimiento las ceacutelulas tienen forma espiral o curvada pero a
medida que los cultivos envejecen adquieren formas esfeacutericas Moacutevil con un uacutenico flagelo
polar que presenta de dos a tres veces el largo de la ceacutelula Aunque hay diversas especies
de Campylobacter causantes de enfermedades C jejuni C coli y C lari son las especies
que se aiacuteslan con mayor frecuencia en casos de gastroenteritis humana siendo C jejuni la
responsable de la mayoriacutea de las toxiinfecciones alimentarias 89-93 de las
toxiintoxicaciones (OMS 2017)
Las especies C coli y C lari son semejantes a C jejuni su diferencia se basa en pruebas
bioquiacutemicas C coli no es capaz de hidrolizar el piruvato y C lari es capaz de crecer en
presencia de 30 microgramos de aacutecido nalidiacutexico (Haddad et al 2013) La movilidad la
quimiotaxis y los flagelos son factores importantes en la virulencia pues de ellos depende la
colonizacioacuten del epitelio intestinal Campylobacter produce una enterotoxina parecida a la
toxina coleacuterica que tambieacuten juega un papel importante en la patogenia (Nichols 2005) C
jejuni puede sobrevivir de 2 a 4 semanas en condiciones de baja humedad oxigenacioacuten y
temperaturas de 4ordmC superando muchas veces el tiempo de vida uacutetil del producto Asimismo
puede perdurar de 2 a 5 meses a -20ordmC pero a temperatura ambiente apenas dura algunos
diacuteas (Khan et al 2013)
C jejuni y C coli son sensibles a diversos agentes antimicrobianos como los macroacutelidos
los aminoglucoacutesidos el cloranfenicol y la tetraciclina La eritromicina ha sido el antibioacutetico de
eleccioacuten para tratar las infecciones del tracto intestinal Al igual que en Salmonella el control
de Campylobacter se debe realizar tanto en el sector agropecuario como en los
establecimientos alimentarios por lo que los controles especificados para Salmonella
podriacutean extrapolarse a este microorganismo Un aspecto importante de su control reside en
la refrigeracioacuten de las aves ya que la baja temperatura junto con la desecacioacuten superficial
que se produce reduce significativamente la incidencia y los recuentos de Campylobacter
viables incluso en canales altamente contaminadas (Fernaacutendez 2008)
B3 Enterobacter
Conocido antiguamente como Cronobacter spp incluye varias especies de patoacutegenos
emergentes relacionados con brotes de meningitis septicemia y enterocolitis necrotizante
especialmente en neonatos y nintildeos La tasa de mortalidad de estos brotes es alta entre 20
Antecedentes
22
y 80 y los supervivientes suelen sufrir severos desoacuterdenes neuroloacutegicos (Grimont y
Grimont 2006)
E sakazakii es un bacilo moacutevil no esporulado gram negativo que ha sido encontrado en
alimento para bebeacutes es maacutes resistente a los cambios osmoacuteticos y a la sequiacutea que otros
miembros de la familia Enterobacteriaceae y se asocia con casos esporaacutedicos de sepsis
meningitis cerebritis y enterocolitis necrotizante La mayoriacutea de las infecciones se observan
en bebeacutes con bajo peso al nacer y que son alimentados de forma insalubre La mortalidad
ha disminuido a menos de 20 en los uacuteltimos antildeos Este microorganismo no se ha
encontrado presente en la foacutermula laacutectea tampoco existe evidencia de la transmisioacuten de
persona a persona o un medio general de difusioacuten ambiental (Vanegas et al 2009)
B4 Listeria
L monocytogenes estaacute muy difundida en la naturaleza en la que suele adoptar un ciclo
saprofiacutetico en estrecha relacioacuten con el suelo Ademaacutes se ha encontrado en aguas
continentales sedimentos marinos material vegetal en descomposicioacuten forrajes heces
humanas y animales y aguas residuales de explotaciones animales entre otros ambientes
lo que explica su presencia en alimentos crudos Epidemioloacutegicamente se caracteriza por su
ubicuidad sobreviviendo en tierra huacutemeda hasta 500 diacuteas en funcioacuten de la temperatura En
heces o aguas residuales mantenidas a temperatura de refrigeracioacuten sobrevive maacutes de seis
antildeos este periodo se reduce si se mantiene a temperatura ambiente (Guenther et al 2009)
Listeria spp son bacilos gram positivos de forma regular y con forma de vara corta
Algunas veces pueden tener forma cocoide apareciendo como ceacutelulas individuales o en
cadenas cortas Son moacuteviles entre 20-25ordmC pero no a 37ordmC Existen seis especies de Listeria
descritas L monocytogenes L innocua L welshimeri L seeligeri L grayi y L ivanovii
subespecie ivanovii y subespecie londoniensis Las cepas patoacutegenas de L monocytogenes
producen la listeriolisina O responsable de la hemoacutelisis-β y de la destruccioacuten de las ceacutelulas
fagocitarias es una hemolisina que segrega la bacteria a causa de la disminucioacuten de pH
(Liu 2006)
L monocytogenes tolera y se multiplica en concentraciones altas de NaCl contando con
la posibilidad de sobrevivir durante un antildeo en ambientes con una concentracioacuten de 16 su
tolerancia aumenta al disminuir el pH o la temperatura del medio Los tratamientos para su
inactivacioacuten son de 617ordmC35min 70ordmC20min 78ordmC15min u 80ordmC5min favoreciendo su
Antecedentes
23
resistencia al calor con la presencia de grasas Se multiplica entre 0 y 4ordmC las temperaturas
bajas ejercen un efecto protector de tal manera que en condiciones de acidez su inactivacioacuten
es maacutes lenta en refrigeracioacuten que a temperatura ambiente (Leverentz et al 2003) La acidez
influye en la capacidad de Listeria para sobrevivir a la congelacioacuten (temperaturas inferiores
a -47ordmC) y almacenamiento a menos de -18ordmC en carne mostrando una disminucioacuten en la
recuperacioacuten de ceacutelulas viables que han sido dantildeadas por el friacuteo (Wu et al 2015)
B5 Salmonella
B51 Origen
Salmonella tiene su origen principal en el tracto intestinal de animales fundamentalmente
las aves y los porcinos y pueden acabar contaminando las carnes crudas el pollo crudo los
productos marinos crudos o el huevo Los brotes de Salmonella estaacuten asociados al consumo
de alimentos elaborados con huevo crudo y siguen siendo frecuentes a pesar de conocerse
el riesgo que representa su consumo de las medidas legales adoptadas y de los programas
de educacioacuten sanitaria dirigidos a disminuir su incidencia Este geacutenero pertenece a la familia
Enterobacteriaceae fue descrito a principios del siglo XX por el bacterioacutelogo estadounidense
Theobald Smith (Zaidi et al 2006) En la figura 2 se muestran los factores de virulencia y
en la figura 3 se presenta la clasificacioacuten de Salmonella enterica con las diferentes
subespecies y serovares que se aiacuteslan maacutes frecuentemente
Antecedentes
24
Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por
Salmonella spp (Brenner et al 2000)
Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella (Brenner et al 2000)
Antecedentes
25
B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp
La mayoriacutea de los miembros de este geacutenero se encuentra en el tracto intestinal del
hombre y los animales como bacterias patoacutegenas o comensales Estaacute integrado por bacilos
gram negativos anaerobios facultativos y no esporulados La mayor parte de los serotipos
conocidos son moacuteviles mediante flagelos peritricos Se conocen maacutes de 2460 serotipos
muchos de ellos patoacutegenos para el ser humano (Chlebicz y Śliżewska 2018)
Son bacterias invasoras enterotoxigeacutenicas y estaacuten ampliamente diseminadas en todo el
mundo su temperatura ideal de sobrevivencia entre los 15 y los 35degC (mesoacutefilas) y en una
amplitud de pH de 45 a 9 Los microorganismos de este geacutenero se distribuyen en seis
grupos se han definido mediante biotipado hibridacioacuten DNA-DNA anaacutelisis de la secuencia
del RNA ribosomal 16S y por ldquomultilocus enzyme electrophoresisrdquo (MLEE) (Brenner et al
2000) La serotipificacioacuten se utiliza para diferenciar maacutes allaacute del nivel de subespecie como
puede observarse en la tabla 2
Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos (Brenner et al 2000)
Grupo Microorganismo
A S Paratyphi Al
B S Typhimurium S Bredeney
C1 S Choleraesuis S Montevideo S Oranienburg
C2 S Newport
D S Typhi S Enteritidis S Dublin S Gallinarum
E S Butantan S Anatum S Give
Salmonella serotipo Typhi es la causante de la fiebre tifoidea presentando siacutentomas como
son fiebre de intensidad variable cefalea diarrea estrentildeimiento tos naacuteuseas y voacutemitos
anorexia dolor abdominal y escalofriacuteos Mientras que los demaacutes serotipos considerados no
tifoidicos presentan un estado asintomaacutetico En el antildeo 2000 los serotipos aislados con
mayor frecuencia en EE UU fueron S Typhimurium S Enteritidis y S Newport (Dunkley et
Antecedentes
26
al 2009) En Meacutexico los serotipos de Salmonella spp identificados con mayor frecuencia
en los servicios de salud fueron S Typhimurium (204) y S Enteritidis (183) (Guenther
et al 2009)
La salmonelosis se produce por la ingestioacuten de alimentos o bebidas contaminados por
Salmonella se manifiesta como una enterocolitis aguda y se caracteriza por presentar
siacutendromes febriles asociados a manifestaciones gastrointestinales o sisteacutemicas con
frecuencia severas (Figueroa y Verdugo 2005 Fernaacutendez 2008) El cuadro cliacutenico se
localiza baacutesicamente en el iacuteleo terminal y el intestino grueso La enfermedad se manifiesta
a traveacutes de diferentes fases En la primera fase la infeccioacuten se limita a la mucosa intestinal
en la siguiente la bacteria invade el tejido linfaacutetico local y le sigue una fase de bacteriemia
durante la cual la mayoriacutea de las bacterias son fagocitadas por macroacutefagos del hiacutegado y el
bazo (Calva et al 2006 Bettini et al 2012)
Con frecuencia el meacutedico hace un diagnoacutestico basaacutendose en el cuadro cliacutenico del
paciente pero sin contar con los estudios microbioloacutegicos necesarios para establecer un
diagnoacutestico certero cuando se presenta infeccioacuten por Salmonella inicia una fase de
crecimiento bacteriano intracelular el cual despueacutes de varios diacuteas provoca la liberacioacuten de
gran cantidad de patoacutegenos al torrente sanguiacuteneo (Zaidi et al 2006)
La salmonelosis es una enfermedad aguda de distribucioacuten mundial Afecta a todos los
grupos de edad con mayor incidencia en los extremos de la vida provocando infecciones
en forma endeacutemica o en brotes epideacutemicos de intoxicacioacuten alimentaria que en ocasiones
abarcan amplias zonas geograacuteficas debido a las extensas cadenas de distribucioacuten de
alimentos existentes hoy en diacutea (Fernaacutendez 2008)
Para la salud puacuteblica la salmonelosis tiene un impacto socioeconoacutemico tanto en los paiacuteses
en desarrollo como en los paiacuteses desarrollados Ademaacutes al no recibir tratamiento puede
ser causante del siacutendrome de Reiter el cual se manifiesta por dolor en articulaciones
irritacioacuten en los ojos dolor al orinar y puede durar meses o antildeos desencadenaacutendose una
artritis croacutenica (CFSPH 2005) Desde la deacutecada de los ochenta la incidencia de
salmonelosis de origen alimentario ha aumentado considerablemente en Meacutexico Este
incremento es resultado de una combinacioacuten de factores como la calidad del agua utilizada
para riego y el manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los alimentos (Zaidi
et al 2006)
Antecedentes
27
Un meta-anaacutelisis (revisioacuten sistemaacutetica en la cual se combinan matemaacuteticamente los
resultados de varios estudios para contestar una misma pregunta) realizado recientemente
confirma que Salmonella resiste a antibioacuteticos empleados en los alimentos de origen animal
ya que pueden estar contaminados con este microorganismo es resistente a 3 antibioacuteticos
como la amoxicilina las sulfonamidas y las tetraciclinas ya que son ampliamente usados en
produccioacuten animal (Ejo et al 2016)
B53 Manifestaciones cliacutenicas
El cuadro cliacutenico normalmente es de 2 a 5 diacuteas aunque en ocasiones persiste varias
semanas La gravedad de los siacutentomas variacutea considerablemente siendo mayor en nintildeos y
ancianos Si el microorganismo pasa desde el intestino a la corriente sanguiacutenea y llega a
otras partes del cuerpo puede ocasionar la muerte si la persona afectada no es tratada
raacutepidamente La mayoriacutea de las muertes causadas por esta bacteria han ocurrido entre
ancianos que viven en residencias La tasa de mortalidad es baja inferior a 1 en paiacuteses
desarrollados pero suelen producirse de 40-50 muertes al antildeo especialmente entre nintildeos
ancianos o personas inmunodeprimidas Las excretas de los enfermos contienen gran
cantidad de la especie de Salmonella implicada al comienzo de la enfermedad la cifra inicial
decrece seguacuten transcurre el tiempo (DeWaal y Barlow 2014)
El estado de portador se refiere a la condicioacuten en que las personas curadas pueden
eliminar Salmonella en sus heces durante meses La mitad de los individuos afectados
excretan este patoacutegeno de 2-4 semanas posteriores a su curacioacuten cliacutenica entre 10 y 20
continuacutean durante 4-8 semanas unos pocos durante 3 meses y en raras ocasiones se
prolonga hasta 6 meses El microorganismo puede eliminarse tambieacuten por la orina La dosis
infectante capaz de desencadenar la salmonelosis humana es alrededor de 1times105 UFCmL
dependiendo de factores como tipo de alimento virulencia de la cepa involucrada y
susceptibilidad del individuo Entre las especies altamente virales se encuentran la S Dublin
y sobre todo S Enteritidis (Callaway et al 2008)
El incremento del serotipo de S Enteritidis en los casos de salmonelosis humana al
contrario de otras del geacutenero Salmonella representa un importante problema de salud
puacuteblica en muchos paiacuteses ya que este serotipo infecta a gallinas aparentemente sanas que
posteriormente transmiten las enfermedades al hombre Si se consumen huevos crudos o
Antecedentes
28
poco cocidos el microorganismo podriacutea causar la enfermedad El nuacutemero de casos de
salmonelosis se incrementa durante el verano (Parra et al 2002 Callaway et al 2008
Fernaacutendez 2008)
B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis
Gran parte de las salmonelosis se deben al consumo de alimentos de origen animal
(carnes de abasto pollo mariscos pescado leche y huevos asiacute como ovoproductos y
productos laacutecteos no pasteurizados) o de origen vegetal que se contaminan con productos
en malas condiciones de salubridad o mal manipulados Muchos alimentos sobre todo los
de origen animal o contaminados con aguas residuales han servido como vehiacuteculos en
brotes de salmonelosis La carne de matadero estaacute contaminada habitualmente con
Salmonella su incidencia es mayor en las canales de ganado y otros animales debido por
ejemplo a la contaminacioacuten por el contenido intestinal de la res viva cuyas heces manchan
su piel pelo y patas al llegar al matadero Las canales de cerdo se contaminan durante las
operaciones de escaldado y pelado La contaminacioacuten entre las mismas canales y de eacutestas
a utensilios superficies de trabajo y manos de los que las manipulan es faacutecil Otro de los
principales reservorios de Salmonella es la carne de aves de corral La contaminacioacuten de las
canales de pollo y otras aves procede igualmente del tracto intestinal o del material fecal
de los animales que manchan sus patas y plumas Las etapas criacuteticas de la contaminacioacuten
de las canales aviares estaacuten en el desplumado y la evisceracioacuten tambieacuten es comuacuten la
contaminacioacuten cruzada a traveacutes de las manos de los operarios equipo y utensilios utilizados
en la preparacioacuten y troceado de las canales (Marcus et al 2004)
Son raras las salmonelosis adquiridas directamente de carnes bien cocinadas la mayoriacutea
de los brotes se deben a una coccioacuten insuficiente o por contaminacioacuten posterior a su
preparacioacuten Las carnes elaboradas mediante fermentacioacuten (salami chorizo y salchichoacuten)
pueden ser causa de brotes de salmonelosis teniendo en cuenta que las especies que
integran este geacutenero pueden sobrevivir al proceso de fermentacioacuten (Forsythe y Hayes
2002)
Como se mencionoacute anteriormente otro alimento que se asocia con frecuencia a
Salmonella es el huevo La contaminacioacuten se produce por dos viacuteas a traveacutes de la caacutescara
contaminada y por viacutea transovaacuterica en aves infectadas (gallina pata pava) En el primer
caso la superficie de la caacutescara se contamina siempre a su paso por la cloaca o cuando el
Antecedentes
29
huevo estaacute en un ambiente fecal los huevos rotos o manchados constituyen un peligro en
la propagacioacuten de especies de Salmonella (EFSA 2014)
La contaminacioacuten partiendo de la caacutescara se produce si eacutesta mantiene un grado de
humedad apropiado y existe una temperatura diferencial significativa entre el contenido del
huevo y el ambiente La diferencia de temperaturas entre el huevo maacutes elevada y el
ambiente favorece la absorcioacuten de los microorganismos como Salmonella Tambieacuten se
transmite sobre la caacutescara por contaminacioacuten cruzada a traveacutes de los manipuladores que
han tenido contacto con superficies infectadas durante el transporte y almacenamiento de
los mismos en lugares con precarias condiciones de higiene (Ejo et al 2016) Salmonella
es causal de graves enfermedades que son trasmitidas por productos derivados de huevo
contaminado y la asociacioacuten entre la infeccioacuten del tracto reproductivo de los pollos fue un
fuerte incentivo para desarrollar programas de prevencioacuten (Jawale y Lee 2014)
La leche cruda puede albergar Salmonella y ser causa de brotes de salmonelosis se
contamina a traveacutes del pezoacuten y por las manos del ordentildeador la pasteurizacioacuten elimina la
presencia de la bacteria Entre los productos laacutecteos se han identificado como causa de
brotes de salmonelosis la leche en polvo el queso los helados y maacutes raramente la
mantequilla todos ellos por fallos en su elaboracioacuten Salmonella se destruye o inactiva
durante la fermentacioacuten de alta acidez como el yogur y el queso de pH inferior a 45 En el
caso del queso poco aacutecido (pH superior a 49) la Salmonella puede desarrollarse en
cualquier etapa de su elaboracioacuten (Mastroeni y Maskell 2006)
Entre las verduras cualquiera puede contener Salmonella cuando se cultivan con aguas
residuales contaminadas o son fertilizadas con abonos de origen animal Algunos vegetales
como los berros han sido causa de brotes de salmonelosis Por otro lado los mariscos se
contaminan con Salmonella cuando se criacutean en aguas residuales contaminadas por lo que
han sido la causa de numerosos brotes en todo el mundo la depuracioacuten es la medida
preventiva adecuada Diferentes alimentos se han identificado como portadores de
Salmonella entre ellos coco cebada harina de cereales pimienta blanca y negra pasta
cacao en polvo y chocolate (Fernaacutendez 2008) La FDA (2017) reportoacute el aumento de las
pruebas de las cuales ha identificado papayas de dos granjas que resultaron positivas para
las cepas de Salmonella que coinciden con enfermedades no relacionadas con este brote
Antecedentes
30
C Crecimiento microbiano
El crecimiento microbiano puede definirse como un incremento en los constituyentes
celulares que ocasiona un aumento del nuacutemero de ceacutelulas de los microorganismos que se
multiplican por gemacioacuten y fisioacuten binaria En el uacuteltimo caso las ceacutelulas individuales se
agrandan y dividen para originar dos ceacutelulas hijas de un tamantildeo aproximadamente igual
(Atlas y Bartha 2002)
C1 Crecimiento de los microorganismos
Todos los mamiacuteferos incluyendo los seres humanos se adaptan a la vida del mundo
microbiano Louis Pasteur Robert Koch Eacutelie Metchnikoff y Theodor Escherich entre otros
investigadores sentaron las bases conceptuales sobre las interacciones microbio-hueacutesped
Pasteur postuloacute que los microbios eran necesarios para la vida humana y Metchnikoff afirmoacute
que la composicioacuten de la flora microbiana era esencial para el bienestar del hueacutesped
Igualmente Escherich estaba convencido de que el conocimiento preciso de la flora
endoacutegena era esencial no soacutelo para la comprensioacuten de la fisiologiacutea de la digestioacuten sino para
la comprensioacuten de la patologiacutea y terapia de enfermedades microbianas intestinales A pesar
de estas primeras ideas soacutelo recientemente los cientiacuteficos han desarrollado meacutetodos que
permiten caracterizar directamente los mecanismos moleculares que subyacen a la creacioacuten
y mantenimiento de diversos ecosistemas microbianos (Falk et al1998)
El crecimiento de una poblacioacuten bacteriana resulta de la suma de ciclos celulares de todos
sus individuos y suele ser asincroacutenico puesto que cada microorganismo se encuentra en un
punto diferente del ciclo celular Por consiguiente en un momento determinado en una
poblacioacuten se encuentran ceacutelulas que acaban de dividirse otras estaacuten replicando su ADN y
elongaacutendose y otras estaacuten iniciando la divisioacuten celular (Melbinger et al 2015)
El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza en la mayoriacutea de los
casos mediante la produccioacuten de colonias aisladas en cultivos soacutelidos El crecimiento
explosivo de las bacterias produce un gran nuacutemero a partir de una uacutenica ceacutelula inicial de
forma que tras un periacuteodo de tiempo de incubacioacuten en las condiciones ambientales
adecuadas se produce una colonia de individuos iguales Para que un microorganismo
crezca necesita nutrientes que le aporten energiacutea y elementos quiacutemicos para la siacutentesis de
sus constituyentes celulares De acuerdo a la fuente de carbono que utilizan los
Antecedentes
31
microorganismos se clasifican en autoacutetrofos si es el CO2 atmosfeacuterico (microorganismos que
fotosintetizan) y heteroacutetrofos si utilizan carbono orgaacutenico (Ouyang y Li 2013)
C11 Disponibilidad del agua
El agua es un factor importante para el crecimiento microbiano se requiere para crecer y
llevar a cabo las funciones metaboacutelicas de lo contrario los microorganismos se deshidratan
o mueren La aw depende de la concentracioacuten de solutos y de la cantidad de agua disponible
en el medio ambiente La mayoriacutea de las bacterias y hongos necesitan valores entre 098 y
0995 de aw para su pleno desarrollo (Madigan y Martinko 2006)
Una membrana plasmaacutetica permanentemente selectiva separa el contenido
citoplasmaacutetico del microorganismo de su ambiente por ello las alteraciones en la
concentracioacuten osmoacutetica del medio extracelular pueden afectar incluso la viabilidad de los
mismos Si se coloca un microorganismo en una solucioacuten isotoacutenica el agua entraraacute en la
ceacutelula y causaraacute su estallido salvo que la propia ceacutelula desarrolle alguna estrategia para
evitarlo por ejemplo reducir la concentracioacuten osmoacutetica del citoplasma gracias a los cuerpos
de inclusioacuten Los procariotas tambieacuten pueden contener canales sensibles a la presioacuten
osmoacutetica que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno
se vuelve maacutes baja que la del citoplasma (Madigan y Martinko 2006)
C12 Acidez y pH
El pH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad entre 5 y 8 para impedir la
destruccioacuten de las macromoleacuteculas haacutebiles en condiciones aacutecidas o alcalinas Los aacutecidos
fuertes (inorgaacutenicos) y los aacutecidos deacutebiles (orgaacutenicos) disminuyen el pH externo
posteriormente se disocian en el interior de la ceacutelula inhibiendo la actividad enzimaacutetica y el
transporte de nutrientes por lo tanto los microorganismos no pueden generar energiacutea de
almacenamiento y ocurre la muerte celular (Brooks et al1992)
C13 Oxiacutegeno
El oxiacutegeno molecular (O2) influye en el metabolismo de los microorganismos Durante el
Antecedentes
32
proceso de reduccioacuten del O2 se crean formas reactivas como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2)
superoacutexidos (O2-) y radicales hidroxilos (OH-) que producen dantildeo celular por la oxidacioacuten
de compuestos orgaacutenicos e incluso macromoleacuteculas (Prescott et al1999)
C14 Temperatura
La temperatura afecta el desarrollo y la supervivencia de los microorganismos En bajas
temperaturas la velocidad de crecimiento de algunos microorganismos disminuye y los
periacuteodos de latencia se alargan Por otro lado las temperaturas elevadas aceleran las
reacciones enzimaacuteticas (antes de los 40degC) pero si se intensifica el calor en algunos casos
provocan la desnaturalizacioacuten de las proteiacutenas y por consiguiente la lisis celular (Brooks et
al1992)
Es importante considerar que cada microorganismo tiene una temperatura de desarrollo
adecuada a mayor temperatura se produce un incremento lineal de la velocidad de
crecimiento hasta alcanzar el clima perfecto a velocidad maacutexima Por encima de esta
temperatura oacuteptima la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte
celular (Atlas y Bartha 2002) En la tabla 3 se presentan algunas condiciones ambientales
para el desarrollo de los microorganismos
Antecedentes
33
Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales (Lu et al 2006 Madigan et al 2006 Falk et al 2009)
Factor Tipo de
microorganismo Caracteriacutesticas Microorganismo representativo
NaCI
Osmotolerante Capaz de crecer en un amplio rango de aw o
presioacuten osmoacutetica St aureus Saccharomyces rouxii
Haloacutefilo Requiere altas concentraciones de NaCl para
crecer normalmente por encima de 02 M Halobacterium Dunaliella Ectohiorhodospira
pH
Acidoacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 0 y 55 Sulfolobus Picrophilus Ferroplasma Acontium
Cyanidium caldarium
Neutroacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 55 y 80 Euglena Paramecium
Alcaloacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 85 y 1 15 Badilas alcalophilus NaIronobaciacuteerium
Temperatu
ra
Psicroacutefilo Crece bien a 0degC temperatura oacuteptima de 15degC
o inferior Badilas psychrophilus Chlamydomonas nivalis
Psicroacutetrofo Puede crecer a 0-7degC oacuteptima de 20 a 30degC Listeria monocytogenes
Mesoacutefilo Temperatura maacutexima de 35degC
Temperatura oacuteptima alrededor de 20-45degC
P fluorescens E coli Neisseria gonorrhoeae
Trichomonas vaginalis
Termoacutefilo Puede crecer a 55degC o superior temperatura
oacuteptima a menudo entre 55 y 65degC
Geobacillus stearothermophilus Thermus
aquaticus Cyanidium caldarium
Hipertermoacutefilo Temperatura oacuteptima entre 80 y 113degC Chaetomium thermophile Sulfolobus
Atmoacutesfera
Aerobio obligado Completamente dependiente del O2 para
crecer Pseudomonas Mycobacterium tuberculosis
Anaerobio
facultativo
No requiere O2 pero crece mejor en su
presencia
M luteus St aureus
Streptococcus pneumoniae L monocytogenes
Anaerobio
aerotolerante Crece bien en presencia o en ausencia de O2 Lactobacillus
Anaerobio
obligado No tolera el O2 y muere en su presencia Clostridium botulinum C perfringens
Microaeroacutefilo
Requiere nivel de O2 inferior a 2-10 para
crecer y es dantildeado por el O2 (20) C fetus
Antecedentes
34
D Control del crecimiento microbiano
Los microorganismos toleran determinados factores ambientales Asiacute unas bacterias
pueden tener condiciones para su desarrollo y estas condiciones pueden ser nocivas para una
especie bacteriana El crecimiento de una poblacioacuten microbiana se estudia analizando la curva
de crecimiento de un cultivo La curva del crecimiento microbiano representa la evolucioacuten del
nuacutemero de nuacutemero de ceacutelulas viables presente en un cultivo microbiano liacutequido a lo largo del
tiempo de estudio Se estudia el nuacutemero de ceacutelulas viables por mililitro de un cultivo de
volumen limitado y con una cantidad de nutrientes limitada como por ejemplo un medio de
cultivo liacutequido en un matraz que ha sido inoculado con una cantidad inicial de microorganismos
o inoacuteculo (Hunter-Cevera y Belt 1996) Para llevar a cabo estos estudios se distingue tres
niveles entre los modelos de microbiologiacutea predictiva los que describen los cambios en el
nuacutemero de microorganismos con respecto al tiempo con respecto al efecto de las condiciones
ambientales y los que combinan los dos aspectos anteriores (Larcher y Cattaneo 2006)
Se considera el crecimiento de las bacterias en funcioacuten de su fondo geneacutetico en relacioacuten
con los nutrientes y en unas hipoteacuteticas condiciones ideales (oacuteptimas) Sin embargo el trabajo
experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales es decir
una serie de agentes fiacutesicos y quiacutemicos El anaacutelisis de la curva de crecimiento bacteriano es
muy importante para determinar el potencial de una teacutecnica de control especiacutefica Al igual que
las bacterias los fagos al forman una interaccioacuten con su bacteria hueacutesped se necesita
determinar una cuantificacioacuten del nuacutemero de copias que se generan por la infeccioacuten a esta
condicioacuten se le conoce como fase de eclipse siendo el momento idoacuteneo para realizar la
infeccioacuten fago-bacteria (Lee et al 2016)
D1 Agentes fiacutesicos
La temperatura es uno de los paraacutemetros ambientales maacutes importantes que condicionan el
crecimiento y la supervivencia de los microorganismos La temperatura afecta a la velocidad
de crecimiento y por lo tanto al tiempo de generacioacuten Cada bacteria es diferente y esto se
puede observar en una curva de tasa de crecimiento en funcioacuten de la temperatura Si se suele
utilizar calor en combinacioacuten con otros agentes fiacutesicos (filtracioacuten presioacuten y radiacioacuten) Al
aplicar temperaturas altas se refleja desnaturalizacioacuten e inactivacioacuten de proteiacutenas enzimaacuteticas
esenciales colapsamiento de la membrana citoplaacutesmica y a veces lisis teacutermica de la bacteria
Antecedentes
35
esta condicioacuten se presenta raacutepidamente cuando se aplica presioacuten la cual se utiliza para
esterilizar objetos como lo demuestra el uso universal de la autoclave en todos los
laboratorios de microbiologiacutea (Madigan y Martinko 2006) El calor es auacuten uno de los meacutetodos
maacutes comunes para destruir microorganismos se puede aplicar huacutemedo o seco (Salgado-Nava
y Jimeacutenez-Munguiacutea 2012) Por otro lado ademaacutes de aplicar calor si a las bacterias se le
extrae el calor del medio de manera intensa recurrir a la congelacioacuten con fines de conservacioacuten
de microorganismos por largos periacuteodos si se realiza apropiadamente numerosos
laboratorios disponen de congeladores a -30 o -70degC para la conservacioacuten de colecciones de
cultivos microbianos (Shafiei et al 2014)
D2 Agentes quiacutemicos
Aunque los objetos se desinfectan a veces con agentes fiacutesicos tambieacuten las sustancias
quiacutemicas se utilizan con mucha frecuencia por ejemplo los quimioteraacutepicos son sustancias
con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostaacutetica) En estas sustancias se busca
que sea efectivo contra un amplio espectro de microorganismos Pero no existe (hasta estos
momentos) un solo agente capaz de inhibir a todos los microorganismos Por otro lado existen
quimioteraacutepicos de espectro estrecho pero muy selectivos contra ciertas bacterias que son
patoacutegenas importantes Muchos factores influyen en la eficacia de los desinfectantes hay que
considerar la cepa de microorganismos presentes la concentracioacuten y naturaleza del
desinfectante y la duracioacuten del tratamiento Asimismo es imprescindible que las superficies
sucias se limpien antes de aplicar un desinfectante El uso apropiado de los agentes quiacutemicos
es esencial para la seguridad en los laboratorios y hospitales estos mismos productos se
utilizan tambieacuten para evitar el crecimiento microbiano en los alimentos (Prescott et al 1999)
E Fagos
E1 Antecedentes
Los virus son agentes infecciosos submicroscoacutepicos que pueden replicarse
independientemente de los cromosomas de una ceacutelula pero no independientemente de ella
A fin de multiplicarse deben penetrar la ceacutelula donde puedan replicarse a la cual se le
denomina hueacutesped Presentan una forma infecciosa madura que es tiacutepicamente extracelular
Antecedentes
36
Pueden infectar a diferentes seres vivos por lo que existen virus de animales de plantas y
de forma particular los llamados virus bacterianos o fagos (Madigan y Martinko 2006)
Los bacterioacutefagos o fagos (del griego φαγετον paguumlento ldquoalimentoingestioacutenrdquo) son agentes
virales de las bacterias su descubrimiento se atribuye por un lado al bacterioacutelogo ingleacutes F
W Twort que en 1915 mencionoacute el aclaramiento de un cultivo soacutelido de Micrococcus
provocado por un agente desconocido Por otro lado en 1917 el francocanadiense F
dHerelle descubrioacute un grupo de entidades bioloacutegicas en medios de cultivo que se propagaban
a expensas de las bacterias a los cuales les denominoacute fagos y dentro de sus investigaciones
definioacute su potencial uso e importancia cliacutenica Esto se refuerza a partir de 1940 con el
desarrollo del microscopio electroacutenico con el que se demuestra la naturaleza viral de los fagos
y que la forma de estudiarlos es mediante procedimientos microbioloacutegicos convencionales
facilitando su manejo y estudio (Grabow 2001)
La uacuteltima variedad de fagos se descubrioacute durante la Primera Guerra Mundial los tipos ya
conocidos eran los virus que afectaban a vegetales y animales fue entonces que se pensoacute
en que su aplicacioacuten para eliminar bacterias podriacutea ser utilizada para la prevencioacuten y el
tratamiento de enfermedades bacterianas pero no resultoacute (Merril et al 1996) Sin embargo
los fagos resultaron tener otros beneficios especialmente como modelos o sustitutos de los
virus en humanos en la investigacioacuten geneacutetica baacutesica asiacute como en la evaluacioacuten de la calidad
del agua Ademaacutes demostraron ser una herramienta valiosa en la mayoriacutea de las
investigaciones sobre los virus ya que en comparacioacuten con los humanos animales vegetales
e incluso los insectos anfitriones de otros virus los fagos son faacutecil y raacutepidamente reproducibles
en el laboratorio y no son particularmente exigentes con respecto al espacio instalaciones y
equipos El trabajar con fagos requiere la separacioacuten y purificacioacuten y las dos principales tareas
para realizar esto es utilizar meacutetodos quiacutemicos en los cuales se utilizan solutos como buffer
glicerol bromuro de potasio cloruro de cesio y tartrato de potasio aunque el maacutes comuacuten es
la sacarosa ademaacutes involucra la precipitacioacuten con sulfato de amonio polietilenglicol o cloruro
de cesio y los meacutetodos fiacutesicos que implican la centrifugacioacuten a diferentes velocidades y
gradientes de densidad y con menor frecuencia la cromatografiacutea de particioacuten (Sambrook y
Russell 2001)
La investigacioacuten sobre las propiedades baacutesicas de los fagos se desarrolla en la biologiacutea
molecular que permitioacute avances sin precedentes en toda la biologiacutea y ciencias meacutedicas La
Antecedentes
37
concentracioacuten y purificacioacuten es un factor determinante para llevar a cabo la infeccioacuten
eficientemente sin embargo existe un periacuteodo de adaptacioacuten por parte de los fagos antes
que se desarrollen y se logren tiacutetulos apreciables en ceacutelulas cultivadas (Sambrook y Russell
2001 Breeuwer et al 2003)
E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos
Los virus son paraacutesitos intracelulares obligados no tienen metabolismo intriacutenseco y
requieren la maquinaria metaboacutelica codificada por los cromosomas de ceacutelula que puedan
infectar y reproducirse en ella denominada hueacutesped Su tamantildeo oscila entre 20 y 200 nm y
consiste de un nuacutecleo de aacutecido nucleico (ARN o ADN de cadena simple o doble) rodeado por
una cubierta proteica (caacutepside) y en algunos casos una cubierta de liacutepidos Los microbioacutelogos
que investigan la presencia de virus en haacutebitats marinos y han detectado su presencia creen
que son diez veces maacutes numerosos que las bacterias marinas En la superficie de los mares
se encuentran entre 106 y 109 partiacuteculas viacutericas por mililitro y se estima que en la capa
superficial (1 mm) de los oceacuteanos se encuentran unas 3 x 1030 partiacuteculas viacutericas (Grabow
2001 Atterbury et al 2003)
E3 Clasificacioacuten de los fagos
Las variaciones en los fagos se presentan en forma estructural como apeacutendices en la
cabeza cuello y las fibras de la cola o espigas ademaacutes del genoma que variacutea en cada orden
En 1962 Andreacute Lwoff junto a otros investigadores propuso una clasificacioacuten basada en la
morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico Los nombraron de la siguiente manera los urovirales
que presentaban cola pronunciada los inoviridae eran los filamentosos y los microviridae los
tipo φX Posteriormente Bradley (1967) consideroacute la morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico y
agrupoacute a los fagos en seis morfotipos baacutesicos denominados de la A a la F posteriormente se
clasifico en fagos baacutesicos los de cola los filamentosos y los icosaeacutedricos con ADN de cadena
sencilla o RNA de cadena simple Los fagos han sido investigados debido a su rol como
agentes de biocontrol para el desarrollo de la seguridad alimentaria En el presente varios
miles de fagos en contra de varios objetivos han sido aislados de varios entornos y alimentos
Aproximadamente el 96 de los fagos aislados eran con cola y del tipo liacuteticos en una de las
Antecedentes
38
tres familias Myoviridae (245) Siphoviridae (61) y Podoviridae (14) en el orden de los
caudovirales (Atterbury et al 2003 Oh y Park 2017)
En 1971 el Comiteacute Internacional de Taxonomiacutea de Virus (ICTV por sus siglas en ingleacutes)
clasificoacute en 6 geacuteneros de los cuales 5 corresponden a la clasificacioacuten propuesta por Bradley
los grupos T4 λ φX174 MS2 y fd Los fagos pueden tener cola larga y flexible no contraacutectil
(Siphoviridae) cola larga y contraacutectil (Myoviridae) o cola corta (Podoviridae) como se observa
en la tabla 4 Para la clasificacioacuten de los fagos se aplican propiedades como el rango de
hueacutespedes y las relaciones inmunoloacutegicas sin embargo las maacutes importantes son su
morfologiacutea y las caracteriacutesticas de su aacutecido nucleico el cual se adsorbe a componentes de la
superficie celular que actuacutean como receptores especiacuteficos La zona de adsorcioacuten del virus es
complementaria al receptor celular por lo tanto un determinado fago soacutelo puede infectar un
nuacutemero limitado de cepas celulares que contengan a un determinado receptor La naturaleza
de la zona de adsorcioacuten variacutea con el tipo de fago En el T4 se localiza en el extremo de la cola
en donde se encuentran la placa basal las espiacuteculas y las fibras de la cola Las formas maacutes
complejas corresponden a los fagos con colas contraacutectiles (Atterbury et al 2003)
Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos
(Ackermann 2003)
Antecedentes
39
E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico
La multiplicacioacuten de los fagos (figura 4) ADN produce la destruccioacuten de la ceacutelula hueacutesped
mediante lisis lo que provoca su liberacioacuten El ciclo vital de un fago que culmina con el
estallido de la ceacutelula hueacutesped y la liberacioacuten de viriones recibe el nombre de ciclo liacutetico Los
acontecimientos que tienen lugar durante el ciclo liacutetico se revisaraacuten en esta seccioacuten con
especial atencioacuten a los fagos T-par de E coli Estos son fagos de ADN bicatenario con colas
contraacutectiles complejas de la familia Myoviridae son algunos de los virus maacutes complejos
conocidos (Fernaacutendez 2008)
Figura 4 Adsorcioacuten del fago T4 e inyeccioacuten del ADN (Leverentz et al 2003)
Los fagos podriacutean infectar hasta un 70 de la poblacioacuten de procariotas marinos y ser
responsables de la tercera parte de la mortalidad bacteriana acuaacutetica Tambieacuten se han
detectado virus que infectan diatomeas y otras algas importantes del fitoplancton marino lo
cual es de gran transcendencia ecoloacutegica ya que la multiplicacioacuten de bacterias marinas
supera la capacidad de reproduccioacuten de los protozoos La lisis por virus de ceacutelulas procariotas
y de algas puede tambieacuten contribuir enormemente en los ciclos del carbono y nitroacutegeno en las
cadenas troacuteficas marinas incluso podriacutea reducir el nivel de productividad marina como la de
moluscos y peces (Muniesa et al 2005)
E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten
Los fagos no se unen al azar a la superficie de una ceacutelula hueacutesped por el contrario se fijan
a receptores especiacuteficos La naturaleza de estos receptores variacutea de acuerdo al fago pueden
Antecedentes
40
ser lipopolisacaacuteridos y proteiacutenas de la pared celular aacutecidos teicoicos flagelos y pili Los fagos
T-par de E coli en particular utilizan lipopolisacaacuteridos o proteiacutenas de la pared celular como
receptores Las variaciones en las propiedades del receptor son parcialmente responsables
de las preferencias del fagos por el hueacutesped (Muniesa et al 2005 Leeuw et al 2017)
La adsorcioacuten de fagos T-par estaacute relacionada con diversas estructuras del tallo La fijacioacuten
del fago comienza cuando una fibra del tallo establece contacto con los receptores adecuados
a medida que maacutes fibras contactan con los receptores la placa basal se asienta en la
superficie La unioacuten se debe probablemente a interacciones electrostaacuteticas y se ve influida por
el pH y por la presencia de iones como Mg+2 y Ca+2 Una vez que la placa basal estaacute
firmemente asentada en la superficie celular se producen cambios conformacionales en ella
y en la vaina del tallo Esta uacuteltima se reorganiza de tal forma que se contrae pasando de una
conformacioacuten en cilindro de 24 anillos a otra de 12 anillos de longitud maacutes corta y ancha es
entonces cuando el tubo central es empujado a traveacutes de la pared celular bacteriana
Finalmente el ADN es extruido de la cabeza pasa a traveacutes del tubo del tallo y penetra en la
ceacutelula hueacutesped Parece ser que el tubo interacciona con la membrana plasmaacutetica para formar
un poro a traveacutes del cual pasa el ADN los mecanismos de penetracioacuten de otros fagos difieren
a menudo de los fagos T-par aunque no se han estudiado en detalle (Leverentz et al 2003)
F Biofilm
Las bacterias existen en la naturaleza bajo dos formas o estados a) bacterias planctoacutenicas
de libre flotacioacuten y b) bacterias biofilm en colonias de microorganismos seacutesiles (Nazar 2007)
Un biofilm se define como una agrupacioacuten de comunidades seacutesiles microbianas que se fijan a
superficies las ceacutelulas estaacuten incrustadas en una matriz autoproducida que actuacutea como
proteccioacuten quiacutemica y mecaacutenica del entorno asiacute estas bacterias presentan mayor resistencia
a desinfectantes y el secado (Vestby et al 2009) Las bacterias pueden crear condiciones
para formar biofilms casi en cualquier ambiente liacutequido La interfase soacutelido-liacutequido entre una
superficie y un medio acuoso (vgr leche) proporciona un entorno ideal para la fijacioacuten y
crecimiento de microorganismos (Fakruddin et al 2014)
Antecedentes
41
G Microscopiacutea electroacutenica
Los microscopios electroacutenicos se usan habitualmente para el estudio detallado de
estructuras celulares (Bradley 1967) Para analizar las estructuras internas es esencial el
microscopio electroacutenico de transmisioacuten MET En el MET se utilizan electrones en lugar de rayo
de luz las lentes son electromagneacuteticas y se opera en todo momento a alto vaciacuteo
(Ackermann 2003) El poder de resolucioacuten del microscopio electroacutenico es mucho mayor que
el del microscopio oacuteptico incluso pueden observarse estructuras moleculares como proteiacutenas
y aacutecidos nucleicos Sin embargo los haces de electrones tienen escaso poder de penetracioacuten
y una ceacutelula aislada es demasiado gruesa para poder visualizarse directamente por este
motivo se emplean teacutecnicas especiales para la obtencioacuten de cortes ultrafinos a fin de poder
observar las muestras Una ceacutelula bacteriana por ejemplo se corta con una cuchilla especial
en varios cortes ultrafinos de 20-60 nm de espesor que son posteriormente examinados de
manera individual en el microscopio electroacutenico (Fuster-Valls et al 2008) Para obtener
suficiente contraste las preparaciones se tintildeen previamente mediante tratamiento con
compuestos como aacutecido oacutesmico permanganato sales de uranilo o de lantano o plomo Como
estas sustancias poseen aacutetomos pesados son capaces de desviar los electrones y aumentar
el contraste (Madigan y Martinko 2006)
La microscopiacutea electroacutenica es el mejor meacutetodo para estudiar la forma de las bacterias Los
virus bacterianos por tener un diaacutemetro menor de 1000 Aring estaacuten por debajo del liacutemite de
resolucioacuten del microscopio oacuteptico sin embargo es posible observarlos mediante el
microscopio electroacutenico porque eacuteste utiliza una radiacioacuten de longitud de onda maacutes corta que
permite aumentar 100 mil veces una resolucioacuten de 10 Aring (Kruger et al 2000 Ackermann
2003) Para observar detenidamente la morfologiacutea se requiere el microscopio electroacutenico con
especificaciones precisas como el de barrido lo cual es una herramienta indispensable en
biologia molecular (Guzmaacuten 2015)
Para la observacioacuten las partiacuteculas se suspenden en un medio volaacutetil por lo general una
solucioacuten de acetato de amonio y se colocan sobre una membrana sostenida por una rejilla
metaacutelica que praacutecticamente no absorbe electrones El problema teacutecnico maacutes frecuente es la
falta de contraste como la imagen obtenida es el resultado de la dispersioacuten de electrones por
los aacutetomos de la partiacutecula se necesita una diferencia apreciable de poder dispersivo entre las
partiacuteculas y el medio de soporte generalmente se emplean teacutecnicas tradicionales La maacutes
utilizada se conoce como tincioacuten negativa consiste en mezclar la suspensioacuten del fago con
Antecedentes
42
fosfovolframato de sodio o acetato de uranilo a pH neutro A este pH las sales no se combinan
con el fago al secarse forman una capa uniforme y opaca a los electrones en la cual los fagos
destacan como partiacuteculas maacutes claras Como las sales en solucioacuten penetran las irregularidades
en la superficie de la partiacutecula la micrografiacutea revela los detalles finos de los fagos (Fuster-
Valls et al 2008 Montantildeez et al 2012)
La forma del fago se establece de manera visual que es directa de la placa cuando las
UFP que se observan a simple vista como placas liacuteticas a contraluz (APHA 2005) Y para
estudiar la adhesioacuten y formacioacuten celular en diversas superficies se han desarrollado varias
teacutecnicas de microscopiacutea entre las cuales se distinguen la microscopiacutea electroacutenica de barrido
y de transmisioacuten asiacute como la microscopiacutea de epifluorescencia (Fuster-Valls et al 2008) la
cual se basa en los mismos principios de oacuteptica de la microscopiacutea comuacuten con diferencias en
el manejo y el disentildeo relacionadas con la generacioacuten y transmisioacuten de longitudes de onda
adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar ya sean propios de la muestra o de
la coloracioacuten utilizada (Franco 2005)
El fundamento de la teacutecnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o
compuestos fluorescentes denominados fluorocromos en fijarse a los anticuerpos mediante
un enlace quiacutemico estable que no puede romperse durante el curso de la reaccioacuten
inmunoloacutegica La espectroscopia de fluorescencia es la teacutecnica de deteccioacuten oacuteptica maacutes
sensible En el caso de la deteccioacuten en ceacutelulas se exponen a alta energiacutea utilizando laacutemparas
de xenon excitando por varios nanosegundos y asiacute emitiendo una longitud de onda de baja
energiacutea (Franz y Jendreizik 2015)
H Fagoterapia
Las enfermedades infecciosas estaacuten catalogadas entre las primeras causas de muerte en
el mundo y por lo tanto son consideradas un problema de salud puacuteblica Entre ellas las
infecciones bacterianas causan gran preocupacioacuten dado que las bacterias adquieren diacutea a
diacutea mayor resistencia a los antibioacuteticos esto ocurre por medio de diversos mecanismos
fisioloacutegicos y moleculares que les permiten a estos microorganismos adaptarse raacutepidamente
a condiciones adversas (Prada-Pentildearanda et al 2015)
El descubrimiento de los fagos por dacuteHerelle se desarrolloacute cuando eacuteste buscaba una
Antecedentes
43
vacuna que pudiera combatir la crisis de disenteriacutea hemorraacutegica que se presentoacute en 1915 en
las afueras de Francia dacuteHerelle observoacute que tras aislar lisados libres de bacterias de la
materia fecal de los enfermos las bacterias eran destruidas por un agente desconocido
invisible capaz de destruir cultivos de bacterias o producir pequentildeas aacutereas de color maacutes claro
cuando las bacterias eran crecidas en confluencia en placas de medio soacutelido y publicoacute sus
observaciones en el artiacuteculo titulado ldquoSobre un microbio invisible antagonista de los bacilos
de la disenteriacuteardquo (Szafranski et al 2017)
El uso de los fagos como agentes terapeacuteuticos comenzoacute hace maacutes de 80 antildeos Entre los
ejemplos maacutes destacados y recientes de la utilizacioacuten exitosa de la fagoterapia cabe citar el
uso de fagos especiacuteficos en el control bioloacutegico de E coli O157H7 productora de colitis
hemorraacutegica (en alimentos) Tambieacuten se ha estudiado el uso de fagos en el tratamiento de
infecciones peritoneales y otitis externa en la erradicacioacuten de P aeruginosa en pacientes con
fibrosis quiacutestica en el tratamiento de infecciones urinarias y osteomielitis por S aureus y en
la descolonizacioacuten intestinal para combatir las infecciones por Enterococcus faecium
resistente a vancomicina entre otros Los efectos favorables de la fagoterapia podriacutean
exceder incluso su actividad antibacteriana Hay datos sorprendentes acerca de la actividad
in vivo de los fagos el conocido fago T4 de E coli podriacutea inhibir la adsorcioacuten y la replicacioacuten
de adenovirus en sus ceacutelulas blanco y el fago Pf4 de P aeruginosa habriacutea sido capaz de
inhibir el desarrollo de cepas de Aspergillus por secuestro de hierro (Lopardo 2017)
El estudio y desarrollo de nuevos tratamientos alternativos es de particular intereacutes en la
lucha contra la resistencia bacteriana Los fagos presentan caracteriacutesticas que los hace una
excelente herramienta contra las bacterias patoacutegenas debido a su especificidad y seguridad
ecoloacutegica Los fagos no solo son atractivos desde un punto de vista cliacutenico Se han utilizaacutedo
como potenciales aplicaciones en otras aacutereas como la agricultura el control de alimentos o
la industria como a continuacioacuten se describe en la siguiente tabla 5 Los fagos son una
solucioacuten ecoloacutegica ubicua para desarrollar nuevos tratamientos contra las bacterias aunque
se deben realizar maacutes estudios para comprender mejor la relacioacuten entre ellos y las bacterias
antes de su aplicacioacuten (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)
Antecedentes
44
Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos la naturaleza lugares
urbanizados y cuerpo humano (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)
Fuente Sitio encontrado
Naturaleza
Suelo y superficie terrestre
Agua continental y oceaacutenica
Ambientes extremos hielo marino pared de
algas zonas hipersalinas etc
Lugares artificiales
Hospitales y zonas similares
Planta de tratamiento de aguas negras
Algunas zonas bajo el impacto humano
Cuerpo de animales
Tracto digestivo y vagina
Tracto respiratorio y oral
Piel y epitelio mucoso
Los productos comerciales para terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones
Los fagos se pueden distribuir liofilizados y se disuelven antes de la administracioacuten por viacutea
intravenosa en un soporte adecuado como por ejemplo una solucioacuten acuosa o tampoacuten o
suspenderse en cualquier liacutequido adecuado coloidal o de la matriz de poliacutemeros para crear
bactericidas el principio activo se puede administrar de una manera conveniente como por
inyeccioacuten (subcutaacutenea intravenosa administracioacuten etc) por viacutea oral pulmonar (por ejemplo
aerosoles o por otros dispositivos a los pulmones) spray nasal intramuscular intraperitoneal
intrahecal intraviacutetrea vaginal rectal la puncioacuten lumbar y la aplicacioacuten directa Dependiendo
de la viacutea de administracioacuten el principio activo puede estar recubierto de un material que
preserve la sustancia de la accioacuten de enzimas aacutecidos y otras condiciones naturales que
pueden inactivar la sustancia (por ejemplo comprimidos recubiertos enteacutericos o pastillas)
Empresas dedicadas a la biotecnologiacutea se dedicaron a desarrollar productos utilizando fagos
especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan ETA la Food and Drug Administration de
los EE UU (FDA) incluye a los fagos en la categoriacutea de aditivos alimentarios la FDA ha
publicado la aprobacioacuten de seis fagos para usar en alimentos listos para comer (ready to eat)
efectivos para L monocytogenes de la compantildeiacutea Intralytix La compantildeiacutea Omnilytics ofrece
productos de control bacterial para varias aacutereas como son agricultura agua y alimentos
industrias que se pueden observar en su paacutegina web (httpswwwomnilyticscom) y otras
empresas como Biophage Pharma Inc (Canada) Exponential Biotherapies (EE UU)
(Segundo 2010)
Antecedentes
45
Estas nuevas estrategias de intervencioacuten eco-amigable son requeridas como agente de
biocontrol en contra de Salmonella Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos
antildeos debido a sus caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutef ico sin
dantildear la micro-flora en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros
distribucioacuten de esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla
algunos ejemplos de la aplicacioacuten de los fagos son los descritos en la siguiente tabla 6 (Oh y
Park 2017)
Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria (Oh y
Park 2017)
Compantildeiacutea Producto del fago Organismo hueacutesped
FINK TEC GmbH (Alemania) Secure Shield E1 E coli
Intralytix Inc
(EE UU)
Ecolicidereg (EcolicidePXtrade) E coli O157H7
EcoShieldtrade E coli O157H7
ListShieldtrade L monocytogenes
SalmoFreshtrade Salmonella spp
ShigaShieldtrade
(ShigActivetrade) Shigella spp
Micreos Food Safety
(Holanda)
PhageGuard Listextrade L monocytogenes
PhageGuard Strade Salmonella spp
E coli O157H7
Passport Food Safety Solutions
(EE UU) Finalysereg E coli O157H7
Phagelux (China)
AgriPhag
Xanthomonas campestris pv
vesicatoria Pseudomonas
syringae
pv tomato
SalmoProreg Salmonella spp
Salmonella spp
Antecedentes
46
47
III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO
48
Objetivos y plan de trabajo
49
A Objetivo general
El objetivo general de este estudio es aislar y caracterizar fagos frente Salmonella spp a
partir de diversas fuentes ambientales para su uso potencial en el control bioloacutegico
El control de Salmonella spp es de gran intereacutes para la industria alimentaria por lo que
encontrar alternativas para su eliminacioacuten es de gran impacto en la salud puacuteblica
B Objetivos especiacuteficos
1- Aislar fagos de Salmonella proveniente de muestras de aguas residuales de la ZMM y
muestras de lavado de carne pollo de un establecimiento donde se comercializa esta carne
2- Caracterizar parcialmente los fagos aislados en base a su morfologiacutea por TEM y el
anaacutelisis de sensibilidad frente a diversas cepas bacterianas
3- Estudiar el efecto de los fagos previamente aislados desarrollando un biofilm de
Salmonella spp sobre discos de acero inoxidable utilizando la DEM
C Plan de trabajo
Para alcanzar los objetivos establecidos se considera la ubicacioacuten de las fuentes para la
obtencioacuten de los fagos en este caso el medio seleccionado son riacuteos arroyos asiacute como un
establecimiento donde se procesan canales de pollo en la ZMM y las lagunas de oxidacioacuten
de aguas residuales en Mariacuten ambas localidades en Nuevo Leoacuten Meacutexico
Posteriormentese utilizaraacute la teacutecnica ADC y se verificaraacute en cual de estas muestras se
podriacutean encontrar fagos que sean liacuteticos para Salmonella enterica y posteriormente se
realizaraacuten pruebas de selectividad con la meta de caracterizar los fagos aislados frente a
diferentes hueacutesped (cepas de Salmonella spp y de E coli) y la observacioacuten de la morfologiacutea
se realizaraacute por el TEM
Salmonella spp presenta un periacuteodo de incubacioacuten por lo general entre 12 y 36 horas
tras el cual el derarrollo bacteriano en las superficies puede dar como resultado la formacioacuten
de un biofilm Para este estudio se desarrollaraacute un biofilm de Salmonella spp sobre discos
de acero inoxidable en condiciones de humedad esto es importante por la fase de eclipse
Objetivos y plan de trabajo
50
(momento en el cual atacan y se desarrollan los fagos) Se probaraacuten 3 concentraciones de
fago 6 7 y 8 UFPmL Se realizaraacuten recuentos durante un periacuteodo de incubacioacuten de 72 h
Con el fin de conseguir estos objetivos el presente trabajo se ha estructurado en tres
secciones las cuales se pueden observar en la figura 5 incluyendo las pruebas con DEM
en los discos de acero inoxidable
Figura 5 Diagrama general de trabajo
51
IV MATERIALES Y MEacuteTODOS
52
Materiales y meacutetodos
53
A Toma de muestras
Las muestras para obtencioacuten de fagos se recolectaron en diez sitios del aacuterea metropolitana
de Monterrey y del municipio de Mariacuten Nuevo Leoacuten (tabla 7) El meacutetodo que se utilizoacute para
aislar fagos de diversas fuentes medio ambientales y su posterior traslado al laboratorio fue
el descrito por Higgins et al (2005) Se obtuvieron las muestras provenientes de aguas
residuales y riacuteos se emplearon frascos de 450 mL previamente lavados y secos que
posteriormente se impregnaron con una solucioacuten de tiosulfato de sodio (Na2S2O3bull5H2O) al
10 (pv) (Sigma-Aldrich EE UU) y se esterilizaron en autoclave 121ordmC15min Al momento
de hacer la recoleccioacuten en campo los frascos fueron abiertos cuidadosamente y se llenaron
con el liacutequido se almacenaron en hieleras para su traslado al laboratorio el tiempo que
transcurrioacute desde la toma de la muestra hasta la llegada al laboratorio fue entre 1 y 3 h
posteriormente las muestras se centrifugaron el mismo diacutea y los sobrenadantes se
almacenaron 4oC hasta su uso (Vidales-Contreras et al 2006)
A cada una de las muestras obtenidas en el muestreo se le agregoacute 25 de cloroformo
(grado de reactivo 995 Sigma-Aldrich EE UU) para conservarlas en condiciones oacuteptimas
para su posterior llegar al laboratorio se mantuvieron a 4degC durante toda la noche para
permitir que el material grueso decante Mientras tanto en lo referente a las muestras
obtenidas de aguas provenientes de los establecimientos expendedores de pollos las
muestras se trataron igual pero como el sobrenadante contiene grasa se optoacute por filtrar y
posteriormente se realizoacute el mismo procedimiento antes descrito
Materiales y meacutetodos
54
Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos
B Obtencioacuten de fagos
Para aislar los fagos se utilizoacute la teacutecnica descrita por Sambrook y Russell (2001) la cual se
describe a continuacioacuten En un tubo de ensayo (16150 mm Fisherbrand EE UU)
conteniendo 45 mL de agar suave (AS) (Bioxon Meacutexico) mantenieacutendose a temperatura de
40C (en una cuba hidroneumaacutetica con agua) se colocaron 500 L de un cultivo de S
Enteritidis (provenientes del cepario del CINSP) en fase logariacutetmica y se agregaron 300 L
de las muestras recolectadas en las que se presume conteniacutean los fagos especiacuteficos para
esta cepa Se agitoacute el tubo de ensayo mezclando con movimientos circulares suaves para
evitar la formacioacuten de burbujas este procedimiento se realizoacute aproximadamente por 5
segundos El contenido se vertioacute uniformemente sobre una caja de Petri (10015 mm
Fisherbrand EE UU) conteniendo agar soya tripticasa (AST) (Bioxon Meacutexico) y se dejoacute a
temperatura ambiente hasta solidificar la ADC Se incuboacute a 37C por 24h Al momento de
observar el desarrollo de las placas de lisis (calvas) se procedioacute al aislamiento de los fagos
Su cuantificacioacuten se realizoacute de manera directa e inmediata ya que las calvas son visibles con
una iluminacioacuten de contraste (Breeuwer et al 2003) Posteriormente los fagos que si formaron
halos de inhibicioacuten fueron aislados de manera directa o siguiendo uno de los dos protocolos
(enriquecimiento y sin enriquecer) debido a que depende principalmente de la amplificacioacuten
del fago y las caracteriacutesticas de cada uno se describen a continuacioacuten
Municipio Sitio de la toma
Monterrey
Parque Fundidora
Riacuteo Santa Catarina
Establecimiento de comida
Av Conductores
Mariacuten Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal
Riacuteo La Libertad
Guadalupe Alcantarillas de la colonia La Azteca
Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados
San Nicolaacutes de los Garza Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac
Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea
Materiales y meacutetodos
55
B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos
Con el protocolo de enriquecimiento se proporcionoacute las condiciones oacuteptimas de desarrollo
al cultivo de la bacteria hueacutesped y la muestra al inocular el cultivo en la muestra y de esta
manera amplificar los posibles fagos que presentes en la muestra de agua
Se realizoacute este protocolo de la siguiente manera primero se seleccionoacute la cepa bacteriana
que seraacute el hueacutesped esto se consiguioacute haciendo un cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y
se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por otra parte se prepararon
aliacutecuotas (10 mL cada una) de cada una de las muestras recolectadas (enriquecidas con
cultivo bacteriano) y se centrifugan a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a
4degC despueacutes el sobrenadante se pasoacute por jeringa y con filtros de 022 microm (Millex-GP
polyethersulfone 33 mm radio-sterilized) Estas dos entidades biloacutegicas se unieron en un
matraz de capacidad de 50 mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon
Meacutexico) a doble concentracioacuten (20) En este matraz se agregaron 300 microL de la muestra
previamente filtrada con fagos y 500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incuboacute a 37degC por
24 h posteriormente por medio de la teacutecnica de ADC se pudo observar la formacioacuten de halos
de lisis de los fagos (Vidales-Contreras et al 2006)
B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos
El protocolo se emplea para adicionar directamente de la muestra una aliacutecuota y testarla
con la bacteria hueacutesped Se siguieron los pasos anteriormente descritos a este protocolo
primero se seleccionoacute la cepa bacteriana (hueacutesped) esto se realizoacute haciendo un cultivo fresco
(AST) (Bioxon Meacutexico) y se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por
otra parte se preparoacute aliacutecuotas (10 mL) de cada una de las muestras recolectadas y se
centrifugaron a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a 4degC despueacutes el
sobrenadante se pasoacute por jeringa con filtros de 022 microm (Millex-GP polyethersulfone 33 mm
radio-sterilized) Estas dos entidades bioloacutegicas se unieron en un matraz de capacidad de 50
mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon Meacutexico) a doble
concentracioacuten (20) A este matraz se agregaron 300 microL de la muestra filtrada con fagos y
500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incubaron a 37degC por 24h posteriormente por medio
de la teacutecnica de ADC se observaron la formacioacuten de halos de lisis de los fagos (Vidales-
Materiales y meacutetodos
56
Contreras et al 2006)
B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas
Despueacutes de que los cultivos bacterianos se reactivaron la preparacioacuten para trabajar con
ellos fue la siguiente se tomoacute una asada de una colonia bacteriana bien diferenciada y se
incuboacute en un tubo inclinado (punta de flauta) se dejoacute el cultivo toda la noche y posteriormente
se traspasoacute a un subcultivo en caldo con infusioacuten cerebro-corazoacuten (BHI Merck Alemania) e
incuboacute a 37degC durante 24 h posteriormente se subcultivoacute en BHI en las mismas condiciones
Una colonia aislada en tubo punta de flauta se inoculoacute en 9 mL de agua peptonada (3M
Meacutexico) y se incuboacute a 37degC durante 24 h luego se realizaron mezclas seriadas en diluyente
(1 gL triptona 85 gL NaCl pH 72) (Merck Alemania) y se implantaron en las superficies de
los discos de acero inoxidable tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm con
un volumen inferior a 50 microL Como control del inoacuteculo se prepararon 5 placas de TSA
En el caso del fago obtenido se amplificoacute realizando la infeccioacuten en repetidas ocasiones
hasta alcanzar una concentracioacuten de 1x107 UFPmL
B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos
Para la realizacioacuten de este estudio se utilizaron cepas bacterianas de Salmonella enterica
y E coli provenientes de diversas colecciones de los laboratorios involucrados tambieacuten se
utilizoacute un fago de prueba (PRD1) para ser utilizado como control positivo en los aislamientos
En la tabla 8 se muestran las bacterias y el fago indicando su denominacioacuten y origen asiacute como
las condiciones de conservacioacuten
Materiales y meacutetodos
57
Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten
Origen Cepa bacteriana fagos Clave Condiciones de conservacioacuten
FaSPyN
S Typhimurium ATCC 13311
Glicerol a -20degC S Paratyphi ATCC 9150
S Enteritidis ATCC 13076
FCB S Typhi ATCC 19430 BGA TSA 4degC
FAUANL
S Typhimurium TSA 4degC
Fago PRD1
Tampoacuten fosfato 4degC
E coli CECT 515
E coli K12
E coli ATCC 10536
E coli O157H7 CECT 4783
S bongori ATCC 43975
UAB
S enterica LT2
Vial liofilizado a -20degC
S enterica sub enterica CECT 4138
S enterica sub enterica CECT 4594
S enterica sub enterica CECT409
S enterica sub enterica CECT 698
S Typhimurium CCUG 29478
Para la reactivacioacuten de los cultivos que se almacenan a 4degC se dejaron a temperatura
ambiente igualmente para los congelados Posteriormente para sacarlos del estreacutes se
sembraron en medio de cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y se incubaron a 37degC por 24
horas tras estas condiciones ya se pudieron utilizar en los ensayos (McLaughlin et al 2006)
A continuacioacuten se describe la forma en que se reactivaron los cultivos en este estudio de
acuerdo a la forma en que estaban almacenados
a) Cultivos almacenados en glicerol
Se descongelaron los viales a temperatura ambiente
Materiales y meacutetodos
58
Se transfirieron 5 microL de cultivo en 20 mL de TSB (Becton Dickinson Co) y se incuboacute a
37degC toda la noche
Se sembroacute en tres campos en caja de Petri de 90 mm con TSA (Becton Dickinson Co)
Se incuboacute a 37degC por 24h
Se seleccionoacute una colonia aislada y bien diferenciada
El cultivo (colonia) se incuboacute en 20 mL de TSB a 37degC toda la noche
b) En caso de los cultivos liofilizados
En el vial se hidrataron los cultivos agregando 1 mL de TSB e incubando 1h a 37degC
Se vertioacute el cultivo en 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC toda la noche
Se realizoacute el mismo proceso anteriormente mencionado en a)
B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC)
La siembra o inoculacioacuten consistioacute en introducir artificialmente una porcioacuten de muestra
(inoacuteculo) en un medio adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano para su desarrollo
y multiplicacioacuten Una vez inoculado el medio se incuboacute a una temperatura adecuada para el
oacuteptimo crecimiento en promedio 37degC Los meacutetodos de conteo en placa como capa doble y
capa simple de agar se basan en la determinacioacuten de la concentracioacuten viral mediante el
conteo de UFP las cuales son zonas de aclaramiento circular o halo de inhibicioacuten de
crecimiento bacteriano que se producen en la capa o ceacutesped bacteriano debido a la lisis
producida por los fagos Inicialmente una partiacutecula de fago infecta a su bacteria hueacutesped se
replica y posteriormente se disemina generando una zona circular sin crecimiento de la
bacteria (Solano et al 2012) Por esta razoacuten en nuestro estudio se utilizoacute esta manera de
trabajar considerando las diferentes formas que se puede presentar los halos de inhibicioacuten
(forma tamantildeo densidad)
La teacutecnica se basoacute en mezclar el cultivo bacteriano en fase logariacutetmica y el fago en agar
suave (AS) tambieacuten llamado top agar cuando se aplica a la placa de Petri donde se realizoacute
el proceso de infeccioacuten El AS se preparoacute con TSB y agar bacterioloacutegico (15) para obtener
una consistencia semisoacutelida que permita el desarrollo de las calvas en el ceacutesped bacteriano
Se mantuvo a una temperatura adecuada para conservar el estado liacutequido y se agitoacute
cuidadosamente para dejar interactuar los cultivos fago-hueacutesped en el tubo de ensayo
Materiales y meacutetodos
59
posteriormente se dispersoacute de manera uniforme en placas de Petri de 90 mm de diaacutemetro con
15 mL de TSA La suspensioacuten (ceacutesped bacteriano en ADC) se dejoacute solidificar a temperatura
ambiente unos minutos y posteriormente se incuboacute 24h37degC (Vidales-Contreras et al 2006)
B6 Modelo de infeccioacuten
Las enzimas endolisinas de los fagos provocan la lisis debilitamiento y rompimiento de la
pared celular de las bacterias La lisis depende de la proporcioacuten de fagos y hueacutesped o
multiplicidad de infeccioacuten (Multiplicity of infection MOI) Cuando hay una MOI baja la relacioacuten
de fagos a bacterias no es superior a 21 Cuando la MOI es alta es decir muchos fagos frente
a pocas bacterias las ceacutelulas se lisan directamente (Dimmock et al 2007)
En ese sentido la Norma ISO 10705-11995 indica que durante el ensayo el fago en fase
de multiplicacioacuten experimenta varios ciclos de replicacioacuten lo que resulta en la muerte de la
ceacutelula hueacutesped que ha actuado como faacutebrica para la produccioacuten viral El modelo que se siguioacute
es para observar los halos de inhibicioacuten y contrastar los resultados En la figura 6 se presenta
el modelo de infeccioacuten utilizado con S Typhimurium y el fago PRD1 siguiendo el modelo de
Vidales-Contreras et al (2006) y la puesta a punto propuetas por Sambrook y Russell (2001)
Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten fago-hueacutesped
Materiales y meacutetodos
60
B7 Controles utilizados durante los ensayos
Se utilizoacute la cepa de S Typhimurium y el fago PRD1 como control positivo para observar
la formacioacuten de las calvas para el control negativo se utilizoacute agua esterilizada con esto se
asegurar que si existe infeccioacuten y evitar los falsos positivos que ocurren primordialmente por
contaminacioacuten
Para control negativo el ceacutesped bacteriano se obtuvo de la siguiente manera en un
tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de cultivo de S
Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de agua destilada esteacuteril la mezcla se vertioacute
en placa Petri con TSA
Como control positivo el ceacutesped bacteriano y las placas de lisis se obtuvieron como
sigue en un tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de
cultivo de S Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de fagos PRD1 la mezcla se
vertioacute en placa Petri con TSA
B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium
Para realizar los ensayos microbioloacutegicos se requirioacute trabajar con la misma cantidad de
biomasa en una fase de crecimiento similar El conteo en placa es un meacutetodo de medicioacuten de
biomasa que permite el recuento de ceacutelulas viables y consiste en determinar el nuacutemero de
ceacutelulas capaces de reproducirse y generar colonias sobre un medio soacutelido (cada ceacutelula viable
da origen a una colonia) Para este estudio y ver el efecto de los fagos sobre las bacterias
primeramente se calculoacute la curva de crecimiento celular pues es imprescindible para realizar
la infeccioacuten que la bacteria hueacutesped y se encuentre en fase logariacutetmica Es decir para
determinar la biomasa bacteriana se mide la cineacutetica de crecimiento celular y se considera
que se ha alcanzado la fase de crecimiento exponencial cuando la concentracioacuten es de 10⁸
UFCmL (McLaughlin et al 2006)
Para el conteo bacteriano se utilizoacute el meacutetodo de filtracioacuten por membrana
Se transfirioacute 1 mL del cultivo bacteriano fresco a 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC
Cada 30 minutos se recolectaron 300 microL de cultivo
A cada aliacutecuota recogida se le realizaron diluciones seriadas con 27 mL de agua
Materiales y meacutetodos
61
destilada esteacuteril hasta obtener un factor de 1010
De cada una de estas diluciones se obtuvieron 100 microL que se filtraron por membrana
de celulosa 045 microm (Millipore Corporation Billerica Ma 47 mm esteacuteril Cat No
JMX000089 Millipore) montada en un embudo de filtracioacuten magneacutetico de 47 mm (Pall
GELMAN Laboratory con capacidad de 300 mL) y con bomba de vaciacuteo (GM motors amp
industrial systems Modelo 5kh36kna510x)
Las membranas se colocaron en caja de Petri con TSA y se incubaron 24h a 37degC
C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos
Con excepcioacuten de la microscopiacutea electroacutenica los meacutetodos empleados para determinar el
tamantildeo forma y composicioacuten quiacutemica de los fago requieren una alta pureza de las partiacuteculas
virales El material de partida en cualquier estudio de este tipo para la obtencioacuten del fago es
cuando se presenten los halos de inhibicioacuten en el ADC en general ademaacutes de los fagos
estas zonas claras pueden contener los restos celulares de las bacterias como trozos de
pared membranas ribosomas ADN ARN proteiacutenas y otros componentes de peso molecular
maacutes bajo El contenido de fago en un lisado es del orden de 001 mg mL por lo que para
obtener la cantidad apropiada para su caracterizacioacuten es necesario partir de varios litros
(Leverentz et al 2003 Maestro y Sanz 2016)
Para llevar a cabo la purificacioacuten de los fagos se debe de realizar con concentraciones
superiores a 1010 UFPmL Uno de los meacutetodos maacutes utilizados es la centrifugacioacuten a alta
velocidad y posterior resuspensioacuten de las partiacuteculas sedimentadas en un volumen menor
Cuando es posible esta teacutecnica se reemplaza por un sistema de dos fases basado en la
propiedad que tienen algunos poliacutemeros de alto peso molecular como el polietilenglicol el
dextrasulfato de sodio y el dextrano al separarse estas fases por diferencia de pesos
moleculares los fagos se dispersan en este tipo de medios considerando las concentraciones
empleadas y las condiciones oacuteptimas de pH fuerza ioacutenica y temperatura y al pasar por el
proceso de centrifugacioacuten se concentran en una columna Una vez concentrado el fago en la
columna se puede recuperar faacutecilmente de la interfase Los procesos maacutes comuacutenmente
utilizados para la purificacioacuten posterior se basan en separar las partiacuteculas de fago ya sea por
su tamantildeo o densidad (Sambrook y Russell 2001 Vidales-Contreras et al 2006)
En la figura 7 se presenta el procedimiento para la amplificacioacuten de fagos que nos asegura
Materiales y meacutetodos
62
cultivos puros uniformes y con tiacutetulos altos lo cual es imprescindible para conseguir una
buena imagen en el microscopio electroacutenico
Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten de bacteriofagos aplicando la teacutecnica
de agar doble capa (ADC)
El meacutetodo utilizado para purificar los fagos que despueacutes de utilizaron para analizar su
morfologiacutea implicoacute el uso del kit Montage SEQ96 (Millipore Sequencing Reaction Cleanup Kit
Millipore Corporation EE UU)
En una placa de filtracioacuten (96 well SEQ plate by Millipore) se depositaron en cada
pocillo 15 microL de concentrado de fagos maacutes 5 microL de agua milli-Q (Injection Solution by
Millipore)
Materiales y meacutetodos
63
La separacioacuten se realizoacute por la exclusioacuten de lavados de la columna de gel aplicando
vaciacuteo por medio de una bomba (Millipore EE UU Vacuumpressure 220 V50 Hz 15 mm
Hg)
Posteriormente se resuspendioacute la muestra (Thermomixer comfort by Eppendorf) con
agitacioacuten durante 1 min a 500 rpm
Finalmente se agregoacute 10 microL de agua ultra pura Milli-Q para concentrar la muestra
(Injection Solution by Millipore)
Una de las modificaciones que se realizaron para obtener los fagos con elevada pureza y
concentracioacuten para ser utilizada en la microscopiacutea electroacutenica se realizoacute con el kit Montage
SEQ96 que se utiliza para la purificacioacuten de DNA y en este caso se utilizoacute para concentrar los
fagos (concentracioacuten 1012 UFPmL) El procedimiento se describe a continuacioacuten
Se antildeadieron 20 microL de buffer de inyeccioacuten a la placa donde se teniacutea la suspensioacuten de
fagos se resuspendioacute y transfirioacute todo el volumen a la placa azul de Millipore (kit Montage)
Se colocoacute la placa en la bomba del kit Montage de 2 a 3 min hasta que quedoacute seca
Es aconsejable no dejar maacutes tiempo del necesario para evitar un secado excesivo
Se limpioacute todo el exceso de liacutequido en la placa con papel filtro secando un par de
veces la placa sobre el papel Inmediatamente despueacutes se colocoacute la placa sobre el soporte
de la bomba evitando dejarla sobre el papel
Se antildeadieron 30 microL de buffer de inyeccioacuten
Se colocoacute la placa en la bomba unos 4-5 min hasta secarse
Con papel filtro se limpioacute todo el exceso de liacutequido que quedoacute en la placa y se colocoacute
en el soporte de la bomba
Se antildeadieron 30 microL maacutes de buffer de inyeccioacuten para resuspender
Se colocoacute la placa en agitacioacuten se centrifugoacute a 500 g por 10 min
Se traspasaron los 30 microL a un nuevo pocillo y se recolectoacute el sobrenadante
D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica
Con la concentracioacuten de fagos purificados se preparoacute la muestra para la observacioacuten al
microscopio electroacutenico y se procedioacute utilizando la teacutecnica de tincioacuten negativa tal como se
explica a continuacioacuten
Se depositaron 2 microL de suspensioacuten de fagos en un disco de capa fina de carbono y cobre
Materiales y meacutetodos
64
(200 Mesh Holes 100 microm square Ethene old 200 RU) despueacutes de 2 min de reposo a
temperatura ambiente se eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente Se antildeadieron 2
microL de agente de contraste solucioacuten tampoacuten 1 de acetato de uranilo (UO2middot (CH3COO)2middot2H2O)
(Merck Alemania) Se dejoacute actuar el colorante durante 2 min a temperatura ambiente y se
eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente y despueacutes se dejoacute el disco alrededor de 5
min a temperatura ambiente antes de observar en el microscopio
D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa
(DEM)
La microscopiacutea oacuteptica es el meacutetodo adecuado para la investigacioacuten de procesos celulares
ya que es menos agresivo para el manejo de la muestra Existen teacutecnicas de microscopiacutea con
otras especificaciones donde se aplican para estudiar la adhesioacuten celular y formacioacuten de
biofilms en superficies tales como el espectrofotoacutemetro infrarrojo transformada de Fourier el
laacuteser confocal de barrido y la microscopiacutea de fuerza atoacutemica estos microscopios se
caracterizada por detectar las ceacutelulas viables de las dantildeadas por medio de cromoacuteforos
(Montantildeez et al 2012) La microscopiacutea que estamos trabajando esta basada en fluorescencia
la cual utiliza cromoacuteforos para detectar DNA de ceacutelulas vivas (coloracioacuten verde) y ceacutelulas
muertas (coloracioacuten roja) y ha tenido grandes avances en la observacioacuten de tejidos ceacutelulas
moleacuteculas individuales y por consiguiente algunos restos celulares todos estos con una
excelente resolucioacuten (Pellegrotti et al 2014)
Para la observacioacuten de ceacutelulas mediante el DEM se utilizoacute el kit comercial de viabilidad Bac
Light (LIVEDEAD Bacterial Viability Kit L-13152 Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE
UU) que estaacute compuesto por dos colorantes fluorescentes de aacutecidos nucleicos (SYTOreg9 y
PISYTOreg9) que penetran tanto en las membranas intactas como en las lesionadas lo que
permite evaluar la vitalidad de las ceacutelulas bacterianas basaacutendose en la deteccioacuten de la
actividad de las oxidasas y reductasas bacterianas Se observa una sentildeal fluorescente
mejorada en ceacutelulas bacterianas con procesos metaboacutelicos activos En contraste PISYTOreg9
se manifiesta soacutelo en las ceacutelulas que presentan membranas lesionadas y desplaza el colorante
SYTOreg9 por la transferencia de energiacutea de la resonancia fluorescente Cuando se aplican
estos dos colorantes en proporcioacuten adecuada las ceacutelulas viables con membranas intactas
presentaraacuten fluorescencia verde y en contraste las ceacutelulas muertas o lesionadas tendraacuten
Materiales y meacutetodos
65
coloracioacuten roja (Berney et al 2007)
A continuacioacuten se describe la preparacioacuten de las muestras para ser observadas por el DEM
Se colocaron 2 microL de la concentracioacuten suspensioacuten de la muestra con fagos en una
concentracioacuten de 1x1012 UFCmL sobre un disco de acero inoxidable (tipo 14301 (2 cm de
diaacutemetro y 1 mm de grosor) ligeramente convexos con una altura maacutexima en el centro
de 1 mm
Se dejoacute secar a temperatura ambiente por espacio de 10 min
Posteriormente se aplicaron 2 microL de la solucioacuten vital de fluorescencia (LIVEDEAD Bac
Light Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE UU) que reacciona y da la coloracioacuten
al material geneacutetico de las bacterias
Para la observacioacuten de los discos se utilizoacute el microscopio de fluorescencia Olympus
BX51BX52 (Tokio Japoacuten) con caacutemara digital incorporada (DP 50 Olympus) equipado con
laacutempara de mercurio de 100 W (USH-103 OL Olympus) con filtro de doble paso (U-M51004
FR V2 Olympus)
Para enumerar las ceacutelulas bacterianas en el biofilm que se formo en los discos de
acero inoxidable se trabajoacute con un objetivo de 20X y se ubicaban 10 campos
aleatoriamente y los resultados se expresaron por cm2 Las imaacutegenes se revisaron con el
sistema de anaacutelisis de imagen (anaacutelisis 32 soft Imaging System GMBH Alemania)
El biofilm bacteriano se desarrolloacute en la superficie de discos de acero inoxidable tipo
14301 Antes de usarse deben limpiarse bien por inmersioacuten en una solucioacuten acuosa de
detergente (DINO-dis-Dipol Espantildea) al 5 en agua durante 1 h despueacutes se realizoacute la
inmersioacuten en bantildeo con alcohol isopropiacutelico (2-propanol) (Merck Alemania) al 70 en agua
durante 15 min Una vez secos se esterilizaron en autoclave a 121degC por 15 min
D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM
Se inocularon la superficie de los discos con 50 microL de cultivo de S enterica maacutes medio de
cultivo (TSB) para proporcionar en medio rico para que se forme el biofilm posteriormente se
colocaron en cajas de Petri esteacuteriles y se mantuvieron en condiciones de humedad a
temperatura ambiente durante periacuteodos de 24 48 y 72h realizaacutendoles el conteo
correspondiente para verificar el desarrollo del biofilm
Materiales y meacutetodos
66
Una vez formado el biofilm se inocularon los discos con 3 concentraciones diferentes de
fagos 6 7 y 8 logcm2 en un volumen inferior a 50 microL Las diluciones del fago se hicieron en
solucioacuten salina fisioloacutegica (SSF cloruro de sodio 080) (Merck Alemania) Se realizoacute la
infeccioacuten al inocular a los discos prueba y los discos de control con el mismo volumen de SSF
las condiciones de incubacioacuten se realizaron con humedad y a temperatura ambiente
Los discos de acero inoxidable que fueron inoculados con la infeccioacuten fago-bacteria se
analizaron en periacuteodos de 0 2 8 24 y 48 h Se utilizaron para la valoracioacuten de bacterias y
fagos y se distribuyeron los discos de la siguiente manera 2 para visualizacioacuten microscoacutepica
panoraacutemica 2 para recuento bacteriano por microscopiacutea y 2 para recuento bacteriano dando
un total de 6 discos por caja de Petri por duplicado y por cada concentracioacuten (3) por cada
ensayo (3) y por horarios (5) de dando un total de 540 discos
Para el conteo sobre cada disco se colocaron 20 microL del colorante (LIVEDEAD Pribes) y
se incubaron por 5 min a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad y se tomaron
fotografiacuteas a 10X 20X y 40X Para la microscopiacutea de conteo las fotografiacuteas se realizaron a
un aumento de 40X considerando 10 campos aleatorios
Cuando se formoacute el biofilm se requirioacute hacer los recuentos de bacterias y de fagos en ese
sentido para recuperar las bacterias los discos se colocaron en un frasco con 5 mL de TSB
con Tween 80 (TSBTW) (Merck Alemania) y 3 g de perlas de vidrio se homogeneizoacute la
muestra por 1 min en agitador voacutertex a maacutexima potencia para favorecer el desprendimiento
de los microorganismos y posteriormente se realizaron diluciones seriadas De este mismo
extracto se obtuvo el material necesario para hacer el conteo de fagos utilizando la teacutecnica de
ADC Y para el recuento de las bacterias viables se trabajoacute con cajas de Petri se sembroacute 1
mL en TSA con 06 de extracto de levadura (TSAYE Merck Alemania) y se incuboacute a 37degC
durante 24h (Fuster-Valls et al 2008)
67
V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Resultados y discusioacuten
68
Resultados y discusioacuten
69
A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras
De los 10 sitios de recoleccioacuten se lograron obtener un total de 39 muestras en junio de
2007 En la tabla 9 se presentan los sitios y el nuacutemero de muestras recogidas en cada sitio
En el caso del Riacuteo Santa Catarina se abarcoacute una distancia de 95 km la cual presentaba
diferentes zonas de descarga de aguas residuales y de ahiacute se hicieron las tomas en un periacuteodo
de estiaje En el caso de las lagunas de oxidacioacuten del municipio de Mariacuten esta zona presenta
tres lagunas con un aacuterea total de 16700 m2 se realizoacute el muestreo de manera aleatoria En
cuanto a las muestras que se obtuvieron en el sitio de comercializar carne de pollo se les tratoacute
de igual manera para comprobar si existiacutean fagos
Los lugares elegidos para la recoleccioacuten de muestras son similares a los reportados en la
literatura regularmente para el aislamiento de fagos del ambiente se utilizan aguas residuales
y establecimientos de manipulacioacuten yo venta de alimentos (Leeuw et al 2017) En
investigaciones previas se realizan muestreos de diversos sitios como en la piel y heces de
animales manos de los cuidadores superficies quiruacutergicas e instrumentos o utensilios usados
en los establecimientos hoteles y restaurantes (Ejo et al 2016 Yergeau et al 2016) Los
muestreos de aguas tambieacuten se pueden realizar en sitios cercanos a las salidas de drenaje
de hospitales esto es de gran importancia ya que donde hay bacterias posiblemente esteacuten
sus respectivos fagos (Tomat et al 2014 Mattila et al 2015 McShan y Nguyen 2016)
Resultados y discusioacuten
70
Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos
B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis
Para el aislamiento de los fagos especiacuteficos de Salmonella fue necesario la puesta a punto
de varios procedimientos la teacutecnica de agar doble capa (ADC) determinar la cineacutetica de
crecimiento de cultivos de Salmonella determinar la fase de eclipse en la relacioacuten fago-
bacteria (se utilizoacute como control la cepa S Typhimurium y el fago PRD1) y su puesta a punto
en el laboratorio de bioremediacioacuten de la Facultad de Agronomiacutea de la UANL
B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S
Typhimurium
La accioacuten liacutetica de los fagos sobre Salmonella se analizoacute utilizando la teacutecnica ADC
En este procedimiento es necesario tener un ceacutesped bacteriano uniforme entre dos capas
de medio soacutelido que puede ser agar-agar o agar-agarosa (Sambrook y Rusell 2001)
Con el objetivo de abaratar los costes y mejorar los resultados en este trabajo se empleoacute
esta teacutecnica con algunas modificaciones que se describen a continuacioacuten Asiacute pues se decidioacute
que las capas fueran agar-agar donde la primera capa fue de agar al 15 en medio TS y la
Municipio Sitio de la toma N de muestras
Tipo de agua
Monterrey
Parque Fundidora 3 Estanque y corriente
Riacuteo Santa Catarina 10 Corriente
Establecimiento de comida 2 Lavado del pollo
Av Conductores 2 Corriente
Mariacuten
Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal
10 Estanque y corriente
Riacuteo La Libertad 2 Corriente
Guadalupe
Alcantarillas de la colonia La Azteca
3 Corriente
Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados
2 Lavado del pollo
San Nicolaacutes de los Garza
Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac
2 Corriente
Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea 3 Corriente
Resultados y discusioacuten
71
segunda con agar a una menor concentracioacuten para hacer la capa menos firme por lo que fue
necesario poner a punto la teacutecnica probando diferentes concentraciones de agar en ambos
casos a pH 72 Ademaacutes esta adecuacioacuten es importante por el ahorro que se generoacute al utilizar
un componente maacutes econoacutemico que la agarosa lo cual repercutioacute favorablemente en el coste
de la prueba
Otra variable para poner a punto en la teacutecnica de ADC es el volumen de cultivo bacteriano
a utilizar para generar el ceacutesped de Salmonella y lograr una adecuada interaccioacuten con el fago
Se probaron 3 voluacutemenes diferentes de cultivo de S Typhimurium incubados 24 horas a 37oC
para alcanzar una concentracioacuten de 16 x 108 UFCmL Dependiendo de la cantidad de inoacuteculo
las caracteriacutesticas del ceacutesped bacteriano tienen diferente contraste lo cual puede facilitar o
dificultar la observacioacuten de las placas liacuteticas Finalmente el mejor resultado se obtuvo al
utilizar el volumen de 500 L ya que se logroacute una mejor observacioacuten del aclaramiento del
ceacutesped bacteriano al formar las placas liacuteticas En la tabla 10 se muestran las caracteriacutesticas
de las capas en la caja Petri para un buen manejo y desarrollo de la zona liacutetica producida por
el fago al multiplicarse
Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC
Paraacutemetro Condiciones
Agar suave (con agar) () 08
Temperatura del agar suave (degC) 49
pH del medio de cultivo (soacutelido y liacutequido) 72
Cantidad de agar suave (mL) 45
Cultivo bacteriano (microL) 500
Muestra tratada con fagos (microL) 100
Resultados y discusioacuten
72
B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium
El cultivo hueacutesped debe de encontrarse creciendo en medio liacutequido TS en fase logariacutetmica
al momento de mezclarlo con el fago Para identificar la fase logariacutetmica se probaron
diferentes tiempos de crecimiento Con todo ello se observa que la fase logariacutetmica de S
Typhimurium se encuentra en el minuto 150 coincidiendo con los datos reportados por
Vidales-Contreras et al (2006) Y siguiendo con mi tesis la determinacioacuten de la concentracioacuten
se realizoacute mediante el promedio de la enumeracioacuten de las UFC por placas Petri preparadas
por duplicado multiplicado por el factor de dilucioacuten el cual es el reciacuteproco del producto del
volumen ensayado y la dilucioacuten usada para el anaacutelisis Al final se observa cuando se ha
llegado a la fase estacionaria del desarrollo bacteriano (tabla 11) Se utiliza un factor de
dilucioacuten el cual se obtiene como el reciacuteproco de la multiplicacioacuten de volumen de ensayo y la
dilucioacuten usada en el anaacutelisis
Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium
Tiempo Minutos
(Acumulado) Dilucioacuten
UFCmL Promedio
F (Factor) Concentracioacuten
(UFCmL)
T0 0 1 x 10-5 9 plusmn 25 1 x 106 900 x 106
T1 30 1 x 10-5 13 plusmn 74 1 x 106 130 x 107
T2 60 1 x 10-5 24 plusmn 56 1 x 106 240 x 107
T3 90 1 x 10-5 51 plusmn 32 1 x 106 510 x 107
T4 123 1 x 10-5 211 plusmn 89 1 x 106 211 x 108
T5 150 1 x 10-6 215 plusmn 81 1 x 107 215 x 109
Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)
B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis
Las consideraciones tomadas del modelo infectivo S Typhimurium y el fago PRD1 y
utilizando la teacutecnica ADC se replican para poner a punto a la bacteria que se quiere probar
que en este caso es S Typhi ATCC 19430 Los resultados de estos ensayos se pueden
observar en la tabla 12 en la que se puede observar que es ligeramente mayor la etapa donde
Resultados y discusioacuten
73
se puede realizar la infeccioacuten (fase de eclipse) de los fagos aislados y la bacteria hueacutesped
Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis (108 UFCmL) (37 ordmC24h)
Tiempo Minutos (Acumulado)
Dilucioacuten UFCmL Promedio
F (Factor) Concentracioacuten (UFCmL)
T0 0 1 x 10-5 216 710 1 x 106 20 x 107
T1 60 1 x 10-5 260 608 1 x 106 20 x 107
T2 120 1 x 10-6 160 173 1 x 107 16 x 108
T3 180 1 x 10-6 244 208 1 x 107 24 x 108
T4 240 1 x 10-7 400 100 1 x 107 40 x 109
Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)
B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis
De los sitios muestreados se logro obtener 39 muestras y se obtuvo un total de 15 fagos
aislados a partir de dos fuentes de aguas residuales las del Riacuteo Santa Catarina y las lagunas
de oxidacioacuten de Mariacuten Los 15 fagos se nombraron consecutivamente como MRH 1-15 Los
15 fagos se probaron contra la cepa hueacutesped S Enteritidis (CINSP tabla 4) tras realizar de
3 a 4 amplificaciones la mayoriacutea (14 fagos) no presentoacute actividad liacutetica (formacioacuten de halos
de inhibicioacuten) de manera que fueron descartados para los siguientes estudios siendo
solamente uno proveniente de la muestra del Rio Santa Catarina el que produjo halos bien
definidos en el ceacutesped bacteriano y con eacuteste se continuoacute trabajando El fago que mantuvo la
actividad liacutetica fue el MRH6 Se propuso nombrarle como MRH considerando la M para
muestra la RH por el Rodrigo Hernaacutendez
B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten
La principal caracteriacutestica de los fagos es cuando forman halos de inhibicioacuten (tambieacuten
llamadas zonas liacuteticas o calvas) y en nuestro estudio las muestras de agua recolectadas
fueron tratadas y analizadas mediante la teacutecnica ADC observando los halos de inhibicioacuten
claros y de diferentes diaacutemetros estas observaciones son similares a las observadas por
Ackermann (2003) Tanto la cantidad de UFP que se pueden desarrollar y observar hecha por
Resultados y discusioacuten
74
los fagos y la pureza en que encuentren los bacterioacutefagos de las muestras obtenidas del medio
ambiente estaacuten directamente relacionadas la especificidad contra la bacteria Al sembrar por
vaciado en placa estos lisados sobre la cepa indicadora se obtuvieron diferentes tamantildeos de
placas liacuteticas
En la figura 8 se muestran los halos de inhibicioacuten en ceacutesped de Salmonella al realizar la
infeccioacuten se pueden observar los diferentes tamantildeos y la forma se da por la capacidad de
raacutefaga (nuacutemero de copias al realizar el proceso liacutetico) de los fagos de la progenie los fagos
suelen tener una raacutefaga de maacutes de 100 partiacuteculas infectivas producidas en un lapso de tiempo
de 05 ndash 20 h Algunos halos formados por el fago fueron claros lo que indica que es liacutetico de
acuerdo con diversos autores (Sambrook y Rusell 2001 Vidales-Contreras et al 2006 Wong
et al 2014) En nuestro estudio se batalloacute en encontrar fagos a pesar de buscar sitios
sentildealados por autores antes mencionados
Al intentar obtener fagos puede suceder que se encuentren en concentraciones tan
pequentildeas que al probarlos contra alguna cepa hueacutesped no sirven para trabajar por lo que se
llevoacute a cabo repeticiones seriadas (amplificacioacuten) asegurando que al formar una placa de Petri
en ADC con tamantildeos de los halos de inhibicioacuten iguales lo que nos indica que pertenecen a
una sola especie de fago
Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por fagos con halos de inihibicioacuten de
diferentes tamantildeos
Resultados y discusioacuten
75
C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli
La clasificacioacuten de los fagos se puede establer en base a su morfologiacutea al aacutecido nucleico
al espectro de accioacuten y algunas consideraciones inmunoloacutegicas (Criscuolo et al 2017) Al
realizar la infeccioacuten de fago-bacteria y observar la presencia de halos liacuteticos en las placas de
ceacutesped bacteriano se considera que se ha producido una infeccioacuten exitosa pero previamente
es necesario poner a punto el cultivo puro de ambos cultivos y considerar la concentracioacuten de
cultivos a utilizar
Al seleccionar los fagos que presentaron uniformidad en cuanto a la inhibicioacuten y posterior
evaluacioacuten de los fagos se consideraron varios factores entre ellos el tiempo que tarda la
replicacioacuten viral (lo cual es variable) siendo que en algunos casos se pueden replicar en
cuestioacuten de minutos A simple vista se pueden observar la formacioacuten de halos de lisis en el
ceacutesped bacteriano en las cajas de Petri
Asiacute pues la teacutecnica ADC se repitioacute varias veces hasta obtener placas liacuteticas con ideacutentica
morfologiacutea y tamantildeo En la tabla 13 se observa que hay diferentes tamantildeos de halos En los
primeros ensayos soacutelo cuatro muestras de agua (15 21 26 y 33) dieron halos de inhibicioacuten
pudieacutendose distinguir bien la forma y el tamantildeo Al realizar posteriores siembras los fagos
fueron perdiendo capacidad de infeccioacuten (fagos atemperados) y soacutelo la muestra 21 de las
lagunas de oxidacioacuten provenientes de Mariacuten presentoacute fagos con actividad liacutetica y el resto de
fagos no desarrolloacute actividad constante
Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten de S Enteritidis en ceacutesped
bacteriano
Diaacutemetro de halo grande ge 8mm mediano 8 lt X lt6mm pequentildeo le 5mm
Distribucioacuten de tamantildeos de halo
Muestra de agua Grande Mediano Pequentildeo
15 8 23 15
21 17 11 27
26 10 18 6
33 7 9 13
Diaacutemetro medio halo (mm) 1055 0671 0376
Resultados y discusioacuten
76
En la tabla 14 se presenta el listado de posibles hueacutespedes probados 12 cepas de
Salmonella y 4 de E coli que se probaron contra los 15 fagos aislados previamente Se puede
distinguir que afecta a algunas serovariedades de Salmonella y no tiene efecto en otras
serovariedades entericas No afecta nada a las cepas de E coli Se ve que la cepa maacutes
afectada por el fago es la S Typhi ATCC 19430 y otras cepas de Salmonella son afectadas
ligeramente
Resultados y discusioacuten
77
Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades de Salmonella spp y de E coli
serovariedades Fagos
M
R
H
1
M
R
H
2
M
R
H
3
M
R
H
4
M
R
H
5
M
R
H
6
M
R
H
7
M
R
H
8
M
R
H
9
M
R
H
1
0
M
R
H
1
1
M
R
H
1
2
M
R
H
1
3
M
R
H
1
4
MR
H15
S Typhimurium ATCC 13311
-
-
t
- -
t
- - - - - - - - -
S Paratyphi ATCC 9150 - - - - - - - - - - - - - - -
S Enteritidis ATCC 13076 - - - - - - - - - - - - - - -
S Typhi ATCC 19430 + + + + + t
c
+ + + n
d
n
d
n
d
n
d
nd +
S Typhimurium - - - - - - - - - - - - - - -
S Bongori ATCC 43975 - - - - - - - - - - - - - - -
S enterica LT2 - - - + + + - - - - - - - -
S sub enterica CECT 4138 - - - - + + + - - - - - - - -
S sub enterica CECT 4594
t
t
t
- + + + - - -
t
- - - -
S sub enterica CECT 409 - - - - n
d
- -
t
- - - - - - -
S sub enterica CECT 698 - - - - - t
c
- - - - - - - - -
S Typhimurium CCUG
29478
- - - + + - - - - - - - -
E coli CECT 515 - - - - - - - - - - - - - - -
E coli K12 - - - - - - - - - - - - - - -
E coli ATCC 10536 - - - - - - - - - - - - - -
E coli O157H7 CECT 4783 - - - - - - - - - - - - - - -
+ crecimiento y desarrollo de halo indica desarrollo muy pequentildeo o difuso del halo t indica desarrollo pequentildeo y turbio del halo tc indica turbio o con centro opaco en el centro del halo - no crecimiento o desarrollo de halo nd aparente baja efectividad o halo difuso
Resultados y discusioacuten
78
Resultados y discusioacuten
79
El fago que siacute mostroacute actividad (MRH6) y que mantuvo la capacidad liacutetica durante las
diferentes amplificaciones se trabajoacute de manera continua hasta obtener halos uniformes en el
tamantildeo y asiacute ya se considera como una entidad pura de fago Los resultados obtenidos en
este trabajo son semejantes a los mostrados por Thung et al (2017) En la figura 9 se
presentan las imaacutegenes donde se muestra el desarrollo de halos liacuteticos previamente
mencionados donde se puede observar los halos uniformes contra A) S Enteritidis (CINSP)
y B) S Typhi ATCC 19430 (UAB)
Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria A) S Enteritidis (CINSP) y B) S Typhi ATCC 19430
La especificidad de los fagos se encuentra generalmente a nivel de cepa y tambieacuten de
especie y maacutes raramente a nivel de geacutenero Es de intereacutes el garantizar una eficiente infeccioacuten
de la dupla fago-bacteria de esta manera se toman todas las medidas precautorias para
obtener resultados fiables en este sentido se requiere verificar todos los aspectos como son
los controles (positivo y negativo) En el caso del control negativo se verificoacute el desarrollo
solamente del ceacutesped bacteriano de la cepa hueacutesped con la teacutecnica ADC y como control
positivo se consideroacute el modelo del fago PRD 1 y S Typhimurium los fagos son altamente
especiacuteficos (no afecta a otros cultivos bacterianos) y no se puede descartar falsos positivos
por la presencia de restos celulares bacterianos (Segundo et al 2010 Szafranski et al 2017)
Resultados y discusioacuten
80
D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM
El ICTV clasifica a los fagos en 1 orden13 familias y 31 geacuteneros De los cuales se
observa al orden de los Caudovirales el cual comprende a la mayor parte de los fagos (en
torno a un 95)y estos estaacuten constituidos por 3 familias con cola Myoviridae Podoviridae
y Siphoviridae Con estas caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas mediante el TEM en la
figura 10 se presentan las imaacutegenes del fago MRH6
El anaacutelisis de una suspensioacuten de fagos con una concentracioacuten de 1x1012 UFPmL mediante
microscopiacutea electroacutenica muestra una distintiva morfologiacutea de cabeza icosaeacutedrica estructura
alargada y cola no contraacutectil La caacutepside tiene un diaacutemetro de 55-60 nm y la cola puede
alcanzar los 570 nm Estas caracteriacutesticas se corresponden con la familia Siphoviridae Yang
et al (2017) comentan que esta familia de fagos se encuentra frecuentemente en
enterobacterias
Figura 10 Imagen por TEM del fago MRH6 (X100 000) la barra representa 100nm (Servicio de Microscopiacutea UAB)
Resultados y discusioacuten
81
D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero
inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de
epifluorescencia directa (DEM)
Para corroborar la potencial condicioacuten como agente de desinfeccioacuten del fago MRH6 es
necesario observar su efectividad a traveacutes de la DEM con la que se pueden observar
bacterias viables y no viables Tambieacuten la materia orgaacutenica puede dar falsos positivos y se
debe tener en cuenta al comparar con otros meacutetodos de conteo (Montantildeez et al 2012)
En este trabajo S Typhi ATCC 19430 desarrolloacute biofilms en las superficies de acero
inoxidable (discos tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm) y consiguieron
niveles de 29 plusmn 02 UFCcm2 despueacutes de tener un maacuteximo de 72 h en incubacioacuten en
condiciones de humedad y temperatura ambiente tal como se puede observar en la figura 11
Estos biofilms tienen distinta intensidad seguacuten el tiempo de incubacioacuten siendo los periodos
evaluados de 24 48 y 72h respectivamente En estas condiciones se realizoacute el recuento en
tres zonas de cada disco para cada tiempo de incubacioacuten y los resultados se presentan en la
figura 12 Para tener fiabilidad de los resultados se realizaron los conteos por triplicado porque
el manejo de los discos es muy complejo y para evitar errores de manejo se consideroacute
necesario tener maacutes de una muestra otorgando ademaacutes la oportunidad de comparar
resultados y tener un margen de referencia en cuanto a los resultados obtenidos
Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 en
diferentes tiempos de incubacioacuten (24 48 y 72h) a temperatura ambiente
Resultados y discusioacuten
82
Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable incubados a temperatura ambiente n = 3
En este estudio se compararon 2 meacutetodos de conteo de bacterias despueacutes de ser atacadas
por los fagos eacutestos fueron el recuento en placa de agar y por otro lado la observacioacuten por
microscopiacutea de epifluorescencia y la relacioacuten entre ambos meacutetodos Desafortunadamente se
han perdido los resultados por un problema irresoluble pero si se puede comentar que existe
una relacioacuten ligeramente inferior a 09 (R2 ) Esta observacioacuten ya ha sido presentada
anteriormente por otros autores (Fuster-Valls et al 2008 Engelhardt et al 2014)
El cultivo bacteriano se puede contabilizar por conteo en placa directo (TSA) este meacutetodo
es utilizado generalmente para cultivos de geacutermenes no exigentes o moderadamente
exigentes y cuando se quiere visualizar como afecta el ataque de los fagos las ceacutelulas
bacterianas se visualizan por DEM (cuya coloracioacuten cambia a verde cuando han sido atacadas
por los fagos) y una forma de visualizar este ataque es por medio de TSA con la teacutecnica de
ADC
0
5
10
15
20
25
0 10 20 30 40 50 60
Co
nte
o (
Lo
g U
FC
cm
2)
Tiempo (h)
Crecimiento bacteriano
Resultados y discusioacuten
83
D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable
Se aplicoacute la DEM para evaluar la efectividad del fago MRH6 en el control de S Typhi ATCC
19430 sobre superficies de acero inoxidable en condiciones de humedad El fago MRH6 es
liacutetico capaz de disgregar los biofilms
El analizar la accioacuten liacutetica del fago sobre Salmonella por medio del DEM es muy importante
e innovador pero el material que se utiliza y la manera en que se comportan las diferentes
bacterias hacen que se deba ser muy precavido al considerar el uso de este meacutetodo como
adecuado para realizar conteos (Libuchi et al 2010) Por ejemplo se debe tener en cuenta
que existen bacterias que no forman un biofilm y presentan movimiento esto puede llegar a
complicar el visualizarlas si no estaacuten en el campo por lo que se podriacutea pensar que fueron
atacadas y eliminadas por los fagos o bien que por los diferentes lavados se barrieron
La DEM con la tincioacuten LIVEDEAD reveloacute la presencia de ceacutelulas viables con coloracioacuten
verde En la figura 13 se puede observar el efecto letal del fago MRH6 sobre la poblacioacuten de
S enteacuterica disminuyendo su cantidad considerablemente en base a el tiempo de incubacioacuten
en color verde Se observa que hay disminucioacuten de las ceacutelulas de S Typhi ATCC 19430 al ser
atacadas por el fago MRH6 Recordemos que la infeccioacuten con el MRH6 se realizoacute despueacutes de
formar un biofilm a temperatura ambiente y con humedad por espacio de 72h en 3
concentraciones 6 7 y 8 UFPmL Al paso del tiempo se aprecia que a las 48h hay pocas
ceacutelulas vivas al menos detectadas por la teacutecnica utilizada
Resultados y discusioacuten
84
a)
b)
c)
Figura 13 Secuencia de imaacutegenes de epifluorescencia que ilustran la destruccioacuten de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable causada por el fago MRH6 tras incubacioacuten de 0 8 24 y 48 h y con 3 concentraciones de fagos a) 6 b) 7 y c) 8 UFPmL respectivamente
La DEM es un meacutetodo altamente sensible que se caracteriza por la formacioacuten de imaacutegenes
amplificadas y es considerada una teacutecnica poderosa con altos niveles de sensibilidad y
resolucioacuten Tomando como referencia los resultados se considera que la DEM es una
herramienta eficaz para el conteo bacteriano pero hay que considerar la experiencia del
observador
Resultados y discusioacuten
85
En algunas ocasiones al observar las bacterias atacadas por los fago se pueden encontrar
muestras con material geneacutetico mezclado con restos celulares esta situacioacuten hace que
algunos investigadores recomienden extraer los fagos de la muestra antes de sembrar las
bacterias con el fin de determinar la reduccioacuten bacteriana uacutenicamente debida a la actividad
virulenta del fago sobre la muestra y no a la infeccioacuten por fagos libres presentes en el agar
(Sharma et al 2009) En ese sentido tal como reporta Fuster-Valls et al (2008) en su trabajo
observoacute que el limite de deteccioacuten de esta teacutecnica es de 279 log10 celulas por cm2 en cambio
en nuestro trabajo y tal como se observa en la figura 14 se pudo llegar a una sensibilidad
muy proacutexima a 2 y que coincide con las imaacutegenes de la figura 13 en las que a las 24 y 48
horas apenas se observan algunas manchas que corresponden al crecimiento bacteriano
Los fagos utilizan los recursos de la ceacutelula para hacer muchos fagos nuevos lo que causa
que la ceacutelula lise (estalle) y muera en el proceso La lisis en las uacuteltimas etapas del ciclo liacutetico
el fago expresa los genes para las proteiacutenas que hacen agujeros en la membrana plasmaacutetica
y la pared celular En la figura 14 se puede observar como el recuento de Salmonella Typhi
ATCC 19430 disminuye por el ataque del fago MRH6 El efecto del fago es muy fuerte y al
final los conteos son muy parecidos
Resultados y discusioacuten
86
Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 en superficies de acero inoxidable por el fago MRH6 con diferentes concentraciones y hasta 48 h de incubacioacuten
En este trabajo se buscoacute crear condiciones de infeccioacuten fago-bacteria en el laboratorio
como las que se pudieran presentar en la industria Los resultados de esta relacioacuten del fago
MRH6 y S Typhi ATCC 19430 muestran que la aplicacioacuten del fago es efectiva pero hay que
considerar que funciona mejor a altos tiacutetulos (108 UFCmL) y que deberaacute de potenciarse
cuando se trate de un coctel de fagos
Nuestros resultados sugieren que los fagos pueden ser utilizados como un meacutetodo para
controlar un biofilm formado por un bacteria especiacutefica
Al realizar la buacutesqueda de informacioacuten en diferentes motores de buacutesqueda una de las
plataformas de libre acceso (Pubmed) se obtuvo una relacioacuten de 5 en publicaciones de
00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Salm
on
ella
Typ
hi
AT
CC
19430
(lo
g1
0ceacutelu
las cm
2)
Tiempo (h)
Fago MRH6 a 6 Logml Fago MRH6 a 7 Logml Fago MRH6 a 8 Logml Control sin fago
Resultados y discusioacuten
87
fagos contra diferentes serovariedades de Salmonella spp lo que se puede traducir en que
hay un aacuterea de oportunidad latente
Las consideraciones que se enviacutean como propuesta es que existen en estos momentos
muchos trabajos sobre fagos pero aquiacute en Meacutexico no hay trabajos reportados y los que
existen estaacuten apenas en fases iniciales
Existe un enorme potencial de trabajo en esta aacuterea con los fagos tal es el caso de la
fagoterapia en otros sitos y en otros tiempos estaacuten realizando experimentos para ser
explotada como alternativa para todos los aacutembitos desde hogares industria salud animales
vegetales etc Por lo menos en EE UU tienen grandes avances en estudios relacionados
con la aplicacioacuten en bacterias multiresistentes que por el uso de antibioacuteticos han mutado esto
en el sector salud donde se estaacute perdiendo la batalla
Una de las fortalezas de estudiar a los fagos es que antes de que los antibioacuteticos fueran
descubiertos habiacutea investigacioacuten considerable sobre los fagos como tratamiento para las
enfermedades bacterianas humanas por lo menos en parte de Europa La aplcacion de los
fagos es potencialmente son buenos candidatos para tratar enfermedades bacterianas en
seres humanos inocuidad aliemnaria bioremediacioacuten y cada regioacuten tiene fagos endeacutemicos y
este tabajo representa de los primeros en llevarse en Monterrey
Ciertas limitaciones de los resultados se debiooacute a las condiciones que se presentaron al
realizar el estudio (laboratorio equipo conocimiento del tema) solamente se pudo aislar un
fago y lo recomendable es que sean varios fagos dado que son muy especiacuteficos de especie
o hasta de cepa Se proboacute su accioacuten sobre superficies con un solo cultivo bacteriano y en la
realidad las superficies se contaminan con diferentes bacterias
Lo que se vizualiza para nuestro estudio es sugerir varias liacuteneas de accioacuten a futuro Por
ejemplo el fago aislado podriacutea probarse in vivo sobre carne de pollo o fagoterapia tambieacuten
podriacutea continuar los estudios para aislar maacutes fagos y hacer mezclas (coacutecteles) que tuvieran
un mayor rango de actividad y combatir a diversas especies de Salmonella Con respecto al
tratamiento de superficies podriacutean utilizarse coacutecteles de fagos para tratar biofilms bacterianos
formados por maacutes de dos especies o inclusive podriacutean probarse en biopeliacuteculas industriales
reales
Resultados y discusioacuten
88
89
VI CONCLUSIONES
90
Conclusiones
91
De las 39 muestras de agua analizadas se aislaron tentativamente15 fagos de los que soacutelo 4
mantuvieron en un primer momento su actividad liacutetica estos fagos se correspondieron con las
muestras de agua 15 21 26 y 33 Se siguioacute trabajando con ellos y finalmente solo uno de
ellos el MRH6 mantuvo su actividad liacutetica despueacutes de varias amplificaciones este fago se
aisloacute de las aguas residuales de Mariacuten
Se consiguioacute optimizar la teacutecnica ADC cambiando la agarosa que tiene un alto costo por
agar-agar maacutes econoacutemico sin alterar la fiabilidad de la teacutecnica ademaacutes con este cambio se
facilita el manejo
En relacioacuten con la especificidad de los 15 fagos aislados frente a las 16 cepas de
enterobacterias probadas (12 cepas de Salmonella spp y 4 de E coli) se observa ciertas
tendencias marcadas Ninguno de los fagos ataca a las cepas de E coli probadas En cuanto
a Salmonella se observa una fuerte especificidad frente a S Typhi (ATCC 19430) una ligera
actividad frente a varias cepas de S enterica y no hubo efecto contra las demaacutes cepas de
Salmonella ensayadas lo cual confirma la elevada especificidad fago-hueacutesped
Las imaacutegenes obtenidas mediante DEM muestran una morfologiacutea caracteriacutestica de cabeza
icosaeacutedrica estructura alargada y cola no contraacutectil que sugieren que el fago MRH6 se puede
clasificar en la familia Siphoviridae
Se observa un efecto liacutetico progresivo del fago MRH6 frente a biofilms de Salmonella en
discos de acero inoxidable llegando a valores miacutenimos inferiores a 102 a las 48 horas de
incubacioacuten para todas las concentraciones de fago utilizadas (6 a 8 UFPmL)
Se comprueba que la DEM es un buen meacutetodo para la cuantificacioacuten del crecimiento de S
Typhi (ATCC 19430) sobre discos de acero inoxidable con una gran sensibilidad y resolucioacuten
ya que se observaron claras diferencias en los diversos tiempos de incubacioacuten ensayados y
a diferentes concentraciones del fago MRH6 Esto confirma que la teacutecnica es una herramienta
eficaz para valorar el efecto liacutetico de los fagos sobre biofilms
Ya que en este trabajo solamente se obtuvo un fago liacutetico se sugiere reflexionar acerca de
los factores que han dificultado la obtencioacuten de un nuacutemero maacutes amplio de fagos
Conclusiones
92
Este trabajo refleja el gran intereacutes por iniciar o regresar a trabajar con fagos tal como esta
sucediendo en otras partes del mundo Hasta el momento hay muchas espectaivas sin
embargo todaviacutea se necesita investigacioacuten para saber queacute tan seguros son
93
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Agradecimientos
Este trabajo se ha realizado gracias a la financiacioacuten aportada por el Programa de
mejoramiento del profesorado (PROMEP) PROMEP1035062037 UANL-326 de la
Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) dentro del programa de becas para la
formacioacuten de investigadores y a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para
el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y de
Cooperacioacuten) Programa Extranjeros II-A convocatoria 2010-2011 0000521211
A la Dra Teresa de los Reyes Pla Soler por la confianza depositada en miacute y darme la
oportunidad de ser su estudiante sin sus consejos no hubiera sido posible concluir esta
tesis
Al Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas por ser un guiacutea durante mi formacioacuten como
investigadora por sus ensentildeanzas con palabras y el ejemplo y por su apoyo en el
aspecto profesional y personal
Al Dr Joseacute Juan Rodriacuteguez Jerez por su gran apoyo acadeacutemico y por permitirme
trabajar desinteresadamente en las instalaciones y con el equipo de laboratorio
A la Dra Manuela Hernaacutendez Herrero que es una gran persona que me ha apoyado
desde el peincipio de estos estudios
A la Dra Marta Capellas Puig que me ha alentado todo el tiempo para terminar de
buena manera
Dedicatorias
Con mucho carintildeo a mi Sentildeor padre Bartolomeacute Hernaacutendez Balbuena (dagger) y a mi Sentildeora
madre Lucia Santiago Santos son un ejemplo en mi vida ya que ellos son fundamentales
en mi formacioacuten como persona
A mis hermanos Flavio Viacutector Manuel Guadalupe Hilda (dagger) porque siempre
estuvieron alliacute alentaacutendome en este trabajo con palabras experiencias etc
A mi prometida y futura esposa Dontildea Rosa Salas Martiacutenez desde que inicmos a estar
juntos siempre estaacute apoyaacutendome en todos los aspectos y en todas las cosas que he
emprendido y que con algunas locuras que se nos pueda ocurrir mas adelante nos
llevaraacute a mejores cosas cada diacutea
A mi hija Gabriela Sarahi Hernaacutendez Flores ella es lo que maacutes aprecio y espero vea
en mi un ejemplo que sirva para alentarla a ser cada diacutea mejor y sacar todas las cosas
que se proponga adelante
A mis compantildeeros y amigos Vannesa Fabio Fontecha Abel Rita Jacira Kathy
Genaro Fabio Poliseli Dora Cecilia Diana Angela Sonia Dolors Marco y Cristina por
las convivencias durante mi estancia en Espantildea que de alliacute solo me llevo grandes
recuerdos
A mis compantildeeros Mirna Patty Letty Tere Adelita Luluacute Betty Marco Arnoldo Joseacute
Luis y Gustavo que compartimos buena cantidad de tiempo gracias por las convivencias
y por los muchos trabajos que hicimos en equipo
CONTENIDO RESUMEN 1
SUMMARY 3
RESUM 5
I INTRODUCCIOacuteN 7
Presentacioacuten del proyecto 9
Justificacioacuten 10
II ANTECEDENTES 13
A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos 15
A1 Problemaacutetica 16
A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea 17
B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria 19
B1 Escherichia 19
B2 Campylobacter 20
B3 Enterobacter 21
B4 Listeria 22
B5 Salmonella 23
B51 Origen 23
B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp 25
B53 Manifestaciones cliacutenicas 27
B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis 28
C Crecimiento microbiano 30
C1 Crecimiento de los microorganismos 30
C11 Disponibilidad del agua 31
C12 Acidez y pH 31
C13 Oxiacutegeno 31
C14 Temperatura 32
D Control del crecimiento microbiano 34
D1 Agentes fiacutesicos 34
D2 Agentes quiacutemicos 35
E Fagos 35
E1 Antecedentes 35
E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos 37
E3 Clasificacioacuten de los fagos 37
E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico 39
E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten 39
F Biofilm 40
G Microscopiacutea electroacutenica 41
H Fagoterapia 42
III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 47
A Objetivo general 49
B Objetivos especiacuteficos 49
C Plan de trabajo 49
IV MATERIALES Y MEacuteTODOS 51
A Toma de muestras 53
B Obtencioacuten de fagos 54
B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55
B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55
B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas 56
B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos 56
B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC) 58
B6 Modelo de infeccioacuten 59
B7 Controles utilizados durante los ensayos 60
B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium 60
C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos 61
D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica 63
D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 64
D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM 65
V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 67
A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras 69
B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis 70
B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S Typhimurium 70
B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium 72
B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis 72
B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis 73
B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten 73
C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli 75
D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM 80
D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 81
D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable 83
VI CONCLUSIONES 89
VII BIBLIOGRAFIacuteA 93
Iacutendice de figuras
Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa 16
Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por Salmonella spp 24
Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella 24
Figura 4 Adsorcioacuten del bacterioacutefago T4 e inyeccioacuten del ADN 39
Figura 5 Diagrama general de trabajo 50
Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten bacterioacutefago-hueacutesped 59
Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten 62
Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por bacterioacutefagos 74
Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria 79
Figura 10 Imagen por TEM del bacterioacutefago MRH6 80
Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 81
Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable 82
Figura 13 Secuencia de imaacutegenes del DEM 84
Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 por el fago MRH6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86
Iacutendice de tablas
Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias 19
Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos 25
Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales 33
Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos 38
Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos 44
Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria 45
Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos 54
Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten 57
Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos 70
Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC 71
Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium 72
Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis 73
Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten 75
Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades 77
Lista de abreviaturas y acroacutenimos
ADN Aacutecido desoxirribonucleico
ARN Aacutecido ribonucleico
ADC Agar doble capa
AS Agar suave
AECID Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el
Desarrollo
ATCC American Type Culture Collection
APPCC Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control
aw Actividad del agua
BGA Agar verde brillante
BHI Infusioacuten cerebro corazoacuten
CCUG Culture Collection University of Goumltenborg
CENAVECE Centro Nacional de Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de
Enfermedades
CETC Coleccioacuten Espantildeola de Cultivos Tipo
CINSP Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica
EDTA Etilendiaminotetraceacutetico
DEM Microscoacutepica de epifluorescencia directa
EE UU Estados Unidos de Norteameacuterica
ETA Enfermedades transmitidas por alimentos
FAO Food and Agriculture Organization (Organizacioacuten de las
Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura)
FaSPyN Facultad de Salud Puacuteblica y Nutricioacuten UANL
FAUANL Facultad de Agronomiacutea UANL Unidad Mariacuten NL
FCB Facultad de Ciencias Bioloacutegicas UANL
HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points (Anaacutelisis de
Peligros y Puntos Criacuteticos de Control)
INEGI Instituto Nacional de Estadiacutestica y Geografiacutea de los Estados
Unidos Mexicanos
nd Aparente baja efectividad o halo difuso
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
PANALIMENTOS Instituto Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y
Zoonosis
PEG Polietilenglicol
SDS Dodecilsulfato soacutedico
SIRVETA Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos
SSF Solucioacuten salina fisioloacutegica
SUH o SHU Siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico
TEM Microscopio electroacutenico de transmisioacuten
TSA Agar soya de tripicasa
TSAYE TSA con 06 de extracto de levadura
TSB Caldo de soja trypticasa
UAB Universitat Autogravenoma de Barcelona
UANL Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
ZMM Zona Metropolitana de Monterrey
RESUMEN
La inocuidad alimentaria es un tema amplio y relevante que impacta directamente en todos
los segmentos de la sociedad involucra productores desarrolladores innovadores
consumidores y gobierno ademaacutes de diversos sectores como la industria la ingenieriacutea y hasta
la educacioacuten Sin embargo las nuevas tecnologiacuteas en la cadena de produccioacuten provocan que
eacutesta sea maacutes larga y compleja
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) causan alta morbilidad y varios casos
de mortalidad Entre los agentes infecciosos maacutes comunes se encuentran Salmonella spp
Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus
Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus
Los bacterioacutefagos o fagos son virus bacterianos especiacuteficos de una ceacutelula hueacutesped en la
cual se multiplican invadiendo su maquinaria de material geneacutetico Son los sistemas bioloacutegicos
maacutes abundantes del planeta se encuentran en el medio ambiente y se introducen y conviven
en la flora intestinal de otros seres cuando eacutestos ingieren diversos alimentos ya sean de tipo
animal o vegetal
El objetivo del presente trabajo fue aislar y probar la especificidad de una serie de fagos de
Salmonella spp a partir de aguas residuales para lo cual se utilizaron muestras de agua
recolectadas de diferentes localidades del aacuterea metropolitana de Monterrey N L Meacutexico La
purificacioacuten de fagos se llevoacute a cabo mediante la teacutecnica de agar doble capa (ADC) hasta
obtener placas liacuteticas uniformes y se usaron diferentes cepas de referencia de Salmonella
como cultivos indicadores
Se aislaron un total de 15 fagos putativamente distintos de los cuales al pasar las pruebas
de replicacioacuten soacutelo uno logroacute mantener la capacidad liacutetica Se seleccionoacute y purificoacute para
realizar pruebas in vitro especiacuteficas para Salmonella Se utilizoacute una concentracioacuten de fagos
de 1x1012 UFPmL para analizar al fago mediante su morfologiacutea por microscopiacutea electroacutenica
la cual se identificoacute como miembro de la familia Siphoviridae Asiacute mismo se probaron los fagos
contra Salmonella in situ en discos de acero que simulan las superficies de trabajo y para
analizar el efecto de la infeccioacuten del fago sobre Salmonella en los discos de acero inoxidable
se utilizoacute el microscopio de epifluorescencia
Para el conteo de fagos se utilizoacute los meacutetodos LIVEDEAD Para finalizar para evaluar la
efectividad del fago MRH6 que resulto liacutetico en nuestro ensayo se procedioacute a dar las
condiciones necesarias para la formacioacuten del biofilm de Salmonella sobre superficies de acero
inoxidable El fago MRH6 fue capaz de disgregar los biofilms a temperatura ambiente Las
mayores reducciones de Salmonella en un menor tiempo se obtuvieron con concentraciones
de fago mayores a 1x108 UFPmL El meacutetodo de cultivo mostroacute reducciones del patoacutegeno a
niveles indetectables sin embargo la tincioacuten vital reveloacute la presencia de ceacutelulas viables
(coloracioacuten verde) que podriacutea representar un riesgo de contaminacioacuten cruzada estas
pudieran tambieacuten presentarse por la presencia de material orgaacutenico Este trabajo con un fago
puede proporcionar una medida adyuvante para controlar la contaminacioacuten de superficies de
acero inoxidable con biofilms de Salmonella La DEM resultoacute ser una buena herramienta para
evaluar raacutepida y adecuadamente por observacioacuten y posterior anaacutelisis el efecto de los fagos
SUMMARY
Food safety is a broad and relevant issue that directly affects all aspects of society involving
producers developers innovators consumers and government as well as various sectors
such as industry engineering and even education However new technologies in the
production chain cause it to be longer and more complex
Foodborne diseases (ETA) cause high morbidity and several cases of mortality Among the
most common infectious agents are Salmonella spp Campylobacter spp Escherichia coli
Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus Clostridium botulinum Listeria
monocytogenes and Staphylococcus aureus
Bacteriophages or phages are bacterial viruses specific to a host cell in which they multiply
by invading their machinery of genetic material They are the most abundant biological systems
on the planet they can be found in the environment In organisms they enter and coexist in
the intestinal flora of other beings when they ingest various foods whether animal or vegetable
The objective of this study was to isolate and test the specificity of a series of phages of
Salmonella spp from wastewater for which water samples were collected from different
locations in the metropolitan area of Monterrey N L Meacutexico The purification of phages was
carried out by means of the double layer agar technique (ADC) until uniform lithic plates were
obtained and different Salmonella reference strains were used as indicator cultures
A total of 15 putatively different phages were isolated of which upon passing the replication
tests only one managed to maintain the lytic capacity It was selected and purified to perform
specific in vitro tests for Salmonella A phage concentration of 1x1012 PFUmL was used to
analyze the phage by means of its electron microscopy morphology which was identified as a
member of the Siphoviridae family Likewise the phages against Salmonella were tested in
situ on steel discs simulating the work surfaces and the epifluorescence microscope was used
to analyze the effect of phage infection on Salmonella on the stainless steel discs
For the phage count the LIVE DEAD Finally in order to evaluate the effectiveness of the
phage MRH6 that was lytic in our trial the necessary conditions for the formation of the
Salmonella biofilm on stainless steel surfaces were established The phage MRH6 was able
to disintegrate the biofilms at room temperature The greatest reductions of Salmonella in a
shorter time were obtained with phage concentrations greater than 1x107 PFUmL The culture
method showed reductions of the pathogen to undetectable levels however vital staining
revealed the presence of viable cells (green coloration) which could represent a risk of cross
contamination these could also be presented by the presence of organic material This work
with a phage can provide an adjuvant measure to control contamination of stainless steel
surfaces with Salmonella biofilms The DEM proved to be a dependable tool to quickly and
adequately evaluate the effect of phages by observation and subsequent analysis
RESUM
La innocuiumltat alimentagraveria eacutes un tema ampli i rellevant que impacta directament en tots els
segments de la societat involucra productors desenvolupadors innovadors consumidors i
govern a meacutes de diversos sectors com la induacutestria lenginyeria i fins a leducacioacute No obstant
aixograve les noves tecnologies en la cadena de produccioacute provoquen que aquesta sigui meacutes llarga
i complexa
Les malalties transmeses per aliments (ETA) causen alta morbiditat i diversos casos de
mortalitat Entre els agents infecciosos meacutes comuns es troben Salmonella spp
Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus
Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus
Els bacteriogravefags o fags soacuten virus bacterians especiacutefics duna cegravelmiddotlula hoste en la qual es
multipliquen envaint la seva maquinagraveria de material genegravetic Soacuten els sistemes biologravegics meacutes
abundants del planeta es troben en el medi ambient i sintrodueixen i conviuen en la flora
intestinal daltres eacutessers quan aquests ingereixen diversos aliments ja siguin de tipus animal
o vegetal
Lobjectiu del present treball va ser aiumlllar i provar lespecificitat duna segraverie de fags de
Salmonella spp a partir daiguumles residuals per a aixograve es van utilitzar mostres daigua recollides
de diferents localitats de lagraverea metropolitana de Monterrey N L Megravexic La purificacioacute de fags
es va dur a terme mitjanccedilant la tegravecnica dagar doble capa (ADC) fins a obtenir plaques liacutetiques
uniformes i es van usar diferents soques de referegravencia de Salmonella com a cultius indicadors
Es van aiumlllar un total de 15 fags possiblement diferents dels quals en passar les proves
de replicacioacute nomeacutes un va aconseguir mantenir la capacitat liacutetica Es va seleccionar i va
purificar per realitzar proves in vitro especiacutefiques per Salmonella Es va utilitzar una
concentracioacute de fags de 1x1012 UFPmL per analitzar fag mitjanccedilant la seva morfologia per
microscogravepia electrogravenica la qual es va identificar com a membre de la famiacutelia Siphoviridae Aixiacute
mateix es van provar els fags contra Salmonella in situ en discos dacer que simulen les
superfiacutecies de treball i per analitzar lefecte de la infeccioacute del fag sobre Salmonella en els
discos dacer inoxidable es va utilitzar el microscopi depifluorescegravencia
Per al recompte de fags es va utilitzar els megravetodes LIVE DEAD Per finalitzar per avaluar
lefectivitat del fag MRH6 que va resultar liacutetic en el nostre assaig es va procedir a donar les
condicions necessagraveria per a la formacioacute del biofilm de Salmonella sobre superfiacutecies dacer
inoxidable El fag MRH6 va ser capaccedil de disgregar els biofilms a temperatura ambient Les
majors reduccions de Salmonella en un menor temps es van obtenir amb concentracions de
fag majors a 1x107 UFP mL El megravetode de cultiu va mostrar reduccions del patogen a nivells
indetectables perograve la tincioacute vital revelar la presegravencia de cegravelmiddotlules viables (coloracioacute verda)
que podria representar un risc de contaminacioacute creuada aquestes poguessin tambeacute
presentar-se per la presegravencia de material orgagravenic Aquest treball amb un fag pot proporcionar
una mesura adjuvant per controlar la contaminacioacute de superfiacutecies dacer inoxidable amb
biofilms de Salmonella La DEM va resultar ser una bona eina per avaluar ragravepida i
adequadament per observacioacute i posterior anagravelisi lefecte dels fags
7
I INTRODUCCIOacuteN
Introduccioacuten
8
Introduccioacuten
9
Presentacioacuten del proyecto
Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica sobre las innovaciones en seguridad alimentaria en
Meacutexico la cual puso en evidencia la necesidad de analizar alternativas enmarcadas en el
aacutembito del uso de las tecnologiacuteas verdes lo que presentoacute la posibilidad de desarrollar un
trabajo innovador y que no se estuviera aplicando ya en el sector alimentario local o nacional
De esa manera se inician las actividades experimentales que para este trabajo doctoral se
dividieron en dos partes la primera realizada en Meacutexico y la segunda en Espantildea
En primera instancia se desarrolloacute un anaacutelisis en el Laboratorio de geneacutetica y biologiacutea
molecular del Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica (CINSP) en el Campus
Ciencias de la Salud de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) y gracias al apoyo
de Programa de mejoramiento del profesorado (PROMEP nuacutemero UANL-326) por medio de
una beca se iniciaron los estudios y asiacute se cumplioacute el primer propoacutesito que fue obtener virus
nativos contra cepas de Salmonella y purificarlos
Posteriormente para lograr los demaacutes objetivos que eran realizar la caracterizacioacuten parcial
de los fagos contra Salmonella se solicitoacute una beca a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten
Internacional para el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y
de Cooperacioacuten curso 2010-2011) con el fin de realizar una estancia de investigacioacuten y crear
oportunidades de desarrollo aprovechando las tecnologiacuteas innovadoras disponibles en la
Universitat Autoacutenoma de Barcelona (UAB) considerando ademaacutes que la alta reputacioacuten de la
institucioacuten y la supervisioacuten por parte de sus investigadores impactariacutean positivamente en el
desarrollo del trabajo y en el Curriculum Vitae del investigador y por consiguiente en su futuro
profesional como docente e investigador
Otra finalidad de este proyecto fue dejar un buen referente al concluir la estancia ya que
ello ofreceriacutea nuevas oportunidades para seguir forjando el perfil del investigador cimentaraacute
cualquier trayectoria profesional y facilitariacutea optar por un plan postdoctoral en esta misma
Universidad De esta manera se accedioacute a la beca del Programa Extranjeros II-A
Convocatoria 2010-2011 Nuacutemero 0000521211 del cual se cumplieron los objetivos
establecidos y otros maacutes por ejemplo conocer nuevas tecnologiacuteas
Siendo eacutesta una liacutenea de investigacioacuten relativamente reciente en Meacutexico se espera que
impacte en las posibilidades laborales en diversos contextos y seacutea de utilidad para sentar
precedentes para futuras liacuteneas de trabajo en dicha aacuterea
Introduccioacuten
10
Justificacioacuten
En las uacuteltimas deacutecadas los cambios ocurridos en la produccioacuten y consumo de alimentos
han tenido un impacto sobre la inocuidad alimentaria La industria en la produccioacuten masiva de
alimentos ha evolucionado de ser local a constituirse en otra donde la produccioacuten yo el
procesamiento estaacuten localizados en diferentes partes del paiacutes o del mundo Por otra parte la
poblacioacuten estaacute envejeciendo por lo que se vuelve maacutes vulnerable a problemas de salud
ademaacutes los agentes patoacutegenos son cada vez maacutes virulentos (DeWaal y Barlow 2014)
Los reportes sobre problemas gastrointestinales que recopila el Centro Nacional de
Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades (CENAVECE) indican que Nuevo
Leoacuten ha permanecido dentro de los primeros 12 lugares de casos de fiebre tifoidea y en los
primeros 14 de fiebre paratifoidea y otras salmonelosis A nivel nacional las enfermedades
infecciosas intestinales se ubican entre las primeras 10 causas de mortalidad de nintildeos en
edad escolar entre los 5 y 14 antildeos de edad (CENAVECE 2007)
Los microorganismos del geacutenero Salmonella pertenecen a la familia Enterobacteriaceae
Son bacilos o cilindros con puntas redondeadas y se diferencian de las demaacutes enterobacterias
mediante reacciones bioquiacutemicas y de aglutinacioacuten existen maacutes de 2500 serotipos todos
ellos patoacutegenos Actualmente se considera una sola especie denominada Salmonella
enterica de la cual seguacuten el esquema de Kauffmann-White se clasifican nueve serogrupos
Esta especie tiene importancia cliacutenica debido a que es la uacutenica capaz de infectar animales
homeotermos esta investigacioacuten se centra en cuatro serovariedades Salmonella enterica
serovar Typhimurium (S Typhimurium) S enterica serovar Paratyphi (S Paratyphi) S
enterica serovar Enteritidis (S Enteritidis) y S enterica serovar Typhi (S Typhi) estos
microorganismos se pueden aislar tanto de fuentes alimentarias (carne de res pollo crudo
huevo fresco carne de puerco almejas chorizos vegetales entre otros) como del medio
ambiente (suelo agua materia fecal y superficies) (Chlebicz y Śliżewska 2018 Nguendo
2018)
En Meacutexico S Enteritidis y S Typhimurium son los microorganismos aislados con mayor
frecuencia en las salmonelosis Normalmente S Enteritidis habita en el intestino de los
animales sin causar enfermedad pero puede infectar a humanos y promover diarrea voacutemito
dolor abdominal calambres y ocasionalmente insuficiencia renal y en los peores casos la
muerte (DeWaal y Barlow 2014) La contaminacioacuten de alimentos por Salmonella spp se debe
Introduccioacuten
11
a una combinacioacuten de factores relacionados con la produccioacuten a gran escala o cambios en el
manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los mismos (Uribe y Suarez 2006)
Por otra parte estaacuten los virus que pueden replicarse independientemente de los
cromosomas de una ceacutelula pero no sin su participacioacuten (Madigan y Martinko 2006) El hecho
de descubrir virus que pueden infectar y destruir bacterias fue recibido con optimismo por su
posible aplicacioacuten en usos terapeacuteuticos (McLaughlin et al 2006)
En un estudio realizado en diversos estados de Meacutexico (Coahuila Durango Estado de
Meacutexico Jalisco Morelos Oaxaca Puebla y Quereacutetaro) se ha fagotipado Salmonella spp
proveniente de huevo carne de pollo de engorde y gallinas progenitoras reproductoras de
postura comercial y productoras (Mancera et al 2004) Ademaacutes diversas investigaciones han
utilizado fagos liacuteticos para reducir la contaminacioacuten por Salmonella en pollos (canal y piel)
semillas germinadas y dulces de frutas cortadas (Goode et al 2003)
El uso de aditivos en los alimentos se ha reducido considerablemente debido al rechazo
generalizado por parte de los consumidores lo que podriacutea repercutir en un incremento en los
casos de intoxicaciones alimentarias En este contexto los fagos aportan ventajas sobre los
desinfectantes conocidos y los meacutetodos tradicionales de aplicacioacuten de friacuteo o calor ya que
pueden actuar como agentes de deteccioacuten y control bioloacutegico de bacterias patoacutegenas en
alimentos y su produccioacuten es relativamente raacutepida y econoacutemica (Atterbury et al 2003)
La utilidad de los fagos en el aacuterea de investigacioacuten es amplia una posible utilidad es ser
un instrumento para identificar cepas bacterianas especiacuteficas Tambieacuten se han utilizado para
el estudio de diversos fenoacutemenos moleculares el trabajo con estos virus permitioacute desarrollar
ensayos de placas de lisis conocer la naturaleza del ciclo de vida viral los tipos de mutaciones
geneacuteticas y los genes como segmentos de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) (Muniesa et al
2005)
Las empresas dedicadas a la biotecnologiacutea (Intralytix Omnilytics) se centran en desarrollar
productos utilizando fagos especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan las ETA y estos
productos comerciales de terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones
(Segundo 2010) Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos antildeos debido a sus
caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutefico sin dantildear la microbiota
en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros distribucioacuten de
Introduccioacuten
12
esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla (Oh y Park
2017)
En este sentido el objetivo general de este estudio es el aislamiento y caracterizarizacion
de fagos contra Salmonella a partir de diversas fuentes para su uso potencial en el control
bioloacutegico
13
II ANTECEDENTES
Antecedentes
14
Antecedentes
15
A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos
A nivel internacional la produccioacuten de alimentos y todos los mecanismos tecnoloacutegicos
involucrados en su procesamiento implican ademaacutes de la optimizacioacuten de los tiempos y de
la calidad un riesgo para la adquisicioacuten de enfermedades inherentes a la misma adopcioacuten
de nuevas tecnologiacuteas (Weaver et al 2017)
La OMS (2017) estima que las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de
muerte de nintildeos menores de cinco antildeos matan a 525000 nintildeos menores de cinco antildeos
cada antildeo una proporcioacuten significativa de las enfermedades diarreicas se puede prevenir
mediante el acceso al agua potable y a servicios adecuados de saneamiento e higiene
ademaacutes de que en todo el mundo se producen unos 1700 millones de casos de
enfermedades diarreicas infantiles cada antildeo
Seguacuten la OMS (2017) existen diferentes condiciones que propician el desarrollo de las
ETA Como son las de tipo bioloacutegico producidos por hongos o bacterias causantes de
enfermedades ya sea por sus metabolitos o toxinas virus o huevecillos de paraacutesitos asiacute
como los venenos de algunos peces y plantas Las de tipo quiacutemico como productos de
limpieza o desinfeccioacuten pesticidas toxinas marinas insecticidas o venenos y fiacutesicos cuando
en la materia prima de los alimentos se encuentran objetos como vidrios metal piedras
grapas barniz de untildeas joyeriacutea cabellos o cualquier elemento extrantildeo
De acuerdo con el Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos (SIRVETA) ndashdesarrollado por el Instituto
Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y Zoonosis (PANALIMENTOS)ndash ocurrieron 1683
brotes de ETA en Meacutexico que ocasionaron 53860 casos de enfermedades y provocaron
207 muertes mientras que en los demaacutes paiacuteses de Ameacuterica Latina se produjeron durante el
mismo periacuteodo 6324 brotes que provocaron 228579 casos y 314 muertes (Forsythe y
Hayes 2002) Cabe aclarar que eacutestos son soacutelo los brotes notificados por la autoridad
competente El sistema utilizado internacionalmente para obtener alimentos inocuos es el
APPCC (Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control) o HACCP (por sus siglas en ingleacutes
Hazard Analysis and Critical Control Points) que se puede implementar en cualquier tipo de
industria y permite prevenir controlar y eliminar cualquier peligro antes de consumir los
alimentos (Rodriacuteguez Torrens et al 2015)
En Meacutexico el Distintivo H es un programa implementado por los servicios alimentarios
Antecedentes
16
oficiales mediante el cual se ofrece a los clientes alimentos seguros El Centro Nacional de
Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades de Meacutexico (CENAVECE) advierte
que uno de los problemas de salud maacutes importantes lo constituyen los trastornos
gastrointestinales cuya mortalidad predomina entre los 5 y los 14 antildeos Entre 2006 y 2012
el Estado de Nuevo Leoacuten ha permanecido entre los primeros 7 lugares de casos de diarrea
(CENAVECE 2018)
La figura 1 muestra la distribucioacuten de la incidencia en Meacutexico la cual estaacute asociada a la
densidad demograacutefica y la accesibilidad a servicios de salud que facilitan el registro es asiacute
que son precisamente las entidades federativas con mayor poblacioacuten quienes registran
nuacutemeros maacutes altos
Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa en
Meacutexico 2010-2012 (CENAVECE 2018)
A1 Problemaacutetica
La inocuidad alimentaria es una preocupacioacuten mundial que se refleja en el incremento
de reportes y noticias relacionadas con la contaminacioacuten de los alimentos difundidos en
diversos paiacuteses a su vez estos productos son retirados del mercado lo que provoca
peacuterdidas por varios cientos de millones de doacutelares El Codex Alimentarius indica que las ETA
y los dantildeos provocados por los alimentos son en el mejor de los casos desagradables y
Antecedentes
17
en el peor fatales y pueden influir negativamente en el comercio y la confianza de los
consumidores Por consiguiente es imprescindible un control eficaz de la higiene Todos los
eslabones de la cadena alimentaria ndashfabricantes elaboradores manipuladores y
consumidores de alimentosndash son responsables del control de los riesgos microbioloacutegicos
desde la explotacioacuten agriacutecola o ganadera hasta el consumidor final Desde esta oacuteptica el
anaacutelisis de riesgos deberiacutea aplicarse dentro de un contexto estrateacutegico organizativo y
operacional reconocido si bien en el proceso puede haber elementos comunes establecer
un nivel apropiado de proteccioacuten en esos sectores puede representar las maacuteximas
diferencias (Atterbury et al 2003)
La OMS ha identificado siete microorganismos patoacutegenos ndashC jejuni C perfringens E
coli 0157H7 L monocytogenes Salmonella spp S aureus y T gondiindash que causan entre
123 y 33 millones de casos de infeccioacuten solamente en los EE UU lo que representa
peacuterdidas econoacutemicas de entre 5500 y 34900 millones de doacutelares Ademaacutes resalta que su
incidencia podriacutea ser de 300 a 350 veces mayor de lo que indican las estadiacutesticas dado que
soacutelo se notifica un nuacutemero relativamente pequentildeo de casos de ETA Se estima que 70 de
los 1500 millones de episodios de diarrea son causados por alimentos en mal estado Es
posible que en los paiacuteses en desarrollo se notifique a las autoridades sanitarias una
proporcioacuten de casos auacuten inferior principalmente por pobreza y escasez de recursos a
disposicioacuten de los servicios de gestioacuten de la inocuidad alimentaria e inspeccioacuten de alimentos
(Van de Venter 2000)
A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea
La OMS estima que el 88 de los casos de diarrea a nivel mundial son atribuibles al
agua el saneamiento y la higiene todos los aspectos de inocuidad de los alimentos estaacuten
relacionados con estos factores En menor medida la enfermedad se transmite a traveacutes de
otras viacuteas por ejemplo el aire y alrededor del 94 de los casos son atribuibles al
saneamiento ambiental el total de fallecimientos se calcula en maacutes de 15 millones
principalmente en nintildeos en los paiacuteses desarrollados el promedio es ligeramente menor a
90 La diarrea atribuible al agua y saneamiento inapropiado representa 53 de las
muertes totales y 35 en nintildeos europeos de 0-14 antildeos y es ademaacutes una de las causas
principales de malnutricioacuten (Pruumlss-Uumlstuumln y Corvalaacuten 2006)
Antecedentes
18
Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud puacuteblica en el mundo
especialmente en paiacuteses en desarrollo Su alta incidencia se debe en gran parte a la
ingestioacuten de alimentos contaminados con microorganismos patoacutegenos como Salmonella
que causa episodios de diarrea aguda Salmonella spp es uno de los patoacutegenos enteacutericos
maacutes frecuentes tanto en paiacuteses desarrollados como subdesarrollados Dependiendo de la
especie tamantildeo del inoacuteculo factores de virulencia expresados por la cepa hueacutesped
involucrado estado inmunoloacutegico del paciente e intervencioacuten meacutedica puede ocasionar una
infeccioacuten gastrointestinal de media a severa hasta una infeccioacuten sistemaacutetica que
comprometa la vida del paciente (Fernaacutendez 2008)
Otros microorganismos que tambieacuten pueden contaminar el agua y los alimentos como
bacterias (Bacillus cereus Clostridium botulinum Campylobacter jejuni Vibrio cholera) virus
(Norwalk Rotavirus Hepatitis A) y paraacutesitos (Entamoeba histolytica Cryptosporidium
parvum Toxoplasma gondii) pueden transmitirse tambieacuten de una persona a otra como
resultado de una higiene deficiente (Freedman et al 2015)
Estudios de empresas dedicadas exclusivamente a la crianza de cerdos reportan
epidemias como el virus de la diarrea porcina la cual posteriormente se transmite a los
consumidores de estas carnes contaminadas ya sea por contacto con las heces o por
consumo de carnes contaminadas lo cual implica tambieacuten una peacuterdida econoacutemica para la
industria alimentaria resaltando la necesidad de establecer medidas preventivas y
correctivas seguacuten sea el caso (Huss et al 2017)
Seguacuten la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO
por sus siglas en ingleacutes Food and Agriculture Organization) las toxiinfecciones alimentarias
son la segunda causa de morbilidad pero muchas permanecen sin declarar quizaacutes por su
mediana severidad y recuperacioacuten raacutepida salvo el coacutelera Los alimentos son susceptibles a
contaminacioacuten de todo tipo la fuente de agentes causales suele ser el tracto gastrointestinal
de individuos reservorios o las heces de animales y humanos infectados o bien agua
corrompida que por deficiencias sanitarias contamina carne fresca pescados moluscos
pasteles de crema y leche no pasteurizada entre otros productos (Riacuteos et al 2012) como
se puede observar en la tabla 1
Antecedentes
19
Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias (Riacuteos et al 2012)
Agente Periacuteodo de
incubacioacuten Fuente Agente patoacutegeno
Salmonella spp 8-24 h Aves huevos mascotas
(tortugas lagartos pollos) Bacteria y endotoxina
E coli
enterotoxigeacutenica 24-72 h
Agua y alimentos
contaminados
Enterotoxina
termoestable
V cholerae 24-72 h Alimentos contaminados Enterotoxina termolaacutebil
Shigella spp 24-72 h Agua y alimentos
contaminados Bacteria y endotoxina
C jejuni 1-7 d Leche aves de corral y
agua no potable
Bacteria y Enterotoxina
termolaacutebil
Yersinia spp 1-7 d Carne de cerdo leche Bacteria y Enterotoxina
B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria
La historia referente a las toxiinfecciones alimentarias se comienza a documentar y
legislar en el siglo X con el botulismo en Bizanzio y documentos sobre el ergotismo en el
siglo XVI En el siglo XIX aparecen los alimentos enlatados y Louis Pasteur asocia el
deterioro de los alimentos con las bacterias En el siglo XX se produce un desarrollo
espectacular de la microbiologiacutea de los alimentos con el establecimiento de la etiologiacutea de
las toxiinfecciones alimentarias el comienzo de una nueva era de la quiacutemica e ingenieriacutea
alimentaria Aunado a los movimientos migratorios de las personas la diversificacioacuten de
alimentos la produccioacuten masiva de alimentos y la facilidad de transporte desde puntos
lejanos entre la produccioacuten y preferencia en el consumo de alimentos aunadas a la
capacidad que tienen los microorganismos para evolucionar y adaptarse a su medio
ambiente hacen pensar en estos microorganismos como patoacutegenos emergentes (DeWaal y
Barlow 2014)
B1 Escherichia
Las cepas de E coli se pueden diferenciar seroloacutegicamente por los antiacutegenos somaacuteticos
(O) flagelares (H) y capsulares (K) Ademaacutes pueden hallarse fimbrias y estructuras
Antecedentes
20
emparentadas que desempentildean un papel en la patogenia Actualmente se reconocen cinco
grupos de E coli causantes de diarrea en funcioacuten del siacutendrome que provocan cuyas
diferencias estaacuten codificadas por plaacutesmidos (Wright et al 2017) Los diferentes tipos son
E coli enteropatoacutegeno (EPEC) es responsable de la diarrea acuosa en lactantes
Produce voacutemitos fiebre y diarrea acuosa con mocos pero sin sangre Coloniza las
microvellosidades de todo el intestino produciendo la lesioacuten de ldquoadhesioacuten y erosioacutenrdquo en
el ribete en cepillo de la membrana de la vellosidad Afecta a adultos y nintildeos menores de
dos antildeos siendo este rango de edad el principal factor de riesgo
E coli enterotoxigeacutenico (ETEC) es el causante de la llamada vulgarmente ldquodiarrea
del viajerordquo se manifiesta con diarrea acuosa como agua de arroz y poca fiebre
Coloniza la porcioacuten proximal del intestino delgado Afecta a adultos y nintildeos son una causa
frecuente de diarrea en lactantes de paiacuteses en desarrollo asiacute como la causa maacutes comuacuten
de diarrea en individuos de paiacuteses industrializados que viajan a zonas menos
desarrolladas del mundo
E coli enteroinvasor (EIEC) coloniza el colon origina fiebre y diarrea profusa con
heces que contienen mocos y estriacuteas sanguinolentas Presenta un plaacutesmido de 120-140
mD conocido como plaacutesmido invasivo que lleva todos los genes necesarios para la
virulencia Al igual que ETEC pero afecta principalmente a adultos
E coli enterohemorraacutegico (EHEC) origina diarrea sanguinolenta colitis hemorraacutegica
siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico (SUH o SHU) y puacuterpura trombocitopeacutenica En este grupo se
incluye E coli verotoxigeacutenico (VTEC) serotipos O157 O26 O111 Afecta principalmente
a nintildeos el principal factor de riesgo es el consumo de carne sin la coccioacuten adecuada
E coli enteroagregativo (EAggEC) posee caraacutecter clonal diferenciaacutendose dos clones
relacionados (1 y 2) Dentro de cada grupo estaacute presente una variedad concreta de
antiacutegenos O mientras que los antiacutegenos H se conservan
En los reportes cientiacuteficos sobre E coli se refieren a las plantas como otra fuente de
infeccioacuten especiacuteficamente en la espinaca (Spinacia oleracea) y lechuga (Lactuca sativa) Se
recomienda igualmente estudiar profundamente los cultivos y los tejidos vegetables y
animales ya que se deben considerar como paraacutemetros de riesgo para la inocuidad de los
alimentos (Fernaacutendez Ferran et al 2003 Wright et al 2017)
B2 Campylobacter
Campylobacter spp es un bacilo delgado gram negativo (05-08 microm x 02-05 microm) y
Antecedentes
21
microaeroacutefilo (necesita 3-5 de O2 y 2-10 de CO2) Su morfologiacutea puede variar entre
vibrioacutenica (bacilos curvados) espirilar en forma de rosquilla de S y cocoide de tal forma
que en fase logariacutetmica de crecimiento las ceacutelulas tienen forma espiral o curvada pero a
medida que los cultivos envejecen adquieren formas esfeacutericas Moacutevil con un uacutenico flagelo
polar que presenta de dos a tres veces el largo de la ceacutelula Aunque hay diversas especies
de Campylobacter causantes de enfermedades C jejuni C coli y C lari son las especies
que se aiacuteslan con mayor frecuencia en casos de gastroenteritis humana siendo C jejuni la
responsable de la mayoriacutea de las toxiinfecciones alimentarias 89-93 de las
toxiintoxicaciones (OMS 2017)
Las especies C coli y C lari son semejantes a C jejuni su diferencia se basa en pruebas
bioquiacutemicas C coli no es capaz de hidrolizar el piruvato y C lari es capaz de crecer en
presencia de 30 microgramos de aacutecido nalidiacutexico (Haddad et al 2013) La movilidad la
quimiotaxis y los flagelos son factores importantes en la virulencia pues de ellos depende la
colonizacioacuten del epitelio intestinal Campylobacter produce una enterotoxina parecida a la
toxina coleacuterica que tambieacuten juega un papel importante en la patogenia (Nichols 2005) C
jejuni puede sobrevivir de 2 a 4 semanas en condiciones de baja humedad oxigenacioacuten y
temperaturas de 4ordmC superando muchas veces el tiempo de vida uacutetil del producto Asimismo
puede perdurar de 2 a 5 meses a -20ordmC pero a temperatura ambiente apenas dura algunos
diacuteas (Khan et al 2013)
C jejuni y C coli son sensibles a diversos agentes antimicrobianos como los macroacutelidos
los aminoglucoacutesidos el cloranfenicol y la tetraciclina La eritromicina ha sido el antibioacutetico de
eleccioacuten para tratar las infecciones del tracto intestinal Al igual que en Salmonella el control
de Campylobacter se debe realizar tanto en el sector agropecuario como en los
establecimientos alimentarios por lo que los controles especificados para Salmonella
podriacutean extrapolarse a este microorganismo Un aspecto importante de su control reside en
la refrigeracioacuten de las aves ya que la baja temperatura junto con la desecacioacuten superficial
que se produce reduce significativamente la incidencia y los recuentos de Campylobacter
viables incluso en canales altamente contaminadas (Fernaacutendez 2008)
B3 Enterobacter
Conocido antiguamente como Cronobacter spp incluye varias especies de patoacutegenos
emergentes relacionados con brotes de meningitis septicemia y enterocolitis necrotizante
especialmente en neonatos y nintildeos La tasa de mortalidad de estos brotes es alta entre 20
Antecedentes
22
y 80 y los supervivientes suelen sufrir severos desoacuterdenes neuroloacutegicos (Grimont y
Grimont 2006)
E sakazakii es un bacilo moacutevil no esporulado gram negativo que ha sido encontrado en
alimento para bebeacutes es maacutes resistente a los cambios osmoacuteticos y a la sequiacutea que otros
miembros de la familia Enterobacteriaceae y se asocia con casos esporaacutedicos de sepsis
meningitis cerebritis y enterocolitis necrotizante La mayoriacutea de las infecciones se observan
en bebeacutes con bajo peso al nacer y que son alimentados de forma insalubre La mortalidad
ha disminuido a menos de 20 en los uacuteltimos antildeos Este microorganismo no se ha
encontrado presente en la foacutermula laacutectea tampoco existe evidencia de la transmisioacuten de
persona a persona o un medio general de difusioacuten ambiental (Vanegas et al 2009)
B4 Listeria
L monocytogenes estaacute muy difundida en la naturaleza en la que suele adoptar un ciclo
saprofiacutetico en estrecha relacioacuten con el suelo Ademaacutes se ha encontrado en aguas
continentales sedimentos marinos material vegetal en descomposicioacuten forrajes heces
humanas y animales y aguas residuales de explotaciones animales entre otros ambientes
lo que explica su presencia en alimentos crudos Epidemioloacutegicamente se caracteriza por su
ubicuidad sobreviviendo en tierra huacutemeda hasta 500 diacuteas en funcioacuten de la temperatura En
heces o aguas residuales mantenidas a temperatura de refrigeracioacuten sobrevive maacutes de seis
antildeos este periodo se reduce si se mantiene a temperatura ambiente (Guenther et al 2009)
Listeria spp son bacilos gram positivos de forma regular y con forma de vara corta
Algunas veces pueden tener forma cocoide apareciendo como ceacutelulas individuales o en
cadenas cortas Son moacuteviles entre 20-25ordmC pero no a 37ordmC Existen seis especies de Listeria
descritas L monocytogenes L innocua L welshimeri L seeligeri L grayi y L ivanovii
subespecie ivanovii y subespecie londoniensis Las cepas patoacutegenas de L monocytogenes
producen la listeriolisina O responsable de la hemoacutelisis-β y de la destruccioacuten de las ceacutelulas
fagocitarias es una hemolisina que segrega la bacteria a causa de la disminucioacuten de pH
(Liu 2006)
L monocytogenes tolera y se multiplica en concentraciones altas de NaCl contando con
la posibilidad de sobrevivir durante un antildeo en ambientes con una concentracioacuten de 16 su
tolerancia aumenta al disminuir el pH o la temperatura del medio Los tratamientos para su
inactivacioacuten son de 617ordmC35min 70ordmC20min 78ordmC15min u 80ordmC5min favoreciendo su
Antecedentes
23
resistencia al calor con la presencia de grasas Se multiplica entre 0 y 4ordmC las temperaturas
bajas ejercen un efecto protector de tal manera que en condiciones de acidez su inactivacioacuten
es maacutes lenta en refrigeracioacuten que a temperatura ambiente (Leverentz et al 2003) La acidez
influye en la capacidad de Listeria para sobrevivir a la congelacioacuten (temperaturas inferiores
a -47ordmC) y almacenamiento a menos de -18ordmC en carne mostrando una disminucioacuten en la
recuperacioacuten de ceacutelulas viables que han sido dantildeadas por el friacuteo (Wu et al 2015)
B5 Salmonella
B51 Origen
Salmonella tiene su origen principal en el tracto intestinal de animales fundamentalmente
las aves y los porcinos y pueden acabar contaminando las carnes crudas el pollo crudo los
productos marinos crudos o el huevo Los brotes de Salmonella estaacuten asociados al consumo
de alimentos elaborados con huevo crudo y siguen siendo frecuentes a pesar de conocerse
el riesgo que representa su consumo de las medidas legales adoptadas y de los programas
de educacioacuten sanitaria dirigidos a disminuir su incidencia Este geacutenero pertenece a la familia
Enterobacteriaceae fue descrito a principios del siglo XX por el bacterioacutelogo estadounidense
Theobald Smith (Zaidi et al 2006) En la figura 2 se muestran los factores de virulencia y
en la figura 3 se presenta la clasificacioacuten de Salmonella enterica con las diferentes
subespecies y serovares que se aiacuteslan maacutes frecuentemente
Antecedentes
24
Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por
Salmonella spp (Brenner et al 2000)
Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella (Brenner et al 2000)
Antecedentes
25
B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp
La mayoriacutea de los miembros de este geacutenero se encuentra en el tracto intestinal del
hombre y los animales como bacterias patoacutegenas o comensales Estaacute integrado por bacilos
gram negativos anaerobios facultativos y no esporulados La mayor parte de los serotipos
conocidos son moacuteviles mediante flagelos peritricos Se conocen maacutes de 2460 serotipos
muchos de ellos patoacutegenos para el ser humano (Chlebicz y Śliżewska 2018)
Son bacterias invasoras enterotoxigeacutenicas y estaacuten ampliamente diseminadas en todo el
mundo su temperatura ideal de sobrevivencia entre los 15 y los 35degC (mesoacutefilas) y en una
amplitud de pH de 45 a 9 Los microorganismos de este geacutenero se distribuyen en seis
grupos se han definido mediante biotipado hibridacioacuten DNA-DNA anaacutelisis de la secuencia
del RNA ribosomal 16S y por ldquomultilocus enzyme electrophoresisrdquo (MLEE) (Brenner et al
2000) La serotipificacioacuten se utiliza para diferenciar maacutes allaacute del nivel de subespecie como
puede observarse en la tabla 2
Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos (Brenner et al 2000)
Grupo Microorganismo
A S Paratyphi Al
B S Typhimurium S Bredeney
C1 S Choleraesuis S Montevideo S Oranienburg
C2 S Newport
D S Typhi S Enteritidis S Dublin S Gallinarum
E S Butantan S Anatum S Give
Salmonella serotipo Typhi es la causante de la fiebre tifoidea presentando siacutentomas como
son fiebre de intensidad variable cefalea diarrea estrentildeimiento tos naacuteuseas y voacutemitos
anorexia dolor abdominal y escalofriacuteos Mientras que los demaacutes serotipos considerados no
tifoidicos presentan un estado asintomaacutetico En el antildeo 2000 los serotipos aislados con
mayor frecuencia en EE UU fueron S Typhimurium S Enteritidis y S Newport (Dunkley et
Antecedentes
26
al 2009) En Meacutexico los serotipos de Salmonella spp identificados con mayor frecuencia
en los servicios de salud fueron S Typhimurium (204) y S Enteritidis (183) (Guenther
et al 2009)
La salmonelosis se produce por la ingestioacuten de alimentos o bebidas contaminados por
Salmonella se manifiesta como una enterocolitis aguda y se caracteriza por presentar
siacutendromes febriles asociados a manifestaciones gastrointestinales o sisteacutemicas con
frecuencia severas (Figueroa y Verdugo 2005 Fernaacutendez 2008) El cuadro cliacutenico se
localiza baacutesicamente en el iacuteleo terminal y el intestino grueso La enfermedad se manifiesta
a traveacutes de diferentes fases En la primera fase la infeccioacuten se limita a la mucosa intestinal
en la siguiente la bacteria invade el tejido linfaacutetico local y le sigue una fase de bacteriemia
durante la cual la mayoriacutea de las bacterias son fagocitadas por macroacutefagos del hiacutegado y el
bazo (Calva et al 2006 Bettini et al 2012)
Con frecuencia el meacutedico hace un diagnoacutestico basaacutendose en el cuadro cliacutenico del
paciente pero sin contar con los estudios microbioloacutegicos necesarios para establecer un
diagnoacutestico certero cuando se presenta infeccioacuten por Salmonella inicia una fase de
crecimiento bacteriano intracelular el cual despueacutes de varios diacuteas provoca la liberacioacuten de
gran cantidad de patoacutegenos al torrente sanguiacuteneo (Zaidi et al 2006)
La salmonelosis es una enfermedad aguda de distribucioacuten mundial Afecta a todos los
grupos de edad con mayor incidencia en los extremos de la vida provocando infecciones
en forma endeacutemica o en brotes epideacutemicos de intoxicacioacuten alimentaria que en ocasiones
abarcan amplias zonas geograacuteficas debido a las extensas cadenas de distribucioacuten de
alimentos existentes hoy en diacutea (Fernaacutendez 2008)
Para la salud puacuteblica la salmonelosis tiene un impacto socioeconoacutemico tanto en los paiacuteses
en desarrollo como en los paiacuteses desarrollados Ademaacutes al no recibir tratamiento puede
ser causante del siacutendrome de Reiter el cual se manifiesta por dolor en articulaciones
irritacioacuten en los ojos dolor al orinar y puede durar meses o antildeos desencadenaacutendose una
artritis croacutenica (CFSPH 2005) Desde la deacutecada de los ochenta la incidencia de
salmonelosis de origen alimentario ha aumentado considerablemente en Meacutexico Este
incremento es resultado de una combinacioacuten de factores como la calidad del agua utilizada
para riego y el manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los alimentos (Zaidi
et al 2006)
Antecedentes
27
Un meta-anaacutelisis (revisioacuten sistemaacutetica en la cual se combinan matemaacuteticamente los
resultados de varios estudios para contestar una misma pregunta) realizado recientemente
confirma que Salmonella resiste a antibioacuteticos empleados en los alimentos de origen animal
ya que pueden estar contaminados con este microorganismo es resistente a 3 antibioacuteticos
como la amoxicilina las sulfonamidas y las tetraciclinas ya que son ampliamente usados en
produccioacuten animal (Ejo et al 2016)
B53 Manifestaciones cliacutenicas
El cuadro cliacutenico normalmente es de 2 a 5 diacuteas aunque en ocasiones persiste varias
semanas La gravedad de los siacutentomas variacutea considerablemente siendo mayor en nintildeos y
ancianos Si el microorganismo pasa desde el intestino a la corriente sanguiacutenea y llega a
otras partes del cuerpo puede ocasionar la muerte si la persona afectada no es tratada
raacutepidamente La mayoriacutea de las muertes causadas por esta bacteria han ocurrido entre
ancianos que viven en residencias La tasa de mortalidad es baja inferior a 1 en paiacuteses
desarrollados pero suelen producirse de 40-50 muertes al antildeo especialmente entre nintildeos
ancianos o personas inmunodeprimidas Las excretas de los enfermos contienen gran
cantidad de la especie de Salmonella implicada al comienzo de la enfermedad la cifra inicial
decrece seguacuten transcurre el tiempo (DeWaal y Barlow 2014)
El estado de portador se refiere a la condicioacuten en que las personas curadas pueden
eliminar Salmonella en sus heces durante meses La mitad de los individuos afectados
excretan este patoacutegeno de 2-4 semanas posteriores a su curacioacuten cliacutenica entre 10 y 20
continuacutean durante 4-8 semanas unos pocos durante 3 meses y en raras ocasiones se
prolonga hasta 6 meses El microorganismo puede eliminarse tambieacuten por la orina La dosis
infectante capaz de desencadenar la salmonelosis humana es alrededor de 1times105 UFCmL
dependiendo de factores como tipo de alimento virulencia de la cepa involucrada y
susceptibilidad del individuo Entre las especies altamente virales se encuentran la S Dublin
y sobre todo S Enteritidis (Callaway et al 2008)
El incremento del serotipo de S Enteritidis en los casos de salmonelosis humana al
contrario de otras del geacutenero Salmonella representa un importante problema de salud
puacuteblica en muchos paiacuteses ya que este serotipo infecta a gallinas aparentemente sanas que
posteriormente transmiten las enfermedades al hombre Si se consumen huevos crudos o
Antecedentes
28
poco cocidos el microorganismo podriacutea causar la enfermedad El nuacutemero de casos de
salmonelosis se incrementa durante el verano (Parra et al 2002 Callaway et al 2008
Fernaacutendez 2008)
B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis
Gran parte de las salmonelosis se deben al consumo de alimentos de origen animal
(carnes de abasto pollo mariscos pescado leche y huevos asiacute como ovoproductos y
productos laacutecteos no pasteurizados) o de origen vegetal que se contaminan con productos
en malas condiciones de salubridad o mal manipulados Muchos alimentos sobre todo los
de origen animal o contaminados con aguas residuales han servido como vehiacuteculos en
brotes de salmonelosis La carne de matadero estaacute contaminada habitualmente con
Salmonella su incidencia es mayor en las canales de ganado y otros animales debido por
ejemplo a la contaminacioacuten por el contenido intestinal de la res viva cuyas heces manchan
su piel pelo y patas al llegar al matadero Las canales de cerdo se contaminan durante las
operaciones de escaldado y pelado La contaminacioacuten entre las mismas canales y de eacutestas
a utensilios superficies de trabajo y manos de los que las manipulan es faacutecil Otro de los
principales reservorios de Salmonella es la carne de aves de corral La contaminacioacuten de las
canales de pollo y otras aves procede igualmente del tracto intestinal o del material fecal
de los animales que manchan sus patas y plumas Las etapas criacuteticas de la contaminacioacuten
de las canales aviares estaacuten en el desplumado y la evisceracioacuten tambieacuten es comuacuten la
contaminacioacuten cruzada a traveacutes de las manos de los operarios equipo y utensilios utilizados
en la preparacioacuten y troceado de las canales (Marcus et al 2004)
Son raras las salmonelosis adquiridas directamente de carnes bien cocinadas la mayoriacutea
de los brotes se deben a una coccioacuten insuficiente o por contaminacioacuten posterior a su
preparacioacuten Las carnes elaboradas mediante fermentacioacuten (salami chorizo y salchichoacuten)
pueden ser causa de brotes de salmonelosis teniendo en cuenta que las especies que
integran este geacutenero pueden sobrevivir al proceso de fermentacioacuten (Forsythe y Hayes
2002)
Como se mencionoacute anteriormente otro alimento que se asocia con frecuencia a
Salmonella es el huevo La contaminacioacuten se produce por dos viacuteas a traveacutes de la caacutescara
contaminada y por viacutea transovaacuterica en aves infectadas (gallina pata pava) En el primer
caso la superficie de la caacutescara se contamina siempre a su paso por la cloaca o cuando el
Antecedentes
29
huevo estaacute en un ambiente fecal los huevos rotos o manchados constituyen un peligro en
la propagacioacuten de especies de Salmonella (EFSA 2014)
La contaminacioacuten partiendo de la caacutescara se produce si eacutesta mantiene un grado de
humedad apropiado y existe una temperatura diferencial significativa entre el contenido del
huevo y el ambiente La diferencia de temperaturas entre el huevo maacutes elevada y el
ambiente favorece la absorcioacuten de los microorganismos como Salmonella Tambieacuten se
transmite sobre la caacutescara por contaminacioacuten cruzada a traveacutes de los manipuladores que
han tenido contacto con superficies infectadas durante el transporte y almacenamiento de
los mismos en lugares con precarias condiciones de higiene (Ejo et al 2016) Salmonella
es causal de graves enfermedades que son trasmitidas por productos derivados de huevo
contaminado y la asociacioacuten entre la infeccioacuten del tracto reproductivo de los pollos fue un
fuerte incentivo para desarrollar programas de prevencioacuten (Jawale y Lee 2014)
La leche cruda puede albergar Salmonella y ser causa de brotes de salmonelosis se
contamina a traveacutes del pezoacuten y por las manos del ordentildeador la pasteurizacioacuten elimina la
presencia de la bacteria Entre los productos laacutecteos se han identificado como causa de
brotes de salmonelosis la leche en polvo el queso los helados y maacutes raramente la
mantequilla todos ellos por fallos en su elaboracioacuten Salmonella se destruye o inactiva
durante la fermentacioacuten de alta acidez como el yogur y el queso de pH inferior a 45 En el
caso del queso poco aacutecido (pH superior a 49) la Salmonella puede desarrollarse en
cualquier etapa de su elaboracioacuten (Mastroeni y Maskell 2006)
Entre las verduras cualquiera puede contener Salmonella cuando se cultivan con aguas
residuales contaminadas o son fertilizadas con abonos de origen animal Algunos vegetales
como los berros han sido causa de brotes de salmonelosis Por otro lado los mariscos se
contaminan con Salmonella cuando se criacutean en aguas residuales contaminadas por lo que
han sido la causa de numerosos brotes en todo el mundo la depuracioacuten es la medida
preventiva adecuada Diferentes alimentos se han identificado como portadores de
Salmonella entre ellos coco cebada harina de cereales pimienta blanca y negra pasta
cacao en polvo y chocolate (Fernaacutendez 2008) La FDA (2017) reportoacute el aumento de las
pruebas de las cuales ha identificado papayas de dos granjas que resultaron positivas para
las cepas de Salmonella que coinciden con enfermedades no relacionadas con este brote
Antecedentes
30
C Crecimiento microbiano
El crecimiento microbiano puede definirse como un incremento en los constituyentes
celulares que ocasiona un aumento del nuacutemero de ceacutelulas de los microorganismos que se
multiplican por gemacioacuten y fisioacuten binaria En el uacuteltimo caso las ceacutelulas individuales se
agrandan y dividen para originar dos ceacutelulas hijas de un tamantildeo aproximadamente igual
(Atlas y Bartha 2002)
C1 Crecimiento de los microorganismos
Todos los mamiacuteferos incluyendo los seres humanos se adaptan a la vida del mundo
microbiano Louis Pasteur Robert Koch Eacutelie Metchnikoff y Theodor Escherich entre otros
investigadores sentaron las bases conceptuales sobre las interacciones microbio-hueacutesped
Pasteur postuloacute que los microbios eran necesarios para la vida humana y Metchnikoff afirmoacute
que la composicioacuten de la flora microbiana era esencial para el bienestar del hueacutesped
Igualmente Escherich estaba convencido de que el conocimiento preciso de la flora
endoacutegena era esencial no soacutelo para la comprensioacuten de la fisiologiacutea de la digestioacuten sino para
la comprensioacuten de la patologiacutea y terapia de enfermedades microbianas intestinales A pesar
de estas primeras ideas soacutelo recientemente los cientiacuteficos han desarrollado meacutetodos que
permiten caracterizar directamente los mecanismos moleculares que subyacen a la creacioacuten
y mantenimiento de diversos ecosistemas microbianos (Falk et al1998)
El crecimiento de una poblacioacuten bacteriana resulta de la suma de ciclos celulares de todos
sus individuos y suele ser asincroacutenico puesto que cada microorganismo se encuentra en un
punto diferente del ciclo celular Por consiguiente en un momento determinado en una
poblacioacuten se encuentran ceacutelulas que acaban de dividirse otras estaacuten replicando su ADN y
elongaacutendose y otras estaacuten iniciando la divisioacuten celular (Melbinger et al 2015)
El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza en la mayoriacutea de los
casos mediante la produccioacuten de colonias aisladas en cultivos soacutelidos El crecimiento
explosivo de las bacterias produce un gran nuacutemero a partir de una uacutenica ceacutelula inicial de
forma que tras un periacuteodo de tiempo de incubacioacuten en las condiciones ambientales
adecuadas se produce una colonia de individuos iguales Para que un microorganismo
crezca necesita nutrientes que le aporten energiacutea y elementos quiacutemicos para la siacutentesis de
sus constituyentes celulares De acuerdo a la fuente de carbono que utilizan los
Antecedentes
31
microorganismos se clasifican en autoacutetrofos si es el CO2 atmosfeacuterico (microorganismos que
fotosintetizan) y heteroacutetrofos si utilizan carbono orgaacutenico (Ouyang y Li 2013)
C11 Disponibilidad del agua
El agua es un factor importante para el crecimiento microbiano se requiere para crecer y
llevar a cabo las funciones metaboacutelicas de lo contrario los microorganismos se deshidratan
o mueren La aw depende de la concentracioacuten de solutos y de la cantidad de agua disponible
en el medio ambiente La mayoriacutea de las bacterias y hongos necesitan valores entre 098 y
0995 de aw para su pleno desarrollo (Madigan y Martinko 2006)
Una membrana plasmaacutetica permanentemente selectiva separa el contenido
citoplasmaacutetico del microorganismo de su ambiente por ello las alteraciones en la
concentracioacuten osmoacutetica del medio extracelular pueden afectar incluso la viabilidad de los
mismos Si se coloca un microorganismo en una solucioacuten isotoacutenica el agua entraraacute en la
ceacutelula y causaraacute su estallido salvo que la propia ceacutelula desarrolle alguna estrategia para
evitarlo por ejemplo reducir la concentracioacuten osmoacutetica del citoplasma gracias a los cuerpos
de inclusioacuten Los procariotas tambieacuten pueden contener canales sensibles a la presioacuten
osmoacutetica que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno
se vuelve maacutes baja que la del citoplasma (Madigan y Martinko 2006)
C12 Acidez y pH
El pH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad entre 5 y 8 para impedir la
destruccioacuten de las macromoleacuteculas haacutebiles en condiciones aacutecidas o alcalinas Los aacutecidos
fuertes (inorgaacutenicos) y los aacutecidos deacutebiles (orgaacutenicos) disminuyen el pH externo
posteriormente se disocian en el interior de la ceacutelula inhibiendo la actividad enzimaacutetica y el
transporte de nutrientes por lo tanto los microorganismos no pueden generar energiacutea de
almacenamiento y ocurre la muerte celular (Brooks et al1992)
C13 Oxiacutegeno
El oxiacutegeno molecular (O2) influye en el metabolismo de los microorganismos Durante el
Antecedentes
32
proceso de reduccioacuten del O2 se crean formas reactivas como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2)
superoacutexidos (O2-) y radicales hidroxilos (OH-) que producen dantildeo celular por la oxidacioacuten
de compuestos orgaacutenicos e incluso macromoleacuteculas (Prescott et al1999)
C14 Temperatura
La temperatura afecta el desarrollo y la supervivencia de los microorganismos En bajas
temperaturas la velocidad de crecimiento de algunos microorganismos disminuye y los
periacuteodos de latencia se alargan Por otro lado las temperaturas elevadas aceleran las
reacciones enzimaacuteticas (antes de los 40degC) pero si se intensifica el calor en algunos casos
provocan la desnaturalizacioacuten de las proteiacutenas y por consiguiente la lisis celular (Brooks et
al1992)
Es importante considerar que cada microorganismo tiene una temperatura de desarrollo
adecuada a mayor temperatura se produce un incremento lineal de la velocidad de
crecimiento hasta alcanzar el clima perfecto a velocidad maacutexima Por encima de esta
temperatura oacuteptima la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte
celular (Atlas y Bartha 2002) En la tabla 3 se presentan algunas condiciones ambientales
para el desarrollo de los microorganismos
Antecedentes
33
Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales (Lu et al 2006 Madigan et al 2006 Falk et al 2009)
Factor Tipo de
microorganismo Caracteriacutesticas Microorganismo representativo
NaCI
Osmotolerante Capaz de crecer en un amplio rango de aw o
presioacuten osmoacutetica St aureus Saccharomyces rouxii
Haloacutefilo Requiere altas concentraciones de NaCl para
crecer normalmente por encima de 02 M Halobacterium Dunaliella Ectohiorhodospira
pH
Acidoacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 0 y 55 Sulfolobus Picrophilus Ferroplasma Acontium
Cyanidium caldarium
Neutroacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 55 y 80 Euglena Paramecium
Alcaloacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 85 y 1 15 Badilas alcalophilus NaIronobaciacuteerium
Temperatu
ra
Psicroacutefilo Crece bien a 0degC temperatura oacuteptima de 15degC
o inferior Badilas psychrophilus Chlamydomonas nivalis
Psicroacutetrofo Puede crecer a 0-7degC oacuteptima de 20 a 30degC Listeria monocytogenes
Mesoacutefilo Temperatura maacutexima de 35degC
Temperatura oacuteptima alrededor de 20-45degC
P fluorescens E coli Neisseria gonorrhoeae
Trichomonas vaginalis
Termoacutefilo Puede crecer a 55degC o superior temperatura
oacuteptima a menudo entre 55 y 65degC
Geobacillus stearothermophilus Thermus
aquaticus Cyanidium caldarium
Hipertermoacutefilo Temperatura oacuteptima entre 80 y 113degC Chaetomium thermophile Sulfolobus
Atmoacutesfera
Aerobio obligado Completamente dependiente del O2 para
crecer Pseudomonas Mycobacterium tuberculosis
Anaerobio
facultativo
No requiere O2 pero crece mejor en su
presencia
M luteus St aureus
Streptococcus pneumoniae L monocytogenes
Anaerobio
aerotolerante Crece bien en presencia o en ausencia de O2 Lactobacillus
Anaerobio
obligado No tolera el O2 y muere en su presencia Clostridium botulinum C perfringens
Microaeroacutefilo
Requiere nivel de O2 inferior a 2-10 para
crecer y es dantildeado por el O2 (20) C fetus
Antecedentes
34
D Control del crecimiento microbiano
Los microorganismos toleran determinados factores ambientales Asiacute unas bacterias
pueden tener condiciones para su desarrollo y estas condiciones pueden ser nocivas para una
especie bacteriana El crecimiento de una poblacioacuten microbiana se estudia analizando la curva
de crecimiento de un cultivo La curva del crecimiento microbiano representa la evolucioacuten del
nuacutemero de nuacutemero de ceacutelulas viables presente en un cultivo microbiano liacutequido a lo largo del
tiempo de estudio Se estudia el nuacutemero de ceacutelulas viables por mililitro de un cultivo de
volumen limitado y con una cantidad de nutrientes limitada como por ejemplo un medio de
cultivo liacutequido en un matraz que ha sido inoculado con una cantidad inicial de microorganismos
o inoacuteculo (Hunter-Cevera y Belt 1996) Para llevar a cabo estos estudios se distingue tres
niveles entre los modelos de microbiologiacutea predictiva los que describen los cambios en el
nuacutemero de microorganismos con respecto al tiempo con respecto al efecto de las condiciones
ambientales y los que combinan los dos aspectos anteriores (Larcher y Cattaneo 2006)
Se considera el crecimiento de las bacterias en funcioacuten de su fondo geneacutetico en relacioacuten
con los nutrientes y en unas hipoteacuteticas condiciones ideales (oacuteptimas) Sin embargo el trabajo
experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales es decir
una serie de agentes fiacutesicos y quiacutemicos El anaacutelisis de la curva de crecimiento bacteriano es
muy importante para determinar el potencial de una teacutecnica de control especiacutefica Al igual que
las bacterias los fagos al forman una interaccioacuten con su bacteria hueacutesped se necesita
determinar una cuantificacioacuten del nuacutemero de copias que se generan por la infeccioacuten a esta
condicioacuten se le conoce como fase de eclipse siendo el momento idoacuteneo para realizar la
infeccioacuten fago-bacteria (Lee et al 2016)
D1 Agentes fiacutesicos
La temperatura es uno de los paraacutemetros ambientales maacutes importantes que condicionan el
crecimiento y la supervivencia de los microorganismos La temperatura afecta a la velocidad
de crecimiento y por lo tanto al tiempo de generacioacuten Cada bacteria es diferente y esto se
puede observar en una curva de tasa de crecimiento en funcioacuten de la temperatura Si se suele
utilizar calor en combinacioacuten con otros agentes fiacutesicos (filtracioacuten presioacuten y radiacioacuten) Al
aplicar temperaturas altas se refleja desnaturalizacioacuten e inactivacioacuten de proteiacutenas enzimaacuteticas
esenciales colapsamiento de la membrana citoplaacutesmica y a veces lisis teacutermica de la bacteria
Antecedentes
35
esta condicioacuten se presenta raacutepidamente cuando se aplica presioacuten la cual se utiliza para
esterilizar objetos como lo demuestra el uso universal de la autoclave en todos los
laboratorios de microbiologiacutea (Madigan y Martinko 2006) El calor es auacuten uno de los meacutetodos
maacutes comunes para destruir microorganismos se puede aplicar huacutemedo o seco (Salgado-Nava
y Jimeacutenez-Munguiacutea 2012) Por otro lado ademaacutes de aplicar calor si a las bacterias se le
extrae el calor del medio de manera intensa recurrir a la congelacioacuten con fines de conservacioacuten
de microorganismos por largos periacuteodos si se realiza apropiadamente numerosos
laboratorios disponen de congeladores a -30 o -70degC para la conservacioacuten de colecciones de
cultivos microbianos (Shafiei et al 2014)
D2 Agentes quiacutemicos
Aunque los objetos se desinfectan a veces con agentes fiacutesicos tambieacuten las sustancias
quiacutemicas se utilizan con mucha frecuencia por ejemplo los quimioteraacutepicos son sustancias
con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostaacutetica) En estas sustancias se busca
que sea efectivo contra un amplio espectro de microorganismos Pero no existe (hasta estos
momentos) un solo agente capaz de inhibir a todos los microorganismos Por otro lado existen
quimioteraacutepicos de espectro estrecho pero muy selectivos contra ciertas bacterias que son
patoacutegenas importantes Muchos factores influyen en la eficacia de los desinfectantes hay que
considerar la cepa de microorganismos presentes la concentracioacuten y naturaleza del
desinfectante y la duracioacuten del tratamiento Asimismo es imprescindible que las superficies
sucias se limpien antes de aplicar un desinfectante El uso apropiado de los agentes quiacutemicos
es esencial para la seguridad en los laboratorios y hospitales estos mismos productos se
utilizan tambieacuten para evitar el crecimiento microbiano en los alimentos (Prescott et al 1999)
E Fagos
E1 Antecedentes
Los virus son agentes infecciosos submicroscoacutepicos que pueden replicarse
independientemente de los cromosomas de una ceacutelula pero no independientemente de ella
A fin de multiplicarse deben penetrar la ceacutelula donde puedan replicarse a la cual se le
denomina hueacutesped Presentan una forma infecciosa madura que es tiacutepicamente extracelular
Antecedentes
36
Pueden infectar a diferentes seres vivos por lo que existen virus de animales de plantas y
de forma particular los llamados virus bacterianos o fagos (Madigan y Martinko 2006)
Los bacterioacutefagos o fagos (del griego φαγετον paguumlento ldquoalimentoingestioacutenrdquo) son agentes
virales de las bacterias su descubrimiento se atribuye por un lado al bacterioacutelogo ingleacutes F
W Twort que en 1915 mencionoacute el aclaramiento de un cultivo soacutelido de Micrococcus
provocado por un agente desconocido Por otro lado en 1917 el francocanadiense F
dHerelle descubrioacute un grupo de entidades bioloacutegicas en medios de cultivo que se propagaban
a expensas de las bacterias a los cuales les denominoacute fagos y dentro de sus investigaciones
definioacute su potencial uso e importancia cliacutenica Esto se refuerza a partir de 1940 con el
desarrollo del microscopio electroacutenico con el que se demuestra la naturaleza viral de los fagos
y que la forma de estudiarlos es mediante procedimientos microbioloacutegicos convencionales
facilitando su manejo y estudio (Grabow 2001)
La uacuteltima variedad de fagos se descubrioacute durante la Primera Guerra Mundial los tipos ya
conocidos eran los virus que afectaban a vegetales y animales fue entonces que se pensoacute
en que su aplicacioacuten para eliminar bacterias podriacutea ser utilizada para la prevencioacuten y el
tratamiento de enfermedades bacterianas pero no resultoacute (Merril et al 1996) Sin embargo
los fagos resultaron tener otros beneficios especialmente como modelos o sustitutos de los
virus en humanos en la investigacioacuten geneacutetica baacutesica asiacute como en la evaluacioacuten de la calidad
del agua Ademaacutes demostraron ser una herramienta valiosa en la mayoriacutea de las
investigaciones sobre los virus ya que en comparacioacuten con los humanos animales vegetales
e incluso los insectos anfitriones de otros virus los fagos son faacutecil y raacutepidamente reproducibles
en el laboratorio y no son particularmente exigentes con respecto al espacio instalaciones y
equipos El trabajar con fagos requiere la separacioacuten y purificacioacuten y las dos principales tareas
para realizar esto es utilizar meacutetodos quiacutemicos en los cuales se utilizan solutos como buffer
glicerol bromuro de potasio cloruro de cesio y tartrato de potasio aunque el maacutes comuacuten es
la sacarosa ademaacutes involucra la precipitacioacuten con sulfato de amonio polietilenglicol o cloruro
de cesio y los meacutetodos fiacutesicos que implican la centrifugacioacuten a diferentes velocidades y
gradientes de densidad y con menor frecuencia la cromatografiacutea de particioacuten (Sambrook y
Russell 2001)
La investigacioacuten sobre las propiedades baacutesicas de los fagos se desarrolla en la biologiacutea
molecular que permitioacute avances sin precedentes en toda la biologiacutea y ciencias meacutedicas La
Antecedentes
37
concentracioacuten y purificacioacuten es un factor determinante para llevar a cabo la infeccioacuten
eficientemente sin embargo existe un periacuteodo de adaptacioacuten por parte de los fagos antes
que se desarrollen y se logren tiacutetulos apreciables en ceacutelulas cultivadas (Sambrook y Russell
2001 Breeuwer et al 2003)
E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos
Los virus son paraacutesitos intracelulares obligados no tienen metabolismo intriacutenseco y
requieren la maquinaria metaboacutelica codificada por los cromosomas de ceacutelula que puedan
infectar y reproducirse en ella denominada hueacutesped Su tamantildeo oscila entre 20 y 200 nm y
consiste de un nuacutecleo de aacutecido nucleico (ARN o ADN de cadena simple o doble) rodeado por
una cubierta proteica (caacutepside) y en algunos casos una cubierta de liacutepidos Los microbioacutelogos
que investigan la presencia de virus en haacutebitats marinos y han detectado su presencia creen
que son diez veces maacutes numerosos que las bacterias marinas En la superficie de los mares
se encuentran entre 106 y 109 partiacuteculas viacutericas por mililitro y se estima que en la capa
superficial (1 mm) de los oceacuteanos se encuentran unas 3 x 1030 partiacuteculas viacutericas (Grabow
2001 Atterbury et al 2003)
E3 Clasificacioacuten de los fagos
Las variaciones en los fagos se presentan en forma estructural como apeacutendices en la
cabeza cuello y las fibras de la cola o espigas ademaacutes del genoma que variacutea en cada orden
En 1962 Andreacute Lwoff junto a otros investigadores propuso una clasificacioacuten basada en la
morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico Los nombraron de la siguiente manera los urovirales
que presentaban cola pronunciada los inoviridae eran los filamentosos y los microviridae los
tipo φX Posteriormente Bradley (1967) consideroacute la morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico y
agrupoacute a los fagos en seis morfotipos baacutesicos denominados de la A a la F posteriormente se
clasifico en fagos baacutesicos los de cola los filamentosos y los icosaeacutedricos con ADN de cadena
sencilla o RNA de cadena simple Los fagos han sido investigados debido a su rol como
agentes de biocontrol para el desarrollo de la seguridad alimentaria En el presente varios
miles de fagos en contra de varios objetivos han sido aislados de varios entornos y alimentos
Aproximadamente el 96 de los fagos aislados eran con cola y del tipo liacuteticos en una de las
Antecedentes
38
tres familias Myoviridae (245) Siphoviridae (61) y Podoviridae (14) en el orden de los
caudovirales (Atterbury et al 2003 Oh y Park 2017)
En 1971 el Comiteacute Internacional de Taxonomiacutea de Virus (ICTV por sus siglas en ingleacutes)
clasificoacute en 6 geacuteneros de los cuales 5 corresponden a la clasificacioacuten propuesta por Bradley
los grupos T4 λ φX174 MS2 y fd Los fagos pueden tener cola larga y flexible no contraacutectil
(Siphoviridae) cola larga y contraacutectil (Myoviridae) o cola corta (Podoviridae) como se observa
en la tabla 4 Para la clasificacioacuten de los fagos se aplican propiedades como el rango de
hueacutespedes y las relaciones inmunoloacutegicas sin embargo las maacutes importantes son su
morfologiacutea y las caracteriacutesticas de su aacutecido nucleico el cual se adsorbe a componentes de la
superficie celular que actuacutean como receptores especiacuteficos La zona de adsorcioacuten del virus es
complementaria al receptor celular por lo tanto un determinado fago soacutelo puede infectar un
nuacutemero limitado de cepas celulares que contengan a un determinado receptor La naturaleza
de la zona de adsorcioacuten variacutea con el tipo de fago En el T4 se localiza en el extremo de la cola
en donde se encuentran la placa basal las espiacuteculas y las fibras de la cola Las formas maacutes
complejas corresponden a los fagos con colas contraacutectiles (Atterbury et al 2003)
Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos
(Ackermann 2003)
Antecedentes
39
E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico
La multiplicacioacuten de los fagos (figura 4) ADN produce la destruccioacuten de la ceacutelula hueacutesped
mediante lisis lo que provoca su liberacioacuten El ciclo vital de un fago que culmina con el
estallido de la ceacutelula hueacutesped y la liberacioacuten de viriones recibe el nombre de ciclo liacutetico Los
acontecimientos que tienen lugar durante el ciclo liacutetico se revisaraacuten en esta seccioacuten con
especial atencioacuten a los fagos T-par de E coli Estos son fagos de ADN bicatenario con colas
contraacutectiles complejas de la familia Myoviridae son algunos de los virus maacutes complejos
conocidos (Fernaacutendez 2008)
Figura 4 Adsorcioacuten del fago T4 e inyeccioacuten del ADN (Leverentz et al 2003)
Los fagos podriacutean infectar hasta un 70 de la poblacioacuten de procariotas marinos y ser
responsables de la tercera parte de la mortalidad bacteriana acuaacutetica Tambieacuten se han
detectado virus que infectan diatomeas y otras algas importantes del fitoplancton marino lo
cual es de gran transcendencia ecoloacutegica ya que la multiplicacioacuten de bacterias marinas
supera la capacidad de reproduccioacuten de los protozoos La lisis por virus de ceacutelulas procariotas
y de algas puede tambieacuten contribuir enormemente en los ciclos del carbono y nitroacutegeno en las
cadenas troacuteficas marinas incluso podriacutea reducir el nivel de productividad marina como la de
moluscos y peces (Muniesa et al 2005)
E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten
Los fagos no se unen al azar a la superficie de una ceacutelula hueacutesped por el contrario se fijan
a receptores especiacuteficos La naturaleza de estos receptores variacutea de acuerdo al fago pueden
Antecedentes
40
ser lipopolisacaacuteridos y proteiacutenas de la pared celular aacutecidos teicoicos flagelos y pili Los fagos
T-par de E coli en particular utilizan lipopolisacaacuteridos o proteiacutenas de la pared celular como
receptores Las variaciones en las propiedades del receptor son parcialmente responsables
de las preferencias del fagos por el hueacutesped (Muniesa et al 2005 Leeuw et al 2017)
La adsorcioacuten de fagos T-par estaacute relacionada con diversas estructuras del tallo La fijacioacuten
del fago comienza cuando una fibra del tallo establece contacto con los receptores adecuados
a medida que maacutes fibras contactan con los receptores la placa basal se asienta en la
superficie La unioacuten se debe probablemente a interacciones electrostaacuteticas y se ve influida por
el pH y por la presencia de iones como Mg+2 y Ca+2 Una vez que la placa basal estaacute
firmemente asentada en la superficie celular se producen cambios conformacionales en ella
y en la vaina del tallo Esta uacuteltima se reorganiza de tal forma que se contrae pasando de una
conformacioacuten en cilindro de 24 anillos a otra de 12 anillos de longitud maacutes corta y ancha es
entonces cuando el tubo central es empujado a traveacutes de la pared celular bacteriana
Finalmente el ADN es extruido de la cabeza pasa a traveacutes del tubo del tallo y penetra en la
ceacutelula hueacutesped Parece ser que el tubo interacciona con la membrana plasmaacutetica para formar
un poro a traveacutes del cual pasa el ADN los mecanismos de penetracioacuten de otros fagos difieren
a menudo de los fagos T-par aunque no se han estudiado en detalle (Leverentz et al 2003)
F Biofilm
Las bacterias existen en la naturaleza bajo dos formas o estados a) bacterias planctoacutenicas
de libre flotacioacuten y b) bacterias biofilm en colonias de microorganismos seacutesiles (Nazar 2007)
Un biofilm se define como una agrupacioacuten de comunidades seacutesiles microbianas que se fijan a
superficies las ceacutelulas estaacuten incrustadas en una matriz autoproducida que actuacutea como
proteccioacuten quiacutemica y mecaacutenica del entorno asiacute estas bacterias presentan mayor resistencia
a desinfectantes y el secado (Vestby et al 2009) Las bacterias pueden crear condiciones
para formar biofilms casi en cualquier ambiente liacutequido La interfase soacutelido-liacutequido entre una
superficie y un medio acuoso (vgr leche) proporciona un entorno ideal para la fijacioacuten y
crecimiento de microorganismos (Fakruddin et al 2014)
Antecedentes
41
G Microscopiacutea electroacutenica
Los microscopios electroacutenicos se usan habitualmente para el estudio detallado de
estructuras celulares (Bradley 1967) Para analizar las estructuras internas es esencial el
microscopio electroacutenico de transmisioacuten MET En el MET se utilizan electrones en lugar de rayo
de luz las lentes son electromagneacuteticas y se opera en todo momento a alto vaciacuteo
(Ackermann 2003) El poder de resolucioacuten del microscopio electroacutenico es mucho mayor que
el del microscopio oacuteptico incluso pueden observarse estructuras moleculares como proteiacutenas
y aacutecidos nucleicos Sin embargo los haces de electrones tienen escaso poder de penetracioacuten
y una ceacutelula aislada es demasiado gruesa para poder visualizarse directamente por este
motivo se emplean teacutecnicas especiales para la obtencioacuten de cortes ultrafinos a fin de poder
observar las muestras Una ceacutelula bacteriana por ejemplo se corta con una cuchilla especial
en varios cortes ultrafinos de 20-60 nm de espesor que son posteriormente examinados de
manera individual en el microscopio electroacutenico (Fuster-Valls et al 2008) Para obtener
suficiente contraste las preparaciones se tintildeen previamente mediante tratamiento con
compuestos como aacutecido oacutesmico permanganato sales de uranilo o de lantano o plomo Como
estas sustancias poseen aacutetomos pesados son capaces de desviar los electrones y aumentar
el contraste (Madigan y Martinko 2006)
La microscopiacutea electroacutenica es el mejor meacutetodo para estudiar la forma de las bacterias Los
virus bacterianos por tener un diaacutemetro menor de 1000 Aring estaacuten por debajo del liacutemite de
resolucioacuten del microscopio oacuteptico sin embargo es posible observarlos mediante el
microscopio electroacutenico porque eacuteste utiliza una radiacioacuten de longitud de onda maacutes corta que
permite aumentar 100 mil veces una resolucioacuten de 10 Aring (Kruger et al 2000 Ackermann
2003) Para observar detenidamente la morfologiacutea se requiere el microscopio electroacutenico con
especificaciones precisas como el de barrido lo cual es una herramienta indispensable en
biologia molecular (Guzmaacuten 2015)
Para la observacioacuten las partiacuteculas se suspenden en un medio volaacutetil por lo general una
solucioacuten de acetato de amonio y se colocan sobre una membrana sostenida por una rejilla
metaacutelica que praacutecticamente no absorbe electrones El problema teacutecnico maacutes frecuente es la
falta de contraste como la imagen obtenida es el resultado de la dispersioacuten de electrones por
los aacutetomos de la partiacutecula se necesita una diferencia apreciable de poder dispersivo entre las
partiacuteculas y el medio de soporte generalmente se emplean teacutecnicas tradicionales La maacutes
utilizada se conoce como tincioacuten negativa consiste en mezclar la suspensioacuten del fago con
Antecedentes
42
fosfovolframato de sodio o acetato de uranilo a pH neutro A este pH las sales no se combinan
con el fago al secarse forman una capa uniforme y opaca a los electrones en la cual los fagos
destacan como partiacuteculas maacutes claras Como las sales en solucioacuten penetran las irregularidades
en la superficie de la partiacutecula la micrografiacutea revela los detalles finos de los fagos (Fuster-
Valls et al 2008 Montantildeez et al 2012)
La forma del fago se establece de manera visual que es directa de la placa cuando las
UFP que se observan a simple vista como placas liacuteticas a contraluz (APHA 2005) Y para
estudiar la adhesioacuten y formacioacuten celular en diversas superficies se han desarrollado varias
teacutecnicas de microscopiacutea entre las cuales se distinguen la microscopiacutea electroacutenica de barrido
y de transmisioacuten asiacute como la microscopiacutea de epifluorescencia (Fuster-Valls et al 2008) la
cual se basa en los mismos principios de oacuteptica de la microscopiacutea comuacuten con diferencias en
el manejo y el disentildeo relacionadas con la generacioacuten y transmisioacuten de longitudes de onda
adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar ya sean propios de la muestra o de
la coloracioacuten utilizada (Franco 2005)
El fundamento de la teacutecnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o
compuestos fluorescentes denominados fluorocromos en fijarse a los anticuerpos mediante
un enlace quiacutemico estable que no puede romperse durante el curso de la reaccioacuten
inmunoloacutegica La espectroscopia de fluorescencia es la teacutecnica de deteccioacuten oacuteptica maacutes
sensible En el caso de la deteccioacuten en ceacutelulas se exponen a alta energiacutea utilizando laacutemparas
de xenon excitando por varios nanosegundos y asiacute emitiendo una longitud de onda de baja
energiacutea (Franz y Jendreizik 2015)
H Fagoterapia
Las enfermedades infecciosas estaacuten catalogadas entre las primeras causas de muerte en
el mundo y por lo tanto son consideradas un problema de salud puacuteblica Entre ellas las
infecciones bacterianas causan gran preocupacioacuten dado que las bacterias adquieren diacutea a
diacutea mayor resistencia a los antibioacuteticos esto ocurre por medio de diversos mecanismos
fisioloacutegicos y moleculares que les permiten a estos microorganismos adaptarse raacutepidamente
a condiciones adversas (Prada-Pentildearanda et al 2015)
El descubrimiento de los fagos por dacuteHerelle se desarrolloacute cuando eacuteste buscaba una
Antecedentes
43
vacuna que pudiera combatir la crisis de disenteriacutea hemorraacutegica que se presentoacute en 1915 en
las afueras de Francia dacuteHerelle observoacute que tras aislar lisados libres de bacterias de la
materia fecal de los enfermos las bacterias eran destruidas por un agente desconocido
invisible capaz de destruir cultivos de bacterias o producir pequentildeas aacutereas de color maacutes claro
cuando las bacterias eran crecidas en confluencia en placas de medio soacutelido y publicoacute sus
observaciones en el artiacuteculo titulado ldquoSobre un microbio invisible antagonista de los bacilos
de la disenteriacuteardquo (Szafranski et al 2017)
El uso de los fagos como agentes terapeacuteuticos comenzoacute hace maacutes de 80 antildeos Entre los
ejemplos maacutes destacados y recientes de la utilizacioacuten exitosa de la fagoterapia cabe citar el
uso de fagos especiacuteficos en el control bioloacutegico de E coli O157H7 productora de colitis
hemorraacutegica (en alimentos) Tambieacuten se ha estudiado el uso de fagos en el tratamiento de
infecciones peritoneales y otitis externa en la erradicacioacuten de P aeruginosa en pacientes con
fibrosis quiacutestica en el tratamiento de infecciones urinarias y osteomielitis por S aureus y en
la descolonizacioacuten intestinal para combatir las infecciones por Enterococcus faecium
resistente a vancomicina entre otros Los efectos favorables de la fagoterapia podriacutean
exceder incluso su actividad antibacteriana Hay datos sorprendentes acerca de la actividad
in vivo de los fagos el conocido fago T4 de E coli podriacutea inhibir la adsorcioacuten y la replicacioacuten
de adenovirus en sus ceacutelulas blanco y el fago Pf4 de P aeruginosa habriacutea sido capaz de
inhibir el desarrollo de cepas de Aspergillus por secuestro de hierro (Lopardo 2017)
El estudio y desarrollo de nuevos tratamientos alternativos es de particular intereacutes en la
lucha contra la resistencia bacteriana Los fagos presentan caracteriacutesticas que los hace una
excelente herramienta contra las bacterias patoacutegenas debido a su especificidad y seguridad
ecoloacutegica Los fagos no solo son atractivos desde un punto de vista cliacutenico Se han utilizaacutedo
como potenciales aplicaciones en otras aacutereas como la agricultura el control de alimentos o
la industria como a continuacioacuten se describe en la siguiente tabla 5 Los fagos son una
solucioacuten ecoloacutegica ubicua para desarrollar nuevos tratamientos contra las bacterias aunque
se deben realizar maacutes estudios para comprender mejor la relacioacuten entre ellos y las bacterias
antes de su aplicacioacuten (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)
Antecedentes
44
Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos la naturaleza lugares
urbanizados y cuerpo humano (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)
Fuente Sitio encontrado
Naturaleza
Suelo y superficie terrestre
Agua continental y oceaacutenica
Ambientes extremos hielo marino pared de
algas zonas hipersalinas etc
Lugares artificiales
Hospitales y zonas similares
Planta de tratamiento de aguas negras
Algunas zonas bajo el impacto humano
Cuerpo de animales
Tracto digestivo y vagina
Tracto respiratorio y oral
Piel y epitelio mucoso
Los productos comerciales para terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones
Los fagos se pueden distribuir liofilizados y se disuelven antes de la administracioacuten por viacutea
intravenosa en un soporte adecuado como por ejemplo una solucioacuten acuosa o tampoacuten o
suspenderse en cualquier liacutequido adecuado coloidal o de la matriz de poliacutemeros para crear
bactericidas el principio activo se puede administrar de una manera conveniente como por
inyeccioacuten (subcutaacutenea intravenosa administracioacuten etc) por viacutea oral pulmonar (por ejemplo
aerosoles o por otros dispositivos a los pulmones) spray nasal intramuscular intraperitoneal
intrahecal intraviacutetrea vaginal rectal la puncioacuten lumbar y la aplicacioacuten directa Dependiendo
de la viacutea de administracioacuten el principio activo puede estar recubierto de un material que
preserve la sustancia de la accioacuten de enzimas aacutecidos y otras condiciones naturales que
pueden inactivar la sustancia (por ejemplo comprimidos recubiertos enteacutericos o pastillas)
Empresas dedicadas a la biotecnologiacutea se dedicaron a desarrollar productos utilizando fagos
especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan ETA la Food and Drug Administration de
los EE UU (FDA) incluye a los fagos en la categoriacutea de aditivos alimentarios la FDA ha
publicado la aprobacioacuten de seis fagos para usar en alimentos listos para comer (ready to eat)
efectivos para L monocytogenes de la compantildeiacutea Intralytix La compantildeiacutea Omnilytics ofrece
productos de control bacterial para varias aacutereas como son agricultura agua y alimentos
industrias que se pueden observar en su paacutegina web (httpswwwomnilyticscom) y otras
empresas como Biophage Pharma Inc (Canada) Exponential Biotherapies (EE UU)
(Segundo 2010)
Antecedentes
45
Estas nuevas estrategias de intervencioacuten eco-amigable son requeridas como agente de
biocontrol en contra de Salmonella Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos
antildeos debido a sus caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutef ico sin
dantildear la micro-flora en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros
distribucioacuten de esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla
algunos ejemplos de la aplicacioacuten de los fagos son los descritos en la siguiente tabla 6 (Oh y
Park 2017)
Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria (Oh y
Park 2017)
Compantildeiacutea Producto del fago Organismo hueacutesped
FINK TEC GmbH (Alemania) Secure Shield E1 E coli
Intralytix Inc
(EE UU)
Ecolicidereg (EcolicidePXtrade) E coli O157H7
EcoShieldtrade E coli O157H7
ListShieldtrade L monocytogenes
SalmoFreshtrade Salmonella spp
ShigaShieldtrade
(ShigActivetrade) Shigella spp
Micreos Food Safety
(Holanda)
PhageGuard Listextrade L monocytogenes
PhageGuard Strade Salmonella spp
E coli O157H7
Passport Food Safety Solutions
(EE UU) Finalysereg E coli O157H7
Phagelux (China)
AgriPhag
Xanthomonas campestris pv
vesicatoria Pseudomonas
syringae
pv tomato
SalmoProreg Salmonella spp
Salmonella spp
Antecedentes
46
47
III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO
48
Objetivos y plan de trabajo
49
A Objetivo general
El objetivo general de este estudio es aislar y caracterizar fagos frente Salmonella spp a
partir de diversas fuentes ambientales para su uso potencial en el control bioloacutegico
El control de Salmonella spp es de gran intereacutes para la industria alimentaria por lo que
encontrar alternativas para su eliminacioacuten es de gran impacto en la salud puacuteblica
B Objetivos especiacuteficos
1- Aislar fagos de Salmonella proveniente de muestras de aguas residuales de la ZMM y
muestras de lavado de carne pollo de un establecimiento donde se comercializa esta carne
2- Caracterizar parcialmente los fagos aislados en base a su morfologiacutea por TEM y el
anaacutelisis de sensibilidad frente a diversas cepas bacterianas
3- Estudiar el efecto de los fagos previamente aislados desarrollando un biofilm de
Salmonella spp sobre discos de acero inoxidable utilizando la DEM
C Plan de trabajo
Para alcanzar los objetivos establecidos se considera la ubicacioacuten de las fuentes para la
obtencioacuten de los fagos en este caso el medio seleccionado son riacuteos arroyos asiacute como un
establecimiento donde se procesan canales de pollo en la ZMM y las lagunas de oxidacioacuten
de aguas residuales en Mariacuten ambas localidades en Nuevo Leoacuten Meacutexico
Posteriormentese utilizaraacute la teacutecnica ADC y se verificaraacute en cual de estas muestras se
podriacutean encontrar fagos que sean liacuteticos para Salmonella enterica y posteriormente se
realizaraacuten pruebas de selectividad con la meta de caracterizar los fagos aislados frente a
diferentes hueacutesped (cepas de Salmonella spp y de E coli) y la observacioacuten de la morfologiacutea
se realizaraacute por el TEM
Salmonella spp presenta un periacuteodo de incubacioacuten por lo general entre 12 y 36 horas
tras el cual el derarrollo bacteriano en las superficies puede dar como resultado la formacioacuten
de un biofilm Para este estudio se desarrollaraacute un biofilm de Salmonella spp sobre discos
de acero inoxidable en condiciones de humedad esto es importante por la fase de eclipse
Objetivos y plan de trabajo
50
(momento en el cual atacan y se desarrollan los fagos) Se probaraacuten 3 concentraciones de
fago 6 7 y 8 UFPmL Se realizaraacuten recuentos durante un periacuteodo de incubacioacuten de 72 h
Con el fin de conseguir estos objetivos el presente trabajo se ha estructurado en tres
secciones las cuales se pueden observar en la figura 5 incluyendo las pruebas con DEM
en los discos de acero inoxidable
Figura 5 Diagrama general de trabajo
51
IV MATERIALES Y MEacuteTODOS
52
Materiales y meacutetodos
53
A Toma de muestras
Las muestras para obtencioacuten de fagos se recolectaron en diez sitios del aacuterea metropolitana
de Monterrey y del municipio de Mariacuten Nuevo Leoacuten (tabla 7) El meacutetodo que se utilizoacute para
aislar fagos de diversas fuentes medio ambientales y su posterior traslado al laboratorio fue
el descrito por Higgins et al (2005) Se obtuvieron las muestras provenientes de aguas
residuales y riacuteos se emplearon frascos de 450 mL previamente lavados y secos que
posteriormente se impregnaron con una solucioacuten de tiosulfato de sodio (Na2S2O3bull5H2O) al
10 (pv) (Sigma-Aldrich EE UU) y se esterilizaron en autoclave 121ordmC15min Al momento
de hacer la recoleccioacuten en campo los frascos fueron abiertos cuidadosamente y se llenaron
con el liacutequido se almacenaron en hieleras para su traslado al laboratorio el tiempo que
transcurrioacute desde la toma de la muestra hasta la llegada al laboratorio fue entre 1 y 3 h
posteriormente las muestras se centrifugaron el mismo diacutea y los sobrenadantes se
almacenaron 4oC hasta su uso (Vidales-Contreras et al 2006)
A cada una de las muestras obtenidas en el muestreo se le agregoacute 25 de cloroformo
(grado de reactivo 995 Sigma-Aldrich EE UU) para conservarlas en condiciones oacuteptimas
para su posterior llegar al laboratorio se mantuvieron a 4degC durante toda la noche para
permitir que el material grueso decante Mientras tanto en lo referente a las muestras
obtenidas de aguas provenientes de los establecimientos expendedores de pollos las
muestras se trataron igual pero como el sobrenadante contiene grasa se optoacute por filtrar y
posteriormente se realizoacute el mismo procedimiento antes descrito
Materiales y meacutetodos
54
Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos
B Obtencioacuten de fagos
Para aislar los fagos se utilizoacute la teacutecnica descrita por Sambrook y Russell (2001) la cual se
describe a continuacioacuten En un tubo de ensayo (16150 mm Fisherbrand EE UU)
conteniendo 45 mL de agar suave (AS) (Bioxon Meacutexico) mantenieacutendose a temperatura de
40C (en una cuba hidroneumaacutetica con agua) se colocaron 500 L de un cultivo de S
Enteritidis (provenientes del cepario del CINSP) en fase logariacutetmica y se agregaron 300 L
de las muestras recolectadas en las que se presume conteniacutean los fagos especiacuteficos para
esta cepa Se agitoacute el tubo de ensayo mezclando con movimientos circulares suaves para
evitar la formacioacuten de burbujas este procedimiento se realizoacute aproximadamente por 5
segundos El contenido se vertioacute uniformemente sobre una caja de Petri (10015 mm
Fisherbrand EE UU) conteniendo agar soya tripticasa (AST) (Bioxon Meacutexico) y se dejoacute a
temperatura ambiente hasta solidificar la ADC Se incuboacute a 37C por 24h Al momento de
observar el desarrollo de las placas de lisis (calvas) se procedioacute al aislamiento de los fagos
Su cuantificacioacuten se realizoacute de manera directa e inmediata ya que las calvas son visibles con
una iluminacioacuten de contraste (Breeuwer et al 2003) Posteriormente los fagos que si formaron
halos de inhibicioacuten fueron aislados de manera directa o siguiendo uno de los dos protocolos
(enriquecimiento y sin enriquecer) debido a que depende principalmente de la amplificacioacuten
del fago y las caracteriacutesticas de cada uno se describen a continuacioacuten
Municipio Sitio de la toma
Monterrey
Parque Fundidora
Riacuteo Santa Catarina
Establecimiento de comida
Av Conductores
Mariacuten Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal
Riacuteo La Libertad
Guadalupe Alcantarillas de la colonia La Azteca
Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados
San Nicolaacutes de los Garza Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac
Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea
Materiales y meacutetodos
55
B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos
Con el protocolo de enriquecimiento se proporcionoacute las condiciones oacuteptimas de desarrollo
al cultivo de la bacteria hueacutesped y la muestra al inocular el cultivo en la muestra y de esta
manera amplificar los posibles fagos que presentes en la muestra de agua
Se realizoacute este protocolo de la siguiente manera primero se seleccionoacute la cepa bacteriana
que seraacute el hueacutesped esto se consiguioacute haciendo un cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y
se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por otra parte se prepararon
aliacutecuotas (10 mL cada una) de cada una de las muestras recolectadas (enriquecidas con
cultivo bacteriano) y se centrifugan a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a
4degC despueacutes el sobrenadante se pasoacute por jeringa y con filtros de 022 microm (Millex-GP
polyethersulfone 33 mm radio-sterilized) Estas dos entidades biloacutegicas se unieron en un
matraz de capacidad de 50 mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon
Meacutexico) a doble concentracioacuten (20) En este matraz se agregaron 300 microL de la muestra
previamente filtrada con fagos y 500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incuboacute a 37degC por
24 h posteriormente por medio de la teacutecnica de ADC se pudo observar la formacioacuten de halos
de lisis de los fagos (Vidales-Contreras et al 2006)
B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos
El protocolo se emplea para adicionar directamente de la muestra una aliacutecuota y testarla
con la bacteria hueacutesped Se siguieron los pasos anteriormente descritos a este protocolo
primero se seleccionoacute la cepa bacteriana (hueacutesped) esto se realizoacute haciendo un cultivo fresco
(AST) (Bioxon Meacutexico) y se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por
otra parte se preparoacute aliacutecuotas (10 mL) de cada una de las muestras recolectadas y se
centrifugaron a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a 4degC despueacutes el
sobrenadante se pasoacute por jeringa con filtros de 022 microm (Millex-GP polyethersulfone 33 mm
radio-sterilized) Estas dos entidades bioloacutegicas se unieron en un matraz de capacidad de 50
mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon Meacutexico) a doble
concentracioacuten (20) A este matraz se agregaron 300 microL de la muestra filtrada con fagos y
500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incubaron a 37degC por 24h posteriormente por medio
de la teacutecnica de ADC se observaron la formacioacuten de halos de lisis de los fagos (Vidales-
Materiales y meacutetodos
56
Contreras et al 2006)
B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas
Despueacutes de que los cultivos bacterianos se reactivaron la preparacioacuten para trabajar con
ellos fue la siguiente se tomoacute una asada de una colonia bacteriana bien diferenciada y se
incuboacute en un tubo inclinado (punta de flauta) se dejoacute el cultivo toda la noche y posteriormente
se traspasoacute a un subcultivo en caldo con infusioacuten cerebro-corazoacuten (BHI Merck Alemania) e
incuboacute a 37degC durante 24 h posteriormente se subcultivoacute en BHI en las mismas condiciones
Una colonia aislada en tubo punta de flauta se inoculoacute en 9 mL de agua peptonada (3M
Meacutexico) y se incuboacute a 37degC durante 24 h luego se realizaron mezclas seriadas en diluyente
(1 gL triptona 85 gL NaCl pH 72) (Merck Alemania) y se implantaron en las superficies de
los discos de acero inoxidable tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm con
un volumen inferior a 50 microL Como control del inoacuteculo se prepararon 5 placas de TSA
En el caso del fago obtenido se amplificoacute realizando la infeccioacuten en repetidas ocasiones
hasta alcanzar una concentracioacuten de 1x107 UFPmL
B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos
Para la realizacioacuten de este estudio se utilizaron cepas bacterianas de Salmonella enterica
y E coli provenientes de diversas colecciones de los laboratorios involucrados tambieacuten se
utilizoacute un fago de prueba (PRD1) para ser utilizado como control positivo en los aislamientos
En la tabla 8 se muestran las bacterias y el fago indicando su denominacioacuten y origen asiacute como
las condiciones de conservacioacuten
Materiales y meacutetodos
57
Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten
Origen Cepa bacteriana fagos Clave Condiciones de conservacioacuten
FaSPyN
S Typhimurium ATCC 13311
Glicerol a -20degC S Paratyphi ATCC 9150
S Enteritidis ATCC 13076
FCB S Typhi ATCC 19430 BGA TSA 4degC
FAUANL
S Typhimurium TSA 4degC
Fago PRD1
Tampoacuten fosfato 4degC
E coli CECT 515
E coli K12
E coli ATCC 10536
E coli O157H7 CECT 4783
S bongori ATCC 43975
UAB
S enterica LT2
Vial liofilizado a -20degC
S enterica sub enterica CECT 4138
S enterica sub enterica CECT 4594
S enterica sub enterica CECT409
S enterica sub enterica CECT 698
S Typhimurium CCUG 29478
Para la reactivacioacuten de los cultivos que se almacenan a 4degC se dejaron a temperatura
ambiente igualmente para los congelados Posteriormente para sacarlos del estreacutes se
sembraron en medio de cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y se incubaron a 37degC por 24
horas tras estas condiciones ya se pudieron utilizar en los ensayos (McLaughlin et al 2006)
A continuacioacuten se describe la forma en que se reactivaron los cultivos en este estudio de
acuerdo a la forma en que estaban almacenados
a) Cultivos almacenados en glicerol
Se descongelaron los viales a temperatura ambiente
Materiales y meacutetodos
58
Se transfirieron 5 microL de cultivo en 20 mL de TSB (Becton Dickinson Co) y se incuboacute a
37degC toda la noche
Se sembroacute en tres campos en caja de Petri de 90 mm con TSA (Becton Dickinson Co)
Se incuboacute a 37degC por 24h
Se seleccionoacute una colonia aislada y bien diferenciada
El cultivo (colonia) se incuboacute en 20 mL de TSB a 37degC toda la noche
b) En caso de los cultivos liofilizados
En el vial se hidrataron los cultivos agregando 1 mL de TSB e incubando 1h a 37degC
Se vertioacute el cultivo en 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC toda la noche
Se realizoacute el mismo proceso anteriormente mencionado en a)
B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC)
La siembra o inoculacioacuten consistioacute en introducir artificialmente una porcioacuten de muestra
(inoacuteculo) en un medio adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano para su desarrollo
y multiplicacioacuten Una vez inoculado el medio se incuboacute a una temperatura adecuada para el
oacuteptimo crecimiento en promedio 37degC Los meacutetodos de conteo en placa como capa doble y
capa simple de agar se basan en la determinacioacuten de la concentracioacuten viral mediante el
conteo de UFP las cuales son zonas de aclaramiento circular o halo de inhibicioacuten de
crecimiento bacteriano que se producen en la capa o ceacutesped bacteriano debido a la lisis
producida por los fagos Inicialmente una partiacutecula de fago infecta a su bacteria hueacutesped se
replica y posteriormente se disemina generando una zona circular sin crecimiento de la
bacteria (Solano et al 2012) Por esta razoacuten en nuestro estudio se utilizoacute esta manera de
trabajar considerando las diferentes formas que se puede presentar los halos de inhibicioacuten
(forma tamantildeo densidad)
La teacutecnica se basoacute en mezclar el cultivo bacteriano en fase logariacutetmica y el fago en agar
suave (AS) tambieacuten llamado top agar cuando se aplica a la placa de Petri donde se realizoacute
el proceso de infeccioacuten El AS se preparoacute con TSB y agar bacterioloacutegico (15) para obtener
una consistencia semisoacutelida que permita el desarrollo de las calvas en el ceacutesped bacteriano
Se mantuvo a una temperatura adecuada para conservar el estado liacutequido y se agitoacute
cuidadosamente para dejar interactuar los cultivos fago-hueacutesped en el tubo de ensayo
Materiales y meacutetodos
59
posteriormente se dispersoacute de manera uniforme en placas de Petri de 90 mm de diaacutemetro con
15 mL de TSA La suspensioacuten (ceacutesped bacteriano en ADC) se dejoacute solidificar a temperatura
ambiente unos minutos y posteriormente se incuboacute 24h37degC (Vidales-Contreras et al 2006)
B6 Modelo de infeccioacuten
Las enzimas endolisinas de los fagos provocan la lisis debilitamiento y rompimiento de la
pared celular de las bacterias La lisis depende de la proporcioacuten de fagos y hueacutesped o
multiplicidad de infeccioacuten (Multiplicity of infection MOI) Cuando hay una MOI baja la relacioacuten
de fagos a bacterias no es superior a 21 Cuando la MOI es alta es decir muchos fagos frente
a pocas bacterias las ceacutelulas se lisan directamente (Dimmock et al 2007)
En ese sentido la Norma ISO 10705-11995 indica que durante el ensayo el fago en fase
de multiplicacioacuten experimenta varios ciclos de replicacioacuten lo que resulta en la muerte de la
ceacutelula hueacutesped que ha actuado como faacutebrica para la produccioacuten viral El modelo que se siguioacute
es para observar los halos de inhibicioacuten y contrastar los resultados En la figura 6 se presenta
el modelo de infeccioacuten utilizado con S Typhimurium y el fago PRD1 siguiendo el modelo de
Vidales-Contreras et al (2006) y la puesta a punto propuetas por Sambrook y Russell (2001)
Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten fago-hueacutesped
Materiales y meacutetodos
60
B7 Controles utilizados durante los ensayos
Se utilizoacute la cepa de S Typhimurium y el fago PRD1 como control positivo para observar
la formacioacuten de las calvas para el control negativo se utilizoacute agua esterilizada con esto se
asegurar que si existe infeccioacuten y evitar los falsos positivos que ocurren primordialmente por
contaminacioacuten
Para control negativo el ceacutesped bacteriano se obtuvo de la siguiente manera en un
tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de cultivo de S
Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de agua destilada esteacuteril la mezcla se vertioacute
en placa Petri con TSA
Como control positivo el ceacutesped bacteriano y las placas de lisis se obtuvieron como
sigue en un tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de
cultivo de S Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de fagos PRD1 la mezcla se
vertioacute en placa Petri con TSA
B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium
Para realizar los ensayos microbioloacutegicos se requirioacute trabajar con la misma cantidad de
biomasa en una fase de crecimiento similar El conteo en placa es un meacutetodo de medicioacuten de
biomasa que permite el recuento de ceacutelulas viables y consiste en determinar el nuacutemero de
ceacutelulas capaces de reproducirse y generar colonias sobre un medio soacutelido (cada ceacutelula viable
da origen a una colonia) Para este estudio y ver el efecto de los fagos sobre las bacterias
primeramente se calculoacute la curva de crecimiento celular pues es imprescindible para realizar
la infeccioacuten que la bacteria hueacutesped y se encuentre en fase logariacutetmica Es decir para
determinar la biomasa bacteriana se mide la cineacutetica de crecimiento celular y se considera
que se ha alcanzado la fase de crecimiento exponencial cuando la concentracioacuten es de 10⁸
UFCmL (McLaughlin et al 2006)
Para el conteo bacteriano se utilizoacute el meacutetodo de filtracioacuten por membrana
Se transfirioacute 1 mL del cultivo bacteriano fresco a 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC
Cada 30 minutos se recolectaron 300 microL de cultivo
A cada aliacutecuota recogida se le realizaron diluciones seriadas con 27 mL de agua
Materiales y meacutetodos
61
destilada esteacuteril hasta obtener un factor de 1010
De cada una de estas diluciones se obtuvieron 100 microL que se filtraron por membrana
de celulosa 045 microm (Millipore Corporation Billerica Ma 47 mm esteacuteril Cat No
JMX000089 Millipore) montada en un embudo de filtracioacuten magneacutetico de 47 mm (Pall
GELMAN Laboratory con capacidad de 300 mL) y con bomba de vaciacuteo (GM motors amp
industrial systems Modelo 5kh36kna510x)
Las membranas se colocaron en caja de Petri con TSA y se incubaron 24h a 37degC
C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos
Con excepcioacuten de la microscopiacutea electroacutenica los meacutetodos empleados para determinar el
tamantildeo forma y composicioacuten quiacutemica de los fago requieren una alta pureza de las partiacuteculas
virales El material de partida en cualquier estudio de este tipo para la obtencioacuten del fago es
cuando se presenten los halos de inhibicioacuten en el ADC en general ademaacutes de los fagos
estas zonas claras pueden contener los restos celulares de las bacterias como trozos de
pared membranas ribosomas ADN ARN proteiacutenas y otros componentes de peso molecular
maacutes bajo El contenido de fago en un lisado es del orden de 001 mg mL por lo que para
obtener la cantidad apropiada para su caracterizacioacuten es necesario partir de varios litros
(Leverentz et al 2003 Maestro y Sanz 2016)
Para llevar a cabo la purificacioacuten de los fagos se debe de realizar con concentraciones
superiores a 1010 UFPmL Uno de los meacutetodos maacutes utilizados es la centrifugacioacuten a alta
velocidad y posterior resuspensioacuten de las partiacuteculas sedimentadas en un volumen menor
Cuando es posible esta teacutecnica se reemplaza por un sistema de dos fases basado en la
propiedad que tienen algunos poliacutemeros de alto peso molecular como el polietilenglicol el
dextrasulfato de sodio y el dextrano al separarse estas fases por diferencia de pesos
moleculares los fagos se dispersan en este tipo de medios considerando las concentraciones
empleadas y las condiciones oacuteptimas de pH fuerza ioacutenica y temperatura y al pasar por el
proceso de centrifugacioacuten se concentran en una columna Una vez concentrado el fago en la
columna se puede recuperar faacutecilmente de la interfase Los procesos maacutes comuacutenmente
utilizados para la purificacioacuten posterior se basan en separar las partiacuteculas de fago ya sea por
su tamantildeo o densidad (Sambrook y Russell 2001 Vidales-Contreras et al 2006)
En la figura 7 se presenta el procedimiento para la amplificacioacuten de fagos que nos asegura
Materiales y meacutetodos
62
cultivos puros uniformes y con tiacutetulos altos lo cual es imprescindible para conseguir una
buena imagen en el microscopio electroacutenico
Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten de bacteriofagos aplicando la teacutecnica
de agar doble capa (ADC)
El meacutetodo utilizado para purificar los fagos que despueacutes de utilizaron para analizar su
morfologiacutea implicoacute el uso del kit Montage SEQ96 (Millipore Sequencing Reaction Cleanup Kit
Millipore Corporation EE UU)
En una placa de filtracioacuten (96 well SEQ plate by Millipore) se depositaron en cada
pocillo 15 microL de concentrado de fagos maacutes 5 microL de agua milli-Q (Injection Solution by
Millipore)
Materiales y meacutetodos
63
La separacioacuten se realizoacute por la exclusioacuten de lavados de la columna de gel aplicando
vaciacuteo por medio de una bomba (Millipore EE UU Vacuumpressure 220 V50 Hz 15 mm
Hg)
Posteriormente se resuspendioacute la muestra (Thermomixer comfort by Eppendorf) con
agitacioacuten durante 1 min a 500 rpm
Finalmente se agregoacute 10 microL de agua ultra pura Milli-Q para concentrar la muestra
(Injection Solution by Millipore)
Una de las modificaciones que se realizaron para obtener los fagos con elevada pureza y
concentracioacuten para ser utilizada en la microscopiacutea electroacutenica se realizoacute con el kit Montage
SEQ96 que se utiliza para la purificacioacuten de DNA y en este caso se utilizoacute para concentrar los
fagos (concentracioacuten 1012 UFPmL) El procedimiento se describe a continuacioacuten
Se antildeadieron 20 microL de buffer de inyeccioacuten a la placa donde se teniacutea la suspensioacuten de
fagos se resuspendioacute y transfirioacute todo el volumen a la placa azul de Millipore (kit Montage)
Se colocoacute la placa en la bomba del kit Montage de 2 a 3 min hasta que quedoacute seca
Es aconsejable no dejar maacutes tiempo del necesario para evitar un secado excesivo
Se limpioacute todo el exceso de liacutequido en la placa con papel filtro secando un par de
veces la placa sobre el papel Inmediatamente despueacutes se colocoacute la placa sobre el soporte
de la bomba evitando dejarla sobre el papel
Se antildeadieron 30 microL de buffer de inyeccioacuten
Se colocoacute la placa en la bomba unos 4-5 min hasta secarse
Con papel filtro se limpioacute todo el exceso de liacutequido que quedoacute en la placa y se colocoacute
en el soporte de la bomba
Se antildeadieron 30 microL maacutes de buffer de inyeccioacuten para resuspender
Se colocoacute la placa en agitacioacuten se centrifugoacute a 500 g por 10 min
Se traspasaron los 30 microL a un nuevo pocillo y se recolectoacute el sobrenadante
D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica
Con la concentracioacuten de fagos purificados se preparoacute la muestra para la observacioacuten al
microscopio electroacutenico y se procedioacute utilizando la teacutecnica de tincioacuten negativa tal como se
explica a continuacioacuten
Se depositaron 2 microL de suspensioacuten de fagos en un disco de capa fina de carbono y cobre
Materiales y meacutetodos
64
(200 Mesh Holes 100 microm square Ethene old 200 RU) despueacutes de 2 min de reposo a
temperatura ambiente se eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente Se antildeadieron 2
microL de agente de contraste solucioacuten tampoacuten 1 de acetato de uranilo (UO2middot (CH3COO)2middot2H2O)
(Merck Alemania) Se dejoacute actuar el colorante durante 2 min a temperatura ambiente y se
eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente y despueacutes se dejoacute el disco alrededor de 5
min a temperatura ambiente antes de observar en el microscopio
D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa
(DEM)
La microscopiacutea oacuteptica es el meacutetodo adecuado para la investigacioacuten de procesos celulares
ya que es menos agresivo para el manejo de la muestra Existen teacutecnicas de microscopiacutea con
otras especificaciones donde se aplican para estudiar la adhesioacuten celular y formacioacuten de
biofilms en superficies tales como el espectrofotoacutemetro infrarrojo transformada de Fourier el
laacuteser confocal de barrido y la microscopiacutea de fuerza atoacutemica estos microscopios se
caracterizada por detectar las ceacutelulas viables de las dantildeadas por medio de cromoacuteforos
(Montantildeez et al 2012) La microscopiacutea que estamos trabajando esta basada en fluorescencia
la cual utiliza cromoacuteforos para detectar DNA de ceacutelulas vivas (coloracioacuten verde) y ceacutelulas
muertas (coloracioacuten roja) y ha tenido grandes avances en la observacioacuten de tejidos ceacutelulas
moleacuteculas individuales y por consiguiente algunos restos celulares todos estos con una
excelente resolucioacuten (Pellegrotti et al 2014)
Para la observacioacuten de ceacutelulas mediante el DEM se utilizoacute el kit comercial de viabilidad Bac
Light (LIVEDEAD Bacterial Viability Kit L-13152 Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE
UU) que estaacute compuesto por dos colorantes fluorescentes de aacutecidos nucleicos (SYTOreg9 y
PISYTOreg9) que penetran tanto en las membranas intactas como en las lesionadas lo que
permite evaluar la vitalidad de las ceacutelulas bacterianas basaacutendose en la deteccioacuten de la
actividad de las oxidasas y reductasas bacterianas Se observa una sentildeal fluorescente
mejorada en ceacutelulas bacterianas con procesos metaboacutelicos activos En contraste PISYTOreg9
se manifiesta soacutelo en las ceacutelulas que presentan membranas lesionadas y desplaza el colorante
SYTOreg9 por la transferencia de energiacutea de la resonancia fluorescente Cuando se aplican
estos dos colorantes en proporcioacuten adecuada las ceacutelulas viables con membranas intactas
presentaraacuten fluorescencia verde y en contraste las ceacutelulas muertas o lesionadas tendraacuten
Materiales y meacutetodos
65
coloracioacuten roja (Berney et al 2007)
A continuacioacuten se describe la preparacioacuten de las muestras para ser observadas por el DEM
Se colocaron 2 microL de la concentracioacuten suspensioacuten de la muestra con fagos en una
concentracioacuten de 1x1012 UFCmL sobre un disco de acero inoxidable (tipo 14301 (2 cm de
diaacutemetro y 1 mm de grosor) ligeramente convexos con una altura maacutexima en el centro
de 1 mm
Se dejoacute secar a temperatura ambiente por espacio de 10 min
Posteriormente se aplicaron 2 microL de la solucioacuten vital de fluorescencia (LIVEDEAD Bac
Light Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE UU) que reacciona y da la coloracioacuten
al material geneacutetico de las bacterias
Para la observacioacuten de los discos se utilizoacute el microscopio de fluorescencia Olympus
BX51BX52 (Tokio Japoacuten) con caacutemara digital incorporada (DP 50 Olympus) equipado con
laacutempara de mercurio de 100 W (USH-103 OL Olympus) con filtro de doble paso (U-M51004
FR V2 Olympus)
Para enumerar las ceacutelulas bacterianas en el biofilm que se formo en los discos de
acero inoxidable se trabajoacute con un objetivo de 20X y se ubicaban 10 campos
aleatoriamente y los resultados se expresaron por cm2 Las imaacutegenes se revisaron con el
sistema de anaacutelisis de imagen (anaacutelisis 32 soft Imaging System GMBH Alemania)
El biofilm bacteriano se desarrolloacute en la superficie de discos de acero inoxidable tipo
14301 Antes de usarse deben limpiarse bien por inmersioacuten en una solucioacuten acuosa de
detergente (DINO-dis-Dipol Espantildea) al 5 en agua durante 1 h despueacutes se realizoacute la
inmersioacuten en bantildeo con alcohol isopropiacutelico (2-propanol) (Merck Alemania) al 70 en agua
durante 15 min Una vez secos se esterilizaron en autoclave a 121degC por 15 min
D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM
Se inocularon la superficie de los discos con 50 microL de cultivo de S enterica maacutes medio de
cultivo (TSB) para proporcionar en medio rico para que se forme el biofilm posteriormente se
colocaron en cajas de Petri esteacuteriles y se mantuvieron en condiciones de humedad a
temperatura ambiente durante periacuteodos de 24 48 y 72h realizaacutendoles el conteo
correspondiente para verificar el desarrollo del biofilm
Materiales y meacutetodos
66
Una vez formado el biofilm se inocularon los discos con 3 concentraciones diferentes de
fagos 6 7 y 8 logcm2 en un volumen inferior a 50 microL Las diluciones del fago se hicieron en
solucioacuten salina fisioloacutegica (SSF cloruro de sodio 080) (Merck Alemania) Se realizoacute la
infeccioacuten al inocular a los discos prueba y los discos de control con el mismo volumen de SSF
las condiciones de incubacioacuten se realizaron con humedad y a temperatura ambiente
Los discos de acero inoxidable que fueron inoculados con la infeccioacuten fago-bacteria se
analizaron en periacuteodos de 0 2 8 24 y 48 h Se utilizaron para la valoracioacuten de bacterias y
fagos y se distribuyeron los discos de la siguiente manera 2 para visualizacioacuten microscoacutepica
panoraacutemica 2 para recuento bacteriano por microscopiacutea y 2 para recuento bacteriano dando
un total de 6 discos por caja de Petri por duplicado y por cada concentracioacuten (3) por cada
ensayo (3) y por horarios (5) de dando un total de 540 discos
Para el conteo sobre cada disco se colocaron 20 microL del colorante (LIVEDEAD Pribes) y
se incubaron por 5 min a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad y se tomaron
fotografiacuteas a 10X 20X y 40X Para la microscopiacutea de conteo las fotografiacuteas se realizaron a
un aumento de 40X considerando 10 campos aleatorios
Cuando se formoacute el biofilm se requirioacute hacer los recuentos de bacterias y de fagos en ese
sentido para recuperar las bacterias los discos se colocaron en un frasco con 5 mL de TSB
con Tween 80 (TSBTW) (Merck Alemania) y 3 g de perlas de vidrio se homogeneizoacute la
muestra por 1 min en agitador voacutertex a maacutexima potencia para favorecer el desprendimiento
de los microorganismos y posteriormente se realizaron diluciones seriadas De este mismo
extracto se obtuvo el material necesario para hacer el conteo de fagos utilizando la teacutecnica de
ADC Y para el recuento de las bacterias viables se trabajoacute con cajas de Petri se sembroacute 1
mL en TSA con 06 de extracto de levadura (TSAYE Merck Alemania) y se incuboacute a 37degC
durante 24h (Fuster-Valls et al 2008)
67
V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Resultados y discusioacuten
68
Resultados y discusioacuten
69
A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras
De los 10 sitios de recoleccioacuten se lograron obtener un total de 39 muestras en junio de
2007 En la tabla 9 se presentan los sitios y el nuacutemero de muestras recogidas en cada sitio
En el caso del Riacuteo Santa Catarina se abarcoacute una distancia de 95 km la cual presentaba
diferentes zonas de descarga de aguas residuales y de ahiacute se hicieron las tomas en un periacuteodo
de estiaje En el caso de las lagunas de oxidacioacuten del municipio de Mariacuten esta zona presenta
tres lagunas con un aacuterea total de 16700 m2 se realizoacute el muestreo de manera aleatoria En
cuanto a las muestras que se obtuvieron en el sitio de comercializar carne de pollo se les tratoacute
de igual manera para comprobar si existiacutean fagos
Los lugares elegidos para la recoleccioacuten de muestras son similares a los reportados en la
literatura regularmente para el aislamiento de fagos del ambiente se utilizan aguas residuales
y establecimientos de manipulacioacuten yo venta de alimentos (Leeuw et al 2017) En
investigaciones previas se realizan muestreos de diversos sitios como en la piel y heces de
animales manos de los cuidadores superficies quiruacutergicas e instrumentos o utensilios usados
en los establecimientos hoteles y restaurantes (Ejo et al 2016 Yergeau et al 2016) Los
muestreos de aguas tambieacuten se pueden realizar en sitios cercanos a las salidas de drenaje
de hospitales esto es de gran importancia ya que donde hay bacterias posiblemente esteacuten
sus respectivos fagos (Tomat et al 2014 Mattila et al 2015 McShan y Nguyen 2016)
Resultados y discusioacuten
70
Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos
B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis
Para el aislamiento de los fagos especiacuteficos de Salmonella fue necesario la puesta a punto
de varios procedimientos la teacutecnica de agar doble capa (ADC) determinar la cineacutetica de
crecimiento de cultivos de Salmonella determinar la fase de eclipse en la relacioacuten fago-
bacteria (se utilizoacute como control la cepa S Typhimurium y el fago PRD1) y su puesta a punto
en el laboratorio de bioremediacioacuten de la Facultad de Agronomiacutea de la UANL
B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S
Typhimurium
La accioacuten liacutetica de los fagos sobre Salmonella se analizoacute utilizando la teacutecnica ADC
En este procedimiento es necesario tener un ceacutesped bacteriano uniforme entre dos capas
de medio soacutelido que puede ser agar-agar o agar-agarosa (Sambrook y Rusell 2001)
Con el objetivo de abaratar los costes y mejorar los resultados en este trabajo se empleoacute
esta teacutecnica con algunas modificaciones que se describen a continuacioacuten Asiacute pues se decidioacute
que las capas fueran agar-agar donde la primera capa fue de agar al 15 en medio TS y la
Municipio Sitio de la toma N de muestras
Tipo de agua
Monterrey
Parque Fundidora 3 Estanque y corriente
Riacuteo Santa Catarina 10 Corriente
Establecimiento de comida 2 Lavado del pollo
Av Conductores 2 Corriente
Mariacuten
Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal
10 Estanque y corriente
Riacuteo La Libertad 2 Corriente
Guadalupe
Alcantarillas de la colonia La Azteca
3 Corriente
Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados
2 Lavado del pollo
San Nicolaacutes de los Garza
Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac
2 Corriente
Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea 3 Corriente
Resultados y discusioacuten
71
segunda con agar a una menor concentracioacuten para hacer la capa menos firme por lo que fue
necesario poner a punto la teacutecnica probando diferentes concentraciones de agar en ambos
casos a pH 72 Ademaacutes esta adecuacioacuten es importante por el ahorro que se generoacute al utilizar
un componente maacutes econoacutemico que la agarosa lo cual repercutioacute favorablemente en el coste
de la prueba
Otra variable para poner a punto en la teacutecnica de ADC es el volumen de cultivo bacteriano
a utilizar para generar el ceacutesped de Salmonella y lograr una adecuada interaccioacuten con el fago
Se probaron 3 voluacutemenes diferentes de cultivo de S Typhimurium incubados 24 horas a 37oC
para alcanzar una concentracioacuten de 16 x 108 UFCmL Dependiendo de la cantidad de inoacuteculo
las caracteriacutesticas del ceacutesped bacteriano tienen diferente contraste lo cual puede facilitar o
dificultar la observacioacuten de las placas liacuteticas Finalmente el mejor resultado se obtuvo al
utilizar el volumen de 500 L ya que se logroacute una mejor observacioacuten del aclaramiento del
ceacutesped bacteriano al formar las placas liacuteticas En la tabla 10 se muestran las caracteriacutesticas
de las capas en la caja Petri para un buen manejo y desarrollo de la zona liacutetica producida por
el fago al multiplicarse
Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC
Paraacutemetro Condiciones
Agar suave (con agar) () 08
Temperatura del agar suave (degC) 49
pH del medio de cultivo (soacutelido y liacutequido) 72
Cantidad de agar suave (mL) 45
Cultivo bacteriano (microL) 500
Muestra tratada con fagos (microL) 100
Resultados y discusioacuten
72
B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium
El cultivo hueacutesped debe de encontrarse creciendo en medio liacutequido TS en fase logariacutetmica
al momento de mezclarlo con el fago Para identificar la fase logariacutetmica se probaron
diferentes tiempos de crecimiento Con todo ello se observa que la fase logariacutetmica de S
Typhimurium se encuentra en el minuto 150 coincidiendo con los datos reportados por
Vidales-Contreras et al (2006) Y siguiendo con mi tesis la determinacioacuten de la concentracioacuten
se realizoacute mediante el promedio de la enumeracioacuten de las UFC por placas Petri preparadas
por duplicado multiplicado por el factor de dilucioacuten el cual es el reciacuteproco del producto del
volumen ensayado y la dilucioacuten usada para el anaacutelisis Al final se observa cuando se ha
llegado a la fase estacionaria del desarrollo bacteriano (tabla 11) Se utiliza un factor de
dilucioacuten el cual se obtiene como el reciacuteproco de la multiplicacioacuten de volumen de ensayo y la
dilucioacuten usada en el anaacutelisis
Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium
Tiempo Minutos
(Acumulado) Dilucioacuten
UFCmL Promedio
F (Factor) Concentracioacuten
(UFCmL)
T0 0 1 x 10-5 9 plusmn 25 1 x 106 900 x 106
T1 30 1 x 10-5 13 plusmn 74 1 x 106 130 x 107
T2 60 1 x 10-5 24 plusmn 56 1 x 106 240 x 107
T3 90 1 x 10-5 51 plusmn 32 1 x 106 510 x 107
T4 123 1 x 10-5 211 plusmn 89 1 x 106 211 x 108
T5 150 1 x 10-6 215 plusmn 81 1 x 107 215 x 109
Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)
B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis
Las consideraciones tomadas del modelo infectivo S Typhimurium y el fago PRD1 y
utilizando la teacutecnica ADC se replican para poner a punto a la bacteria que se quiere probar
que en este caso es S Typhi ATCC 19430 Los resultados de estos ensayos se pueden
observar en la tabla 12 en la que se puede observar que es ligeramente mayor la etapa donde
Resultados y discusioacuten
73
se puede realizar la infeccioacuten (fase de eclipse) de los fagos aislados y la bacteria hueacutesped
Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis (108 UFCmL) (37 ordmC24h)
Tiempo Minutos (Acumulado)
Dilucioacuten UFCmL Promedio
F (Factor) Concentracioacuten (UFCmL)
T0 0 1 x 10-5 216 710 1 x 106 20 x 107
T1 60 1 x 10-5 260 608 1 x 106 20 x 107
T2 120 1 x 10-6 160 173 1 x 107 16 x 108
T3 180 1 x 10-6 244 208 1 x 107 24 x 108
T4 240 1 x 10-7 400 100 1 x 107 40 x 109
Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)
B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis
De los sitios muestreados se logro obtener 39 muestras y se obtuvo un total de 15 fagos
aislados a partir de dos fuentes de aguas residuales las del Riacuteo Santa Catarina y las lagunas
de oxidacioacuten de Mariacuten Los 15 fagos se nombraron consecutivamente como MRH 1-15 Los
15 fagos se probaron contra la cepa hueacutesped S Enteritidis (CINSP tabla 4) tras realizar de
3 a 4 amplificaciones la mayoriacutea (14 fagos) no presentoacute actividad liacutetica (formacioacuten de halos
de inhibicioacuten) de manera que fueron descartados para los siguientes estudios siendo
solamente uno proveniente de la muestra del Rio Santa Catarina el que produjo halos bien
definidos en el ceacutesped bacteriano y con eacuteste se continuoacute trabajando El fago que mantuvo la
actividad liacutetica fue el MRH6 Se propuso nombrarle como MRH considerando la M para
muestra la RH por el Rodrigo Hernaacutendez
B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten
La principal caracteriacutestica de los fagos es cuando forman halos de inhibicioacuten (tambieacuten
llamadas zonas liacuteticas o calvas) y en nuestro estudio las muestras de agua recolectadas
fueron tratadas y analizadas mediante la teacutecnica ADC observando los halos de inhibicioacuten
claros y de diferentes diaacutemetros estas observaciones son similares a las observadas por
Ackermann (2003) Tanto la cantidad de UFP que se pueden desarrollar y observar hecha por
Resultados y discusioacuten
74
los fagos y la pureza en que encuentren los bacterioacutefagos de las muestras obtenidas del medio
ambiente estaacuten directamente relacionadas la especificidad contra la bacteria Al sembrar por
vaciado en placa estos lisados sobre la cepa indicadora se obtuvieron diferentes tamantildeos de
placas liacuteticas
En la figura 8 se muestran los halos de inhibicioacuten en ceacutesped de Salmonella al realizar la
infeccioacuten se pueden observar los diferentes tamantildeos y la forma se da por la capacidad de
raacutefaga (nuacutemero de copias al realizar el proceso liacutetico) de los fagos de la progenie los fagos
suelen tener una raacutefaga de maacutes de 100 partiacuteculas infectivas producidas en un lapso de tiempo
de 05 ndash 20 h Algunos halos formados por el fago fueron claros lo que indica que es liacutetico de
acuerdo con diversos autores (Sambrook y Rusell 2001 Vidales-Contreras et al 2006 Wong
et al 2014) En nuestro estudio se batalloacute en encontrar fagos a pesar de buscar sitios
sentildealados por autores antes mencionados
Al intentar obtener fagos puede suceder que se encuentren en concentraciones tan
pequentildeas que al probarlos contra alguna cepa hueacutesped no sirven para trabajar por lo que se
llevoacute a cabo repeticiones seriadas (amplificacioacuten) asegurando que al formar una placa de Petri
en ADC con tamantildeos de los halos de inhibicioacuten iguales lo que nos indica que pertenecen a
una sola especie de fago
Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por fagos con halos de inihibicioacuten de
diferentes tamantildeos
Resultados y discusioacuten
75
C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli
La clasificacioacuten de los fagos se puede establer en base a su morfologiacutea al aacutecido nucleico
al espectro de accioacuten y algunas consideraciones inmunoloacutegicas (Criscuolo et al 2017) Al
realizar la infeccioacuten de fago-bacteria y observar la presencia de halos liacuteticos en las placas de
ceacutesped bacteriano se considera que se ha producido una infeccioacuten exitosa pero previamente
es necesario poner a punto el cultivo puro de ambos cultivos y considerar la concentracioacuten de
cultivos a utilizar
Al seleccionar los fagos que presentaron uniformidad en cuanto a la inhibicioacuten y posterior
evaluacioacuten de los fagos se consideraron varios factores entre ellos el tiempo que tarda la
replicacioacuten viral (lo cual es variable) siendo que en algunos casos se pueden replicar en
cuestioacuten de minutos A simple vista se pueden observar la formacioacuten de halos de lisis en el
ceacutesped bacteriano en las cajas de Petri
Asiacute pues la teacutecnica ADC se repitioacute varias veces hasta obtener placas liacuteticas con ideacutentica
morfologiacutea y tamantildeo En la tabla 13 se observa que hay diferentes tamantildeos de halos En los
primeros ensayos soacutelo cuatro muestras de agua (15 21 26 y 33) dieron halos de inhibicioacuten
pudieacutendose distinguir bien la forma y el tamantildeo Al realizar posteriores siembras los fagos
fueron perdiendo capacidad de infeccioacuten (fagos atemperados) y soacutelo la muestra 21 de las
lagunas de oxidacioacuten provenientes de Mariacuten presentoacute fagos con actividad liacutetica y el resto de
fagos no desarrolloacute actividad constante
Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten de S Enteritidis en ceacutesped
bacteriano
Diaacutemetro de halo grande ge 8mm mediano 8 lt X lt6mm pequentildeo le 5mm
Distribucioacuten de tamantildeos de halo
Muestra de agua Grande Mediano Pequentildeo
15 8 23 15
21 17 11 27
26 10 18 6
33 7 9 13
Diaacutemetro medio halo (mm) 1055 0671 0376
Resultados y discusioacuten
76
En la tabla 14 se presenta el listado de posibles hueacutespedes probados 12 cepas de
Salmonella y 4 de E coli que se probaron contra los 15 fagos aislados previamente Se puede
distinguir que afecta a algunas serovariedades de Salmonella y no tiene efecto en otras
serovariedades entericas No afecta nada a las cepas de E coli Se ve que la cepa maacutes
afectada por el fago es la S Typhi ATCC 19430 y otras cepas de Salmonella son afectadas
ligeramente
Resultados y discusioacuten
77
Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades de Salmonella spp y de E coli
serovariedades Fagos
M
R
H
1
M
R
H
2
M
R
H
3
M
R
H
4
M
R
H
5
M
R
H
6
M
R
H
7
M
R
H
8
M
R
H
9
M
R
H
1
0
M
R
H
1
1
M
R
H
1
2
M
R
H
1
3
M
R
H
1
4
MR
H15
S Typhimurium ATCC 13311
-
-
t
- -
t
- - - - - - - - -
S Paratyphi ATCC 9150 - - - - - - - - - - - - - - -
S Enteritidis ATCC 13076 - - - - - - - - - - - - - - -
S Typhi ATCC 19430 + + + + + t
c
+ + + n
d
n
d
n
d
n
d
nd +
S Typhimurium - - - - - - - - - - - - - - -
S Bongori ATCC 43975 - - - - - - - - - - - - - - -
S enterica LT2 - - - + + + - - - - - - - -
S sub enterica CECT 4138 - - - - + + + - - - - - - - -
S sub enterica CECT 4594
t
t
t
- + + + - - -
t
- - - -
S sub enterica CECT 409 - - - - n
d
- -
t
- - - - - - -
S sub enterica CECT 698 - - - - - t
c
- - - - - - - - -
S Typhimurium CCUG
29478
- - - + + - - - - - - - -
E coli CECT 515 - - - - - - - - - - - - - - -
E coli K12 - - - - - - - - - - - - - - -
E coli ATCC 10536 - - - - - - - - - - - - - -
E coli O157H7 CECT 4783 - - - - - - - - - - - - - - -
+ crecimiento y desarrollo de halo indica desarrollo muy pequentildeo o difuso del halo t indica desarrollo pequentildeo y turbio del halo tc indica turbio o con centro opaco en el centro del halo - no crecimiento o desarrollo de halo nd aparente baja efectividad o halo difuso
Resultados y discusioacuten
78
Resultados y discusioacuten
79
El fago que siacute mostroacute actividad (MRH6) y que mantuvo la capacidad liacutetica durante las
diferentes amplificaciones se trabajoacute de manera continua hasta obtener halos uniformes en el
tamantildeo y asiacute ya se considera como una entidad pura de fago Los resultados obtenidos en
este trabajo son semejantes a los mostrados por Thung et al (2017) En la figura 9 se
presentan las imaacutegenes donde se muestra el desarrollo de halos liacuteticos previamente
mencionados donde se puede observar los halos uniformes contra A) S Enteritidis (CINSP)
y B) S Typhi ATCC 19430 (UAB)
Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria A) S Enteritidis (CINSP) y B) S Typhi ATCC 19430
La especificidad de los fagos se encuentra generalmente a nivel de cepa y tambieacuten de
especie y maacutes raramente a nivel de geacutenero Es de intereacutes el garantizar una eficiente infeccioacuten
de la dupla fago-bacteria de esta manera se toman todas las medidas precautorias para
obtener resultados fiables en este sentido se requiere verificar todos los aspectos como son
los controles (positivo y negativo) En el caso del control negativo se verificoacute el desarrollo
solamente del ceacutesped bacteriano de la cepa hueacutesped con la teacutecnica ADC y como control
positivo se consideroacute el modelo del fago PRD 1 y S Typhimurium los fagos son altamente
especiacuteficos (no afecta a otros cultivos bacterianos) y no se puede descartar falsos positivos
por la presencia de restos celulares bacterianos (Segundo et al 2010 Szafranski et al 2017)
Resultados y discusioacuten
80
D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM
El ICTV clasifica a los fagos en 1 orden13 familias y 31 geacuteneros De los cuales se
observa al orden de los Caudovirales el cual comprende a la mayor parte de los fagos (en
torno a un 95)y estos estaacuten constituidos por 3 familias con cola Myoviridae Podoviridae
y Siphoviridae Con estas caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas mediante el TEM en la
figura 10 se presentan las imaacutegenes del fago MRH6
El anaacutelisis de una suspensioacuten de fagos con una concentracioacuten de 1x1012 UFPmL mediante
microscopiacutea electroacutenica muestra una distintiva morfologiacutea de cabeza icosaeacutedrica estructura
alargada y cola no contraacutectil La caacutepside tiene un diaacutemetro de 55-60 nm y la cola puede
alcanzar los 570 nm Estas caracteriacutesticas se corresponden con la familia Siphoviridae Yang
et al (2017) comentan que esta familia de fagos se encuentra frecuentemente en
enterobacterias
Figura 10 Imagen por TEM del fago MRH6 (X100 000) la barra representa 100nm (Servicio de Microscopiacutea UAB)
Resultados y discusioacuten
81
D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero
inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de
epifluorescencia directa (DEM)
Para corroborar la potencial condicioacuten como agente de desinfeccioacuten del fago MRH6 es
necesario observar su efectividad a traveacutes de la DEM con la que se pueden observar
bacterias viables y no viables Tambieacuten la materia orgaacutenica puede dar falsos positivos y se
debe tener en cuenta al comparar con otros meacutetodos de conteo (Montantildeez et al 2012)
En este trabajo S Typhi ATCC 19430 desarrolloacute biofilms en las superficies de acero
inoxidable (discos tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm) y consiguieron
niveles de 29 plusmn 02 UFCcm2 despueacutes de tener un maacuteximo de 72 h en incubacioacuten en
condiciones de humedad y temperatura ambiente tal como se puede observar en la figura 11
Estos biofilms tienen distinta intensidad seguacuten el tiempo de incubacioacuten siendo los periodos
evaluados de 24 48 y 72h respectivamente En estas condiciones se realizoacute el recuento en
tres zonas de cada disco para cada tiempo de incubacioacuten y los resultados se presentan en la
figura 12 Para tener fiabilidad de los resultados se realizaron los conteos por triplicado porque
el manejo de los discos es muy complejo y para evitar errores de manejo se consideroacute
necesario tener maacutes de una muestra otorgando ademaacutes la oportunidad de comparar
resultados y tener un margen de referencia en cuanto a los resultados obtenidos
Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 en
diferentes tiempos de incubacioacuten (24 48 y 72h) a temperatura ambiente
Resultados y discusioacuten
82
Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable incubados a temperatura ambiente n = 3
En este estudio se compararon 2 meacutetodos de conteo de bacterias despueacutes de ser atacadas
por los fagos eacutestos fueron el recuento en placa de agar y por otro lado la observacioacuten por
microscopiacutea de epifluorescencia y la relacioacuten entre ambos meacutetodos Desafortunadamente se
han perdido los resultados por un problema irresoluble pero si se puede comentar que existe
una relacioacuten ligeramente inferior a 09 (R2 ) Esta observacioacuten ya ha sido presentada
anteriormente por otros autores (Fuster-Valls et al 2008 Engelhardt et al 2014)
El cultivo bacteriano se puede contabilizar por conteo en placa directo (TSA) este meacutetodo
es utilizado generalmente para cultivos de geacutermenes no exigentes o moderadamente
exigentes y cuando se quiere visualizar como afecta el ataque de los fagos las ceacutelulas
bacterianas se visualizan por DEM (cuya coloracioacuten cambia a verde cuando han sido atacadas
por los fagos) y una forma de visualizar este ataque es por medio de TSA con la teacutecnica de
ADC
0
5
10
15
20
25
0 10 20 30 40 50 60
Co
nte
o (
Lo
g U
FC
cm
2)
Tiempo (h)
Crecimiento bacteriano
Resultados y discusioacuten
83
D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable
Se aplicoacute la DEM para evaluar la efectividad del fago MRH6 en el control de S Typhi ATCC
19430 sobre superficies de acero inoxidable en condiciones de humedad El fago MRH6 es
liacutetico capaz de disgregar los biofilms
El analizar la accioacuten liacutetica del fago sobre Salmonella por medio del DEM es muy importante
e innovador pero el material que se utiliza y la manera en que se comportan las diferentes
bacterias hacen que se deba ser muy precavido al considerar el uso de este meacutetodo como
adecuado para realizar conteos (Libuchi et al 2010) Por ejemplo se debe tener en cuenta
que existen bacterias que no forman un biofilm y presentan movimiento esto puede llegar a
complicar el visualizarlas si no estaacuten en el campo por lo que se podriacutea pensar que fueron
atacadas y eliminadas por los fagos o bien que por los diferentes lavados se barrieron
La DEM con la tincioacuten LIVEDEAD reveloacute la presencia de ceacutelulas viables con coloracioacuten
verde En la figura 13 se puede observar el efecto letal del fago MRH6 sobre la poblacioacuten de
S enteacuterica disminuyendo su cantidad considerablemente en base a el tiempo de incubacioacuten
en color verde Se observa que hay disminucioacuten de las ceacutelulas de S Typhi ATCC 19430 al ser
atacadas por el fago MRH6 Recordemos que la infeccioacuten con el MRH6 se realizoacute despueacutes de
formar un biofilm a temperatura ambiente y con humedad por espacio de 72h en 3
concentraciones 6 7 y 8 UFPmL Al paso del tiempo se aprecia que a las 48h hay pocas
ceacutelulas vivas al menos detectadas por la teacutecnica utilizada
Resultados y discusioacuten
84
a)
b)
c)
Figura 13 Secuencia de imaacutegenes de epifluorescencia que ilustran la destruccioacuten de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable causada por el fago MRH6 tras incubacioacuten de 0 8 24 y 48 h y con 3 concentraciones de fagos a) 6 b) 7 y c) 8 UFPmL respectivamente
La DEM es un meacutetodo altamente sensible que se caracteriza por la formacioacuten de imaacutegenes
amplificadas y es considerada una teacutecnica poderosa con altos niveles de sensibilidad y
resolucioacuten Tomando como referencia los resultados se considera que la DEM es una
herramienta eficaz para el conteo bacteriano pero hay que considerar la experiencia del
observador
Resultados y discusioacuten
85
En algunas ocasiones al observar las bacterias atacadas por los fago se pueden encontrar
muestras con material geneacutetico mezclado con restos celulares esta situacioacuten hace que
algunos investigadores recomienden extraer los fagos de la muestra antes de sembrar las
bacterias con el fin de determinar la reduccioacuten bacteriana uacutenicamente debida a la actividad
virulenta del fago sobre la muestra y no a la infeccioacuten por fagos libres presentes en el agar
(Sharma et al 2009) En ese sentido tal como reporta Fuster-Valls et al (2008) en su trabajo
observoacute que el limite de deteccioacuten de esta teacutecnica es de 279 log10 celulas por cm2 en cambio
en nuestro trabajo y tal como se observa en la figura 14 se pudo llegar a una sensibilidad
muy proacutexima a 2 y que coincide con las imaacutegenes de la figura 13 en las que a las 24 y 48
horas apenas se observan algunas manchas que corresponden al crecimiento bacteriano
Los fagos utilizan los recursos de la ceacutelula para hacer muchos fagos nuevos lo que causa
que la ceacutelula lise (estalle) y muera en el proceso La lisis en las uacuteltimas etapas del ciclo liacutetico
el fago expresa los genes para las proteiacutenas que hacen agujeros en la membrana plasmaacutetica
y la pared celular En la figura 14 se puede observar como el recuento de Salmonella Typhi
ATCC 19430 disminuye por el ataque del fago MRH6 El efecto del fago es muy fuerte y al
final los conteos son muy parecidos
Resultados y discusioacuten
86
Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 en superficies de acero inoxidable por el fago MRH6 con diferentes concentraciones y hasta 48 h de incubacioacuten
En este trabajo se buscoacute crear condiciones de infeccioacuten fago-bacteria en el laboratorio
como las que se pudieran presentar en la industria Los resultados de esta relacioacuten del fago
MRH6 y S Typhi ATCC 19430 muestran que la aplicacioacuten del fago es efectiva pero hay que
considerar que funciona mejor a altos tiacutetulos (108 UFCmL) y que deberaacute de potenciarse
cuando se trate de un coctel de fagos
Nuestros resultados sugieren que los fagos pueden ser utilizados como un meacutetodo para
controlar un biofilm formado por un bacteria especiacutefica
Al realizar la buacutesqueda de informacioacuten en diferentes motores de buacutesqueda una de las
plataformas de libre acceso (Pubmed) se obtuvo una relacioacuten de 5 en publicaciones de
00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Salm
on
ella
Typ
hi
AT
CC
19430
(lo
g1
0ceacutelu
las cm
2)
Tiempo (h)
Fago MRH6 a 6 Logml Fago MRH6 a 7 Logml Fago MRH6 a 8 Logml Control sin fago
Resultados y discusioacuten
87
fagos contra diferentes serovariedades de Salmonella spp lo que se puede traducir en que
hay un aacuterea de oportunidad latente
Las consideraciones que se enviacutean como propuesta es que existen en estos momentos
muchos trabajos sobre fagos pero aquiacute en Meacutexico no hay trabajos reportados y los que
existen estaacuten apenas en fases iniciales
Existe un enorme potencial de trabajo en esta aacuterea con los fagos tal es el caso de la
fagoterapia en otros sitos y en otros tiempos estaacuten realizando experimentos para ser
explotada como alternativa para todos los aacutembitos desde hogares industria salud animales
vegetales etc Por lo menos en EE UU tienen grandes avances en estudios relacionados
con la aplicacioacuten en bacterias multiresistentes que por el uso de antibioacuteticos han mutado esto
en el sector salud donde se estaacute perdiendo la batalla
Una de las fortalezas de estudiar a los fagos es que antes de que los antibioacuteticos fueran
descubiertos habiacutea investigacioacuten considerable sobre los fagos como tratamiento para las
enfermedades bacterianas humanas por lo menos en parte de Europa La aplcacion de los
fagos es potencialmente son buenos candidatos para tratar enfermedades bacterianas en
seres humanos inocuidad aliemnaria bioremediacioacuten y cada regioacuten tiene fagos endeacutemicos y
este tabajo representa de los primeros en llevarse en Monterrey
Ciertas limitaciones de los resultados se debiooacute a las condiciones que se presentaron al
realizar el estudio (laboratorio equipo conocimiento del tema) solamente se pudo aislar un
fago y lo recomendable es que sean varios fagos dado que son muy especiacuteficos de especie
o hasta de cepa Se proboacute su accioacuten sobre superficies con un solo cultivo bacteriano y en la
realidad las superficies se contaminan con diferentes bacterias
Lo que se vizualiza para nuestro estudio es sugerir varias liacuteneas de accioacuten a futuro Por
ejemplo el fago aislado podriacutea probarse in vivo sobre carne de pollo o fagoterapia tambieacuten
podriacutea continuar los estudios para aislar maacutes fagos y hacer mezclas (coacutecteles) que tuvieran
un mayor rango de actividad y combatir a diversas especies de Salmonella Con respecto al
tratamiento de superficies podriacutean utilizarse coacutecteles de fagos para tratar biofilms bacterianos
formados por maacutes de dos especies o inclusive podriacutean probarse en biopeliacuteculas industriales
reales
Resultados y discusioacuten
88
89
VI CONCLUSIONES
90
Conclusiones
91
De las 39 muestras de agua analizadas se aislaron tentativamente15 fagos de los que soacutelo 4
mantuvieron en un primer momento su actividad liacutetica estos fagos se correspondieron con las
muestras de agua 15 21 26 y 33 Se siguioacute trabajando con ellos y finalmente solo uno de
ellos el MRH6 mantuvo su actividad liacutetica despueacutes de varias amplificaciones este fago se
aisloacute de las aguas residuales de Mariacuten
Se consiguioacute optimizar la teacutecnica ADC cambiando la agarosa que tiene un alto costo por
agar-agar maacutes econoacutemico sin alterar la fiabilidad de la teacutecnica ademaacutes con este cambio se
facilita el manejo
En relacioacuten con la especificidad de los 15 fagos aislados frente a las 16 cepas de
enterobacterias probadas (12 cepas de Salmonella spp y 4 de E coli) se observa ciertas
tendencias marcadas Ninguno de los fagos ataca a las cepas de E coli probadas En cuanto
a Salmonella se observa una fuerte especificidad frente a S Typhi (ATCC 19430) una ligera
actividad frente a varias cepas de S enterica y no hubo efecto contra las demaacutes cepas de
Salmonella ensayadas lo cual confirma la elevada especificidad fago-hueacutesped
Las imaacutegenes obtenidas mediante DEM muestran una morfologiacutea caracteriacutestica de cabeza
icosaeacutedrica estructura alargada y cola no contraacutectil que sugieren que el fago MRH6 se puede
clasificar en la familia Siphoviridae
Se observa un efecto liacutetico progresivo del fago MRH6 frente a biofilms de Salmonella en
discos de acero inoxidable llegando a valores miacutenimos inferiores a 102 a las 48 horas de
incubacioacuten para todas las concentraciones de fago utilizadas (6 a 8 UFPmL)
Se comprueba que la DEM es un buen meacutetodo para la cuantificacioacuten del crecimiento de S
Typhi (ATCC 19430) sobre discos de acero inoxidable con una gran sensibilidad y resolucioacuten
ya que se observaron claras diferencias en los diversos tiempos de incubacioacuten ensayados y
a diferentes concentraciones del fago MRH6 Esto confirma que la teacutecnica es una herramienta
eficaz para valorar el efecto liacutetico de los fagos sobre biofilms
Ya que en este trabajo solamente se obtuvo un fago liacutetico se sugiere reflexionar acerca de
los factores que han dificultado la obtencioacuten de un nuacutemero maacutes amplio de fagos
Conclusiones
92
Este trabajo refleja el gran intereacutes por iniciar o regresar a trabajar con fagos tal como esta
sucediendo en otras partes del mundo Hasta el momento hay muchas espectaivas sin
embargo todaviacutea se necesita investigacioacuten para saber queacute tan seguros son
93
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106
Functional Genes in Biosolids from Two Different Wastewater Treatment Facilities in
Canada Plos One 11(4)
Zaidi MB Loacutepez Maciacuteas C y Calva E (2006) Estudios mexicanos sobre Salmonella
epidemiologiacutea vacunas y biologiacutea molecular Rev Latinoam Microbiol 48(2) 121-125
Dedicatorias
Con mucho carintildeo a mi Sentildeor padre Bartolomeacute Hernaacutendez Balbuena (dagger) y a mi Sentildeora
madre Lucia Santiago Santos son un ejemplo en mi vida ya que ellos son fundamentales
en mi formacioacuten como persona
A mis hermanos Flavio Viacutector Manuel Guadalupe Hilda (dagger) porque siempre
estuvieron alliacute alentaacutendome en este trabajo con palabras experiencias etc
A mi prometida y futura esposa Dontildea Rosa Salas Martiacutenez desde que inicmos a estar
juntos siempre estaacute apoyaacutendome en todos los aspectos y en todas las cosas que he
emprendido y que con algunas locuras que se nos pueda ocurrir mas adelante nos
llevaraacute a mejores cosas cada diacutea
A mi hija Gabriela Sarahi Hernaacutendez Flores ella es lo que maacutes aprecio y espero vea
en mi un ejemplo que sirva para alentarla a ser cada diacutea mejor y sacar todas las cosas
que se proponga adelante
A mis compantildeeros y amigos Vannesa Fabio Fontecha Abel Rita Jacira Kathy
Genaro Fabio Poliseli Dora Cecilia Diana Angela Sonia Dolors Marco y Cristina por
las convivencias durante mi estancia en Espantildea que de alliacute solo me llevo grandes
recuerdos
A mis compantildeeros Mirna Patty Letty Tere Adelita Luluacute Betty Marco Arnoldo Joseacute
Luis y Gustavo que compartimos buena cantidad de tiempo gracias por las convivencias
y por los muchos trabajos que hicimos en equipo
CONTENIDO RESUMEN 1
SUMMARY 3
RESUM 5
I INTRODUCCIOacuteN 7
Presentacioacuten del proyecto 9
Justificacioacuten 10
II ANTECEDENTES 13
A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos 15
A1 Problemaacutetica 16
A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea 17
B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria 19
B1 Escherichia 19
B2 Campylobacter 20
B3 Enterobacter 21
B4 Listeria 22
B5 Salmonella 23
B51 Origen 23
B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp 25
B53 Manifestaciones cliacutenicas 27
B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis 28
C Crecimiento microbiano 30
C1 Crecimiento de los microorganismos 30
C11 Disponibilidad del agua 31
C12 Acidez y pH 31
C13 Oxiacutegeno 31
C14 Temperatura 32
D Control del crecimiento microbiano 34
D1 Agentes fiacutesicos 34
D2 Agentes quiacutemicos 35
E Fagos 35
E1 Antecedentes 35
E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos 37
E3 Clasificacioacuten de los fagos 37
E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico 39
E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten 39
F Biofilm 40
G Microscopiacutea electroacutenica 41
H Fagoterapia 42
III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 47
A Objetivo general 49
B Objetivos especiacuteficos 49
C Plan de trabajo 49
IV MATERIALES Y MEacuteTODOS 51
A Toma de muestras 53
B Obtencioacuten de fagos 54
B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55
B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55
B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas 56
B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos 56
B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC) 58
B6 Modelo de infeccioacuten 59
B7 Controles utilizados durante los ensayos 60
B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium 60
C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos 61
D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica 63
D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 64
D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM 65
V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 67
A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras 69
B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis 70
B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S Typhimurium 70
B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium 72
B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis 72
B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis 73
B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten 73
C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli 75
D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM 80
D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 81
D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable 83
VI CONCLUSIONES 89
VII BIBLIOGRAFIacuteA 93
Iacutendice de figuras
Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa 16
Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por Salmonella spp 24
Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella 24
Figura 4 Adsorcioacuten del bacterioacutefago T4 e inyeccioacuten del ADN 39
Figura 5 Diagrama general de trabajo 50
Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten bacterioacutefago-hueacutesped 59
Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten 62
Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por bacterioacutefagos 74
Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria 79
Figura 10 Imagen por TEM del bacterioacutefago MRH6 80
Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 81
Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable 82
Figura 13 Secuencia de imaacutegenes del DEM 84
Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 por el fago MRH6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86
Iacutendice de tablas
Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias 19
Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos 25
Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales 33
Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos 38
Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos 44
Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria 45
Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos 54
Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten 57
Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos 70
Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC 71
Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium 72
Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis 73
Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten 75
Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades 77
Lista de abreviaturas y acroacutenimos
ADN Aacutecido desoxirribonucleico
ARN Aacutecido ribonucleico
ADC Agar doble capa
AS Agar suave
AECID Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el
Desarrollo
ATCC American Type Culture Collection
APPCC Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control
aw Actividad del agua
BGA Agar verde brillante
BHI Infusioacuten cerebro corazoacuten
CCUG Culture Collection University of Goumltenborg
CENAVECE Centro Nacional de Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de
Enfermedades
CETC Coleccioacuten Espantildeola de Cultivos Tipo
CINSP Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica
EDTA Etilendiaminotetraceacutetico
DEM Microscoacutepica de epifluorescencia directa
EE UU Estados Unidos de Norteameacuterica
ETA Enfermedades transmitidas por alimentos
FAO Food and Agriculture Organization (Organizacioacuten de las
Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura)
FaSPyN Facultad de Salud Puacuteblica y Nutricioacuten UANL
FAUANL Facultad de Agronomiacutea UANL Unidad Mariacuten NL
FCB Facultad de Ciencias Bioloacutegicas UANL
HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points (Anaacutelisis de
Peligros y Puntos Criacuteticos de Control)
INEGI Instituto Nacional de Estadiacutestica y Geografiacutea de los Estados
Unidos Mexicanos
nd Aparente baja efectividad o halo difuso
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
PANALIMENTOS Instituto Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y
Zoonosis
PEG Polietilenglicol
SDS Dodecilsulfato soacutedico
SIRVETA Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos
SSF Solucioacuten salina fisioloacutegica
SUH o SHU Siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico
TEM Microscopio electroacutenico de transmisioacuten
TSA Agar soya de tripicasa
TSAYE TSA con 06 de extracto de levadura
TSB Caldo de soja trypticasa
UAB Universitat Autogravenoma de Barcelona
UANL Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
ZMM Zona Metropolitana de Monterrey
RESUMEN
La inocuidad alimentaria es un tema amplio y relevante que impacta directamente en todos
los segmentos de la sociedad involucra productores desarrolladores innovadores
consumidores y gobierno ademaacutes de diversos sectores como la industria la ingenieriacutea y hasta
la educacioacuten Sin embargo las nuevas tecnologiacuteas en la cadena de produccioacuten provocan que
eacutesta sea maacutes larga y compleja
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) causan alta morbilidad y varios casos
de mortalidad Entre los agentes infecciosos maacutes comunes se encuentran Salmonella spp
Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus
Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus
Los bacterioacutefagos o fagos son virus bacterianos especiacuteficos de una ceacutelula hueacutesped en la
cual se multiplican invadiendo su maquinaria de material geneacutetico Son los sistemas bioloacutegicos
maacutes abundantes del planeta se encuentran en el medio ambiente y se introducen y conviven
en la flora intestinal de otros seres cuando eacutestos ingieren diversos alimentos ya sean de tipo
animal o vegetal
El objetivo del presente trabajo fue aislar y probar la especificidad de una serie de fagos de
Salmonella spp a partir de aguas residuales para lo cual se utilizaron muestras de agua
recolectadas de diferentes localidades del aacuterea metropolitana de Monterrey N L Meacutexico La
purificacioacuten de fagos se llevoacute a cabo mediante la teacutecnica de agar doble capa (ADC) hasta
obtener placas liacuteticas uniformes y se usaron diferentes cepas de referencia de Salmonella
como cultivos indicadores
Se aislaron un total de 15 fagos putativamente distintos de los cuales al pasar las pruebas
de replicacioacuten soacutelo uno logroacute mantener la capacidad liacutetica Se seleccionoacute y purificoacute para
realizar pruebas in vitro especiacuteficas para Salmonella Se utilizoacute una concentracioacuten de fagos
de 1x1012 UFPmL para analizar al fago mediante su morfologiacutea por microscopiacutea electroacutenica
la cual se identificoacute como miembro de la familia Siphoviridae Asiacute mismo se probaron los fagos
contra Salmonella in situ en discos de acero que simulan las superficies de trabajo y para
analizar el efecto de la infeccioacuten del fago sobre Salmonella en los discos de acero inoxidable
se utilizoacute el microscopio de epifluorescencia
Para el conteo de fagos se utilizoacute los meacutetodos LIVEDEAD Para finalizar para evaluar la
efectividad del fago MRH6 que resulto liacutetico en nuestro ensayo se procedioacute a dar las
condiciones necesarias para la formacioacuten del biofilm de Salmonella sobre superficies de acero
inoxidable El fago MRH6 fue capaz de disgregar los biofilms a temperatura ambiente Las
mayores reducciones de Salmonella en un menor tiempo se obtuvieron con concentraciones
de fago mayores a 1x108 UFPmL El meacutetodo de cultivo mostroacute reducciones del patoacutegeno a
niveles indetectables sin embargo la tincioacuten vital reveloacute la presencia de ceacutelulas viables
(coloracioacuten verde) que podriacutea representar un riesgo de contaminacioacuten cruzada estas
pudieran tambieacuten presentarse por la presencia de material orgaacutenico Este trabajo con un fago
puede proporcionar una medida adyuvante para controlar la contaminacioacuten de superficies de
acero inoxidable con biofilms de Salmonella La DEM resultoacute ser una buena herramienta para
evaluar raacutepida y adecuadamente por observacioacuten y posterior anaacutelisis el efecto de los fagos
SUMMARY
Food safety is a broad and relevant issue that directly affects all aspects of society involving
producers developers innovators consumers and government as well as various sectors
such as industry engineering and even education However new technologies in the
production chain cause it to be longer and more complex
Foodborne diseases (ETA) cause high morbidity and several cases of mortality Among the
most common infectious agents are Salmonella spp Campylobacter spp Escherichia coli
Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus Clostridium botulinum Listeria
monocytogenes and Staphylococcus aureus
Bacteriophages or phages are bacterial viruses specific to a host cell in which they multiply
by invading their machinery of genetic material They are the most abundant biological systems
on the planet they can be found in the environment In organisms they enter and coexist in
the intestinal flora of other beings when they ingest various foods whether animal or vegetable
The objective of this study was to isolate and test the specificity of a series of phages of
Salmonella spp from wastewater for which water samples were collected from different
locations in the metropolitan area of Monterrey N L Meacutexico The purification of phages was
carried out by means of the double layer agar technique (ADC) until uniform lithic plates were
obtained and different Salmonella reference strains were used as indicator cultures
A total of 15 putatively different phages were isolated of which upon passing the replication
tests only one managed to maintain the lytic capacity It was selected and purified to perform
specific in vitro tests for Salmonella A phage concentration of 1x1012 PFUmL was used to
analyze the phage by means of its electron microscopy morphology which was identified as a
member of the Siphoviridae family Likewise the phages against Salmonella were tested in
situ on steel discs simulating the work surfaces and the epifluorescence microscope was used
to analyze the effect of phage infection on Salmonella on the stainless steel discs
For the phage count the LIVE DEAD Finally in order to evaluate the effectiveness of the
phage MRH6 that was lytic in our trial the necessary conditions for the formation of the
Salmonella biofilm on stainless steel surfaces were established The phage MRH6 was able
to disintegrate the biofilms at room temperature The greatest reductions of Salmonella in a
shorter time were obtained with phage concentrations greater than 1x107 PFUmL The culture
method showed reductions of the pathogen to undetectable levels however vital staining
revealed the presence of viable cells (green coloration) which could represent a risk of cross
contamination these could also be presented by the presence of organic material This work
with a phage can provide an adjuvant measure to control contamination of stainless steel
surfaces with Salmonella biofilms The DEM proved to be a dependable tool to quickly and
adequately evaluate the effect of phages by observation and subsequent analysis
RESUM
La innocuiumltat alimentagraveria eacutes un tema ampli i rellevant que impacta directament en tots els
segments de la societat involucra productors desenvolupadors innovadors consumidors i
govern a meacutes de diversos sectors com la induacutestria lenginyeria i fins a leducacioacute No obstant
aixograve les noves tecnologies en la cadena de produccioacute provoquen que aquesta sigui meacutes llarga
i complexa
Les malalties transmeses per aliments (ETA) causen alta morbiditat i diversos casos de
mortalitat Entre els agents infecciosos meacutes comuns es troben Salmonella spp
Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus
Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus
Els bacteriogravefags o fags soacuten virus bacterians especiacutefics duna cegravelmiddotlula hoste en la qual es
multipliquen envaint la seva maquinagraveria de material genegravetic Soacuten els sistemes biologravegics meacutes
abundants del planeta es troben en el medi ambient i sintrodueixen i conviuen en la flora
intestinal daltres eacutessers quan aquests ingereixen diversos aliments ja siguin de tipus animal
o vegetal
Lobjectiu del present treball va ser aiumlllar i provar lespecificitat duna segraverie de fags de
Salmonella spp a partir daiguumles residuals per a aixograve es van utilitzar mostres daigua recollides
de diferents localitats de lagraverea metropolitana de Monterrey N L Megravexic La purificacioacute de fags
es va dur a terme mitjanccedilant la tegravecnica dagar doble capa (ADC) fins a obtenir plaques liacutetiques
uniformes i es van usar diferents soques de referegravencia de Salmonella com a cultius indicadors
Es van aiumlllar un total de 15 fags possiblement diferents dels quals en passar les proves
de replicacioacute nomeacutes un va aconseguir mantenir la capacitat liacutetica Es va seleccionar i va
purificar per realitzar proves in vitro especiacutefiques per Salmonella Es va utilitzar una
concentracioacute de fags de 1x1012 UFPmL per analitzar fag mitjanccedilant la seva morfologia per
microscogravepia electrogravenica la qual es va identificar com a membre de la famiacutelia Siphoviridae Aixiacute
mateix es van provar els fags contra Salmonella in situ en discos dacer que simulen les
superfiacutecies de treball i per analitzar lefecte de la infeccioacute del fag sobre Salmonella en els
discos dacer inoxidable es va utilitzar el microscopi depifluorescegravencia
Per al recompte de fags es va utilitzar els megravetodes LIVE DEAD Per finalitzar per avaluar
lefectivitat del fag MRH6 que va resultar liacutetic en el nostre assaig es va procedir a donar les
condicions necessagraveria per a la formacioacute del biofilm de Salmonella sobre superfiacutecies dacer
inoxidable El fag MRH6 va ser capaccedil de disgregar els biofilms a temperatura ambient Les
majors reduccions de Salmonella en un menor temps es van obtenir amb concentracions de
fag majors a 1x107 UFP mL El megravetode de cultiu va mostrar reduccions del patogen a nivells
indetectables perograve la tincioacute vital revelar la presegravencia de cegravelmiddotlules viables (coloracioacute verda)
que podria representar un risc de contaminacioacute creuada aquestes poguessin tambeacute
presentar-se per la presegravencia de material orgagravenic Aquest treball amb un fag pot proporcionar
una mesura adjuvant per controlar la contaminacioacute de superfiacutecies dacer inoxidable amb
biofilms de Salmonella La DEM va resultar ser una bona eina per avaluar ragravepida i
adequadament per observacioacute i posterior anagravelisi lefecte dels fags
7
I INTRODUCCIOacuteN
Introduccioacuten
8
Introduccioacuten
9
Presentacioacuten del proyecto
Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica sobre las innovaciones en seguridad alimentaria en
Meacutexico la cual puso en evidencia la necesidad de analizar alternativas enmarcadas en el
aacutembito del uso de las tecnologiacuteas verdes lo que presentoacute la posibilidad de desarrollar un
trabajo innovador y que no se estuviera aplicando ya en el sector alimentario local o nacional
De esa manera se inician las actividades experimentales que para este trabajo doctoral se
dividieron en dos partes la primera realizada en Meacutexico y la segunda en Espantildea
En primera instancia se desarrolloacute un anaacutelisis en el Laboratorio de geneacutetica y biologiacutea
molecular del Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica (CINSP) en el Campus
Ciencias de la Salud de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) y gracias al apoyo
de Programa de mejoramiento del profesorado (PROMEP nuacutemero UANL-326) por medio de
una beca se iniciaron los estudios y asiacute se cumplioacute el primer propoacutesito que fue obtener virus
nativos contra cepas de Salmonella y purificarlos
Posteriormente para lograr los demaacutes objetivos que eran realizar la caracterizacioacuten parcial
de los fagos contra Salmonella se solicitoacute una beca a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten
Internacional para el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y
de Cooperacioacuten curso 2010-2011) con el fin de realizar una estancia de investigacioacuten y crear
oportunidades de desarrollo aprovechando las tecnologiacuteas innovadoras disponibles en la
Universitat Autoacutenoma de Barcelona (UAB) considerando ademaacutes que la alta reputacioacuten de la
institucioacuten y la supervisioacuten por parte de sus investigadores impactariacutean positivamente en el
desarrollo del trabajo y en el Curriculum Vitae del investigador y por consiguiente en su futuro
profesional como docente e investigador
Otra finalidad de este proyecto fue dejar un buen referente al concluir la estancia ya que
ello ofreceriacutea nuevas oportunidades para seguir forjando el perfil del investigador cimentaraacute
cualquier trayectoria profesional y facilitariacutea optar por un plan postdoctoral en esta misma
Universidad De esta manera se accedioacute a la beca del Programa Extranjeros II-A
Convocatoria 2010-2011 Nuacutemero 0000521211 del cual se cumplieron los objetivos
establecidos y otros maacutes por ejemplo conocer nuevas tecnologiacuteas
Siendo eacutesta una liacutenea de investigacioacuten relativamente reciente en Meacutexico se espera que
impacte en las posibilidades laborales en diversos contextos y seacutea de utilidad para sentar
precedentes para futuras liacuteneas de trabajo en dicha aacuterea
Introduccioacuten
10
Justificacioacuten
En las uacuteltimas deacutecadas los cambios ocurridos en la produccioacuten y consumo de alimentos
han tenido un impacto sobre la inocuidad alimentaria La industria en la produccioacuten masiva de
alimentos ha evolucionado de ser local a constituirse en otra donde la produccioacuten yo el
procesamiento estaacuten localizados en diferentes partes del paiacutes o del mundo Por otra parte la
poblacioacuten estaacute envejeciendo por lo que se vuelve maacutes vulnerable a problemas de salud
ademaacutes los agentes patoacutegenos son cada vez maacutes virulentos (DeWaal y Barlow 2014)
Los reportes sobre problemas gastrointestinales que recopila el Centro Nacional de
Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades (CENAVECE) indican que Nuevo
Leoacuten ha permanecido dentro de los primeros 12 lugares de casos de fiebre tifoidea y en los
primeros 14 de fiebre paratifoidea y otras salmonelosis A nivel nacional las enfermedades
infecciosas intestinales se ubican entre las primeras 10 causas de mortalidad de nintildeos en
edad escolar entre los 5 y 14 antildeos de edad (CENAVECE 2007)
Los microorganismos del geacutenero Salmonella pertenecen a la familia Enterobacteriaceae
Son bacilos o cilindros con puntas redondeadas y se diferencian de las demaacutes enterobacterias
mediante reacciones bioquiacutemicas y de aglutinacioacuten existen maacutes de 2500 serotipos todos
ellos patoacutegenos Actualmente se considera una sola especie denominada Salmonella
enterica de la cual seguacuten el esquema de Kauffmann-White se clasifican nueve serogrupos
Esta especie tiene importancia cliacutenica debido a que es la uacutenica capaz de infectar animales
homeotermos esta investigacioacuten se centra en cuatro serovariedades Salmonella enterica
serovar Typhimurium (S Typhimurium) S enterica serovar Paratyphi (S Paratyphi) S
enterica serovar Enteritidis (S Enteritidis) y S enterica serovar Typhi (S Typhi) estos
microorganismos se pueden aislar tanto de fuentes alimentarias (carne de res pollo crudo
huevo fresco carne de puerco almejas chorizos vegetales entre otros) como del medio
ambiente (suelo agua materia fecal y superficies) (Chlebicz y Śliżewska 2018 Nguendo
2018)
En Meacutexico S Enteritidis y S Typhimurium son los microorganismos aislados con mayor
frecuencia en las salmonelosis Normalmente S Enteritidis habita en el intestino de los
animales sin causar enfermedad pero puede infectar a humanos y promover diarrea voacutemito
dolor abdominal calambres y ocasionalmente insuficiencia renal y en los peores casos la
muerte (DeWaal y Barlow 2014) La contaminacioacuten de alimentos por Salmonella spp se debe
Introduccioacuten
11
a una combinacioacuten de factores relacionados con la produccioacuten a gran escala o cambios en el
manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los mismos (Uribe y Suarez 2006)
Por otra parte estaacuten los virus que pueden replicarse independientemente de los
cromosomas de una ceacutelula pero no sin su participacioacuten (Madigan y Martinko 2006) El hecho
de descubrir virus que pueden infectar y destruir bacterias fue recibido con optimismo por su
posible aplicacioacuten en usos terapeacuteuticos (McLaughlin et al 2006)
En un estudio realizado en diversos estados de Meacutexico (Coahuila Durango Estado de
Meacutexico Jalisco Morelos Oaxaca Puebla y Quereacutetaro) se ha fagotipado Salmonella spp
proveniente de huevo carne de pollo de engorde y gallinas progenitoras reproductoras de
postura comercial y productoras (Mancera et al 2004) Ademaacutes diversas investigaciones han
utilizado fagos liacuteticos para reducir la contaminacioacuten por Salmonella en pollos (canal y piel)
semillas germinadas y dulces de frutas cortadas (Goode et al 2003)
El uso de aditivos en los alimentos se ha reducido considerablemente debido al rechazo
generalizado por parte de los consumidores lo que podriacutea repercutir en un incremento en los
casos de intoxicaciones alimentarias En este contexto los fagos aportan ventajas sobre los
desinfectantes conocidos y los meacutetodos tradicionales de aplicacioacuten de friacuteo o calor ya que
pueden actuar como agentes de deteccioacuten y control bioloacutegico de bacterias patoacutegenas en
alimentos y su produccioacuten es relativamente raacutepida y econoacutemica (Atterbury et al 2003)
La utilidad de los fagos en el aacuterea de investigacioacuten es amplia una posible utilidad es ser
un instrumento para identificar cepas bacterianas especiacuteficas Tambieacuten se han utilizado para
el estudio de diversos fenoacutemenos moleculares el trabajo con estos virus permitioacute desarrollar
ensayos de placas de lisis conocer la naturaleza del ciclo de vida viral los tipos de mutaciones
geneacuteticas y los genes como segmentos de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) (Muniesa et al
2005)
Las empresas dedicadas a la biotecnologiacutea (Intralytix Omnilytics) se centran en desarrollar
productos utilizando fagos especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan las ETA y estos
productos comerciales de terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones
(Segundo 2010) Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos antildeos debido a sus
caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutefico sin dantildear la microbiota
en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros distribucioacuten de
Introduccioacuten
12
esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla (Oh y Park
2017)
En este sentido el objetivo general de este estudio es el aislamiento y caracterizarizacion
de fagos contra Salmonella a partir de diversas fuentes para su uso potencial en el control
bioloacutegico
13
II ANTECEDENTES
Antecedentes
14
Antecedentes
15
A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos
A nivel internacional la produccioacuten de alimentos y todos los mecanismos tecnoloacutegicos
involucrados en su procesamiento implican ademaacutes de la optimizacioacuten de los tiempos y de
la calidad un riesgo para la adquisicioacuten de enfermedades inherentes a la misma adopcioacuten
de nuevas tecnologiacuteas (Weaver et al 2017)
La OMS (2017) estima que las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de
muerte de nintildeos menores de cinco antildeos matan a 525000 nintildeos menores de cinco antildeos
cada antildeo una proporcioacuten significativa de las enfermedades diarreicas se puede prevenir
mediante el acceso al agua potable y a servicios adecuados de saneamiento e higiene
ademaacutes de que en todo el mundo se producen unos 1700 millones de casos de
enfermedades diarreicas infantiles cada antildeo
Seguacuten la OMS (2017) existen diferentes condiciones que propician el desarrollo de las
ETA Como son las de tipo bioloacutegico producidos por hongos o bacterias causantes de
enfermedades ya sea por sus metabolitos o toxinas virus o huevecillos de paraacutesitos asiacute
como los venenos de algunos peces y plantas Las de tipo quiacutemico como productos de
limpieza o desinfeccioacuten pesticidas toxinas marinas insecticidas o venenos y fiacutesicos cuando
en la materia prima de los alimentos se encuentran objetos como vidrios metal piedras
grapas barniz de untildeas joyeriacutea cabellos o cualquier elemento extrantildeo
De acuerdo con el Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos (SIRVETA) ndashdesarrollado por el Instituto
Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y Zoonosis (PANALIMENTOS)ndash ocurrieron 1683
brotes de ETA en Meacutexico que ocasionaron 53860 casos de enfermedades y provocaron
207 muertes mientras que en los demaacutes paiacuteses de Ameacuterica Latina se produjeron durante el
mismo periacuteodo 6324 brotes que provocaron 228579 casos y 314 muertes (Forsythe y
Hayes 2002) Cabe aclarar que eacutestos son soacutelo los brotes notificados por la autoridad
competente El sistema utilizado internacionalmente para obtener alimentos inocuos es el
APPCC (Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control) o HACCP (por sus siglas en ingleacutes
Hazard Analysis and Critical Control Points) que se puede implementar en cualquier tipo de
industria y permite prevenir controlar y eliminar cualquier peligro antes de consumir los
alimentos (Rodriacuteguez Torrens et al 2015)
En Meacutexico el Distintivo H es un programa implementado por los servicios alimentarios
Antecedentes
16
oficiales mediante el cual se ofrece a los clientes alimentos seguros El Centro Nacional de
Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades de Meacutexico (CENAVECE) advierte
que uno de los problemas de salud maacutes importantes lo constituyen los trastornos
gastrointestinales cuya mortalidad predomina entre los 5 y los 14 antildeos Entre 2006 y 2012
el Estado de Nuevo Leoacuten ha permanecido entre los primeros 7 lugares de casos de diarrea
(CENAVECE 2018)
La figura 1 muestra la distribucioacuten de la incidencia en Meacutexico la cual estaacute asociada a la
densidad demograacutefica y la accesibilidad a servicios de salud que facilitan el registro es asiacute
que son precisamente las entidades federativas con mayor poblacioacuten quienes registran
nuacutemeros maacutes altos
Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa en
Meacutexico 2010-2012 (CENAVECE 2018)
A1 Problemaacutetica
La inocuidad alimentaria es una preocupacioacuten mundial que se refleja en el incremento
de reportes y noticias relacionadas con la contaminacioacuten de los alimentos difundidos en
diversos paiacuteses a su vez estos productos son retirados del mercado lo que provoca
peacuterdidas por varios cientos de millones de doacutelares El Codex Alimentarius indica que las ETA
y los dantildeos provocados por los alimentos son en el mejor de los casos desagradables y
Antecedentes
17
en el peor fatales y pueden influir negativamente en el comercio y la confianza de los
consumidores Por consiguiente es imprescindible un control eficaz de la higiene Todos los
eslabones de la cadena alimentaria ndashfabricantes elaboradores manipuladores y
consumidores de alimentosndash son responsables del control de los riesgos microbioloacutegicos
desde la explotacioacuten agriacutecola o ganadera hasta el consumidor final Desde esta oacuteptica el
anaacutelisis de riesgos deberiacutea aplicarse dentro de un contexto estrateacutegico organizativo y
operacional reconocido si bien en el proceso puede haber elementos comunes establecer
un nivel apropiado de proteccioacuten en esos sectores puede representar las maacuteximas
diferencias (Atterbury et al 2003)
La OMS ha identificado siete microorganismos patoacutegenos ndashC jejuni C perfringens E
coli 0157H7 L monocytogenes Salmonella spp S aureus y T gondiindash que causan entre
123 y 33 millones de casos de infeccioacuten solamente en los EE UU lo que representa
peacuterdidas econoacutemicas de entre 5500 y 34900 millones de doacutelares Ademaacutes resalta que su
incidencia podriacutea ser de 300 a 350 veces mayor de lo que indican las estadiacutesticas dado que
soacutelo se notifica un nuacutemero relativamente pequentildeo de casos de ETA Se estima que 70 de
los 1500 millones de episodios de diarrea son causados por alimentos en mal estado Es
posible que en los paiacuteses en desarrollo se notifique a las autoridades sanitarias una
proporcioacuten de casos auacuten inferior principalmente por pobreza y escasez de recursos a
disposicioacuten de los servicios de gestioacuten de la inocuidad alimentaria e inspeccioacuten de alimentos
(Van de Venter 2000)
A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea
La OMS estima que el 88 de los casos de diarrea a nivel mundial son atribuibles al
agua el saneamiento y la higiene todos los aspectos de inocuidad de los alimentos estaacuten
relacionados con estos factores En menor medida la enfermedad se transmite a traveacutes de
otras viacuteas por ejemplo el aire y alrededor del 94 de los casos son atribuibles al
saneamiento ambiental el total de fallecimientos se calcula en maacutes de 15 millones
principalmente en nintildeos en los paiacuteses desarrollados el promedio es ligeramente menor a
90 La diarrea atribuible al agua y saneamiento inapropiado representa 53 de las
muertes totales y 35 en nintildeos europeos de 0-14 antildeos y es ademaacutes una de las causas
principales de malnutricioacuten (Pruumlss-Uumlstuumln y Corvalaacuten 2006)
Antecedentes
18
Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud puacuteblica en el mundo
especialmente en paiacuteses en desarrollo Su alta incidencia se debe en gran parte a la
ingestioacuten de alimentos contaminados con microorganismos patoacutegenos como Salmonella
que causa episodios de diarrea aguda Salmonella spp es uno de los patoacutegenos enteacutericos
maacutes frecuentes tanto en paiacuteses desarrollados como subdesarrollados Dependiendo de la
especie tamantildeo del inoacuteculo factores de virulencia expresados por la cepa hueacutesped
involucrado estado inmunoloacutegico del paciente e intervencioacuten meacutedica puede ocasionar una
infeccioacuten gastrointestinal de media a severa hasta una infeccioacuten sistemaacutetica que
comprometa la vida del paciente (Fernaacutendez 2008)
Otros microorganismos que tambieacuten pueden contaminar el agua y los alimentos como
bacterias (Bacillus cereus Clostridium botulinum Campylobacter jejuni Vibrio cholera) virus
(Norwalk Rotavirus Hepatitis A) y paraacutesitos (Entamoeba histolytica Cryptosporidium
parvum Toxoplasma gondii) pueden transmitirse tambieacuten de una persona a otra como
resultado de una higiene deficiente (Freedman et al 2015)
Estudios de empresas dedicadas exclusivamente a la crianza de cerdos reportan
epidemias como el virus de la diarrea porcina la cual posteriormente se transmite a los
consumidores de estas carnes contaminadas ya sea por contacto con las heces o por
consumo de carnes contaminadas lo cual implica tambieacuten una peacuterdida econoacutemica para la
industria alimentaria resaltando la necesidad de establecer medidas preventivas y
correctivas seguacuten sea el caso (Huss et al 2017)
Seguacuten la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO
por sus siglas en ingleacutes Food and Agriculture Organization) las toxiinfecciones alimentarias
son la segunda causa de morbilidad pero muchas permanecen sin declarar quizaacutes por su
mediana severidad y recuperacioacuten raacutepida salvo el coacutelera Los alimentos son susceptibles a
contaminacioacuten de todo tipo la fuente de agentes causales suele ser el tracto gastrointestinal
de individuos reservorios o las heces de animales y humanos infectados o bien agua
corrompida que por deficiencias sanitarias contamina carne fresca pescados moluscos
pasteles de crema y leche no pasteurizada entre otros productos (Riacuteos et al 2012) como
se puede observar en la tabla 1
Antecedentes
19
Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias (Riacuteos et al 2012)
Agente Periacuteodo de
incubacioacuten Fuente Agente patoacutegeno
Salmonella spp 8-24 h Aves huevos mascotas
(tortugas lagartos pollos) Bacteria y endotoxina
E coli
enterotoxigeacutenica 24-72 h
Agua y alimentos
contaminados
Enterotoxina
termoestable
V cholerae 24-72 h Alimentos contaminados Enterotoxina termolaacutebil
Shigella spp 24-72 h Agua y alimentos
contaminados Bacteria y endotoxina
C jejuni 1-7 d Leche aves de corral y
agua no potable
Bacteria y Enterotoxina
termolaacutebil
Yersinia spp 1-7 d Carne de cerdo leche Bacteria y Enterotoxina
B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria
La historia referente a las toxiinfecciones alimentarias se comienza a documentar y
legislar en el siglo X con el botulismo en Bizanzio y documentos sobre el ergotismo en el
siglo XVI En el siglo XIX aparecen los alimentos enlatados y Louis Pasteur asocia el
deterioro de los alimentos con las bacterias En el siglo XX se produce un desarrollo
espectacular de la microbiologiacutea de los alimentos con el establecimiento de la etiologiacutea de
las toxiinfecciones alimentarias el comienzo de una nueva era de la quiacutemica e ingenieriacutea
alimentaria Aunado a los movimientos migratorios de las personas la diversificacioacuten de
alimentos la produccioacuten masiva de alimentos y la facilidad de transporte desde puntos
lejanos entre la produccioacuten y preferencia en el consumo de alimentos aunadas a la
capacidad que tienen los microorganismos para evolucionar y adaptarse a su medio
ambiente hacen pensar en estos microorganismos como patoacutegenos emergentes (DeWaal y
Barlow 2014)
B1 Escherichia
Las cepas de E coli se pueden diferenciar seroloacutegicamente por los antiacutegenos somaacuteticos
(O) flagelares (H) y capsulares (K) Ademaacutes pueden hallarse fimbrias y estructuras
Antecedentes
20
emparentadas que desempentildean un papel en la patogenia Actualmente se reconocen cinco
grupos de E coli causantes de diarrea en funcioacuten del siacutendrome que provocan cuyas
diferencias estaacuten codificadas por plaacutesmidos (Wright et al 2017) Los diferentes tipos son
E coli enteropatoacutegeno (EPEC) es responsable de la diarrea acuosa en lactantes
Produce voacutemitos fiebre y diarrea acuosa con mocos pero sin sangre Coloniza las
microvellosidades de todo el intestino produciendo la lesioacuten de ldquoadhesioacuten y erosioacutenrdquo en
el ribete en cepillo de la membrana de la vellosidad Afecta a adultos y nintildeos menores de
dos antildeos siendo este rango de edad el principal factor de riesgo
E coli enterotoxigeacutenico (ETEC) es el causante de la llamada vulgarmente ldquodiarrea
del viajerordquo se manifiesta con diarrea acuosa como agua de arroz y poca fiebre
Coloniza la porcioacuten proximal del intestino delgado Afecta a adultos y nintildeos son una causa
frecuente de diarrea en lactantes de paiacuteses en desarrollo asiacute como la causa maacutes comuacuten
de diarrea en individuos de paiacuteses industrializados que viajan a zonas menos
desarrolladas del mundo
E coli enteroinvasor (EIEC) coloniza el colon origina fiebre y diarrea profusa con
heces que contienen mocos y estriacuteas sanguinolentas Presenta un plaacutesmido de 120-140
mD conocido como plaacutesmido invasivo que lleva todos los genes necesarios para la
virulencia Al igual que ETEC pero afecta principalmente a adultos
E coli enterohemorraacutegico (EHEC) origina diarrea sanguinolenta colitis hemorraacutegica
siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico (SUH o SHU) y puacuterpura trombocitopeacutenica En este grupo se
incluye E coli verotoxigeacutenico (VTEC) serotipos O157 O26 O111 Afecta principalmente
a nintildeos el principal factor de riesgo es el consumo de carne sin la coccioacuten adecuada
E coli enteroagregativo (EAggEC) posee caraacutecter clonal diferenciaacutendose dos clones
relacionados (1 y 2) Dentro de cada grupo estaacute presente una variedad concreta de
antiacutegenos O mientras que los antiacutegenos H se conservan
En los reportes cientiacuteficos sobre E coli se refieren a las plantas como otra fuente de
infeccioacuten especiacuteficamente en la espinaca (Spinacia oleracea) y lechuga (Lactuca sativa) Se
recomienda igualmente estudiar profundamente los cultivos y los tejidos vegetables y
animales ya que se deben considerar como paraacutemetros de riesgo para la inocuidad de los
alimentos (Fernaacutendez Ferran et al 2003 Wright et al 2017)
B2 Campylobacter
Campylobacter spp es un bacilo delgado gram negativo (05-08 microm x 02-05 microm) y
Antecedentes
21
microaeroacutefilo (necesita 3-5 de O2 y 2-10 de CO2) Su morfologiacutea puede variar entre
vibrioacutenica (bacilos curvados) espirilar en forma de rosquilla de S y cocoide de tal forma
que en fase logariacutetmica de crecimiento las ceacutelulas tienen forma espiral o curvada pero a
medida que los cultivos envejecen adquieren formas esfeacutericas Moacutevil con un uacutenico flagelo
polar que presenta de dos a tres veces el largo de la ceacutelula Aunque hay diversas especies
de Campylobacter causantes de enfermedades C jejuni C coli y C lari son las especies
que se aiacuteslan con mayor frecuencia en casos de gastroenteritis humana siendo C jejuni la
responsable de la mayoriacutea de las toxiinfecciones alimentarias 89-93 de las
toxiintoxicaciones (OMS 2017)
Las especies C coli y C lari son semejantes a C jejuni su diferencia se basa en pruebas
bioquiacutemicas C coli no es capaz de hidrolizar el piruvato y C lari es capaz de crecer en
presencia de 30 microgramos de aacutecido nalidiacutexico (Haddad et al 2013) La movilidad la
quimiotaxis y los flagelos son factores importantes en la virulencia pues de ellos depende la
colonizacioacuten del epitelio intestinal Campylobacter produce una enterotoxina parecida a la
toxina coleacuterica que tambieacuten juega un papel importante en la patogenia (Nichols 2005) C
jejuni puede sobrevivir de 2 a 4 semanas en condiciones de baja humedad oxigenacioacuten y
temperaturas de 4ordmC superando muchas veces el tiempo de vida uacutetil del producto Asimismo
puede perdurar de 2 a 5 meses a -20ordmC pero a temperatura ambiente apenas dura algunos
diacuteas (Khan et al 2013)
C jejuni y C coli son sensibles a diversos agentes antimicrobianos como los macroacutelidos
los aminoglucoacutesidos el cloranfenicol y la tetraciclina La eritromicina ha sido el antibioacutetico de
eleccioacuten para tratar las infecciones del tracto intestinal Al igual que en Salmonella el control
de Campylobacter se debe realizar tanto en el sector agropecuario como en los
establecimientos alimentarios por lo que los controles especificados para Salmonella
podriacutean extrapolarse a este microorganismo Un aspecto importante de su control reside en
la refrigeracioacuten de las aves ya que la baja temperatura junto con la desecacioacuten superficial
que se produce reduce significativamente la incidencia y los recuentos de Campylobacter
viables incluso en canales altamente contaminadas (Fernaacutendez 2008)
B3 Enterobacter
Conocido antiguamente como Cronobacter spp incluye varias especies de patoacutegenos
emergentes relacionados con brotes de meningitis septicemia y enterocolitis necrotizante
especialmente en neonatos y nintildeos La tasa de mortalidad de estos brotes es alta entre 20
Antecedentes
22
y 80 y los supervivientes suelen sufrir severos desoacuterdenes neuroloacutegicos (Grimont y
Grimont 2006)
E sakazakii es un bacilo moacutevil no esporulado gram negativo que ha sido encontrado en
alimento para bebeacutes es maacutes resistente a los cambios osmoacuteticos y a la sequiacutea que otros
miembros de la familia Enterobacteriaceae y se asocia con casos esporaacutedicos de sepsis
meningitis cerebritis y enterocolitis necrotizante La mayoriacutea de las infecciones se observan
en bebeacutes con bajo peso al nacer y que son alimentados de forma insalubre La mortalidad
ha disminuido a menos de 20 en los uacuteltimos antildeos Este microorganismo no se ha
encontrado presente en la foacutermula laacutectea tampoco existe evidencia de la transmisioacuten de
persona a persona o un medio general de difusioacuten ambiental (Vanegas et al 2009)
B4 Listeria
L monocytogenes estaacute muy difundida en la naturaleza en la que suele adoptar un ciclo
saprofiacutetico en estrecha relacioacuten con el suelo Ademaacutes se ha encontrado en aguas
continentales sedimentos marinos material vegetal en descomposicioacuten forrajes heces
humanas y animales y aguas residuales de explotaciones animales entre otros ambientes
lo que explica su presencia en alimentos crudos Epidemioloacutegicamente se caracteriza por su
ubicuidad sobreviviendo en tierra huacutemeda hasta 500 diacuteas en funcioacuten de la temperatura En
heces o aguas residuales mantenidas a temperatura de refrigeracioacuten sobrevive maacutes de seis
antildeos este periodo se reduce si se mantiene a temperatura ambiente (Guenther et al 2009)
Listeria spp son bacilos gram positivos de forma regular y con forma de vara corta
Algunas veces pueden tener forma cocoide apareciendo como ceacutelulas individuales o en
cadenas cortas Son moacuteviles entre 20-25ordmC pero no a 37ordmC Existen seis especies de Listeria
descritas L monocytogenes L innocua L welshimeri L seeligeri L grayi y L ivanovii
subespecie ivanovii y subespecie londoniensis Las cepas patoacutegenas de L monocytogenes
producen la listeriolisina O responsable de la hemoacutelisis-β y de la destruccioacuten de las ceacutelulas
fagocitarias es una hemolisina que segrega la bacteria a causa de la disminucioacuten de pH
(Liu 2006)
L monocytogenes tolera y se multiplica en concentraciones altas de NaCl contando con
la posibilidad de sobrevivir durante un antildeo en ambientes con una concentracioacuten de 16 su
tolerancia aumenta al disminuir el pH o la temperatura del medio Los tratamientos para su
inactivacioacuten son de 617ordmC35min 70ordmC20min 78ordmC15min u 80ordmC5min favoreciendo su
Antecedentes
23
resistencia al calor con la presencia de grasas Se multiplica entre 0 y 4ordmC las temperaturas
bajas ejercen un efecto protector de tal manera que en condiciones de acidez su inactivacioacuten
es maacutes lenta en refrigeracioacuten que a temperatura ambiente (Leverentz et al 2003) La acidez
influye en la capacidad de Listeria para sobrevivir a la congelacioacuten (temperaturas inferiores
a -47ordmC) y almacenamiento a menos de -18ordmC en carne mostrando una disminucioacuten en la
recuperacioacuten de ceacutelulas viables que han sido dantildeadas por el friacuteo (Wu et al 2015)
B5 Salmonella
B51 Origen
Salmonella tiene su origen principal en el tracto intestinal de animales fundamentalmente
las aves y los porcinos y pueden acabar contaminando las carnes crudas el pollo crudo los
productos marinos crudos o el huevo Los brotes de Salmonella estaacuten asociados al consumo
de alimentos elaborados con huevo crudo y siguen siendo frecuentes a pesar de conocerse
el riesgo que representa su consumo de las medidas legales adoptadas y de los programas
de educacioacuten sanitaria dirigidos a disminuir su incidencia Este geacutenero pertenece a la familia
Enterobacteriaceae fue descrito a principios del siglo XX por el bacterioacutelogo estadounidense
Theobald Smith (Zaidi et al 2006) En la figura 2 se muestran los factores de virulencia y
en la figura 3 se presenta la clasificacioacuten de Salmonella enterica con las diferentes
subespecies y serovares que se aiacuteslan maacutes frecuentemente
Antecedentes
24
Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por
Salmonella spp (Brenner et al 2000)
Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella (Brenner et al 2000)
Antecedentes
25
B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp
La mayoriacutea de los miembros de este geacutenero se encuentra en el tracto intestinal del
hombre y los animales como bacterias patoacutegenas o comensales Estaacute integrado por bacilos
gram negativos anaerobios facultativos y no esporulados La mayor parte de los serotipos
conocidos son moacuteviles mediante flagelos peritricos Se conocen maacutes de 2460 serotipos
muchos de ellos patoacutegenos para el ser humano (Chlebicz y Śliżewska 2018)
Son bacterias invasoras enterotoxigeacutenicas y estaacuten ampliamente diseminadas en todo el
mundo su temperatura ideal de sobrevivencia entre los 15 y los 35degC (mesoacutefilas) y en una
amplitud de pH de 45 a 9 Los microorganismos de este geacutenero se distribuyen en seis
grupos se han definido mediante biotipado hibridacioacuten DNA-DNA anaacutelisis de la secuencia
del RNA ribosomal 16S y por ldquomultilocus enzyme electrophoresisrdquo (MLEE) (Brenner et al
2000) La serotipificacioacuten se utiliza para diferenciar maacutes allaacute del nivel de subespecie como
puede observarse en la tabla 2
Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos (Brenner et al 2000)
Grupo Microorganismo
A S Paratyphi Al
B S Typhimurium S Bredeney
C1 S Choleraesuis S Montevideo S Oranienburg
C2 S Newport
D S Typhi S Enteritidis S Dublin S Gallinarum
E S Butantan S Anatum S Give
Salmonella serotipo Typhi es la causante de la fiebre tifoidea presentando siacutentomas como
son fiebre de intensidad variable cefalea diarrea estrentildeimiento tos naacuteuseas y voacutemitos
anorexia dolor abdominal y escalofriacuteos Mientras que los demaacutes serotipos considerados no
tifoidicos presentan un estado asintomaacutetico En el antildeo 2000 los serotipos aislados con
mayor frecuencia en EE UU fueron S Typhimurium S Enteritidis y S Newport (Dunkley et
Antecedentes
26
al 2009) En Meacutexico los serotipos de Salmonella spp identificados con mayor frecuencia
en los servicios de salud fueron S Typhimurium (204) y S Enteritidis (183) (Guenther
et al 2009)
La salmonelosis se produce por la ingestioacuten de alimentos o bebidas contaminados por
Salmonella se manifiesta como una enterocolitis aguda y se caracteriza por presentar
siacutendromes febriles asociados a manifestaciones gastrointestinales o sisteacutemicas con
frecuencia severas (Figueroa y Verdugo 2005 Fernaacutendez 2008) El cuadro cliacutenico se
localiza baacutesicamente en el iacuteleo terminal y el intestino grueso La enfermedad se manifiesta
a traveacutes de diferentes fases En la primera fase la infeccioacuten se limita a la mucosa intestinal
en la siguiente la bacteria invade el tejido linfaacutetico local y le sigue una fase de bacteriemia
durante la cual la mayoriacutea de las bacterias son fagocitadas por macroacutefagos del hiacutegado y el
bazo (Calva et al 2006 Bettini et al 2012)
Con frecuencia el meacutedico hace un diagnoacutestico basaacutendose en el cuadro cliacutenico del
paciente pero sin contar con los estudios microbioloacutegicos necesarios para establecer un
diagnoacutestico certero cuando se presenta infeccioacuten por Salmonella inicia una fase de
crecimiento bacteriano intracelular el cual despueacutes de varios diacuteas provoca la liberacioacuten de
gran cantidad de patoacutegenos al torrente sanguiacuteneo (Zaidi et al 2006)
La salmonelosis es una enfermedad aguda de distribucioacuten mundial Afecta a todos los
grupos de edad con mayor incidencia en los extremos de la vida provocando infecciones
en forma endeacutemica o en brotes epideacutemicos de intoxicacioacuten alimentaria que en ocasiones
abarcan amplias zonas geograacuteficas debido a las extensas cadenas de distribucioacuten de
alimentos existentes hoy en diacutea (Fernaacutendez 2008)
Para la salud puacuteblica la salmonelosis tiene un impacto socioeconoacutemico tanto en los paiacuteses
en desarrollo como en los paiacuteses desarrollados Ademaacutes al no recibir tratamiento puede
ser causante del siacutendrome de Reiter el cual se manifiesta por dolor en articulaciones
irritacioacuten en los ojos dolor al orinar y puede durar meses o antildeos desencadenaacutendose una
artritis croacutenica (CFSPH 2005) Desde la deacutecada de los ochenta la incidencia de
salmonelosis de origen alimentario ha aumentado considerablemente en Meacutexico Este
incremento es resultado de una combinacioacuten de factores como la calidad del agua utilizada
para riego y el manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los alimentos (Zaidi
et al 2006)
Antecedentes
27
Un meta-anaacutelisis (revisioacuten sistemaacutetica en la cual se combinan matemaacuteticamente los
resultados de varios estudios para contestar una misma pregunta) realizado recientemente
confirma que Salmonella resiste a antibioacuteticos empleados en los alimentos de origen animal
ya que pueden estar contaminados con este microorganismo es resistente a 3 antibioacuteticos
como la amoxicilina las sulfonamidas y las tetraciclinas ya que son ampliamente usados en
produccioacuten animal (Ejo et al 2016)
B53 Manifestaciones cliacutenicas
El cuadro cliacutenico normalmente es de 2 a 5 diacuteas aunque en ocasiones persiste varias
semanas La gravedad de los siacutentomas variacutea considerablemente siendo mayor en nintildeos y
ancianos Si el microorganismo pasa desde el intestino a la corriente sanguiacutenea y llega a
otras partes del cuerpo puede ocasionar la muerte si la persona afectada no es tratada
raacutepidamente La mayoriacutea de las muertes causadas por esta bacteria han ocurrido entre
ancianos que viven en residencias La tasa de mortalidad es baja inferior a 1 en paiacuteses
desarrollados pero suelen producirse de 40-50 muertes al antildeo especialmente entre nintildeos
ancianos o personas inmunodeprimidas Las excretas de los enfermos contienen gran
cantidad de la especie de Salmonella implicada al comienzo de la enfermedad la cifra inicial
decrece seguacuten transcurre el tiempo (DeWaal y Barlow 2014)
El estado de portador se refiere a la condicioacuten en que las personas curadas pueden
eliminar Salmonella en sus heces durante meses La mitad de los individuos afectados
excretan este patoacutegeno de 2-4 semanas posteriores a su curacioacuten cliacutenica entre 10 y 20
continuacutean durante 4-8 semanas unos pocos durante 3 meses y en raras ocasiones se
prolonga hasta 6 meses El microorganismo puede eliminarse tambieacuten por la orina La dosis
infectante capaz de desencadenar la salmonelosis humana es alrededor de 1times105 UFCmL
dependiendo de factores como tipo de alimento virulencia de la cepa involucrada y
susceptibilidad del individuo Entre las especies altamente virales se encuentran la S Dublin
y sobre todo S Enteritidis (Callaway et al 2008)
El incremento del serotipo de S Enteritidis en los casos de salmonelosis humana al
contrario de otras del geacutenero Salmonella representa un importante problema de salud
puacuteblica en muchos paiacuteses ya que este serotipo infecta a gallinas aparentemente sanas que
posteriormente transmiten las enfermedades al hombre Si se consumen huevos crudos o
Antecedentes
28
poco cocidos el microorganismo podriacutea causar la enfermedad El nuacutemero de casos de
salmonelosis se incrementa durante el verano (Parra et al 2002 Callaway et al 2008
Fernaacutendez 2008)
B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis
Gran parte de las salmonelosis se deben al consumo de alimentos de origen animal
(carnes de abasto pollo mariscos pescado leche y huevos asiacute como ovoproductos y
productos laacutecteos no pasteurizados) o de origen vegetal que se contaminan con productos
en malas condiciones de salubridad o mal manipulados Muchos alimentos sobre todo los
de origen animal o contaminados con aguas residuales han servido como vehiacuteculos en
brotes de salmonelosis La carne de matadero estaacute contaminada habitualmente con
Salmonella su incidencia es mayor en las canales de ganado y otros animales debido por
ejemplo a la contaminacioacuten por el contenido intestinal de la res viva cuyas heces manchan
su piel pelo y patas al llegar al matadero Las canales de cerdo se contaminan durante las
operaciones de escaldado y pelado La contaminacioacuten entre las mismas canales y de eacutestas
a utensilios superficies de trabajo y manos de los que las manipulan es faacutecil Otro de los
principales reservorios de Salmonella es la carne de aves de corral La contaminacioacuten de las
canales de pollo y otras aves procede igualmente del tracto intestinal o del material fecal
de los animales que manchan sus patas y plumas Las etapas criacuteticas de la contaminacioacuten
de las canales aviares estaacuten en el desplumado y la evisceracioacuten tambieacuten es comuacuten la
contaminacioacuten cruzada a traveacutes de las manos de los operarios equipo y utensilios utilizados
en la preparacioacuten y troceado de las canales (Marcus et al 2004)
Son raras las salmonelosis adquiridas directamente de carnes bien cocinadas la mayoriacutea
de los brotes se deben a una coccioacuten insuficiente o por contaminacioacuten posterior a su
preparacioacuten Las carnes elaboradas mediante fermentacioacuten (salami chorizo y salchichoacuten)
pueden ser causa de brotes de salmonelosis teniendo en cuenta que las especies que
integran este geacutenero pueden sobrevivir al proceso de fermentacioacuten (Forsythe y Hayes
2002)
Como se mencionoacute anteriormente otro alimento que se asocia con frecuencia a
Salmonella es el huevo La contaminacioacuten se produce por dos viacuteas a traveacutes de la caacutescara
contaminada y por viacutea transovaacuterica en aves infectadas (gallina pata pava) En el primer
caso la superficie de la caacutescara se contamina siempre a su paso por la cloaca o cuando el
Antecedentes
29
huevo estaacute en un ambiente fecal los huevos rotos o manchados constituyen un peligro en
la propagacioacuten de especies de Salmonella (EFSA 2014)
La contaminacioacuten partiendo de la caacutescara se produce si eacutesta mantiene un grado de
humedad apropiado y existe una temperatura diferencial significativa entre el contenido del
huevo y el ambiente La diferencia de temperaturas entre el huevo maacutes elevada y el
ambiente favorece la absorcioacuten de los microorganismos como Salmonella Tambieacuten se
transmite sobre la caacutescara por contaminacioacuten cruzada a traveacutes de los manipuladores que
han tenido contacto con superficies infectadas durante el transporte y almacenamiento de
los mismos en lugares con precarias condiciones de higiene (Ejo et al 2016) Salmonella
es causal de graves enfermedades que son trasmitidas por productos derivados de huevo
contaminado y la asociacioacuten entre la infeccioacuten del tracto reproductivo de los pollos fue un
fuerte incentivo para desarrollar programas de prevencioacuten (Jawale y Lee 2014)
La leche cruda puede albergar Salmonella y ser causa de brotes de salmonelosis se
contamina a traveacutes del pezoacuten y por las manos del ordentildeador la pasteurizacioacuten elimina la
presencia de la bacteria Entre los productos laacutecteos se han identificado como causa de
brotes de salmonelosis la leche en polvo el queso los helados y maacutes raramente la
mantequilla todos ellos por fallos en su elaboracioacuten Salmonella se destruye o inactiva
durante la fermentacioacuten de alta acidez como el yogur y el queso de pH inferior a 45 En el
caso del queso poco aacutecido (pH superior a 49) la Salmonella puede desarrollarse en
cualquier etapa de su elaboracioacuten (Mastroeni y Maskell 2006)
Entre las verduras cualquiera puede contener Salmonella cuando se cultivan con aguas
residuales contaminadas o son fertilizadas con abonos de origen animal Algunos vegetales
como los berros han sido causa de brotes de salmonelosis Por otro lado los mariscos se
contaminan con Salmonella cuando se criacutean en aguas residuales contaminadas por lo que
han sido la causa de numerosos brotes en todo el mundo la depuracioacuten es la medida
preventiva adecuada Diferentes alimentos se han identificado como portadores de
Salmonella entre ellos coco cebada harina de cereales pimienta blanca y negra pasta
cacao en polvo y chocolate (Fernaacutendez 2008) La FDA (2017) reportoacute el aumento de las
pruebas de las cuales ha identificado papayas de dos granjas que resultaron positivas para
las cepas de Salmonella que coinciden con enfermedades no relacionadas con este brote
Antecedentes
30
C Crecimiento microbiano
El crecimiento microbiano puede definirse como un incremento en los constituyentes
celulares que ocasiona un aumento del nuacutemero de ceacutelulas de los microorganismos que se
multiplican por gemacioacuten y fisioacuten binaria En el uacuteltimo caso las ceacutelulas individuales se
agrandan y dividen para originar dos ceacutelulas hijas de un tamantildeo aproximadamente igual
(Atlas y Bartha 2002)
C1 Crecimiento de los microorganismos
Todos los mamiacuteferos incluyendo los seres humanos se adaptan a la vida del mundo
microbiano Louis Pasteur Robert Koch Eacutelie Metchnikoff y Theodor Escherich entre otros
investigadores sentaron las bases conceptuales sobre las interacciones microbio-hueacutesped
Pasteur postuloacute que los microbios eran necesarios para la vida humana y Metchnikoff afirmoacute
que la composicioacuten de la flora microbiana era esencial para el bienestar del hueacutesped
Igualmente Escherich estaba convencido de que el conocimiento preciso de la flora
endoacutegena era esencial no soacutelo para la comprensioacuten de la fisiologiacutea de la digestioacuten sino para
la comprensioacuten de la patologiacutea y terapia de enfermedades microbianas intestinales A pesar
de estas primeras ideas soacutelo recientemente los cientiacuteficos han desarrollado meacutetodos que
permiten caracterizar directamente los mecanismos moleculares que subyacen a la creacioacuten
y mantenimiento de diversos ecosistemas microbianos (Falk et al1998)
El crecimiento de una poblacioacuten bacteriana resulta de la suma de ciclos celulares de todos
sus individuos y suele ser asincroacutenico puesto que cada microorganismo se encuentra en un
punto diferente del ciclo celular Por consiguiente en un momento determinado en una
poblacioacuten se encuentran ceacutelulas que acaban de dividirse otras estaacuten replicando su ADN y
elongaacutendose y otras estaacuten iniciando la divisioacuten celular (Melbinger et al 2015)
El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza en la mayoriacutea de los
casos mediante la produccioacuten de colonias aisladas en cultivos soacutelidos El crecimiento
explosivo de las bacterias produce un gran nuacutemero a partir de una uacutenica ceacutelula inicial de
forma que tras un periacuteodo de tiempo de incubacioacuten en las condiciones ambientales
adecuadas se produce una colonia de individuos iguales Para que un microorganismo
crezca necesita nutrientes que le aporten energiacutea y elementos quiacutemicos para la siacutentesis de
sus constituyentes celulares De acuerdo a la fuente de carbono que utilizan los
Antecedentes
31
microorganismos se clasifican en autoacutetrofos si es el CO2 atmosfeacuterico (microorganismos que
fotosintetizan) y heteroacutetrofos si utilizan carbono orgaacutenico (Ouyang y Li 2013)
C11 Disponibilidad del agua
El agua es un factor importante para el crecimiento microbiano se requiere para crecer y
llevar a cabo las funciones metaboacutelicas de lo contrario los microorganismos se deshidratan
o mueren La aw depende de la concentracioacuten de solutos y de la cantidad de agua disponible
en el medio ambiente La mayoriacutea de las bacterias y hongos necesitan valores entre 098 y
0995 de aw para su pleno desarrollo (Madigan y Martinko 2006)
Una membrana plasmaacutetica permanentemente selectiva separa el contenido
citoplasmaacutetico del microorganismo de su ambiente por ello las alteraciones en la
concentracioacuten osmoacutetica del medio extracelular pueden afectar incluso la viabilidad de los
mismos Si se coloca un microorganismo en una solucioacuten isotoacutenica el agua entraraacute en la
ceacutelula y causaraacute su estallido salvo que la propia ceacutelula desarrolle alguna estrategia para
evitarlo por ejemplo reducir la concentracioacuten osmoacutetica del citoplasma gracias a los cuerpos
de inclusioacuten Los procariotas tambieacuten pueden contener canales sensibles a la presioacuten
osmoacutetica que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno
se vuelve maacutes baja que la del citoplasma (Madigan y Martinko 2006)
C12 Acidez y pH
El pH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad entre 5 y 8 para impedir la
destruccioacuten de las macromoleacuteculas haacutebiles en condiciones aacutecidas o alcalinas Los aacutecidos
fuertes (inorgaacutenicos) y los aacutecidos deacutebiles (orgaacutenicos) disminuyen el pH externo
posteriormente se disocian en el interior de la ceacutelula inhibiendo la actividad enzimaacutetica y el
transporte de nutrientes por lo tanto los microorganismos no pueden generar energiacutea de
almacenamiento y ocurre la muerte celular (Brooks et al1992)
C13 Oxiacutegeno
El oxiacutegeno molecular (O2) influye en el metabolismo de los microorganismos Durante el
Antecedentes
32
proceso de reduccioacuten del O2 se crean formas reactivas como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2)
superoacutexidos (O2-) y radicales hidroxilos (OH-) que producen dantildeo celular por la oxidacioacuten
de compuestos orgaacutenicos e incluso macromoleacuteculas (Prescott et al1999)
C14 Temperatura
La temperatura afecta el desarrollo y la supervivencia de los microorganismos En bajas
temperaturas la velocidad de crecimiento de algunos microorganismos disminuye y los
periacuteodos de latencia se alargan Por otro lado las temperaturas elevadas aceleran las
reacciones enzimaacuteticas (antes de los 40degC) pero si se intensifica el calor en algunos casos
provocan la desnaturalizacioacuten de las proteiacutenas y por consiguiente la lisis celular (Brooks et
al1992)
Es importante considerar que cada microorganismo tiene una temperatura de desarrollo
adecuada a mayor temperatura se produce un incremento lineal de la velocidad de
crecimiento hasta alcanzar el clima perfecto a velocidad maacutexima Por encima de esta
temperatura oacuteptima la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte
celular (Atlas y Bartha 2002) En la tabla 3 se presentan algunas condiciones ambientales
para el desarrollo de los microorganismos
Antecedentes
33
Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales (Lu et al 2006 Madigan et al 2006 Falk et al 2009)
Factor Tipo de
microorganismo Caracteriacutesticas Microorganismo representativo
NaCI
Osmotolerante Capaz de crecer en un amplio rango de aw o
presioacuten osmoacutetica St aureus Saccharomyces rouxii
Haloacutefilo Requiere altas concentraciones de NaCl para
crecer normalmente por encima de 02 M Halobacterium Dunaliella Ectohiorhodospira
pH
Acidoacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 0 y 55 Sulfolobus Picrophilus Ferroplasma Acontium
Cyanidium caldarium
Neutroacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 55 y 80 Euglena Paramecium
Alcaloacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 85 y 1 15 Badilas alcalophilus NaIronobaciacuteerium
Temperatu
ra
Psicroacutefilo Crece bien a 0degC temperatura oacuteptima de 15degC
o inferior Badilas psychrophilus Chlamydomonas nivalis
Psicroacutetrofo Puede crecer a 0-7degC oacuteptima de 20 a 30degC Listeria monocytogenes
Mesoacutefilo Temperatura maacutexima de 35degC
Temperatura oacuteptima alrededor de 20-45degC
P fluorescens E coli Neisseria gonorrhoeae
Trichomonas vaginalis
Termoacutefilo Puede crecer a 55degC o superior temperatura
oacuteptima a menudo entre 55 y 65degC
Geobacillus stearothermophilus Thermus
aquaticus Cyanidium caldarium
Hipertermoacutefilo Temperatura oacuteptima entre 80 y 113degC Chaetomium thermophile Sulfolobus
Atmoacutesfera
Aerobio obligado Completamente dependiente del O2 para
crecer Pseudomonas Mycobacterium tuberculosis
Anaerobio
facultativo
No requiere O2 pero crece mejor en su
presencia
M luteus St aureus
Streptococcus pneumoniae L monocytogenes
Anaerobio
aerotolerante Crece bien en presencia o en ausencia de O2 Lactobacillus
Anaerobio
obligado No tolera el O2 y muere en su presencia Clostridium botulinum C perfringens
Microaeroacutefilo
Requiere nivel de O2 inferior a 2-10 para
crecer y es dantildeado por el O2 (20) C fetus
Antecedentes
34
D Control del crecimiento microbiano
Los microorganismos toleran determinados factores ambientales Asiacute unas bacterias
pueden tener condiciones para su desarrollo y estas condiciones pueden ser nocivas para una
especie bacteriana El crecimiento de una poblacioacuten microbiana se estudia analizando la curva
de crecimiento de un cultivo La curva del crecimiento microbiano representa la evolucioacuten del
nuacutemero de nuacutemero de ceacutelulas viables presente en un cultivo microbiano liacutequido a lo largo del
tiempo de estudio Se estudia el nuacutemero de ceacutelulas viables por mililitro de un cultivo de
volumen limitado y con una cantidad de nutrientes limitada como por ejemplo un medio de
cultivo liacutequido en un matraz que ha sido inoculado con una cantidad inicial de microorganismos
o inoacuteculo (Hunter-Cevera y Belt 1996) Para llevar a cabo estos estudios se distingue tres
niveles entre los modelos de microbiologiacutea predictiva los que describen los cambios en el
nuacutemero de microorganismos con respecto al tiempo con respecto al efecto de las condiciones
ambientales y los que combinan los dos aspectos anteriores (Larcher y Cattaneo 2006)
Se considera el crecimiento de las bacterias en funcioacuten de su fondo geneacutetico en relacioacuten
con los nutrientes y en unas hipoteacuteticas condiciones ideales (oacuteptimas) Sin embargo el trabajo
experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales es decir
una serie de agentes fiacutesicos y quiacutemicos El anaacutelisis de la curva de crecimiento bacteriano es
muy importante para determinar el potencial de una teacutecnica de control especiacutefica Al igual que
las bacterias los fagos al forman una interaccioacuten con su bacteria hueacutesped se necesita
determinar una cuantificacioacuten del nuacutemero de copias que se generan por la infeccioacuten a esta
condicioacuten se le conoce como fase de eclipse siendo el momento idoacuteneo para realizar la
infeccioacuten fago-bacteria (Lee et al 2016)
D1 Agentes fiacutesicos
La temperatura es uno de los paraacutemetros ambientales maacutes importantes que condicionan el
crecimiento y la supervivencia de los microorganismos La temperatura afecta a la velocidad
de crecimiento y por lo tanto al tiempo de generacioacuten Cada bacteria es diferente y esto se
puede observar en una curva de tasa de crecimiento en funcioacuten de la temperatura Si se suele
utilizar calor en combinacioacuten con otros agentes fiacutesicos (filtracioacuten presioacuten y radiacioacuten) Al
aplicar temperaturas altas se refleja desnaturalizacioacuten e inactivacioacuten de proteiacutenas enzimaacuteticas
esenciales colapsamiento de la membrana citoplaacutesmica y a veces lisis teacutermica de la bacteria
Antecedentes
35
esta condicioacuten se presenta raacutepidamente cuando se aplica presioacuten la cual se utiliza para
esterilizar objetos como lo demuestra el uso universal de la autoclave en todos los
laboratorios de microbiologiacutea (Madigan y Martinko 2006) El calor es auacuten uno de los meacutetodos
maacutes comunes para destruir microorganismos se puede aplicar huacutemedo o seco (Salgado-Nava
y Jimeacutenez-Munguiacutea 2012) Por otro lado ademaacutes de aplicar calor si a las bacterias se le
extrae el calor del medio de manera intensa recurrir a la congelacioacuten con fines de conservacioacuten
de microorganismos por largos periacuteodos si se realiza apropiadamente numerosos
laboratorios disponen de congeladores a -30 o -70degC para la conservacioacuten de colecciones de
cultivos microbianos (Shafiei et al 2014)
D2 Agentes quiacutemicos
Aunque los objetos se desinfectan a veces con agentes fiacutesicos tambieacuten las sustancias
quiacutemicas se utilizan con mucha frecuencia por ejemplo los quimioteraacutepicos son sustancias
con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostaacutetica) En estas sustancias se busca
que sea efectivo contra un amplio espectro de microorganismos Pero no existe (hasta estos
momentos) un solo agente capaz de inhibir a todos los microorganismos Por otro lado existen
quimioteraacutepicos de espectro estrecho pero muy selectivos contra ciertas bacterias que son
patoacutegenas importantes Muchos factores influyen en la eficacia de los desinfectantes hay que
considerar la cepa de microorganismos presentes la concentracioacuten y naturaleza del
desinfectante y la duracioacuten del tratamiento Asimismo es imprescindible que las superficies
sucias se limpien antes de aplicar un desinfectante El uso apropiado de los agentes quiacutemicos
es esencial para la seguridad en los laboratorios y hospitales estos mismos productos se
utilizan tambieacuten para evitar el crecimiento microbiano en los alimentos (Prescott et al 1999)
E Fagos
E1 Antecedentes
Los virus son agentes infecciosos submicroscoacutepicos que pueden replicarse
independientemente de los cromosomas de una ceacutelula pero no independientemente de ella
A fin de multiplicarse deben penetrar la ceacutelula donde puedan replicarse a la cual se le
denomina hueacutesped Presentan una forma infecciosa madura que es tiacutepicamente extracelular
Antecedentes
36
Pueden infectar a diferentes seres vivos por lo que existen virus de animales de plantas y
de forma particular los llamados virus bacterianos o fagos (Madigan y Martinko 2006)
Los bacterioacutefagos o fagos (del griego φαγετον paguumlento ldquoalimentoingestioacutenrdquo) son agentes
virales de las bacterias su descubrimiento se atribuye por un lado al bacterioacutelogo ingleacutes F
W Twort que en 1915 mencionoacute el aclaramiento de un cultivo soacutelido de Micrococcus
provocado por un agente desconocido Por otro lado en 1917 el francocanadiense F
dHerelle descubrioacute un grupo de entidades bioloacutegicas en medios de cultivo que se propagaban
a expensas de las bacterias a los cuales les denominoacute fagos y dentro de sus investigaciones
definioacute su potencial uso e importancia cliacutenica Esto se refuerza a partir de 1940 con el
desarrollo del microscopio electroacutenico con el que se demuestra la naturaleza viral de los fagos
y que la forma de estudiarlos es mediante procedimientos microbioloacutegicos convencionales
facilitando su manejo y estudio (Grabow 2001)
La uacuteltima variedad de fagos se descubrioacute durante la Primera Guerra Mundial los tipos ya
conocidos eran los virus que afectaban a vegetales y animales fue entonces que se pensoacute
en que su aplicacioacuten para eliminar bacterias podriacutea ser utilizada para la prevencioacuten y el
tratamiento de enfermedades bacterianas pero no resultoacute (Merril et al 1996) Sin embargo
los fagos resultaron tener otros beneficios especialmente como modelos o sustitutos de los
virus en humanos en la investigacioacuten geneacutetica baacutesica asiacute como en la evaluacioacuten de la calidad
del agua Ademaacutes demostraron ser una herramienta valiosa en la mayoriacutea de las
investigaciones sobre los virus ya que en comparacioacuten con los humanos animales vegetales
e incluso los insectos anfitriones de otros virus los fagos son faacutecil y raacutepidamente reproducibles
en el laboratorio y no son particularmente exigentes con respecto al espacio instalaciones y
equipos El trabajar con fagos requiere la separacioacuten y purificacioacuten y las dos principales tareas
para realizar esto es utilizar meacutetodos quiacutemicos en los cuales se utilizan solutos como buffer
glicerol bromuro de potasio cloruro de cesio y tartrato de potasio aunque el maacutes comuacuten es
la sacarosa ademaacutes involucra la precipitacioacuten con sulfato de amonio polietilenglicol o cloruro
de cesio y los meacutetodos fiacutesicos que implican la centrifugacioacuten a diferentes velocidades y
gradientes de densidad y con menor frecuencia la cromatografiacutea de particioacuten (Sambrook y
Russell 2001)
La investigacioacuten sobre las propiedades baacutesicas de los fagos se desarrolla en la biologiacutea
molecular que permitioacute avances sin precedentes en toda la biologiacutea y ciencias meacutedicas La
Antecedentes
37
concentracioacuten y purificacioacuten es un factor determinante para llevar a cabo la infeccioacuten
eficientemente sin embargo existe un periacuteodo de adaptacioacuten por parte de los fagos antes
que se desarrollen y se logren tiacutetulos apreciables en ceacutelulas cultivadas (Sambrook y Russell
2001 Breeuwer et al 2003)
E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos
Los virus son paraacutesitos intracelulares obligados no tienen metabolismo intriacutenseco y
requieren la maquinaria metaboacutelica codificada por los cromosomas de ceacutelula que puedan
infectar y reproducirse en ella denominada hueacutesped Su tamantildeo oscila entre 20 y 200 nm y
consiste de un nuacutecleo de aacutecido nucleico (ARN o ADN de cadena simple o doble) rodeado por
una cubierta proteica (caacutepside) y en algunos casos una cubierta de liacutepidos Los microbioacutelogos
que investigan la presencia de virus en haacutebitats marinos y han detectado su presencia creen
que son diez veces maacutes numerosos que las bacterias marinas En la superficie de los mares
se encuentran entre 106 y 109 partiacuteculas viacutericas por mililitro y se estima que en la capa
superficial (1 mm) de los oceacuteanos se encuentran unas 3 x 1030 partiacuteculas viacutericas (Grabow
2001 Atterbury et al 2003)
E3 Clasificacioacuten de los fagos
Las variaciones en los fagos se presentan en forma estructural como apeacutendices en la
cabeza cuello y las fibras de la cola o espigas ademaacutes del genoma que variacutea en cada orden
En 1962 Andreacute Lwoff junto a otros investigadores propuso una clasificacioacuten basada en la
morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico Los nombraron de la siguiente manera los urovirales
que presentaban cola pronunciada los inoviridae eran los filamentosos y los microviridae los
tipo φX Posteriormente Bradley (1967) consideroacute la morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico y
agrupoacute a los fagos en seis morfotipos baacutesicos denominados de la A a la F posteriormente se
clasifico en fagos baacutesicos los de cola los filamentosos y los icosaeacutedricos con ADN de cadena
sencilla o RNA de cadena simple Los fagos han sido investigados debido a su rol como
agentes de biocontrol para el desarrollo de la seguridad alimentaria En el presente varios
miles de fagos en contra de varios objetivos han sido aislados de varios entornos y alimentos
Aproximadamente el 96 de los fagos aislados eran con cola y del tipo liacuteticos en una de las
Antecedentes
38
tres familias Myoviridae (245) Siphoviridae (61) y Podoviridae (14) en el orden de los
caudovirales (Atterbury et al 2003 Oh y Park 2017)
En 1971 el Comiteacute Internacional de Taxonomiacutea de Virus (ICTV por sus siglas en ingleacutes)
clasificoacute en 6 geacuteneros de los cuales 5 corresponden a la clasificacioacuten propuesta por Bradley
los grupos T4 λ φX174 MS2 y fd Los fagos pueden tener cola larga y flexible no contraacutectil
(Siphoviridae) cola larga y contraacutectil (Myoviridae) o cola corta (Podoviridae) como se observa
en la tabla 4 Para la clasificacioacuten de los fagos se aplican propiedades como el rango de
hueacutespedes y las relaciones inmunoloacutegicas sin embargo las maacutes importantes son su
morfologiacutea y las caracteriacutesticas de su aacutecido nucleico el cual se adsorbe a componentes de la
superficie celular que actuacutean como receptores especiacuteficos La zona de adsorcioacuten del virus es
complementaria al receptor celular por lo tanto un determinado fago soacutelo puede infectar un
nuacutemero limitado de cepas celulares que contengan a un determinado receptor La naturaleza
de la zona de adsorcioacuten variacutea con el tipo de fago En el T4 se localiza en el extremo de la cola
en donde se encuentran la placa basal las espiacuteculas y las fibras de la cola Las formas maacutes
complejas corresponden a los fagos con colas contraacutectiles (Atterbury et al 2003)
Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos
(Ackermann 2003)
Antecedentes
39
E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico
La multiplicacioacuten de los fagos (figura 4) ADN produce la destruccioacuten de la ceacutelula hueacutesped
mediante lisis lo que provoca su liberacioacuten El ciclo vital de un fago que culmina con el
estallido de la ceacutelula hueacutesped y la liberacioacuten de viriones recibe el nombre de ciclo liacutetico Los
acontecimientos que tienen lugar durante el ciclo liacutetico se revisaraacuten en esta seccioacuten con
especial atencioacuten a los fagos T-par de E coli Estos son fagos de ADN bicatenario con colas
contraacutectiles complejas de la familia Myoviridae son algunos de los virus maacutes complejos
conocidos (Fernaacutendez 2008)
Figura 4 Adsorcioacuten del fago T4 e inyeccioacuten del ADN (Leverentz et al 2003)
Los fagos podriacutean infectar hasta un 70 de la poblacioacuten de procariotas marinos y ser
responsables de la tercera parte de la mortalidad bacteriana acuaacutetica Tambieacuten se han
detectado virus que infectan diatomeas y otras algas importantes del fitoplancton marino lo
cual es de gran transcendencia ecoloacutegica ya que la multiplicacioacuten de bacterias marinas
supera la capacidad de reproduccioacuten de los protozoos La lisis por virus de ceacutelulas procariotas
y de algas puede tambieacuten contribuir enormemente en los ciclos del carbono y nitroacutegeno en las
cadenas troacuteficas marinas incluso podriacutea reducir el nivel de productividad marina como la de
moluscos y peces (Muniesa et al 2005)
E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten
Los fagos no se unen al azar a la superficie de una ceacutelula hueacutesped por el contrario se fijan
a receptores especiacuteficos La naturaleza de estos receptores variacutea de acuerdo al fago pueden
Antecedentes
40
ser lipopolisacaacuteridos y proteiacutenas de la pared celular aacutecidos teicoicos flagelos y pili Los fagos
T-par de E coli en particular utilizan lipopolisacaacuteridos o proteiacutenas de la pared celular como
receptores Las variaciones en las propiedades del receptor son parcialmente responsables
de las preferencias del fagos por el hueacutesped (Muniesa et al 2005 Leeuw et al 2017)
La adsorcioacuten de fagos T-par estaacute relacionada con diversas estructuras del tallo La fijacioacuten
del fago comienza cuando una fibra del tallo establece contacto con los receptores adecuados
a medida que maacutes fibras contactan con los receptores la placa basal se asienta en la
superficie La unioacuten se debe probablemente a interacciones electrostaacuteticas y se ve influida por
el pH y por la presencia de iones como Mg+2 y Ca+2 Una vez que la placa basal estaacute
firmemente asentada en la superficie celular se producen cambios conformacionales en ella
y en la vaina del tallo Esta uacuteltima se reorganiza de tal forma que se contrae pasando de una
conformacioacuten en cilindro de 24 anillos a otra de 12 anillos de longitud maacutes corta y ancha es
entonces cuando el tubo central es empujado a traveacutes de la pared celular bacteriana
Finalmente el ADN es extruido de la cabeza pasa a traveacutes del tubo del tallo y penetra en la
ceacutelula hueacutesped Parece ser que el tubo interacciona con la membrana plasmaacutetica para formar
un poro a traveacutes del cual pasa el ADN los mecanismos de penetracioacuten de otros fagos difieren
a menudo de los fagos T-par aunque no se han estudiado en detalle (Leverentz et al 2003)
F Biofilm
Las bacterias existen en la naturaleza bajo dos formas o estados a) bacterias planctoacutenicas
de libre flotacioacuten y b) bacterias biofilm en colonias de microorganismos seacutesiles (Nazar 2007)
Un biofilm se define como una agrupacioacuten de comunidades seacutesiles microbianas que se fijan a
superficies las ceacutelulas estaacuten incrustadas en una matriz autoproducida que actuacutea como
proteccioacuten quiacutemica y mecaacutenica del entorno asiacute estas bacterias presentan mayor resistencia
a desinfectantes y el secado (Vestby et al 2009) Las bacterias pueden crear condiciones
para formar biofilms casi en cualquier ambiente liacutequido La interfase soacutelido-liacutequido entre una
superficie y un medio acuoso (vgr leche) proporciona un entorno ideal para la fijacioacuten y
crecimiento de microorganismos (Fakruddin et al 2014)
Antecedentes
41
G Microscopiacutea electroacutenica
Los microscopios electroacutenicos se usan habitualmente para el estudio detallado de
estructuras celulares (Bradley 1967) Para analizar las estructuras internas es esencial el
microscopio electroacutenico de transmisioacuten MET En el MET se utilizan electrones en lugar de rayo
de luz las lentes son electromagneacuteticas y se opera en todo momento a alto vaciacuteo
(Ackermann 2003) El poder de resolucioacuten del microscopio electroacutenico es mucho mayor que
el del microscopio oacuteptico incluso pueden observarse estructuras moleculares como proteiacutenas
y aacutecidos nucleicos Sin embargo los haces de electrones tienen escaso poder de penetracioacuten
y una ceacutelula aislada es demasiado gruesa para poder visualizarse directamente por este
motivo se emplean teacutecnicas especiales para la obtencioacuten de cortes ultrafinos a fin de poder
observar las muestras Una ceacutelula bacteriana por ejemplo se corta con una cuchilla especial
en varios cortes ultrafinos de 20-60 nm de espesor que son posteriormente examinados de
manera individual en el microscopio electroacutenico (Fuster-Valls et al 2008) Para obtener
suficiente contraste las preparaciones se tintildeen previamente mediante tratamiento con
compuestos como aacutecido oacutesmico permanganato sales de uranilo o de lantano o plomo Como
estas sustancias poseen aacutetomos pesados son capaces de desviar los electrones y aumentar
el contraste (Madigan y Martinko 2006)
La microscopiacutea electroacutenica es el mejor meacutetodo para estudiar la forma de las bacterias Los
virus bacterianos por tener un diaacutemetro menor de 1000 Aring estaacuten por debajo del liacutemite de
resolucioacuten del microscopio oacuteptico sin embargo es posible observarlos mediante el
microscopio electroacutenico porque eacuteste utiliza una radiacioacuten de longitud de onda maacutes corta que
permite aumentar 100 mil veces una resolucioacuten de 10 Aring (Kruger et al 2000 Ackermann
2003) Para observar detenidamente la morfologiacutea se requiere el microscopio electroacutenico con
especificaciones precisas como el de barrido lo cual es una herramienta indispensable en
biologia molecular (Guzmaacuten 2015)
Para la observacioacuten las partiacuteculas se suspenden en un medio volaacutetil por lo general una
solucioacuten de acetato de amonio y se colocan sobre una membrana sostenida por una rejilla
metaacutelica que praacutecticamente no absorbe electrones El problema teacutecnico maacutes frecuente es la
falta de contraste como la imagen obtenida es el resultado de la dispersioacuten de electrones por
los aacutetomos de la partiacutecula se necesita una diferencia apreciable de poder dispersivo entre las
partiacuteculas y el medio de soporte generalmente se emplean teacutecnicas tradicionales La maacutes
utilizada se conoce como tincioacuten negativa consiste en mezclar la suspensioacuten del fago con
Antecedentes
42
fosfovolframato de sodio o acetato de uranilo a pH neutro A este pH las sales no se combinan
con el fago al secarse forman una capa uniforme y opaca a los electrones en la cual los fagos
destacan como partiacuteculas maacutes claras Como las sales en solucioacuten penetran las irregularidades
en la superficie de la partiacutecula la micrografiacutea revela los detalles finos de los fagos (Fuster-
Valls et al 2008 Montantildeez et al 2012)
La forma del fago se establece de manera visual que es directa de la placa cuando las
UFP que se observan a simple vista como placas liacuteticas a contraluz (APHA 2005) Y para
estudiar la adhesioacuten y formacioacuten celular en diversas superficies se han desarrollado varias
teacutecnicas de microscopiacutea entre las cuales se distinguen la microscopiacutea electroacutenica de barrido
y de transmisioacuten asiacute como la microscopiacutea de epifluorescencia (Fuster-Valls et al 2008) la
cual se basa en los mismos principios de oacuteptica de la microscopiacutea comuacuten con diferencias en
el manejo y el disentildeo relacionadas con la generacioacuten y transmisioacuten de longitudes de onda
adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar ya sean propios de la muestra o de
la coloracioacuten utilizada (Franco 2005)
El fundamento de la teacutecnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o
compuestos fluorescentes denominados fluorocromos en fijarse a los anticuerpos mediante
un enlace quiacutemico estable que no puede romperse durante el curso de la reaccioacuten
inmunoloacutegica La espectroscopia de fluorescencia es la teacutecnica de deteccioacuten oacuteptica maacutes
sensible En el caso de la deteccioacuten en ceacutelulas se exponen a alta energiacutea utilizando laacutemparas
de xenon excitando por varios nanosegundos y asiacute emitiendo una longitud de onda de baja
energiacutea (Franz y Jendreizik 2015)
H Fagoterapia
Las enfermedades infecciosas estaacuten catalogadas entre las primeras causas de muerte en
el mundo y por lo tanto son consideradas un problema de salud puacuteblica Entre ellas las
infecciones bacterianas causan gran preocupacioacuten dado que las bacterias adquieren diacutea a
diacutea mayor resistencia a los antibioacuteticos esto ocurre por medio de diversos mecanismos
fisioloacutegicos y moleculares que les permiten a estos microorganismos adaptarse raacutepidamente
a condiciones adversas (Prada-Pentildearanda et al 2015)
El descubrimiento de los fagos por dacuteHerelle se desarrolloacute cuando eacuteste buscaba una
Antecedentes
43
vacuna que pudiera combatir la crisis de disenteriacutea hemorraacutegica que se presentoacute en 1915 en
las afueras de Francia dacuteHerelle observoacute que tras aislar lisados libres de bacterias de la
materia fecal de los enfermos las bacterias eran destruidas por un agente desconocido
invisible capaz de destruir cultivos de bacterias o producir pequentildeas aacutereas de color maacutes claro
cuando las bacterias eran crecidas en confluencia en placas de medio soacutelido y publicoacute sus
observaciones en el artiacuteculo titulado ldquoSobre un microbio invisible antagonista de los bacilos
de la disenteriacuteardquo (Szafranski et al 2017)
El uso de los fagos como agentes terapeacuteuticos comenzoacute hace maacutes de 80 antildeos Entre los
ejemplos maacutes destacados y recientes de la utilizacioacuten exitosa de la fagoterapia cabe citar el
uso de fagos especiacuteficos en el control bioloacutegico de E coli O157H7 productora de colitis
hemorraacutegica (en alimentos) Tambieacuten se ha estudiado el uso de fagos en el tratamiento de
infecciones peritoneales y otitis externa en la erradicacioacuten de P aeruginosa en pacientes con
fibrosis quiacutestica en el tratamiento de infecciones urinarias y osteomielitis por S aureus y en
la descolonizacioacuten intestinal para combatir las infecciones por Enterococcus faecium
resistente a vancomicina entre otros Los efectos favorables de la fagoterapia podriacutean
exceder incluso su actividad antibacteriana Hay datos sorprendentes acerca de la actividad
in vivo de los fagos el conocido fago T4 de E coli podriacutea inhibir la adsorcioacuten y la replicacioacuten
de adenovirus en sus ceacutelulas blanco y el fago Pf4 de P aeruginosa habriacutea sido capaz de
inhibir el desarrollo de cepas de Aspergillus por secuestro de hierro (Lopardo 2017)
El estudio y desarrollo de nuevos tratamientos alternativos es de particular intereacutes en la
lucha contra la resistencia bacteriana Los fagos presentan caracteriacutesticas que los hace una
excelente herramienta contra las bacterias patoacutegenas debido a su especificidad y seguridad
ecoloacutegica Los fagos no solo son atractivos desde un punto de vista cliacutenico Se han utilizaacutedo
como potenciales aplicaciones en otras aacutereas como la agricultura el control de alimentos o
la industria como a continuacioacuten se describe en la siguiente tabla 5 Los fagos son una
solucioacuten ecoloacutegica ubicua para desarrollar nuevos tratamientos contra las bacterias aunque
se deben realizar maacutes estudios para comprender mejor la relacioacuten entre ellos y las bacterias
antes de su aplicacioacuten (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)
Antecedentes
44
Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos la naturaleza lugares
urbanizados y cuerpo humano (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)
Fuente Sitio encontrado
Naturaleza
Suelo y superficie terrestre
Agua continental y oceaacutenica
Ambientes extremos hielo marino pared de
algas zonas hipersalinas etc
Lugares artificiales
Hospitales y zonas similares
Planta de tratamiento de aguas negras
Algunas zonas bajo el impacto humano
Cuerpo de animales
Tracto digestivo y vagina
Tracto respiratorio y oral
Piel y epitelio mucoso
Los productos comerciales para terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones
Los fagos se pueden distribuir liofilizados y se disuelven antes de la administracioacuten por viacutea
intravenosa en un soporte adecuado como por ejemplo una solucioacuten acuosa o tampoacuten o
suspenderse en cualquier liacutequido adecuado coloidal o de la matriz de poliacutemeros para crear
bactericidas el principio activo se puede administrar de una manera conveniente como por
inyeccioacuten (subcutaacutenea intravenosa administracioacuten etc) por viacutea oral pulmonar (por ejemplo
aerosoles o por otros dispositivos a los pulmones) spray nasal intramuscular intraperitoneal
intrahecal intraviacutetrea vaginal rectal la puncioacuten lumbar y la aplicacioacuten directa Dependiendo
de la viacutea de administracioacuten el principio activo puede estar recubierto de un material que
preserve la sustancia de la accioacuten de enzimas aacutecidos y otras condiciones naturales que
pueden inactivar la sustancia (por ejemplo comprimidos recubiertos enteacutericos o pastillas)
Empresas dedicadas a la biotecnologiacutea se dedicaron a desarrollar productos utilizando fagos
especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan ETA la Food and Drug Administration de
los EE UU (FDA) incluye a los fagos en la categoriacutea de aditivos alimentarios la FDA ha
publicado la aprobacioacuten de seis fagos para usar en alimentos listos para comer (ready to eat)
efectivos para L monocytogenes de la compantildeiacutea Intralytix La compantildeiacutea Omnilytics ofrece
productos de control bacterial para varias aacutereas como son agricultura agua y alimentos
industrias que se pueden observar en su paacutegina web (httpswwwomnilyticscom) y otras
empresas como Biophage Pharma Inc (Canada) Exponential Biotherapies (EE UU)
(Segundo 2010)
Antecedentes
45
Estas nuevas estrategias de intervencioacuten eco-amigable son requeridas como agente de
biocontrol en contra de Salmonella Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos
antildeos debido a sus caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutef ico sin
dantildear la micro-flora en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros
distribucioacuten de esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla
algunos ejemplos de la aplicacioacuten de los fagos son los descritos en la siguiente tabla 6 (Oh y
Park 2017)
Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria (Oh y
Park 2017)
Compantildeiacutea Producto del fago Organismo hueacutesped
FINK TEC GmbH (Alemania) Secure Shield E1 E coli
Intralytix Inc
(EE UU)
Ecolicidereg (EcolicidePXtrade) E coli O157H7
EcoShieldtrade E coli O157H7
ListShieldtrade L monocytogenes
SalmoFreshtrade Salmonella spp
ShigaShieldtrade
(ShigActivetrade) Shigella spp
Micreos Food Safety
(Holanda)
PhageGuard Listextrade L monocytogenes
PhageGuard Strade Salmonella spp
E coli O157H7
Passport Food Safety Solutions
(EE UU) Finalysereg E coli O157H7
Phagelux (China)
AgriPhag
Xanthomonas campestris pv
vesicatoria Pseudomonas
syringae
pv tomato
SalmoProreg Salmonella spp
Salmonella spp
Antecedentes
46
47
III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO
48
Objetivos y plan de trabajo
49
A Objetivo general
El objetivo general de este estudio es aislar y caracterizar fagos frente Salmonella spp a
partir de diversas fuentes ambientales para su uso potencial en el control bioloacutegico
El control de Salmonella spp es de gran intereacutes para la industria alimentaria por lo que
encontrar alternativas para su eliminacioacuten es de gran impacto en la salud puacuteblica
B Objetivos especiacuteficos
1- Aislar fagos de Salmonella proveniente de muestras de aguas residuales de la ZMM y
muestras de lavado de carne pollo de un establecimiento donde se comercializa esta carne
2- Caracterizar parcialmente los fagos aislados en base a su morfologiacutea por TEM y el
anaacutelisis de sensibilidad frente a diversas cepas bacterianas
3- Estudiar el efecto de los fagos previamente aislados desarrollando un biofilm de
Salmonella spp sobre discos de acero inoxidable utilizando la DEM
C Plan de trabajo
Para alcanzar los objetivos establecidos se considera la ubicacioacuten de las fuentes para la
obtencioacuten de los fagos en este caso el medio seleccionado son riacuteos arroyos asiacute como un
establecimiento donde se procesan canales de pollo en la ZMM y las lagunas de oxidacioacuten
de aguas residuales en Mariacuten ambas localidades en Nuevo Leoacuten Meacutexico
Posteriormentese utilizaraacute la teacutecnica ADC y se verificaraacute en cual de estas muestras se
podriacutean encontrar fagos que sean liacuteticos para Salmonella enterica y posteriormente se
realizaraacuten pruebas de selectividad con la meta de caracterizar los fagos aislados frente a
diferentes hueacutesped (cepas de Salmonella spp y de E coli) y la observacioacuten de la morfologiacutea
se realizaraacute por el TEM
Salmonella spp presenta un periacuteodo de incubacioacuten por lo general entre 12 y 36 horas
tras el cual el derarrollo bacteriano en las superficies puede dar como resultado la formacioacuten
de un biofilm Para este estudio se desarrollaraacute un biofilm de Salmonella spp sobre discos
de acero inoxidable en condiciones de humedad esto es importante por la fase de eclipse
Objetivos y plan de trabajo
50
(momento en el cual atacan y se desarrollan los fagos) Se probaraacuten 3 concentraciones de
fago 6 7 y 8 UFPmL Se realizaraacuten recuentos durante un periacuteodo de incubacioacuten de 72 h
Con el fin de conseguir estos objetivos el presente trabajo se ha estructurado en tres
secciones las cuales se pueden observar en la figura 5 incluyendo las pruebas con DEM
en los discos de acero inoxidable
Figura 5 Diagrama general de trabajo
51
IV MATERIALES Y MEacuteTODOS
52
Materiales y meacutetodos
53
A Toma de muestras
Las muestras para obtencioacuten de fagos se recolectaron en diez sitios del aacuterea metropolitana
de Monterrey y del municipio de Mariacuten Nuevo Leoacuten (tabla 7) El meacutetodo que se utilizoacute para
aislar fagos de diversas fuentes medio ambientales y su posterior traslado al laboratorio fue
el descrito por Higgins et al (2005) Se obtuvieron las muestras provenientes de aguas
residuales y riacuteos se emplearon frascos de 450 mL previamente lavados y secos que
posteriormente se impregnaron con una solucioacuten de tiosulfato de sodio (Na2S2O3bull5H2O) al
10 (pv) (Sigma-Aldrich EE UU) y se esterilizaron en autoclave 121ordmC15min Al momento
de hacer la recoleccioacuten en campo los frascos fueron abiertos cuidadosamente y se llenaron
con el liacutequido se almacenaron en hieleras para su traslado al laboratorio el tiempo que
transcurrioacute desde la toma de la muestra hasta la llegada al laboratorio fue entre 1 y 3 h
posteriormente las muestras se centrifugaron el mismo diacutea y los sobrenadantes se
almacenaron 4oC hasta su uso (Vidales-Contreras et al 2006)
A cada una de las muestras obtenidas en el muestreo se le agregoacute 25 de cloroformo
(grado de reactivo 995 Sigma-Aldrich EE UU) para conservarlas en condiciones oacuteptimas
para su posterior llegar al laboratorio se mantuvieron a 4degC durante toda la noche para
permitir que el material grueso decante Mientras tanto en lo referente a las muestras
obtenidas de aguas provenientes de los establecimientos expendedores de pollos las
muestras se trataron igual pero como el sobrenadante contiene grasa se optoacute por filtrar y
posteriormente se realizoacute el mismo procedimiento antes descrito
Materiales y meacutetodos
54
Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos
B Obtencioacuten de fagos
Para aislar los fagos se utilizoacute la teacutecnica descrita por Sambrook y Russell (2001) la cual se
describe a continuacioacuten En un tubo de ensayo (16150 mm Fisherbrand EE UU)
conteniendo 45 mL de agar suave (AS) (Bioxon Meacutexico) mantenieacutendose a temperatura de
40C (en una cuba hidroneumaacutetica con agua) se colocaron 500 L de un cultivo de S
Enteritidis (provenientes del cepario del CINSP) en fase logariacutetmica y se agregaron 300 L
de las muestras recolectadas en las que se presume conteniacutean los fagos especiacuteficos para
esta cepa Se agitoacute el tubo de ensayo mezclando con movimientos circulares suaves para
evitar la formacioacuten de burbujas este procedimiento se realizoacute aproximadamente por 5
segundos El contenido se vertioacute uniformemente sobre una caja de Petri (10015 mm
Fisherbrand EE UU) conteniendo agar soya tripticasa (AST) (Bioxon Meacutexico) y se dejoacute a
temperatura ambiente hasta solidificar la ADC Se incuboacute a 37C por 24h Al momento de
observar el desarrollo de las placas de lisis (calvas) se procedioacute al aislamiento de los fagos
Su cuantificacioacuten se realizoacute de manera directa e inmediata ya que las calvas son visibles con
una iluminacioacuten de contraste (Breeuwer et al 2003) Posteriormente los fagos que si formaron
halos de inhibicioacuten fueron aislados de manera directa o siguiendo uno de los dos protocolos
(enriquecimiento y sin enriquecer) debido a que depende principalmente de la amplificacioacuten
del fago y las caracteriacutesticas de cada uno se describen a continuacioacuten
Municipio Sitio de la toma
Monterrey
Parque Fundidora
Riacuteo Santa Catarina
Establecimiento de comida
Av Conductores
Mariacuten Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal
Riacuteo La Libertad
Guadalupe Alcantarillas de la colonia La Azteca
Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados
San Nicolaacutes de los Garza Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac
Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea
Materiales y meacutetodos
55
B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos
Con el protocolo de enriquecimiento se proporcionoacute las condiciones oacuteptimas de desarrollo
al cultivo de la bacteria hueacutesped y la muestra al inocular el cultivo en la muestra y de esta
manera amplificar los posibles fagos que presentes en la muestra de agua
Se realizoacute este protocolo de la siguiente manera primero se seleccionoacute la cepa bacteriana
que seraacute el hueacutesped esto se consiguioacute haciendo un cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y
se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por otra parte se prepararon
aliacutecuotas (10 mL cada una) de cada una de las muestras recolectadas (enriquecidas con
cultivo bacteriano) y se centrifugan a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a
4degC despueacutes el sobrenadante se pasoacute por jeringa y con filtros de 022 microm (Millex-GP
polyethersulfone 33 mm radio-sterilized) Estas dos entidades biloacutegicas se unieron en un
matraz de capacidad de 50 mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon
Meacutexico) a doble concentracioacuten (20) En este matraz se agregaron 300 microL de la muestra
previamente filtrada con fagos y 500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incuboacute a 37degC por
24 h posteriormente por medio de la teacutecnica de ADC se pudo observar la formacioacuten de halos
de lisis de los fagos (Vidales-Contreras et al 2006)
B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos
El protocolo se emplea para adicionar directamente de la muestra una aliacutecuota y testarla
con la bacteria hueacutesped Se siguieron los pasos anteriormente descritos a este protocolo
primero se seleccionoacute la cepa bacteriana (hueacutesped) esto se realizoacute haciendo un cultivo fresco
(AST) (Bioxon Meacutexico) y se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por
otra parte se preparoacute aliacutecuotas (10 mL) de cada una de las muestras recolectadas y se
centrifugaron a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a 4degC despueacutes el
sobrenadante se pasoacute por jeringa con filtros de 022 microm (Millex-GP polyethersulfone 33 mm
radio-sterilized) Estas dos entidades bioloacutegicas se unieron en un matraz de capacidad de 50
mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon Meacutexico) a doble
concentracioacuten (20) A este matraz se agregaron 300 microL de la muestra filtrada con fagos y
500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incubaron a 37degC por 24h posteriormente por medio
de la teacutecnica de ADC se observaron la formacioacuten de halos de lisis de los fagos (Vidales-
Materiales y meacutetodos
56
Contreras et al 2006)
B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas
Despueacutes de que los cultivos bacterianos se reactivaron la preparacioacuten para trabajar con
ellos fue la siguiente se tomoacute una asada de una colonia bacteriana bien diferenciada y se
incuboacute en un tubo inclinado (punta de flauta) se dejoacute el cultivo toda la noche y posteriormente
se traspasoacute a un subcultivo en caldo con infusioacuten cerebro-corazoacuten (BHI Merck Alemania) e
incuboacute a 37degC durante 24 h posteriormente se subcultivoacute en BHI en las mismas condiciones
Una colonia aislada en tubo punta de flauta se inoculoacute en 9 mL de agua peptonada (3M
Meacutexico) y se incuboacute a 37degC durante 24 h luego se realizaron mezclas seriadas en diluyente
(1 gL triptona 85 gL NaCl pH 72) (Merck Alemania) y se implantaron en las superficies de
los discos de acero inoxidable tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm con
un volumen inferior a 50 microL Como control del inoacuteculo se prepararon 5 placas de TSA
En el caso del fago obtenido se amplificoacute realizando la infeccioacuten en repetidas ocasiones
hasta alcanzar una concentracioacuten de 1x107 UFPmL
B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos
Para la realizacioacuten de este estudio se utilizaron cepas bacterianas de Salmonella enterica
y E coli provenientes de diversas colecciones de los laboratorios involucrados tambieacuten se
utilizoacute un fago de prueba (PRD1) para ser utilizado como control positivo en los aislamientos
En la tabla 8 se muestran las bacterias y el fago indicando su denominacioacuten y origen asiacute como
las condiciones de conservacioacuten
Materiales y meacutetodos
57
Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten
Origen Cepa bacteriana fagos Clave Condiciones de conservacioacuten
FaSPyN
S Typhimurium ATCC 13311
Glicerol a -20degC S Paratyphi ATCC 9150
S Enteritidis ATCC 13076
FCB S Typhi ATCC 19430 BGA TSA 4degC
FAUANL
S Typhimurium TSA 4degC
Fago PRD1
Tampoacuten fosfato 4degC
E coli CECT 515
E coli K12
E coli ATCC 10536
E coli O157H7 CECT 4783
S bongori ATCC 43975
UAB
S enterica LT2
Vial liofilizado a -20degC
S enterica sub enterica CECT 4138
S enterica sub enterica CECT 4594
S enterica sub enterica CECT409
S enterica sub enterica CECT 698
S Typhimurium CCUG 29478
Para la reactivacioacuten de los cultivos que se almacenan a 4degC se dejaron a temperatura
ambiente igualmente para los congelados Posteriormente para sacarlos del estreacutes se
sembraron en medio de cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y se incubaron a 37degC por 24
horas tras estas condiciones ya se pudieron utilizar en los ensayos (McLaughlin et al 2006)
A continuacioacuten se describe la forma en que se reactivaron los cultivos en este estudio de
acuerdo a la forma en que estaban almacenados
a) Cultivos almacenados en glicerol
Se descongelaron los viales a temperatura ambiente
Materiales y meacutetodos
58
Se transfirieron 5 microL de cultivo en 20 mL de TSB (Becton Dickinson Co) y se incuboacute a
37degC toda la noche
Se sembroacute en tres campos en caja de Petri de 90 mm con TSA (Becton Dickinson Co)
Se incuboacute a 37degC por 24h
Se seleccionoacute una colonia aislada y bien diferenciada
El cultivo (colonia) se incuboacute en 20 mL de TSB a 37degC toda la noche
b) En caso de los cultivos liofilizados
En el vial se hidrataron los cultivos agregando 1 mL de TSB e incubando 1h a 37degC
Se vertioacute el cultivo en 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC toda la noche
Se realizoacute el mismo proceso anteriormente mencionado en a)
B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC)
La siembra o inoculacioacuten consistioacute en introducir artificialmente una porcioacuten de muestra
(inoacuteculo) en un medio adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano para su desarrollo
y multiplicacioacuten Una vez inoculado el medio se incuboacute a una temperatura adecuada para el
oacuteptimo crecimiento en promedio 37degC Los meacutetodos de conteo en placa como capa doble y
capa simple de agar se basan en la determinacioacuten de la concentracioacuten viral mediante el
conteo de UFP las cuales son zonas de aclaramiento circular o halo de inhibicioacuten de
crecimiento bacteriano que se producen en la capa o ceacutesped bacteriano debido a la lisis
producida por los fagos Inicialmente una partiacutecula de fago infecta a su bacteria hueacutesped se
replica y posteriormente se disemina generando una zona circular sin crecimiento de la
bacteria (Solano et al 2012) Por esta razoacuten en nuestro estudio se utilizoacute esta manera de
trabajar considerando las diferentes formas que se puede presentar los halos de inhibicioacuten
(forma tamantildeo densidad)
La teacutecnica se basoacute en mezclar el cultivo bacteriano en fase logariacutetmica y el fago en agar
suave (AS) tambieacuten llamado top agar cuando se aplica a la placa de Petri donde se realizoacute
el proceso de infeccioacuten El AS se preparoacute con TSB y agar bacterioloacutegico (15) para obtener
una consistencia semisoacutelida que permita el desarrollo de las calvas en el ceacutesped bacteriano
Se mantuvo a una temperatura adecuada para conservar el estado liacutequido y se agitoacute
cuidadosamente para dejar interactuar los cultivos fago-hueacutesped en el tubo de ensayo
Materiales y meacutetodos
59
posteriormente se dispersoacute de manera uniforme en placas de Petri de 90 mm de diaacutemetro con
15 mL de TSA La suspensioacuten (ceacutesped bacteriano en ADC) se dejoacute solidificar a temperatura
ambiente unos minutos y posteriormente se incuboacute 24h37degC (Vidales-Contreras et al 2006)
B6 Modelo de infeccioacuten
Las enzimas endolisinas de los fagos provocan la lisis debilitamiento y rompimiento de la
pared celular de las bacterias La lisis depende de la proporcioacuten de fagos y hueacutesped o
multiplicidad de infeccioacuten (Multiplicity of infection MOI) Cuando hay una MOI baja la relacioacuten
de fagos a bacterias no es superior a 21 Cuando la MOI es alta es decir muchos fagos frente
a pocas bacterias las ceacutelulas se lisan directamente (Dimmock et al 2007)
En ese sentido la Norma ISO 10705-11995 indica que durante el ensayo el fago en fase
de multiplicacioacuten experimenta varios ciclos de replicacioacuten lo que resulta en la muerte de la
ceacutelula hueacutesped que ha actuado como faacutebrica para la produccioacuten viral El modelo que se siguioacute
es para observar los halos de inhibicioacuten y contrastar los resultados En la figura 6 se presenta
el modelo de infeccioacuten utilizado con S Typhimurium y el fago PRD1 siguiendo el modelo de
Vidales-Contreras et al (2006) y la puesta a punto propuetas por Sambrook y Russell (2001)
Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten fago-hueacutesped
Materiales y meacutetodos
60
B7 Controles utilizados durante los ensayos
Se utilizoacute la cepa de S Typhimurium y el fago PRD1 como control positivo para observar
la formacioacuten de las calvas para el control negativo se utilizoacute agua esterilizada con esto se
asegurar que si existe infeccioacuten y evitar los falsos positivos que ocurren primordialmente por
contaminacioacuten
Para control negativo el ceacutesped bacteriano se obtuvo de la siguiente manera en un
tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de cultivo de S
Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de agua destilada esteacuteril la mezcla se vertioacute
en placa Petri con TSA
Como control positivo el ceacutesped bacteriano y las placas de lisis se obtuvieron como
sigue en un tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de
cultivo de S Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de fagos PRD1 la mezcla se
vertioacute en placa Petri con TSA
B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium
Para realizar los ensayos microbioloacutegicos se requirioacute trabajar con la misma cantidad de
biomasa en una fase de crecimiento similar El conteo en placa es un meacutetodo de medicioacuten de
biomasa que permite el recuento de ceacutelulas viables y consiste en determinar el nuacutemero de
ceacutelulas capaces de reproducirse y generar colonias sobre un medio soacutelido (cada ceacutelula viable
da origen a una colonia) Para este estudio y ver el efecto de los fagos sobre las bacterias
primeramente se calculoacute la curva de crecimiento celular pues es imprescindible para realizar
la infeccioacuten que la bacteria hueacutesped y se encuentre en fase logariacutetmica Es decir para
determinar la biomasa bacteriana se mide la cineacutetica de crecimiento celular y se considera
que se ha alcanzado la fase de crecimiento exponencial cuando la concentracioacuten es de 10⁸
UFCmL (McLaughlin et al 2006)
Para el conteo bacteriano se utilizoacute el meacutetodo de filtracioacuten por membrana
Se transfirioacute 1 mL del cultivo bacteriano fresco a 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC
Cada 30 minutos se recolectaron 300 microL de cultivo
A cada aliacutecuota recogida se le realizaron diluciones seriadas con 27 mL de agua
Materiales y meacutetodos
61
destilada esteacuteril hasta obtener un factor de 1010
De cada una de estas diluciones se obtuvieron 100 microL que se filtraron por membrana
de celulosa 045 microm (Millipore Corporation Billerica Ma 47 mm esteacuteril Cat No
JMX000089 Millipore) montada en un embudo de filtracioacuten magneacutetico de 47 mm (Pall
GELMAN Laboratory con capacidad de 300 mL) y con bomba de vaciacuteo (GM motors amp
industrial systems Modelo 5kh36kna510x)
Las membranas se colocaron en caja de Petri con TSA y se incubaron 24h a 37degC
C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos
Con excepcioacuten de la microscopiacutea electroacutenica los meacutetodos empleados para determinar el
tamantildeo forma y composicioacuten quiacutemica de los fago requieren una alta pureza de las partiacuteculas
virales El material de partida en cualquier estudio de este tipo para la obtencioacuten del fago es
cuando se presenten los halos de inhibicioacuten en el ADC en general ademaacutes de los fagos
estas zonas claras pueden contener los restos celulares de las bacterias como trozos de
pared membranas ribosomas ADN ARN proteiacutenas y otros componentes de peso molecular
maacutes bajo El contenido de fago en un lisado es del orden de 001 mg mL por lo que para
obtener la cantidad apropiada para su caracterizacioacuten es necesario partir de varios litros
(Leverentz et al 2003 Maestro y Sanz 2016)
Para llevar a cabo la purificacioacuten de los fagos se debe de realizar con concentraciones
superiores a 1010 UFPmL Uno de los meacutetodos maacutes utilizados es la centrifugacioacuten a alta
velocidad y posterior resuspensioacuten de las partiacuteculas sedimentadas en un volumen menor
Cuando es posible esta teacutecnica se reemplaza por un sistema de dos fases basado en la
propiedad que tienen algunos poliacutemeros de alto peso molecular como el polietilenglicol el
dextrasulfato de sodio y el dextrano al separarse estas fases por diferencia de pesos
moleculares los fagos se dispersan en este tipo de medios considerando las concentraciones
empleadas y las condiciones oacuteptimas de pH fuerza ioacutenica y temperatura y al pasar por el
proceso de centrifugacioacuten se concentran en una columna Una vez concentrado el fago en la
columna se puede recuperar faacutecilmente de la interfase Los procesos maacutes comuacutenmente
utilizados para la purificacioacuten posterior se basan en separar las partiacuteculas de fago ya sea por
su tamantildeo o densidad (Sambrook y Russell 2001 Vidales-Contreras et al 2006)
En la figura 7 se presenta el procedimiento para la amplificacioacuten de fagos que nos asegura
Materiales y meacutetodos
62
cultivos puros uniformes y con tiacutetulos altos lo cual es imprescindible para conseguir una
buena imagen en el microscopio electroacutenico
Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten de bacteriofagos aplicando la teacutecnica
de agar doble capa (ADC)
El meacutetodo utilizado para purificar los fagos que despueacutes de utilizaron para analizar su
morfologiacutea implicoacute el uso del kit Montage SEQ96 (Millipore Sequencing Reaction Cleanup Kit
Millipore Corporation EE UU)
En una placa de filtracioacuten (96 well SEQ plate by Millipore) se depositaron en cada
pocillo 15 microL de concentrado de fagos maacutes 5 microL de agua milli-Q (Injection Solution by
Millipore)
Materiales y meacutetodos
63
La separacioacuten se realizoacute por la exclusioacuten de lavados de la columna de gel aplicando
vaciacuteo por medio de una bomba (Millipore EE UU Vacuumpressure 220 V50 Hz 15 mm
Hg)
Posteriormente se resuspendioacute la muestra (Thermomixer comfort by Eppendorf) con
agitacioacuten durante 1 min a 500 rpm
Finalmente se agregoacute 10 microL de agua ultra pura Milli-Q para concentrar la muestra
(Injection Solution by Millipore)
Una de las modificaciones que se realizaron para obtener los fagos con elevada pureza y
concentracioacuten para ser utilizada en la microscopiacutea electroacutenica se realizoacute con el kit Montage
SEQ96 que se utiliza para la purificacioacuten de DNA y en este caso se utilizoacute para concentrar los
fagos (concentracioacuten 1012 UFPmL) El procedimiento se describe a continuacioacuten
Se antildeadieron 20 microL de buffer de inyeccioacuten a la placa donde se teniacutea la suspensioacuten de
fagos se resuspendioacute y transfirioacute todo el volumen a la placa azul de Millipore (kit Montage)
Se colocoacute la placa en la bomba del kit Montage de 2 a 3 min hasta que quedoacute seca
Es aconsejable no dejar maacutes tiempo del necesario para evitar un secado excesivo
Se limpioacute todo el exceso de liacutequido en la placa con papel filtro secando un par de
veces la placa sobre el papel Inmediatamente despueacutes se colocoacute la placa sobre el soporte
de la bomba evitando dejarla sobre el papel
Se antildeadieron 30 microL de buffer de inyeccioacuten
Se colocoacute la placa en la bomba unos 4-5 min hasta secarse
Con papel filtro se limpioacute todo el exceso de liacutequido que quedoacute en la placa y se colocoacute
en el soporte de la bomba
Se antildeadieron 30 microL maacutes de buffer de inyeccioacuten para resuspender
Se colocoacute la placa en agitacioacuten se centrifugoacute a 500 g por 10 min
Se traspasaron los 30 microL a un nuevo pocillo y se recolectoacute el sobrenadante
D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica
Con la concentracioacuten de fagos purificados se preparoacute la muestra para la observacioacuten al
microscopio electroacutenico y se procedioacute utilizando la teacutecnica de tincioacuten negativa tal como se
explica a continuacioacuten
Se depositaron 2 microL de suspensioacuten de fagos en un disco de capa fina de carbono y cobre
Materiales y meacutetodos
64
(200 Mesh Holes 100 microm square Ethene old 200 RU) despueacutes de 2 min de reposo a
temperatura ambiente se eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente Se antildeadieron 2
microL de agente de contraste solucioacuten tampoacuten 1 de acetato de uranilo (UO2middot (CH3COO)2middot2H2O)
(Merck Alemania) Se dejoacute actuar el colorante durante 2 min a temperatura ambiente y se
eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente y despueacutes se dejoacute el disco alrededor de 5
min a temperatura ambiente antes de observar en el microscopio
D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa
(DEM)
La microscopiacutea oacuteptica es el meacutetodo adecuado para la investigacioacuten de procesos celulares
ya que es menos agresivo para el manejo de la muestra Existen teacutecnicas de microscopiacutea con
otras especificaciones donde se aplican para estudiar la adhesioacuten celular y formacioacuten de
biofilms en superficies tales como el espectrofotoacutemetro infrarrojo transformada de Fourier el
laacuteser confocal de barrido y la microscopiacutea de fuerza atoacutemica estos microscopios se
caracterizada por detectar las ceacutelulas viables de las dantildeadas por medio de cromoacuteforos
(Montantildeez et al 2012) La microscopiacutea que estamos trabajando esta basada en fluorescencia
la cual utiliza cromoacuteforos para detectar DNA de ceacutelulas vivas (coloracioacuten verde) y ceacutelulas
muertas (coloracioacuten roja) y ha tenido grandes avances en la observacioacuten de tejidos ceacutelulas
moleacuteculas individuales y por consiguiente algunos restos celulares todos estos con una
excelente resolucioacuten (Pellegrotti et al 2014)
Para la observacioacuten de ceacutelulas mediante el DEM se utilizoacute el kit comercial de viabilidad Bac
Light (LIVEDEAD Bacterial Viability Kit L-13152 Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE
UU) que estaacute compuesto por dos colorantes fluorescentes de aacutecidos nucleicos (SYTOreg9 y
PISYTOreg9) que penetran tanto en las membranas intactas como en las lesionadas lo que
permite evaluar la vitalidad de las ceacutelulas bacterianas basaacutendose en la deteccioacuten de la
actividad de las oxidasas y reductasas bacterianas Se observa una sentildeal fluorescente
mejorada en ceacutelulas bacterianas con procesos metaboacutelicos activos En contraste PISYTOreg9
se manifiesta soacutelo en las ceacutelulas que presentan membranas lesionadas y desplaza el colorante
SYTOreg9 por la transferencia de energiacutea de la resonancia fluorescente Cuando se aplican
estos dos colorantes en proporcioacuten adecuada las ceacutelulas viables con membranas intactas
presentaraacuten fluorescencia verde y en contraste las ceacutelulas muertas o lesionadas tendraacuten
Materiales y meacutetodos
65
coloracioacuten roja (Berney et al 2007)
A continuacioacuten se describe la preparacioacuten de las muestras para ser observadas por el DEM
Se colocaron 2 microL de la concentracioacuten suspensioacuten de la muestra con fagos en una
concentracioacuten de 1x1012 UFCmL sobre un disco de acero inoxidable (tipo 14301 (2 cm de
diaacutemetro y 1 mm de grosor) ligeramente convexos con una altura maacutexima en el centro
de 1 mm
Se dejoacute secar a temperatura ambiente por espacio de 10 min
Posteriormente se aplicaron 2 microL de la solucioacuten vital de fluorescencia (LIVEDEAD Bac
Light Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE UU) que reacciona y da la coloracioacuten
al material geneacutetico de las bacterias
Para la observacioacuten de los discos se utilizoacute el microscopio de fluorescencia Olympus
BX51BX52 (Tokio Japoacuten) con caacutemara digital incorporada (DP 50 Olympus) equipado con
laacutempara de mercurio de 100 W (USH-103 OL Olympus) con filtro de doble paso (U-M51004
FR V2 Olympus)
Para enumerar las ceacutelulas bacterianas en el biofilm que se formo en los discos de
acero inoxidable se trabajoacute con un objetivo de 20X y se ubicaban 10 campos
aleatoriamente y los resultados se expresaron por cm2 Las imaacutegenes se revisaron con el
sistema de anaacutelisis de imagen (anaacutelisis 32 soft Imaging System GMBH Alemania)
El biofilm bacteriano se desarrolloacute en la superficie de discos de acero inoxidable tipo
14301 Antes de usarse deben limpiarse bien por inmersioacuten en una solucioacuten acuosa de
detergente (DINO-dis-Dipol Espantildea) al 5 en agua durante 1 h despueacutes se realizoacute la
inmersioacuten en bantildeo con alcohol isopropiacutelico (2-propanol) (Merck Alemania) al 70 en agua
durante 15 min Una vez secos se esterilizaron en autoclave a 121degC por 15 min
D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM
Se inocularon la superficie de los discos con 50 microL de cultivo de S enterica maacutes medio de
cultivo (TSB) para proporcionar en medio rico para que se forme el biofilm posteriormente se
colocaron en cajas de Petri esteacuteriles y se mantuvieron en condiciones de humedad a
temperatura ambiente durante periacuteodos de 24 48 y 72h realizaacutendoles el conteo
correspondiente para verificar el desarrollo del biofilm
Materiales y meacutetodos
66
Una vez formado el biofilm se inocularon los discos con 3 concentraciones diferentes de
fagos 6 7 y 8 logcm2 en un volumen inferior a 50 microL Las diluciones del fago se hicieron en
solucioacuten salina fisioloacutegica (SSF cloruro de sodio 080) (Merck Alemania) Se realizoacute la
infeccioacuten al inocular a los discos prueba y los discos de control con el mismo volumen de SSF
las condiciones de incubacioacuten se realizaron con humedad y a temperatura ambiente
Los discos de acero inoxidable que fueron inoculados con la infeccioacuten fago-bacteria se
analizaron en periacuteodos de 0 2 8 24 y 48 h Se utilizaron para la valoracioacuten de bacterias y
fagos y se distribuyeron los discos de la siguiente manera 2 para visualizacioacuten microscoacutepica
panoraacutemica 2 para recuento bacteriano por microscopiacutea y 2 para recuento bacteriano dando
un total de 6 discos por caja de Petri por duplicado y por cada concentracioacuten (3) por cada
ensayo (3) y por horarios (5) de dando un total de 540 discos
Para el conteo sobre cada disco se colocaron 20 microL del colorante (LIVEDEAD Pribes) y
se incubaron por 5 min a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad y se tomaron
fotografiacuteas a 10X 20X y 40X Para la microscopiacutea de conteo las fotografiacuteas se realizaron a
un aumento de 40X considerando 10 campos aleatorios
Cuando se formoacute el biofilm se requirioacute hacer los recuentos de bacterias y de fagos en ese
sentido para recuperar las bacterias los discos se colocaron en un frasco con 5 mL de TSB
con Tween 80 (TSBTW) (Merck Alemania) y 3 g de perlas de vidrio se homogeneizoacute la
muestra por 1 min en agitador voacutertex a maacutexima potencia para favorecer el desprendimiento
de los microorganismos y posteriormente se realizaron diluciones seriadas De este mismo
extracto se obtuvo el material necesario para hacer el conteo de fagos utilizando la teacutecnica de
ADC Y para el recuento de las bacterias viables se trabajoacute con cajas de Petri se sembroacute 1
mL en TSA con 06 de extracto de levadura (TSAYE Merck Alemania) y se incuboacute a 37degC
durante 24h (Fuster-Valls et al 2008)
67
V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Resultados y discusioacuten
68
Resultados y discusioacuten
69
A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras
De los 10 sitios de recoleccioacuten se lograron obtener un total de 39 muestras en junio de
2007 En la tabla 9 se presentan los sitios y el nuacutemero de muestras recogidas en cada sitio
En el caso del Riacuteo Santa Catarina se abarcoacute una distancia de 95 km la cual presentaba
diferentes zonas de descarga de aguas residuales y de ahiacute se hicieron las tomas en un periacuteodo
de estiaje En el caso de las lagunas de oxidacioacuten del municipio de Mariacuten esta zona presenta
tres lagunas con un aacuterea total de 16700 m2 se realizoacute el muestreo de manera aleatoria En
cuanto a las muestras que se obtuvieron en el sitio de comercializar carne de pollo se les tratoacute
de igual manera para comprobar si existiacutean fagos
Los lugares elegidos para la recoleccioacuten de muestras son similares a los reportados en la
literatura regularmente para el aislamiento de fagos del ambiente se utilizan aguas residuales
y establecimientos de manipulacioacuten yo venta de alimentos (Leeuw et al 2017) En
investigaciones previas se realizan muestreos de diversos sitios como en la piel y heces de
animales manos de los cuidadores superficies quiruacutergicas e instrumentos o utensilios usados
en los establecimientos hoteles y restaurantes (Ejo et al 2016 Yergeau et al 2016) Los
muestreos de aguas tambieacuten se pueden realizar en sitios cercanos a las salidas de drenaje
de hospitales esto es de gran importancia ya que donde hay bacterias posiblemente esteacuten
sus respectivos fagos (Tomat et al 2014 Mattila et al 2015 McShan y Nguyen 2016)
Resultados y discusioacuten
70
Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos
B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis
Para el aislamiento de los fagos especiacuteficos de Salmonella fue necesario la puesta a punto
de varios procedimientos la teacutecnica de agar doble capa (ADC) determinar la cineacutetica de
crecimiento de cultivos de Salmonella determinar la fase de eclipse en la relacioacuten fago-
bacteria (se utilizoacute como control la cepa S Typhimurium y el fago PRD1) y su puesta a punto
en el laboratorio de bioremediacioacuten de la Facultad de Agronomiacutea de la UANL
B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S
Typhimurium
La accioacuten liacutetica de los fagos sobre Salmonella se analizoacute utilizando la teacutecnica ADC
En este procedimiento es necesario tener un ceacutesped bacteriano uniforme entre dos capas
de medio soacutelido que puede ser agar-agar o agar-agarosa (Sambrook y Rusell 2001)
Con el objetivo de abaratar los costes y mejorar los resultados en este trabajo se empleoacute
esta teacutecnica con algunas modificaciones que se describen a continuacioacuten Asiacute pues se decidioacute
que las capas fueran agar-agar donde la primera capa fue de agar al 15 en medio TS y la
Municipio Sitio de la toma N de muestras
Tipo de agua
Monterrey
Parque Fundidora 3 Estanque y corriente
Riacuteo Santa Catarina 10 Corriente
Establecimiento de comida 2 Lavado del pollo
Av Conductores 2 Corriente
Mariacuten
Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal
10 Estanque y corriente
Riacuteo La Libertad 2 Corriente
Guadalupe
Alcantarillas de la colonia La Azteca
3 Corriente
Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados
2 Lavado del pollo
San Nicolaacutes de los Garza
Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac
2 Corriente
Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea 3 Corriente
Resultados y discusioacuten
71
segunda con agar a una menor concentracioacuten para hacer la capa menos firme por lo que fue
necesario poner a punto la teacutecnica probando diferentes concentraciones de agar en ambos
casos a pH 72 Ademaacutes esta adecuacioacuten es importante por el ahorro que se generoacute al utilizar
un componente maacutes econoacutemico que la agarosa lo cual repercutioacute favorablemente en el coste
de la prueba
Otra variable para poner a punto en la teacutecnica de ADC es el volumen de cultivo bacteriano
a utilizar para generar el ceacutesped de Salmonella y lograr una adecuada interaccioacuten con el fago
Se probaron 3 voluacutemenes diferentes de cultivo de S Typhimurium incubados 24 horas a 37oC
para alcanzar una concentracioacuten de 16 x 108 UFCmL Dependiendo de la cantidad de inoacuteculo
las caracteriacutesticas del ceacutesped bacteriano tienen diferente contraste lo cual puede facilitar o
dificultar la observacioacuten de las placas liacuteticas Finalmente el mejor resultado se obtuvo al
utilizar el volumen de 500 L ya que se logroacute una mejor observacioacuten del aclaramiento del
ceacutesped bacteriano al formar las placas liacuteticas En la tabla 10 se muestran las caracteriacutesticas
de las capas en la caja Petri para un buen manejo y desarrollo de la zona liacutetica producida por
el fago al multiplicarse
Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC
Paraacutemetro Condiciones
Agar suave (con agar) () 08
Temperatura del agar suave (degC) 49
pH del medio de cultivo (soacutelido y liacutequido) 72
Cantidad de agar suave (mL) 45
Cultivo bacteriano (microL) 500
Muestra tratada con fagos (microL) 100
Resultados y discusioacuten
72
B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium
El cultivo hueacutesped debe de encontrarse creciendo en medio liacutequido TS en fase logariacutetmica
al momento de mezclarlo con el fago Para identificar la fase logariacutetmica se probaron
diferentes tiempos de crecimiento Con todo ello se observa que la fase logariacutetmica de S
Typhimurium se encuentra en el minuto 150 coincidiendo con los datos reportados por
Vidales-Contreras et al (2006) Y siguiendo con mi tesis la determinacioacuten de la concentracioacuten
se realizoacute mediante el promedio de la enumeracioacuten de las UFC por placas Petri preparadas
por duplicado multiplicado por el factor de dilucioacuten el cual es el reciacuteproco del producto del
volumen ensayado y la dilucioacuten usada para el anaacutelisis Al final se observa cuando se ha
llegado a la fase estacionaria del desarrollo bacteriano (tabla 11) Se utiliza un factor de
dilucioacuten el cual se obtiene como el reciacuteproco de la multiplicacioacuten de volumen de ensayo y la
dilucioacuten usada en el anaacutelisis
Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium
Tiempo Minutos
(Acumulado) Dilucioacuten
UFCmL Promedio
F (Factor) Concentracioacuten
(UFCmL)
T0 0 1 x 10-5 9 plusmn 25 1 x 106 900 x 106
T1 30 1 x 10-5 13 plusmn 74 1 x 106 130 x 107
T2 60 1 x 10-5 24 plusmn 56 1 x 106 240 x 107
T3 90 1 x 10-5 51 plusmn 32 1 x 106 510 x 107
T4 123 1 x 10-5 211 plusmn 89 1 x 106 211 x 108
T5 150 1 x 10-6 215 plusmn 81 1 x 107 215 x 109
Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)
B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis
Las consideraciones tomadas del modelo infectivo S Typhimurium y el fago PRD1 y
utilizando la teacutecnica ADC se replican para poner a punto a la bacteria que se quiere probar
que en este caso es S Typhi ATCC 19430 Los resultados de estos ensayos se pueden
observar en la tabla 12 en la que se puede observar que es ligeramente mayor la etapa donde
Resultados y discusioacuten
73
se puede realizar la infeccioacuten (fase de eclipse) de los fagos aislados y la bacteria hueacutesped
Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis (108 UFCmL) (37 ordmC24h)
Tiempo Minutos (Acumulado)
Dilucioacuten UFCmL Promedio
F (Factor) Concentracioacuten (UFCmL)
T0 0 1 x 10-5 216 710 1 x 106 20 x 107
T1 60 1 x 10-5 260 608 1 x 106 20 x 107
T2 120 1 x 10-6 160 173 1 x 107 16 x 108
T3 180 1 x 10-6 244 208 1 x 107 24 x 108
T4 240 1 x 10-7 400 100 1 x 107 40 x 109
Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)
B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis
De los sitios muestreados se logro obtener 39 muestras y se obtuvo un total de 15 fagos
aislados a partir de dos fuentes de aguas residuales las del Riacuteo Santa Catarina y las lagunas
de oxidacioacuten de Mariacuten Los 15 fagos se nombraron consecutivamente como MRH 1-15 Los
15 fagos se probaron contra la cepa hueacutesped S Enteritidis (CINSP tabla 4) tras realizar de
3 a 4 amplificaciones la mayoriacutea (14 fagos) no presentoacute actividad liacutetica (formacioacuten de halos
de inhibicioacuten) de manera que fueron descartados para los siguientes estudios siendo
solamente uno proveniente de la muestra del Rio Santa Catarina el que produjo halos bien
definidos en el ceacutesped bacteriano y con eacuteste se continuoacute trabajando El fago que mantuvo la
actividad liacutetica fue el MRH6 Se propuso nombrarle como MRH considerando la M para
muestra la RH por el Rodrigo Hernaacutendez
B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten
La principal caracteriacutestica de los fagos es cuando forman halos de inhibicioacuten (tambieacuten
llamadas zonas liacuteticas o calvas) y en nuestro estudio las muestras de agua recolectadas
fueron tratadas y analizadas mediante la teacutecnica ADC observando los halos de inhibicioacuten
claros y de diferentes diaacutemetros estas observaciones son similares a las observadas por
Ackermann (2003) Tanto la cantidad de UFP que se pueden desarrollar y observar hecha por
Resultados y discusioacuten
74
los fagos y la pureza en que encuentren los bacterioacutefagos de las muestras obtenidas del medio
ambiente estaacuten directamente relacionadas la especificidad contra la bacteria Al sembrar por
vaciado en placa estos lisados sobre la cepa indicadora se obtuvieron diferentes tamantildeos de
placas liacuteticas
En la figura 8 se muestran los halos de inhibicioacuten en ceacutesped de Salmonella al realizar la
infeccioacuten se pueden observar los diferentes tamantildeos y la forma se da por la capacidad de
raacutefaga (nuacutemero de copias al realizar el proceso liacutetico) de los fagos de la progenie los fagos
suelen tener una raacutefaga de maacutes de 100 partiacuteculas infectivas producidas en un lapso de tiempo
de 05 ndash 20 h Algunos halos formados por el fago fueron claros lo que indica que es liacutetico de
acuerdo con diversos autores (Sambrook y Rusell 2001 Vidales-Contreras et al 2006 Wong
et al 2014) En nuestro estudio se batalloacute en encontrar fagos a pesar de buscar sitios
sentildealados por autores antes mencionados
Al intentar obtener fagos puede suceder que se encuentren en concentraciones tan
pequentildeas que al probarlos contra alguna cepa hueacutesped no sirven para trabajar por lo que se
llevoacute a cabo repeticiones seriadas (amplificacioacuten) asegurando que al formar una placa de Petri
en ADC con tamantildeos de los halos de inhibicioacuten iguales lo que nos indica que pertenecen a
una sola especie de fago
Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por fagos con halos de inihibicioacuten de
diferentes tamantildeos
Resultados y discusioacuten
75
C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli
La clasificacioacuten de los fagos se puede establer en base a su morfologiacutea al aacutecido nucleico
al espectro de accioacuten y algunas consideraciones inmunoloacutegicas (Criscuolo et al 2017) Al
realizar la infeccioacuten de fago-bacteria y observar la presencia de halos liacuteticos en las placas de
ceacutesped bacteriano se considera que se ha producido una infeccioacuten exitosa pero previamente
es necesario poner a punto el cultivo puro de ambos cultivos y considerar la concentracioacuten de
cultivos a utilizar
Al seleccionar los fagos que presentaron uniformidad en cuanto a la inhibicioacuten y posterior
evaluacioacuten de los fagos se consideraron varios factores entre ellos el tiempo que tarda la
replicacioacuten viral (lo cual es variable) siendo que en algunos casos se pueden replicar en
cuestioacuten de minutos A simple vista se pueden observar la formacioacuten de halos de lisis en el
ceacutesped bacteriano en las cajas de Petri
Asiacute pues la teacutecnica ADC se repitioacute varias veces hasta obtener placas liacuteticas con ideacutentica
morfologiacutea y tamantildeo En la tabla 13 se observa que hay diferentes tamantildeos de halos En los
primeros ensayos soacutelo cuatro muestras de agua (15 21 26 y 33) dieron halos de inhibicioacuten
pudieacutendose distinguir bien la forma y el tamantildeo Al realizar posteriores siembras los fagos
fueron perdiendo capacidad de infeccioacuten (fagos atemperados) y soacutelo la muestra 21 de las
lagunas de oxidacioacuten provenientes de Mariacuten presentoacute fagos con actividad liacutetica y el resto de
fagos no desarrolloacute actividad constante
Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten de S Enteritidis en ceacutesped
bacteriano
Diaacutemetro de halo grande ge 8mm mediano 8 lt X lt6mm pequentildeo le 5mm
Distribucioacuten de tamantildeos de halo
Muestra de agua Grande Mediano Pequentildeo
15 8 23 15
21 17 11 27
26 10 18 6
33 7 9 13
Diaacutemetro medio halo (mm) 1055 0671 0376
Resultados y discusioacuten
76
En la tabla 14 se presenta el listado de posibles hueacutespedes probados 12 cepas de
Salmonella y 4 de E coli que se probaron contra los 15 fagos aislados previamente Se puede
distinguir que afecta a algunas serovariedades de Salmonella y no tiene efecto en otras
serovariedades entericas No afecta nada a las cepas de E coli Se ve que la cepa maacutes
afectada por el fago es la S Typhi ATCC 19430 y otras cepas de Salmonella son afectadas
ligeramente
Resultados y discusioacuten
77
Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades de Salmonella spp y de E coli
serovariedades Fagos
M
R
H
1
M
R
H
2
M
R
H
3
M
R
H
4
M
R
H
5
M
R
H
6
M
R
H
7
M
R
H
8
M
R
H
9
M
R
H
1
0
M
R
H
1
1
M
R
H
1
2
M
R
H
1
3
M
R
H
1
4
MR
H15
S Typhimurium ATCC 13311
-
-
t
- -
t
- - - - - - - - -
S Paratyphi ATCC 9150 - - - - - - - - - - - - - - -
S Enteritidis ATCC 13076 - - - - - - - - - - - - - - -
S Typhi ATCC 19430 + + + + + t
c
+ + + n
d
n
d
n
d
n
d
nd +
S Typhimurium - - - - - - - - - - - - - - -
S Bongori ATCC 43975 - - - - - - - - - - - - - - -
S enterica LT2 - - - + + + - - - - - - - -
S sub enterica CECT 4138 - - - - + + + - - - - - - - -
S sub enterica CECT 4594
t
t
t
- + + + - - -
t
- - - -
S sub enterica CECT 409 - - - - n
d
- -
t
- - - - - - -
S sub enterica CECT 698 - - - - - t
c
- - - - - - - - -
S Typhimurium CCUG
29478
- - - + + - - - - - - - -
E coli CECT 515 - - - - - - - - - - - - - - -
E coli K12 - - - - - - - - - - - - - - -
E coli ATCC 10536 - - - - - - - - - - - - - -
E coli O157H7 CECT 4783 - - - - - - - - - - - - - - -
+ crecimiento y desarrollo de halo indica desarrollo muy pequentildeo o difuso del halo t indica desarrollo pequentildeo y turbio del halo tc indica turbio o con centro opaco en el centro del halo - no crecimiento o desarrollo de halo nd aparente baja efectividad o halo difuso
Resultados y discusioacuten
78
Resultados y discusioacuten
79
El fago que siacute mostroacute actividad (MRH6) y que mantuvo la capacidad liacutetica durante las
diferentes amplificaciones se trabajoacute de manera continua hasta obtener halos uniformes en el
tamantildeo y asiacute ya se considera como una entidad pura de fago Los resultados obtenidos en
este trabajo son semejantes a los mostrados por Thung et al (2017) En la figura 9 se
presentan las imaacutegenes donde se muestra el desarrollo de halos liacuteticos previamente
mencionados donde se puede observar los halos uniformes contra A) S Enteritidis (CINSP)
y B) S Typhi ATCC 19430 (UAB)
Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria A) S Enteritidis (CINSP) y B) S Typhi ATCC 19430
La especificidad de los fagos se encuentra generalmente a nivel de cepa y tambieacuten de
especie y maacutes raramente a nivel de geacutenero Es de intereacutes el garantizar una eficiente infeccioacuten
de la dupla fago-bacteria de esta manera se toman todas las medidas precautorias para
obtener resultados fiables en este sentido se requiere verificar todos los aspectos como son
los controles (positivo y negativo) En el caso del control negativo se verificoacute el desarrollo
solamente del ceacutesped bacteriano de la cepa hueacutesped con la teacutecnica ADC y como control
positivo se consideroacute el modelo del fago PRD 1 y S Typhimurium los fagos son altamente
especiacuteficos (no afecta a otros cultivos bacterianos) y no se puede descartar falsos positivos
por la presencia de restos celulares bacterianos (Segundo et al 2010 Szafranski et al 2017)
Resultados y discusioacuten
80
D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM
El ICTV clasifica a los fagos en 1 orden13 familias y 31 geacuteneros De los cuales se
observa al orden de los Caudovirales el cual comprende a la mayor parte de los fagos (en
torno a un 95)y estos estaacuten constituidos por 3 familias con cola Myoviridae Podoviridae
y Siphoviridae Con estas caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas mediante el TEM en la
figura 10 se presentan las imaacutegenes del fago MRH6
El anaacutelisis de una suspensioacuten de fagos con una concentracioacuten de 1x1012 UFPmL mediante
microscopiacutea electroacutenica muestra una distintiva morfologiacutea de cabeza icosaeacutedrica estructura
alargada y cola no contraacutectil La caacutepside tiene un diaacutemetro de 55-60 nm y la cola puede
alcanzar los 570 nm Estas caracteriacutesticas se corresponden con la familia Siphoviridae Yang
et al (2017) comentan que esta familia de fagos se encuentra frecuentemente en
enterobacterias
Figura 10 Imagen por TEM del fago MRH6 (X100 000) la barra representa 100nm (Servicio de Microscopiacutea UAB)
Resultados y discusioacuten
81
D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero
inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de
epifluorescencia directa (DEM)
Para corroborar la potencial condicioacuten como agente de desinfeccioacuten del fago MRH6 es
necesario observar su efectividad a traveacutes de la DEM con la que se pueden observar
bacterias viables y no viables Tambieacuten la materia orgaacutenica puede dar falsos positivos y se
debe tener en cuenta al comparar con otros meacutetodos de conteo (Montantildeez et al 2012)
En este trabajo S Typhi ATCC 19430 desarrolloacute biofilms en las superficies de acero
inoxidable (discos tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm) y consiguieron
niveles de 29 plusmn 02 UFCcm2 despueacutes de tener un maacuteximo de 72 h en incubacioacuten en
condiciones de humedad y temperatura ambiente tal como se puede observar en la figura 11
Estos biofilms tienen distinta intensidad seguacuten el tiempo de incubacioacuten siendo los periodos
evaluados de 24 48 y 72h respectivamente En estas condiciones se realizoacute el recuento en
tres zonas de cada disco para cada tiempo de incubacioacuten y los resultados se presentan en la
figura 12 Para tener fiabilidad de los resultados se realizaron los conteos por triplicado porque
el manejo de los discos es muy complejo y para evitar errores de manejo se consideroacute
necesario tener maacutes de una muestra otorgando ademaacutes la oportunidad de comparar
resultados y tener un margen de referencia en cuanto a los resultados obtenidos
Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 en
diferentes tiempos de incubacioacuten (24 48 y 72h) a temperatura ambiente
Resultados y discusioacuten
82
Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable incubados a temperatura ambiente n = 3
En este estudio se compararon 2 meacutetodos de conteo de bacterias despueacutes de ser atacadas
por los fagos eacutestos fueron el recuento en placa de agar y por otro lado la observacioacuten por
microscopiacutea de epifluorescencia y la relacioacuten entre ambos meacutetodos Desafortunadamente se
han perdido los resultados por un problema irresoluble pero si se puede comentar que existe
una relacioacuten ligeramente inferior a 09 (R2 ) Esta observacioacuten ya ha sido presentada
anteriormente por otros autores (Fuster-Valls et al 2008 Engelhardt et al 2014)
El cultivo bacteriano se puede contabilizar por conteo en placa directo (TSA) este meacutetodo
es utilizado generalmente para cultivos de geacutermenes no exigentes o moderadamente
exigentes y cuando se quiere visualizar como afecta el ataque de los fagos las ceacutelulas
bacterianas se visualizan por DEM (cuya coloracioacuten cambia a verde cuando han sido atacadas
por los fagos) y una forma de visualizar este ataque es por medio de TSA con la teacutecnica de
ADC
0
5
10
15
20
25
0 10 20 30 40 50 60
Co
nte
o (
Lo
g U
FC
cm
2)
Tiempo (h)
Crecimiento bacteriano
Resultados y discusioacuten
83
D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable
Se aplicoacute la DEM para evaluar la efectividad del fago MRH6 en el control de S Typhi ATCC
19430 sobre superficies de acero inoxidable en condiciones de humedad El fago MRH6 es
liacutetico capaz de disgregar los biofilms
El analizar la accioacuten liacutetica del fago sobre Salmonella por medio del DEM es muy importante
e innovador pero el material que se utiliza y la manera en que se comportan las diferentes
bacterias hacen que se deba ser muy precavido al considerar el uso de este meacutetodo como
adecuado para realizar conteos (Libuchi et al 2010) Por ejemplo se debe tener en cuenta
que existen bacterias que no forman un biofilm y presentan movimiento esto puede llegar a
complicar el visualizarlas si no estaacuten en el campo por lo que se podriacutea pensar que fueron
atacadas y eliminadas por los fagos o bien que por los diferentes lavados se barrieron
La DEM con la tincioacuten LIVEDEAD reveloacute la presencia de ceacutelulas viables con coloracioacuten
verde En la figura 13 se puede observar el efecto letal del fago MRH6 sobre la poblacioacuten de
S enteacuterica disminuyendo su cantidad considerablemente en base a el tiempo de incubacioacuten
en color verde Se observa que hay disminucioacuten de las ceacutelulas de S Typhi ATCC 19430 al ser
atacadas por el fago MRH6 Recordemos que la infeccioacuten con el MRH6 se realizoacute despueacutes de
formar un biofilm a temperatura ambiente y con humedad por espacio de 72h en 3
concentraciones 6 7 y 8 UFPmL Al paso del tiempo se aprecia que a las 48h hay pocas
ceacutelulas vivas al menos detectadas por la teacutecnica utilizada
Resultados y discusioacuten
84
a)
b)
c)
Figura 13 Secuencia de imaacutegenes de epifluorescencia que ilustran la destruccioacuten de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable causada por el fago MRH6 tras incubacioacuten de 0 8 24 y 48 h y con 3 concentraciones de fagos a) 6 b) 7 y c) 8 UFPmL respectivamente
La DEM es un meacutetodo altamente sensible que se caracteriza por la formacioacuten de imaacutegenes
amplificadas y es considerada una teacutecnica poderosa con altos niveles de sensibilidad y
resolucioacuten Tomando como referencia los resultados se considera que la DEM es una
herramienta eficaz para el conteo bacteriano pero hay que considerar la experiencia del
observador
Resultados y discusioacuten
85
En algunas ocasiones al observar las bacterias atacadas por los fago se pueden encontrar
muestras con material geneacutetico mezclado con restos celulares esta situacioacuten hace que
algunos investigadores recomienden extraer los fagos de la muestra antes de sembrar las
bacterias con el fin de determinar la reduccioacuten bacteriana uacutenicamente debida a la actividad
virulenta del fago sobre la muestra y no a la infeccioacuten por fagos libres presentes en el agar
(Sharma et al 2009) En ese sentido tal como reporta Fuster-Valls et al (2008) en su trabajo
observoacute que el limite de deteccioacuten de esta teacutecnica es de 279 log10 celulas por cm2 en cambio
en nuestro trabajo y tal como se observa en la figura 14 se pudo llegar a una sensibilidad
muy proacutexima a 2 y que coincide con las imaacutegenes de la figura 13 en las que a las 24 y 48
horas apenas se observan algunas manchas que corresponden al crecimiento bacteriano
Los fagos utilizan los recursos de la ceacutelula para hacer muchos fagos nuevos lo que causa
que la ceacutelula lise (estalle) y muera en el proceso La lisis en las uacuteltimas etapas del ciclo liacutetico
el fago expresa los genes para las proteiacutenas que hacen agujeros en la membrana plasmaacutetica
y la pared celular En la figura 14 se puede observar como el recuento de Salmonella Typhi
ATCC 19430 disminuye por el ataque del fago MRH6 El efecto del fago es muy fuerte y al
final los conteos son muy parecidos
Resultados y discusioacuten
86
Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 en superficies de acero inoxidable por el fago MRH6 con diferentes concentraciones y hasta 48 h de incubacioacuten
En este trabajo se buscoacute crear condiciones de infeccioacuten fago-bacteria en el laboratorio
como las que se pudieran presentar en la industria Los resultados de esta relacioacuten del fago
MRH6 y S Typhi ATCC 19430 muestran que la aplicacioacuten del fago es efectiva pero hay que
considerar que funciona mejor a altos tiacutetulos (108 UFCmL) y que deberaacute de potenciarse
cuando se trate de un coctel de fagos
Nuestros resultados sugieren que los fagos pueden ser utilizados como un meacutetodo para
controlar un biofilm formado por un bacteria especiacutefica
Al realizar la buacutesqueda de informacioacuten en diferentes motores de buacutesqueda una de las
plataformas de libre acceso (Pubmed) se obtuvo una relacioacuten de 5 en publicaciones de
00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Salm
on
ella
Typ
hi
AT
CC
19430
(lo
g1
0ceacutelu
las cm
2)
Tiempo (h)
Fago MRH6 a 6 Logml Fago MRH6 a 7 Logml Fago MRH6 a 8 Logml Control sin fago
Resultados y discusioacuten
87
fagos contra diferentes serovariedades de Salmonella spp lo que se puede traducir en que
hay un aacuterea de oportunidad latente
Las consideraciones que se enviacutean como propuesta es que existen en estos momentos
muchos trabajos sobre fagos pero aquiacute en Meacutexico no hay trabajos reportados y los que
existen estaacuten apenas en fases iniciales
Existe un enorme potencial de trabajo en esta aacuterea con los fagos tal es el caso de la
fagoterapia en otros sitos y en otros tiempos estaacuten realizando experimentos para ser
explotada como alternativa para todos los aacutembitos desde hogares industria salud animales
vegetales etc Por lo menos en EE UU tienen grandes avances en estudios relacionados
con la aplicacioacuten en bacterias multiresistentes que por el uso de antibioacuteticos han mutado esto
en el sector salud donde se estaacute perdiendo la batalla
Una de las fortalezas de estudiar a los fagos es que antes de que los antibioacuteticos fueran
descubiertos habiacutea investigacioacuten considerable sobre los fagos como tratamiento para las
enfermedades bacterianas humanas por lo menos en parte de Europa La aplcacion de los
fagos es potencialmente son buenos candidatos para tratar enfermedades bacterianas en
seres humanos inocuidad aliemnaria bioremediacioacuten y cada regioacuten tiene fagos endeacutemicos y
este tabajo representa de los primeros en llevarse en Monterrey
Ciertas limitaciones de los resultados se debiooacute a las condiciones que se presentaron al
realizar el estudio (laboratorio equipo conocimiento del tema) solamente se pudo aislar un
fago y lo recomendable es que sean varios fagos dado que son muy especiacuteficos de especie
o hasta de cepa Se proboacute su accioacuten sobre superficies con un solo cultivo bacteriano y en la
realidad las superficies se contaminan con diferentes bacterias
Lo que se vizualiza para nuestro estudio es sugerir varias liacuteneas de accioacuten a futuro Por
ejemplo el fago aislado podriacutea probarse in vivo sobre carne de pollo o fagoterapia tambieacuten
podriacutea continuar los estudios para aislar maacutes fagos y hacer mezclas (coacutecteles) que tuvieran
un mayor rango de actividad y combatir a diversas especies de Salmonella Con respecto al
tratamiento de superficies podriacutean utilizarse coacutecteles de fagos para tratar biofilms bacterianos
formados por maacutes de dos especies o inclusive podriacutean probarse en biopeliacuteculas industriales
reales
Resultados y discusioacuten
88
89
VI CONCLUSIONES
90
Conclusiones
91
De las 39 muestras de agua analizadas se aislaron tentativamente15 fagos de los que soacutelo 4
mantuvieron en un primer momento su actividad liacutetica estos fagos se correspondieron con las
muestras de agua 15 21 26 y 33 Se siguioacute trabajando con ellos y finalmente solo uno de
ellos el MRH6 mantuvo su actividad liacutetica despueacutes de varias amplificaciones este fago se
aisloacute de las aguas residuales de Mariacuten
Se consiguioacute optimizar la teacutecnica ADC cambiando la agarosa que tiene un alto costo por
agar-agar maacutes econoacutemico sin alterar la fiabilidad de la teacutecnica ademaacutes con este cambio se
facilita el manejo
En relacioacuten con la especificidad de los 15 fagos aislados frente a las 16 cepas de
enterobacterias probadas (12 cepas de Salmonella spp y 4 de E coli) se observa ciertas
tendencias marcadas Ninguno de los fagos ataca a las cepas de E coli probadas En cuanto
a Salmonella se observa una fuerte especificidad frente a S Typhi (ATCC 19430) una ligera
actividad frente a varias cepas de S enterica y no hubo efecto contra las demaacutes cepas de
Salmonella ensayadas lo cual confirma la elevada especificidad fago-hueacutesped
Las imaacutegenes obtenidas mediante DEM muestran una morfologiacutea caracteriacutestica de cabeza
icosaeacutedrica estructura alargada y cola no contraacutectil que sugieren que el fago MRH6 se puede
clasificar en la familia Siphoviridae
Se observa un efecto liacutetico progresivo del fago MRH6 frente a biofilms de Salmonella en
discos de acero inoxidable llegando a valores miacutenimos inferiores a 102 a las 48 horas de
incubacioacuten para todas las concentraciones de fago utilizadas (6 a 8 UFPmL)
Se comprueba que la DEM es un buen meacutetodo para la cuantificacioacuten del crecimiento de S
Typhi (ATCC 19430) sobre discos de acero inoxidable con una gran sensibilidad y resolucioacuten
ya que se observaron claras diferencias en los diversos tiempos de incubacioacuten ensayados y
a diferentes concentraciones del fago MRH6 Esto confirma que la teacutecnica es una herramienta
eficaz para valorar el efecto liacutetico de los fagos sobre biofilms
Ya que en este trabajo solamente se obtuvo un fago liacutetico se sugiere reflexionar acerca de
los factores que han dificultado la obtencioacuten de un nuacutemero maacutes amplio de fagos
Conclusiones
92
Este trabajo refleja el gran intereacutes por iniciar o regresar a trabajar con fagos tal como esta
sucediendo en otras partes del mundo Hasta el momento hay muchas espectaivas sin
embargo todaviacutea se necesita investigacioacuten para saber queacute tan seguros son
93
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CONTENIDO RESUMEN 1
SUMMARY 3
RESUM 5
I INTRODUCCIOacuteN 7
Presentacioacuten del proyecto 9
Justificacioacuten 10
II ANTECEDENTES 13
A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos 15
A1 Problemaacutetica 16
A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea 17
B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria 19
B1 Escherichia 19
B2 Campylobacter 20
B3 Enterobacter 21
B4 Listeria 22
B5 Salmonella 23
B51 Origen 23
B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp 25
B53 Manifestaciones cliacutenicas 27
B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis 28
C Crecimiento microbiano 30
C1 Crecimiento de los microorganismos 30
C11 Disponibilidad del agua 31
C12 Acidez y pH 31
C13 Oxiacutegeno 31
C14 Temperatura 32
D Control del crecimiento microbiano 34
D1 Agentes fiacutesicos 34
D2 Agentes quiacutemicos 35
E Fagos 35
E1 Antecedentes 35
E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos 37
E3 Clasificacioacuten de los fagos 37
E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico 39
E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten 39
F Biofilm 40
G Microscopiacutea electroacutenica 41
H Fagoterapia 42
III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 47
A Objetivo general 49
B Objetivos especiacuteficos 49
C Plan de trabajo 49
IV MATERIALES Y MEacuteTODOS 51
A Toma de muestras 53
B Obtencioacuten de fagos 54
B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55
B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55
B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas 56
B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos 56
B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC) 58
B6 Modelo de infeccioacuten 59
B7 Controles utilizados durante los ensayos 60
B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium 60
C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos 61
D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica 63
D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 64
D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM 65
V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 67
A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras 69
B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis 70
B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S Typhimurium 70
B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium 72
B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis 72
B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis 73
B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten 73
C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli 75
D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM 80
D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 81
D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable 83
VI CONCLUSIONES 89
VII BIBLIOGRAFIacuteA 93
Iacutendice de figuras
Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa 16
Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por Salmonella spp 24
Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella 24
Figura 4 Adsorcioacuten del bacterioacutefago T4 e inyeccioacuten del ADN 39
Figura 5 Diagrama general de trabajo 50
Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten bacterioacutefago-hueacutesped 59
Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten 62
Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por bacterioacutefagos 74
Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria 79
Figura 10 Imagen por TEM del bacterioacutefago MRH6 80
Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 81
Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable 82
Figura 13 Secuencia de imaacutegenes del DEM 84
Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 por el fago MRH6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86
Iacutendice de tablas
Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias 19
Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos 25
Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales 33
Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos 38
Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos 44
Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria 45
Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos 54
Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten 57
Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos 70
Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC 71
Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium 72
Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis 73
Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten 75
Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades 77
Lista de abreviaturas y acroacutenimos
ADN Aacutecido desoxirribonucleico
ARN Aacutecido ribonucleico
ADC Agar doble capa
AS Agar suave
AECID Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el
Desarrollo
ATCC American Type Culture Collection
APPCC Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control
aw Actividad del agua
BGA Agar verde brillante
BHI Infusioacuten cerebro corazoacuten
CCUG Culture Collection University of Goumltenborg
CENAVECE Centro Nacional de Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de
Enfermedades
CETC Coleccioacuten Espantildeola de Cultivos Tipo
CINSP Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica
EDTA Etilendiaminotetraceacutetico
DEM Microscoacutepica de epifluorescencia directa
EE UU Estados Unidos de Norteameacuterica
ETA Enfermedades transmitidas por alimentos
FAO Food and Agriculture Organization (Organizacioacuten de las
Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura)
FaSPyN Facultad de Salud Puacuteblica y Nutricioacuten UANL
FAUANL Facultad de Agronomiacutea UANL Unidad Mariacuten NL
FCB Facultad de Ciencias Bioloacutegicas UANL
HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points (Anaacutelisis de
Peligros y Puntos Criacuteticos de Control)
INEGI Instituto Nacional de Estadiacutestica y Geografiacutea de los Estados
Unidos Mexicanos
nd Aparente baja efectividad o halo difuso
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
PANALIMENTOS Instituto Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y
Zoonosis
PEG Polietilenglicol
SDS Dodecilsulfato soacutedico
SIRVETA Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos
SSF Solucioacuten salina fisioloacutegica
SUH o SHU Siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico
TEM Microscopio electroacutenico de transmisioacuten
TSA Agar soya de tripicasa
TSAYE TSA con 06 de extracto de levadura
TSB Caldo de soja trypticasa
UAB Universitat Autogravenoma de Barcelona
UANL Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
ZMM Zona Metropolitana de Monterrey
RESUMEN
La inocuidad alimentaria es un tema amplio y relevante que impacta directamente en todos
los segmentos de la sociedad involucra productores desarrolladores innovadores
consumidores y gobierno ademaacutes de diversos sectores como la industria la ingenieriacutea y hasta
la educacioacuten Sin embargo las nuevas tecnologiacuteas en la cadena de produccioacuten provocan que
eacutesta sea maacutes larga y compleja
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) causan alta morbilidad y varios casos
de mortalidad Entre los agentes infecciosos maacutes comunes se encuentran Salmonella spp
Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus
Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus
Los bacterioacutefagos o fagos son virus bacterianos especiacuteficos de una ceacutelula hueacutesped en la
cual se multiplican invadiendo su maquinaria de material geneacutetico Son los sistemas bioloacutegicos
maacutes abundantes del planeta se encuentran en el medio ambiente y se introducen y conviven
en la flora intestinal de otros seres cuando eacutestos ingieren diversos alimentos ya sean de tipo
animal o vegetal
El objetivo del presente trabajo fue aislar y probar la especificidad de una serie de fagos de
Salmonella spp a partir de aguas residuales para lo cual se utilizaron muestras de agua
recolectadas de diferentes localidades del aacuterea metropolitana de Monterrey N L Meacutexico La
purificacioacuten de fagos se llevoacute a cabo mediante la teacutecnica de agar doble capa (ADC) hasta
obtener placas liacuteticas uniformes y se usaron diferentes cepas de referencia de Salmonella
como cultivos indicadores
Se aislaron un total de 15 fagos putativamente distintos de los cuales al pasar las pruebas
de replicacioacuten soacutelo uno logroacute mantener la capacidad liacutetica Se seleccionoacute y purificoacute para
realizar pruebas in vitro especiacuteficas para Salmonella Se utilizoacute una concentracioacuten de fagos
de 1x1012 UFPmL para analizar al fago mediante su morfologiacutea por microscopiacutea electroacutenica
la cual se identificoacute como miembro de la familia Siphoviridae Asiacute mismo se probaron los fagos
contra Salmonella in situ en discos de acero que simulan las superficies de trabajo y para
analizar el efecto de la infeccioacuten del fago sobre Salmonella en los discos de acero inoxidable
se utilizoacute el microscopio de epifluorescencia
Para el conteo de fagos se utilizoacute los meacutetodos LIVEDEAD Para finalizar para evaluar la
efectividad del fago MRH6 que resulto liacutetico en nuestro ensayo se procedioacute a dar las
condiciones necesarias para la formacioacuten del biofilm de Salmonella sobre superficies de acero
inoxidable El fago MRH6 fue capaz de disgregar los biofilms a temperatura ambiente Las
mayores reducciones de Salmonella en un menor tiempo se obtuvieron con concentraciones
de fago mayores a 1x108 UFPmL El meacutetodo de cultivo mostroacute reducciones del patoacutegeno a
niveles indetectables sin embargo la tincioacuten vital reveloacute la presencia de ceacutelulas viables
(coloracioacuten verde) que podriacutea representar un riesgo de contaminacioacuten cruzada estas
pudieran tambieacuten presentarse por la presencia de material orgaacutenico Este trabajo con un fago
puede proporcionar una medida adyuvante para controlar la contaminacioacuten de superficies de
acero inoxidable con biofilms de Salmonella La DEM resultoacute ser una buena herramienta para
evaluar raacutepida y adecuadamente por observacioacuten y posterior anaacutelisis el efecto de los fagos
SUMMARY
Food safety is a broad and relevant issue that directly affects all aspects of society involving
producers developers innovators consumers and government as well as various sectors
such as industry engineering and even education However new technologies in the
production chain cause it to be longer and more complex
Foodborne diseases (ETA) cause high morbidity and several cases of mortality Among the
most common infectious agents are Salmonella spp Campylobacter spp Escherichia coli
Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus Clostridium botulinum Listeria
monocytogenes and Staphylococcus aureus
Bacteriophages or phages are bacterial viruses specific to a host cell in which they multiply
by invading their machinery of genetic material They are the most abundant biological systems
on the planet they can be found in the environment In organisms they enter and coexist in
the intestinal flora of other beings when they ingest various foods whether animal or vegetable
The objective of this study was to isolate and test the specificity of a series of phages of
Salmonella spp from wastewater for which water samples were collected from different
locations in the metropolitan area of Monterrey N L Meacutexico The purification of phages was
carried out by means of the double layer agar technique (ADC) until uniform lithic plates were
obtained and different Salmonella reference strains were used as indicator cultures
A total of 15 putatively different phages were isolated of which upon passing the replication
tests only one managed to maintain the lytic capacity It was selected and purified to perform
specific in vitro tests for Salmonella A phage concentration of 1x1012 PFUmL was used to
analyze the phage by means of its electron microscopy morphology which was identified as a
member of the Siphoviridae family Likewise the phages against Salmonella were tested in
situ on steel discs simulating the work surfaces and the epifluorescence microscope was used
to analyze the effect of phage infection on Salmonella on the stainless steel discs
For the phage count the LIVE DEAD Finally in order to evaluate the effectiveness of the
phage MRH6 that was lytic in our trial the necessary conditions for the formation of the
Salmonella biofilm on stainless steel surfaces were established The phage MRH6 was able
to disintegrate the biofilms at room temperature The greatest reductions of Salmonella in a
shorter time were obtained with phage concentrations greater than 1x107 PFUmL The culture
method showed reductions of the pathogen to undetectable levels however vital staining
revealed the presence of viable cells (green coloration) which could represent a risk of cross
contamination these could also be presented by the presence of organic material This work
with a phage can provide an adjuvant measure to control contamination of stainless steel
surfaces with Salmonella biofilms The DEM proved to be a dependable tool to quickly and
adequately evaluate the effect of phages by observation and subsequent analysis
RESUM
La innocuiumltat alimentagraveria eacutes un tema ampli i rellevant que impacta directament en tots els
segments de la societat involucra productors desenvolupadors innovadors consumidors i
govern a meacutes de diversos sectors com la induacutestria lenginyeria i fins a leducacioacute No obstant
aixograve les noves tecnologies en la cadena de produccioacute provoquen que aquesta sigui meacutes llarga
i complexa
Les malalties transmeses per aliments (ETA) causen alta morbiditat i diversos casos de
mortalitat Entre els agents infecciosos meacutes comuns es troben Salmonella spp
Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus
Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus
Els bacteriogravefags o fags soacuten virus bacterians especiacutefics duna cegravelmiddotlula hoste en la qual es
multipliquen envaint la seva maquinagraveria de material genegravetic Soacuten els sistemes biologravegics meacutes
abundants del planeta es troben en el medi ambient i sintrodueixen i conviuen en la flora
intestinal daltres eacutessers quan aquests ingereixen diversos aliments ja siguin de tipus animal
o vegetal
Lobjectiu del present treball va ser aiumlllar i provar lespecificitat duna segraverie de fags de
Salmonella spp a partir daiguumles residuals per a aixograve es van utilitzar mostres daigua recollides
de diferents localitats de lagraverea metropolitana de Monterrey N L Megravexic La purificacioacute de fags
es va dur a terme mitjanccedilant la tegravecnica dagar doble capa (ADC) fins a obtenir plaques liacutetiques
uniformes i es van usar diferents soques de referegravencia de Salmonella com a cultius indicadors
Es van aiumlllar un total de 15 fags possiblement diferents dels quals en passar les proves
de replicacioacute nomeacutes un va aconseguir mantenir la capacitat liacutetica Es va seleccionar i va
purificar per realitzar proves in vitro especiacutefiques per Salmonella Es va utilitzar una
concentracioacute de fags de 1x1012 UFPmL per analitzar fag mitjanccedilant la seva morfologia per
microscogravepia electrogravenica la qual es va identificar com a membre de la famiacutelia Siphoviridae Aixiacute
mateix es van provar els fags contra Salmonella in situ en discos dacer que simulen les
superfiacutecies de treball i per analitzar lefecte de la infeccioacute del fag sobre Salmonella en els
discos dacer inoxidable es va utilitzar el microscopi depifluorescegravencia
Per al recompte de fags es va utilitzar els megravetodes LIVE DEAD Per finalitzar per avaluar
lefectivitat del fag MRH6 que va resultar liacutetic en el nostre assaig es va procedir a donar les
condicions necessagraveria per a la formacioacute del biofilm de Salmonella sobre superfiacutecies dacer
inoxidable El fag MRH6 va ser capaccedil de disgregar els biofilms a temperatura ambient Les
majors reduccions de Salmonella en un menor temps es van obtenir amb concentracions de
fag majors a 1x107 UFP mL El megravetode de cultiu va mostrar reduccions del patogen a nivells
indetectables perograve la tincioacute vital revelar la presegravencia de cegravelmiddotlules viables (coloracioacute verda)
que podria representar un risc de contaminacioacute creuada aquestes poguessin tambeacute
presentar-se per la presegravencia de material orgagravenic Aquest treball amb un fag pot proporcionar
una mesura adjuvant per controlar la contaminacioacute de superfiacutecies dacer inoxidable amb
biofilms de Salmonella La DEM va resultar ser una bona eina per avaluar ragravepida i
adequadament per observacioacute i posterior anagravelisi lefecte dels fags
7
I INTRODUCCIOacuteN
Introduccioacuten
8
Introduccioacuten
9
Presentacioacuten del proyecto
Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica sobre las innovaciones en seguridad alimentaria en
Meacutexico la cual puso en evidencia la necesidad de analizar alternativas enmarcadas en el
aacutembito del uso de las tecnologiacuteas verdes lo que presentoacute la posibilidad de desarrollar un
trabajo innovador y que no se estuviera aplicando ya en el sector alimentario local o nacional
De esa manera se inician las actividades experimentales que para este trabajo doctoral se
dividieron en dos partes la primera realizada en Meacutexico y la segunda en Espantildea
En primera instancia se desarrolloacute un anaacutelisis en el Laboratorio de geneacutetica y biologiacutea
molecular del Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica (CINSP) en el Campus
Ciencias de la Salud de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) y gracias al apoyo
de Programa de mejoramiento del profesorado (PROMEP nuacutemero UANL-326) por medio de
una beca se iniciaron los estudios y asiacute se cumplioacute el primer propoacutesito que fue obtener virus
nativos contra cepas de Salmonella y purificarlos
Posteriormente para lograr los demaacutes objetivos que eran realizar la caracterizacioacuten parcial
de los fagos contra Salmonella se solicitoacute una beca a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten
Internacional para el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y
de Cooperacioacuten curso 2010-2011) con el fin de realizar una estancia de investigacioacuten y crear
oportunidades de desarrollo aprovechando las tecnologiacuteas innovadoras disponibles en la
Universitat Autoacutenoma de Barcelona (UAB) considerando ademaacutes que la alta reputacioacuten de la
institucioacuten y la supervisioacuten por parte de sus investigadores impactariacutean positivamente en el
desarrollo del trabajo y en el Curriculum Vitae del investigador y por consiguiente en su futuro
profesional como docente e investigador
Otra finalidad de este proyecto fue dejar un buen referente al concluir la estancia ya que
ello ofreceriacutea nuevas oportunidades para seguir forjando el perfil del investigador cimentaraacute
cualquier trayectoria profesional y facilitariacutea optar por un plan postdoctoral en esta misma
Universidad De esta manera se accedioacute a la beca del Programa Extranjeros II-A
Convocatoria 2010-2011 Nuacutemero 0000521211 del cual se cumplieron los objetivos
establecidos y otros maacutes por ejemplo conocer nuevas tecnologiacuteas
Siendo eacutesta una liacutenea de investigacioacuten relativamente reciente en Meacutexico se espera que
impacte en las posibilidades laborales en diversos contextos y seacutea de utilidad para sentar
precedentes para futuras liacuteneas de trabajo en dicha aacuterea
Introduccioacuten
10
Justificacioacuten
En las uacuteltimas deacutecadas los cambios ocurridos en la produccioacuten y consumo de alimentos
han tenido un impacto sobre la inocuidad alimentaria La industria en la produccioacuten masiva de
alimentos ha evolucionado de ser local a constituirse en otra donde la produccioacuten yo el
procesamiento estaacuten localizados en diferentes partes del paiacutes o del mundo Por otra parte la
poblacioacuten estaacute envejeciendo por lo que se vuelve maacutes vulnerable a problemas de salud
ademaacutes los agentes patoacutegenos son cada vez maacutes virulentos (DeWaal y Barlow 2014)
Los reportes sobre problemas gastrointestinales que recopila el Centro Nacional de
Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades (CENAVECE) indican que Nuevo
Leoacuten ha permanecido dentro de los primeros 12 lugares de casos de fiebre tifoidea y en los
primeros 14 de fiebre paratifoidea y otras salmonelosis A nivel nacional las enfermedades
infecciosas intestinales se ubican entre las primeras 10 causas de mortalidad de nintildeos en
edad escolar entre los 5 y 14 antildeos de edad (CENAVECE 2007)
Los microorganismos del geacutenero Salmonella pertenecen a la familia Enterobacteriaceae
Son bacilos o cilindros con puntas redondeadas y se diferencian de las demaacutes enterobacterias
mediante reacciones bioquiacutemicas y de aglutinacioacuten existen maacutes de 2500 serotipos todos
ellos patoacutegenos Actualmente se considera una sola especie denominada Salmonella
enterica de la cual seguacuten el esquema de Kauffmann-White se clasifican nueve serogrupos
Esta especie tiene importancia cliacutenica debido a que es la uacutenica capaz de infectar animales
homeotermos esta investigacioacuten se centra en cuatro serovariedades Salmonella enterica
serovar Typhimurium (S Typhimurium) S enterica serovar Paratyphi (S Paratyphi) S
enterica serovar Enteritidis (S Enteritidis) y S enterica serovar Typhi (S Typhi) estos
microorganismos se pueden aislar tanto de fuentes alimentarias (carne de res pollo crudo
huevo fresco carne de puerco almejas chorizos vegetales entre otros) como del medio
ambiente (suelo agua materia fecal y superficies) (Chlebicz y Śliżewska 2018 Nguendo
2018)
En Meacutexico S Enteritidis y S Typhimurium son los microorganismos aislados con mayor
frecuencia en las salmonelosis Normalmente S Enteritidis habita en el intestino de los
animales sin causar enfermedad pero puede infectar a humanos y promover diarrea voacutemito
dolor abdominal calambres y ocasionalmente insuficiencia renal y en los peores casos la
muerte (DeWaal y Barlow 2014) La contaminacioacuten de alimentos por Salmonella spp se debe
Introduccioacuten
11
a una combinacioacuten de factores relacionados con la produccioacuten a gran escala o cambios en el
manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los mismos (Uribe y Suarez 2006)
Por otra parte estaacuten los virus que pueden replicarse independientemente de los
cromosomas de una ceacutelula pero no sin su participacioacuten (Madigan y Martinko 2006) El hecho
de descubrir virus que pueden infectar y destruir bacterias fue recibido con optimismo por su
posible aplicacioacuten en usos terapeacuteuticos (McLaughlin et al 2006)
En un estudio realizado en diversos estados de Meacutexico (Coahuila Durango Estado de
Meacutexico Jalisco Morelos Oaxaca Puebla y Quereacutetaro) se ha fagotipado Salmonella spp
proveniente de huevo carne de pollo de engorde y gallinas progenitoras reproductoras de
postura comercial y productoras (Mancera et al 2004) Ademaacutes diversas investigaciones han
utilizado fagos liacuteticos para reducir la contaminacioacuten por Salmonella en pollos (canal y piel)
semillas germinadas y dulces de frutas cortadas (Goode et al 2003)
El uso de aditivos en los alimentos se ha reducido considerablemente debido al rechazo
generalizado por parte de los consumidores lo que podriacutea repercutir en un incremento en los
casos de intoxicaciones alimentarias En este contexto los fagos aportan ventajas sobre los
desinfectantes conocidos y los meacutetodos tradicionales de aplicacioacuten de friacuteo o calor ya que
pueden actuar como agentes de deteccioacuten y control bioloacutegico de bacterias patoacutegenas en
alimentos y su produccioacuten es relativamente raacutepida y econoacutemica (Atterbury et al 2003)
La utilidad de los fagos en el aacuterea de investigacioacuten es amplia una posible utilidad es ser
un instrumento para identificar cepas bacterianas especiacuteficas Tambieacuten se han utilizado para
el estudio de diversos fenoacutemenos moleculares el trabajo con estos virus permitioacute desarrollar
ensayos de placas de lisis conocer la naturaleza del ciclo de vida viral los tipos de mutaciones
geneacuteticas y los genes como segmentos de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) (Muniesa et al
2005)
Las empresas dedicadas a la biotecnologiacutea (Intralytix Omnilytics) se centran en desarrollar
productos utilizando fagos especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan las ETA y estos
productos comerciales de terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones
(Segundo 2010) Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos antildeos debido a sus
caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutefico sin dantildear la microbiota
en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros distribucioacuten de
Introduccioacuten
12
esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla (Oh y Park
2017)
En este sentido el objetivo general de este estudio es el aislamiento y caracterizarizacion
de fagos contra Salmonella a partir de diversas fuentes para su uso potencial en el control
bioloacutegico
13
II ANTECEDENTES
Antecedentes
14
Antecedentes
15
A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos
A nivel internacional la produccioacuten de alimentos y todos los mecanismos tecnoloacutegicos
involucrados en su procesamiento implican ademaacutes de la optimizacioacuten de los tiempos y de
la calidad un riesgo para la adquisicioacuten de enfermedades inherentes a la misma adopcioacuten
de nuevas tecnologiacuteas (Weaver et al 2017)
La OMS (2017) estima que las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de
muerte de nintildeos menores de cinco antildeos matan a 525000 nintildeos menores de cinco antildeos
cada antildeo una proporcioacuten significativa de las enfermedades diarreicas se puede prevenir
mediante el acceso al agua potable y a servicios adecuados de saneamiento e higiene
ademaacutes de que en todo el mundo se producen unos 1700 millones de casos de
enfermedades diarreicas infantiles cada antildeo
Seguacuten la OMS (2017) existen diferentes condiciones que propician el desarrollo de las
ETA Como son las de tipo bioloacutegico producidos por hongos o bacterias causantes de
enfermedades ya sea por sus metabolitos o toxinas virus o huevecillos de paraacutesitos asiacute
como los venenos de algunos peces y plantas Las de tipo quiacutemico como productos de
limpieza o desinfeccioacuten pesticidas toxinas marinas insecticidas o venenos y fiacutesicos cuando
en la materia prima de los alimentos se encuentran objetos como vidrios metal piedras
grapas barniz de untildeas joyeriacutea cabellos o cualquier elemento extrantildeo
De acuerdo con el Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos (SIRVETA) ndashdesarrollado por el Instituto
Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y Zoonosis (PANALIMENTOS)ndash ocurrieron 1683
brotes de ETA en Meacutexico que ocasionaron 53860 casos de enfermedades y provocaron
207 muertes mientras que en los demaacutes paiacuteses de Ameacuterica Latina se produjeron durante el
mismo periacuteodo 6324 brotes que provocaron 228579 casos y 314 muertes (Forsythe y
Hayes 2002) Cabe aclarar que eacutestos son soacutelo los brotes notificados por la autoridad
competente El sistema utilizado internacionalmente para obtener alimentos inocuos es el
APPCC (Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control) o HACCP (por sus siglas en ingleacutes
Hazard Analysis and Critical Control Points) que se puede implementar en cualquier tipo de
industria y permite prevenir controlar y eliminar cualquier peligro antes de consumir los
alimentos (Rodriacuteguez Torrens et al 2015)
En Meacutexico el Distintivo H es un programa implementado por los servicios alimentarios
Antecedentes
16
oficiales mediante el cual se ofrece a los clientes alimentos seguros El Centro Nacional de
Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades de Meacutexico (CENAVECE) advierte
que uno de los problemas de salud maacutes importantes lo constituyen los trastornos
gastrointestinales cuya mortalidad predomina entre los 5 y los 14 antildeos Entre 2006 y 2012
el Estado de Nuevo Leoacuten ha permanecido entre los primeros 7 lugares de casos de diarrea
(CENAVECE 2018)
La figura 1 muestra la distribucioacuten de la incidencia en Meacutexico la cual estaacute asociada a la
densidad demograacutefica y la accesibilidad a servicios de salud que facilitan el registro es asiacute
que son precisamente las entidades federativas con mayor poblacioacuten quienes registran
nuacutemeros maacutes altos
Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa en
Meacutexico 2010-2012 (CENAVECE 2018)
A1 Problemaacutetica
La inocuidad alimentaria es una preocupacioacuten mundial que se refleja en el incremento
de reportes y noticias relacionadas con la contaminacioacuten de los alimentos difundidos en
diversos paiacuteses a su vez estos productos son retirados del mercado lo que provoca
peacuterdidas por varios cientos de millones de doacutelares El Codex Alimentarius indica que las ETA
y los dantildeos provocados por los alimentos son en el mejor de los casos desagradables y
Antecedentes
17
en el peor fatales y pueden influir negativamente en el comercio y la confianza de los
consumidores Por consiguiente es imprescindible un control eficaz de la higiene Todos los
eslabones de la cadena alimentaria ndashfabricantes elaboradores manipuladores y
consumidores de alimentosndash son responsables del control de los riesgos microbioloacutegicos
desde la explotacioacuten agriacutecola o ganadera hasta el consumidor final Desde esta oacuteptica el
anaacutelisis de riesgos deberiacutea aplicarse dentro de un contexto estrateacutegico organizativo y
operacional reconocido si bien en el proceso puede haber elementos comunes establecer
un nivel apropiado de proteccioacuten en esos sectores puede representar las maacuteximas
diferencias (Atterbury et al 2003)
La OMS ha identificado siete microorganismos patoacutegenos ndashC jejuni C perfringens E
coli 0157H7 L monocytogenes Salmonella spp S aureus y T gondiindash que causan entre
123 y 33 millones de casos de infeccioacuten solamente en los EE UU lo que representa
peacuterdidas econoacutemicas de entre 5500 y 34900 millones de doacutelares Ademaacutes resalta que su
incidencia podriacutea ser de 300 a 350 veces mayor de lo que indican las estadiacutesticas dado que
soacutelo se notifica un nuacutemero relativamente pequentildeo de casos de ETA Se estima que 70 de
los 1500 millones de episodios de diarrea son causados por alimentos en mal estado Es
posible que en los paiacuteses en desarrollo se notifique a las autoridades sanitarias una
proporcioacuten de casos auacuten inferior principalmente por pobreza y escasez de recursos a
disposicioacuten de los servicios de gestioacuten de la inocuidad alimentaria e inspeccioacuten de alimentos
(Van de Venter 2000)
A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea
La OMS estima que el 88 de los casos de diarrea a nivel mundial son atribuibles al
agua el saneamiento y la higiene todos los aspectos de inocuidad de los alimentos estaacuten
relacionados con estos factores En menor medida la enfermedad se transmite a traveacutes de
otras viacuteas por ejemplo el aire y alrededor del 94 de los casos son atribuibles al
saneamiento ambiental el total de fallecimientos se calcula en maacutes de 15 millones
principalmente en nintildeos en los paiacuteses desarrollados el promedio es ligeramente menor a
90 La diarrea atribuible al agua y saneamiento inapropiado representa 53 de las
muertes totales y 35 en nintildeos europeos de 0-14 antildeos y es ademaacutes una de las causas
principales de malnutricioacuten (Pruumlss-Uumlstuumln y Corvalaacuten 2006)
Antecedentes
18
Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud puacuteblica en el mundo
especialmente en paiacuteses en desarrollo Su alta incidencia se debe en gran parte a la
ingestioacuten de alimentos contaminados con microorganismos patoacutegenos como Salmonella
que causa episodios de diarrea aguda Salmonella spp es uno de los patoacutegenos enteacutericos
maacutes frecuentes tanto en paiacuteses desarrollados como subdesarrollados Dependiendo de la
especie tamantildeo del inoacuteculo factores de virulencia expresados por la cepa hueacutesped
involucrado estado inmunoloacutegico del paciente e intervencioacuten meacutedica puede ocasionar una
infeccioacuten gastrointestinal de media a severa hasta una infeccioacuten sistemaacutetica que
comprometa la vida del paciente (Fernaacutendez 2008)
Otros microorganismos que tambieacuten pueden contaminar el agua y los alimentos como
bacterias (Bacillus cereus Clostridium botulinum Campylobacter jejuni Vibrio cholera) virus
(Norwalk Rotavirus Hepatitis A) y paraacutesitos (Entamoeba histolytica Cryptosporidium
parvum Toxoplasma gondii) pueden transmitirse tambieacuten de una persona a otra como
resultado de una higiene deficiente (Freedman et al 2015)
Estudios de empresas dedicadas exclusivamente a la crianza de cerdos reportan
epidemias como el virus de la diarrea porcina la cual posteriormente se transmite a los
consumidores de estas carnes contaminadas ya sea por contacto con las heces o por
consumo de carnes contaminadas lo cual implica tambieacuten una peacuterdida econoacutemica para la
industria alimentaria resaltando la necesidad de establecer medidas preventivas y
correctivas seguacuten sea el caso (Huss et al 2017)
Seguacuten la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO
por sus siglas en ingleacutes Food and Agriculture Organization) las toxiinfecciones alimentarias
son la segunda causa de morbilidad pero muchas permanecen sin declarar quizaacutes por su
mediana severidad y recuperacioacuten raacutepida salvo el coacutelera Los alimentos son susceptibles a
contaminacioacuten de todo tipo la fuente de agentes causales suele ser el tracto gastrointestinal
de individuos reservorios o las heces de animales y humanos infectados o bien agua
corrompida que por deficiencias sanitarias contamina carne fresca pescados moluscos
pasteles de crema y leche no pasteurizada entre otros productos (Riacuteos et al 2012) como
se puede observar en la tabla 1
Antecedentes
19
Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias (Riacuteos et al 2012)
Agente Periacuteodo de
incubacioacuten Fuente Agente patoacutegeno
Salmonella spp 8-24 h Aves huevos mascotas
(tortugas lagartos pollos) Bacteria y endotoxina
E coli
enterotoxigeacutenica 24-72 h
Agua y alimentos
contaminados
Enterotoxina
termoestable
V cholerae 24-72 h Alimentos contaminados Enterotoxina termolaacutebil
Shigella spp 24-72 h Agua y alimentos
contaminados Bacteria y endotoxina
C jejuni 1-7 d Leche aves de corral y
agua no potable
Bacteria y Enterotoxina
termolaacutebil
Yersinia spp 1-7 d Carne de cerdo leche Bacteria y Enterotoxina
B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria
La historia referente a las toxiinfecciones alimentarias se comienza a documentar y
legislar en el siglo X con el botulismo en Bizanzio y documentos sobre el ergotismo en el
siglo XVI En el siglo XIX aparecen los alimentos enlatados y Louis Pasteur asocia el
deterioro de los alimentos con las bacterias En el siglo XX se produce un desarrollo
espectacular de la microbiologiacutea de los alimentos con el establecimiento de la etiologiacutea de
las toxiinfecciones alimentarias el comienzo de una nueva era de la quiacutemica e ingenieriacutea
alimentaria Aunado a los movimientos migratorios de las personas la diversificacioacuten de
alimentos la produccioacuten masiva de alimentos y la facilidad de transporte desde puntos
lejanos entre la produccioacuten y preferencia en el consumo de alimentos aunadas a la
capacidad que tienen los microorganismos para evolucionar y adaptarse a su medio
ambiente hacen pensar en estos microorganismos como patoacutegenos emergentes (DeWaal y
Barlow 2014)
B1 Escherichia
Las cepas de E coli se pueden diferenciar seroloacutegicamente por los antiacutegenos somaacuteticos
(O) flagelares (H) y capsulares (K) Ademaacutes pueden hallarse fimbrias y estructuras
Antecedentes
20
emparentadas que desempentildean un papel en la patogenia Actualmente se reconocen cinco
grupos de E coli causantes de diarrea en funcioacuten del siacutendrome que provocan cuyas
diferencias estaacuten codificadas por plaacutesmidos (Wright et al 2017) Los diferentes tipos son
E coli enteropatoacutegeno (EPEC) es responsable de la diarrea acuosa en lactantes
Produce voacutemitos fiebre y diarrea acuosa con mocos pero sin sangre Coloniza las
microvellosidades de todo el intestino produciendo la lesioacuten de ldquoadhesioacuten y erosioacutenrdquo en
el ribete en cepillo de la membrana de la vellosidad Afecta a adultos y nintildeos menores de
dos antildeos siendo este rango de edad el principal factor de riesgo
E coli enterotoxigeacutenico (ETEC) es el causante de la llamada vulgarmente ldquodiarrea
del viajerordquo se manifiesta con diarrea acuosa como agua de arroz y poca fiebre
Coloniza la porcioacuten proximal del intestino delgado Afecta a adultos y nintildeos son una causa
frecuente de diarrea en lactantes de paiacuteses en desarrollo asiacute como la causa maacutes comuacuten
de diarrea en individuos de paiacuteses industrializados que viajan a zonas menos
desarrolladas del mundo
E coli enteroinvasor (EIEC) coloniza el colon origina fiebre y diarrea profusa con
heces que contienen mocos y estriacuteas sanguinolentas Presenta un plaacutesmido de 120-140
mD conocido como plaacutesmido invasivo que lleva todos los genes necesarios para la
virulencia Al igual que ETEC pero afecta principalmente a adultos
E coli enterohemorraacutegico (EHEC) origina diarrea sanguinolenta colitis hemorraacutegica
siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico (SUH o SHU) y puacuterpura trombocitopeacutenica En este grupo se
incluye E coli verotoxigeacutenico (VTEC) serotipos O157 O26 O111 Afecta principalmente
a nintildeos el principal factor de riesgo es el consumo de carne sin la coccioacuten adecuada
E coli enteroagregativo (EAggEC) posee caraacutecter clonal diferenciaacutendose dos clones
relacionados (1 y 2) Dentro de cada grupo estaacute presente una variedad concreta de
antiacutegenos O mientras que los antiacutegenos H se conservan
En los reportes cientiacuteficos sobre E coli se refieren a las plantas como otra fuente de
infeccioacuten especiacuteficamente en la espinaca (Spinacia oleracea) y lechuga (Lactuca sativa) Se
recomienda igualmente estudiar profundamente los cultivos y los tejidos vegetables y
animales ya que se deben considerar como paraacutemetros de riesgo para la inocuidad de los
alimentos (Fernaacutendez Ferran et al 2003 Wright et al 2017)
B2 Campylobacter
Campylobacter spp es un bacilo delgado gram negativo (05-08 microm x 02-05 microm) y
Antecedentes
21
microaeroacutefilo (necesita 3-5 de O2 y 2-10 de CO2) Su morfologiacutea puede variar entre
vibrioacutenica (bacilos curvados) espirilar en forma de rosquilla de S y cocoide de tal forma
que en fase logariacutetmica de crecimiento las ceacutelulas tienen forma espiral o curvada pero a
medida que los cultivos envejecen adquieren formas esfeacutericas Moacutevil con un uacutenico flagelo
polar que presenta de dos a tres veces el largo de la ceacutelula Aunque hay diversas especies
de Campylobacter causantes de enfermedades C jejuni C coli y C lari son las especies
que se aiacuteslan con mayor frecuencia en casos de gastroenteritis humana siendo C jejuni la
responsable de la mayoriacutea de las toxiinfecciones alimentarias 89-93 de las
toxiintoxicaciones (OMS 2017)
Las especies C coli y C lari son semejantes a C jejuni su diferencia se basa en pruebas
bioquiacutemicas C coli no es capaz de hidrolizar el piruvato y C lari es capaz de crecer en
presencia de 30 microgramos de aacutecido nalidiacutexico (Haddad et al 2013) La movilidad la
quimiotaxis y los flagelos son factores importantes en la virulencia pues de ellos depende la
colonizacioacuten del epitelio intestinal Campylobacter produce una enterotoxina parecida a la
toxina coleacuterica que tambieacuten juega un papel importante en la patogenia (Nichols 2005) C
jejuni puede sobrevivir de 2 a 4 semanas en condiciones de baja humedad oxigenacioacuten y
temperaturas de 4ordmC superando muchas veces el tiempo de vida uacutetil del producto Asimismo
puede perdurar de 2 a 5 meses a -20ordmC pero a temperatura ambiente apenas dura algunos
diacuteas (Khan et al 2013)
C jejuni y C coli son sensibles a diversos agentes antimicrobianos como los macroacutelidos
los aminoglucoacutesidos el cloranfenicol y la tetraciclina La eritromicina ha sido el antibioacutetico de
eleccioacuten para tratar las infecciones del tracto intestinal Al igual que en Salmonella el control
de Campylobacter se debe realizar tanto en el sector agropecuario como en los
establecimientos alimentarios por lo que los controles especificados para Salmonella
podriacutean extrapolarse a este microorganismo Un aspecto importante de su control reside en
la refrigeracioacuten de las aves ya que la baja temperatura junto con la desecacioacuten superficial
que se produce reduce significativamente la incidencia y los recuentos de Campylobacter
viables incluso en canales altamente contaminadas (Fernaacutendez 2008)
B3 Enterobacter
Conocido antiguamente como Cronobacter spp incluye varias especies de patoacutegenos
emergentes relacionados con brotes de meningitis septicemia y enterocolitis necrotizante
especialmente en neonatos y nintildeos La tasa de mortalidad de estos brotes es alta entre 20
Antecedentes
22
y 80 y los supervivientes suelen sufrir severos desoacuterdenes neuroloacutegicos (Grimont y
Grimont 2006)
E sakazakii es un bacilo moacutevil no esporulado gram negativo que ha sido encontrado en
alimento para bebeacutes es maacutes resistente a los cambios osmoacuteticos y a la sequiacutea que otros
miembros de la familia Enterobacteriaceae y se asocia con casos esporaacutedicos de sepsis
meningitis cerebritis y enterocolitis necrotizante La mayoriacutea de las infecciones se observan
en bebeacutes con bajo peso al nacer y que son alimentados de forma insalubre La mortalidad
ha disminuido a menos de 20 en los uacuteltimos antildeos Este microorganismo no se ha
encontrado presente en la foacutermula laacutectea tampoco existe evidencia de la transmisioacuten de
persona a persona o un medio general de difusioacuten ambiental (Vanegas et al 2009)
B4 Listeria
L monocytogenes estaacute muy difundida en la naturaleza en la que suele adoptar un ciclo
saprofiacutetico en estrecha relacioacuten con el suelo Ademaacutes se ha encontrado en aguas
continentales sedimentos marinos material vegetal en descomposicioacuten forrajes heces
humanas y animales y aguas residuales de explotaciones animales entre otros ambientes
lo que explica su presencia en alimentos crudos Epidemioloacutegicamente se caracteriza por su
ubicuidad sobreviviendo en tierra huacutemeda hasta 500 diacuteas en funcioacuten de la temperatura En
heces o aguas residuales mantenidas a temperatura de refrigeracioacuten sobrevive maacutes de seis
antildeos este periodo se reduce si se mantiene a temperatura ambiente (Guenther et al 2009)
Listeria spp son bacilos gram positivos de forma regular y con forma de vara corta
Algunas veces pueden tener forma cocoide apareciendo como ceacutelulas individuales o en
cadenas cortas Son moacuteviles entre 20-25ordmC pero no a 37ordmC Existen seis especies de Listeria
descritas L monocytogenes L innocua L welshimeri L seeligeri L grayi y L ivanovii
subespecie ivanovii y subespecie londoniensis Las cepas patoacutegenas de L monocytogenes
producen la listeriolisina O responsable de la hemoacutelisis-β y de la destruccioacuten de las ceacutelulas
fagocitarias es una hemolisina que segrega la bacteria a causa de la disminucioacuten de pH
(Liu 2006)
L monocytogenes tolera y se multiplica en concentraciones altas de NaCl contando con
la posibilidad de sobrevivir durante un antildeo en ambientes con una concentracioacuten de 16 su
tolerancia aumenta al disminuir el pH o la temperatura del medio Los tratamientos para su
inactivacioacuten son de 617ordmC35min 70ordmC20min 78ordmC15min u 80ordmC5min favoreciendo su
Antecedentes
23
resistencia al calor con la presencia de grasas Se multiplica entre 0 y 4ordmC las temperaturas
bajas ejercen un efecto protector de tal manera que en condiciones de acidez su inactivacioacuten
es maacutes lenta en refrigeracioacuten que a temperatura ambiente (Leverentz et al 2003) La acidez
influye en la capacidad de Listeria para sobrevivir a la congelacioacuten (temperaturas inferiores
a -47ordmC) y almacenamiento a menos de -18ordmC en carne mostrando una disminucioacuten en la
recuperacioacuten de ceacutelulas viables que han sido dantildeadas por el friacuteo (Wu et al 2015)
B5 Salmonella
B51 Origen
Salmonella tiene su origen principal en el tracto intestinal de animales fundamentalmente
las aves y los porcinos y pueden acabar contaminando las carnes crudas el pollo crudo los
productos marinos crudos o el huevo Los brotes de Salmonella estaacuten asociados al consumo
de alimentos elaborados con huevo crudo y siguen siendo frecuentes a pesar de conocerse
el riesgo que representa su consumo de las medidas legales adoptadas y de los programas
de educacioacuten sanitaria dirigidos a disminuir su incidencia Este geacutenero pertenece a la familia
Enterobacteriaceae fue descrito a principios del siglo XX por el bacterioacutelogo estadounidense
Theobald Smith (Zaidi et al 2006) En la figura 2 se muestran los factores de virulencia y
en la figura 3 se presenta la clasificacioacuten de Salmonella enterica con las diferentes
subespecies y serovares que se aiacuteslan maacutes frecuentemente
Antecedentes
24
Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por
Salmonella spp (Brenner et al 2000)
Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella (Brenner et al 2000)
Antecedentes
25
B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp
La mayoriacutea de los miembros de este geacutenero se encuentra en el tracto intestinal del
hombre y los animales como bacterias patoacutegenas o comensales Estaacute integrado por bacilos
gram negativos anaerobios facultativos y no esporulados La mayor parte de los serotipos
conocidos son moacuteviles mediante flagelos peritricos Se conocen maacutes de 2460 serotipos
muchos de ellos patoacutegenos para el ser humano (Chlebicz y Śliżewska 2018)
Son bacterias invasoras enterotoxigeacutenicas y estaacuten ampliamente diseminadas en todo el
mundo su temperatura ideal de sobrevivencia entre los 15 y los 35degC (mesoacutefilas) y en una
amplitud de pH de 45 a 9 Los microorganismos de este geacutenero se distribuyen en seis
grupos se han definido mediante biotipado hibridacioacuten DNA-DNA anaacutelisis de la secuencia
del RNA ribosomal 16S y por ldquomultilocus enzyme electrophoresisrdquo (MLEE) (Brenner et al
2000) La serotipificacioacuten se utiliza para diferenciar maacutes allaacute del nivel de subespecie como
puede observarse en la tabla 2
Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos (Brenner et al 2000)
Grupo Microorganismo
A S Paratyphi Al
B S Typhimurium S Bredeney
C1 S Choleraesuis S Montevideo S Oranienburg
C2 S Newport
D S Typhi S Enteritidis S Dublin S Gallinarum
E S Butantan S Anatum S Give
Salmonella serotipo Typhi es la causante de la fiebre tifoidea presentando siacutentomas como
son fiebre de intensidad variable cefalea diarrea estrentildeimiento tos naacuteuseas y voacutemitos
anorexia dolor abdominal y escalofriacuteos Mientras que los demaacutes serotipos considerados no
tifoidicos presentan un estado asintomaacutetico En el antildeo 2000 los serotipos aislados con
mayor frecuencia en EE UU fueron S Typhimurium S Enteritidis y S Newport (Dunkley et
Antecedentes
26
al 2009) En Meacutexico los serotipos de Salmonella spp identificados con mayor frecuencia
en los servicios de salud fueron S Typhimurium (204) y S Enteritidis (183) (Guenther
et al 2009)
La salmonelosis se produce por la ingestioacuten de alimentos o bebidas contaminados por
Salmonella se manifiesta como una enterocolitis aguda y se caracteriza por presentar
siacutendromes febriles asociados a manifestaciones gastrointestinales o sisteacutemicas con
frecuencia severas (Figueroa y Verdugo 2005 Fernaacutendez 2008) El cuadro cliacutenico se
localiza baacutesicamente en el iacuteleo terminal y el intestino grueso La enfermedad se manifiesta
a traveacutes de diferentes fases En la primera fase la infeccioacuten se limita a la mucosa intestinal
en la siguiente la bacteria invade el tejido linfaacutetico local y le sigue una fase de bacteriemia
durante la cual la mayoriacutea de las bacterias son fagocitadas por macroacutefagos del hiacutegado y el
bazo (Calva et al 2006 Bettini et al 2012)
Con frecuencia el meacutedico hace un diagnoacutestico basaacutendose en el cuadro cliacutenico del
paciente pero sin contar con los estudios microbioloacutegicos necesarios para establecer un
diagnoacutestico certero cuando se presenta infeccioacuten por Salmonella inicia una fase de
crecimiento bacteriano intracelular el cual despueacutes de varios diacuteas provoca la liberacioacuten de
gran cantidad de patoacutegenos al torrente sanguiacuteneo (Zaidi et al 2006)
La salmonelosis es una enfermedad aguda de distribucioacuten mundial Afecta a todos los
grupos de edad con mayor incidencia en los extremos de la vida provocando infecciones
en forma endeacutemica o en brotes epideacutemicos de intoxicacioacuten alimentaria que en ocasiones
abarcan amplias zonas geograacuteficas debido a las extensas cadenas de distribucioacuten de
alimentos existentes hoy en diacutea (Fernaacutendez 2008)
Para la salud puacuteblica la salmonelosis tiene un impacto socioeconoacutemico tanto en los paiacuteses
en desarrollo como en los paiacuteses desarrollados Ademaacutes al no recibir tratamiento puede
ser causante del siacutendrome de Reiter el cual se manifiesta por dolor en articulaciones
irritacioacuten en los ojos dolor al orinar y puede durar meses o antildeos desencadenaacutendose una
artritis croacutenica (CFSPH 2005) Desde la deacutecada de los ochenta la incidencia de
salmonelosis de origen alimentario ha aumentado considerablemente en Meacutexico Este
incremento es resultado de una combinacioacuten de factores como la calidad del agua utilizada
para riego y el manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los alimentos (Zaidi
et al 2006)
Antecedentes
27
Un meta-anaacutelisis (revisioacuten sistemaacutetica en la cual se combinan matemaacuteticamente los
resultados de varios estudios para contestar una misma pregunta) realizado recientemente
confirma que Salmonella resiste a antibioacuteticos empleados en los alimentos de origen animal
ya que pueden estar contaminados con este microorganismo es resistente a 3 antibioacuteticos
como la amoxicilina las sulfonamidas y las tetraciclinas ya que son ampliamente usados en
produccioacuten animal (Ejo et al 2016)
B53 Manifestaciones cliacutenicas
El cuadro cliacutenico normalmente es de 2 a 5 diacuteas aunque en ocasiones persiste varias
semanas La gravedad de los siacutentomas variacutea considerablemente siendo mayor en nintildeos y
ancianos Si el microorganismo pasa desde el intestino a la corriente sanguiacutenea y llega a
otras partes del cuerpo puede ocasionar la muerte si la persona afectada no es tratada
raacutepidamente La mayoriacutea de las muertes causadas por esta bacteria han ocurrido entre
ancianos que viven en residencias La tasa de mortalidad es baja inferior a 1 en paiacuteses
desarrollados pero suelen producirse de 40-50 muertes al antildeo especialmente entre nintildeos
ancianos o personas inmunodeprimidas Las excretas de los enfermos contienen gran
cantidad de la especie de Salmonella implicada al comienzo de la enfermedad la cifra inicial
decrece seguacuten transcurre el tiempo (DeWaal y Barlow 2014)
El estado de portador se refiere a la condicioacuten en que las personas curadas pueden
eliminar Salmonella en sus heces durante meses La mitad de los individuos afectados
excretan este patoacutegeno de 2-4 semanas posteriores a su curacioacuten cliacutenica entre 10 y 20
continuacutean durante 4-8 semanas unos pocos durante 3 meses y en raras ocasiones se
prolonga hasta 6 meses El microorganismo puede eliminarse tambieacuten por la orina La dosis
infectante capaz de desencadenar la salmonelosis humana es alrededor de 1times105 UFCmL
dependiendo de factores como tipo de alimento virulencia de la cepa involucrada y
susceptibilidad del individuo Entre las especies altamente virales se encuentran la S Dublin
y sobre todo S Enteritidis (Callaway et al 2008)
El incremento del serotipo de S Enteritidis en los casos de salmonelosis humana al
contrario de otras del geacutenero Salmonella representa un importante problema de salud
puacuteblica en muchos paiacuteses ya que este serotipo infecta a gallinas aparentemente sanas que
posteriormente transmiten las enfermedades al hombre Si se consumen huevos crudos o
Antecedentes
28
poco cocidos el microorganismo podriacutea causar la enfermedad El nuacutemero de casos de
salmonelosis se incrementa durante el verano (Parra et al 2002 Callaway et al 2008
Fernaacutendez 2008)
B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis
Gran parte de las salmonelosis se deben al consumo de alimentos de origen animal
(carnes de abasto pollo mariscos pescado leche y huevos asiacute como ovoproductos y
productos laacutecteos no pasteurizados) o de origen vegetal que se contaminan con productos
en malas condiciones de salubridad o mal manipulados Muchos alimentos sobre todo los
de origen animal o contaminados con aguas residuales han servido como vehiacuteculos en
brotes de salmonelosis La carne de matadero estaacute contaminada habitualmente con
Salmonella su incidencia es mayor en las canales de ganado y otros animales debido por
ejemplo a la contaminacioacuten por el contenido intestinal de la res viva cuyas heces manchan
su piel pelo y patas al llegar al matadero Las canales de cerdo se contaminan durante las
operaciones de escaldado y pelado La contaminacioacuten entre las mismas canales y de eacutestas
a utensilios superficies de trabajo y manos de los que las manipulan es faacutecil Otro de los
principales reservorios de Salmonella es la carne de aves de corral La contaminacioacuten de las
canales de pollo y otras aves procede igualmente del tracto intestinal o del material fecal
de los animales que manchan sus patas y plumas Las etapas criacuteticas de la contaminacioacuten
de las canales aviares estaacuten en el desplumado y la evisceracioacuten tambieacuten es comuacuten la
contaminacioacuten cruzada a traveacutes de las manos de los operarios equipo y utensilios utilizados
en la preparacioacuten y troceado de las canales (Marcus et al 2004)
Son raras las salmonelosis adquiridas directamente de carnes bien cocinadas la mayoriacutea
de los brotes se deben a una coccioacuten insuficiente o por contaminacioacuten posterior a su
preparacioacuten Las carnes elaboradas mediante fermentacioacuten (salami chorizo y salchichoacuten)
pueden ser causa de brotes de salmonelosis teniendo en cuenta que las especies que
integran este geacutenero pueden sobrevivir al proceso de fermentacioacuten (Forsythe y Hayes
2002)
Como se mencionoacute anteriormente otro alimento que se asocia con frecuencia a
Salmonella es el huevo La contaminacioacuten se produce por dos viacuteas a traveacutes de la caacutescara
contaminada y por viacutea transovaacuterica en aves infectadas (gallina pata pava) En el primer
caso la superficie de la caacutescara se contamina siempre a su paso por la cloaca o cuando el
Antecedentes
29
huevo estaacute en un ambiente fecal los huevos rotos o manchados constituyen un peligro en
la propagacioacuten de especies de Salmonella (EFSA 2014)
La contaminacioacuten partiendo de la caacutescara se produce si eacutesta mantiene un grado de
humedad apropiado y existe una temperatura diferencial significativa entre el contenido del
huevo y el ambiente La diferencia de temperaturas entre el huevo maacutes elevada y el
ambiente favorece la absorcioacuten de los microorganismos como Salmonella Tambieacuten se
transmite sobre la caacutescara por contaminacioacuten cruzada a traveacutes de los manipuladores que
han tenido contacto con superficies infectadas durante el transporte y almacenamiento de
los mismos en lugares con precarias condiciones de higiene (Ejo et al 2016) Salmonella
es causal de graves enfermedades que son trasmitidas por productos derivados de huevo
contaminado y la asociacioacuten entre la infeccioacuten del tracto reproductivo de los pollos fue un
fuerte incentivo para desarrollar programas de prevencioacuten (Jawale y Lee 2014)
La leche cruda puede albergar Salmonella y ser causa de brotes de salmonelosis se
contamina a traveacutes del pezoacuten y por las manos del ordentildeador la pasteurizacioacuten elimina la
presencia de la bacteria Entre los productos laacutecteos se han identificado como causa de
brotes de salmonelosis la leche en polvo el queso los helados y maacutes raramente la
mantequilla todos ellos por fallos en su elaboracioacuten Salmonella se destruye o inactiva
durante la fermentacioacuten de alta acidez como el yogur y el queso de pH inferior a 45 En el
caso del queso poco aacutecido (pH superior a 49) la Salmonella puede desarrollarse en
cualquier etapa de su elaboracioacuten (Mastroeni y Maskell 2006)
Entre las verduras cualquiera puede contener Salmonella cuando se cultivan con aguas
residuales contaminadas o son fertilizadas con abonos de origen animal Algunos vegetales
como los berros han sido causa de brotes de salmonelosis Por otro lado los mariscos se
contaminan con Salmonella cuando se criacutean en aguas residuales contaminadas por lo que
han sido la causa de numerosos brotes en todo el mundo la depuracioacuten es la medida
preventiva adecuada Diferentes alimentos se han identificado como portadores de
Salmonella entre ellos coco cebada harina de cereales pimienta blanca y negra pasta
cacao en polvo y chocolate (Fernaacutendez 2008) La FDA (2017) reportoacute el aumento de las
pruebas de las cuales ha identificado papayas de dos granjas que resultaron positivas para
las cepas de Salmonella que coinciden con enfermedades no relacionadas con este brote
Antecedentes
30
C Crecimiento microbiano
El crecimiento microbiano puede definirse como un incremento en los constituyentes
celulares que ocasiona un aumento del nuacutemero de ceacutelulas de los microorganismos que se
multiplican por gemacioacuten y fisioacuten binaria En el uacuteltimo caso las ceacutelulas individuales se
agrandan y dividen para originar dos ceacutelulas hijas de un tamantildeo aproximadamente igual
(Atlas y Bartha 2002)
C1 Crecimiento de los microorganismos
Todos los mamiacuteferos incluyendo los seres humanos se adaptan a la vida del mundo
microbiano Louis Pasteur Robert Koch Eacutelie Metchnikoff y Theodor Escherich entre otros
investigadores sentaron las bases conceptuales sobre las interacciones microbio-hueacutesped
Pasteur postuloacute que los microbios eran necesarios para la vida humana y Metchnikoff afirmoacute
que la composicioacuten de la flora microbiana era esencial para el bienestar del hueacutesped
Igualmente Escherich estaba convencido de que el conocimiento preciso de la flora
endoacutegena era esencial no soacutelo para la comprensioacuten de la fisiologiacutea de la digestioacuten sino para
la comprensioacuten de la patologiacutea y terapia de enfermedades microbianas intestinales A pesar
de estas primeras ideas soacutelo recientemente los cientiacuteficos han desarrollado meacutetodos que
permiten caracterizar directamente los mecanismos moleculares que subyacen a la creacioacuten
y mantenimiento de diversos ecosistemas microbianos (Falk et al1998)
El crecimiento de una poblacioacuten bacteriana resulta de la suma de ciclos celulares de todos
sus individuos y suele ser asincroacutenico puesto que cada microorganismo se encuentra en un
punto diferente del ciclo celular Por consiguiente en un momento determinado en una
poblacioacuten se encuentran ceacutelulas que acaban de dividirse otras estaacuten replicando su ADN y
elongaacutendose y otras estaacuten iniciando la divisioacuten celular (Melbinger et al 2015)
El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza en la mayoriacutea de los
casos mediante la produccioacuten de colonias aisladas en cultivos soacutelidos El crecimiento
explosivo de las bacterias produce un gran nuacutemero a partir de una uacutenica ceacutelula inicial de
forma que tras un periacuteodo de tiempo de incubacioacuten en las condiciones ambientales
adecuadas se produce una colonia de individuos iguales Para que un microorganismo
crezca necesita nutrientes que le aporten energiacutea y elementos quiacutemicos para la siacutentesis de
sus constituyentes celulares De acuerdo a la fuente de carbono que utilizan los
Antecedentes
31
microorganismos se clasifican en autoacutetrofos si es el CO2 atmosfeacuterico (microorganismos que
fotosintetizan) y heteroacutetrofos si utilizan carbono orgaacutenico (Ouyang y Li 2013)
C11 Disponibilidad del agua
El agua es un factor importante para el crecimiento microbiano se requiere para crecer y
llevar a cabo las funciones metaboacutelicas de lo contrario los microorganismos se deshidratan
o mueren La aw depende de la concentracioacuten de solutos y de la cantidad de agua disponible
en el medio ambiente La mayoriacutea de las bacterias y hongos necesitan valores entre 098 y
0995 de aw para su pleno desarrollo (Madigan y Martinko 2006)
Una membrana plasmaacutetica permanentemente selectiva separa el contenido
citoplasmaacutetico del microorganismo de su ambiente por ello las alteraciones en la
concentracioacuten osmoacutetica del medio extracelular pueden afectar incluso la viabilidad de los
mismos Si se coloca un microorganismo en una solucioacuten isotoacutenica el agua entraraacute en la
ceacutelula y causaraacute su estallido salvo que la propia ceacutelula desarrolle alguna estrategia para
evitarlo por ejemplo reducir la concentracioacuten osmoacutetica del citoplasma gracias a los cuerpos
de inclusioacuten Los procariotas tambieacuten pueden contener canales sensibles a la presioacuten
osmoacutetica que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno
se vuelve maacutes baja que la del citoplasma (Madigan y Martinko 2006)
C12 Acidez y pH
El pH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad entre 5 y 8 para impedir la
destruccioacuten de las macromoleacuteculas haacutebiles en condiciones aacutecidas o alcalinas Los aacutecidos
fuertes (inorgaacutenicos) y los aacutecidos deacutebiles (orgaacutenicos) disminuyen el pH externo
posteriormente se disocian en el interior de la ceacutelula inhibiendo la actividad enzimaacutetica y el
transporte de nutrientes por lo tanto los microorganismos no pueden generar energiacutea de
almacenamiento y ocurre la muerte celular (Brooks et al1992)
C13 Oxiacutegeno
El oxiacutegeno molecular (O2) influye en el metabolismo de los microorganismos Durante el
Antecedentes
32
proceso de reduccioacuten del O2 se crean formas reactivas como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2)
superoacutexidos (O2-) y radicales hidroxilos (OH-) que producen dantildeo celular por la oxidacioacuten
de compuestos orgaacutenicos e incluso macromoleacuteculas (Prescott et al1999)
C14 Temperatura
La temperatura afecta el desarrollo y la supervivencia de los microorganismos En bajas
temperaturas la velocidad de crecimiento de algunos microorganismos disminuye y los
periacuteodos de latencia se alargan Por otro lado las temperaturas elevadas aceleran las
reacciones enzimaacuteticas (antes de los 40degC) pero si se intensifica el calor en algunos casos
provocan la desnaturalizacioacuten de las proteiacutenas y por consiguiente la lisis celular (Brooks et
al1992)
Es importante considerar que cada microorganismo tiene una temperatura de desarrollo
adecuada a mayor temperatura se produce un incremento lineal de la velocidad de
crecimiento hasta alcanzar el clima perfecto a velocidad maacutexima Por encima de esta
temperatura oacuteptima la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte
celular (Atlas y Bartha 2002) En la tabla 3 se presentan algunas condiciones ambientales
para el desarrollo de los microorganismos
Antecedentes
33
Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales (Lu et al 2006 Madigan et al 2006 Falk et al 2009)
Factor Tipo de
microorganismo Caracteriacutesticas Microorganismo representativo
NaCI
Osmotolerante Capaz de crecer en un amplio rango de aw o
presioacuten osmoacutetica St aureus Saccharomyces rouxii
Haloacutefilo Requiere altas concentraciones de NaCl para
crecer normalmente por encima de 02 M Halobacterium Dunaliella Ectohiorhodospira
pH
Acidoacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 0 y 55 Sulfolobus Picrophilus Ferroplasma Acontium
Cyanidium caldarium
Neutroacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 55 y 80 Euglena Paramecium
Alcaloacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 85 y 1 15 Badilas alcalophilus NaIronobaciacuteerium
Temperatu
ra
Psicroacutefilo Crece bien a 0degC temperatura oacuteptima de 15degC
o inferior Badilas psychrophilus Chlamydomonas nivalis
Psicroacutetrofo Puede crecer a 0-7degC oacuteptima de 20 a 30degC Listeria monocytogenes
Mesoacutefilo Temperatura maacutexima de 35degC
Temperatura oacuteptima alrededor de 20-45degC
P fluorescens E coli Neisseria gonorrhoeae
Trichomonas vaginalis
Termoacutefilo Puede crecer a 55degC o superior temperatura
oacuteptima a menudo entre 55 y 65degC
Geobacillus stearothermophilus Thermus
aquaticus Cyanidium caldarium
Hipertermoacutefilo Temperatura oacuteptima entre 80 y 113degC Chaetomium thermophile Sulfolobus
Atmoacutesfera
Aerobio obligado Completamente dependiente del O2 para
crecer Pseudomonas Mycobacterium tuberculosis
Anaerobio
facultativo
No requiere O2 pero crece mejor en su
presencia
M luteus St aureus
Streptococcus pneumoniae L monocytogenes
Anaerobio
aerotolerante Crece bien en presencia o en ausencia de O2 Lactobacillus
Anaerobio
obligado No tolera el O2 y muere en su presencia Clostridium botulinum C perfringens
Microaeroacutefilo
Requiere nivel de O2 inferior a 2-10 para
crecer y es dantildeado por el O2 (20) C fetus
Antecedentes
34
D Control del crecimiento microbiano
Los microorganismos toleran determinados factores ambientales Asiacute unas bacterias
pueden tener condiciones para su desarrollo y estas condiciones pueden ser nocivas para una
especie bacteriana El crecimiento de una poblacioacuten microbiana se estudia analizando la curva
de crecimiento de un cultivo La curva del crecimiento microbiano representa la evolucioacuten del
nuacutemero de nuacutemero de ceacutelulas viables presente en un cultivo microbiano liacutequido a lo largo del
tiempo de estudio Se estudia el nuacutemero de ceacutelulas viables por mililitro de un cultivo de
volumen limitado y con una cantidad de nutrientes limitada como por ejemplo un medio de
cultivo liacutequido en un matraz que ha sido inoculado con una cantidad inicial de microorganismos
o inoacuteculo (Hunter-Cevera y Belt 1996) Para llevar a cabo estos estudios se distingue tres
niveles entre los modelos de microbiologiacutea predictiva los que describen los cambios en el
nuacutemero de microorganismos con respecto al tiempo con respecto al efecto de las condiciones
ambientales y los que combinan los dos aspectos anteriores (Larcher y Cattaneo 2006)
Se considera el crecimiento de las bacterias en funcioacuten de su fondo geneacutetico en relacioacuten
con los nutrientes y en unas hipoteacuteticas condiciones ideales (oacuteptimas) Sin embargo el trabajo
experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales es decir
una serie de agentes fiacutesicos y quiacutemicos El anaacutelisis de la curva de crecimiento bacteriano es
muy importante para determinar el potencial de una teacutecnica de control especiacutefica Al igual que
las bacterias los fagos al forman una interaccioacuten con su bacteria hueacutesped se necesita
determinar una cuantificacioacuten del nuacutemero de copias que se generan por la infeccioacuten a esta
condicioacuten se le conoce como fase de eclipse siendo el momento idoacuteneo para realizar la
infeccioacuten fago-bacteria (Lee et al 2016)
D1 Agentes fiacutesicos
La temperatura es uno de los paraacutemetros ambientales maacutes importantes que condicionan el
crecimiento y la supervivencia de los microorganismos La temperatura afecta a la velocidad
de crecimiento y por lo tanto al tiempo de generacioacuten Cada bacteria es diferente y esto se
puede observar en una curva de tasa de crecimiento en funcioacuten de la temperatura Si se suele
utilizar calor en combinacioacuten con otros agentes fiacutesicos (filtracioacuten presioacuten y radiacioacuten) Al
aplicar temperaturas altas se refleja desnaturalizacioacuten e inactivacioacuten de proteiacutenas enzimaacuteticas
esenciales colapsamiento de la membrana citoplaacutesmica y a veces lisis teacutermica de la bacteria
Antecedentes
35
esta condicioacuten se presenta raacutepidamente cuando se aplica presioacuten la cual se utiliza para
esterilizar objetos como lo demuestra el uso universal de la autoclave en todos los
laboratorios de microbiologiacutea (Madigan y Martinko 2006) El calor es auacuten uno de los meacutetodos
maacutes comunes para destruir microorganismos se puede aplicar huacutemedo o seco (Salgado-Nava
y Jimeacutenez-Munguiacutea 2012) Por otro lado ademaacutes de aplicar calor si a las bacterias se le
extrae el calor del medio de manera intensa recurrir a la congelacioacuten con fines de conservacioacuten
de microorganismos por largos periacuteodos si se realiza apropiadamente numerosos
laboratorios disponen de congeladores a -30 o -70degC para la conservacioacuten de colecciones de
cultivos microbianos (Shafiei et al 2014)
D2 Agentes quiacutemicos
Aunque los objetos se desinfectan a veces con agentes fiacutesicos tambieacuten las sustancias
quiacutemicas se utilizan con mucha frecuencia por ejemplo los quimioteraacutepicos son sustancias
con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostaacutetica) En estas sustancias se busca
que sea efectivo contra un amplio espectro de microorganismos Pero no existe (hasta estos
momentos) un solo agente capaz de inhibir a todos los microorganismos Por otro lado existen
quimioteraacutepicos de espectro estrecho pero muy selectivos contra ciertas bacterias que son
patoacutegenas importantes Muchos factores influyen en la eficacia de los desinfectantes hay que
considerar la cepa de microorganismos presentes la concentracioacuten y naturaleza del
desinfectante y la duracioacuten del tratamiento Asimismo es imprescindible que las superficies
sucias se limpien antes de aplicar un desinfectante El uso apropiado de los agentes quiacutemicos
es esencial para la seguridad en los laboratorios y hospitales estos mismos productos se
utilizan tambieacuten para evitar el crecimiento microbiano en los alimentos (Prescott et al 1999)
E Fagos
E1 Antecedentes
Los virus son agentes infecciosos submicroscoacutepicos que pueden replicarse
independientemente de los cromosomas de una ceacutelula pero no independientemente de ella
A fin de multiplicarse deben penetrar la ceacutelula donde puedan replicarse a la cual se le
denomina hueacutesped Presentan una forma infecciosa madura que es tiacutepicamente extracelular
Antecedentes
36
Pueden infectar a diferentes seres vivos por lo que existen virus de animales de plantas y
de forma particular los llamados virus bacterianos o fagos (Madigan y Martinko 2006)
Los bacterioacutefagos o fagos (del griego φαγετον paguumlento ldquoalimentoingestioacutenrdquo) son agentes
virales de las bacterias su descubrimiento se atribuye por un lado al bacterioacutelogo ingleacutes F
W Twort que en 1915 mencionoacute el aclaramiento de un cultivo soacutelido de Micrococcus
provocado por un agente desconocido Por otro lado en 1917 el francocanadiense F
dHerelle descubrioacute un grupo de entidades bioloacutegicas en medios de cultivo que se propagaban
a expensas de las bacterias a los cuales les denominoacute fagos y dentro de sus investigaciones
definioacute su potencial uso e importancia cliacutenica Esto se refuerza a partir de 1940 con el
desarrollo del microscopio electroacutenico con el que se demuestra la naturaleza viral de los fagos
y que la forma de estudiarlos es mediante procedimientos microbioloacutegicos convencionales
facilitando su manejo y estudio (Grabow 2001)
La uacuteltima variedad de fagos se descubrioacute durante la Primera Guerra Mundial los tipos ya
conocidos eran los virus que afectaban a vegetales y animales fue entonces que se pensoacute
en que su aplicacioacuten para eliminar bacterias podriacutea ser utilizada para la prevencioacuten y el
tratamiento de enfermedades bacterianas pero no resultoacute (Merril et al 1996) Sin embargo
los fagos resultaron tener otros beneficios especialmente como modelos o sustitutos de los
virus en humanos en la investigacioacuten geneacutetica baacutesica asiacute como en la evaluacioacuten de la calidad
del agua Ademaacutes demostraron ser una herramienta valiosa en la mayoriacutea de las
investigaciones sobre los virus ya que en comparacioacuten con los humanos animales vegetales
e incluso los insectos anfitriones de otros virus los fagos son faacutecil y raacutepidamente reproducibles
en el laboratorio y no son particularmente exigentes con respecto al espacio instalaciones y
equipos El trabajar con fagos requiere la separacioacuten y purificacioacuten y las dos principales tareas
para realizar esto es utilizar meacutetodos quiacutemicos en los cuales se utilizan solutos como buffer
glicerol bromuro de potasio cloruro de cesio y tartrato de potasio aunque el maacutes comuacuten es
la sacarosa ademaacutes involucra la precipitacioacuten con sulfato de amonio polietilenglicol o cloruro
de cesio y los meacutetodos fiacutesicos que implican la centrifugacioacuten a diferentes velocidades y
gradientes de densidad y con menor frecuencia la cromatografiacutea de particioacuten (Sambrook y
Russell 2001)
La investigacioacuten sobre las propiedades baacutesicas de los fagos se desarrolla en la biologiacutea
molecular que permitioacute avances sin precedentes en toda la biologiacutea y ciencias meacutedicas La
Antecedentes
37
concentracioacuten y purificacioacuten es un factor determinante para llevar a cabo la infeccioacuten
eficientemente sin embargo existe un periacuteodo de adaptacioacuten por parte de los fagos antes
que se desarrollen y se logren tiacutetulos apreciables en ceacutelulas cultivadas (Sambrook y Russell
2001 Breeuwer et al 2003)
E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos
Los virus son paraacutesitos intracelulares obligados no tienen metabolismo intriacutenseco y
requieren la maquinaria metaboacutelica codificada por los cromosomas de ceacutelula que puedan
infectar y reproducirse en ella denominada hueacutesped Su tamantildeo oscila entre 20 y 200 nm y
consiste de un nuacutecleo de aacutecido nucleico (ARN o ADN de cadena simple o doble) rodeado por
una cubierta proteica (caacutepside) y en algunos casos una cubierta de liacutepidos Los microbioacutelogos
que investigan la presencia de virus en haacutebitats marinos y han detectado su presencia creen
que son diez veces maacutes numerosos que las bacterias marinas En la superficie de los mares
se encuentran entre 106 y 109 partiacuteculas viacutericas por mililitro y se estima que en la capa
superficial (1 mm) de los oceacuteanos se encuentran unas 3 x 1030 partiacuteculas viacutericas (Grabow
2001 Atterbury et al 2003)
E3 Clasificacioacuten de los fagos
Las variaciones en los fagos se presentan en forma estructural como apeacutendices en la
cabeza cuello y las fibras de la cola o espigas ademaacutes del genoma que variacutea en cada orden
En 1962 Andreacute Lwoff junto a otros investigadores propuso una clasificacioacuten basada en la
morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico Los nombraron de la siguiente manera los urovirales
que presentaban cola pronunciada los inoviridae eran los filamentosos y los microviridae los
tipo φX Posteriormente Bradley (1967) consideroacute la morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico y
agrupoacute a los fagos en seis morfotipos baacutesicos denominados de la A a la F posteriormente se
clasifico en fagos baacutesicos los de cola los filamentosos y los icosaeacutedricos con ADN de cadena
sencilla o RNA de cadena simple Los fagos han sido investigados debido a su rol como
agentes de biocontrol para el desarrollo de la seguridad alimentaria En el presente varios
miles de fagos en contra de varios objetivos han sido aislados de varios entornos y alimentos
Aproximadamente el 96 de los fagos aislados eran con cola y del tipo liacuteticos en una de las
Antecedentes
38
tres familias Myoviridae (245) Siphoviridae (61) y Podoviridae (14) en el orden de los
caudovirales (Atterbury et al 2003 Oh y Park 2017)
En 1971 el Comiteacute Internacional de Taxonomiacutea de Virus (ICTV por sus siglas en ingleacutes)
clasificoacute en 6 geacuteneros de los cuales 5 corresponden a la clasificacioacuten propuesta por Bradley
los grupos T4 λ φX174 MS2 y fd Los fagos pueden tener cola larga y flexible no contraacutectil
(Siphoviridae) cola larga y contraacutectil (Myoviridae) o cola corta (Podoviridae) como se observa
en la tabla 4 Para la clasificacioacuten de los fagos se aplican propiedades como el rango de
hueacutespedes y las relaciones inmunoloacutegicas sin embargo las maacutes importantes son su
morfologiacutea y las caracteriacutesticas de su aacutecido nucleico el cual se adsorbe a componentes de la
superficie celular que actuacutean como receptores especiacuteficos La zona de adsorcioacuten del virus es
complementaria al receptor celular por lo tanto un determinado fago soacutelo puede infectar un
nuacutemero limitado de cepas celulares que contengan a un determinado receptor La naturaleza
de la zona de adsorcioacuten variacutea con el tipo de fago En el T4 se localiza en el extremo de la cola
en donde se encuentran la placa basal las espiacuteculas y las fibras de la cola Las formas maacutes
complejas corresponden a los fagos con colas contraacutectiles (Atterbury et al 2003)
Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos
(Ackermann 2003)
Antecedentes
39
E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico
La multiplicacioacuten de los fagos (figura 4) ADN produce la destruccioacuten de la ceacutelula hueacutesped
mediante lisis lo que provoca su liberacioacuten El ciclo vital de un fago que culmina con el
estallido de la ceacutelula hueacutesped y la liberacioacuten de viriones recibe el nombre de ciclo liacutetico Los
acontecimientos que tienen lugar durante el ciclo liacutetico se revisaraacuten en esta seccioacuten con
especial atencioacuten a los fagos T-par de E coli Estos son fagos de ADN bicatenario con colas
contraacutectiles complejas de la familia Myoviridae son algunos de los virus maacutes complejos
conocidos (Fernaacutendez 2008)
Figura 4 Adsorcioacuten del fago T4 e inyeccioacuten del ADN (Leverentz et al 2003)
Los fagos podriacutean infectar hasta un 70 de la poblacioacuten de procariotas marinos y ser
responsables de la tercera parte de la mortalidad bacteriana acuaacutetica Tambieacuten se han
detectado virus que infectan diatomeas y otras algas importantes del fitoplancton marino lo
cual es de gran transcendencia ecoloacutegica ya que la multiplicacioacuten de bacterias marinas
supera la capacidad de reproduccioacuten de los protozoos La lisis por virus de ceacutelulas procariotas
y de algas puede tambieacuten contribuir enormemente en los ciclos del carbono y nitroacutegeno en las
cadenas troacuteficas marinas incluso podriacutea reducir el nivel de productividad marina como la de
moluscos y peces (Muniesa et al 2005)
E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten
Los fagos no se unen al azar a la superficie de una ceacutelula hueacutesped por el contrario se fijan
a receptores especiacuteficos La naturaleza de estos receptores variacutea de acuerdo al fago pueden
Antecedentes
40
ser lipopolisacaacuteridos y proteiacutenas de la pared celular aacutecidos teicoicos flagelos y pili Los fagos
T-par de E coli en particular utilizan lipopolisacaacuteridos o proteiacutenas de la pared celular como
receptores Las variaciones en las propiedades del receptor son parcialmente responsables
de las preferencias del fagos por el hueacutesped (Muniesa et al 2005 Leeuw et al 2017)
La adsorcioacuten de fagos T-par estaacute relacionada con diversas estructuras del tallo La fijacioacuten
del fago comienza cuando una fibra del tallo establece contacto con los receptores adecuados
a medida que maacutes fibras contactan con los receptores la placa basal se asienta en la
superficie La unioacuten se debe probablemente a interacciones electrostaacuteticas y se ve influida por
el pH y por la presencia de iones como Mg+2 y Ca+2 Una vez que la placa basal estaacute
firmemente asentada en la superficie celular se producen cambios conformacionales en ella
y en la vaina del tallo Esta uacuteltima se reorganiza de tal forma que se contrae pasando de una
conformacioacuten en cilindro de 24 anillos a otra de 12 anillos de longitud maacutes corta y ancha es
entonces cuando el tubo central es empujado a traveacutes de la pared celular bacteriana
Finalmente el ADN es extruido de la cabeza pasa a traveacutes del tubo del tallo y penetra en la
ceacutelula hueacutesped Parece ser que el tubo interacciona con la membrana plasmaacutetica para formar
un poro a traveacutes del cual pasa el ADN los mecanismos de penetracioacuten de otros fagos difieren
a menudo de los fagos T-par aunque no se han estudiado en detalle (Leverentz et al 2003)
F Biofilm
Las bacterias existen en la naturaleza bajo dos formas o estados a) bacterias planctoacutenicas
de libre flotacioacuten y b) bacterias biofilm en colonias de microorganismos seacutesiles (Nazar 2007)
Un biofilm se define como una agrupacioacuten de comunidades seacutesiles microbianas que se fijan a
superficies las ceacutelulas estaacuten incrustadas en una matriz autoproducida que actuacutea como
proteccioacuten quiacutemica y mecaacutenica del entorno asiacute estas bacterias presentan mayor resistencia
a desinfectantes y el secado (Vestby et al 2009) Las bacterias pueden crear condiciones
para formar biofilms casi en cualquier ambiente liacutequido La interfase soacutelido-liacutequido entre una
superficie y un medio acuoso (vgr leche) proporciona un entorno ideal para la fijacioacuten y
crecimiento de microorganismos (Fakruddin et al 2014)
Antecedentes
41
G Microscopiacutea electroacutenica
Los microscopios electroacutenicos se usan habitualmente para el estudio detallado de
estructuras celulares (Bradley 1967) Para analizar las estructuras internas es esencial el
microscopio electroacutenico de transmisioacuten MET En el MET se utilizan electrones en lugar de rayo
de luz las lentes son electromagneacuteticas y se opera en todo momento a alto vaciacuteo
(Ackermann 2003) El poder de resolucioacuten del microscopio electroacutenico es mucho mayor que
el del microscopio oacuteptico incluso pueden observarse estructuras moleculares como proteiacutenas
y aacutecidos nucleicos Sin embargo los haces de electrones tienen escaso poder de penetracioacuten
y una ceacutelula aislada es demasiado gruesa para poder visualizarse directamente por este
motivo se emplean teacutecnicas especiales para la obtencioacuten de cortes ultrafinos a fin de poder
observar las muestras Una ceacutelula bacteriana por ejemplo se corta con una cuchilla especial
en varios cortes ultrafinos de 20-60 nm de espesor que son posteriormente examinados de
manera individual en el microscopio electroacutenico (Fuster-Valls et al 2008) Para obtener
suficiente contraste las preparaciones se tintildeen previamente mediante tratamiento con
compuestos como aacutecido oacutesmico permanganato sales de uranilo o de lantano o plomo Como
estas sustancias poseen aacutetomos pesados son capaces de desviar los electrones y aumentar
el contraste (Madigan y Martinko 2006)
La microscopiacutea electroacutenica es el mejor meacutetodo para estudiar la forma de las bacterias Los
virus bacterianos por tener un diaacutemetro menor de 1000 Aring estaacuten por debajo del liacutemite de
resolucioacuten del microscopio oacuteptico sin embargo es posible observarlos mediante el
microscopio electroacutenico porque eacuteste utiliza una radiacioacuten de longitud de onda maacutes corta que
permite aumentar 100 mil veces una resolucioacuten de 10 Aring (Kruger et al 2000 Ackermann
2003) Para observar detenidamente la morfologiacutea se requiere el microscopio electroacutenico con
especificaciones precisas como el de barrido lo cual es una herramienta indispensable en
biologia molecular (Guzmaacuten 2015)
Para la observacioacuten las partiacuteculas se suspenden en un medio volaacutetil por lo general una
solucioacuten de acetato de amonio y se colocan sobre una membrana sostenida por una rejilla
metaacutelica que praacutecticamente no absorbe electrones El problema teacutecnico maacutes frecuente es la
falta de contraste como la imagen obtenida es el resultado de la dispersioacuten de electrones por
los aacutetomos de la partiacutecula se necesita una diferencia apreciable de poder dispersivo entre las
partiacuteculas y el medio de soporte generalmente se emplean teacutecnicas tradicionales La maacutes
utilizada se conoce como tincioacuten negativa consiste en mezclar la suspensioacuten del fago con
Antecedentes
42
fosfovolframato de sodio o acetato de uranilo a pH neutro A este pH las sales no se combinan
con el fago al secarse forman una capa uniforme y opaca a los electrones en la cual los fagos
destacan como partiacuteculas maacutes claras Como las sales en solucioacuten penetran las irregularidades
en la superficie de la partiacutecula la micrografiacutea revela los detalles finos de los fagos (Fuster-
Valls et al 2008 Montantildeez et al 2012)
La forma del fago se establece de manera visual que es directa de la placa cuando las
UFP que se observan a simple vista como placas liacuteticas a contraluz (APHA 2005) Y para
estudiar la adhesioacuten y formacioacuten celular en diversas superficies se han desarrollado varias
teacutecnicas de microscopiacutea entre las cuales se distinguen la microscopiacutea electroacutenica de barrido
y de transmisioacuten asiacute como la microscopiacutea de epifluorescencia (Fuster-Valls et al 2008) la
cual se basa en los mismos principios de oacuteptica de la microscopiacutea comuacuten con diferencias en
el manejo y el disentildeo relacionadas con la generacioacuten y transmisioacuten de longitudes de onda
adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar ya sean propios de la muestra o de
la coloracioacuten utilizada (Franco 2005)
El fundamento de la teacutecnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o
compuestos fluorescentes denominados fluorocromos en fijarse a los anticuerpos mediante
un enlace quiacutemico estable que no puede romperse durante el curso de la reaccioacuten
inmunoloacutegica La espectroscopia de fluorescencia es la teacutecnica de deteccioacuten oacuteptica maacutes
sensible En el caso de la deteccioacuten en ceacutelulas se exponen a alta energiacutea utilizando laacutemparas
de xenon excitando por varios nanosegundos y asiacute emitiendo una longitud de onda de baja
energiacutea (Franz y Jendreizik 2015)
H Fagoterapia
Las enfermedades infecciosas estaacuten catalogadas entre las primeras causas de muerte en
el mundo y por lo tanto son consideradas un problema de salud puacuteblica Entre ellas las
infecciones bacterianas causan gran preocupacioacuten dado que las bacterias adquieren diacutea a
diacutea mayor resistencia a los antibioacuteticos esto ocurre por medio de diversos mecanismos
fisioloacutegicos y moleculares que les permiten a estos microorganismos adaptarse raacutepidamente
a condiciones adversas (Prada-Pentildearanda et al 2015)
El descubrimiento de los fagos por dacuteHerelle se desarrolloacute cuando eacuteste buscaba una
Antecedentes
43
vacuna que pudiera combatir la crisis de disenteriacutea hemorraacutegica que se presentoacute en 1915 en
las afueras de Francia dacuteHerelle observoacute que tras aislar lisados libres de bacterias de la
materia fecal de los enfermos las bacterias eran destruidas por un agente desconocido
invisible capaz de destruir cultivos de bacterias o producir pequentildeas aacutereas de color maacutes claro
cuando las bacterias eran crecidas en confluencia en placas de medio soacutelido y publicoacute sus
observaciones en el artiacuteculo titulado ldquoSobre un microbio invisible antagonista de los bacilos
de la disenteriacuteardquo (Szafranski et al 2017)
El uso de los fagos como agentes terapeacuteuticos comenzoacute hace maacutes de 80 antildeos Entre los
ejemplos maacutes destacados y recientes de la utilizacioacuten exitosa de la fagoterapia cabe citar el
uso de fagos especiacuteficos en el control bioloacutegico de E coli O157H7 productora de colitis
hemorraacutegica (en alimentos) Tambieacuten se ha estudiado el uso de fagos en el tratamiento de
infecciones peritoneales y otitis externa en la erradicacioacuten de P aeruginosa en pacientes con
fibrosis quiacutestica en el tratamiento de infecciones urinarias y osteomielitis por S aureus y en
la descolonizacioacuten intestinal para combatir las infecciones por Enterococcus faecium
resistente a vancomicina entre otros Los efectos favorables de la fagoterapia podriacutean
exceder incluso su actividad antibacteriana Hay datos sorprendentes acerca de la actividad
in vivo de los fagos el conocido fago T4 de E coli podriacutea inhibir la adsorcioacuten y la replicacioacuten
de adenovirus en sus ceacutelulas blanco y el fago Pf4 de P aeruginosa habriacutea sido capaz de
inhibir el desarrollo de cepas de Aspergillus por secuestro de hierro (Lopardo 2017)
El estudio y desarrollo de nuevos tratamientos alternativos es de particular intereacutes en la
lucha contra la resistencia bacteriana Los fagos presentan caracteriacutesticas que los hace una
excelente herramienta contra las bacterias patoacutegenas debido a su especificidad y seguridad
ecoloacutegica Los fagos no solo son atractivos desde un punto de vista cliacutenico Se han utilizaacutedo
como potenciales aplicaciones en otras aacutereas como la agricultura el control de alimentos o
la industria como a continuacioacuten se describe en la siguiente tabla 5 Los fagos son una
solucioacuten ecoloacutegica ubicua para desarrollar nuevos tratamientos contra las bacterias aunque
se deben realizar maacutes estudios para comprender mejor la relacioacuten entre ellos y las bacterias
antes de su aplicacioacuten (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)
Antecedentes
44
Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos la naturaleza lugares
urbanizados y cuerpo humano (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)
Fuente Sitio encontrado
Naturaleza
Suelo y superficie terrestre
Agua continental y oceaacutenica
Ambientes extremos hielo marino pared de
algas zonas hipersalinas etc
Lugares artificiales
Hospitales y zonas similares
Planta de tratamiento de aguas negras
Algunas zonas bajo el impacto humano
Cuerpo de animales
Tracto digestivo y vagina
Tracto respiratorio y oral
Piel y epitelio mucoso
Los productos comerciales para terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones
Los fagos se pueden distribuir liofilizados y se disuelven antes de la administracioacuten por viacutea
intravenosa en un soporte adecuado como por ejemplo una solucioacuten acuosa o tampoacuten o
suspenderse en cualquier liacutequido adecuado coloidal o de la matriz de poliacutemeros para crear
bactericidas el principio activo se puede administrar de una manera conveniente como por
inyeccioacuten (subcutaacutenea intravenosa administracioacuten etc) por viacutea oral pulmonar (por ejemplo
aerosoles o por otros dispositivos a los pulmones) spray nasal intramuscular intraperitoneal
intrahecal intraviacutetrea vaginal rectal la puncioacuten lumbar y la aplicacioacuten directa Dependiendo
de la viacutea de administracioacuten el principio activo puede estar recubierto de un material que
preserve la sustancia de la accioacuten de enzimas aacutecidos y otras condiciones naturales que
pueden inactivar la sustancia (por ejemplo comprimidos recubiertos enteacutericos o pastillas)
Empresas dedicadas a la biotecnologiacutea se dedicaron a desarrollar productos utilizando fagos
especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan ETA la Food and Drug Administration de
los EE UU (FDA) incluye a los fagos en la categoriacutea de aditivos alimentarios la FDA ha
publicado la aprobacioacuten de seis fagos para usar en alimentos listos para comer (ready to eat)
efectivos para L monocytogenes de la compantildeiacutea Intralytix La compantildeiacutea Omnilytics ofrece
productos de control bacterial para varias aacutereas como son agricultura agua y alimentos
industrias que se pueden observar en su paacutegina web (httpswwwomnilyticscom) y otras
empresas como Biophage Pharma Inc (Canada) Exponential Biotherapies (EE UU)
(Segundo 2010)
Antecedentes
45
Estas nuevas estrategias de intervencioacuten eco-amigable son requeridas como agente de
biocontrol en contra de Salmonella Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos
antildeos debido a sus caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutef ico sin
dantildear la micro-flora en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros
distribucioacuten de esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla
algunos ejemplos de la aplicacioacuten de los fagos son los descritos en la siguiente tabla 6 (Oh y
Park 2017)
Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria (Oh y
Park 2017)
Compantildeiacutea Producto del fago Organismo hueacutesped
FINK TEC GmbH (Alemania) Secure Shield E1 E coli
Intralytix Inc
(EE UU)
Ecolicidereg (EcolicidePXtrade) E coli O157H7
EcoShieldtrade E coli O157H7
ListShieldtrade L monocytogenes
SalmoFreshtrade Salmonella spp
ShigaShieldtrade
(ShigActivetrade) Shigella spp
Micreos Food Safety
(Holanda)
PhageGuard Listextrade L monocytogenes
PhageGuard Strade Salmonella spp
E coli O157H7
Passport Food Safety Solutions
(EE UU) Finalysereg E coli O157H7
Phagelux (China)
AgriPhag
Xanthomonas campestris pv
vesicatoria Pseudomonas
syringae
pv tomato
SalmoProreg Salmonella spp
Salmonella spp
Antecedentes
46
47
III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO
48
Objetivos y plan de trabajo
49
A Objetivo general
El objetivo general de este estudio es aislar y caracterizar fagos frente Salmonella spp a
partir de diversas fuentes ambientales para su uso potencial en el control bioloacutegico
El control de Salmonella spp es de gran intereacutes para la industria alimentaria por lo que
encontrar alternativas para su eliminacioacuten es de gran impacto en la salud puacuteblica
B Objetivos especiacuteficos
1- Aislar fagos de Salmonella proveniente de muestras de aguas residuales de la ZMM y
muestras de lavado de carne pollo de un establecimiento donde se comercializa esta carne
2- Caracterizar parcialmente los fagos aislados en base a su morfologiacutea por TEM y el
anaacutelisis de sensibilidad frente a diversas cepas bacterianas
3- Estudiar el efecto de los fagos previamente aislados desarrollando un biofilm de
Salmonella spp sobre discos de acero inoxidable utilizando la DEM
C Plan de trabajo
Para alcanzar los objetivos establecidos se considera la ubicacioacuten de las fuentes para la
obtencioacuten de los fagos en este caso el medio seleccionado son riacuteos arroyos asiacute como un
establecimiento donde se procesan canales de pollo en la ZMM y las lagunas de oxidacioacuten
de aguas residuales en Mariacuten ambas localidades en Nuevo Leoacuten Meacutexico
Posteriormentese utilizaraacute la teacutecnica ADC y se verificaraacute en cual de estas muestras se
podriacutean encontrar fagos que sean liacuteticos para Salmonella enterica y posteriormente se
realizaraacuten pruebas de selectividad con la meta de caracterizar los fagos aislados frente a
diferentes hueacutesped (cepas de Salmonella spp y de E coli) y la observacioacuten de la morfologiacutea
se realizaraacute por el TEM
Salmonella spp presenta un periacuteodo de incubacioacuten por lo general entre 12 y 36 horas
tras el cual el derarrollo bacteriano en las superficies puede dar como resultado la formacioacuten
de un biofilm Para este estudio se desarrollaraacute un biofilm de Salmonella spp sobre discos
de acero inoxidable en condiciones de humedad esto es importante por la fase de eclipse
Objetivos y plan de trabajo
50
(momento en el cual atacan y se desarrollan los fagos) Se probaraacuten 3 concentraciones de
fago 6 7 y 8 UFPmL Se realizaraacuten recuentos durante un periacuteodo de incubacioacuten de 72 h
Con el fin de conseguir estos objetivos el presente trabajo se ha estructurado en tres
secciones las cuales se pueden observar en la figura 5 incluyendo las pruebas con DEM
en los discos de acero inoxidable
Figura 5 Diagrama general de trabajo
51
IV MATERIALES Y MEacuteTODOS
52
Materiales y meacutetodos
53
A Toma de muestras
Las muestras para obtencioacuten de fagos se recolectaron en diez sitios del aacuterea metropolitana
de Monterrey y del municipio de Mariacuten Nuevo Leoacuten (tabla 7) El meacutetodo que se utilizoacute para
aislar fagos de diversas fuentes medio ambientales y su posterior traslado al laboratorio fue
el descrito por Higgins et al (2005) Se obtuvieron las muestras provenientes de aguas
residuales y riacuteos se emplearon frascos de 450 mL previamente lavados y secos que
posteriormente se impregnaron con una solucioacuten de tiosulfato de sodio (Na2S2O3bull5H2O) al
10 (pv) (Sigma-Aldrich EE UU) y se esterilizaron en autoclave 121ordmC15min Al momento
de hacer la recoleccioacuten en campo los frascos fueron abiertos cuidadosamente y se llenaron
con el liacutequido se almacenaron en hieleras para su traslado al laboratorio el tiempo que
transcurrioacute desde la toma de la muestra hasta la llegada al laboratorio fue entre 1 y 3 h
posteriormente las muestras se centrifugaron el mismo diacutea y los sobrenadantes se
almacenaron 4oC hasta su uso (Vidales-Contreras et al 2006)
A cada una de las muestras obtenidas en el muestreo se le agregoacute 25 de cloroformo
(grado de reactivo 995 Sigma-Aldrich EE UU) para conservarlas en condiciones oacuteptimas
para su posterior llegar al laboratorio se mantuvieron a 4degC durante toda la noche para
permitir que el material grueso decante Mientras tanto en lo referente a las muestras
obtenidas de aguas provenientes de los establecimientos expendedores de pollos las
muestras se trataron igual pero como el sobrenadante contiene grasa se optoacute por filtrar y
posteriormente se realizoacute el mismo procedimiento antes descrito
Materiales y meacutetodos
54
Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos
B Obtencioacuten de fagos
Para aislar los fagos se utilizoacute la teacutecnica descrita por Sambrook y Russell (2001) la cual se
describe a continuacioacuten En un tubo de ensayo (16150 mm Fisherbrand EE UU)
conteniendo 45 mL de agar suave (AS) (Bioxon Meacutexico) mantenieacutendose a temperatura de
40C (en una cuba hidroneumaacutetica con agua) se colocaron 500 L de un cultivo de S
Enteritidis (provenientes del cepario del CINSP) en fase logariacutetmica y se agregaron 300 L
de las muestras recolectadas en las que se presume conteniacutean los fagos especiacuteficos para
esta cepa Se agitoacute el tubo de ensayo mezclando con movimientos circulares suaves para
evitar la formacioacuten de burbujas este procedimiento se realizoacute aproximadamente por 5
segundos El contenido se vertioacute uniformemente sobre una caja de Petri (10015 mm
Fisherbrand EE UU) conteniendo agar soya tripticasa (AST) (Bioxon Meacutexico) y se dejoacute a
temperatura ambiente hasta solidificar la ADC Se incuboacute a 37C por 24h Al momento de
observar el desarrollo de las placas de lisis (calvas) se procedioacute al aislamiento de los fagos
Su cuantificacioacuten se realizoacute de manera directa e inmediata ya que las calvas son visibles con
una iluminacioacuten de contraste (Breeuwer et al 2003) Posteriormente los fagos que si formaron
halos de inhibicioacuten fueron aislados de manera directa o siguiendo uno de los dos protocolos
(enriquecimiento y sin enriquecer) debido a que depende principalmente de la amplificacioacuten
del fago y las caracteriacutesticas de cada uno se describen a continuacioacuten
Municipio Sitio de la toma
Monterrey
Parque Fundidora
Riacuteo Santa Catarina
Establecimiento de comida
Av Conductores
Mariacuten Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal
Riacuteo La Libertad
Guadalupe Alcantarillas de la colonia La Azteca
Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados
San Nicolaacutes de los Garza Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac
Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea
Materiales y meacutetodos
55
B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos
Con el protocolo de enriquecimiento se proporcionoacute las condiciones oacuteptimas de desarrollo
al cultivo de la bacteria hueacutesped y la muestra al inocular el cultivo en la muestra y de esta
manera amplificar los posibles fagos que presentes en la muestra de agua
Se realizoacute este protocolo de la siguiente manera primero se seleccionoacute la cepa bacteriana
que seraacute el hueacutesped esto se consiguioacute haciendo un cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y
se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por otra parte se prepararon
aliacutecuotas (10 mL cada una) de cada una de las muestras recolectadas (enriquecidas con
cultivo bacteriano) y se centrifugan a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a
4degC despueacutes el sobrenadante se pasoacute por jeringa y con filtros de 022 microm (Millex-GP
polyethersulfone 33 mm radio-sterilized) Estas dos entidades biloacutegicas se unieron en un
matraz de capacidad de 50 mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon
Meacutexico) a doble concentracioacuten (20) En este matraz se agregaron 300 microL de la muestra
previamente filtrada con fagos y 500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incuboacute a 37degC por
24 h posteriormente por medio de la teacutecnica de ADC se pudo observar la formacioacuten de halos
de lisis de los fagos (Vidales-Contreras et al 2006)
B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos
El protocolo se emplea para adicionar directamente de la muestra una aliacutecuota y testarla
con la bacteria hueacutesped Se siguieron los pasos anteriormente descritos a este protocolo
primero se seleccionoacute la cepa bacteriana (hueacutesped) esto se realizoacute haciendo un cultivo fresco
(AST) (Bioxon Meacutexico) y se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por
otra parte se preparoacute aliacutecuotas (10 mL) de cada una de las muestras recolectadas y se
centrifugaron a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a 4degC despueacutes el
sobrenadante se pasoacute por jeringa con filtros de 022 microm (Millex-GP polyethersulfone 33 mm
radio-sterilized) Estas dos entidades bioloacutegicas se unieron en un matraz de capacidad de 50
mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon Meacutexico) a doble
concentracioacuten (20) A este matraz se agregaron 300 microL de la muestra filtrada con fagos y
500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incubaron a 37degC por 24h posteriormente por medio
de la teacutecnica de ADC se observaron la formacioacuten de halos de lisis de los fagos (Vidales-
Materiales y meacutetodos
56
Contreras et al 2006)
B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas
Despueacutes de que los cultivos bacterianos se reactivaron la preparacioacuten para trabajar con
ellos fue la siguiente se tomoacute una asada de una colonia bacteriana bien diferenciada y se
incuboacute en un tubo inclinado (punta de flauta) se dejoacute el cultivo toda la noche y posteriormente
se traspasoacute a un subcultivo en caldo con infusioacuten cerebro-corazoacuten (BHI Merck Alemania) e
incuboacute a 37degC durante 24 h posteriormente se subcultivoacute en BHI en las mismas condiciones
Una colonia aislada en tubo punta de flauta se inoculoacute en 9 mL de agua peptonada (3M
Meacutexico) y se incuboacute a 37degC durante 24 h luego se realizaron mezclas seriadas en diluyente
(1 gL triptona 85 gL NaCl pH 72) (Merck Alemania) y se implantaron en las superficies de
los discos de acero inoxidable tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm con
un volumen inferior a 50 microL Como control del inoacuteculo se prepararon 5 placas de TSA
En el caso del fago obtenido se amplificoacute realizando la infeccioacuten en repetidas ocasiones
hasta alcanzar una concentracioacuten de 1x107 UFPmL
B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos
Para la realizacioacuten de este estudio se utilizaron cepas bacterianas de Salmonella enterica
y E coli provenientes de diversas colecciones de los laboratorios involucrados tambieacuten se
utilizoacute un fago de prueba (PRD1) para ser utilizado como control positivo en los aislamientos
En la tabla 8 se muestran las bacterias y el fago indicando su denominacioacuten y origen asiacute como
las condiciones de conservacioacuten
Materiales y meacutetodos
57
Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten
Origen Cepa bacteriana fagos Clave Condiciones de conservacioacuten
FaSPyN
S Typhimurium ATCC 13311
Glicerol a -20degC S Paratyphi ATCC 9150
S Enteritidis ATCC 13076
FCB S Typhi ATCC 19430 BGA TSA 4degC
FAUANL
S Typhimurium TSA 4degC
Fago PRD1
Tampoacuten fosfato 4degC
E coli CECT 515
E coli K12
E coli ATCC 10536
E coli O157H7 CECT 4783
S bongori ATCC 43975
UAB
S enterica LT2
Vial liofilizado a -20degC
S enterica sub enterica CECT 4138
S enterica sub enterica CECT 4594
S enterica sub enterica CECT409
S enterica sub enterica CECT 698
S Typhimurium CCUG 29478
Para la reactivacioacuten de los cultivos que se almacenan a 4degC se dejaron a temperatura
ambiente igualmente para los congelados Posteriormente para sacarlos del estreacutes se
sembraron en medio de cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y se incubaron a 37degC por 24
horas tras estas condiciones ya se pudieron utilizar en los ensayos (McLaughlin et al 2006)
A continuacioacuten se describe la forma en que se reactivaron los cultivos en este estudio de
acuerdo a la forma en que estaban almacenados
a) Cultivos almacenados en glicerol
Se descongelaron los viales a temperatura ambiente
Materiales y meacutetodos
58
Se transfirieron 5 microL de cultivo en 20 mL de TSB (Becton Dickinson Co) y se incuboacute a
37degC toda la noche
Se sembroacute en tres campos en caja de Petri de 90 mm con TSA (Becton Dickinson Co)
Se incuboacute a 37degC por 24h
Se seleccionoacute una colonia aislada y bien diferenciada
El cultivo (colonia) se incuboacute en 20 mL de TSB a 37degC toda la noche
b) En caso de los cultivos liofilizados
En el vial se hidrataron los cultivos agregando 1 mL de TSB e incubando 1h a 37degC
Se vertioacute el cultivo en 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC toda la noche
Se realizoacute el mismo proceso anteriormente mencionado en a)
B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC)
La siembra o inoculacioacuten consistioacute en introducir artificialmente una porcioacuten de muestra
(inoacuteculo) en un medio adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano para su desarrollo
y multiplicacioacuten Una vez inoculado el medio se incuboacute a una temperatura adecuada para el
oacuteptimo crecimiento en promedio 37degC Los meacutetodos de conteo en placa como capa doble y
capa simple de agar se basan en la determinacioacuten de la concentracioacuten viral mediante el
conteo de UFP las cuales son zonas de aclaramiento circular o halo de inhibicioacuten de
crecimiento bacteriano que se producen en la capa o ceacutesped bacteriano debido a la lisis
producida por los fagos Inicialmente una partiacutecula de fago infecta a su bacteria hueacutesped se
replica y posteriormente se disemina generando una zona circular sin crecimiento de la
bacteria (Solano et al 2012) Por esta razoacuten en nuestro estudio se utilizoacute esta manera de
trabajar considerando las diferentes formas que se puede presentar los halos de inhibicioacuten
(forma tamantildeo densidad)
La teacutecnica se basoacute en mezclar el cultivo bacteriano en fase logariacutetmica y el fago en agar
suave (AS) tambieacuten llamado top agar cuando se aplica a la placa de Petri donde se realizoacute
el proceso de infeccioacuten El AS se preparoacute con TSB y agar bacterioloacutegico (15) para obtener
una consistencia semisoacutelida que permita el desarrollo de las calvas en el ceacutesped bacteriano
Se mantuvo a una temperatura adecuada para conservar el estado liacutequido y se agitoacute
cuidadosamente para dejar interactuar los cultivos fago-hueacutesped en el tubo de ensayo
Materiales y meacutetodos
59
posteriormente se dispersoacute de manera uniforme en placas de Petri de 90 mm de diaacutemetro con
15 mL de TSA La suspensioacuten (ceacutesped bacteriano en ADC) se dejoacute solidificar a temperatura
ambiente unos minutos y posteriormente se incuboacute 24h37degC (Vidales-Contreras et al 2006)
B6 Modelo de infeccioacuten
Las enzimas endolisinas de los fagos provocan la lisis debilitamiento y rompimiento de la
pared celular de las bacterias La lisis depende de la proporcioacuten de fagos y hueacutesped o
multiplicidad de infeccioacuten (Multiplicity of infection MOI) Cuando hay una MOI baja la relacioacuten
de fagos a bacterias no es superior a 21 Cuando la MOI es alta es decir muchos fagos frente
a pocas bacterias las ceacutelulas se lisan directamente (Dimmock et al 2007)
En ese sentido la Norma ISO 10705-11995 indica que durante el ensayo el fago en fase
de multiplicacioacuten experimenta varios ciclos de replicacioacuten lo que resulta en la muerte de la
ceacutelula hueacutesped que ha actuado como faacutebrica para la produccioacuten viral El modelo que se siguioacute
es para observar los halos de inhibicioacuten y contrastar los resultados En la figura 6 se presenta
el modelo de infeccioacuten utilizado con S Typhimurium y el fago PRD1 siguiendo el modelo de
Vidales-Contreras et al (2006) y la puesta a punto propuetas por Sambrook y Russell (2001)
Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten fago-hueacutesped
Materiales y meacutetodos
60
B7 Controles utilizados durante los ensayos
Se utilizoacute la cepa de S Typhimurium y el fago PRD1 como control positivo para observar
la formacioacuten de las calvas para el control negativo se utilizoacute agua esterilizada con esto se
asegurar que si existe infeccioacuten y evitar los falsos positivos que ocurren primordialmente por
contaminacioacuten
Para control negativo el ceacutesped bacteriano se obtuvo de la siguiente manera en un
tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de cultivo de S
Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de agua destilada esteacuteril la mezcla se vertioacute
en placa Petri con TSA
Como control positivo el ceacutesped bacteriano y las placas de lisis se obtuvieron como
sigue en un tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de
cultivo de S Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de fagos PRD1 la mezcla se
vertioacute en placa Petri con TSA
B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium
Para realizar los ensayos microbioloacutegicos se requirioacute trabajar con la misma cantidad de
biomasa en una fase de crecimiento similar El conteo en placa es un meacutetodo de medicioacuten de
biomasa que permite el recuento de ceacutelulas viables y consiste en determinar el nuacutemero de
ceacutelulas capaces de reproducirse y generar colonias sobre un medio soacutelido (cada ceacutelula viable
da origen a una colonia) Para este estudio y ver el efecto de los fagos sobre las bacterias
primeramente se calculoacute la curva de crecimiento celular pues es imprescindible para realizar
la infeccioacuten que la bacteria hueacutesped y se encuentre en fase logariacutetmica Es decir para
determinar la biomasa bacteriana se mide la cineacutetica de crecimiento celular y se considera
que se ha alcanzado la fase de crecimiento exponencial cuando la concentracioacuten es de 10⁸
UFCmL (McLaughlin et al 2006)
Para el conteo bacteriano se utilizoacute el meacutetodo de filtracioacuten por membrana
Se transfirioacute 1 mL del cultivo bacteriano fresco a 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC
Cada 30 minutos se recolectaron 300 microL de cultivo
A cada aliacutecuota recogida se le realizaron diluciones seriadas con 27 mL de agua
Materiales y meacutetodos
61
destilada esteacuteril hasta obtener un factor de 1010
De cada una de estas diluciones se obtuvieron 100 microL que se filtraron por membrana
de celulosa 045 microm (Millipore Corporation Billerica Ma 47 mm esteacuteril Cat No
JMX000089 Millipore) montada en un embudo de filtracioacuten magneacutetico de 47 mm (Pall
GELMAN Laboratory con capacidad de 300 mL) y con bomba de vaciacuteo (GM motors amp
industrial systems Modelo 5kh36kna510x)
Las membranas se colocaron en caja de Petri con TSA y se incubaron 24h a 37degC
C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos
Con excepcioacuten de la microscopiacutea electroacutenica los meacutetodos empleados para determinar el
tamantildeo forma y composicioacuten quiacutemica de los fago requieren una alta pureza de las partiacuteculas
virales El material de partida en cualquier estudio de este tipo para la obtencioacuten del fago es
cuando se presenten los halos de inhibicioacuten en el ADC en general ademaacutes de los fagos
estas zonas claras pueden contener los restos celulares de las bacterias como trozos de
pared membranas ribosomas ADN ARN proteiacutenas y otros componentes de peso molecular
maacutes bajo El contenido de fago en un lisado es del orden de 001 mg mL por lo que para
obtener la cantidad apropiada para su caracterizacioacuten es necesario partir de varios litros
(Leverentz et al 2003 Maestro y Sanz 2016)
Para llevar a cabo la purificacioacuten de los fagos se debe de realizar con concentraciones
superiores a 1010 UFPmL Uno de los meacutetodos maacutes utilizados es la centrifugacioacuten a alta
velocidad y posterior resuspensioacuten de las partiacuteculas sedimentadas en un volumen menor
Cuando es posible esta teacutecnica se reemplaza por un sistema de dos fases basado en la
propiedad que tienen algunos poliacutemeros de alto peso molecular como el polietilenglicol el
dextrasulfato de sodio y el dextrano al separarse estas fases por diferencia de pesos
moleculares los fagos se dispersan en este tipo de medios considerando las concentraciones
empleadas y las condiciones oacuteptimas de pH fuerza ioacutenica y temperatura y al pasar por el
proceso de centrifugacioacuten se concentran en una columna Una vez concentrado el fago en la
columna se puede recuperar faacutecilmente de la interfase Los procesos maacutes comuacutenmente
utilizados para la purificacioacuten posterior se basan en separar las partiacuteculas de fago ya sea por
su tamantildeo o densidad (Sambrook y Russell 2001 Vidales-Contreras et al 2006)
En la figura 7 se presenta el procedimiento para la amplificacioacuten de fagos que nos asegura
Materiales y meacutetodos
62
cultivos puros uniformes y con tiacutetulos altos lo cual es imprescindible para conseguir una
buena imagen en el microscopio electroacutenico
Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten de bacteriofagos aplicando la teacutecnica
de agar doble capa (ADC)
El meacutetodo utilizado para purificar los fagos que despueacutes de utilizaron para analizar su
morfologiacutea implicoacute el uso del kit Montage SEQ96 (Millipore Sequencing Reaction Cleanup Kit
Millipore Corporation EE UU)
En una placa de filtracioacuten (96 well SEQ plate by Millipore) se depositaron en cada
pocillo 15 microL de concentrado de fagos maacutes 5 microL de agua milli-Q (Injection Solution by
Millipore)
Materiales y meacutetodos
63
La separacioacuten se realizoacute por la exclusioacuten de lavados de la columna de gel aplicando
vaciacuteo por medio de una bomba (Millipore EE UU Vacuumpressure 220 V50 Hz 15 mm
Hg)
Posteriormente se resuspendioacute la muestra (Thermomixer comfort by Eppendorf) con
agitacioacuten durante 1 min a 500 rpm
Finalmente se agregoacute 10 microL de agua ultra pura Milli-Q para concentrar la muestra
(Injection Solution by Millipore)
Una de las modificaciones que se realizaron para obtener los fagos con elevada pureza y
concentracioacuten para ser utilizada en la microscopiacutea electroacutenica se realizoacute con el kit Montage
SEQ96 que se utiliza para la purificacioacuten de DNA y en este caso se utilizoacute para concentrar los
fagos (concentracioacuten 1012 UFPmL) El procedimiento se describe a continuacioacuten
Se antildeadieron 20 microL de buffer de inyeccioacuten a la placa donde se teniacutea la suspensioacuten de
fagos se resuspendioacute y transfirioacute todo el volumen a la placa azul de Millipore (kit Montage)
Se colocoacute la placa en la bomba del kit Montage de 2 a 3 min hasta que quedoacute seca
Es aconsejable no dejar maacutes tiempo del necesario para evitar un secado excesivo
Se limpioacute todo el exceso de liacutequido en la placa con papel filtro secando un par de
veces la placa sobre el papel Inmediatamente despueacutes se colocoacute la placa sobre el soporte
de la bomba evitando dejarla sobre el papel
Se antildeadieron 30 microL de buffer de inyeccioacuten
Se colocoacute la placa en la bomba unos 4-5 min hasta secarse
Con papel filtro se limpioacute todo el exceso de liacutequido que quedoacute en la placa y se colocoacute
en el soporte de la bomba
Se antildeadieron 30 microL maacutes de buffer de inyeccioacuten para resuspender
Se colocoacute la placa en agitacioacuten se centrifugoacute a 500 g por 10 min
Se traspasaron los 30 microL a un nuevo pocillo y se recolectoacute el sobrenadante
D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica
Con la concentracioacuten de fagos purificados se preparoacute la muestra para la observacioacuten al
microscopio electroacutenico y se procedioacute utilizando la teacutecnica de tincioacuten negativa tal como se
explica a continuacioacuten
Se depositaron 2 microL de suspensioacuten de fagos en un disco de capa fina de carbono y cobre
Materiales y meacutetodos
64
(200 Mesh Holes 100 microm square Ethene old 200 RU) despueacutes de 2 min de reposo a
temperatura ambiente se eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente Se antildeadieron 2
microL de agente de contraste solucioacuten tampoacuten 1 de acetato de uranilo (UO2middot (CH3COO)2middot2H2O)
(Merck Alemania) Se dejoacute actuar el colorante durante 2 min a temperatura ambiente y se
eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente y despueacutes se dejoacute el disco alrededor de 5
min a temperatura ambiente antes de observar en el microscopio
D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa
(DEM)
La microscopiacutea oacuteptica es el meacutetodo adecuado para la investigacioacuten de procesos celulares
ya que es menos agresivo para el manejo de la muestra Existen teacutecnicas de microscopiacutea con
otras especificaciones donde se aplican para estudiar la adhesioacuten celular y formacioacuten de
biofilms en superficies tales como el espectrofotoacutemetro infrarrojo transformada de Fourier el
laacuteser confocal de barrido y la microscopiacutea de fuerza atoacutemica estos microscopios se
caracterizada por detectar las ceacutelulas viables de las dantildeadas por medio de cromoacuteforos
(Montantildeez et al 2012) La microscopiacutea que estamos trabajando esta basada en fluorescencia
la cual utiliza cromoacuteforos para detectar DNA de ceacutelulas vivas (coloracioacuten verde) y ceacutelulas
muertas (coloracioacuten roja) y ha tenido grandes avances en la observacioacuten de tejidos ceacutelulas
moleacuteculas individuales y por consiguiente algunos restos celulares todos estos con una
excelente resolucioacuten (Pellegrotti et al 2014)
Para la observacioacuten de ceacutelulas mediante el DEM se utilizoacute el kit comercial de viabilidad Bac
Light (LIVEDEAD Bacterial Viability Kit L-13152 Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE
UU) que estaacute compuesto por dos colorantes fluorescentes de aacutecidos nucleicos (SYTOreg9 y
PISYTOreg9) que penetran tanto en las membranas intactas como en las lesionadas lo que
permite evaluar la vitalidad de las ceacutelulas bacterianas basaacutendose en la deteccioacuten de la
actividad de las oxidasas y reductasas bacterianas Se observa una sentildeal fluorescente
mejorada en ceacutelulas bacterianas con procesos metaboacutelicos activos En contraste PISYTOreg9
se manifiesta soacutelo en las ceacutelulas que presentan membranas lesionadas y desplaza el colorante
SYTOreg9 por la transferencia de energiacutea de la resonancia fluorescente Cuando se aplican
estos dos colorantes en proporcioacuten adecuada las ceacutelulas viables con membranas intactas
presentaraacuten fluorescencia verde y en contraste las ceacutelulas muertas o lesionadas tendraacuten
Materiales y meacutetodos
65
coloracioacuten roja (Berney et al 2007)
A continuacioacuten se describe la preparacioacuten de las muestras para ser observadas por el DEM
Se colocaron 2 microL de la concentracioacuten suspensioacuten de la muestra con fagos en una
concentracioacuten de 1x1012 UFCmL sobre un disco de acero inoxidable (tipo 14301 (2 cm de
diaacutemetro y 1 mm de grosor) ligeramente convexos con una altura maacutexima en el centro
de 1 mm
Se dejoacute secar a temperatura ambiente por espacio de 10 min
Posteriormente se aplicaron 2 microL de la solucioacuten vital de fluorescencia (LIVEDEAD Bac
Light Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE UU) que reacciona y da la coloracioacuten
al material geneacutetico de las bacterias
Para la observacioacuten de los discos se utilizoacute el microscopio de fluorescencia Olympus
BX51BX52 (Tokio Japoacuten) con caacutemara digital incorporada (DP 50 Olympus) equipado con
laacutempara de mercurio de 100 W (USH-103 OL Olympus) con filtro de doble paso (U-M51004
FR V2 Olympus)
Para enumerar las ceacutelulas bacterianas en el biofilm que se formo en los discos de
acero inoxidable se trabajoacute con un objetivo de 20X y se ubicaban 10 campos
aleatoriamente y los resultados se expresaron por cm2 Las imaacutegenes se revisaron con el
sistema de anaacutelisis de imagen (anaacutelisis 32 soft Imaging System GMBH Alemania)
El biofilm bacteriano se desarrolloacute en la superficie de discos de acero inoxidable tipo
14301 Antes de usarse deben limpiarse bien por inmersioacuten en una solucioacuten acuosa de
detergente (DINO-dis-Dipol Espantildea) al 5 en agua durante 1 h despueacutes se realizoacute la
inmersioacuten en bantildeo con alcohol isopropiacutelico (2-propanol) (Merck Alemania) al 70 en agua
durante 15 min Una vez secos se esterilizaron en autoclave a 121degC por 15 min
D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM
Se inocularon la superficie de los discos con 50 microL de cultivo de S enterica maacutes medio de
cultivo (TSB) para proporcionar en medio rico para que se forme el biofilm posteriormente se
colocaron en cajas de Petri esteacuteriles y se mantuvieron en condiciones de humedad a
temperatura ambiente durante periacuteodos de 24 48 y 72h realizaacutendoles el conteo
correspondiente para verificar el desarrollo del biofilm
Materiales y meacutetodos
66
Una vez formado el biofilm se inocularon los discos con 3 concentraciones diferentes de
fagos 6 7 y 8 logcm2 en un volumen inferior a 50 microL Las diluciones del fago se hicieron en
solucioacuten salina fisioloacutegica (SSF cloruro de sodio 080) (Merck Alemania) Se realizoacute la
infeccioacuten al inocular a los discos prueba y los discos de control con el mismo volumen de SSF
las condiciones de incubacioacuten se realizaron con humedad y a temperatura ambiente
Los discos de acero inoxidable que fueron inoculados con la infeccioacuten fago-bacteria se
analizaron en periacuteodos de 0 2 8 24 y 48 h Se utilizaron para la valoracioacuten de bacterias y
fagos y se distribuyeron los discos de la siguiente manera 2 para visualizacioacuten microscoacutepica
panoraacutemica 2 para recuento bacteriano por microscopiacutea y 2 para recuento bacteriano dando
un total de 6 discos por caja de Petri por duplicado y por cada concentracioacuten (3) por cada
ensayo (3) y por horarios (5) de dando un total de 540 discos
Para el conteo sobre cada disco se colocaron 20 microL del colorante (LIVEDEAD Pribes) y
se incubaron por 5 min a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad y se tomaron
fotografiacuteas a 10X 20X y 40X Para la microscopiacutea de conteo las fotografiacuteas se realizaron a
un aumento de 40X considerando 10 campos aleatorios
Cuando se formoacute el biofilm se requirioacute hacer los recuentos de bacterias y de fagos en ese
sentido para recuperar las bacterias los discos se colocaron en un frasco con 5 mL de TSB
con Tween 80 (TSBTW) (Merck Alemania) y 3 g de perlas de vidrio se homogeneizoacute la
muestra por 1 min en agitador voacutertex a maacutexima potencia para favorecer el desprendimiento
de los microorganismos y posteriormente se realizaron diluciones seriadas De este mismo
extracto se obtuvo el material necesario para hacer el conteo de fagos utilizando la teacutecnica de
ADC Y para el recuento de las bacterias viables se trabajoacute con cajas de Petri se sembroacute 1
mL en TSA con 06 de extracto de levadura (TSAYE Merck Alemania) y se incuboacute a 37degC
durante 24h (Fuster-Valls et al 2008)
67
V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Resultados y discusioacuten
68
Resultados y discusioacuten
69
A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras
De los 10 sitios de recoleccioacuten se lograron obtener un total de 39 muestras en junio de
2007 En la tabla 9 se presentan los sitios y el nuacutemero de muestras recogidas en cada sitio
En el caso del Riacuteo Santa Catarina se abarcoacute una distancia de 95 km la cual presentaba
diferentes zonas de descarga de aguas residuales y de ahiacute se hicieron las tomas en un periacuteodo
de estiaje En el caso de las lagunas de oxidacioacuten del municipio de Mariacuten esta zona presenta
tres lagunas con un aacuterea total de 16700 m2 se realizoacute el muestreo de manera aleatoria En
cuanto a las muestras que se obtuvieron en el sitio de comercializar carne de pollo se les tratoacute
de igual manera para comprobar si existiacutean fagos
Los lugares elegidos para la recoleccioacuten de muestras son similares a los reportados en la
literatura regularmente para el aislamiento de fagos del ambiente se utilizan aguas residuales
y establecimientos de manipulacioacuten yo venta de alimentos (Leeuw et al 2017) En
investigaciones previas se realizan muestreos de diversos sitios como en la piel y heces de
animales manos de los cuidadores superficies quiruacutergicas e instrumentos o utensilios usados
en los establecimientos hoteles y restaurantes (Ejo et al 2016 Yergeau et al 2016) Los
muestreos de aguas tambieacuten se pueden realizar en sitios cercanos a las salidas de drenaje
de hospitales esto es de gran importancia ya que donde hay bacterias posiblemente esteacuten
sus respectivos fagos (Tomat et al 2014 Mattila et al 2015 McShan y Nguyen 2016)
Resultados y discusioacuten
70
Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos
B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis
Para el aislamiento de los fagos especiacuteficos de Salmonella fue necesario la puesta a punto
de varios procedimientos la teacutecnica de agar doble capa (ADC) determinar la cineacutetica de
crecimiento de cultivos de Salmonella determinar la fase de eclipse en la relacioacuten fago-
bacteria (se utilizoacute como control la cepa S Typhimurium y el fago PRD1) y su puesta a punto
en el laboratorio de bioremediacioacuten de la Facultad de Agronomiacutea de la UANL
B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S
Typhimurium
La accioacuten liacutetica de los fagos sobre Salmonella se analizoacute utilizando la teacutecnica ADC
En este procedimiento es necesario tener un ceacutesped bacteriano uniforme entre dos capas
de medio soacutelido que puede ser agar-agar o agar-agarosa (Sambrook y Rusell 2001)
Con el objetivo de abaratar los costes y mejorar los resultados en este trabajo se empleoacute
esta teacutecnica con algunas modificaciones que se describen a continuacioacuten Asiacute pues se decidioacute
que las capas fueran agar-agar donde la primera capa fue de agar al 15 en medio TS y la
Municipio Sitio de la toma N de muestras
Tipo de agua
Monterrey
Parque Fundidora 3 Estanque y corriente
Riacuteo Santa Catarina 10 Corriente
Establecimiento de comida 2 Lavado del pollo
Av Conductores 2 Corriente
Mariacuten
Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal
10 Estanque y corriente
Riacuteo La Libertad 2 Corriente
Guadalupe
Alcantarillas de la colonia La Azteca
3 Corriente
Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados
2 Lavado del pollo
San Nicolaacutes de los Garza
Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac
2 Corriente
Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea 3 Corriente
Resultados y discusioacuten
71
segunda con agar a una menor concentracioacuten para hacer la capa menos firme por lo que fue
necesario poner a punto la teacutecnica probando diferentes concentraciones de agar en ambos
casos a pH 72 Ademaacutes esta adecuacioacuten es importante por el ahorro que se generoacute al utilizar
un componente maacutes econoacutemico que la agarosa lo cual repercutioacute favorablemente en el coste
de la prueba
Otra variable para poner a punto en la teacutecnica de ADC es el volumen de cultivo bacteriano
a utilizar para generar el ceacutesped de Salmonella y lograr una adecuada interaccioacuten con el fago
Se probaron 3 voluacutemenes diferentes de cultivo de S Typhimurium incubados 24 horas a 37oC
para alcanzar una concentracioacuten de 16 x 108 UFCmL Dependiendo de la cantidad de inoacuteculo
las caracteriacutesticas del ceacutesped bacteriano tienen diferente contraste lo cual puede facilitar o
dificultar la observacioacuten de las placas liacuteticas Finalmente el mejor resultado se obtuvo al
utilizar el volumen de 500 L ya que se logroacute una mejor observacioacuten del aclaramiento del
ceacutesped bacteriano al formar las placas liacuteticas En la tabla 10 se muestran las caracteriacutesticas
de las capas en la caja Petri para un buen manejo y desarrollo de la zona liacutetica producida por
el fago al multiplicarse
Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC
Paraacutemetro Condiciones
Agar suave (con agar) () 08
Temperatura del agar suave (degC) 49
pH del medio de cultivo (soacutelido y liacutequido) 72
Cantidad de agar suave (mL) 45
Cultivo bacteriano (microL) 500
Muestra tratada con fagos (microL) 100
Resultados y discusioacuten
72
B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium
El cultivo hueacutesped debe de encontrarse creciendo en medio liacutequido TS en fase logariacutetmica
al momento de mezclarlo con el fago Para identificar la fase logariacutetmica se probaron
diferentes tiempos de crecimiento Con todo ello se observa que la fase logariacutetmica de S
Typhimurium se encuentra en el minuto 150 coincidiendo con los datos reportados por
Vidales-Contreras et al (2006) Y siguiendo con mi tesis la determinacioacuten de la concentracioacuten
se realizoacute mediante el promedio de la enumeracioacuten de las UFC por placas Petri preparadas
por duplicado multiplicado por el factor de dilucioacuten el cual es el reciacuteproco del producto del
volumen ensayado y la dilucioacuten usada para el anaacutelisis Al final se observa cuando se ha
llegado a la fase estacionaria del desarrollo bacteriano (tabla 11) Se utiliza un factor de
dilucioacuten el cual se obtiene como el reciacuteproco de la multiplicacioacuten de volumen de ensayo y la
dilucioacuten usada en el anaacutelisis
Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium
Tiempo Minutos
(Acumulado) Dilucioacuten
UFCmL Promedio
F (Factor) Concentracioacuten
(UFCmL)
T0 0 1 x 10-5 9 plusmn 25 1 x 106 900 x 106
T1 30 1 x 10-5 13 plusmn 74 1 x 106 130 x 107
T2 60 1 x 10-5 24 plusmn 56 1 x 106 240 x 107
T3 90 1 x 10-5 51 plusmn 32 1 x 106 510 x 107
T4 123 1 x 10-5 211 plusmn 89 1 x 106 211 x 108
T5 150 1 x 10-6 215 plusmn 81 1 x 107 215 x 109
Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)
B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis
Las consideraciones tomadas del modelo infectivo S Typhimurium y el fago PRD1 y
utilizando la teacutecnica ADC se replican para poner a punto a la bacteria que se quiere probar
que en este caso es S Typhi ATCC 19430 Los resultados de estos ensayos se pueden
observar en la tabla 12 en la que se puede observar que es ligeramente mayor la etapa donde
Resultados y discusioacuten
73
se puede realizar la infeccioacuten (fase de eclipse) de los fagos aislados y la bacteria hueacutesped
Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis (108 UFCmL) (37 ordmC24h)
Tiempo Minutos (Acumulado)
Dilucioacuten UFCmL Promedio
F (Factor) Concentracioacuten (UFCmL)
T0 0 1 x 10-5 216 710 1 x 106 20 x 107
T1 60 1 x 10-5 260 608 1 x 106 20 x 107
T2 120 1 x 10-6 160 173 1 x 107 16 x 108
T3 180 1 x 10-6 244 208 1 x 107 24 x 108
T4 240 1 x 10-7 400 100 1 x 107 40 x 109
Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)
B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis
De los sitios muestreados se logro obtener 39 muestras y se obtuvo un total de 15 fagos
aislados a partir de dos fuentes de aguas residuales las del Riacuteo Santa Catarina y las lagunas
de oxidacioacuten de Mariacuten Los 15 fagos se nombraron consecutivamente como MRH 1-15 Los
15 fagos se probaron contra la cepa hueacutesped S Enteritidis (CINSP tabla 4) tras realizar de
3 a 4 amplificaciones la mayoriacutea (14 fagos) no presentoacute actividad liacutetica (formacioacuten de halos
de inhibicioacuten) de manera que fueron descartados para los siguientes estudios siendo
solamente uno proveniente de la muestra del Rio Santa Catarina el que produjo halos bien
definidos en el ceacutesped bacteriano y con eacuteste se continuoacute trabajando El fago que mantuvo la
actividad liacutetica fue el MRH6 Se propuso nombrarle como MRH considerando la M para
muestra la RH por el Rodrigo Hernaacutendez
B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten
La principal caracteriacutestica de los fagos es cuando forman halos de inhibicioacuten (tambieacuten
llamadas zonas liacuteticas o calvas) y en nuestro estudio las muestras de agua recolectadas
fueron tratadas y analizadas mediante la teacutecnica ADC observando los halos de inhibicioacuten
claros y de diferentes diaacutemetros estas observaciones son similares a las observadas por
Ackermann (2003) Tanto la cantidad de UFP que se pueden desarrollar y observar hecha por
Resultados y discusioacuten
74
los fagos y la pureza en que encuentren los bacterioacutefagos de las muestras obtenidas del medio
ambiente estaacuten directamente relacionadas la especificidad contra la bacteria Al sembrar por
vaciado en placa estos lisados sobre la cepa indicadora se obtuvieron diferentes tamantildeos de
placas liacuteticas
En la figura 8 se muestran los halos de inhibicioacuten en ceacutesped de Salmonella al realizar la
infeccioacuten se pueden observar los diferentes tamantildeos y la forma se da por la capacidad de
raacutefaga (nuacutemero de copias al realizar el proceso liacutetico) de los fagos de la progenie los fagos
suelen tener una raacutefaga de maacutes de 100 partiacuteculas infectivas producidas en un lapso de tiempo
de 05 ndash 20 h Algunos halos formados por el fago fueron claros lo que indica que es liacutetico de
acuerdo con diversos autores (Sambrook y Rusell 2001 Vidales-Contreras et al 2006 Wong
et al 2014) En nuestro estudio se batalloacute en encontrar fagos a pesar de buscar sitios
sentildealados por autores antes mencionados
Al intentar obtener fagos puede suceder que se encuentren en concentraciones tan
pequentildeas que al probarlos contra alguna cepa hueacutesped no sirven para trabajar por lo que se
llevoacute a cabo repeticiones seriadas (amplificacioacuten) asegurando que al formar una placa de Petri
en ADC con tamantildeos de los halos de inhibicioacuten iguales lo que nos indica que pertenecen a
una sola especie de fago
Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por fagos con halos de inihibicioacuten de
diferentes tamantildeos
Resultados y discusioacuten
75
C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli
La clasificacioacuten de los fagos se puede establer en base a su morfologiacutea al aacutecido nucleico
al espectro de accioacuten y algunas consideraciones inmunoloacutegicas (Criscuolo et al 2017) Al
realizar la infeccioacuten de fago-bacteria y observar la presencia de halos liacuteticos en las placas de
ceacutesped bacteriano se considera que se ha producido una infeccioacuten exitosa pero previamente
es necesario poner a punto el cultivo puro de ambos cultivos y considerar la concentracioacuten de
cultivos a utilizar
Al seleccionar los fagos que presentaron uniformidad en cuanto a la inhibicioacuten y posterior
evaluacioacuten de los fagos se consideraron varios factores entre ellos el tiempo que tarda la
replicacioacuten viral (lo cual es variable) siendo que en algunos casos se pueden replicar en
cuestioacuten de minutos A simple vista se pueden observar la formacioacuten de halos de lisis en el
ceacutesped bacteriano en las cajas de Petri
Asiacute pues la teacutecnica ADC se repitioacute varias veces hasta obtener placas liacuteticas con ideacutentica
morfologiacutea y tamantildeo En la tabla 13 se observa que hay diferentes tamantildeos de halos En los
primeros ensayos soacutelo cuatro muestras de agua (15 21 26 y 33) dieron halos de inhibicioacuten
pudieacutendose distinguir bien la forma y el tamantildeo Al realizar posteriores siembras los fagos
fueron perdiendo capacidad de infeccioacuten (fagos atemperados) y soacutelo la muestra 21 de las
lagunas de oxidacioacuten provenientes de Mariacuten presentoacute fagos con actividad liacutetica y el resto de
fagos no desarrolloacute actividad constante
Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten de S Enteritidis en ceacutesped
bacteriano
Diaacutemetro de halo grande ge 8mm mediano 8 lt X lt6mm pequentildeo le 5mm
Distribucioacuten de tamantildeos de halo
Muestra de agua Grande Mediano Pequentildeo
15 8 23 15
21 17 11 27
26 10 18 6
33 7 9 13
Diaacutemetro medio halo (mm) 1055 0671 0376
Resultados y discusioacuten
76
En la tabla 14 se presenta el listado de posibles hueacutespedes probados 12 cepas de
Salmonella y 4 de E coli que se probaron contra los 15 fagos aislados previamente Se puede
distinguir que afecta a algunas serovariedades de Salmonella y no tiene efecto en otras
serovariedades entericas No afecta nada a las cepas de E coli Se ve que la cepa maacutes
afectada por el fago es la S Typhi ATCC 19430 y otras cepas de Salmonella son afectadas
ligeramente
Resultados y discusioacuten
77
Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades de Salmonella spp y de E coli
serovariedades Fagos
M
R
H
1
M
R
H
2
M
R
H
3
M
R
H
4
M
R
H
5
M
R
H
6
M
R
H
7
M
R
H
8
M
R
H
9
M
R
H
1
0
M
R
H
1
1
M
R
H
1
2
M
R
H
1
3
M
R
H
1
4
MR
H15
S Typhimurium ATCC 13311
-
-
t
- -
t
- - - - - - - - -
S Paratyphi ATCC 9150 - - - - - - - - - - - - - - -
S Enteritidis ATCC 13076 - - - - - - - - - - - - - - -
S Typhi ATCC 19430 + + + + + t
c
+ + + n
d
n
d
n
d
n
d
nd +
S Typhimurium - - - - - - - - - - - - - - -
S Bongori ATCC 43975 - - - - - - - - - - - - - - -
S enterica LT2 - - - + + + - - - - - - - -
S sub enterica CECT 4138 - - - - + + + - - - - - - - -
S sub enterica CECT 4594
t
t
t
- + + + - - -
t
- - - -
S sub enterica CECT 409 - - - - n
d
- -
t
- - - - - - -
S sub enterica CECT 698 - - - - - t
c
- - - - - - - - -
S Typhimurium CCUG
29478
- - - + + - - - - - - - -
E coli CECT 515 - - - - - - - - - - - - - - -
E coli K12 - - - - - - - - - - - - - - -
E coli ATCC 10536 - - - - - - - - - - - - - -
E coli O157H7 CECT 4783 - - - - - - - - - - - - - - -
+ crecimiento y desarrollo de halo indica desarrollo muy pequentildeo o difuso del halo t indica desarrollo pequentildeo y turbio del halo tc indica turbio o con centro opaco en el centro del halo - no crecimiento o desarrollo de halo nd aparente baja efectividad o halo difuso
Resultados y discusioacuten
78
Resultados y discusioacuten
79
El fago que siacute mostroacute actividad (MRH6) y que mantuvo la capacidad liacutetica durante las
diferentes amplificaciones se trabajoacute de manera continua hasta obtener halos uniformes en el
tamantildeo y asiacute ya se considera como una entidad pura de fago Los resultados obtenidos en
este trabajo son semejantes a los mostrados por Thung et al (2017) En la figura 9 se
presentan las imaacutegenes donde se muestra el desarrollo de halos liacuteticos previamente
mencionados donde se puede observar los halos uniformes contra A) S Enteritidis (CINSP)
y B) S Typhi ATCC 19430 (UAB)
Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria A) S Enteritidis (CINSP) y B) S Typhi ATCC 19430
La especificidad de los fagos se encuentra generalmente a nivel de cepa y tambieacuten de
especie y maacutes raramente a nivel de geacutenero Es de intereacutes el garantizar una eficiente infeccioacuten
de la dupla fago-bacteria de esta manera se toman todas las medidas precautorias para
obtener resultados fiables en este sentido se requiere verificar todos los aspectos como son
los controles (positivo y negativo) En el caso del control negativo se verificoacute el desarrollo
solamente del ceacutesped bacteriano de la cepa hueacutesped con la teacutecnica ADC y como control
positivo se consideroacute el modelo del fago PRD 1 y S Typhimurium los fagos son altamente
especiacuteficos (no afecta a otros cultivos bacterianos) y no se puede descartar falsos positivos
por la presencia de restos celulares bacterianos (Segundo et al 2010 Szafranski et al 2017)
Resultados y discusioacuten
80
D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM
El ICTV clasifica a los fagos en 1 orden13 familias y 31 geacuteneros De los cuales se
observa al orden de los Caudovirales el cual comprende a la mayor parte de los fagos (en
torno a un 95)y estos estaacuten constituidos por 3 familias con cola Myoviridae Podoviridae
y Siphoviridae Con estas caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas mediante el TEM en la
figura 10 se presentan las imaacutegenes del fago MRH6
El anaacutelisis de una suspensioacuten de fagos con una concentracioacuten de 1x1012 UFPmL mediante
microscopiacutea electroacutenica muestra una distintiva morfologiacutea de cabeza icosaeacutedrica estructura
alargada y cola no contraacutectil La caacutepside tiene un diaacutemetro de 55-60 nm y la cola puede
alcanzar los 570 nm Estas caracteriacutesticas se corresponden con la familia Siphoviridae Yang
et al (2017) comentan que esta familia de fagos se encuentra frecuentemente en
enterobacterias
Figura 10 Imagen por TEM del fago MRH6 (X100 000) la barra representa 100nm (Servicio de Microscopiacutea UAB)
Resultados y discusioacuten
81
D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero
inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de
epifluorescencia directa (DEM)
Para corroborar la potencial condicioacuten como agente de desinfeccioacuten del fago MRH6 es
necesario observar su efectividad a traveacutes de la DEM con la que se pueden observar
bacterias viables y no viables Tambieacuten la materia orgaacutenica puede dar falsos positivos y se
debe tener en cuenta al comparar con otros meacutetodos de conteo (Montantildeez et al 2012)
En este trabajo S Typhi ATCC 19430 desarrolloacute biofilms en las superficies de acero
inoxidable (discos tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm) y consiguieron
niveles de 29 plusmn 02 UFCcm2 despueacutes de tener un maacuteximo de 72 h en incubacioacuten en
condiciones de humedad y temperatura ambiente tal como se puede observar en la figura 11
Estos biofilms tienen distinta intensidad seguacuten el tiempo de incubacioacuten siendo los periodos
evaluados de 24 48 y 72h respectivamente En estas condiciones se realizoacute el recuento en
tres zonas de cada disco para cada tiempo de incubacioacuten y los resultados se presentan en la
figura 12 Para tener fiabilidad de los resultados se realizaron los conteos por triplicado porque
el manejo de los discos es muy complejo y para evitar errores de manejo se consideroacute
necesario tener maacutes de una muestra otorgando ademaacutes la oportunidad de comparar
resultados y tener un margen de referencia en cuanto a los resultados obtenidos
Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 en
diferentes tiempos de incubacioacuten (24 48 y 72h) a temperatura ambiente
Resultados y discusioacuten
82
Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable incubados a temperatura ambiente n = 3
En este estudio se compararon 2 meacutetodos de conteo de bacterias despueacutes de ser atacadas
por los fagos eacutestos fueron el recuento en placa de agar y por otro lado la observacioacuten por
microscopiacutea de epifluorescencia y la relacioacuten entre ambos meacutetodos Desafortunadamente se
han perdido los resultados por un problema irresoluble pero si se puede comentar que existe
una relacioacuten ligeramente inferior a 09 (R2 ) Esta observacioacuten ya ha sido presentada
anteriormente por otros autores (Fuster-Valls et al 2008 Engelhardt et al 2014)
El cultivo bacteriano se puede contabilizar por conteo en placa directo (TSA) este meacutetodo
es utilizado generalmente para cultivos de geacutermenes no exigentes o moderadamente
exigentes y cuando se quiere visualizar como afecta el ataque de los fagos las ceacutelulas
bacterianas se visualizan por DEM (cuya coloracioacuten cambia a verde cuando han sido atacadas
por los fagos) y una forma de visualizar este ataque es por medio de TSA con la teacutecnica de
ADC
0
5
10
15
20
25
0 10 20 30 40 50 60
Co
nte
o (
Lo
g U
FC
cm
2)
Tiempo (h)
Crecimiento bacteriano
Resultados y discusioacuten
83
D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable
Se aplicoacute la DEM para evaluar la efectividad del fago MRH6 en el control de S Typhi ATCC
19430 sobre superficies de acero inoxidable en condiciones de humedad El fago MRH6 es
liacutetico capaz de disgregar los biofilms
El analizar la accioacuten liacutetica del fago sobre Salmonella por medio del DEM es muy importante
e innovador pero el material que se utiliza y la manera en que se comportan las diferentes
bacterias hacen que se deba ser muy precavido al considerar el uso de este meacutetodo como
adecuado para realizar conteos (Libuchi et al 2010) Por ejemplo se debe tener en cuenta
que existen bacterias que no forman un biofilm y presentan movimiento esto puede llegar a
complicar el visualizarlas si no estaacuten en el campo por lo que se podriacutea pensar que fueron
atacadas y eliminadas por los fagos o bien que por los diferentes lavados se barrieron
La DEM con la tincioacuten LIVEDEAD reveloacute la presencia de ceacutelulas viables con coloracioacuten
verde En la figura 13 se puede observar el efecto letal del fago MRH6 sobre la poblacioacuten de
S enteacuterica disminuyendo su cantidad considerablemente en base a el tiempo de incubacioacuten
en color verde Se observa que hay disminucioacuten de las ceacutelulas de S Typhi ATCC 19430 al ser
atacadas por el fago MRH6 Recordemos que la infeccioacuten con el MRH6 se realizoacute despueacutes de
formar un biofilm a temperatura ambiente y con humedad por espacio de 72h en 3
concentraciones 6 7 y 8 UFPmL Al paso del tiempo se aprecia que a las 48h hay pocas
ceacutelulas vivas al menos detectadas por la teacutecnica utilizada
Resultados y discusioacuten
84
a)
b)
c)
Figura 13 Secuencia de imaacutegenes de epifluorescencia que ilustran la destruccioacuten de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable causada por el fago MRH6 tras incubacioacuten de 0 8 24 y 48 h y con 3 concentraciones de fagos a) 6 b) 7 y c) 8 UFPmL respectivamente
La DEM es un meacutetodo altamente sensible que se caracteriza por la formacioacuten de imaacutegenes
amplificadas y es considerada una teacutecnica poderosa con altos niveles de sensibilidad y
resolucioacuten Tomando como referencia los resultados se considera que la DEM es una
herramienta eficaz para el conteo bacteriano pero hay que considerar la experiencia del
observador
Resultados y discusioacuten
85
En algunas ocasiones al observar las bacterias atacadas por los fago se pueden encontrar
muestras con material geneacutetico mezclado con restos celulares esta situacioacuten hace que
algunos investigadores recomienden extraer los fagos de la muestra antes de sembrar las
bacterias con el fin de determinar la reduccioacuten bacteriana uacutenicamente debida a la actividad
virulenta del fago sobre la muestra y no a la infeccioacuten por fagos libres presentes en el agar
(Sharma et al 2009) En ese sentido tal como reporta Fuster-Valls et al (2008) en su trabajo
observoacute que el limite de deteccioacuten de esta teacutecnica es de 279 log10 celulas por cm2 en cambio
en nuestro trabajo y tal como se observa en la figura 14 se pudo llegar a una sensibilidad
muy proacutexima a 2 y que coincide con las imaacutegenes de la figura 13 en las que a las 24 y 48
horas apenas se observan algunas manchas que corresponden al crecimiento bacteriano
Los fagos utilizan los recursos de la ceacutelula para hacer muchos fagos nuevos lo que causa
que la ceacutelula lise (estalle) y muera en el proceso La lisis en las uacuteltimas etapas del ciclo liacutetico
el fago expresa los genes para las proteiacutenas que hacen agujeros en la membrana plasmaacutetica
y la pared celular En la figura 14 se puede observar como el recuento de Salmonella Typhi
ATCC 19430 disminuye por el ataque del fago MRH6 El efecto del fago es muy fuerte y al
final los conteos son muy parecidos
Resultados y discusioacuten
86
Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 en superficies de acero inoxidable por el fago MRH6 con diferentes concentraciones y hasta 48 h de incubacioacuten
En este trabajo se buscoacute crear condiciones de infeccioacuten fago-bacteria en el laboratorio
como las que se pudieran presentar en la industria Los resultados de esta relacioacuten del fago
MRH6 y S Typhi ATCC 19430 muestran que la aplicacioacuten del fago es efectiva pero hay que
considerar que funciona mejor a altos tiacutetulos (108 UFCmL) y que deberaacute de potenciarse
cuando se trate de un coctel de fagos
Nuestros resultados sugieren que los fagos pueden ser utilizados como un meacutetodo para
controlar un biofilm formado por un bacteria especiacutefica
Al realizar la buacutesqueda de informacioacuten en diferentes motores de buacutesqueda una de las
plataformas de libre acceso (Pubmed) se obtuvo una relacioacuten de 5 en publicaciones de
00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Salm
on
ella
Typ
hi
AT
CC
19430
(lo
g1
0ceacutelu
las cm
2)
Tiempo (h)
Fago MRH6 a 6 Logml Fago MRH6 a 7 Logml Fago MRH6 a 8 Logml Control sin fago
Resultados y discusioacuten
87
fagos contra diferentes serovariedades de Salmonella spp lo que se puede traducir en que
hay un aacuterea de oportunidad latente
Las consideraciones que se enviacutean como propuesta es que existen en estos momentos
muchos trabajos sobre fagos pero aquiacute en Meacutexico no hay trabajos reportados y los que
existen estaacuten apenas en fases iniciales
Existe un enorme potencial de trabajo en esta aacuterea con los fagos tal es el caso de la
fagoterapia en otros sitos y en otros tiempos estaacuten realizando experimentos para ser
explotada como alternativa para todos los aacutembitos desde hogares industria salud animales
vegetales etc Por lo menos en EE UU tienen grandes avances en estudios relacionados
con la aplicacioacuten en bacterias multiresistentes que por el uso de antibioacuteticos han mutado esto
en el sector salud donde se estaacute perdiendo la batalla
Una de las fortalezas de estudiar a los fagos es que antes de que los antibioacuteticos fueran
descubiertos habiacutea investigacioacuten considerable sobre los fagos como tratamiento para las
enfermedades bacterianas humanas por lo menos en parte de Europa La aplcacion de los
fagos es potencialmente son buenos candidatos para tratar enfermedades bacterianas en
seres humanos inocuidad aliemnaria bioremediacioacuten y cada regioacuten tiene fagos endeacutemicos y
este tabajo representa de los primeros en llevarse en Monterrey
Ciertas limitaciones de los resultados se debiooacute a las condiciones que se presentaron al
realizar el estudio (laboratorio equipo conocimiento del tema) solamente se pudo aislar un
fago y lo recomendable es que sean varios fagos dado que son muy especiacuteficos de especie
o hasta de cepa Se proboacute su accioacuten sobre superficies con un solo cultivo bacteriano y en la
realidad las superficies se contaminan con diferentes bacterias
Lo que se vizualiza para nuestro estudio es sugerir varias liacuteneas de accioacuten a futuro Por
ejemplo el fago aislado podriacutea probarse in vivo sobre carne de pollo o fagoterapia tambieacuten
podriacutea continuar los estudios para aislar maacutes fagos y hacer mezclas (coacutecteles) que tuvieran
un mayor rango de actividad y combatir a diversas especies de Salmonella Con respecto al
tratamiento de superficies podriacutean utilizarse coacutecteles de fagos para tratar biofilms bacterianos
formados por maacutes de dos especies o inclusive podriacutean probarse en biopeliacuteculas industriales
reales
Resultados y discusioacuten
88
89
VI CONCLUSIONES
90
Conclusiones
91
De las 39 muestras de agua analizadas se aislaron tentativamente15 fagos de los que soacutelo 4
mantuvieron en un primer momento su actividad liacutetica estos fagos se correspondieron con las
muestras de agua 15 21 26 y 33 Se siguioacute trabajando con ellos y finalmente solo uno de
ellos el MRH6 mantuvo su actividad liacutetica despueacutes de varias amplificaciones este fago se
aisloacute de las aguas residuales de Mariacuten
Se consiguioacute optimizar la teacutecnica ADC cambiando la agarosa que tiene un alto costo por
agar-agar maacutes econoacutemico sin alterar la fiabilidad de la teacutecnica ademaacutes con este cambio se
facilita el manejo
En relacioacuten con la especificidad de los 15 fagos aislados frente a las 16 cepas de
enterobacterias probadas (12 cepas de Salmonella spp y 4 de E coli) se observa ciertas
tendencias marcadas Ninguno de los fagos ataca a las cepas de E coli probadas En cuanto
a Salmonella se observa una fuerte especificidad frente a S Typhi (ATCC 19430) una ligera
actividad frente a varias cepas de S enterica y no hubo efecto contra las demaacutes cepas de
Salmonella ensayadas lo cual confirma la elevada especificidad fago-hueacutesped
Las imaacutegenes obtenidas mediante DEM muestran una morfologiacutea caracteriacutestica de cabeza
icosaeacutedrica estructura alargada y cola no contraacutectil que sugieren que el fago MRH6 se puede
clasificar en la familia Siphoviridae
Se observa un efecto liacutetico progresivo del fago MRH6 frente a biofilms de Salmonella en
discos de acero inoxidable llegando a valores miacutenimos inferiores a 102 a las 48 horas de
incubacioacuten para todas las concentraciones de fago utilizadas (6 a 8 UFPmL)
Se comprueba que la DEM es un buen meacutetodo para la cuantificacioacuten del crecimiento de S
Typhi (ATCC 19430) sobre discos de acero inoxidable con una gran sensibilidad y resolucioacuten
ya que se observaron claras diferencias en los diversos tiempos de incubacioacuten ensayados y
a diferentes concentraciones del fago MRH6 Esto confirma que la teacutecnica es una herramienta
eficaz para valorar el efecto liacutetico de los fagos sobre biofilms
Ya que en este trabajo solamente se obtuvo un fago liacutetico se sugiere reflexionar acerca de
los factores que han dificultado la obtencioacuten de un nuacutemero maacutes amplio de fagos
Conclusiones
92
Este trabajo refleja el gran intereacutes por iniciar o regresar a trabajar con fagos tal como esta
sucediendo en otras partes del mundo Hasta el momento hay muchas espectaivas sin
embargo todaviacutea se necesita investigacioacuten para saber queacute tan seguros son
93
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E Fagos 35
E1 Antecedentes 35
E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos 37
E3 Clasificacioacuten de los fagos 37
E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico 39
E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten 39
F Biofilm 40
G Microscopiacutea electroacutenica 41
H Fagoterapia 42
III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 47
A Objetivo general 49
B Objetivos especiacuteficos 49
C Plan de trabajo 49
IV MATERIALES Y MEacuteTODOS 51
A Toma de muestras 53
B Obtencioacuten de fagos 54
B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55
B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55
B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas 56
B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos 56
B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC) 58
B6 Modelo de infeccioacuten 59
B7 Controles utilizados durante los ensayos 60
B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium 60
C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos 61
D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica 63
D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 64
D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM 65
V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 67
A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras 69
B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis 70
B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S Typhimurium 70
B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium 72
B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis 72
B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis 73
B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten 73
C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli 75
D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM 80
D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 81
D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable 83
VI CONCLUSIONES 89
VII BIBLIOGRAFIacuteA 93
Iacutendice de figuras
Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa 16
Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por Salmonella spp 24
Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella 24
Figura 4 Adsorcioacuten del bacterioacutefago T4 e inyeccioacuten del ADN 39
Figura 5 Diagrama general de trabajo 50
Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten bacterioacutefago-hueacutesped 59
Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten 62
Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por bacterioacutefagos 74
Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria 79
Figura 10 Imagen por TEM del bacterioacutefago MRH6 80
Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 81
Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable 82
Figura 13 Secuencia de imaacutegenes del DEM 84
Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 por el fago MRH6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86
Iacutendice de tablas
Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias 19
Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos 25
Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales 33
Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos 38
Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos 44
Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria 45
Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos 54
Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten 57
Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos 70
Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC 71
Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium 72
Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis 73
Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten 75
Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades 77
Lista de abreviaturas y acroacutenimos
ADN Aacutecido desoxirribonucleico
ARN Aacutecido ribonucleico
ADC Agar doble capa
AS Agar suave
AECID Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el
Desarrollo
ATCC American Type Culture Collection
APPCC Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control
aw Actividad del agua
BGA Agar verde brillante
BHI Infusioacuten cerebro corazoacuten
CCUG Culture Collection University of Goumltenborg
CENAVECE Centro Nacional de Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de
Enfermedades
CETC Coleccioacuten Espantildeola de Cultivos Tipo
CINSP Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica
EDTA Etilendiaminotetraceacutetico
DEM Microscoacutepica de epifluorescencia directa
EE UU Estados Unidos de Norteameacuterica
ETA Enfermedades transmitidas por alimentos
FAO Food and Agriculture Organization (Organizacioacuten de las
Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura)
FaSPyN Facultad de Salud Puacuteblica y Nutricioacuten UANL
FAUANL Facultad de Agronomiacutea UANL Unidad Mariacuten NL
FCB Facultad de Ciencias Bioloacutegicas UANL
HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points (Anaacutelisis de
Peligros y Puntos Criacuteticos de Control)
INEGI Instituto Nacional de Estadiacutestica y Geografiacutea de los Estados
Unidos Mexicanos
nd Aparente baja efectividad o halo difuso
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
PANALIMENTOS Instituto Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y
Zoonosis
PEG Polietilenglicol
SDS Dodecilsulfato soacutedico
SIRVETA Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos
SSF Solucioacuten salina fisioloacutegica
SUH o SHU Siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico
TEM Microscopio electroacutenico de transmisioacuten
TSA Agar soya de tripicasa
TSAYE TSA con 06 de extracto de levadura
TSB Caldo de soja trypticasa
UAB Universitat Autogravenoma de Barcelona
UANL Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
ZMM Zona Metropolitana de Monterrey
RESUMEN
La inocuidad alimentaria es un tema amplio y relevante que impacta directamente en todos
los segmentos de la sociedad involucra productores desarrolladores innovadores
consumidores y gobierno ademaacutes de diversos sectores como la industria la ingenieriacutea y hasta
la educacioacuten Sin embargo las nuevas tecnologiacuteas en la cadena de produccioacuten provocan que
eacutesta sea maacutes larga y compleja
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) causan alta morbilidad y varios casos
de mortalidad Entre los agentes infecciosos maacutes comunes se encuentran Salmonella spp
Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus
Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus
Los bacterioacutefagos o fagos son virus bacterianos especiacuteficos de una ceacutelula hueacutesped en la
cual se multiplican invadiendo su maquinaria de material geneacutetico Son los sistemas bioloacutegicos
maacutes abundantes del planeta se encuentran en el medio ambiente y se introducen y conviven
en la flora intestinal de otros seres cuando eacutestos ingieren diversos alimentos ya sean de tipo
animal o vegetal
El objetivo del presente trabajo fue aislar y probar la especificidad de una serie de fagos de
Salmonella spp a partir de aguas residuales para lo cual se utilizaron muestras de agua
recolectadas de diferentes localidades del aacuterea metropolitana de Monterrey N L Meacutexico La
purificacioacuten de fagos se llevoacute a cabo mediante la teacutecnica de agar doble capa (ADC) hasta
obtener placas liacuteticas uniformes y se usaron diferentes cepas de referencia de Salmonella
como cultivos indicadores
Se aislaron un total de 15 fagos putativamente distintos de los cuales al pasar las pruebas
de replicacioacuten soacutelo uno logroacute mantener la capacidad liacutetica Se seleccionoacute y purificoacute para
realizar pruebas in vitro especiacuteficas para Salmonella Se utilizoacute una concentracioacuten de fagos
de 1x1012 UFPmL para analizar al fago mediante su morfologiacutea por microscopiacutea electroacutenica
la cual se identificoacute como miembro de la familia Siphoviridae Asiacute mismo se probaron los fagos
contra Salmonella in situ en discos de acero que simulan las superficies de trabajo y para
analizar el efecto de la infeccioacuten del fago sobre Salmonella en los discos de acero inoxidable
se utilizoacute el microscopio de epifluorescencia
Para el conteo de fagos se utilizoacute los meacutetodos LIVEDEAD Para finalizar para evaluar la
efectividad del fago MRH6 que resulto liacutetico en nuestro ensayo se procedioacute a dar las
condiciones necesarias para la formacioacuten del biofilm de Salmonella sobre superficies de acero
inoxidable El fago MRH6 fue capaz de disgregar los biofilms a temperatura ambiente Las
mayores reducciones de Salmonella en un menor tiempo se obtuvieron con concentraciones
de fago mayores a 1x108 UFPmL El meacutetodo de cultivo mostroacute reducciones del patoacutegeno a
niveles indetectables sin embargo la tincioacuten vital reveloacute la presencia de ceacutelulas viables
(coloracioacuten verde) que podriacutea representar un riesgo de contaminacioacuten cruzada estas
pudieran tambieacuten presentarse por la presencia de material orgaacutenico Este trabajo con un fago
puede proporcionar una medida adyuvante para controlar la contaminacioacuten de superficies de
acero inoxidable con biofilms de Salmonella La DEM resultoacute ser una buena herramienta para
evaluar raacutepida y adecuadamente por observacioacuten y posterior anaacutelisis el efecto de los fagos
SUMMARY
Food safety is a broad and relevant issue that directly affects all aspects of society involving
producers developers innovators consumers and government as well as various sectors
such as industry engineering and even education However new technologies in the
production chain cause it to be longer and more complex
Foodborne diseases (ETA) cause high morbidity and several cases of mortality Among the
most common infectious agents are Salmonella spp Campylobacter spp Escherichia coli
Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus Clostridium botulinum Listeria
monocytogenes and Staphylococcus aureus
Bacteriophages or phages are bacterial viruses specific to a host cell in which they multiply
by invading their machinery of genetic material They are the most abundant biological systems
on the planet they can be found in the environment In organisms they enter and coexist in
the intestinal flora of other beings when they ingest various foods whether animal or vegetable
The objective of this study was to isolate and test the specificity of a series of phages of
Salmonella spp from wastewater for which water samples were collected from different
locations in the metropolitan area of Monterrey N L Meacutexico The purification of phages was
carried out by means of the double layer agar technique (ADC) until uniform lithic plates were
obtained and different Salmonella reference strains were used as indicator cultures
A total of 15 putatively different phages were isolated of which upon passing the replication
tests only one managed to maintain the lytic capacity It was selected and purified to perform
specific in vitro tests for Salmonella A phage concentration of 1x1012 PFUmL was used to
analyze the phage by means of its electron microscopy morphology which was identified as a
member of the Siphoviridae family Likewise the phages against Salmonella were tested in
situ on steel discs simulating the work surfaces and the epifluorescence microscope was used
to analyze the effect of phage infection on Salmonella on the stainless steel discs
For the phage count the LIVE DEAD Finally in order to evaluate the effectiveness of the
phage MRH6 that was lytic in our trial the necessary conditions for the formation of the
Salmonella biofilm on stainless steel surfaces were established The phage MRH6 was able
to disintegrate the biofilms at room temperature The greatest reductions of Salmonella in a
shorter time were obtained with phage concentrations greater than 1x107 PFUmL The culture
method showed reductions of the pathogen to undetectable levels however vital staining
revealed the presence of viable cells (green coloration) which could represent a risk of cross
contamination these could also be presented by the presence of organic material This work
with a phage can provide an adjuvant measure to control contamination of stainless steel
surfaces with Salmonella biofilms The DEM proved to be a dependable tool to quickly and
adequately evaluate the effect of phages by observation and subsequent analysis
RESUM
La innocuiumltat alimentagraveria eacutes un tema ampli i rellevant que impacta directament en tots els
segments de la societat involucra productors desenvolupadors innovadors consumidors i
govern a meacutes de diversos sectors com la induacutestria lenginyeria i fins a leducacioacute No obstant
aixograve les noves tecnologies en la cadena de produccioacute provoquen que aquesta sigui meacutes llarga
i complexa
Les malalties transmeses per aliments (ETA) causen alta morbiditat i diversos casos de
mortalitat Entre els agents infecciosos meacutes comuns es troben Salmonella spp
Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus
Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus
Els bacteriogravefags o fags soacuten virus bacterians especiacutefics duna cegravelmiddotlula hoste en la qual es
multipliquen envaint la seva maquinagraveria de material genegravetic Soacuten els sistemes biologravegics meacutes
abundants del planeta es troben en el medi ambient i sintrodueixen i conviuen en la flora
intestinal daltres eacutessers quan aquests ingereixen diversos aliments ja siguin de tipus animal
o vegetal
Lobjectiu del present treball va ser aiumlllar i provar lespecificitat duna segraverie de fags de
Salmonella spp a partir daiguumles residuals per a aixograve es van utilitzar mostres daigua recollides
de diferents localitats de lagraverea metropolitana de Monterrey N L Megravexic La purificacioacute de fags
es va dur a terme mitjanccedilant la tegravecnica dagar doble capa (ADC) fins a obtenir plaques liacutetiques
uniformes i es van usar diferents soques de referegravencia de Salmonella com a cultius indicadors
Es van aiumlllar un total de 15 fags possiblement diferents dels quals en passar les proves
de replicacioacute nomeacutes un va aconseguir mantenir la capacitat liacutetica Es va seleccionar i va
purificar per realitzar proves in vitro especiacutefiques per Salmonella Es va utilitzar una
concentracioacute de fags de 1x1012 UFPmL per analitzar fag mitjanccedilant la seva morfologia per
microscogravepia electrogravenica la qual es va identificar com a membre de la famiacutelia Siphoviridae Aixiacute
mateix es van provar els fags contra Salmonella in situ en discos dacer que simulen les
superfiacutecies de treball i per analitzar lefecte de la infeccioacute del fag sobre Salmonella en els
discos dacer inoxidable es va utilitzar el microscopi depifluorescegravencia
Per al recompte de fags es va utilitzar els megravetodes LIVE DEAD Per finalitzar per avaluar
lefectivitat del fag MRH6 que va resultar liacutetic en el nostre assaig es va procedir a donar les
condicions necessagraveria per a la formacioacute del biofilm de Salmonella sobre superfiacutecies dacer
inoxidable El fag MRH6 va ser capaccedil de disgregar els biofilms a temperatura ambient Les
majors reduccions de Salmonella en un menor temps es van obtenir amb concentracions de
fag majors a 1x107 UFP mL El megravetode de cultiu va mostrar reduccions del patogen a nivells
indetectables perograve la tincioacute vital revelar la presegravencia de cegravelmiddotlules viables (coloracioacute verda)
que podria representar un risc de contaminacioacute creuada aquestes poguessin tambeacute
presentar-se per la presegravencia de material orgagravenic Aquest treball amb un fag pot proporcionar
una mesura adjuvant per controlar la contaminacioacute de superfiacutecies dacer inoxidable amb
biofilms de Salmonella La DEM va resultar ser una bona eina per avaluar ragravepida i
adequadament per observacioacute i posterior anagravelisi lefecte dels fags
7
I INTRODUCCIOacuteN
Introduccioacuten
8
Introduccioacuten
9
Presentacioacuten del proyecto
Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica sobre las innovaciones en seguridad alimentaria en
Meacutexico la cual puso en evidencia la necesidad de analizar alternativas enmarcadas en el
aacutembito del uso de las tecnologiacuteas verdes lo que presentoacute la posibilidad de desarrollar un
trabajo innovador y que no se estuviera aplicando ya en el sector alimentario local o nacional
De esa manera se inician las actividades experimentales que para este trabajo doctoral se
dividieron en dos partes la primera realizada en Meacutexico y la segunda en Espantildea
En primera instancia se desarrolloacute un anaacutelisis en el Laboratorio de geneacutetica y biologiacutea
molecular del Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica (CINSP) en el Campus
Ciencias de la Salud de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) y gracias al apoyo
de Programa de mejoramiento del profesorado (PROMEP nuacutemero UANL-326) por medio de
una beca se iniciaron los estudios y asiacute se cumplioacute el primer propoacutesito que fue obtener virus
nativos contra cepas de Salmonella y purificarlos
Posteriormente para lograr los demaacutes objetivos que eran realizar la caracterizacioacuten parcial
de los fagos contra Salmonella se solicitoacute una beca a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten
Internacional para el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y
de Cooperacioacuten curso 2010-2011) con el fin de realizar una estancia de investigacioacuten y crear
oportunidades de desarrollo aprovechando las tecnologiacuteas innovadoras disponibles en la
Universitat Autoacutenoma de Barcelona (UAB) considerando ademaacutes que la alta reputacioacuten de la
institucioacuten y la supervisioacuten por parte de sus investigadores impactariacutean positivamente en el
desarrollo del trabajo y en el Curriculum Vitae del investigador y por consiguiente en su futuro
profesional como docente e investigador
Otra finalidad de este proyecto fue dejar un buen referente al concluir la estancia ya que
ello ofreceriacutea nuevas oportunidades para seguir forjando el perfil del investigador cimentaraacute
cualquier trayectoria profesional y facilitariacutea optar por un plan postdoctoral en esta misma
Universidad De esta manera se accedioacute a la beca del Programa Extranjeros II-A
Convocatoria 2010-2011 Nuacutemero 0000521211 del cual se cumplieron los objetivos
establecidos y otros maacutes por ejemplo conocer nuevas tecnologiacuteas
Siendo eacutesta una liacutenea de investigacioacuten relativamente reciente en Meacutexico se espera que
impacte en las posibilidades laborales en diversos contextos y seacutea de utilidad para sentar
precedentes para futuras liacuteneas de trabajo en dicha aacuterea
Introduccioacuten
10
Justificacioacuten
En las uacuteltimas deacutecadas los cambios ocurridos en la produccioacuten y consumo de alimentos
han tenido un impacto sobre la inocuidad alimentaria La industria en la produccioacuten masiva de
alimentos ha evolucionado de ser local a constituirse en otra donde la produccioacuten yo el
procesamiento estaacuten localizados en diferentes partes del paiacutes o del mundo Por otra parte la
poblacioacuten estaacute envejeciendo por lo que se vuelve maacutes vulnerable a problemas de salud
ademaacutes los agentes patoacutegenos son cada vez maacutes virulentos (DeWaal y Barlow 2014)
Los reportes sobre problemas gastrointestinales que recopila el Centro Nacional de
Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades (CENAVECE) indican que Nuevo
Leoacuten ha permanecido dentro de los primeros 12 lugares de casos de fiebre tifoidea y en los
primeros 14 de fiebre paratifoidea y otras salmonelosis A nivel nacional las enfermedades
infecciosas intestinales se ubican entre las primeras 10 causas de mortalidad de nintildeos en
edad escolar entre los 5 y 14 antildeos de edad (CENAVECE 2007)
Los microorganismos del geacutenero Salmonella pertenecen a la familia Enterobacteriaceae
Son bacilos o cilindros con puntas redondeadas y se diferencian de las demaacutes enterobacterias
mediante reacciones bioquiacutemicas y de aglutinacioacuten existen maacutes de 2500 serotipos todos
ellos patoacutegenos Actualmente se considera una sola especie denominada Salmonella
enterica de la cual seguacuten el esquema de Kauffmann-White se clasifican nueve serogrupos
Esta especie tiene importancia cliacutenica debido a que es la uacutenica capaz de infectar animales
homeotermos esta investigacioacuten se centra en cuatro serovariedades Salmonella enterica
serovar Typhimurium (S Typhimurium) S enterica serovar Paratyphi (S Paratyphi) S
enterica serovar Enteritidis (S Enteritidis) y S enterica serovar Typhi (S Typhi) estos
microorganismos se pueden aislar tanto de fuentes alimentarias (carne de res pollo crudo
huevo fresco carne de puerco almejas chorizos vegetales entre otros) como del medio
ambiente (suelo agua materia fecal y superficies) (Chlebicz y Śliżewska 2018 Nguendo
2018)
En Meacutexico S Enteritidis y S Typhimurium son los microorganismos aislados con mayor
frecuencia en las salmonelosis Normalmente S Enteritidis habita en el intestino de los
animales sin causar enfermedad pero puede infectar a humanos y promover diarrea voacutemito
dolor abdominal calambres y ocasionalmente insuficiencia renal y en los peores casos la
muerte (DeWaal y Barlow 2014) La contaminacioacuten de alimentos por Salmonella spp se debe
Introduccioacuten
11
a una combinacioacuten de factores relacionados con la produccioacuten a gran escala o cambios en el
manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los mismos (Uribe y Suarez 2006)
Por otra parte estaacuten los virus que pueden replicarse independientemente de los
cromosomas de una ceacutelula pero no sin su participacioacuten (Madigan y Martinko 2006) El hecho
de descubrir virus que pueden infectar y destruir bacterias fue recibido con optimismo por su
posible aplicacioacuten en usos terapeacuteuticos (McLaughlin et al 2006)
En un estudio realizado en diversos estados de Meacutexico (Coahuila Durango Estado de
Meacutexico Jalisco Morelos Oaxaca Puebla y Quereacutetaro) se ha fagotipado Salmonella spp
proveniente de huevo carne de pollo de engorde y gallinas progenitoras reproductoras de
postura comercial y productoras (Mancera et al 2004) Ademaacutes diversas investigaciones han
utilizado fagos liacuteticos para reducir la contaminacioacuten por Salmonella en pollos (canal y piel)
semillas germinadas y dulces de frutas cortadas (Goode et al 2003)
El uso de aditivos en los alimentos se ha reducido considerablemente debido al rechazo
generalizado por parte de los consumidores lo que podriacutea repercutir en un incremento en los
casos de intoxicaciones alimentarias En este contexto los fagos aportan ventajas sobre los
desinfectantes conocidos y los meacutetodos tradicionales de aplicacioacuten de friacuteo o calor ya que
pueden actuar como agentes de deteccioacuten y control bioloacutegico de bacterias patoacutegenas en
alimentos y su produccioacuten es relativamente raacutepida y econoacutemica (Atterbury et al 2003)
La utilidad de los fagos en el aacuterea de investigacioacuten es amplia una posible utilidad es ser
un instrumento para identificar cepas bacterianas especiacuteficas Tambieacuten se han utilizado para
el estudio de diversos fenoacutemenos moleculares el trabajo con estos virus permitioacute desarrollar
ensayos de placas de lisis conocer la naturaleza del ciclo de vida viral los tipos de mutaciones
geneacuteticas y los genes como segmentos de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) (Muniesa et al
2005)
Las empresas dedicadas a la biotecnologiacutea (Intralytix Omnilytics) se centran en desarrollar
productos utilizando fagos especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan las ETA y estos
productos comerciales de terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones
(Segundo 2010) Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos antildeos debido a sus
caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutefico sin dantildear la microbiota
en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros distribucioacuten de
Introduccioacuten
12
esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla (Oh y Park
2017)
En este sentido el objetivo general de este estudio es el aislamiento y caracterizarizacion
de fagos contra Salmonella a partir de diversas fuentes para su uso potencial en el control
bioloacutegico
13
II ANTECEDENTES
Antecedentes
14
Antecedentes
15
A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos
A nivel internacional la produccioacuten de alimentos y todos los mecanismos tecnoloacutegicos
involucrados en su procesamiento implican ademaacutes de la optimizacioacuten de los tiempos y de
la calidad un riesgo para la adquisicioacuten de enfermedades inherentes a la misma adopcioacuten
de nuevas tecnologiacuteas (Weaver et al 2017)
La OMS (2017) estima que las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de
muerte de nintildeos menores de cinco antildeos matan a 525000 nintildeos menores de cinco antildeos
cada antildeo una proporcioacuten significativa de las enfermedades diarreicas se puede prevenir
mediante el acceso al agua potable y a servicios adecuados de saneamiento e higiene
ademaacutes de que en todo el mundo se producen unos 1700 millones de casos de
enfermedades diarreicas infantiles cada antildeo
Seguacuten la OMS (2017) existen diferentes condiciones que propician el desarrollo de las
ETA Como son las de tipo bioloacutegico producidos por hongos o bacterias causantes de
enfermedades ya sea por sus metabolitos o toxinas virus o huevecillos de paraacutesitos asiacute
como los venenos de algunos peces y plantas Las de tipo quiacutemico como productos de
limpieza o desinfeccioacuten pesticidas toxinas marinas insecticidas o venenos y fiacutesicos cuando
en la materia prima de los alimentos se encuentran objetos como vidrios metal piedras
grapas barniz de untildeas joyeriacutea cabellos o cualquier elemento extrantildeo
De acuerdo con el Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos (SIRVETA) ndashdesarrollado por el Instituto
Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y Zoonosis (PANALIMENTOS)ndash ocurrieron 1683
brotes de ETA en Meacutexico que ocasionaron 53860 casos de enfermedades y provocaron
207 muertes mientras que en los demaacutes paiacuteses de Ameacuterica Latina se produjeron durante el
mismo periacuteodo 6324 brotes que provocaron 228579 casos y 314 muertes (Forsythe y
Hayes 2002) Cabe aclarar que eacutestos son soacutelo los brotes notificados por la autoridad
competente El sistema utilizado internacionalmente para obtener alimentos inocuos es el
APPCC (Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control) o HACCP (por sus siglas en ingleacutes
Hazard Analysis and Critical Control Points) que se puede implementar en cualquier tipo de
industria y permite prevenir controlar y eliminar cualquier peligro antes de consumir los
alimentos (Rodriacuteguez Torrens et al 2015)
En Meacutexico el Distintivo H es un programa implementado por los servicios alimentarios
Antecedentes
16
oficiales mediante el cual se ofrece a los clientes alimentos seguros El Centro Nacional de
Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades de Meacutexico (CENAVECE) advierte
que uno de los problemas de salud maacutes importantes lo constituyen los trastornos
gastrointestinales cuya mortalidad predomina entre los 5 y los 14 antildeos Entre 2006 y 2012
el Estado de Nuevo Leoacuten ha permanecido entre los primeros 7 lugares de casos de diarrea
(CENAVECE 2018)
La figura 1 muestra la distribucioacuten de la incidencia en Meacutexico la cual estaacute asociada a la
densidad demograacutefica y la accesibilidad a servicios de salud que facilitan el registro es asiacute
que son precisamente las entidades federativas con mayor poblacioacuten quienes registran
nuacutemeros maacutes altos
Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa en
Meacutexico 2010-2012 (CENAVECE 2018)
A1 Problemaacutetica
La inocuidad alimentaria es una preocupacioacuten mundial que se refleja en el incremento
de reportes y noticias relacionadas con la contaminacioacuten de los alimentos difundidos en
diversos paiacuteses a su vez estos productos son retirados del mercado lo que provoca
peacuterdidas por varios cientos de millones de doacutelares El Codex Alimentarius indica que las ETA
y los dantildeos provocados por los alimentos son en el mejor de los casos desagradables y
Antecedentes
17
en el peor fatales y pueden influir negativamente en el comercio y la confianza de los
consumidores Por consiguiente es imprescindible un control eficaz de la higiene Todos los
eslabones de la cadena alimentaria ndashfabricantes elaboradores manipuladores y
consumidores de alimentosndash son responsables del control de los riesgos microbioloacutegicos
desde la explotacioacuten agriacutecola o ganadera hasta el consumidor final Desde esta oacuteptica el
anaacutelisis de riesgos deberiacutea aplicarse dentro de un contexto estrateacutegico organizativo y
operacional reconocido si bien en el proceso puede haber elementos comunes establecer
un nivel apropiado de proteccioacuten en esos sectores puede representar las maacuteximas
diferencias (Atterbury et al 2003)
La OMS ha identificado siete microorganismos patoacutegenos ndashC jejuni C perfringens E
coli 0157H7 L monocytogenes Salmonella spp S aureus y T gondiindash que causan entre
123 y 33 millones de casos de infeccioacuten solamente en los EE UU lo que representa
peacuterdidas econoacutemicas de entre 5500 y 34900 millones de doacutelares Ademaacutes resalta que su
incidencia podriacutea ser de 300 a 350 veces mayor de lo que indican las estadiacutesticas dado que
soacutelo se notifica un nuacutemero relativamente pequentildeo de casos de ETA Se estima que 70 de
los 1500 millones de episodios de diarrea son causados por alimentos en mal estado Es
posible que en los paiacuteses en desarrollo se notifique a las autoridades sanitarias una
proporcioacuten de casos auacuten inferior principalmente por pobreza y escasez de recursos a
disposicioacuten de los servicios de gestioacuten de la inocuidad alimentaria e inspeccioacuten de alimentos
(Van de Venter 2000)
A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea
La OMS estima que el 88 de los casos de diarrea a nivel mundial son atribuibles al
agua el saneamiento y la higiene todos los aspectos de inocuidad de los alimentos estaacuten
relacionados con estos factores En menor medida la enfermedad se transmite a traveacutes de
otras viacuteas por ejemplo el aire y alrededor del 94 de los casos son atribuibles al
saneamiento ambiental el total de fallecimientos se calcula en maacutes de 15 millones
principalmente en nintildeos en los paiacuteses desarrollados el promedio es ligeramente menor a
90 La diarrea atribuible al agua y saneamiento inapropiado representa 53 de las
muertes totales y 35 en nintildeos europeos de 0-14 antildeos y es ademaacutes una de las causas
principales de malnutricioacuten (Pruumlss-Uumlstuumln y Corvalaacuten 2006)
Antecedentes
18
Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud puacuteblica en el mundo
especialmente en paiacuteses en desarrollo Su alta incidencia se debe en gran parte a la
ingestioacuten de alimentos contaminados con microorganismos patoacutegenos como Salmonella
que causa episodios de diarrea aguda Salmonella spp es uno de los patoacutegenos enteacutericos
maacutes frecuentes tanto en paiacuteses desarrollados como subdesarrollados Dependiendo de la
especie tamantildeo del inoacuteculo factores de virulencia expresados por la cepa hueacutesped
involucrado estado inmunoloacutegico del paciente e intervencioacuten meacutedica puede ocasionar una
infeccioacuten gastrointestinal de media a severa hasta una infeccioacuten sistemaacutetica que
comprometa la vida del paciente (Fernaacutendez 2008)
Otros microorganismos que tambieacuten pueden contaminar el agua y los alimentos como
bacterias (Bacillus cereus Clostridium botulinum Campylobacter jejuni Vibrio cholera) virus
(Norwalk Rotavirus Hepatitis A) y paraacutesitos (Entamoeba histolytica Cryptosporidium
parvum Toxoplasma gondii) pueden transmitirse tambieacuten de una persona a otra como
resultado de una higiene deficiente (Freedman et al 2015)
Estudios de empresas dedicadas exclusivamente a la crianza de cerdos reportan
epidemias como el virus de la diarrea porcina la cual posteriormente se transmite a los
consumidores de estas carnes contaminadas ya sea por contacto con las heces o por
consumo de carnes contaminadas lo cual implica tambieacuten una peacuterdida econoacutemica para la
industria alimentaria resaltando la necesidad de establecer medidas preventivas y
correctivas seguacuten sea el caso (Huss et al 2017)
Seguacuten la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO
por sus siglas en ingleacutes Food and Agriculture Organization) las toxiinfecciones alimentarias
son la segunda causa de morbilidad pero muchas permanecen sin declarar quizaacutes por su
mediana severidad y recuperacioacuten raacutepida salvo el coacutelera Los alimentos son susceptibles a
contaminacioacuten de todo tipo la fuente de agentes causales suele ser el tracto gastrointestinal
de individuos reservorios o las heces de animales y humanos infectados o bien agua
corrompida que por deficiencias sanitarias contamina carne fresca pescados moluscos
pasteles de crema y leche no pasteurizada entre otros productos (Riacuteos et al 2012) como
se puede observar en la tabla 1
Antecedentes
19
Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias (Riacuteos et al 2012)
Agente Periacuteodo de
incubacioacuten Fuente Agente patoacutegeno
Salmonella spp 8-24 h Aves huevos mascotas
(tortugas lagartos pollos) Bacteria y endotoxina
E coli
enterotoxigeacutenica 24-72 h
Agua y alimentos
contaminados
Enterotoxina
termoestable
V cholerae 24-72 h Alimentos contaminados Enterotoxina termolaacutebil
Shigella spp 24-72 h Agua y alimentos
contaminados Bacteria y endotoxina
C jejuni 1-7 d Leche aves de corral y
agua no potable
Bacteria y Enterotoxina
termolaacutebil
Yersinia spp 1-7 d Carne de cerdo leche Bacteria y Enterotoxina
B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria
La historia referente a las toxiinfecciones alimentarias se comienza a documentar y
legislar en el siglo X con el botulismo en Bizanzio y documentos sobre el ergotismo en el
siglo XVI En el siglo XIX aparecen los alimentos enlatados y Louis Pasteur asocia el
deterioro de los alimentos con las bacterias En el siglo XX se produce un desarrollo
espectacular de la microbiologiacutea de los alimentos con el establecimiento de la etiologiacutea de
las toxiinfecciones alimentarias el comienzo de una nueva era de la quiacutemica e ingenieriacutea
alimentaria Aunado a los movimientos migratorios de las personas la diversificacioacuten de
alimentos la produccioacuten masiva de alimentos y la facilidad de transporte desde puntos
lejanos entre la produccioacuten y preferencia en el consumo de alimentos aunadas a la
capacidad que tienen los microorganismos para evolucionar y adaptarse a su medio
ambiente hacen pensar en estos microorganismos como patoacutegenos emergentes (DeWaal y
Barlow 2014)
B1 Escherichia
Las cepas de E coli se pueden diferenciar seroloacutegicamente por los antiacutegenos somaacuteticos
(O) flagelares (H) y capsulares (K) Ademaacutes pueden hallarse fimbrias y estructuras
Antecedentes
20
emparentadas que desempentildean un papel en la patogenia Actualmente se reconocen cinco
grupos de E coli causantes de diarrea en funcioacuten del siacutendrome que provocan cuyas
diferencias estaacuten codificadas por plaacutesmidos (Wright et al 2017) Los diferentes tipos son
E coli enteropatoacutegeno (EPEC) es responsable de la diarrea acuosa en lactantes
Produce voacutemitos fiebre y diarrea acuosa con mocos pero sin sangre Coloniza las
microvellosidades de todo el intestino produciendo la lesioacuten de ldquoadhesioacuten y erosioacutenrdquo en
el ribete en cepillo de la membrana de la vellosidad Afecta a adultos y nintildeos menores de
dos antildeos siendo este rango de edad el principal factor de riesgo
E coli enterotoxigeacutenico (ETEC) es el causante de la llamada vulgarmente ldquodiarrea
del viajerordquo se manifiesta con diarrea acuosa como agua de arroz y poca fiebre
Coloniza la porcioacuten proximal del intestino delgado Afecta a adultos y nintildeos son una causa
frecuente de diarrea en lactantes de paiacuteses en desarrollo asiacute como la causa maacutes comuacuten
de diarrea en individuos de paiacuteses industrializados que viajan a zonas menos
desarrolladas del mundo
E coli enteroinvasor (EIEC) coloniza el colon origina fiebre y diarrea profusa con
heces que contienen mocos y estriacuteas sanguinolentas Presenta un plaacutesmido de 120-140
mD conocido como plaacutesmido invasivo que lleva todos los genes necesarios para la
virulencia Al igual que ETEC pero afecta principalmente a adultos
E coli enterohemorraacutegico (EHEC) origina diarrea sanguinolenta colitis hemorraacutegica
siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico (SUH o SHU) y puacuterpura trombocitopeacutenica En este grupo se
incluye E coli verotoxigeacutenico (VTEC) serotipos O157 O26 O111 Afecta principalmente
a nintildeos el principal factor de riesgo es el consumo de carne sin la coccioacuten adecuada
E coli enteroagregativo (EAggEC) posee caraacutecter clonal diferenciaacutendose dos clones
relacionados (1 y 2) Dentro de cada grupo estaacute presente una variedad concreta de
antiacutegenos O mientras que los antiacutegenos H se conservan
En los reportes cientiacuteficos sobre E coli se refieren a las plantas como otra fuente de
infeccioacuten especiacuteficamente en la espinaca (Spinacia oleracea) y lechuga (Lactuca sativa) Se
recomienda igualmente estudiar profundamente los cultivos y los tejidos vegetables y
animales ya que se deben considerar como paraacutemetros de riesgo para la inocuidad de los
alimentos (Fernaacutendez Ferran et al 2003 Wright et al 2017)
B2 Campylobacter
Campylobacter spp es un bacilo delgado gram negativo (05-08 microm x 02-05 microm) y
Antecedentes
21
microaeroacutefilo (necesita 3-5 de O2 y 2-10 de CO2) Su morfologiacutea puede variar entre
vibrioacutenica (bacilos curvados) espirilar en forma de rosquilla de S y cocoide de tal forma
que en fase logariacutetmica de crecimiento las ceacutelulas tienen forma espiral o curvada pero a
medida que los cultivos envejecen adquieren formas esfeacutericas Moacutevil con un uacutenico flagelo
polar que presenta de dos a tres veces el largo de la ceacutelula Aunque hay diversas especies
de Campylobacter causantes de enfermedades C jejuni C coli y C lari son las especies
que se aiacuteslan con mayor frecuencia en casos de gastroenteritis humana siendo C jejuni la
responsable de la mayoriacutea de las toxiinfecciones alimentarias 89-93 de las
toxiintoxicaciones (OMS 2017)
Las especies C coli y C lari son semejantes a C jejuni su diferencia se basa en pruebas
bioquiacutemicas C coli no es capaz de hidrolizar el piruvato y C lari es capaz de crecer en
presencia de 30 microgramos de aacutecido nalidiacutexico (Haddad et al 2013) La movilidad la
quimiotaxis y los flagelos son factores importantes en la virulencia pues de ellos depende la
colonizacioacuten del epitelio intestinal Campylobacter produce una enterotoxina parecida a la
toxina coleacuterica que tambieacuten juega un papel importante en la patogenia (Nichols 2005) C
jejuni puede sobrevivir de 2 a 4 semanas en condiciones de baja humedad oxigenacioacuten y
temperaturas de 4ordmC superando muchas veces el tiempo de vida uacutetil del producto Asimismo
puede perdurar de 2 a 5 meses a -20ordmC pero a temperatura ambiente apenas dura algunos
diacuteas (Khan et al 2013)
C jejuni y C coli son sensibles a diversos agentes antimicrobianos como los macroacutelidos
los aminoglucoacutesidos el cloranfenicol y la tetraciclina La eritromicina ha sido el antibioacutetico de
eleccioacuten para tratar las infecciones del tracto intestinal Al igual que en Salmonella el control
de Campylobacter se debe realizar tanto en el sector agropecuario como en los
establecimientos alimentarios por lo que los controles especificados para Salmonella
podriacutean extrapolarse a este microorganismo Un aspecto importante de su control reside en
la refrigeracioacuten de las aves ya que la baja temperatura junto con la desecacioacuten superficial
que se produce reduce significativamente la incidencia y los recuentos de Campylobacter
viables incluso en canales altamente contaminadas (Fernaacutendez 2008)
B3 Enterobacter
Conocido antiguamente como Cronobacter spp incluye varias especies de patoacutegenos
emergentes relacionados con brotes de meningitis septicemia y enterocolitis necrotizante
especialmente en neonatos y nintildeos La tasa de mortalidad de estos brotes es alta entre 20
Antecedentes
22
y 80 y los supervivientes suelen sufrir severos desoacuterdenes neuroloacutegicos (Grimont y
Grimont 2006)
E sakazakii es un bacilo moacutevil no esporulado gram negativo que ha sido encontrado en
alimento para bebeacutes es maacutes resistente a los cambios osmoacuteticos y a la sequiacutea que otros
miembros de la familia Enterobacteriaceae y se asocia con casos esporaacutedicos de sepsis
meningitis cerebritis y enterocolitis necrotizante La mayoriacutea de las infecciones se observan
en bebeacutes con bajo peso al nacer y que son alimentados de forma insalubre La mortalidad
ha disminuido a menos de 20 en los uacuteltimos antildeos Este microorganismo no se ha
encontrado presente en la foacutermula laacutectea tampoco existe evidencia de la transmisioacuten de
persona a persona o un medio general de difusioacuten ambiental (Vanegas et al 2009)
B4 Listeria
L monocytogenes estaacute muy difundida en la naturaleza en la que suele adoptar un ciclo
saprofiacutetico en estrecha relacioacuten con el suelo Ademaacutes se ha encontrado en aguas
continentales sedimentos marinos material vegetal en descomposicioacuten forrajes heces
humanas y animales y aguas residuales de explotaciones animales entre otros ambientes
lo que explica su presencia en alimentos crudos Epidemioloacutegicamente se caracteriza por su
ubicuidad sobreviviendo en tierra huacutemeda hasta 500 diacuteas en funcioacuten de la temperatura En
heces o aguas residuales mantenidas a temperatura de refrigeracioacuten sobrevive maacutes de seis
antildeos este periodo se reduce si se mantiene a temperatura ambiente (Guenther et al 2009)
Listeria spp son bacilos gram positivos de forma regular y con forma de vara corta
Algunas veces pueden tener forma cocoide apareciendo como ceacutelulas individuales o en
cadenas cortas Son moacuteviles entre 20-25ordmC pero no a 37ordmC Existen seis especies de Listeria
descritas L monocytogenes L innocua L welshimeri L seeligeri L grayi y L ivanovii
subespecie ivanovii y subespecie londoniensis Las cepas patoacutegenas de L monocytogenes
producen la listeriolisina O responsable de la hemoacutelisis-β y de la destruccioacuten de las ceacutelulas
fagocitarias es una hemolisina que segrega la bacteria a causa de la disminucioacuten de pH
(Liu 2006)
L monocytogenes tolera y se multiplica en concentraciones altas de NaCl contando con
la posibilidad de sobrevivir durante un antildeo en ambientes con una concentracioacuten de 16 su
tolerancia aumenta al disminuir el pH o la temperatura del medio Los tratamientos para su
inactivacioacuten son de 617ordmC35min 70ordmC20min 78ordmC15min u 80ordmC5min favoreciendo su
Antecedentes
23
resistencia al calor con la presencia de grasas Se multiplica entre 0 y 4ordmC las temperaturas
bajas ejercen un efecto protector de tal manera que en condiciones de acidez su inactivacioacuten
es maacutes lenta en refrigeracioacuten que a temperatura ambiente (Leverentz et al 2003) La acidez
influye en la capacidad de Listeria para sobrevivir a la congelacioacuten (temperaturas inferiores
a -47ordmC) y almacenamiento a menos de -18ordmC en carne mostrando una disminucioacuten en la
recuperacioacuten de ceacutelulas viables que han sido dantildeadas por el friacuteo (Wu et al 2015)
B5 Salmonella
B51 Origen
Salmonella tiene su origen principal en el tracto intestinal de animales fundamentalmente
las aves y los porcinos y pueden acabar contaminando las carnes crudas el pollo crudo los
productos marinos crudos o el huevo Los brotes de Salmonella estaacuten asociados al consumo
de alimentos elaborados con huevo crudo y siguen siendo frecuentes a pesar de conocerse
el riesgo que representa su consumo de las medidas legales adoptadas y de los programas
de educacioacuten sanitaria dirigidos a disminuir su incidencia Este geacutenero pertenece a la familia
Enterobacteriaceae fue descrito a principios del siglo XX por el bacterioacutelogo estadounidense
Theobald Smith (Zaidi et al 2006) En la figura 2 se muestran los factores de virulencia y
en la figura 3 se presenta la clasificacioacuten de Salmonella enterica con las diferentes
subespecies y serovares que se aiacuteslan maacutes frecuentemente
Antecedentes
24
Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por
Salmonella spp (Brenner et al 2000)
Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella (Brenner et al 2000)
Antecedentes
25
B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp
La mayoriacutea de los miembros de este geacutenero se encuentra en el tracto intestinal del
hombre y los animales como bacterias patoacutegenas o comensales Estaacute integrado por bacilos
gram negativos anaerobios facultativos y no esporulados La mayor parte de los serotipos
conocidos son moacuteviles mediante flagelos peritricos Se conocen maacutes de 2460 serotipos
muchos de ellos patoacutegenos para el ser humano (Chlebicz y Śliżewska 2018)
Son bacterias invasoras enterotoxigeacutenicas y estaacuten ampliamente diseminadas en todo el
mundo su temperatura ideal de sobrevivencia entre los 15 y los 35degC (mesoacutefilas) y en una
amplitud de pH de 45 a 9 Los microorganismos de este geacutenero se distribuyen en seis
grupos se han definido mediante biotipado hibridacioacuten DNA-DNA anaacutelisis de la secuencia
del RNA ribosomal 16S y por ldquomultilocus enzyme electrophoresisrdquo (MLEE) (Brenner et al
2000) La serotipificacioacuten se utiliza para diferenciar maacutes allaacute del nivel de subespecie como
puede observarse en la tabla 2
Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos (Brenner et al 2000)
Grupo Microorganismo
A S Paratyphi Al
B S Typhimurium S Bredeney
C1 S Choleraesuis S Montevideo S Oranienburg
C2 S Newport
D S Typhi S Enteritidis S Dublin S Gallinarum
E S Butantan S Anatum S Give
Salmonella serotipo Typhi es la causante de la fiebre tifoidea presentando siacutentomas como
son fiebre de intensidad variable cefalea diarrea estrentildeimiento tos naacuteuseas y voacutemitos
anorexia dolor abdominal y escalofriacuteos Mientras que los demaacutes serotipos considerados no
tifoidicos presentan un estado asintomaacutetico En el antildeo 2000 los serotipos aislados con
mayor frecuencia en EE UU fueron S Typhimurium S Enteritidis y S Newport (Dunkley et
Antecedentes
26
al 2009) En Meacutexico los serotipos de Salmonella spp identificados con mayor frecuencia
en los servicios de salud fueron S Typhimurium (204) y S Enteritidis (183) (Guenther
et al 2009)
La salmonelosis se produce por la ingestioacuten de alimentos o bebidas contaminados por
Salmonella se manifiesta como una enterocolitis aguda y se caracteriza por presentar
siacutendromes febriles asociados a manifestaciones gastrointestinales o sisteacutemicas con
frecuencia severas (Figueroa y Verdugo 2005 Fernaacutendez 2008) El cuadro cliacutenico se
localiza baacutesicamente en el iacuteleo terminal y el intestino grueso La enfermedad se manifiesta
a traveacutes de diferentes fases En la primera fase la infeccioacuten se limita a la mucosa intestinal
en la siguiente la bacteria invade el tejido linfaacutetico local y le sigue una fase de bacteriemia
durante la cual la mayoriacutea de las bacterias son fagocitadas por macroacutefagos del hiacutegado y el
bazo (Calva et al 2006 Bettini et al 2012)
Con frecuencia el meacutedico hace un diagnoacutestico basaacutendose en el cuadro cliacutenico del
paciente pero sin contar con los estudios microbioloacutegicos necesarios para establecer un
diagnoacutestico certero cuando se presenta infeccioacuten por Salmonella inicia una fase de
crecimiento bacteriano intracelular el cual despueacutes de varios diacuteas provoca la liberacioacuten de
gran cantidad de patoacutegenos al torrente sanguiacuteneo (Zaidi et al 2006)
La salmonelosis es una enfermedad aguda de distribucioacuten mundial Afecta a todos los
grupos de edad con mayor incidencia en los extremos de la vida provocando infecciones
en forma endeacutemica o en brotes epideacutemicos de intoxicacioacuten alimentaria que en ocasiones
abarcan amplias zonas geograacuteficas debido a las extensas cadenas de distribucioacuten de
alimentos existentes hoy en diacutea (Fernaacutendez 2008)
Para la salud puacuteblica la salmonelosis tiene un impacto socioeconoacutemico tanto en los paiacuteses
en desarrollo como en los paiacuteses desarrollados Ademaacutes al no recibir tratamiento puede
ser causante del siacutendrome de Reiter el cual se manifiesta por dolor en articulaciones
irritacioacuten en los ojos dolor al orinar y puede durar meses o antildeos desencadenaacutendose una
artritis croacutenica (CFSPH 2005) Desde la deacutecada de los ochenta la incidencia de
salmonelosis de origen alimentario ha aumentado considerablemente en Meacutexico Este
incremento es resultado de una combinacioacuten de factores como la calidad del agua utilizada
para riego y el manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los alimentos (Zaidi
et al 2006)
Antecedentes
27
Un meta-anaacutelisis (revisioacuten sistemaacutetica en la cual se combinan matemaacuteticamente los
resultados de varios estudios para contestar una misma pregunta) realizado recientemente
confirma que Salmonella resiste a antibioacuteticos empleados en los alimentos de origen animal
ya que pueden estar contaminados con este microorganismo es resistente a 3 antibioacuteticos
como la amoxicilina las sulfonamidas y las tetraciclinas ya que son ampliamente usados en
produccioacuten animal (Ejo et al 2016)
B53 Manifestaciones cliacutenicas
El cuadro cliacutenico normalmente es de 2 a 5 diacuteas aunque en ocasiones persiste varias
semanas La gravedad de los siacutentomas variacutea considerablemente siendo mayor en nintildeos y
ancianos Si el microorganismo pasa desde el intestino a la corriente sanguiacutenea y llega a
otras partes del cuerpo puede ocasionar la muerte si la persona afectada no es tratada
raacutepidamente La mayoriacutea de las muertes causadas por esta bacteria han ocurrido entre
ancianos que viven en residencias La tasa de mortalidad es baja inferior a 1 en paiacuteses
desarrollados pero suelen producirse de 40-50 muertes al antildeo especialmente entre nintildeos
ancianos o personas inmunodeprimidas Las excretas de los enfermos contienen gran
cantidad de la especie de Salmonella implicada al comienzo de la enfermedad la cifra inicial
decrece seguacuten transcurre el tiempo (DeWaal y Barlow 2014)
El estado de portador se refiere a la condicioacuten en que las personas curadas pueden
eliminar Salmonella en sus heces durante meses La mitad de los individuos afectados
excretan este patoacutegeno de 2-4 semanas posteriores a su curacioacuten cliacutenica entre 10 y 20
continuacutean durante 4-8 semanas unos pocos durante 3 meses y en raras ocasiones se
prolonga hasta 6 meses El microorganismo puede eliminarse tambieacuten por la orina La dosis
infectante capaz de desencadenar la salmonelosis humana es alrededor de 1times105 UFCmL
dependiendo de factores como tipo de alimento virulencia de la cepa involucrada y
susceptibilidad del individuo Entre las especies altamente virales se encuentran la S Dublin
y sobre todo S Enteritidis (Callaway et al 2008)
El incremento del serotipo de S Enteritidis en los casos de salmonelosis humana al
contrario de otras del geacutenero Salmonella representa un importante problema de salud
puacuteblica en muchos paiacuteses ya que este serotipo infecta a gallinas aparentemente sanas que
posteriormente transmiten las enfermedades al hombre Si se consumen huevos crudos o
Antecedentes
28
poco cocidos el microorganismo podriacutea causar la enfermedad El nuacutemero de casos de
salmonelosis se incrementa durante el verano (Parra et al 2002 Callaway et al 2008
Fernaacutendez 2008)
B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis
Gran parte de las salmonelosis se deben al consumo de alimentos de origen animal
(carnes de abasto pollo mariscos pescado leche y huevos asiacute como ovoproductos y
productos laacutecteos no pasteurizados) o de origen vegetal que se contaminan con productos
en malas condiciones de salubridad o mal manipulados Muchos alimentos sobre todo los
de origen animal o contaminados con aguas residuales han servido como vehiacuteculos en
brotes de salmonelosis La carne de matadero estaacute contaminada habitualmente con
Salmonella su incidencia es mayor en las canales de ganado y otros animales debido por
ejemplo a la contaminacioacuten por el contenido intestinal de la res viva cuyas heces manchan
su piel pelo y patas al llegar al matadero Las canales de cerdo se contaminan durante las
operaciones de escaldado y pelado La contaminacioacuten entre las mismas canales y de eacutestas
a utensilios superficies de trabajo y manos de los que las manipulan es faacutecil Otro de los
principales reservorios de Salmonella es la carne de aves de corral La contaminacioacuten de las
canales de pollo y otras aves procede igualmente del tracto intestinal o del material fecal
de los animales que manchan sus patas y plumas Las etapas criacuteticas de la contaminacioacuten
de las canales aviares estaacuten en el desplumado y la evisceracioacuten tambieacuten es comuacuten la
contaminacioacuten cruzada a traveacutes de las manos de los operarios equipo y utensilios utilizados
en la preparacioacuten y troceado de las canales (Marcus et al 2004)
Son raras las salmonelosis adquiridas directamente de carnes bien cocinadas la mayoriacutea
de los brotes se deben a una coccioacuten insuficiente o por contaminacioacuten posterior a su
preparacioacuten Las carnes elaboradas mediante fermentacioacuten (salami chorizo y salchichoacuten)
pueden ser causa de brotes de salmonelosis teniendo en cuenta que las especies que
integran este geacutenero pueden sobrevivir al proceso de fermentacioacuten (Forsythe y Hayes
2002)
Como se mencionoacute anteriormente otro alimento que se asocia con frecuencia a
Salmonella es el huevo La contaminacioacuten se produce por dos viacuteas a traveacutes de la caacutescara
contaminada y por viacutea transovaacuterica en aves infectadas (gallina pata pava) En el primer
caso la superficie de la caacutescara se contamina siempre a su paso por la cloaca o cuando el
Antecedentes
29
huevo estaacute en un ambiente fecal los huevos rotos o manchados constituyen un peligro en
la propagacioacuten de especies de Salmonella (EFSA 2014)
La contaminacioacuten partiendo de la caacutescara se produce si eacutesta mantiene un grado de
humedad apropiado y existe una temperatura diferencial significativa entre el contenido del
huevo y el ambiente La diferencia de temperaturas entre el huevo maacutes elevada y el
ambiente favorece la absorcioacuten de los microorganismos como Salmonella Tambieacuten se
transmite sobre la caacutescara por contaminacioacuten cruzada a traveacutes de los manipuladores que
han tenido contacto con superficies infectadas durante el transporte y almacenamiento de
los mismos en lugares con precarias condiciones de higiene (Ejo et al 2016) Salmonella
es causal de graves enfermedades que son trasmitidas por productos derivados de huevo
contaminado y la asociacioacuten entre la infeccioacuten del tracto reproductivo de los pollos fue un
fuerte incentivo para desarrollar programas de prevencioacuten (Jawale y Lee 2014)
La leche cruda puede albergar Salmonella y ser causa de brotes de salmonelosis se
contamina a traveacutes del pezoacuten y por las manos del ordentildeador la pasteurizacioacuten elimina la
presencia de la bacteria Entre los productos laacutecteos se han identificado como causa de
brotes de salmonelosis la leche en polvo el queso los helados y maacutes raramente la
mantequilla todos ellos por fallos en su elaboracioacuten Salmonella se destruye o inactiva
durante la fermentacioacuten de alta acidez como el yogur y el queso de pH inferior a 45 En el
caso del queso poco aacutecido (pH superior a 49) la Salmonella puede desarrollarse en
cualquier etapa de su elaboracioacuten (Mastroeni y Maskell 2006)
Entre las verduras cualquiera puede contener Salmonella cuando se cultivan con aguas
residuales contaminadas o son fertilizadas con abonos de origen animal Algunos vegetales
como los berros han sido causa de brotes de salmonelosis Por otro lado los mariscos se
contaminan con Salmonella cuando se criacutean en aguas residuales contaminadas por lo que
han sido la causa de numerosos brotes en todo el mundo la depuracioacuten es la medida
preventiva adecuada Diferentes alimentos se han identificado como portadores de
Salmonella entre ellos coco cebada harina de cereales pimienta blanca y negra pasta
cacao en polvo y chocolate (Fernaacutendez 2008) La FDA (2017) reportoacute el aumento de las
pruebas de las cuales ha identificado papayas de dos granjas que resultaron positivas para
las cepas de Salmonella que coinciden con enfermedades no relacionadas con este brote
Antecedentes
30
C Crecimiento microbiano
El crecimiento microbiano puede definirse como un incremento en los constituyentes
celulares que ocasiona un aumento del nuacutemero de ceacutelulas de los microorganismos que se
multiplican por gemacioacuten y fisioacuten binaria En el uacuteltimo caso las ceacutelulas individuales se
agrandan y dividen para originar dos ceacutelulas hijas de un tamantildeo aproximadamente igual
(Atlas y Bartha 2002)
C1 Crecimiento de los microorganismos
Todos los mamiacuteferos incluyendo los seres humanos se adaptan a la vida del mundo
microbiano Louis Pasteur Robert Koch Eacutelie Metchnikoff y Theodor Escherich entre otros
investigadores sentaron las bases conceptuales sobre las interacciones microbio-hueacutesped
Pasteur postuloacute que los microbios eran necesarios para la vida humana y Metchnikoff afirmoacute
que la composicioacuten de la flora microbiana era esencial para el bienestar del hueacutesped
Igualmente Escherich estaba convencido de que el conocimiento preciso de la flora
endoacutegena era esencial no soacutelo para la comprensioacuten de la fisiologiacutea de la digestioacuten sino para
la comprensioacuten de la patologiacutea y terapia de enfermedades microbianas intestinales A pesar
de estas primeras ideas soacutelo recientemente los cientiacuteficos han desarrollado meacutetodos que
permiten caracterizar directamente los mecanismos moleculares que subyacen a la creacioacuten
y mantenimiento de diversos ecosistemas microbianos (Falk et al1998)
El crecimiento de una poblacioacuten bacteriana resulta de la suma de ciclos celulares de todos
sus individuos y suele ser asincroacutenico puesto que cada microorganismo se encuentra en un
punto diferente del ciclo celular Por consiguiente en un momento determinado en una
poblacioacuten se encuentran ceacutelulas que acaban de dividirse otras estaacuten replicando su ADN y
elongaacutendose y otras estaacuten iniciando la divisioacuten celular (Melbinger et al 2015)
El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza en la mayoriacutea de los
casos mediante la produccioacuten de colonias aisladas en cultivos soacutelidos El crecimiento
explosivo de las bacterias produce un gran nuacutemero a partir de una uacutenica ceacutelula inicial de
forma que tras un periacuteodo de tiempo de incubacioacuten en las condiciones ambientales
adecuadas se produce una colonia de individuos iguales Para que un microorganismo
crezca necesita nutrientes que le aporten energiacutea y elementos quiacutemicos para la siacutentesis de
sus constituyentes celulares De acuerdo a la fuente de carbono que utilizan los
Antecedentes
31
microorganismos se clasifican en autoacutetrofos si es el CO2 atmosfeacuterico (microorganismos que
fotosintetizan) y heteroacutetrofos si utilizan carbono orgaacutenico (Ouyang y Li 2013)
C11 Disponibilidad del agua
El agua es un factor importante para el crecimiento microbiano se requiere para crecer y
llevar a cabo las funciones metaboacutelicas de lo contrario los microorganismos se deshidratan
o mueren La aw depende de la concentracioacuten de solutos y de la cantidad de agua disponible
en el medio ambiente La mayoriacutea de las bacterias y hongos necesitan valores entre 098 y
0995 de aw para su pleno desarrollo (Madigan y Martinko 2006)
Una membrana plasmaacutetica permanentemente selectiva separa el contenido
citoplasmaacutetico del microorganismo de su ambiente por ello las alteraciones en la
concentracioacuten osmoacutetica del medio extracelular pueden afectar incluso la viabilidad de los
mismos Si se coloca un microorganismo en una solucioacuten isotoacutenica el agua entraraacute en la
ceacutelula y causaraacute su estallido salvo que la propia ceacutelula desarrolle alguna estrategia para
evitarlo por ejemplo reducir la concentracioacuten osmoacutetica del citoplasma gracias a los cuerpos
de inclusioacuten Los procariotas tambieacuten pueden contener canales sensibles a la presioacuten
osmoacutetica que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno
se vuelve maacutes baja que la del citoplasma (Madigan y Martinko 2006)
C12 Acidez y pH
El pH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad entre 5 y 8 para impedir la
destruccioacuten de las macromoleacuteculas haacutebiles en condiciones aacutecidas o alcalinas Los aacutecidos
fuertes (inorgaacutenicos) y los aacutecidos deacutebiles (orgaacutenicos) disminuyen el pH externo
posteriormente se disocian en el interior de la ceacutelula inhibiendo la actividad enzimaacutetica y el
transporte de nutrientes por lo tanto los microorganismos no pueden generar energiacutea de
almacenamiento y ocurre la muerte celular (Brooks et al1992)
C13 Oxiacutegeno
El oxiacutegeno molecular (O2) influye en el metabolismo de los microorganismos Durante el
Antecedentes
32
proceso de reduccioacuten del O2 se crean formas reactivas como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2)
superoacutexidos (O2-) y radicales hidroxilos (OH-) que producen dantildeo celular por la oxidacioacuten
de compuestos orgaacutenicos e incluso macromoleacuteculas (Prescott et al1999)
C14 Temperatura
La temperatura afecta el desarrollo y la supervivencia de los microorganismos En bajas
temperaturas la velocidad de crecimiento de algunos microorganismos disminuye y los
periacuteodos de latencia se alargan Por otro lado las temperaturas elevadas aceleran las
reacciones enzimaacuteticas (antes de los 40degC) pero si se intensifica el calor en algunos casos
provocan la desnaturalizacioacuten de las proteiacutenas y por consiguiente la lisis celular (Brooks et
al1992)
Es importante considerar que cada microorganismo tiene una temperatura de desarrollo
adecuada a mayor temperatura se produce un incremento lineal de la velocidad de
crecimiento hasta alcanzar el clima perfecto a velocidad maacutexima Por encima de esta
temperatura oacuteptima la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte
celular (Atlas y Bartha 2002) En la tabla 3 se presentan algunas condiciones ambientales
para el desarrollo de los microorganismos
Antecedentes
33
Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales (Lu et al 2006 Madigan et al 2006 Falk et al 2009)
Factor Tipo de
microorganismo Caracteriacutesticas Microorganismo representativo
NaCI
Osmotolerante Capaz de crecer en un amplio rango de aw o
presioacuten osmoacutetica St aureus Saccharomyces rouxii
Haloacutefilo Requiere altas concentraciones de NaCl para
crecer normalmente por encima de 02 M Halobacterium Dunaliella Ectohiorhodospira
pH
Acidoacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 0 y 55 Sulfolobus Picrophilus Ferroplasma Acontium
Cyanidium caldarium
Neutroacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 55 y 80 Euglena Paramecium
Alcaloacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 85 y 1 15 Badilas alcalophilus NaIronobaciacuteerium
Temperatu
ra
Psicroacutefilo Crece bien a 0degC temperatura oacuteptima de 15degC
o inferior Badilas psychrophilus Chlamydomonas nivalis
Psicroacutetrofo Puede crecer a 0-7degC oacuteptima de 20 a 30degC Listeria monocytogenes
Mesoacutefilo Temperatura maacutexima de 35degC
Temperatura oacuteptima alrededor de 20-45degC
P fluorescens E coli Neisseria gonorrhoeae
Trichomonas vaginalis
Termoacutefilo Puede crecer a 55degC o superior temperatura
oacuteptima a menudo entre 55 y 65degC
Geobacillus stearothermophilus Thermus
aquaticus Cyanidium caldarium
Hipertermoacutefilo Temperatura oacuteptima entre 80 y 113degC Chaetomium thermophile Sulfolobus
Atmoacutesfera
Aerobio obligado Completamente dependiente del O2 para
crecer Pseudomonas Mycobacterium tuberculosis
Anaerobio
facultativo
No requiere O2 pero crece mejor en su
presencia
M luteus St aureus
Streptococcus pneumoniae L monocytogenes
Anaerobio
aerotolerante Crece bien en presencia o en ausencia de O2 Lactobacillus
Anaerobio
obligado No tolera el O2 y muere en su presencia Clostridium botulinum C perfringens
Microaeroacutefilo
Requiere nivel de O2 inferior a 2-10 para
crecer y es dantildeado por el O2 (20) C fetus
Antecedentes
34
D Control del crecimiento microbiano
Los microorganismos toleran determinados factores ambientales Asiacute unas bacterias
pueden tener condiciones para su desarrollo y estas condiciones pueden ser nocivas para una
especie bacteriana El crecimiento de una poblacioacuten microbiana se estudia analizando la curva
de crecimiento de un cultivo La curva del crecimiento microbiano representa la evolucioacuten del
nuacutemero de nuacutemero de ceacutelulas viables presente en un cultivo microbiano liacutequido a lo largo del
tiempo de estudio Se estudia el nuacutemero de ceacutelulas viables por mililitro de un cultivo de
volumen limitado y con una cantidad de nutrientes limitada como por ejemplo un medio de
cultivo liacutequido en un matraz que ha sido inoculado con una cantidad inicial de microorganismos
o inoacuteculo (Hunter-Cevera y Belt 1996) Para llevar a cabo estos estudios se distingue tres
niveles entre los modelos de microbiologiacutea predictiva los que describen los cambios en el
nuacutemero de microorganismos con respecto al tiempo con respecto al efecto de las condiciones
ambientales y los que combinan los dos aspectos anteriores (Larcher y Cattaneo 2006)
Se considera el crecimiento de las bacterias en funcioacuten de su fondo geneacutetico en relacioacuten
con los nutrientes y en unas hipoteacuteticas condiciones ideales (oacuteptimas) Sin embargo el trabajo
experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales es decir
una serie de agentes fiacutesicos y quiacutemicos El anaacutelisis de la curva de crecimiento bacteriano es
muy importante para determinar el potencial de una teacutecnica de control especiacutefica Al igual que
las bacterias los fagos al forman una interaccioacuten con su bacteria hueacutesped se necesita
determinar una cuantificacioacuten del nuacutemero de copias que se generan por la infeccioacuten a esta
condicioacuten se le conoce como fase de eclipse siendo el momento idoacuteneo para realizar la
infeccioacuten fago-bacteria (Lee et al 2016)
D1 Agentes fiacutesicos
La temperatura es uno de los paraacutemetros ambientales maacutes importantes que condicionan el
crecimiento y la supervivencia de los microorganismos La temperatura afecta a la velocidad
de crecimiento y por lo tanto al tiempo de generacioacuten Cada bacteria es diferente y esto se
puede observar en una curva de tasa de crecimiento en funcioacuten de la temperatura Si se suele
utilizar calor en combinacioacuten con otros agentes fiacutesicos (filtracioacuten presioacuten y radiacioacuten) Al
aplicar temperaturas altas se refleja desnaturalizacioacuten e inactivacioacuten de proteiacutenas enzimaacuteticas
esenciales colapsamiento de la membrana citoplaacutesmica y a veces lisis teacutermica de la bacteria
Antecedentes
35
esta condicioacuten se presenta raacutepidamente cuando se aplica presioacuten la cual se utiliza para
esterilizar objetos como lo demuestra el uso universal de la autoclave en todos los
laboratorios de microbiologiacutea (Madigan y Martinko 2006) El calor es auacuten uno de los meacutetodos
maacutes comunes para destruir microorganismos se puede aplicar huacutemedo o seco (Salgado-Nava
y Jimeacutenez-Munguiacutea 2012) Por otro lado ademaacutes de aplicar calor si a las bacterias se le
extrae el calor del medio de manera intensa recurrir a la congelacioacuten con fines de conservacioacuten
de microorganismos por largos periacuteodos si se realiza apropiadamente numerosos
laboratorios disponen de congeladores a -30 o -70degC para la conservacioacuten de colecciones de
cultivos microbianos (Shafiei et al 2014)
D2 Agentes quiacutemicos
Aunque los objetos se desinfectan a veces con agentes fiacutesicos tambieacuten las sustancias
quiacutemicas se utilizan con mucha frecuencia por ejemplo los quimioteraacutepicos son sustancias
con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostaacutetica) En estas sustancias se busca
que sea efectivo contra un amplio espectro de microorganismos Pero no existe (hasta estos
momentos) un solo agente capaz de inhibir a todos los microorganismos Por otro lado existen
quimioteraacutepicos de espectro estrecho pero muy selectivos contra ciertas bacterias que son
patoacutegenas importantes Muchos factores influyen en la eficacia de los desinfectantes hay que
considerar la cepa de microorganismos presentes la concentracioacuten y naturaleza del
desinfectante y la duracioacuten del tratamiento Asimismo es imprescindible que las superficies
sucias se limpien antes de aplicar un desinfectante El uso apropiado de los agentes quiacutemicos
es esencial para la seguridad en los laboratorios y hospitales estos mismos productos se
utilizan tambieacuten para evitar el crecimiento microbiano en los alimentos (Prescott et al 1999)
E Fagos
E1 Antecedentes
Los virus son agentes infecciosos submicroscoacutepicos que pueden replicarse
independientemente de los cromosomas de una ceacutelula pero no independientemente de ella
A fin de multiplicarse deben penetrar la ceacutelula donde puedan replicarse a la cual se le
denomina hueacutesped Presentan una forma infecciosa madura que es tiacutepicamente extracelular
Antecedentes
36
Pueden infectar a diferentes seres vivos por lo que existen virus de animales de plantas y
de forma particular los llamados virus bacterianos o fagos (Madigan y Martinko 2006)
Los bacterioacutefagos o fagos (del griego φαγετον paguumlento ldquoalimentoingestioacutenrdquo) son agentes
virales de las bacterias su descubrimiento se atribuye por un lado al bacterioacutelogo ingleacutes F
W Twort que en 1915 mencionoacute el aclaramiento de un cultivo soacutelido de Micrococcus
provocado por un agente desconocido Por otro lado en 1917 el francocanadiense F
dHerelle descubrioacute un grupo de entidades bioloacutegicas en medios de cultivo que se propagaban
a expensas de las bacterias a los cuales les denominoacute fagos y dentro de sus investigaciones
definioacute su potencial uso e importancia cliacutenica Esto se refuerza a partir de 1940 con el
desarrollo del microscopio electroacutenico con el que se demuestra la naturaleza viral de los fagos
y que la forma de estudiarlos es mediante procedimientos microbioloacutegicos convencionales
facilitando su manejo y estudio (Grabow 2001)
La uacuteltima variedad de fagos se descubrioacute durante la Primera Guerra Mundial los tipos ya
conocidos eran los virus que afectaban a vegetales y animales fue entonces que se pensoacute
en que su aplicacioacuten para eliminar bacterias podriacutea ser utilizada para la prevencioacuten y el
tratamiento de enfermedades bacterianas pero no resultoacute (Merril et al 1996) Sin embargo
los fagos resultaron tener otros beneficios especialmente como modelos o sustitutos de los
virus en humanos en la investigacioacuten geneacutetica baacutesica asiacute como en la evaluacioacuten de la calidad
del agua Ademaacutes demostraron ser una herramienta valiosa en la mayoriacutea de las
investigaciones sobre los virus ya que en comparacioacuten con los humanos animales vegetales
e incluso los insectos anfitriones de otros virus los fagos son faacutecil y raacutepidamente reproducibles
en el laboratorio y no son particularmente exigentes con respecto al espacio instalaciones y
equipos El trabajar con fagos requiere la separacioacuten y purificacioacuten y las dos principales tareas
para realizar esto es utilizar meacutetodos quiacutemicos en los cuales se utilizan solutos como buffer
glicerol bromuro de potasio cloruro de cesio y tartrato de potasio aunque el maacutes comuacuten es
la sacarosa ademaacutes involucra la precipitacioacuten con sulfato de amonio polietilenglicol o cloruro
de cesio y los meacutetodos fiacutesicos que implican la centrifugacioacuten a diferentes velocidades y
gradientes de densidad y con menor frecuencia la cromatografiacutea de particioacuten (Sambrook y
Russell 2001)
La investigacioacuten sobre las propiedades baacutesicas de los fagos se desarrolla en la biologiacutea
molecular que permitioacute avances sin precedentes en toda la biologiacutea y ciencias meacutedicas La
Antecedentes
37
concentracioacuten y purificacioacuten es un factor determinante para llevar a cabo la infeccioacuten
eficientemente sin embargo existe un periacuteodo de adaptacioacuten por parte de los fagos antes
que se desarrollen y se logren tiacutetulos apreciables en ceacutelulas cultivadas (Sambrook y Russell
2001 Breeuwer et al 2003)
E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos
Los virus son paraacutesitos intracelulares obligados no tienen metabolismo intriacutenseco y
requieren la maquinaria metaboacutelica codificada por los cromosomas de ceacutelula que puedan
infectar y reproducirse en ella denominada hueacutesped Su tamantildeo oscila entre 20 y 200 nm y
consiste de un nuacutecleo de aacutecido nucleico (ARN o ADN de cadena simple o doble) rodeado por
una cubierta proteica (caacutepside) y en algunos casos una cubierta de liacutepidos Los microbioacutelogos
que investigan la presencia de virus en haacutebitats marinos y han detectado su presencia creen
que son diez veces maacutes numerosos que las bacterias marinas En la superficie de los mares
se encuentran entre 106 y 109 partiacuteculas viacutericas por mililitro y se estima que en la capa
superficial (1 mm) de los oceacuteanos se encuentran unas 3 x 1030 partiacuteculas viacutericas (Grabow
2001 Atterbury et al 2003)
E3 Clasificacioacuten de los fagos
Las variaciones en los fagos se presentan en forma estructural como apeacutendices en la
cabeza cuello y las fibras de la cola o espigas ademaacutes del genoma que variacutea en cada orden
En 1962 Andreacute Lwoff junto a otros investigadores propuso una clasificacioacuten basada en la
morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico Los nombraron de la siguiente manera los urovirales
que presentaban cola pronunciada los inoviridae eran los filamentosos y los microviridae los
tipo φX Posteriormente Bradley (1967) consideroacute la morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico y
agrupoacute a los fagos en seis morfotipos baacutesicos denominados de la A a la F posteriormente se
clasifico en fagos baacutesicos los de cola los filamentosos y los icosaeacutedricos con ADN de cadena
sencilla o RNA de cadena simple Los fagos han sido investigados debido a su rol como
agentes de biocontrol para el desarrollo de la seguridad alimentaria En el presente varios
miles de fagos en contra de varios objetivos han sido aislados de varios entornos y alimentos
Aproximadamente el 96 de los fagos aislados eran con cola y del tipo liacuteticos en una de las
Antecedentes
38
tres familias Myoviridae (245) Siphoviridae (61) y Podoviridae (14) en el orden de los
caudovirales (Atterbury et al 2003 Oh y Park 2017)
En 1971 el Comiteacute Internacional de Taxonomiacutea de Virus (ICTV por sus siglas en ingleacutes)
clasificoacute en 6 geacuteneros de los cuales 5 corresponden a la clasificacioacuten propuesta por Bradley
los grupos T4 λ φX174 MS2 y fd Los fagos pueden tener cola larga y flexible no contraacutectil
(Siphoviridae) cola larga y contraacutectil (Myoviridae) o cola corta (Podoviridae) como se observa
en la tabla 4 Para la clasificacioacuten de los fagos se aplican propiedades como el rango de
hueacutespedes y las relaciones inmunoloacutegicas sin embargo las maacutes importantes son su
morfologiacutea y las caracteriacutesticas de su aacutecido nucleico el cual se adsorbe a componentes de la
superficie celular que actuacutean como receptores especiacuteficos La zona de adsorcioacuten del virus es
complementaria al receptor celular por lo tanto un determinado fago soacutelo puede infectar un
nuacutemero limitado de cepas celulares que contengan a un determinado receptor La naturaleza
de la zona de adsorcioacuten variacutea con el tipo de fago En el T4 se localiza en el extremo de la cola
en donde se encuentran la placa basal las espiacuteculas y las fibras de la cola Las formas maacutes
complejas corresponden a los fagos con colas contraacutectiles (Atterbury et al 2003)
Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos
(Ackermann 2003)
Antecedentes
39
E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico
La multiplicacioacuten de los fagos (figura 4) ADN produce la destruccioacuten de la ceacutelula hueacutesped
mediante lisis lo que provoca su liberacioacuten El ciclo vital de un fago que culmina con el
estallido de la ceacutelula hueacutesped y la liberacioacuten de viriones recibe el nombre de ciclo liacutetico Los
acontecimientos que tienen lugar durante el ciclo liacutetico se revisaraacuten en esta seccioacuten con
especial atencioacuten a los fagos T-par de E coli Estos son fagos de ADN bicatenario con colas
contraacutectiles complejas de la familia Myoviridae son algunos de los virus maacutes complejos
conocidos (Fernaacutendez 2008)
Figura 4 Adsorcioacuten del fago T4 e inyeccioacuten del ADN (Leverentz et al 2003)
Los fagos podriacutean infectar hasta un 70 de la poblacioacuten de procariotas marinos y ser
responsables de la tercera parte de la mortalidad bacteriana acuaacutetica Tambieacuten se han
detectado virus que infectan diatomeas y otras algas importantes del fitoplancton marino lo
cual es de gran transcendencia ecoloacutegica ya que la multiplicacioacuten de bacterias marinas
supera la capacidad de reproduccioacuten de los protozoos La lisis por virus de ceacutelulas procariotas
y de algas puede tambieacuten contribuir enormemente en los ciclos del carbono y nitroacutegeno en las
cadenas troacuteficas marinas incluso podriacutea reducir el nivel de productividad marina como la de
moluscos y peces (Muniesa et al 2005)
E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten
Los fagos no se unen al azar a la superficie de una ceacutelula hueacutesped por el contrario se fijan
a receptores especiacuteficos La naturaleza de estos receptores variacutea de acuerdo al fago pueden
Antecedentes
40
ser lipopolisacaacuteridos y proteiacutenas de la pared celular aacutecidos teicoicos flagelos y pili Los fagos
T-par de E coli en particular utilizan lipopolisacaacuteridos o proteiacutenas de la pared celular como
receptores Las variaciones en las propiedades del receptor son parcialmente responsables
de las preferencias del fagos por el hueacutesped (Muniesa et al 2005 Leeuw et al 2017)
La adsorcioacuten de fagos T-par estaacute relacionada con diversas estructuras del tallo La fijacioacuten
del fago comienza cuando una fibra del tallo establece contacto con los receptores adecuados
a medida que maacutes fibras contactan con los receptores la placa basal se asienta en la
superficie La unioacuten se debe probablemente a interacciones electrostaacuteticas y se ve influida por
el pH y por la presencia de iones como Mg+2 y Ca+2 Una vez que la placa basal estaacute
firmemente asentada en la superficie celular se producen cambios conformacionales en ella
y en la vaina del tallo Esta uacuteltima se reorganiza de tal forma que se contrae pasando de una
conformacioacuten en cilindro de 24 anillos a otra de 12 anillos de longitud maacutes corta y ancha es
entonces cuando el tubo central es empujado a traveacutes de la pared celular bacteriana
Finalmente el ADN es extruido de la cabeza pasa a traveacutes del tubo del tallo y penetra en la
ceacutelula hueacutesped Parece ser que el tubo interacciona con la membrana plasmaacutetica para formar
un poro a traveacutes del cual pasa el ADN los mecanismos de penetracioacuten de otros fagos difieren
a menudo de los fagos T-par aunque no se han estudiado en detalle (Leverentz et al 2003)
F Biofilm
Las bacterias existen en la naturaleza bajo dos formas o estados a) bacterias planctoacutenicas
de libre flotacioacuten y b) bacterias biofilm en colonias de microorganismos seacutesiles (Nazar 2007)
Un biofilm se define como una agrupacioacuten de comunidades seacutesiles microbianas que se fijan a
superficies las ceacutelulas estaacuten incrustadas en una matriz autoproducida que actuacutea como
proteccioacuten quiacutemica y mecaacutenica del entorno asiacute estas bacterias presentan mayor resistencia
a desinfectantes y el secado (Vestby et al 2009) Las bacterias pueden crear condiciones
para formar biofilms casi en cualquier ambiente liacutequido La interfase soacutelido-liacutequido entre una
superficie y un medio acuoso (vgr leche) proporciona un entorno ideal para la fijacioacuten y
crecimiento de microorganismos (Fakruddin et al 2014)
Antecedentes
41
G Microscopiacutea electroacutenica
Los microscopios electroacutenicos se usan habitualmente para el estudio detallado de
estructuras celulares (Bradley 1967) Para analizar las estructuras internas es esencial el
microscopio electroacutenico de transmisioacuten MET En el MET se utilizan electrones en lugar de rayo
de luz las lentes son electromagneacuteticas y se opera en todo momento a alto vaciacuteo
(Ackermann 2003) El poder de resolucioacuten del microscopio electroacutenico es mucho mayor que
el del microscopio oacuteptico incluso pueden observarse estructuras moleculares como proteiacutenas
y aacutecidos nucleicos Sin embargo los haces de electrones tienen escaso poder de penetracioacuten
y una ceacutelula aislada es demasiado gruesa para poder visualizarse directamente por este
motivo se emplean teacutecnicas especiales para la obtencioacuten de cortes ultrafinos a fin de poder
observar las muestras Una ceacutelula bacteriana por ejemplo se corta con una cuchilla especial
en varios cortes ultrafinos de 20-60 nm de espesor que son posteriormente examinados de
manera individual en el microscopio electroacutenico (Fuster-Valls et al 2008) Para obtener
suficiente contraste las preparaciones se tintildeen previamente mediante tratamiento con
compuestos como aacutecido oacutesmico permanganato sales de uranilo o de lantano o plomo Como
estas sustancias poseen aacutetomos pesados son capaces de desviar los electrones y aumentar
el contraste (Madigan y Martinko 2006)
La microscopiacutea electroacutenica es el mejor meacutetodo para estudiar la forma de las bacterias Los
virus bacterianos por tener un diaacutemetro menor de 1000 Aring estaacuten por debajo del liacutemite de
resolucioacuten del microscopio oacuteptico sin embargo es posible observarlos mediante el
microscopio electroacutenico porque eacuteste utiliza una radiacioacuten de longitud de onda maacutes corta que
permite aumentar 100 mil veces una resolucioacuten de 10 Aring (Kruger et al 2000 Ackermann
2003) Para observar detenidamente la morfologiacutea se requiere el microscopio electroacutenico con
especificaciones precisas como el de barrido lo cual es una herramienta indispensable en
biologia molecular (Guzmaacuten 2015)
Para la observacioacuten las partiacuteculas se suspenden en un medio volaacutetil por lo general una
solucioacuten de acetato de amonio y se colocan sobre una membrana sostenida por una rejilla
metaacutelica que praacutecticamente no absorbe electrones El problema teacutecnico maacutes frecuente es la
falta de contraste como la imagen obtenida es el resultado de la dispersioacuten de electrones por
los aacutetomos de la partiacutecula se necesita una diferencia apreciable de poder dispersivo entre las
partiacuteculas y el medio de soporte generalmente se emplean teacutecnicas tradicionales La maacutes
utilizada se conoce como tincioacuten negativa consiste en mezclar la suspensioacuten del fago con
Antecedentes
42
fosfovolframato de sodio o acetato de uranilo a pH neutro A este pH las sales no se combinan
con el fago al secarse forman una capa uniforme y opaca a los electrones en la cual los fagos
destacan como partiacuteculas maacutes claras Como las sales en solucioacuten penetran las irregularidades
en la superficie de la partiacutecula la micrografiacutea revela los detalles finos de los fagos (Fuster-
Valls et al 2008 Montantildeez et al 2012)
La forma del fago se establece de manera visual que es directa de la placa cuando las
UFP que se observan a simple vista como placas liacuteticas a contraluz (APHA 2005) Y para
estudiar la adhesioacuten y formacioacuten celular en diversas superficies se han desarrollado varias
teacutecnicas de microscopiacutea entre las cuales se distinguen la microscopiacutea electroacutenica de barrido
y de transmisioacuten asiacute como la microscopiacutea de epifluorescencia (Fuster-Valls et al 2008) la
cual se basa en los mismos principios de oacuteptica de la microscopiacutea comuacuten con diferencias en
el manejo y el disentildeo relacionadas con la generacioacuten y transmisioacuten de longitudes de onda
adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar ya sean propios de la muestra o de
la coloracioacuten utilizada (Franco 2005)
El fundamento de la teacutecnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o
compuestos fluorescentes denominados fluorocromos en fijarse a los anticuerpos mediante
un enlace quiacutemico estable que no puede romperse durante el curso de la reaccioacuten
inmunoloacutegica La espectroscopia de fluorescencia es la teacutecnica de deteccioacuten oacuteptica maacutes
sensible En el caso de la deteccioacuten en ceacutelulas se exponen a alta energiacutea utilizando laacutemparas
de xenon excitando por varios nanosegundos y asiacute emitiendo una longitud de onda de baja
energiacutea (Franz y Jendreizik 2015)
H Fagoterapia
Las enfermedades infecciosas estaacuten catalogadas entre las primeras causas de muerte en
el mundo y por lo tanto son consideradas un problema de salud puacuteblica Entre ellas las
infecciones bacterianas causan gran preocupacioacuten dado que las bacterias adquieren diacutea a
diacutea mayor resistencia a los antibioacuteticos esto ocurre por medio de diversos mecanismos
fisioloacutegicos y moleculares que les permiten a estos microorganismos adaptarse raacutepidamente
a condiciones adversas (Prada-Pentildearanda et al 2015)
El descubrimiento de los fagos por dacuteHerelle se desarrolloacute cuando eacuteste buscaba una
Antecedentes
43
vacuna que pudiera combatir la crisis de disenteriacutea hemorraacutegica que se presentoacute en 1915 en
las afueras de Francia dacuteHerelle observoacute que tras aislar lisados libres de bacterias de la
materia fecal de los enfermos las bacterias eran destruidas por un agente desconocido
invisible capaz de destruir cultivos de bacterias o producir pequentildeas aacutereas de color maacutes claro
cuando las bacterias eran crecidas en confluencia en placas de medio soacutelido y publicoacute sus
observaciones en el artiacuteculo titulado ldquoSobre un microbio invisible antagonista de los bacilos
de la disenteriacuteardquo (Szafranski et al 2017)
El uso de los fagos como agentes terapeacuteuticos comenzoacute hace maacutes de 80 antildeos Entre los
ejemplos maacutes destacados y recientes de la utilizacioacuten exitosa de la fagoterapia cabe citar el
uso de fagos especiacuteficos en el control bioloacutegico de E coli O157H7 productora de colitis
hemorraacutegica (en alimentos) Tambieacuten se ha estudiado el uso de fagos en el tratamiento de
infecciones peritoneales y otitis externa en la erradicacioacuten de P aeruginosa en pacientes con
fibrosis quiacutestica en el tratamiento de infecciones urinarias y osteomielitis por S aureus y en
la descolonizacioacuten intestinal para combatir las infecciones por Enterococcus faecium
resistente a vancomicina entre otros Los efectos favorables de la fagoterapia podriacutean
exceder incluso su actividad antibacteriana Hay datos sorprendentes acerca de la actividad
in vivo de los fagos el conocido fago T4 de E coli podriacutea inhibir la adsorcioacuten y la replicacioacuten
de adenovirus en sus ceacutelulas blanco y el fago Pf4 de P aeruginosa habriacutea sido capaz de
inhibir el desarrollo de cepas de Aspergillus por secuestro de hierro (Lopardo 2017)
El estudio y desarrollo de nuevos tratamientos alternativos es de particular intereacutes en la
lucha contra la resistencia bacteriana Los fagos presentan caracteriacutesticas que los hace una
excelente herramienta contra las bacterias patoacutegenas debido a su especificidad y seguridad
ecoloacutegica Los fagos no solo son atractivos desde un punto de vista cliacutenico Se han utilizaacutedo
como potenciales aplicaciones en otras aacutereas como la agricultura el control de alimentos o
la industria como a continuacioacuten se describe en la siguiente tabla 5 Los fagos son una
solucioacuten ecoloacutegica ubicua para desarrollar nuevos tratamientos contra las bacterias aunque
se deben realizar maacutes estudios para comprender mejor la relacioacuten entre ellos y las bacterias
antes de su aplicacioacuten (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)
Antecedentes
44
Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos la naturaleza lugares
urbanizados y cuerpo humano (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)
Fuente Sitio encontrado
Naturaleza
Suelo y superficie terrestre
Agua continental y oceaacutenica
Ambientes extremos hielo marino pared de
algas zonas hipersalinas etc
Lugares artificiales
Hospitales y zonas similares
Planta de tratamiento de aguas negras
Algunas zonas bajo el impacto humano
Cuerpo de animales
Tracto digestivo y vagina
Tracto respiratorio y oral
Piel y epitelio mucoso
Los productos comerciales para terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones
Los fagos se pueden distribuir liofilizados y se disuelven antes de la administracioacuten por viacutea
intravenosa en un soporte adecuado como por ejemplo una solucioacuten acuosa o tampoacuten o
suspenderse en cualquier liacutequido adecuado coloidal o de la matriz de poliacutemeros para crear
bactericidas el principio activo se puede administrar de una manera conveniente como por
inyeccioacuten (subcutaacutenea intravenosa administracioacuten etc) por viacutea oral pulmonar (por ejemplo
aerosoles o por otros dispositivos a los pulmones) spray nasal intramuscular intraperitoneal
intrahecal intraviacutetrea vaginal rectal la puncioacuten lumbar y la aplicacioacuten directa Dependiendo
de la viacutea de administracioacuten el principio activo puede estar recubierto de un material que
preserve la sustancia de la accioacuten de enzimas aacutecidos y otras condiciones naturales que
pueden inactivar la sustancia (por ejemplo comprimidos recubiertos enteacutericos o pastillas)
Empresas dedicadas a la biotecnologiacutea se dedicaron a desarrollar productos utilizando fagos
especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan ETA la Food and Drug Administration de
los EE UU (FDA) incluye a los fagos en la categoriacutea de aditivos alimentarios la FDA ha
publicado la aprobacioacuten de seis fagos para usar en alimentos listos para comer (ready to eat)
efectivos para L monocytogenes de la compantildeiacutea Intralytix La compantildeiacutea Omnilytics ofrece
productos de control bacterial para varias aacutereas como son agricultura agua y alimentos
industrias que se pueden observar en su paacutegina web (httpswwwomnilyticscom) y otras
empresas como Biophage Pharma Inc (Canada) Exponential Biotherapies (EE UU)
(Segundo 2010)
Antecedentes
45
Estas nuevas estrategias de intervencioacuten eco-amigable son requeridas como agente de
biocontrol en contra de Salmonella Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos
antildeos debido a sus caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutef ico sin
dantildear la micro-flora en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros
distribucioacuten de esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla
algunos ejemplos de la aplicacioacuten de los fagos son los descritos en la siguiente tabla 6 (Oh y
Park 2017)
Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria (Oh y
Park 2017)
Compantildeiacutea Producto del fago Organismo hueacutesped
FINK TEC GmbH (Alemania) Secure Shield E1 E coli
Intralytix Inc
(EE UU)
Ecolicidereg (EcolicidePXtrade) E coli O157H7
EcoShieldtrade E coli O157H7
ListShieldtrade L monocytogenes
SalmoFreshtrade Salmonella spp
ShigaShieldtrade
(ShigActivetrade) Shigella spp
Micreos Food Safety
(Holanda)
PhageGuard Listextrade L monocytogenes
PhageGuard Strade Salmonella spp
E coli O157H7
Passport Food Safety Solutions
(EE UU) Finalysereg E coli O157H7
Phagelux (China)
AgriPhag
Xanthomonas campestris pv
vesicatoria Pseudomonas
syringae
pv tomato
SalmoProreg Salmonella spp
Salmonella spp
Antecedentes
46
47
III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO
48
Objetivos y plan de trabajo
49
A Objetivo general
El objetivo general de este estudio es aislar y caracterizar fagos frente Salmonella spp a
partir de diversas fuentes ambientales para su uso potencial en el control bioloacutegico
El control de Salmonella spp es de gran intereacutes para la industria alimentaria por lo que
encontrar alternativas para su eliminacioacuten es de gran impacto en la salud puacuteblica
B Objetivos especiacuteficos
1- Aislar fagos de Salmonella proveniente de muestras de aguas residuales de la ZMM y
muestras de lavado de carne pollo de un establecimiento donde se comercializa esta carne
2- Caracterizar parcialmente los fagos aislados en base a su morfologiacutea por TEM y el
anaacutelisis de sensibilidad frente a diversas cepas bacterianas
3- Estudiar el efecto de los fagos previamente aislados desarrollando un biofilm de
Salmonella spp sobre discos de acero inoxidable utilizando la DEM
C Plan de trabajo
Para alcanzar los objetivos establecidos se considera la ubicacioacuten de las fuentes para la
obtencioacuten de los fagos en este caso el medio seleccionado son riacuteos arroyos asiacute como un
establecimiento donde se procesan canales de pollo en la ZMM y las lagunas de oxidacioacuten
de aguas residuales en Mariacuten ambas localidades en Nuevo Leoacuten Meacutexico
Posteriormentese utilizaraacute la teacutecnica ADC y se verificaraacute en cual de estas muestras se
podriacutean encontrar fagos que sean liacuteticos para Salmonella enterica y posteriormente se
realizaraacuten pruebas de selectividad con la meta de caracterizar los fagos aislados frente a
diferentes hueacutesped (cepas de Salmonella spp y de E coli) y la observacioacuten de la morfologiacutea
se realizaraacute por el TEM
Salmonella spp presenta un periacuteodo de incubacioacuten por lo general entre 12 y 36 horas
tras el cual el derarrollo bacteriano en las superficies puede dar como resultado la formacioacuten
de un biofilm Para este estudio se desarrollaraacute un biofilm de Salmonella spp sobre discos
de acero inoxidable en condiciones de humedad esto es importante por la fase de eclipse
Objetivos y plan de trabajo
50
(momento en el cual atacan y se desarrollan los fagos) Se probaraacuten 3 concentraciones de
fago 6 7 y 8 UFPmL Se realizaraacuten recuentos durante un periacuteodo de incubacioacuten de 72 h
Con el fin de conseguir estos objetivos el presente trabajo se ha estructurado en tres
secciones las cuales se pueden observar en la figura 5 incluyendo las pruebas con DEM
en los discos de acero inoxidable
Figura 5 Diagrama general de trabajo
51
IV MATERIALES Y MEacuteTODOS
52
Materiales y meacutetodos
53
A Toma de muestras
Las muestras para obtencioacuten de fagos se recolectaron en diez sitios del aacuterea metropolitana
de Monterrey y del municipio de Mariacuten Nuevo Leoacuten (tabla 7) El meacutetodo que se utilizoacute para
aislar fagos de diversas fuentes medio ambientales y su posterior traslado al laboratorio fue
el descrito por Higgins et al (2005) Se obtuvieron las muestras provenientes de aguas
residuales y riacuteos se emplearon frascos de 450 mL previamente lavados y secos que
posteriormente se impregnaron con una solucioacuten de tiosulfato de sodio (Na2S2O3bull5H2O) al
10 (pv) (Sigma-Aldrich EE UU) y se esterilizaron en autoclave 121ordmC15min Al momento
de hacer la recoleccioacuten en campo los frascos fueron abiertos cuidadosamente y se llenaron
con el liacutequido se almacenaron en hieleras para su traslado al laboratorio el tiempo que
transcurrioacute desde la toma de la muestra hasta la llegada al laboratorio fue entre 1 y 3 h
posteriormente las muestras se centrifugaron el mismo diacutea y los sobrenadantes se
almacenaron 4oC hasta su uso (Vidales-Contreras et al 2006)
A cada una de las muestras obtenidas en el muestreo se le agregoacute 25 de cloroformo
(grado de reactivo 995 Sigma-Aldrich EE UU) para conservarlas en condiciones oacuteptimas
para su posterior llegar al laboratorio se mantuvieron a 4degC durante toda la noche para
permitir que el material grueso decante Mientras tanto en lo referente a las muestras
obtenidas de aguas provenientes de los establecimientos expendedores de pollos las
muestras se trataron igual pero como el sobrenadante contiene grasa se optoacute por filtrar y
posteriormente se realizoacute el mismo procedimiento antes descrito
Materiales y meacutetodos
54
Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos
B Obtencioacuten de fagos
Para aislar los fagos se utilizoacute la teacutecnica descrita por Sambrook y Russell (2001) la cual se
describe a continuacioacuten En un tubo de ensayo (16150 mm Fisherbrand EE UU)
conteniendo 45 mL de agar suave (AS) (Bioxon Meacutexico) mantenieacutendose a temperatura de
40C (en una cuba hidroneumaacutetica con agua) se colocaron 500 L de un cultivo de S
Enteritidis (provenientes del cepario del CINSP) en fase logariacutetmica y se agregaron 300 L
de las muestras recolectadas en las que se presume conteniacutean los fagos especiacuteficos para
esta cepa Se agitoacute el tubo de ensayo mezclando con movimientos circulares suaves para
evitar la formacioacuten de burbujas este procedimiento se realizoacute aproximadamente por 5
segundos El contenido se vertioacute uniformemente sobre una caja de Petri (10015 mm
Fisherbrand EE UU) conteniendo agar soya tripticasa (AST) (Bioxon Meacutexico) y se dejoacute a
temperatura ambiente hasta solidificar la ADC Se incuboacute a 37C por 24h Al momento de
observar el desarrollo de las placas de lisis (calvas) se procedioacute al aislamiento de los fagos
Su cuantificacioacuten se realizoacute de manera directa e inmediata ya que las calvas son visibles con
una iluminacioacuten de contraste (Breeuwer et al 2003) Posteriormente los fagos que si formaron
halos de inhibicioacuten fueron aislados de manera directa o siguiendo uno de los dos protocolos
(enriquecimiento y sin enriquecer) debido a que depende principalmente de la amplificacioacuten
del fago y las caracteriacutesticas de cada uno se describen a continuacioacuten
Municipio Sitio de la toma
Monterrey
Parque Fundidora
Riacuteo Santa Catarina
Establecimiento de comida
Av Conductores
Mariacuten Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal
Riacuteo La Libertad
Guadalupe Alcantarillas de la colonia La Azteca
Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados
San Nicolaacutes de los Garza Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac
Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea
Materiales y meacutetodos
55
B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos
Con el protocolo de enriquecimiento se proporcionoacute las condiciones oacuteptimas de desarrollo
al cultivo de la bacteria hueacutesped y la muestra al inocular el cultivo en la muestra y de esta
manera amplificar los posibles fagos que presentes en la muestra de agua
Se realizoacute este protocolo de la siguiente manera primero se seleccionoacute la cepa bacteriana
que seraacute el hueacutesped esto se consiguioacute haciendo un cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y
se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por otra parte se prepararon
aliacutecuotas (10 mL cada una) de cada una de las muestras recolectadas (enriquecidas con
cultivo bacteriano) y se centrifugan a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a
4degC despueacutes el sobrenadante se pasoacute por jeringa y con filtros de 022 microm (Millex-GP
polyethersulfone 33 mm radio-sterilized) Estas dos entidades biloacutegicas se unieron en un
matraz de capacidad de 50 mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon
Meacutexico) a doble concentracioacuten (20) En este matraz se agregaron 300 microL de la muestra
previamente filtrada con fagos y 500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incuboacute a 37degC por
24 h posteriormente por medio de la teacutecnica de ADC se pudo observar la formacioacuten de halos
de lisis de los fagos (Vidales-Contreras et al 2006)
B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos
El protocolo se emplea para adicionar directamente de la muestra una aliacutecuota y testarla
con la bacteria hueacutesped Se siguieron los pasos anteriormente descritos a este protocolo
primero se seleccionoacute la cepa bacteriana (hueacutesped) esto se realizoacute haciendo un cultivo fresco
(AST) (Bioxon Meacutexico) y se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por
otra parte se preparoacute aliacutecuotas (10 mL) de cada una de las muestras recolectadas y se
centrifugaron a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a 4degC despueacutes el
sobrenadante se pasoacute por jeringa con filtros de 022 microm (Millex-GP polyethersulfone 33 mm
radio-sterilized) Estas dos entidades bioloacutegicas se unieron en un matraz de capacidad de 50
mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon Meacutexico) a doble
concentracioacuten (20) A este matraz se agregaron 300 microL de la muestra filtrada con fagos y
500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incubaron a 37degC por 24h posteriormente por medio
de la teacutecnica de ADC se observaron la formacioacuten de halos de lisis de los fagos (Vidales-
Materiales y meacutetodos
56
Contreras et al 2006)
B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas
Despueacutes de que los cultivos bacterianos se reactivaron la preparacioacuten para trabajar con
ellos fue la siguiente se tomoacute una asada de una colonia bacteriana bien diferenciada y se
incuboacute en un tubo inclinado (punta de flauta) se dejoacute el cultivo toda la noche y posteriormente
se traspasoacute a un subcultivo en caldo con infusioacuten cerebro-corazoacuten (BHI Merck Alemania) e
incuboacute a 37degC durante 24 h posteriormente se subcultivoacute en BHI en las mismas condiciones
Una colonia aislada en tubo punta de flauta se inoculoacute en 9 mL de agua peptonada (3M
Meacutexico) y se incuboacute a 37degC durante 24 h luego se realizaron mezclas seriadas en diluyente
(1 gL triptona 85 gL NaCl pH 72) (Merck Alemania) y se implantaron en las superficies de
los discos de acero inoxidable tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm con
un volumen inferior a 50 microL Como control del inoacuteculo se prepararon 5 placas de TSA
En el caso del fago obtenido se amplificoacute realizando la infeccioacuten en repetidas ocasiones
hasta alcanzar una concentracioacuten de 1x107 UFPmL
B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos
Para la realizacioacuten de este estudio se utilizaron cepas bacterianas de Salmonella enterica
y E coli provenientes de diversas colecciones de los laboratorios involucrados tambieacuten se
utilizoacute un fago de prueba (PRD1) para ser utilizado como control positivo en los aislamientos
En la tabla 8 se muestran las bacterias y el fago indicando su denominacioacuten y origen asiacute como
las condiciones de conservacioacuten
Materiales y meacutetodos
57
Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten
Origen Cepa bacteriana fagos Clave Condiciones de conservacioacuten
FaSPyN
S Typhimurium ATCC 13311
Glicerol a -20degC S Paratyphi ATCC 9150
S Enteritidis ATCC 13076
FCB S Typhi ATCC 19430 BGA TSA 4degC
FAUANL
S Typhimurium TSA 4degC
Fago PRD1
Tampoacuten fosfato 4degC
E coli CECT 515
E coli K12
E coli ATCC 10536
E coli O157H7 CECT 4783
S bongori ATCC 43975
UAB
S enterica LT2
Vial liofilizado a -20degC
S enterica sub enterica CECT 4138
S enterica sub enterica CECT 4594
S enterica sub enterica CECT409
S enterica sub enterica CECT 698
S Typhimurium CCUG 29478
Para la reactivacioacuten de los cultivos que se almacenan a 4degC se dejaron a temperatura
ambiente igualmente para los congelados Posteriormente para sacarlos del estreacutes se
sembraron en medio de cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y se incubaron a 37degC por 24
horas tras estas condiciones ya se pudieron utilizar en los ensayos (McLaughlin et al 2006)
A continuacioacuten se describe la forma en que se reactivaron los cultivos en este estudio de
acuerdo a la forma en que estaban almacenados
a) Cultivos almacenados en glicerol
Se descongelaron los viales a temperatura ambiente
Materiales y meacutetodos
58
Se transfirieron 5 microL de cultivo en 20 mL de TSB (Becton Dickinson Co) y se incuboacute a
37degC toda la noche
Se sembroacute en tres campos en caja de Petri de 90 mm con TSA (Becton Dickinson Co)
Se incuboacute a 37degC por 24h
Se seleccionoacute una colonia aislada y bien diferenciada
El cultivo (colonia) se incuboacute en 20 mL de TSB a 37degC toda la noche
b) En caso de los cultivos liofilizados
En el vial se hidrataron los cultivos agregando 1 mL de TSB e incubando 1h a 37degC
Se vertioacute el cultivo en 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC toda la noche
Se realizoacute el mismo proceso anteriormente mencionado en a)
B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC)
La siembra o inoculacioacuten consistioacute en introducir artificialmente una porcioacuten de muestra
(inoacuteculo) en un medio adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano para su desarrollo
y multiplicacioacuten Una vez inoculado el medio se incuboacute a una temperatura adecuada para el
oacuteptimo crecimiento en promedio 37degC Los meacutetodos de conteo en placa como capa doble y
capa simple de agar se basan en la determinacioacuten de la concentracioacuten viral mediante el
conteo de UFP las cuales son zonas de aclaramiento circular o halo de inhibicioacuten de
crecimiento bacteriano que se producen en la capa o ceacutesped bacteriano debido a la lisis
producida por los fagos Inicialmente una partiacutecula de fago infecta a su bacteria hueacutesped se
replica y posteriormente se disemina generando una zona circular sin crecimiento de la
bacteria (Solano et al 2012) Por esta razoacuten en nuestro estudio se utilizoacute esta manera de
trabajar considerando las diferentes formas que se puede presentar los halos de inhibicioacuten
(forma tamantildeo densidad)
La teacutecnica se basoacute en mezclar el cultivo bacteriano en fase logariacutetmica y el fago en agar
suave (AS) tambieacuten llamado top agar cuando se aplica a la placa de Petri donde se realizoacute
el proceso de infeccioacuten El AS se preparoacute con TSB y agar bacterioloacutegico (15) para obtener
una consistencia semisoacutelida que permita el desarrollo de las calvas en el ceacutesped bacteriano
Se mantuvo a una temperatura adecuada para conservar el estado liacutequido y se agitoacute
cuidadosamente para dejar interactuar los cultivos fago-hueacutesped en el tubo de ensayo
Materiales y meacutetodos
59
posteriormente se dispersoacute de manera uniforme en placas de Petri de 90 mm de diaacutemetro con
15 mL de TSA La suspensioacuten (ceacutesped bacteriano en ADC) se dejoacute solidificar a temperatura
ambiente unos minutos y posteriormente se incuboacute 24h37degC (Vidales-Contreras et al 2006)
B6 Modelo de infeccioacuten
Las enzimas endolisinas de los fagos provocan la lisis debilitamiento y rompimiento de la
pared celular de las bacterias La lisis depende de la proporcioacuten de fagos y hueacutesped o
multiplicidad de infeccioacuten (Multiplicity of infection MOI) Cuando hay una MOI baja la relacioacuten
de fagos a bacterias no es superior a 21 Cuando la MOI es alta es decir muchos fagos frente
a pocas bacterias las ceacutelulas se lisan directamente (Dimmock et al 2007)
En ese sentido la Norma ISO 10705-11995 indica que durante el ensayo el fago en fase
de multiplicacioacuten experimenta varios ciclos de replicacioacuten lo que resulta en la muerte de la
ceacutelula hueacutesped que ha actuado como faacutebrica para la produccioacuten viral El modelo que se siguioacute
es para observar los halos de inhibicioacuten y contrastar los resultados En la figura 6 se presenta
el modelo de infeccioacuten utilizado con S Typhimurium y el fago PRD1 siguiendo el modelo de
Vidales-Contreras et al (2006) y la puesta a punto propuetas por Sambrook y Russell (2001)
Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten fago-hueacutesped
Materiales y meacutetodos
60
B7 Controles utilizados durante los ensayos
Se utilizoacute la cepa de S Typhimurium y el fago PRD1 como control positivo para observar
la formacioacuten de las calvas para el control negativo se utilizoacute agua esterilizada con esto se
asegurar que si existe infeccioacuten y evitar los falsos positivos que ocurren primordialmente por
contaminacioacuten
Para control negativo el ceacutesped bacteriano se obtuvo de la siguiente manera en un
tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de cultivo de S
Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de agua destilada esteacuteril la mezcla se vertioacute
en placa Petri con TSA
Como control positivo el ceacutesped bacteriano y las placas de lisis se obtuvieron como
sigue en un tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de
cultivo de S Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de fagos PRD1 la mezcla se
vertioacute en placa Petri con TSA
B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium
Para realizar los ensayos microbioloacutegicos se requirioacute trabajar con la misma cantidad de
biomasa en una fase de crecimiento similar El conteo en placa es un meacutetodo de medicioacuten de
biomasa que permite el recuento de ceacutelulas viables y consiste en determinar el nuacutemero de
ceacutelulas capaces de reproducirse y generar colonias sobre un medio soacutelido (cada ceacutelula viable
da origen a una colonia) Para este estudio y ver el efecto de los fagos sobre las bacterias
primeramente se calculoacute la curva de crecimiento celular pues es imprescindible para realizar
la infeccioacuten que la bacteria hueacutesped y se encuentre en fase logariacutetmica Es decir para
determinar la biomasa bacteriana se mide la cineacutetica de crecimiento celular y se considera
que se ha alcanzado la fase de crecimiento exponencial cuando la concentracioacuten es de 10⁸
UFCmL (McLaughlin et al 2006)
Para el conteo bacteriano se utilizoacute el meacutetodo de filtracioacuten por membrana
Se transfirioacute 1 mL del cultivo bacteriano fresco a 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC
Cada 30 minutos se recolectaron 300 microL de cultivo
A cada aliacutecuota recogida se le realizaron diluciones seriadas con 27 mL de agua
Materiales y meacutetodos
61
destilada esteacuteril hasta obtener un factor de 1010
De cada una de estas diluciones se obtuvieron 100 microL que se filtraron por membrana
de celulosa 045 microm (Millipore Corporation Billerica Ma 47 mm esteacuteril Cat No
JMX000089 Millipore) montada en un embudo de filtracioacuten magneacutetico de 47 mm (Pall
GELMAN Laboratory con capacidad de 300 mL) y con bomba de vaciacuteo (GM motors amp
industrial systems Modelo 5kh36kna510x)
Las membranas se colocaron en caja de Petri con TSA y se incubaron 24h a 37degC
C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos
Con excepcioacuten de la microscopiacutea electroacutenica los meacutetodos empleados para determinar el
tamantildeo forma y composicioacuten quiacutemica de los fago requieren una alta pureza de las partiacuteculas
virales El material de partida en cualquier estudio de este tipo para la obtencioacuten del fago es
cuando se presenten los halos de inhibicioacuten en el ADC en general ademaacutes de los fagos
estas zonas claras pueden contener los restos celulares de las bacterias como trozos de
pared membranas ribosomas ADN ARN proteiacutenas y otros componentes de peso molecular
maacutes bajo El contenido de fago en un lisado es del orden de 001 mg mL por lo que para
obtener la cantidad apropiada para su caracterizacioacuten es necesario partir de varios litros
(Leverentz et al 2003 Maestro y Sanz 2016)
Para llevar a cabo la purificacioacuten de los fagos se debe de realizar con concentraciones
superiores a 1010 UFPmL Uno de los meacutetodos maacutes utilizados es la centrifugacioacuten a alta
velocidad y posterior resuspensioacuten de las partiacuteculas sedimentadas en un volumen menor
Cuando es posible esta teacutecnica se reemplaza por un sistema de dos fases basado en la
propiedad que tienen algunos poliacutemeros de alto peso molecular como el polietilenglicol el
dextrasulfato de sodio y el dextrano al separarse estas fases por diferencia de pesos
moleculares los fagos se dispersan en este tipo de medios considerando las concentraciones
empleadas y las condiciones oacuteptimas de pH fuerza ioacutenica y temperatura y al pasar por el
proceso de centrifugacioacuten se concentran en una columna Una vez concentrado el fago en la
columna se puede recuperar faacutecilmente de la interfase Los procesos maacutes comuacutenmente
utilizados para la purificacioacuten posterior se basan en separar las partiacuteculas de fago ya sea por
su tamantildeo o densidad (Sambrook y Russell 2001 Vidales-Contreras et al 2006)
En la figura 7 se presenta el procedimiento para la amplificacioacuten de fagos que nos asegura
Materiales y meacutetodos
62
cultivos puros uniformes y con tiacutetulos altos lo cual es imprescindible para conseguir una
buena imagen en el microscopio electroacutenico
Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten de bacteriofagos aplicando la teacutecnica
de agar doble capa (ADC)
El meacutetodo utilizado para purificar los fagos que despueacutes de utilizaron para analizar su
morfologiacutea implicoacute el uso del kit Montage SEQ96 (Millipore Sequencing Reaction Cleanup Kit
Millipore Corporation EE UU)
En una placa de filtracioacuten (96 well SEQ plate by Millipore) se depositaron en cada
pocillo 15 microL de concentrado de fagos maacutes 5 microL de agua milli-Q (Injection Solution by
Millipore)
Materiales y meacutetodos
63
La separacioacuten se realizoacute por la exclusioacuten de lavados de la columna de gel aplicando
vaciacuteo por medio de una bomba (Millipore EE UU Vacuumpressure 220 V50 Hz 15 mm
Hg)
Posteriormente se resuspendioacute la muestra (Thermomixer comfort by Eppendorf) con
agitacioacuten durante 1 min a 500 rpm
Finalmente se agregoacute 10 microL de agua ultra pura Milli-Q para concentrar la muestra
(Injection Solution by Millipore)
Una de las modificaciones que se realizaron para obtener los fagos con elevada pureza y
concentracioacuten para ser utilizada en la microscopiacutea electroacutenica se realizoacute con el kit Montage
SEQ96 que se utiliza para la purificacioacuten de DNA y en este caso se utilizoacute para concentrar los
fagos (concentracioacuten 1012 UFPmL) El procedimiento se describe a continuacioacuten
Se antildeadieron 20 microL de buffer de inyeccioacuten a la placa donde se teniacutea la suspensioacuten de
fagos se resuspendioacute y transfirioacute todo el volumen a la placa azul de Millipore (kit Montage)
Se colocoacute la placa en la bomba del kit Montage de 2 a 3 min hasta que quedoacute seca
Es aconsejable no dejar maacutes tiempo del necesario para evitar un secado excesivo
Se limpioacute todo el exceso de liacutequido en la placa con papel filtro secando un par de
veces la placa sobre el papel Inmediatamente despueacutes se colocoacute la placa sobre el soporte
de la bomba evitando dejarla sobre el papel
Se antildeadieron 30 microL de buffer de inyeccioacuten
Se colocoacute la placa en la bomba unos 4-5 min hasta secarse
Con papel filtro se limpioacute todo el exceso de liacutequido que quedoacute en la placa y se colocoacute
en el soporte de la bomba
Se antildeadieron 30 microL maacutes de buffer de inyeccioacuten para resuspender
Se colocoacute la placa en agitacioacuten se centrifugoacute a 500 g por 10 min
Se traspasaron los 30 microL a un nuevo pocillo y se recolectoacute el sobrenadante
D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica
Con la concentracioacuten de fagos purificados se preparoacute la muestra para la observacioacuten al
microscopio electroacutenico y se procedioacute utilizando la teacutecnica de tincioacuten negativa tal como se
explica a continuacioacuten
Se depositaron 2 microL de suspensioacuten de fagos en un disco de capa fina de carbono y cobre
Materiales y meacutetodos
64
(200 Mesh Holes 100 microm square Ethene old 200 RU) despueacutes de 2 min de reposo a
temperatura ambiente se eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente Se antildeadieron 2
microL de agente de contraste solucioacuten tampoacuten 1 de acetato de uranilo (UO2middot (CH3COO)2middot2H2O)
(Merck Alemania) Se dejoacute actuar el colorante durante 2 min a temperatura ambiente y se
eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente y despueacutes se dejoacute el disco alrededor de 5
min a temperatura ambiente antes de observar en el microscopio
D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa
(DEM)
La microscopiacutea oacuteptica es el meacutetodo adecuado para la investigacioacuten de procesos celulares
ya que es menos agresivo para el manejo de la muestra Existen teacutecnicas de microscopiacutea con
otras especificaciones donde se aplican para estudiar la adhesioacuten celular y formacioacuten de
biofilms en superficies tales como el espectrofotoacutemetro infrarrojo transformada de Fourier el
laacuteser confocal de barrido y la microscopiacutea de fuerza atoacutemica estos microscopios se
caracterizada por detectar las ceacutelulas viables de las dantildeadas por medio de cromoacuteforos
(Montantildeez et al 2012) La microscopiacutea que estamos trabajando esta basada en fluorescencia
la cual utiliza cromoacuteforos para detectar DNA de ceacutelulas vivas (coloracioacuten verde) y ceacutelulas
muertas (coloracioacuten roja) y ha tenido grandes avances en la observacioacuten de tejidos ceacutelulas
moleacuteculas individuales y por consiguiente algunos restos celulares todos estos con una
excelente resolucioacuten (Pellegrotti et al 2014)
Para la observacioacuten de ceacutelulas mediante el DEM se utilizoacute el kit comercial de viabilidad Bac
Light (LIVEDEAD Bacterial Viability Kit L-13152 Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE
UU) que estaacute compuesto por dos colorantes fluorescentes de aacutecidos nucleicos (SYTOreg9 y
PISYTOreg9) que penetran tanto en las membranas intactas como en las lesionadas lo que
permite evaluar la vitalidad de las ceacutelulas bacterianas basaacutendose en la deteccioacuten de la
actividad de las oxidasas y reductasas bacterianas Se observa una sentildeal fluorescente
mejorada en ceacutelulas bacterianas con procesos metaboacutelicos activos En contraste PISYTOreg9
se manifiesta soacutelo en las ceacutelulas que presentan membranas lesionadas y desplaza el colorante
SYTOreg9 por la transferencia de energiacutea de la resonancia fluorescente Cuando se aplican
estos dos colorantes en proporcioacuten adecuada las ceacutelulas viables con membranas intactas
presentaraacuten fluorescencia verde y en contraste las ceacutelulas muertas o lesionadas tendraacuten
Materiales y meacutetodos
65
coloracioacuten roja (Berney et al 2007)
A continuacioacuten se describe la preparacioacuten de las muestras para ser observadas por el DEM
Se colocaron 2 microL de la concentracioacuten suspensioacuten de la muestra con fagos en una
concentracioacuten de 1x1012 UFCmL sobre un disco de acero inoxidable (tipo 14301 (2 cm de
diaacutemetro y 1 mm de grosor) ligeramente convexos con una altura maacutexima en el centro
de 1 mm
Se dejoacute secar a temperatura ambiente por espacio de 10 min
Posteriormente se aplicaron 2 microL de la solucioacuten vital de fluorescencia (LIVEDEAD Bac
Light Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE UU) que reacciona y da la coloracioacuten
al material geneacutetico de las bacterias
Para la observacioacuten de los discos se utilizoacute el microscopio de fluorescencia Olympus
BX51BX52 (Tokio Japoacuten) con caacutemara digital incorporada (DP 50 Olympus) equipado con
laacutempara de mercurio de 100 W (USH-103 OL Olympus) con filtro de doble paso (U-M51004
FR V2 Olympus)
Para enumerar las ceacutelulas bacterianas en el biofilm que se formo en los discos de
acero inoxidable se trabajoacute con un objetivo de 20X y se ubicaban 10 campos
aleatoriamente y los resultados se expresaron por cm2 Las imaacutegenes se revisaron con el
sistema de anaacutelisis de imagen (anaacutelisis 32 soft Imaging System GMBH Alemania)
El biofilm bacteriano se desarrolloacute en la superficie de discos de acero inoxidable tipo
14301 Antes de usarse deben limpiarse bien por inmersioacuten en una solucioacuten acuosa de
detergente (DINO-dis-Dipol Espantildea) al 5 en agua durante 1 h despueacutes se realizoacute la
inmersioacuten en bantildeo con alcohol isopropiacutelico (2-propanol) (Merck Alemania) al 70 en agua
durante 15 min Una vez secos se esterilizaron en autoclave a 121degC por 15 min
D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM
Se inocularon la superficie de los discos con 50 microL de cultivo de S enterica maacutes medio de
cultivo (TSB) para proporcionar en medio rico para que se forme el biofilm posteriormente se
colocaron en cajas de Petri esteacuteriles y se mantuvieron en condiciones de humedad a
temperatura ambiente durante periacuteodos de 24 48 y 72h realizaacutendoles el conteo
correspondiente para verificar el desarrollo del biofilm
Materiales y meacutetodos
66
Una vez formado el biofilm se inocularon los discos con 3 concentraciones diferentes de
fagos 6 7 y 8 logcm2 en un volumen inferior a 50 microL Las diluciones del fago se hicieron en
solucioacuten salina fisioloacutegica (SSF cloruro de sodio 080) (Merck Alemania) Se realizoacute la
infeccioacuten al inocular a los discos prueba y los discos de control con el mismo volumen de SSF
las condiciones de incubacioacuten se realizaron con humedad y a temperatura ambiente
Los discos de acero inoxidable que fueron inoculados con la infeccioacuten fago-bacteria se
analizaron en periacuteodos de 0 2 8 24 y 48 h Se utilizaron para la valoracioacuten de bacterias y
fagos y se distribuyeron los discos de la siguiente manera 2 para visualizacioacuten microscoacutepica
panoraacutemica 2 para recuento bacteriano por microscopiacutea y 2 para recuento bacteriano dando
un total de 6 discos por caja de Petri por duplicado y por cada concentracioacuten (3) por cada
ensayo (3) y por horarios (5) de dando un total de 540 discos
Para el conteo sobre cada disco se colocaron 20 microL del colorante (LIVEDEAD Pribes) y
se incubaron por 5 min a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad y se tomaron
fotografiacuteas a 10X 20X y 40X Para la microscopiacutea de conteo las fotografiacuteas se realizaron a
un aumento de 40X considerando 10 campos aleatorios
Cuando se formoacute el biofilm se requirioacute hacer los recuentos de bacterias y de fagos en ese
sentido para recuperar las bacterias los discos se colocaron en un frasco con 5 mL de TSB
con Tween 80 (TSBTW) (Merck Alemania) y 3 g de perlas de vidrio se homogeneizoacute la
muestra por 1 min en agitador voacutertex a maacutexima potencia para favorecer el desprendimiento
de los microorganismos y posteriormente se realizaron diluciones seriadas De este mismo
extracto se obtuvo el material necesario para hacer el conteo de fagos utilizando la teacutecnica de
ADC Y para el recuento de las bacterias viables se trabajoacute con cajas de Petri se sembroacute 1
mL en TSA con 06 de extracto de levadura (TSAYE Merck Alemania) y se incuboacute a 37degC
durante 24h (Fuster-Valls et al 2008)
67
V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Resultados y discusioacuten
68
Resultados y discusioacuten
69
A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras
De los 10 sitios de recoleccioacuten se lograron obtener un total de 39 muestras en junio de
2007 En la tabla 9 se presentan los sitios y el nuacutemero de muestras recogidas en cada sitio
En el caso del Riacuteo Santa Catarina se abarcoacute una distancia de 95 km la cual presentaba
diferentes zonas de descarga de aguas residuales y de ahiacute se hicieron las tomas en un periacuteodo
de estiaje En el caso de las lagunas de oxidacioacuten del municipio de Mariacuten esta zona presenta
tres lagunas con un aacuterea total de 16700 m2 se realizoacute el muestreo de manera aleatoria En
cuanto a las muestras que se obtuvieron en el sitio de comercializar carne de pollo se les tratoacute
de igual manera para comprobar si existiacutean fagos
Los lugares elegidos para la recoleccioacuten de muestras son similares a los reportados en la
literatura regularmente para el aislamiento de fagos del ambiente se utilizan aguas residuales
y establecimientos de manipulacioacuten yo venta de alimentos (Leeuw et al 2017) En
investigaciones previas se realizan muestreos de diversos sitios como en la piel y heces de
animales manos de los cuidadores superficies quiruacutergicas e instrumentos o utensilios usados
en los establecimientos hoteles y restaurantes (Ejo et al 2016 Yergeau et al 2016) Los
muestreos de aguas tambieacuten se pueden realizar en sitios cercanos a las salidas de drenaje
de hospitales esto es de gran importancia ya que donde hay bacterias posiblemente esteacuten
sus respectivos fagos (Tomat et al 2014 Mattila et al 2015 McShan y Nguyen 2016)
Resultados y discusioacuten
70
Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos
B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis
Para el aislamiento de los fagos especiacuteficos de Salmonella fue necesario la puesta a punto
de varios procedimientos la teacutecnica de agar doble capa (ADC) determinar la cineacutetica de
crecimiento de cultivos de Salmonella determinar la fase de eclipse en la relacioacuten fago-
bacteria (se utilizoacute como control la cepa S Typhimurium y el fago PRD1) y su puesta a punto
en el laboratorio de bioremediacioacuten de la Facultad de Agronomiacutea de la UANL
B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S
Typhimurium
La accioacuten liacutetica de los fagos sobre Salmonella se analizoacute utilizando la teacutecnica ADC
En este procedimiento es necesario tener un ceacutesped bacteriano uniforme entre dos capas
de medio soacutelido que puede ser agar-agar o agar-agarosa (Sambrook y Rusell 2001)
Con el objetivo de abaratar los costes y mejorar los resultados en este trabajo se empleoacute
esta teacutecnica con algunas modificaciones que se describen a continuacioacuten Asiacute pues se decidioacute
que las capas fueran agar-agar donde la primera capa fue de agar al 15 en medio TS y la
Municipio Sitio de la toma N de muestras
Tipo de agua
Monterrey
Parque Fundidora 3 Estanque y corriente
Riacuteo Santa Catarina 10 Corriente
Establecimiento de comida 2 Lavado del pollo
Av Conductores 2 Corriente
Mariacuten
Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal
10 Estanque y corriente
Riacuteo La Libertad 2 Corriente
Guadalupe
Alcantarillas de la colonia La Azteca
3 Corriente
Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados
2 Lavado del pollo
San Nicolaacutes de los Garza
Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac
2 Corriente
Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea 3 Corriente
Resultados y discusioacuten
71
segunda con agar a una menor concentracioacuten para hacer la capa menos firme por lo que fue
necesario poner a punto la teacutecnica probando diferentes concentraciones de agar en ambos
casos a pH 72 Ademaacutes esta adecuacioacuten es importante por el ahorro que se generoacute al utilizar
un componente maacutes econoacutemico que la agarosa lo cual repercutioacute favorablemente en el coste
de la prueba
Otra variable para poner a punto en la teacutecnica de ADC es el volumen de cultivo bacteriano
a utilizar para generar el ceacutesped de Salmonella y lograr una adecuada interaccioacuten con el fago
Se probaron 3 voluacutemenes diferentes de cultivo de S Typhimurium incubados 24 horas a 37oC
para alcanzar una concentracioacuten de 16 x 108 UFCmL Dependiendo de la cantidad de inoacuteculo
las caracteriacutesticas del ceacutesped bacteriano tienen diferente contraste lo cual puede facilitar o
dificultar la observacioacuten de las placas liacuteticas Finalmente el mejor resultado se obtuvo al
utilizar el volumen de 500 L ya que se logroacute una mejor observacioacuten del aclaramiento del
ceacutesped bacteriano al formar las placas liacuteticas En la tabla 10 se muestran las caracteriacutesticas
de las capas en la caja Petri para un buen manejo y desarrollo de la zona liacutetica producida por
el fago al multiplicarse
Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC
Paraacutemetro Condiciones
Agar suave (con agar) () 08
Temperatura del agar suave (degC) 49
pH del medio de cultivo (soacutelido y liacutequido) 72
Cantidad de agar suave (mL) 45
Cultivo bacteriano (microL) 500
Muestra tratada con fagos (microL) 100
Resultados y discusioacuten
72
B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium
El cultivo hueacutesped debe de encontrarse creciendo en medio liacutequido TS en fase logariacutetmica
al momento de mezclarlo con el fago Para identificar la fase logariacutetmica se probaron
diferentes tiempos de crecimiento Con todo ello se observa que la fase logariacutetmica de S
Typhimurium se encuentra en el minuto 150 coincidiendo con los datos reportados por
Vidales-Contreras et al (2006) Y siguiendo con mi tesis la determinacioacuten de la concentracioacuten
se realizoacute mediante el promedio de la enumeracioacuten de las UFC por placas Petri preparadas
por duplicado multiplicado por el factor de dilucioacuten el cual es el reciacuteproco del producto del
volumen ensayado y la dilucioacuten usada para el anaacutelisis Al final se observa cuando se ha
llegado a la fase estacionaria del desarrollo bacteriano (tabla 11) Se utiliza un factor de
dilucioacuten el cual se obtiene como el reciacuteproco de la multiplicacioacuten de volumen de ensayo y la
dilucioacuten usada en el anaacutelisis
Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium
Tiempo Minutos
(Acumulado) Dilucioacuten
UFCmL Promedio
F (Factor) Concentracioacuten
(UFCmL)
T0 0 1 x 10-5 9 plusmn 25 1 x 106 900 x 106
T1 30 1 x 10-5 13 plusmn 74 1 x 106 130 x 107
T2 60 1 x 10-5 24 plusmn 56 1 x 106 240 x 107
T3 90 1 x 10-5 51 plusmn 32 1 x 106 510 x 107
T4 123 1 x 10-5 211 plusmn 89 1 x 106 211 x 108
T5 150 1 x 10-6 215 plusmn 81 1 x 107 215 x 109
Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)
B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis
Las consideraciones tomadas del modelo infectivo S Typhimurium y el fago PRD1 y
utilizando la teacutecnica ADC se replican para poner a punto a la bacteria que se quiere probar
que en este caso es S Typhi ATCC 19430 Los resultados de estos ensayos se pueden
observar en la tabla 12 en la que se puede observar que es ligeramente mayor la etapa donde
Resultados y discusioacuten
73
se puede realizar la infeccioacuten (fase de eclipse) de los fagos aislados y la bacteria hueacutesped
Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis (108 UFCmL) (37 ordmC24h)
Tiempo Minutos (Acumulado)
Dilucioacuten UFCmL Promedio
F (Factor) Concentracioacuten (UFCmL)
T0 0 1 x 10-5 216 710 1 x 106 20 x 107
T1 60 1 x 10-5 260 608 1 x 106 20 x 107
T2 120 1 x 10-6 160 173 1 x 107 16 x 108
T3 180 1 x 10-6 244 208 1 x 107 24 x 108
T4 240 1 x 10-7 400 100 1 x 107 40 x 109
Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)
B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis
De los sitios muestreados se logro obtener 39 muestras y se obtuvo un total de 15 fagos
aislados a partir de dos fuentes de aguas residuales las del Riacuteo Santa Catarina y las lagunas
de oxidacioacuten de Mariacuten Los 15 fagos se nombraron consecutivamente como MRH 1-15 Los
15 fagos se probaron contra la cepa hueacutesped S Enteritidis (CINSP tabla 4) tras realizar de
3 a 4 amplificaciones la mayoriacutea (14 fagos) no presentoacute actividad liacutetica (formacioacuten de halos
de inhibicioacuten) de manera que fueron descartados para los siguientes estudios siendo
solamente uno proveniente de la muestra del Rio Santa Catarina el que produjo halos bien
definidos en el ceacutesped bacteriano y con eacuteste se continuoacute trabajando El fago que mantuvo la
actividad liacutetica fue el MRH6 Se propuso nombrarle como MRH considerando la M para
muestra la RH por el Rodrigo Hernaacutendez
B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten
La principal caracteriacutestica de los fagos es cuando forman halos de inhibicioacuten (tambieacuten
llamadas zonas liacuteticas o calvas) y en nuestro estudio las muestras de agua recolectadas
fueron tratadas y analizadas mediante la teacutecnica ADC observando los halos de inhibicioacuten
claros y de diferentes diaacutemetros estas observaciones son similares a las observadas por
Ackermann (2003) Tanto la cantidad de UFP que se pueden desarrollar y observar hecha por
Resultados y discusioacuten
74
los fagos y la pureza en que encuentren los bacterioacutefagos de las muestras obtenidas del medio
ambiente estaacuten directamente relacionadas la especificidad contra la bacteria Al sembrar por
vaciado en placa estos lisados sobre la cepa indicadora se obtuvieron diferentes tamantildeos de
placas liacuteticas
En la figura 8 se muestran los halos de inhibicioacuten en ceacutesped de Salmonella al realizar la
infeccioacuten se pueden observar los diferentes tamantildeos y la forma se da por la capacidad de
raacutefaga (nuacutemero de copias al realizar el proceso liacutetico) de los fagos de la progenie los fagos
suelen tener una raacutefaga de maacutes de 100 partiacuteculas infectivas producidas en un lapso de tiempo
de 05 ndash 20 h Algunos halos formados por el fago fueron claros lo que indica que es liacutetico de
acuerdo con diversos autores (Sambrook y Rusell 2001 Vidales-Contreras et al 2006 Wong
et al 2014) En nuestro estudio se batalloacute en encontrar fagos a pesar de buscar sitios
sentildealados por autores antes mencionados
Al intentar obtener fagos puede suceder que se encuentren en concentraciones tan
pequentildeas que al probarlos contra alguna cepa hueacutesped no sirven para trabajar por lo que se
llevoacute a cabo repeticiones seriadas (amplificacioacuten) asegurando que al formar una placa de Petri
en ADC con tamantildeos de los halos de inhibicioacuten iguales lo que nos indica que pertenecen a
una sola especie de fago
Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por fagos con halos de inihibicioacuten de
diferentes tamantildeos
Resultados y discusioacuten
75
C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli
La clasificacioacuten de los fagos se puede establer en base a su morfologiacutea al aacutecido nucleico
al espectro de accioacuten y algunas consideraciones inmunoloacutegicas (Criscuolo et al 2017) Al
realizar la infeccioacuten de fago-bacteria y observar la presencia de halos liacuteticos en las placas de
ceacutesped bacteriano se considera que se ha producido una infeccioacuten exitosa pero previamente
es necesario poner a punto el cultivo puro de ambos cultivos y considerar la concentracioacuten de
cultivos a utilizar
Al seleccionar los fagos que presentaron uniformidad en cuanto a la inhibicioacuten y posterior
evaluacioacuten de los fagos se consideraron varios factores entre ellos el tiempo que tarda la
replicacioacuten viral (lo cual es variable) siendo que en algunos casos se pueden replicar en
cuestioacuten de minutos A simple vista se pueden observar la formacioacuten de halos de lisis en el
ceacutesped bacteriano en las cajas de Petri
Asiacute pues la teacutecnica ADC se repitioacute varias veces hasta obtener placas liacuteticas con ideacutentica
morfologiacutea y tamantildeo En la tabla 13 se observa que hay diferentes tamantildeos de halos En los
primeros ensayos soacutelo cuatro muestras de agua (15 21 26 y 33) dieron halos de inhibicioacuten
pudieacutendose distinguir bien la forma y el tamantildeo Al realizar posteriores siembras los fagos
fueron perdiendo capacidad de infeccioacuten (fagos atemperados) y soacutelo la muestra 21 de las
lagunas de oxidacioacuten provenientes de Mariacuten presentoacute fagos con actividad liacutetica y el resto de
fagos no desarrolloacute actividad constante
Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten de S Enteritidis en ceacutesped
bacteriano
Diaacutemetro de halo grande ge 8mm mediano 8 lt X lt6mm pequentildeo le 5mm
Distribucioacuten de tamantildeos de halo
Muestra de agua Grande Mediano Pequentildeo
15 8 23 15
21 17 11 27
26 10 18 6
33 7 9 13
Diaacutemetro medio halo (mm) 1055 0671 0376
Resultados y discusioacuten
76
En la tabla 14 se presenta el listado de posibles hueacutespedes probados 12 cepas de
Salmonella y 4 de E coli que se probaron contra los 15 fagos aislados previamente Se puede
distinguir que afecta a algunas serovariedades de Salmonella y no tiene efecto en otras
serovariedades entericas No afecta nada a las cepas de E coli Se ve que la cepa maacutes
afectada por el fago es la S Typhi ATCC 19430 y otras cepas de Salmonella son afectadas
ligeramente
Resultados y discusioacuten
77
Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades de Salmonella spp y de E coli
serovariedades Fagos
M
R
H
1
M
R
H
2
M
R
H
3
M
R
H
4
M
R
H
5
M
R
H
6
M
R
H
7
M
R
H
8
M
R
H
9
M
R
H
1
0
M
R
H
1
1
M
R
H
1
2
M
R
H
1
3
M
R
H
1
4
MR
H15
S Typhimurium ATCC 13311
-
-
t
- -
t
- - - - - - - - -
S Paratyphi ATCC 9150 - - - - - - - - - - - - - - -
S Enteritidis ATCC 13076 - - - - - - - - - - - - - - -
S Typhi ATCC 19430 + + + + + t
c
+ + + n
d
n
d
n
d
n
d
nd +
S Typhimurium - - - - - - - - - - - - - - -
S Bongori ATCC 43975 - - - - - - - - - - - - - - -
S enterica LT2 - - - + + + - - - - - - - -
S sub enterica CECT 4138 - - - - + + + - - - - - - - -
S sub enterica CECT 4594
t
t
t
- + + + - - -
t
- - - -
S sub enterica CECT 409 - - - - n
d
- -
t
- - - - - - -
S sub enterica CECT 698 - - - - - t
c
- - - - - - - - -
S Typhimurium CCUG
29478
- - - + + - - - - - - - -
E coli CECT 515 - - - - - - - - - - - - - - -
E coli K12 - - - - - - - - - - - - - - -
E coli ATCC 10536 - - - - - - - - - - - - - -
E coli O157H7 CECT 4783 - - - - - - - - - - - - - - -
+ crecimiento y desarrollo de halo indica desarrollo muy pequentildeo o difuso del halo t indica desarrollo pequentildeo y turbio del halo tc indica turbio o con centro opaco en el centro del halo - no crecimiento o desarrollo de halo nd aparente baja efectividad o halo difuso
Resultados y discusioacuten
78
Resultados y discusioacuten
79
El fago que siacute mostroacute actividad (MRH6) y que mantuvo la capacidad liacutetica durante las
diferentes amplificaciones se trabajoacute de manera continua hasta obtener halos uniformes en el
tamantildeo y asiacute ya se considera como una entidad pura de fago Los resultados obtenidos en
este trabajo son semejantes a los mostrados por Thung et al (2017) En la figura 9 se
presentan las imaacutegenes donde se muestra el desarrollo de halos liacuteticos previamente
mencionados donde se puede observar los halos uniformes contra A) S Enteritidis (CINSP)
y B) S Typhi ATCC 19430 (UAB)
Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria A) S Enteritidis (CINSP) y B) S Typhi ATCC 19430
La especificidad de los fagos se encuentra generalmente a nivel de cepa y tambieacuten de
especie y maacutes raramente a nivel de geacutenero Es de intereacutes el garantizar una eficiente infeccioacuten
de la dupla fago-bacteria de esta manera se toman todas las medidas precautorias para
obtener resultados fiables en este sentido se requiere verificar todos los aspectos como son
los controles (positivo y negativo) En el caso del control negativo se verificoacute el desarrollo
solamente del ceacutesped bacteriano de la cepa hueacutesped con la teacutecnica ADC y como control
positivo se consideroacute el modelo del fago PRD 1 y S Typhimurium los fagos son altamente
especiacuteficos (no afecta a otros cultivos bacterianos) y no se puede descartar falsos positivos
por la presencia de restos celulares bacterianos (Segundo et al 2010 Szafranski et al 2017)
Resultados y discusioacuten
80
D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM
El ICTV clasifica a los fagos en 1 orden13 familias y 31 geacuteneros De los cuales se
observa al orden de los Caudovirales el cual comprende a la mayor parte de los fagos (en
torno a un 95)y estos estaacuten constituidos por 3 familias con cola Myoviridae Podoviridae
y Siphoviridae Con estas caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas mediante el TEM en la
figura 10 se presentan las imaacutegenes del fago MRH6
El anaacutelisis de una suspensioacuten de fagos con una concentracioacuten de 1x1012 UFPmL mediante
microscopiacutea electroacutenica muestra una distintiva morfologiacutea de cabeza icosaeacutedrica estructura
alargada y cola no contraacutectil La caacutepside tiene un diaacutemetro de 55-60 nm y la cola puede
alcanzar los 570 nm Estas caracteriacutesticas se corresponden con la familia Siphoviridae Yang
et al (2017) comentan que esta familia de fagos se encuentra frecuentemente en
enterobacterias
Figura 10 Imagen por TEM del fago MRH6 (X100 000) la barra representa 100nm (Servicio de Microscopiacutea UAB)
Resultados y discusioacuten
81
D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero
inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de
epifluorescencia directa (DEM)
Para corroborar la potencial condicioacuten como agente de desinfeccioacuten del fago MRH6 es
necesario observar su efectividad a traveacutes de la DEM con la que se pueden observar
bacterias viables y no viables Tambieacuten la materia orgaacutenica puede dar falsos positivos y se
debe tener en cuenta al comparar con otros meacutetodos de conteo (Montantildeez et al 2012)
En este trabajo S Typhi ATCC 19430 desarrolloacute biofilms en las superficies de acero
inoxidable (discos tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm) y consiguieron
niveles de 29 plusmn 02 UFCcm2 despueacutes de tener un maacuteximo de 72 h en incubacioacuten en
condiciones de humedad y temperatura ambiente tal como se puede observar en la figura 11
Estos biofilms tienen distinta intensidad seguacuten el tiempo de incubacioacuten siendo los periodos
evaluados de 24 48 y 72h respectivamente En estas condiciones se realizoacute el recuento en
tres zonas de cada disco para cada tiempo de incubacioacuten y los resultados se presentan en la
figura 12 Para tener fiabilidad de los resultados se realizaron los conteos por triplicado porque
el manejo de los discos es muy complejo y para evitar errores de manejo se consideroacute
necesario tener maacutes de una muestra otorgando ademaacutes la oportunidad de comparar
resultados y tener un margen de referencia en cuanto a los resultados obtenidos
Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 en
diferentes tiempos de incubacioacuten (24 48 y 72h) a temperatura ambiente
Resultados y discusioacuten
82
Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable incubados a temperatura ambiente n = 3
En este estudio se compararon 2 meacutetodos de conteo de bacterias despueacutes de ser atacadas
por los fagos eacutestos fueron el recuento en placa de agar y por otro lado la observacioacuten por
microscopiacutea de epifluorescencia y la relacioacuten entre ambos meacutetodos Desafortunadamente se
han perdido los resultados por un problema irresoluble pero si se puede comentar que existe
una relacioacuten ligeramente inferior a 09 (R2 ) Esta observacioacuten ya ha sido presentada
anteriormente por otros autores (Fuster-Valls et al 2008 Engelhardt et al 2014)
El cultivo bacteriano se puede contabilizar por conteo en placa directo (TSA) este meacutetodo
es utilizado generalmente para cultivos de geacutermenes no exigentes o moderadamente
exigentes y cuando se quiere visualizar como afecta el ataque de los fagos las ceacutelulas
bacterianas se visualizan por DEM (cuya coloracioacuten cambia a verde cuando han sido atacadas
por los fagos) y una forma de visualizar este ataque es por medio de TSA con la teacutecnica de
ADC
0
5
10
15
20
25
0 10 20 30 40 50 60
Co
nte
o (
Lo
g U
FC
cm
2)
Tiempo (h)
Crecimiento bacteriano
Resultados y discusioacuten
83
D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable
Se aplicoacute la DEM para evaluar la efectividad del fago MRH6 en el control de S Typhi ATCC
19430 sobre superficies de acero inoxidable en condiciones de humedad El fago MRH6 es
liacutetico capaz de disgregar los biofilms
El analizar la accioacuten liacutetica del fago sobre Salmonella por medio del DEM es muy importante
e innovador pero el material que se utiliza y la manera en que se comportan las diferentes
bacterias hacen que se deba ser muy precavido al considerar el uso de este meacutetodo como
adecuado para realizar conteos (Libuchi et al 2010) Por ejemplo se debe tener en cuenta
que existen bacterias que no forman un biofilm y presentan movimiento esto puede llegar a
complicar el visualizarlas si no estaacuten en el campo por lo que se podriacutea pensar que fueron
atacadas y eliminadas por los fagos o bien que por los diferentes lavados se barrieron
La DEM con la tincioacuten LIVEDEAD reveloacute la presencia de ceacutelulas viables con coloracioacuten
verde En la figura 13 se puede observar el efecto letal del fago MRH6 sobre la poblacioacuten de
S enteacuterica disminuyendo su cantidad considerablemente en base a el tiempo de incubacioacuten
en color verde Se observa que hay disminucioacuten de las ceacutelulas de S Typhi ATCC 19430 al ser
atacadas por el fago MRH6 Recordemos que la infeccioacuten con el MRH6 se realizoacute despueacutes de
formar un biofilm a temperatura ambiente y con humedad por espacio de 72h en 3
concentraciones 6 7 y 8 UFPmL Al paso del tiempo se aprecia que a las 48h hay pocas
ceacutelulas vivas al menos detectadas por la teacutecnica utilizada
Resultados y discusioacuten
84
a)
b)
c)
Figura 13 Secuencia de imaacutegenes de epifluorescencia que ilustran la destruccioacuten de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable causada por el fago MRH6 tras incubacioacuten de 0 8 24 y 48 h y con 3 concentraciones de fagos a) 6 b) 7 y c) 8 UFPmL respectivamente
La DEM es un meacutetodo altamente sensible que se caracteriza por la formacioacuten de imaacutegenes
amplificadas y es considerada una teacutecnica poderosa con altos niveles de sensibilidad y
resolucioacuten Tomando como referencia los resultados se considera que la DEM es una
herramienta eficaz para el conteo bacteriano pero hay que considerar la experiencia del
observador
Resultados y discusioacuten
85
En algunas ocasiones al observar las bacterias atacadas por los fago se pueden encontrar
muestras con material geneacutetico mezclado con restos celulares esta situacioacuten hace que
algunos investigadores recomienden extraer los fagos de la muestra antes de sembrar las
bacterias con el fin de determinar la reduccioacuten bacteriana uacutenicamente debida a la actividad
virulenta del fago sobre la muestra y no a la infeccioacuten por fagos libres presentes en el agar
(Sharma et al 2009) En ese sentido tal como reporta Fuster-Valls et al (2008) en su trabajo
observoacute que el limite de deteccioacuten de esta teacutecnica es de 279 log10 celulas por cm2 en cambio
en nuestro trabajo y tal como se observa en la figura 14 se pudo llegar a una sensibilidad
muy proacutexima a 2 y que coincide con las imaacutegenes de la figura 13 en las que a las 24 y 48
horas apenas se observan algunas manchas que corresponden al crecimiento bacteriano
Los fagos utilizan los recursos de la ceacutelula para hacer muchos fagos nuevos lo que causa
que la ceacutelula lise (estalle) y muera en el proceso La lisis en las uacuteltimas etapas del ciclo liacutetico
el fago expresa los genes para las proteiacutenas que hacen agujeros en la membrana plasmaacutetica
y la pared celular En la figura 14 se puede observar como el recuento de Salmonella Typhi
ATCC 19430 disminuye por el ataque del fago MRH6 El efecto del fago es muy fuerte y al
final los conteos son muy parecidos
Resultados y discusioacuten
86
Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 en superficies de acero inoxidable por el fago MRH6 con diferentes concentraciones y hasta 48 h de incubacioacuten
En este trabajo se buscoacute crear condiciones de infeccioacuten fago-bacteria en el laboratorio
como las que se pudieran presentar en la industria Los resultados de esta relacioacuten del fago
MRH6 y S Typhi ATCC 19430 muestran que la aplicacioacuten del fago es efectiva pero hay que
considerar que funciona mejor a altos tiacutetulos (108 UFCmL) y que deberaacute de potenciarse
cuando se trate de un coctel de fagos
Nuestros resultados sugieren que los fagos pueden ser utilizados como un meacutetodo para
controlar un biofilm formado por un bacteria especiacutefica
Al realizar la buacutesqueda de informacioacuten en diferentes motores de buacutesqueda una de las
plataformas de libre acceso (Pubmed) se obtuvo una relacioacuten de 5 en publicaciones de
00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Salm
on
ella
Typ
hi
AT
CC
19430
(lo
g1
0ceacutelu
las cm
2)
Tiempo (h)
Fago MRH6 a 6 Logml Fago MRH6 a 7 Logml Fago MRH6 a 8 Logml Control sin fago
Resultados y discusioacuten
87
fagos contra diferentes serovariedades de Salmonella spp lo que se puede traducir en que
hay un aacuterea de oportunidad latente
Las consideraciones que se enviacutean como propuesta es que existen en estos momentos
muchos trabajos sobre fagos pero aquiacute en Meacutexico no hay trabajos reportados y los que
existen estaacuten apenas en fases iniciales
Existe un enorme potencial de trabajo en esta aacuterea con los fagos tal es el caso de la
fagoterapia en otros sitos y en otros tiempos estaacuten realizando experimentos para ser
explotada como alternativa para todos los aacutembitos desde hogares industria salud animales
vegetales etc Por lo menos en EE UU tienen grandes avances en estudios relacionados
con la aplicacioacuten en bacterias multiresistentes que por el uso de antibioacuteticos han mutado esto
en el sector salud donde se estaacute perdiendo la batalla
Una de las fortalezas de estudiar a los fagos es que antes de que los antibioacuteticos fueran
descubiertos habiacutea investigacioacuten considerable sobre los fagos como tratamiento para las
enfermedades bacterianas humanas por lo menos en parte de Europa La aplcacion de los
fagos es potencialmente son buenos candidatos para tratar enfermedades bacterianas en
seres humanos inocuidad aliemnaria bioremediacioacuten y cada regioacuten tiene fagos endeacutemicos y
este tabajo representa de los primeros en llevarse en Monterrey
Ciertas limitaciones de los resultados se debiooacute a las condiciones que se presentaron al
realizar el estudio (laboratorio equipo conocimiento del tema) solamente se pudo aislar un
fago y lo recomendable es que sean varios fagos dado que son muy especiacuteficos de especie
o hasta de cepa Se proboacute su accioacuten sobre superficies con un solo cultivo bacteriano y en la
realidad las superficies se contaminan con diferentes bacterias
Lo que se vizualiza para nuestro estudio es sugerir varias liacuteneas de accioacuten a futuro Por
ejemplo el fago aislado podriacutea probarse in vivo sobre carne de pollo o fagoterapia tambieacuten
podriacutea continuar los estudios para aislar maacutes fagos y hacer mezclas (coacutecteles) que tuvieran
un mayor rango de actividad y combatir a diversas especies de Salmonella Con respecto al
tratamiento de superficies podriacutean utilizarse coacutecteles de fagos para tratar biofilms bacterianos
formados por maacutes de dos especies o inclusive podriacutean probarse en biopeliacuteculas industriales
reales
Resultados y discusioacuten
88
89
VI CONCLUSIONES
90
Conclusiones
91
De las 39 muestras de agua analizadas se aislaron tentativamente15 fagos de los que soacutelo 4
mantuvieron en un primer momento su actividad liacutetica estos fagos se correspondieron con las
muestras de agua 15 21 26 y 33 Se siguioacute trabajando con ellos y finalmente solo uno de
ellos el MRH6 mantuvo su actividad liacutetica despueacutes de varias amplificaciones este fago se
aisloacute de las aguas residuales de Mariacuten
Se consiguioacute optimizar la teacutecnica ADC cambiando la agarosa que tiene un alto costo por
agar-agar maacutes econoacutemico sin alterar la fiabilidad de la teacutecnica ademaacutes con este cambio se
facilita el manejo
En relacioacuten con la especificidad de los 15 fagos aislados frente a las 16 cepas de
enterobacterias probadas (12 cepas de Salmonella spp y 4 de E coli) se observa ciertas
tendencias marcadas Ninguno de los fagos ataca a las cepas de E coli probadas En cuanto
a Salmonella se observa una fuerte especificidad frente a S Typhi (ATCC 19430) una ligera
actividad frente a varias cepas de S enterica y no hubo efecto contra las demaacutes cepas de
Salmonella ensayadas lo cual confirma la elevada especificidad fago-hueacutesped
Las imaacutegenes obtenidas mediante DEM muestran una morfologiacutea caracteriacutestica de cabeza
icosaeacutedrica estructura alargada y cola no contraacutectil que sugieren que el fago MRH6 se puede
clasificar en la familia Siphoviridae
Se observa un efecto liacutetico progresivo del fago MRH6 frente a biofilms de Salmonella en
discos de acero inoxidable llegando a valores miacutenimos inferiores a 102 a las 48 horas de
incubacioacuten para todas las concentraciones de fago utilizadas (6 a 8 UFPmL)
Se comprueba que la DEM es un buen meacutetodo para la cuantificacioacuten del crecimiento de S
Typhi (ATCC 19430) sobre discos de acero inoxidable con una gran sensibilidad y resolucioacuten
ya que se observaron claras diferencias en los diversos tiempos de incubacioacuten ensayados y
a diferentes concentraciones del fago MRH6 Esto confirma que la teacutecnica es una herramienta
eficaz para valorar el efecto liacutetico de los fagos sobre biofilms
Ya que en este trabajo solamente se obtuvo un fago liacutetico se sugiere reflexionar acerca de
los factores que han dificultado la obtencioacuten de un nuacutemero maacutes amplio de fagos
Conclusiones
92
Este trabajo refleja el gran intereacutes por iniciar o regresar a trabajar con fagos tal como esta
sucediendo en otras partes del mundo Hasta el momento hay muchas espectaivas sin
embargo todaviacutea se necesita investigacioacuten para saber queacute tan seguros son
93
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B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis 70
B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S Typhimurium 70
B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium 72
B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis 72
B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis 73
B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten 73
C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli 75
D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM 80
D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 81
D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable 83
VI CONCLUSIONES 89
VII BIBLIOGRAFIacuteA 93
Iacutendice de figuras
Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa 16
Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por Salmonella spp 24
Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella 24
Figura 4 Adsorcioacuten del bacterioacutefago T4 e inyeccioacuten del ADN 39
Figura 5 Diagrama general de trabajo 50
Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten bacterioacutefago-hueacutesped 59
Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten 62
Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por bacterioacutefagos 74
Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria 79
Figura 10 Imagen por TEM del bacterioacutefago MRH6 80
Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 81
Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable 82
Figura 13 Secuencia de imaacutegenes del DEM 84
Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 por el fago MRH6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86
Iacutendice de tablas
Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias 19
Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos 25
Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales 33
Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos 38
Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos 44
Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria 45
Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos 54
Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten 57
Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos 70
Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC 71
Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium 72
Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis 73
Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten 75
Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades 77
Lista de abreviaturas y acroacutenimos
ADN Aacutecido desoxirribonucleico
ARN Aacutecido ribonucleico
ADC Agar doble capa
AS Agar suave
AECID Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el
Desarrollo
ATCC American Type Culture Collection
APPCC Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control
aw Actividad del agua
BGA Agar verde brillante
BHI Infusioacuten cerebro corazoacuten
CCUG Culture Collection University of Goumltenborg
CENAVECE Centro Nacional de Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de
Enfermedades
CETC Coleccioacuten Espantildeola de Cultivos Tipo
CINSP Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica
EDTA Etilendiaminotetraceacutetico
DEM Microscoacutepica de epifluorescencia directa
EE UU Estados Unidos de Norteameacuterica
ETA Enfermedades transmitidas por alimentos
FAO Food and Agriculture Organization (Organizacioacuten de las
Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura)
FaSPyN Facultad de Salud Puacuteblica y Nutricioacuten UANL
FAUANL Facultad de Agronomiacutea UANL Unidad Mariacuten NL
FCB Facultad de Ciencias Bioloacutegicas UANL
HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points (Anaacutelisis de
Peligros y Puntos Criacuteticos de Control)
INEGI Instituto Nacional de Estadiacutestica y Geografiacutea de los Estados
Unidos Mexicanos
nd Aparente baja efectividad o halo difuso
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
PANALIMENTOS Instituto Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y
Zoonosis
PEG Polietilenglicol
SDS Dodecilsulfato soacutedico
SIRVETA Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos
SSF Solucioacuten salina fisioloacutegica
SUH o SHU Siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico
TEM Microscopio electroacutenico de transmisioacuten
TSA Agar soya de tripicasa
TSAYE TSA con 06 de extracto de levadura
TSB Caldo de soja trypticasa
UAB Universitat Autogravenoma de Barcelona
UANL Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
ZMM Zona Metropolitana de Monterrey
RESUMEN
La inocuidad alimentaria es un tema amplio y relevante que impacta directamente en todos
los segmentos de la sociedad involucra productores desarrolladores innovadores
consumidores y gobierno ademaacutes de diversos sectores como la industria la ingenieriacutea y hasta
la educacioacuten Sin embargo las nuevas tecnologiacuteas en la cadena de produccioacuten provocan que
eacutesta sea maacutes larga y compleja
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) causan alta morbilidad y varios casos
de mortalidad Entre los agentes infecciosos maacutes comunes se encuentran Salmonella spp
Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus
Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus
Los bacterioacutefagos o fagos son virus bacterianos especiacuteficos de una ceacutelula hueacutesped en la
cual se multiplican invadiendo su maquinaria de material geneacutetico Son los sistemas bioloacutegicos
maacutes abundantes del planeta se encuentran en el medio ambiente y se introducen y conviven
en la flora intestinal de otros seres cuando eacutestos ingieren diversos alimentos ya sean de tipo
animal o vegetal
El objetivo del presente trabajo fue aislar y probar la especificidad de una serie de fagos de
Salmonella spp a partir de aguas residuales para lo cual se utilizaron muestras de agua
recolectadas de diferentes localidades del aacuterea metropolitana de Monterrey N L Meacutexico La
purificacioacuten de fagos se llevoacute a cabo mediante la teacutecnica de agar doble capa (ADC) hasta
obtener placas liacuteticas uniformes y se usaron diferentes cepas de referencia de Salmonella
como cultivos indicadores
Se aislaron un total de 15 fagos putativamente distintos de los cuales al pasar las pruebas
de replicacioacuten soacutelo uno logroacute mantener la capacidad liacutetica Se seleccionoacute y purificoacute para
realizar pruebas in vitro especiacuteficas para Salmonella Se utilizoacute una concentracioacuten de fagos
de 1x1012 UFPmL para analizar al fago mediante su morfologiacutea por microscopiacutea electroacutenica
la cual se identificoacute como miembro de la familia Siphoviridae Asiacute mismo se probaron los fagos
contra Salmonella in situ en discos de acero que simulan las superficies de trabajo y para
analizar el efecto de la infeccioacuten del fago sobre Salmonella en los discos de acero inoxidable
se utilizoacute el microscopio de epifluorescencia
Para el conteo de fagos se utilizoacute los meacutetodos LIVEDEAD Para finalizar para evaluar la
efectividad del fago MRH6 que resulto liacutetico en nuestro ensayo se procedioacute a dar las
condiciones necesarias para la formacioacuten del biofilm de Salmonella sobre superficies de acero
inoxidable El fago MRH6 fue capaz de disgregar los biofilms a temperatura ambiente Las
mayores reducciones de Salmonella en un menor tiempo se obtuvieron con concentraciones
de fago mayores a 1x108 UFPmL El meacutetodo de cultivo mostroacute reducciones del patoacutegeno a
niveles indetectables sin embargo la tincioacuten vital reveloacute la presencia de ceacutelulas viables
(coloracioacuten verde) que podriacutea representar un riesgo de contaminacioacuten cruzada estas
pudieran tambieacuten presentarse por la presencia de material orgaacutenico Este trabajo con un fago
puede proporcionar una medida adyuvante para controlar la contaminacioacuten de superficies de
acero inoxidable con biofilms de Salmonella La DEM resultoacute ser una buena herramienta para
evaluar raacutepida y adecuadamente por observacioacuten y posterior anaacutelisis el efecto de los fagos
SUMMARY
Food safety is a broad and relevant issue that directly affects all aspects of society involving
producers developers innovators consumers and government as well as various sectors
such as industry engineering and even education However new technologies in the
production chain cause it to be longer and more complex
Foodborne diseases (ETA) cause high morbidity and several cases of mortality Among the
most common infectious agents are Salmonella spp Campylobacter spp Escherichia coli
Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus Clostridium botulinum Listeria
monocytogenes and Staphylococcus aureus
Bacteriophages or phages are bacterial viruses specific to a host cell in which they multiply
by invading their machinery of genetic material They are the most abundant biological systems
on the planet they can be found in the environment In organisms they enter and coexist in
the intestinal flora of other beings when they ingest various foods whether animal or vegetable
The objective of this study was to isolate and test the specificity of a series of phages of
Salmonella spp from wastewater for which water samples were collected from different
locations in the metropolitan area of Monterrey N L Meacutexico The purification of phages was
carried out by means of the double layer agar technique (ADC) until uniform lithic plates were
obtained and different Salmonella reference strains were used as indicator cultures
A total of 15 putatively different phages were isolated of which upon passing the replication
tests only one managed to maintain the lytic capacity It was selected and purified to perform
specific in vitro tests for Salmonella A phage concentration of 1x1012 PFUmL was used to
analyze the phage by means of its electron microscopy morphology which was identified as a
member of the Siphoviridae family Likewise the phages against Salmonella were tested in
situ on steel discs simulating the work surfaces and the epifluorescence microscope was used
to analyze the effect of phage infection on Salmonella on the stainless steel discs
For the phage count the LIVE DEAD Finally in order to evaluate the effectiveness of the
phage MRH6 that was lytic in our trial the necessary conditions for the formation of the
Salmonella biofilm on stainless steel surfaces were established The phage MRH6 was able
to disintegrate the biofilms at room temperature The greatest reductions of Salmonella in a
shorter time were obtained with phage concentrations greater than 1x107 PFUmL The culture
method showed reductions of the pathogen to undetectable levels however vital staining
revealed the presence of viable cells (green coloration) which could represent a risk of cross
contamination these could also be presented by the presence of organic material This work
with a phage can provide an adjuvant measure to control contamination of stainless steel
surfaces with Salmonella biofilms The DEM proved to be a dependable tool to quickly and
adequately evaluate the effect of phages by observation and subsequent analysis
RESUM
La innocuiumltat alimentagraveria eacutes un tema ampli i rellevant que impacta directament en tots els
segments de la societat involucra productors desenvolupadors innovadors consumidors i
govern a meacutes de diversos sectors com la induacutestria lenginyeria i fins a leducacioacute No obstant
aixograve les noves tecnologies en la cadena de produccioacute provoquen que aquesta sigui meacutes llarga
i complexa
Les malalties transmeses per aliments (ETA) causen alta morbiditat i diversos casos de
mortalitat Entre els agents infecciosos meacutes comuns es troben Salmonella spp
Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus
Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus
Els bacteriogravefags o fags soacuten virus bacterians especiacutefics duna cegravelmiddotlula hoste en la qual es
multipliquen envaint la seva maquinagraveria de material genegravetic Soacuten els sistemes biologravegics meacutes
abundants del planeta es troben en el medi ambient i sintrodueixen i conviuen en la flora
intestinal daltres eacutessers quan aquests ingereixen diversos aliments ja siguin de tipus animal
o vegetal
Lobjectiu del present treball va ser aiumlllar i provar lespecificitat duna segraverie de fags de
Salmonella spp a partir daiguumles residuals per a aixograve es van utilitzar mostres daigua recollides
de diferents localitats de lagraverea metropolitana de Monterrey N L Megravexic La purificacioacute de fags
es va dur a terme mitjanccedilant la tegravecnica dagar doble capa (ADC) fins a obtenir plaques liacutetiques
uniformes i es van usar diferents soques de referegravencia de Salmonella com a cultius indicadors
Es van aiumlllar un total de 15 fags possiblement diferents dels quals en passar les proves
de replicacioacute nomeacutes un va aconseguir mantenir la capacitat liacutetica Es va seleccionar i va
purificar per realitzar proves in vitro especiacutefiques per Salmonella Es va utilitzar una
concentracioacute de fags de 1x1012 UFPmL per analitzar fag mitjanccedilant la seva morfologia per
microscogravepia electrogravenica la qual es va identificar com a membre de la famiacutelia Siphoviridae Aixiacute
mateix es van provar els fags contra Salmonella in situ en discos dacer que simulen les
superfiacutecies de treball i per analitzar lefecte de la infeccioacute del fag sobre Salmonella en els
discos dacer inoxidable es va utilitzar el microscopi depifluorescegravencia
Per al recompte de fags es va utilitzar els megravetodes LIVE DEAD Per finalitzar per avaluar
lefectivitat del fag MRH6 que va resultar liacutetic en el nostre assaig es va procedir a donar les
condicions necessagraveria per a la formacioacute del biofilm de Salmonella sobre superfiacutecies dacer
inoxidable El fag MRH6 va ser capaccedil de disgregar els biofilms a temperatura ambient Les
majors reduccions de Salmonella en un menor temps es van obtenir amb concentracions de
fag majors a 1x107 UFP mL El megravetode de cultiu va mostrar reduccions del patogen a nivells
indetectables perograve la tincioacute vital revelar la presegravencia de cegravelmiddotlules viables (coloracioacute verda)
que podria representar un risc de contaminacioacute creuada aquestes poguessin tambeacute
presentar-se per la presegravencia de material orgagravenic Aquest treball amb un fag pot proporcionar
una mesura adjuvant per controlar la contaminacioacute de superfiacutecies dacer inoxidable amb
biofilms de Salmonella La DEM va resultar ser una bona eina per avaluar ragravepida i
adequadament per observacioacute i posterior anagravelisi lefecte dels fags
7
I INTRODUCCIOacuteN
Introduccioacuten
8
Introduccioacuten
9
Presentacioacuten del proyecto
Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica sobre las innovaciones en seguridad alimentaria en
Meacutexico la cual puso en evidencia la necesidad de analizar alternativas enmarcadas en el
aacutembito del uso de las tecnologiacuteas verdes lo que presentoacute la posibilidad de desarrollar un
trabajo innovador y que no se estuviera aplicando ya en el sector alimentario local o nacional
De esa manera se inician las actividades experimentales que para este trabajo doctoral se
dividieron en dos partes la primera realizada en Meacutexico y la segunda en Espantildea
En primera instancia se desarrolloacute un anaacutelisis en el Laboratorio de geneacutetica y biologiacutea
molecular del Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica (CINSP) en el Campus
Ciencias de la Salud de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) y gracias al apoyo
de Programa de mejoramiento del profesorado (PROMEP nuacutemero UANL-326) por medio de
una beca se iniciaron los estudios y asiacute se cumplioacute el primer propoacutesito que fue obtener virus
nativos contra cepas de Salmonella y purificarlos
Posteriormente para lograr los demaacutes objetivos que eran realizar la caracterizacioacuten parcial
de los fagos contra Salmonella se solicitoacute una beca a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten
Internacional para el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y
de Cooperacioacuten curso 2010-2011) con el fin de realizar una estancia de investigacioacuten y crear
oportunidades de desarrollo aprovechando las tecnologiacuteas innovadoras disponibles en la
Universitat Autoacutenoma de Barcelona (UAB) considerando ademaacutes que la alta reputacioacuten de la
institucioacuten y la supervisioacuten por parte de sus investigadores impactariacutean positivamente en el
desarrollo del trabajo y en el Curriculum Vitae del investigador y por consiguiente en su futuro
profesional como docente e investigador
Otra finalidad de este proyecto fue dejar un buen referente al concluir la estancia ya que
ello ofreceriacutea nuevas oportunidades para seguir forjando el perfil del investigador cimentaraacute
cualquier trayectoria profesional y facilitariacutea optar por un plan postdoctoral en esta misma
Universidad De esta manera se accedioacute a la beca del Programa Extranjeros II-A
Convocatoria 2010-2011 Nuacutemero 0000521211 del cual se cumplieron los objetivos
establecidos y otros maacutes por ejemplo conocer nuevas tecnologiacuteas
Siendo eacutesta una liacutenea de investigacioacuten relativamente reciente en Meacutexico se espera que
impacte en las posibilidades laborales en diversos contextos y seacutea de utilidad para sentar
precedentes para futuras liacuteneas de trabajo en dicha aacuterea
Introduccioacuten
10
Justificacioacuten
En las uacuteltimas deacutecadas los cambios ocurridos en la produccioacuten y consumo de alimentos
han tenido un impacto sobre la inocuidad alimentaria La industria en la produccioacuten masiva de
alimentos ha evolucionado de ser local a constituirse en otra donde la produccioacuten yo el
procesamiento estaacuten localizados en diferentes partes del paiacutes o del mundo Por otra parte la
poblacioacuten estaacute envejeciendo por lo que se vuelve maacutes vulnerable a problemas de salud
ademaacutes los agentes patoacutegenos son cada vez maacutes virulentos (DeWaal y Barlow 2014)
Los reportes sobre problemas gastrointestinales que recopila el Centro Nacional de
Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades (CENAVECE) indican que Nuevo
Leoacuten ha permanecido dentro de los primeros 12 lugares de casos de fiebre tifoidea y en los
primeros 14 de fiebre paratifoidea y otras salmonelosis A nivel nacional las enfermedades
infecciosas intestinales se ubican entre las primeras 10 causas de mortalidad de nintildeos en
edad escolar entre los 5 y 14 antildeos de edad (CENAVECE 2007)
Los microorganismos del geacutenero Salmonella pertenecen a la familia Enterobacteriaceae
Son bacilos o cilindros con puntas redondeadas y se diferencian de las demaacutes enterobacterias
mediante reacciones bioquiacutemicas y de aglutinacioacuten existen maacutes de 2500 serotipos todos
ellos patoacutegenos Actualmente se considera una sola especie denominada Salmonella
enterica de la cual seguacuten el esquema de Kauffmann-White se clasifican nueve serogrupos
Esta especie tiene importancia cliacutenica debido a que es la uacutenica capaz de infectar animales
homeotermos esta investigacioacuten se centra en cuatro serovariedades Salmonella enterica
serovar Typhimurium (S Typhimurium) S enterica serovar Paratyphi (S Paratyphi) S
enterica serovar Enteritidis (S Enteritidis) y S enterica serovar Typhi (S Typhi) estos
microorganismos se pueden aislar tanto de fuentes alimentarias (carne de res pollo crudo
huevo fresco carne de puerco almejas chorizos vegetales entre otros) como del medio
ambiente (suelo agua materia fecal y superficies) (Chlebicz y Śliżewska 2018 Nguendo
2018)
En Meacutexico S Enteritidis y S Typhimurium son los microorganismos aislados con mayor
frecuencia en las salmonelosis Normalmente S Enteritidis habita en el intestino de los
animales sin causar enfermedad pero puede infectar a humanos y promover diarrea voacutemito
dolor abdominal calambres y ocasionalmente insuficiencia renal y en los peores casos la
muerte (DeWaal y Barlow 2014) La contaminacioacuten de alimentos por Salmonella spp se debe
Introduccioacuten
11
a una combinacioacuten de factores relacionados con la produccioacuten a gran escala o cambios en el
manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los mismos (Uribe y Suarez 2006)
Por otra parte estaacuten los virus que pueden replicarse independientemente de los
cromosomas de una ceacutelula pero no sin su participacioacuten (Madigan y Martinko 2006) El hecho
de descubrir virus que pueden infectar y destruir bacterias fue recibido con optimismo por su
posible aplicacioacuten en usos terapeacuteuticos (McLaughlin et al 2006)
En un estudio realizado en diversos estados de Meacutexico (Coahuila Durango Estado de
Meacutexico Jalisco Morelos Oaxaca Puebla y Quereacutetaro) se ha fagotipado Salmonella spp
proveniente de huevo carne de pollo de engorde y gallinas progenitoras reproductoras de
postura comercial y productoras (Mancera et al 2004) Ademaacutes diversas investigaciones han
utilizado fagos liacuteticos para reducir la contaminacioacuten por Salmonella en pollos (canal y piel)
semillas germinadas y dulces de frutas cortadas (Goode et al 2003)
El uso de aditivos en los alimentos se ha reducido considerablemente debido al rechazo
generalizado por parte de los consumidores lo que podriacutea repercutir en un incremento en los
casos de intoxicaciones alimentarias En este contexto los fagos aportan ventajas sobre los
desinfectantes conocidos y los meacutetodos tradicionales de aplicacioacuten de friacuteo o calor ya que
pueden actuar como agentes de deteccioacuten y control bioloacutegico de bacterias patoacutegenas en
alimentos y su produccioacuten es relativamente raacutepida y econoacutemica (Atterbury et al 2003)
La utilidad de los fagos en el aacuterea de investigacioacuten es amplia una posible utilidad es ser
un instrumento para identificar cepas bacterianas especiacuteficas Tambieacuten se han utilizado para
el estudio de diversos fenoacutemenos moleculares el trabajo con estos virus permitioacute desarrollar
ensayos de placas de lisis conocer la naturaleza del ciclo de vida viral los tipos de mutaciones
geneacuteticas y los genes como segmentos de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) (Muniesa et al
2005)
Las empresas dedicadas a la biotecnologiacutea (Intralytix Omnilytics) se centran en desarrollar
productos utilizando fagos especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan las ETA y estos
productos comerciales de terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones
(Segundo 2010) Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos antildeos debido a sus
caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutefico sin dantildear la microbiota
en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros distribucioacuten de
Introduccioacuten
12
esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla (Oh y Park
2017)
En este sentido el objetivo general de este estudio es el aislamiento y caracterizarizacion
de fagos contra Salmonella a partir de diversas fuentes para su uso potencial en el control
bioloacutegico
13
II ANTECEDENTES
Antecedentes
14
Antecedentes
15
A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos
A nivel internacional la produccioacuten de alimentos y todos los mecanismos tecnoloacutegicos
involucrados en su procesamiento implican ademaacutes de la optimizacioacuten de los tiempos y de
la calidad un riesgo para la adquisicioacuten de enfermedades inherentes a la misma adopcioacuten
de nuevas tecnologiacuteas (Weaver et al 2017)
La OMS (2017) estima que las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de
muerte de nintildeos menores de cinco antildeos matan a 525000 nintildeos menores de cinco antildeos
cada antildeo una proporcioacuten significativa de las enfermedades diarreicas se puede prevenir
mediante el acceso al agua potable y a servicios adecuados de saneamiento e higiene
ademaacutes de que en todo el mundo se producen unos 1700 millones de casos de
enfermedades diarreicas infantiles cada antildeo
Seguacuten la OMS (2017) existen diferentes condiciones que propician el desarrollo de las
ETA Como son las de tipo bioloacutegico producidos por hongos o bacterias causantes de
enfermedades ya sea por sus metabolitos o toxinas virus o huevecillos de paraacutesitos asiacute
como los venenos de algunos peces y plantas Las de tipo quiacutemico como productos de
limpieza o desinfeccioacuten pesticidas toxinas marinas insecticidas o venenos y fiacutesicos cuando
en la materia prima de los alimentos se encuentran objetos como vidrios metal piedras
grapas barniz de untildeas joyeriacutea cabellos o cualquier elemento extrantildeo
De acuerdo con el Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos (SIRVETA) ndashdesarrollado por el Instituto
Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y Zoonosis (PANALIMENTOS)ndash ocurrieron 1683
brotes de ETA en Meacutexico que ocasionaron 53860 casos de enfermedades y provocaron
207 muertes mientras que en los demaacutes paiacuteses de Ameacuterica Latina se produjeron durante el
mismo periacuteodo 6324 brotes que provocaron 228579 casos y 314 muertes (Forsythe y
Hayes 2002) Cabe aclarar que eacutestos son soacutelo los brotes notificados por la autoridad
competente El sistema utilizado internacionalmente para obtener alimentos inocuos es el
APPCC (Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control) o HACCP (por sus siglas en ingleacutes
Hazard Analysis and Critical Control Points) que se puede implementar en cualquier tipo de
industria y permite prevenir controlar y eliminar cualquier peligro antes de consumir los
alimentos (Rodriacuteguez Torrens et al 2015)
En Meacutexico el Distintivo H es un programa implementado por los servicios alimentarios
Antecedentes
16
oficiales mediante el cual se ofrece a los clientes alimentos seguros El Centro Nacional de
Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades de Meacutexico (CENAVECE) advierte
que uno de los problemas de salud maacutes importantes lo constituyen los trastornos
gastrointestinales cuya mortalidad predomina entre los 5 y los 14 antildeos Entre 2006 y 2012
el Estado de Nuevo Leoacuten ha permanecido entre los primeros 7 lugares de casos de diarrea
(CENAVECE 2018)
La figura 1 muestra la distribucioacuten de la incidencia en Meacutexico la cual estaacute asociada a la
densidad demograacutefica y la accesibilidad a servicios de salud que facilitan el registro es asiacute
que son precisamente las entidades federativas con mayor poblacioacuten quienes registran
nuacutemeros maacutes altos
Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa en
Meacutexico 2010-2012 (CENAVECE 2018)
A1 Problemaacutetica
La inocuidad alimentaria es una preocupacioacuten mundial que se refleja en el incremento
de reportes y noticias relacionadas con la contaminacioacuten de los alimentos difundidos en
diversos paiacuteses a su vez estos productos son retirados del mercado lo que provoca
peacuterdidas por varios cientos de millones de doacutelares El Codex Alimentarius indica que las ETA
y los dantildeos provocados por los alimentos son en el mejor de los casos desagradables y
Antecedentes
17
en el peor fatales y pueden influir negativamente en el comercio y la confianza de los
consumidores Por consiguiente es imprescindible un control eficaz de la higiene Todos los
eslabones de la cadena alimentaria ndashfabricantes elaboradores manipuladores y
consumidores de alimentosndash son responsables del control de los riesgos microbioloacutegicos
desde la explotacioacuten agriacutecola o ganadera hasta el consumidor final Desde esta oacuteptica el
anaacutelisis de riesgos deberiacutea aplicarse dentro de un contexto estrateacutegico organizativo y
operacional reconocido si bien en el proceso puede haber elementos comunes establecer
un nivel apropiado de proteccioacuten en esos sectores puede representar las maacuteximas
diferencias (Atterbury et al 2003)
La OMS ha identificado siete microorganismos patoacutegenos ndashC jejuni C perfringens E
coli 0157H7 L monocytogenes Salmonella spp S aureus y T gondiindash que causan entre
123 y 33 millones de casos de infeccioacuten solamente en los EE UU lo que representa
peacuterdidas econoacutemicas de entre 5500 y 34900 millones de doacutelares Ademaacutes resalta que su
incidencia podriacutea ser de 300 a 350 veces mayor de lo que indican las estadiacutesticas dado que
soacutelo se notifica un nuacutemero relativamente pequentildeo de casos de ETA Se estima que 70 de
los 1500 millones de episodios de diarrea son causados por alimentos en mal estado Es
posible que en los paiacuteses en desarrollo se notifique a las autoridades sanitarias una
proporcioacuten de casos auacuten inferior principalmente por pobreza y escasez de recursos a
disposicioacuten de los servicios de gestioacuten de la inocuidad alimentaria e inspeccioacuten de alimentos
(Van de Venter 2000)
A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea
La OMS estima que el 88 de los casos de diarrea a nivel mundial son atribuibles al
agua el saneamiento y la higiene todos los aspectos de inocuidad de los alimentos estaacuten
relacionados con estos factores En menor medida la enfermedad se transmite a traveacutes de
otras viacuteas por ejemplo el aire y alrededor del 94 de los casos son atribuibles al
saneamiento ambiental el total de fallecimientos se calcula en maacutes de 15 millones
principalmente en nintildeos en los paiacuteses desarrollados el promedio es ligeramente menor a
90 La diarrea atribuible al agua y saneamiento inapropiado representa 53 de las
muertes totales y 35 en nintildeos europeos de 0-14 antildeos y es ademaacutes una de las causas
principales de malnutricioacuten (Pruumlss-Uumlstuumln y Corvalaacuten 2006)
Antecedentes
18
Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud puacuteblica en el mundo
especialmente en paiacuteses en desarrollo Su alta incidencia se debe en gran parte a la
ingestioacuten de alimentos contaminados con microorganismos patoacutegenos como Salmonella
que causa episodios de diarrea aguda Salmonella spp es uno de los patoacutegenos enteacutericos
maacutes frecuentes tanto en paiacuteses desarrollados como subdesarrollados Dependiendo de la
especie tamantildeo del inoacuteculo factores de virulencia expresados por la cepa hueacutesped
involucrado estado inmunoloacutegico del paciente e intervencioacuten meacutedica puede ocasionar una
infeccioacuten gastrointestinal de media a severa hasta una infeccioacuten sistemaacutetica que
comprometa la vida del paciente (Fernaacutendez 2008)
Otros microorganismos que tambieacuten pueden contaminar el agua y los alimentos como
bacterias (Bacillus cereus Clostridium botulinum Campylobacter jejuni Vibrio cholera) virus
(Norwalk Rotavirus Hepatitis A) y paraacutesitos (Entamoeba histolytica Cryptosporidium
parvum Toxoplasma gondii) pueden transmitirse tambieacuten de una persona a otra como
resultado de una higiene deficiente (Freedman et al 2015)
Estudios de empresas dedicadas exclusivamente a la crianza de cerdos reportan
epidemias como el virus de la diarrea porcina la cual posteriormente se transmite a los
consumidores de estas carnes contaminadas ya sea por contacto con las heces o por
consumo de carnes contaminadas lo cual implica tambieacuten una peacuterdida econoacutemica para la
industria alimentaria resaltando la necesidad de establecer medidas preventivas y
correctivas seguacuten sea el caso (Huss et al 2017)
Seguacuten la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO
por sus siglas en ingleacutes Food and Agriculture Organization) las toxiinfecciones alimentarias
son la segunda causa de morbilidad pero muchas permanecen sin declarar quizaacutes por su
mediana severidad y recuperacioacuten raacutepida salvo el coacutelera Los alimentos son susceptibles a
contaminacioacuten de todo tipo la fuente de agentes causales suele ser el tracto gastrointestinal
de individuos reservorios o las heces de animales y humanos infectados o bien agua
corrompida que por deficiencias sanitarias contamina carne fresca pescados moluscos
pasteles de crema y leche no pasteurizada entre otros productos (Riacuteos et al 2012) como
se puede observar en la tabla 1
Antecedentes
19
Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias (Riacuteos et al 2012)
Agente Periacuteodo de
incubacioacuten Fuente Agente patoacutegeno
Salmonella spp 8-24 h Aves huevos mascotas
(tortugas lagartos pollos) Bacteria y endotoxina
E coli
enterotoxigeacutenica 24-72 h
Agua y alimentos
contaminados
Enterotoxina
termoestable
V cholerae 24-72 h Alimentos contaminados Enterotoxina termolaacutebil
Shigella spp 24-72 h Agua y alimentos
contaminados Bacteria y endotoxina
C jejuni 1-7 d Leche aves de corral y
agua no potable
Bacteria y Enterotoxina
termolaacutebil
Yersinia spp 1-7 d Carne de cerdo leche Bacteria y Enterotoxina
B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria
La historia referente a las toxiinfecciones alimentarias se comienza a documentar y
legislar en el siglo X con el botulismo en Bizanzio y documentos sobre el ergotismo en el
siglo XVI En el siglo XIX aparecen los alimentos enlatados y Louis Pasteur asocia el
deterioro de los alimentos con las bacterias En el siglo XX se produce un desarrollo
espectacular de la microbiologiacutea de los alimentos con el establecimiento de la etiologiacutea de
las toxiinfecciones alimentarias el comienzo de una nueva era de la quiacutemica e ingenieriacutea
alimentaria Aunado a los movimientos migratorios de las personas la diversificacioacuten de
alimentos la produccioacuten masiva de alimentos y la facilidad de transporte desde puntos
lejanos entre la produccioacuten y preferencia en el consumo de alimentos aunadas a la
capacidad que tienen los microorganismos para evolucionar y adaptarse a su medio
ambiente hacen pensar en estos microorganismos como patoacutegenos emergentes (DeWaal y
Barlow 2014)
B1 Escherichia
Las cepas de E coli se pueden diferenciar seroloacutegicamente por los antiacutegenos somaacuteticos
(O) flagelares (H) y capsulares (K) Ademaacutes pueden hallarse fimbrias y estructuras
Antecedentes
20
emparentadas que desempentildean un papel en la patogenia Actualmente se reconocen cinco
grupos de E coli causantes de diarrea en funcioacuten del siacutendrome que provocan cuyas
diferencias estaacuten codificadas por plaacutesmidos (Wright et al 2017) Los diferentes tipos son
E coli enteropatoacutegeno (EPEC) es responsable de la diarrea acuosa en lactantes
Produce voacutemitos fiebre y diarrea acuosa con mocos pero sin sangre Coloniza las
microvellosidades de todo el intestino produciendo la lesioacuten de ldquoadhesioacuten y erosioacutenrdquo en
el ribete en cepillo de la membrana de la vellosidad Afecta a adultos y nintildeos menores de
dos antildeos siendo este rango de edad el principal factor de riesgo
E coli enterotoxigeacutenico (ETEC) es el causante de la llamada vulgarmente ldquodiarrea
del viajerordquo se manifiesta con diarrea acuosa como agua de arroz y poca fiebre
Coloniza la porcioacuten proximal del intestino delgado Afecta a adultos y nintildeos son una causa
frecuente de diarrea en lactantes de paiacuteses en desarrollo asiacute como la causa maacutes comuacuten
de diarrea en individuos de paiacuteses industrializados que viajan a zonas menos
desarrolladas del mundo
E coli enteroinvasor (EIEC) coloniza el colon origina fiebre y diarrea profusa con
heces que contienen mocos y estriacuteas sanguinolentas Presenta un plaacutesmido de 120-140
mD conocido como plaacutesmido invasivo que lleva todos los genes necesarios para la
virulencia Al igual que ETEC pero afecta principalmente a adultos
E coli enterohemorraacutegico (EHEC) origina diarrea sanguinolenta colitis hemorraacutegica
siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico (SUH o SHU) y puacuterpura trombocitopeacutenica En este grupo se
incluye E coli verotoxigeacutenico (VTEC) serotipos O157 O26 O111 Afecta principalmente
a nintildeos el principal factor de riesgo es el consumo de carne sin la coccioacuten adecuada
E coli enteroagregativo (EAggEC) posee caraacutecter clonal diferenciaacutendose dos clones
relacionados (1 y 2) Dentro de cada grupo estaacute presente una variedad concreta de
antiacutegenos O mientras que los antiacutegenos H se conservan
En los reportes cientiacuteficos sobre E coli se refieren a las plantas como otra fuente de
infeccioacuten especiacuteficamente en la espinaca (Spinacia oleracea) y lechuga (Lactuca sativa) Se
recomienda igualmente estudiar profundamente los cultivos y los tejidos vegetables y
animales ya que se deben considerar como paraacutemetros de riesgo para la inocuidad de los
alimentos (Fernaacutendez Ferran et al 2003 Wright et al 2017)
B2 Campylobacter
Campylobacter spp es un bacilo delgado gram negativo (05-08 microm x 02-05 microm) y
Antecedentes
21
microaeroacutefilo (necesita 3-5 de O2 y 2-10 de CO2) Su morfologiacutea puede variar entre
vibrioacutenica (bacilos curvados) espirilar en forma de rosquilla de S y cocoide de tal forma
que en fase logariacutetmica de crecimiento las ceacutelulas tienen forma espiral o curvada pero a
medida que los cultivos envejecen adquieren formas esfeacutericas Moacutevil con un uacutenico flagelo
polar que presenta de dos a tres veces el largo de la ceacutelula Aunque hay diversas especies
de Campylobacter causantes de enfermedades C jejuni C coli y C lari son las especies
que se aiacuteslan con mayor frecuencia en casos de gastroenteritis humana siendo C jejuni la
responsable de la mayoriacutea de las toxiinfecciones alimentarias 89-93 de las
toxiintoxicaciones (OMS 2017)
Las especies C coli y C lari son semejantes a C jejuni su diferencia se basa en pruebas
bioquiacutemicas C coli no es capaz de hidrolizar el piruvato y C lari es capaz de crecer en
presencia de 30 microgramos de aacutecido nalidiacutexico (Haddad et al 2013) La movilidad la
quimiotaxis y los flagelos son factores importantes en la virulencia pues de ellos depende la
colonizacioacuten del epitelio intestinal Campylobacter produce una enterotoxina parecida a la
toxina coleacuterica que tambieacuten juega un papel importante en la patogenia (Nichols 2005) C
jejuni puede sobrevivir de 2 a 4 semanas en condiciones de baja humedad oxigenacioacuten y
temperaturas de 4ordmC superando muchas veces el tiempo de vida uacutetil del producto Asimismo
puede perdurar de 2 a 5 meses a -20ordmC pero a temperatura ambiente apenas dura algunos
diacuteas (Khan et al 2013)
C jejuni y C coli son sensibles a diversos agentes antimicrobianos como los macroacutelidos
los aminoglucoacutesidos el cloranfenicol y la tetraciclina La eritromicina ha sido el antibioacutetico de
eleccioacuten para tratar las infecciones del tracto intestinal Al igual que en Salmonella el control
de Campylobacter se debe realizar tanto en el sector agropecuario como en los
establecimientos alimentarios por lo que los controles especificados para Salmonella
podriacutean extrapolarse a este microorganismo Un aspecto importante de su control reside en
la refrigeracioacuten de las aves ya que la baja temperatura junto con la desecacioacuten superficial
que se produce reduce significativamente la incidencia y los recuentos de Campylobacter
viables incluso en canales altamente contaminadas (Fernaacutendez 2008)
B3 Enterobacter
Conocido antiguamente como Cronobacter spp incluye varias especies de patoacutegenos
emergentes relacionados con brotes de meningitis septicemia y enterocolitis necrotizante
especialmente en neonatos y nintildeos La tasa de mortalidad de estos brotes es alta entre 20
Antecedentes
22
y 80 y los supervivientes suelen sufrir severos desoacuterdenes neuroloacutegicos (Grimont y
Grimont 2006)
E sakazakii es un bacilo moacutevil no esporulado gram negativo que ha sido encontrado en
alimento para bebeacutes es maacutes resistente a los cambios osmoacuteticos y a la sequiacutea que otros
miembros de la familia Enterobacteriaceae y se asocia con casos esporaacutedicos de sepsis
meningitis cerebritis y enterocolitis necrotizante La mayoriacutea de las infecciones se observan
en bebeacutes con bajo peso al nacer y que son alimentados de forma insalubre La mortalidad
ha disminuido a menos de 20 en los uacuteltimos antildeos Este microorganismo no se ha
encontrado presente en la foacutermula laacutectea tampoco existe evidencia de la transmisioacuten de
persona a persona o un medio general de difusioacuten ambiental (Vanegas et al 2009)
B4 Listeria
L monocytogenes estaacute muy difundida en la naturaleza en la que suele adoptar un ciclo
saprofiacutetico en estrecha relacioacuten con el suelo Ademaacutes se ha encontrado en aguas
continentales sedimentos marinos material vegetal en descomposicioacuten forrajes heces
humanas y animales y aguas residuales de explotaciones animales entre otros ambientes
lo que explica su presencia en alimentos crudos Epidemioloacutegicamente se caracteriza por su
ubicuidad sobreviviendo en tierra huacutemeda hasta 500 diacuteas en funcioacuten de la temperatura En
heces o aguas residuales mantenidas a temperatura de refrigeracioacuten sobrevive maacutes de seis
antildeos este periodo se reduce si se mantiene a temperatura ambiente (Guenther et al 2009)
Listeria spp son bacilos gram positivos de forma regular y con forma de vara corta
Algunas veces pueden tener forma cocoide apareciendo como ceacutelulas individuales o en
cadenas cortas Son moacuteviles entre 20-25ordmC pero no a 37ordmC Existen seis especies de Listeria
descritas L monocytogenes L innocua L welshimeri L seeligeri L grayi y L ivanovii
subespecie ivanovii y subespecie londoniensis Las cepas patoacutegenas de L monocytogenes
producen la listeriolisina O responsable de la hemoacutelisis-β y de la destruccioacuten de las ceacutelulas
fagocitarias es una hemolisina que segrega la bacteria a causa de la disminucioacuten de pH
(Liu 2006)
L monocytogenes tolera y se multiplica en concentraciones altas de NaCl contando con
la posibilidad de sobrevivir durante un antildeo en ambientes con una concentracioacuten de 16 su
tolerancia aumenta al disminuir el pH o la temperatura del medio Los tratamientos para su
inactivacioacuten son de 617ordmC35min 70ordmC20min 78ordmC15min u 80ordmC5min favoreciendo su
Antecedentes
23
resistencia al calor con la presencia de grasas Se multiplica entre 0 y 4ordmC las temperaturas
bajas ejercen un efecto protector de tal manera que en condiciones de acidez su inactivacioacuten
es maacutes lenta en refrigeracioacuten que a temperatura ambiente (Leverentz et al 2003) La acidez
influye en la capacidad de Listeria para sobrevivir a la congelacioacuten (temperaturas inferiores
a -47ordmC) y almacenamiento a menos de -18ordmC en carne mostrando una disminucioacuten en la
recuperacioacuten de ceacutelulas viables que han sido dantildeadas por el friacuteo (Wu et al 2015)
B5 Salmonella
B51 Origen
Salmonella tiene su origen principal en el tracto intestinal de animales fundamentalmente
las aves y los porcinos y pueden acabar contaminando las carnes crudas el pollo crudo los
productos marinos crudos o el huevo Los brotes de Salmonella estaacuten asociados al consumo
de alimentos elaborados con huevo crudo y siguen siendo frecuentes a pesar de conocerse
el riesgo que representa su consumo de las medidas legales adoptadas y de los programas
de educacioacuten sanitaria dirigidos a disminuir su incidencia Este geacutenero pertenece a la familia
Enterobacteriaceae fue descrito a principios del siglo XX por el bacterioacutelogo estadounidense
Theobald Smith (Zaidi et al 2006) En la figura 2 se muestran los factores de virulencia y
en la figura 3 se presenta la clasificacioacuten de Salmonella enterica con las diferentes
subespecies y serovares que se aiacuteslan maacutes frecuentemente
Antecedentes
24
Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por
Salmonella spp (Brenner et al 2000)
Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella (Brenner et al 2000)
Antecedentes
25
B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp
La mayoriacutea de los miembros de este geacutenero se encuentra en el tracto intestinal del
hombre y los animales como bacterias patoacutegenas o comensales Estaacute integrado por bacilos
gram negativos anaerobios facultativos y no esporulados La mayor parte de los serotipos
conocidos son moacuteviles mediante flagelos peritricos Se conocen maacutes de 2460 serotipos
muchos de ellos patoacutegenos para el ser humano (Chlebicz y Śliżewska 2018)
Son bacterias invasoras enterotoxigeacutenicas y estaacuten ampliamente diseminadas en todo el
mundo su temperatura ideal de sobrevivencia entre los 15 y los 35degC (mesoacutefilas) y en una
amplitud de pH de 45 a 9 Los microorganismos de este geacutenero se distribuyen en seis
grupos se han definido mediante biotipado hibridacioacuten DNA-DNA anaacutelisis de la secuencia
del RNA ribosomal 16S y por ldquomultilocus enzyme electrophoresisrdquo (MLEE) (Brenner et al
2000) La serotipificacioacuten se utiliza para diferenciar maacutes allaacute del nivel de subespecie como
puede observarse en la tabla 2
Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos (Brenner et al 2000)
Grupo Microorganismo
A S Paratyphi Al
B S Typhimurium S Bredeney
C1 S Choleraesuis S Montevideo S Oranienburg
C2 S Newport
D S Typhi S Enteritidis S Dublin S Gallinarum
E S Butantan S Anatum S Give
Salmonella serotipo Typhi es la causante de la fiebre tifoidea presentando siacutentomas como
son fiebre de intensidad variable cefalea diarrea estrentildeimiento tos naacuteuseas y voacutemitos
anorexia dolor abdominal y escalofriacuteos Mientras que los demaacutes serotipos considerados no
tifoidicos presentan un estado asintomaacutetico En el antildeo 2000 los serotipos aislados con
mayor frecuencia en EE UU fueron S Typhimurium S Enteritidis y S Newport (Dunkley et
Antecedentes
26
al 2009) En Meacutexico los serotipos de Salmonella spp identificados con mayor frecuencia
en los servicios de salud fueron S Typhimurium (204) y S Enteritidis (183) (Guenther
et al 2009)
La salmonelosis se produce por la ingestioacuten de alimentos o bebidas contaminados por
Salmonella se manifiesta como una enterocolitis aguda y se caracteriza por presentar
siacutendromes febriles asociados a manifestaciones gastrointestinales o sisteacutemicas con
frecuencia severas (Figueroa y Verdugo 2005 Fernaacutendez 2008) El cuadro cliacutenico se
localiza baacutesicamente en el iacuteleo terminal y el intestino grueso La enfermedad se manifiesta
a traveacutes de diferentes fases En la primera fase la infeccioacuten se limita a la mucosa intestinal
en la siguiente la bacteria invade el tejido linfaacutetico local y le sigue una fase de bacteriemia
durante la cual la mayoriacutea de las bacterias son fagocitadas por macroacutefagos del hiacutegado y el
bazo (Calva et al 2006 Bettini et al 2012)
Con frecuencia el meacutedico hace un diagnoacutestico basaacutendose en el cuadro cliacutenico del
paciente pero sin contar con los estudios microbioloacutegicos necesarios para establecer un
diagnoacutestico certero cuando se presenta infeccioacuten por Salmonella inicia una fase de
crecimiento bacteriano intracelular el cual despueacutes de varios diacuteas provoca la liberacioacuten de
gran cantidad de patoacutegenos al torrente sanguiacuteneo (Zaidi et al 2006)
La salmonelosis es una enfermedad aguda de distribucioacuten mundial Afecta a todos los
grupos de edad con mayor incidencia en los extremos de la vida provocando infecciones
en forma endeacutemica o en brotes epideacutemicos de intoxicacioacuten alimentaria que en ocasiones
abarcan amplias zonas geograacuteficas debido a las extensas cadenas de distribucioacuten de
alimentos existentes hoy en diacutea (Fernaacutendez 2008)
Para la salud puacuteblica la salmonelosis tiene un impacto socioeconoacutemico tanto en los paiacuteses
en desarrollo como en los paiacuteses desarrollados Ademaacutes al no recibir tratamiento puede
ser causante del siacutendrome de Reiter el cual se manifiesta por dolor en articulaciones
irritacioacuten en los ojos dolor al orinar y puede durar meses o antildeos desencadenaacutendose una
artritis croacutenica (CFSPH 2005) Desde la deacutecada de los ochenta la incidencia de
salmonelosis de origen alimentario ha aumentado considerablemente en Meacutexico Este
incremento es resultado de una combinacioacuten de factores como la calidad del agua utilizada
para riego y el manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los alimentos (Zaidi
et al 2006)
Antecedentes
27
Un meta-anaacutelisis (revisioacuten sistemaacutetica en la cual se combinan matemaacuteticamente los
resultados de varios estudios para contestar una misma pregunta) realizado recientemente
confirma que Salmonella resiste a antibioacuteticos empleados en los alimentos de origen animal
ya que pueden estar contaminados con este microorganismo es resistente a 3 antibioacuteticos
como la amoxicilina las sulfonamidas y las tetraciclinas ya que son ampliamente usados en
produccioacuten animal (Ejo et al 2016)
B53 Manifestaciones cliacutenicas
El cuadro cliacutenico normalmente es de 2 a 5 diacuteas aunque en ocasiones persiste varias
semanas La gravedad de los siacutentomas variacutea considerablemente siendo mayor en nintildeos y
ancianos Si el microorganismo pasa desde el intestino a la corriente sanguiacutenea y llega a
otras partes del cuerpo puede ocasionar la muerte si la persona afectada no es tratada
raacutepidamente La mayoriacutea de las muertes causadas por esta bacteria han ocurrido entre
ancianos que viven en residencias La tasa de mortalidad es baja inferior a 1 en paiacuteses
desarrollados pero suelen producirse de 40-50 muertes al antildeo especialmente entre nintildeos
ancianos o personas inmunodeprimidas Las excretas de los enfermos contienen gran
cantidad de la especie de Salmonella implicada al comienzo de la enfermedad la cifra inicial
decrece seguacuten transcurre el tiempo (DeWaal y Barlow 2014)
El estado de portador se refiere a la condicioacuten en que las personas curadas pueden
eliminar Salmonella en sus heces durante meses La mitad de los individuos afectados
excretan este patoacutegeno de 2-4 semanas posteriores a su curacioacuten cliacutenica entre 10 y 20
continuacutean durante 4-8 semanas unos pocos durante 3 meses y en raras ocasiones se
prolonga hasta 6 meses El microorganismo puede eliminarse tambieacuten por la orina La dosis
infectante capaz de desencadenar la salmonelosis humana es alrededor de 1times105 UFCmL
dependiendo de factores como tipo de alimento virulencia de la cepa involucrada y
susceptibilidad del individuo Entre las especies altamente virales se encuentran la S Dublin
y sobre todo S Enteritidis (Callaway et al 2008)
El incremento del serotipo de S Enteritidis en los casos de salmonelosis humana al
contrario de otras del geacutenero Salmonella representa un importante problema de salud
puacuteblica en muchos paiacuteses ya que este serotipo infecta a gallinas aparentemente sanas que
posteriormente transmiten las enfermedades al hombre Si se consumen huevos crudos o
Antecedentes
28
poco cocidos el microorganismo podriacutea causar la enfermedad El nuacutemero de casos de
salmonelosis se incrementa durante el verano (Parra et al 2002 Callaway et al 2008
Fernaacutendez 2008)
B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis
Gran parte de las salmonelosis se deben al consumo de alimentos de origen animal
(carnes de abasto pollo mariscos pescado leche y huevos asiacute como ovoproductos y
productos laacutecteos no pasteurizados) o de origen vegetal que se contaminan con productos
en malas condiciones de salubridad o mal manipulados Muchos alimentos sobre todo los
de origen animal o contaminados con aguas residuales han servido como vehiacuteculos en
brotes de salmonelosis La carne de matadero estaacute contaminada habitualmente con
Salmonella su incidencia es mayor en las canales de ganado y otros animales debido por
ejemplo a la contaminacioacuten por el contenido intestinal de la res viva cuyas heces manchan
su piel pelo y patas al llegar al matadero Las canales de cerdo se contaminan durante las
operaciones de escaldado y pelado La contaminacioacuten entre las mismas canales y de eacutestas
a utensilios superficies de trabajo y manos de los que las manipulan es faacutecil Otro de los
principales reservorios de Salmonella es la carne de aves de corral La contaminacioacuten de las
canales de pollo y otras aves procede igualmente del tracto intestinal o del material fecal
de los animales que manchan sus patas y plumas Las etapas criacuteticas de la contaminacioacuten
de las canales aviares estaacuten en el desplumado y la evisceracioacuten tambieacuten es comuacuten la
contaminacioacuten cruzada a traveacutes de las manos de los operarios equipo y utensilios utilizados
en la preparacioacuten y troceado de las canales (Marcus et al 2004)
Son raras las salmonelosis adquiridas directamente de carnes bien cocinadas la mayoriacutea
de los brotes se deben a una coccioacuten insuficiente o por contaminacioacuten posterior a su
preparacioacuten Las carnes elaboradas mediante fermentacioacuten (salami chorizo y salchichoacuten)
pueden ser causa de brotes de salmonelosis teniendo en cuenta que las especies que
integran este geacutenero pueden sobrevivir al proceso de fermentacioacuten (Forsythe y Hayes
2002)
Como se mencionoacute anteriormente otro alimento que se asocia con frecuencia a
Salmonella es el huevo La contaminacioacuten se produce por dos viacuteas a traveacutes de la caacutescara
contaminada y por viacutea transovaacuterica en aves infectadas (gallina pata pava) En el primer
caso la superficie de la caacutescara se contamina siempre a su paso por la cloaca o cuando el
Antecedentes
29
huevo estaacute en un ambiente fecal los huevos rotos o manchados constituyen un peligro en
la propagacioacuten de especies de Salmonella (EFSA 2014)
La contaminacioacuten partiendo de la caacutescara se produce si eacutesta mantiene un grado de
humedad apropiado y existe una temperatura diferencial significativa entre el contenido del
huevo y el ambiente La diferencia de temperaturas entre el huevo maacutes elevada y el
ambiente favorece la absorcioacuten de los microorganismos como Salmonella Tambieacuten se
transmite sobre la caacutescara por contaminacioacuten cruzada a traveacutes de los manipuladores que
han tenido contacto con superficies infectadas durante el transporte y almacenamiento de
los mismos en lugares con precarias condiciones de higiene (Ejo et al 2016) Salmonella
es causal de graves enfermedades que son trasmitidas por productos derivados de huevo
contaminado y la asociacioacuten entre la infeccioacuten del tracto reproductivo de los pollos fue un
fuerte incentivo para desarrollar programas de prevencioacuten (Jawale y Lee 2014)
La leche cruda puede albergar Salmonella y ser causa de brotes de salmonelosis se
contamina a traveacutes del pezoacuten y por las manos del ordentildeador la pasteurizacioacuten elimina la
presencia de la bacteria Entre los productos laacutecteos se han identificado como causa de
brotes de salmonelosis la leche en polvo el queso los helados y maacutes raramente la
mantequilla todos ellos por fallos en su elaboracioacuten Salmonella se destruye o inactiva
durante la fermentacioacuten de alta acidez como el yogur y el queso de pH inferior a 45 En el
caso del queso poco aacutecido (pH superior a 49) la Salmonella puede desarrollarse en
cualquier etapa de su elaboracioacuten (Mastroeni y Maskell 2006)
Entre las verduras cualquiera puede contener Salmonella cuando se cultivan con aguas
residuales contaminadas o son fertilizadas con abonos de origen animal Algunos vegetales
como los berros han sido causa de brotes de salmonelosis Por otro lado los mariscos se
contaminan con Salmonella cuando se criacutean en aguas residuales contaminadas por lo que
han sido la causa de numerosos brotes en todo el mundo la depuracioacuten es la medida
preventiva adecuada Diferentes alimentos se han identificado como portadores de
Salmonella entre ellos coco cebada harina de cereales pimienta blanca y negra pasta
cacao en polvo y chocolate (Fernaacutendez 2008) La FDA (2017) reportoacute el aumento de las
pruebas de las cuales ha identificado papayas de dos granjas que resultaron positivas para
las cepas de Salmonella que coinciden con enfermedades no relacionadas con este brote
Antecedentes
30
C Crecimiento microbiano
El crecimiento microbiano puede definirse como un incremento en los constituyentes
celulares que ocasiona un aumento del nuacutemero de ceacutelulas de los microorganismos que se
multiplican por gemacioacuten y fisioacuten binaria En el uacuteltimo caso las ceacutelulas individuales se
agrandan y dividen para originar dos ceacutelulas hijas de un tamantildeo aproximadamente igual
(Atlas y Bartha 2002)
C1 Crecimiento de los microorganismos
Todos los mamiacuteferos incluyendo los seres humanos se adaptan a la vida del mundo
microbiano Louis Pasteur Robert Koch Eacutelie Metchnikoff y Theodor Escherich entre otros
investigadores sentaron las bases conceptuales sobre las interacciones microbio-hueacutesped
Pasteur postuloacute que los microbios eran necesarios para la vida humana y Metchnikoff afirmoacute
que la composicioacuten de la flora microbiana era esencial para el bienestar del hueacutesped
Igualmente Escherich estaba convencido de que el conocimiento preciso de la flora
endoacutegena era esencial no soacutelo para la comprensioacuten de la fisiologiacutea de la digestioacuten sino para
la comprensioacuten de la patologiacutea y terapia de enfermedades microbianas intestinales A pesar
de estas primeras ideas soacutelo recientemente los cientiacuteficos han desarrollado meacutetodos que
permiten caracterizar directamente los mecanismos moleculares que subyacen a la creacioacuten
y mantenimiento de diversos ecosistemas microbianos (Falk et al1998)
El crecimiento de una poblacioacuten bacteriana resulta de la suma de ciclos celulares de todos
sus individuos y suele ser asincroacutenico puesto que cada microorganismo se encuentra en un
punto diferente del ciclo celular Por consiguiente en un momento determinado en una
poblacioacuten se encuentran ceacutelulas que acaban de dividirse otras estaacuten replicando su ADN y
elongaacutendose y otras estaacuten iniciando la divisioacuten celular (Melbinger et al 2015)
El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza en la mayoriacutea de los
casos mediante la produccioacuten de colonias aisladas en cultivos soacutelidos El crecimiento
explosivo de las bacterias produce un gran nuacutemero a partir de una uacutenica ceacutelula inicial de
forma que tras un periacuteodo de tiempo de incubacioacuten en las condiciones ambientales
adecuadas se produce una colonia de individuos iguales Para que un microorganismo
crezca necesita nutrientes que le aporten energiacutea y elementos quiacutemicos para la siacutentesis de
sus constituyentes celulares De acuerdo a la fuente de carbono que utilizan los
Antecedentes
31
microorganismos se clasifican en autoacutetrofos si es el CO2 atmosfeacuterico (microorganismos que
fotosintetizan) y heteroacutetrofos si utilizan carbono orgaacutenico (Ouyang y Li 2013)
C11 Disponibilidad del agua
El agua es un factor importante para el crecimiento microbiano se requiere para crecer y
llevar a cabo las funciones metaboacutelicas de lo contrario los microorganismos se deshidratan
o mueren La aw depende de la concentracioacuten de solutos y de la cantidad de agua disponible
en el medio ambiente La mayoriacutea de las bacterias y hongos necesitan valores entre 098 y
0995 de aw para su pleno desarrollo (Madigan y Martinko 2006)
Una membrana plasmaacutetica permanentemente selectiva separa el contenido
citoplasmaacutetico del microorganismo de su ambiente por ello las alteraciones en la
concentracioacuten osmoacutetica del medio extracelular pueden afectar incluso la viabilidad de los
mismos Si se coloca un microorganismo en una solucioacuten isotoacutenica el agua entraraacute en la
ceacutelula y causaraacute su estallido salvo que la propia ceacutelula desarrolle alguna estrategia para
evitarlo por ejemplo reducir la concentracioacuten osmoacutetica del citoplasma gracias a los cuerpos
de inclusioacuten Los procariotas tambieacuten pueden contener canales sensibles a la presioacuten
osmoacutetica que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno
se vuelve maacutes baja que la del citoplasma (Madigan y Martinko 2006)
C12 Acidez y pH
El pH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad entre 5 y 8 para impedir la
destruccioacuten de las macromoleacuteculas haacutebiles en condiciones aacutecidas o alcalinas Los aacutecidos
fuertes (inorgaacutenicos) y los aacutecidos deacutebiles (orgaacutenicos) disminuyen el pH externo
posteriormente se disocian en el interior de la ceacutelula inhibiendo la actividad enzimaacutetica y el
transporte de nutrientes por lo tanto los microorganismos no pueden generar energiacutea de
almacenamiento y ocurre la muerte celular (Brooks et al1992)
C13 Oxiacutegeno
El oxiacutegeno molecular (O2) influye en el metabolismo de los microorganismos Durante el
Antecedentes
32
proceso de reduccioacuten del O2 se crean formas reactivas como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2)
superoacutexidos (O2-) y radicales hidroxilos (OH-) que producen dantildeo celular por la oxidacioacuten
de compuestos orgaacutenicos e incluso macromoleacuteculas (Prescott et al1999)
C14 Temperatura
La temperatura afecta el desarrollo y la supervivencia de los microorganismos En bajas
temperaturas la velocidad de crecimiento de algunos microorganismos disminuye y los
periacuteodos de latencia se alargan Por otro lado las temperaturas elevadas aceleran las
reacciones enzimaacuteticas (antes de los 40degC) pero si se intensifica el calor en algunos casos
provocan la desnaturalizacioacuten de las proteiacutenas y por consiguiente la lisis celular (Brooks et
al1992)
Es importante considerar que cada microorganismo tiene una temperatura de desarrollo
adecuada a mayor temperatura se produce un incremento lineal de la velocidad de
crecimiento hasta alcanzar el clima perfecto a velocidad maacutexima Por encima de esta
temperatura oacuteptima la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte
celular (Atlas y Bartha 2002) En la tabla 3 se presentan algunas condiciones ambientales
para el desarrollo de los microorganismos
Antecedentes
33
Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales (Lu et al 2006 Madigan et al 2006 Falk et al 2009)
Factor Tipo de
microorganismo Caracteriacutesticas Microorganismo representativo
NaCI
Osmotolerante Capaz de crecer en un amplio rango de aw o
presioacuten osmoacutetica St aureus Saccharomyces rouxii
Haloacutefilo Requiere altas concentraciones de NaCl para
crecer normalmente por encima de 02 M Halobacterium Dunaliella Ectohiorhodospira
pH
Acidoacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 0 y 55 Sulfolobus Picrophilus Ferroplasma Acontium
Cyanidium caldarium
Neutroacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 55 y 80 Euglena Paramecium
Alcaloacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 85 y 1 15 Badilas alcalophilus NaIronobaciacuteerium
Temperatu
ra
Psicroacutefilo Crece bien a 0degC temperatura oacuteptima de 15degC
o inferior Badilas psychrophilus Chlamydomonas nivalis
Psicroacutetrofo Puede crecer a 0-7degC oacuteptima de 20 a 30degC Listeria monocytogenes
Mesoacutefilo Temperatura maacutexima de 35degC
Temperatura oacuteptima alrededor de 20-45degC
P fluorescens E coli Neisseria gonorrhoeae
Trichomonas vaginalis
Termoacutefilo Puede crecer a 55degC o superior temperatura
oacuteptima a menudo entre 55 y 65degC
Geobacillus stearothermophilus Thermus
aquaticus Cyanidium caldarium
Hipertermoacutefilo Temperatura oacuteptima entre 80 y 113degC Chaetomium thermophile Sulfolobus
Atmoacutesfera
Aerobio obligado Completamente dependiente del O2 para
crecer Pseudomonas Mycobacterium tuberculosis
Anaerobio
facultativo
No requiere O2 pero crece mejor en su
presencia
M luteus St aureus
Streptococcus pneumoniae L monocytogenes
Anaerobio
aerotolerante Crece bien en presencia o en ausencia de O2 Lactobacillus
Anaerobio
obligado No tolera el O2 y muere en su presencia Clostridium botulinum C perfringens
Microaeroacutefilo
Requiere nivel de O2 inferior a 2-10 para
crecer y es dantildeado por el O2 (20) C fetus
Antecedentes
34
D Control del crecimiento microbiano
Los microorganismos toleran determinados factores ambientales Asiacute unas bacterias
pueden tener condiciones para su desarrollo y estas condiciones pueden ser nocivas para una
especie bacteriana El crecimiento de una poblacioacuten microbiana se estudia analizando la curva
de crecimiento de un cultivo La curva del crecimiento microbiano representa la evolucioacuten del
nuacutemero de nuacutemero de ceacutelulas viables presente en un cultivo microbiano liacutequido a lo largo del
tiempo de estudio Se estudia el nuacutemero de ceacutelulas viables por mililitro de un cultivo de
volumen limitado y con una cantidad de nutrientes limitada como por ejemplo un medio de
cultivo liacutequido en un matraz que ha sido inoculado con una cantidad inicial de microorganismos
o inoacuteculo (Hunter-Cevera y Belt 1996) Para llevar a cabo estos estudios se distingue tres
niveles entre los modelos de microbiologiacutea predictiva los que describen los cambios en el
nuacutemero de microorganismos con respecto al tiempo con respecto al efecto de las condiciones
ambientales y los que combinan los dos aspectos anteriores (Larcher y Cattaneo 2006)
Se considera el crecimiento de las bacterias en funcioacuten de su fondo geneacutetico en relacioacuten
con los nutrientes y en unas hipoteacuteticas condiciones ideales (oacuteptimas) Sin embargo el trabajo
experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales es decir
una serie de agentes fiacutesicos y quiacutemicos El anaacutelisis de la curva de crecimiento bacteriano es
muy importante para determinar el potencial de una teacutecnica de control especiacutefica Al igual que
las bacterias los fagos al forman una interaccioacuten con su bacteria hueacutesped se necesita
determinar una cuantificacioacuten del nuacutemero de copias que se generan por la infeccioacuten a esta
condicioacuten se le conoce como fase de eclipse siendo el momento idoacuteneo para realizar la
infeccioacuten fago-bacteria (Lee et al 2016)
D1 Agentes fiacutesicos
La temperatura es uno de los paraacutemetros ambientales maacutes importantes que condicionan el
crecimiento y la supervivencia de los microorganismos La temperatura afecta a la velocidad
de crecimiento y por lo tanto al tiempo de generacioacuten Cada bacteria es diferente y esto se
puede observar en una curva de tasa de crecimiento en funcioacuten de la temperatura Si se suele
utilizar calor en combinacioacuten con otros agentes fiacutesicos (filtracioacuten presioacuten y radiacioacuten) Al
aplicar temperaturas altas se refleja desnaturalizacioacuten e inactivacioacuten de proteiacutenas enzimaacuteticas
esenciales colapsamiento de la membrana citoplaacutesmica y a veces lisis teacutermica de la bacteria
Antecedentes
35
esta condicioacuten se presenta raacutepidamente cuando se aplica presioacuten la cual se utiliza para
esterilizar objetos como lo demuestra el uso universal de la autoclave en todos los
laboratorios de microbiologiacutea (Madigan y Martinko 2006) El calor es auacuten uno de los meacutetodos
maacutes comunes para destruir microorganismos se puede aplicar huacutemedo o seco (Salgado-Nava
y Jimeacutenez-Munguiacutea 2012) Por otro lado ademaacutes de aplicar calor si a las bacterias se le
extrae el calor del medio de manera intensa recurrir a la congelacioacuten con fines de conservacioacuten
de microorganismos por largos periacuteodos si se realiza apropiadamente numerosos
laboratorios disponen de congeladores a -30 o -70degC para la conservacioacuten de colecciones de
cultivos microbianos (Shafiei et al 2014)
D2 Agentes quiacutemicos
Aunque los objetos se desinfectan a veces con agentes fiacutesicos tambieacuten las sustancias
quiacutemicas se utilizan con mucha frecuencia por ejemplo los quimioteraacutepicos son sustancias
con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostaacutetica) En estas sustancias se busca
que sea efectivo contra un amplio espectro de microorganismos Pero no existe (hasta estos
momentos) un solo agente capaz de inhibir a todos los microorganismos Por otro lado existen
quimioteraacutepicos de espectro estrecho pero muy selectivos contra ciertas bacterias que son
patoacutegenas importantes Muchos factores influyen en la eficacia de los desinfectantes hay que
considerar la cepa de microorganismos presentes la concentracioacuten y naturaleza del
desinfectante y la duracioacuten del tratamiento Asimismo es imprescindible que las superficies
sucias se limpien antes de aplicar un desinfectante El uso apropiado de los agentes quiacutemicos
es esencial para la seguridad en los laboratorios y hospitales estos mismos productos se
utilizan tambieacuten para evitar el crecimiento microbiano en los alimentos (Prescott et al 1999)
E Fagos
E1 Antecedentes
Los virus son agentes infecciosos submicroscoacutepicos que pueden replicarse
independientemente de los cromosomas de una ceacutelula pero no independientemente de ella
A fin de multiplicarse deben penetrar la ceacutelula donde puedan replicarse a la cual se le
denomina hueacutesped Presentan una forma infecciosa madura que es tiacutepicamente extracelular
Antecedentes
36
Pueden infectar a diferentes seres vivos por lo que existen virus de animales de plantas y
de forma particular los llamados virus bacterianos o fagos (Madigan y Martinko 2006)
Los bacterioacutefagos o fagos (del griego φαγετον paguumlento ldquoalimentoingestioacutenrdquo) son agentes
virales de las bacterias su descubrimiento se atribuye por un lado al bacterioacutelogo ingleacutes F
W Twort que en 1915 mencionoacute el aclaramiento de un cultivo soacutelido de Micrococcus
provocado por un agente desconocido Por otro lado en 1917 el francocanadiense F
dHerelle descubrioacute un grupo de entidades bioloacutegicas en medios de cultivo que se propagaban
a expensas de las bacterias a los cuales les denominoacute fagos y dentro de sus investigaciones
definioacute su potencial uso e importancia cliacutenica Esto se refuerza a partir de 1940 con el
desarrollo del microscopio electroacutenico con el que se demuestra la naturaleza viral de los fagos
y que la forma de estudiarlos es mediante procedimientos microbioloacutegicos convencionales
facilitando su manejo y estudio (Grabow 2001)
La uacuteltima variedad de fagos se descubrioacute durante la Primera Guerra Mundial los tipos ya
conocidos eran los virus que afectaban a vegetales y animales fue entonces que se pensoacute
en que su aplicacioacuten para eliminar bacterias podriacutea ser utilizada para la prevencioacuten y el
tratamiento de enfermedades bacterianas pero no resultoacute (Merril et al 1996) Sin embargo
los fagos resultaron tener otros beneficios especialmente como modelos o sustitutos de los
virus en humanos en la investigacioacuten geneacutetica baacutesica asiacute como en la evaluacioacuten de la calidad
del agua Ademaacutes demostraron ser una herramienta valiosa en la mayoriacutea de las
investigaciones sobre los virus ya que en comparacioacuten con los humanos animales vegetales
e incluso los insectos anfitriones de otros virus los fagos son faacutecil y raacutepidamente reproducibles
en el laboratorio y no son particularmente exigentes con respecto al espacio instalaciones y
equipos El trabajar con fagos requiere la separacioacuten y purificacioacuten y las dos principales tareas
para realizar esto es utilizar meacutetodos quiacutemicos en los cuales se utilizan solutos como buffer
glicerol bromuro de potasio cloruro de cesio y tartrato de potasio aunque el maacutes comuacuten es
la sacarosa ademaacutes involucra la precipitacioacuten con sulfato de amonio polietilenglicol o cloruro
de cesio y los meacutetodos fiacutesicos que implican la centrifugacioacuten a diferentes velocidades y
gradientes de densidad y con menor frecuencia la cromatografiacutea de particioacuten (Sambrook y
Russell 2001)
La investigacioacuten sobre las propiedades baacutesicas de los fagos se desarrolla en la biologiacutea
molecular que permitioacute avances sin precedentes en toda la biologiacutea y ciencias meacutedicas La
Antecedentes
37
concentracioacuten y purificacioacuten es un factor determinante para llevar a cabo la infeccioacuten
eficientemente sin embargo existe un periacuteodo de adaptacioacuten por parte de los fagos antes
que se desarrollen y se logren tiacutetulos apreciables en ceacutelulas cultivadas (Sambrook y Russell
2001 Breeuwer et al 2003)
E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos
Los virus son paraacutesitos intracelulares obligados no tienen metabolismo intriacutenseco y
requieren la maquinaria metaboacutelica codificada por los cromosomas de ceacutelula que puedan
infectar y reproducirse en ella denominada hueacutesped Su tamantildeo oscila entre 20 y 200 nm y
consiste de un nuacutecleo de aacutecido nucleico (ARN o ADN de cadena simple o doble) rodeado por
una cubierta proteica (caacutepside) y en algunos casos una cubierta de liacutepidos Los microbioacutelogos
que investigan la presencia de virus en haacutebitats marinos y han detectado su presencia creen
que son diez veces maacutes numerosos que las bacterias marinas En la superficie de los mares
se encuentran entre 106 y 109 partiacuteculas viacutericas por mililitro y se estima que en la capa
superficial (1 mm) de los oceacuteanos se encuentran unas 3 x 1030 partiacuteculas viacutericas (Grabow
2001 Atterbury et al 2003)
E3 Clasificacioacuten de los fagos
Las variaciones en los fagos se presentan en forma estructural como apeacutendices en la
cabeza cuello y las fibras de la cola o espigas ademaacutes del genoma que variacutea en cada orden
En 1962 Andreacute Lwoff junto a otros investigadores propuso una clasificacioacuten basada en la
morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico Los nombraron de la siguiente manera los urovirales
que presentaban cola pronunciada los inoviridae eran los filamentosos y los microviridae los
tipo φX Posteriormente Bradley (1967) consideroacute la morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico y
agrupoacute a los fagos en seis morfotipos baacutesicos denominados de la A a la F posteriormente se
clasifico en fagos baacutesicos los de cola los filamentosos y los icosaeacutedricos con ADN de cadena
sencilla o RNA de cadena simple Los fagos han sido investigados debido a su rol como
agentes de biocontrol para el desarrollo de la seguridad alimentaria En el presente varios
miles de fagos en contra de varios objetivos han sido aislados de varios entornos y alimentos
Aproximadamente el 96 de los fagos aislados eran con cola y del tipo liacuteticos en una de las
Antecedentes
38
tres familias Myoviridae (245) Siphoviridae (61) y Podoviridae (14) en el orden de los
caudovirales (Atterbury et al 2003 Oh y Park 2017)
En 1971 el Comiteacute Internacional de Taxonomiacutea de Virus (ICTV por sus siglas en ingleacutes)
clasificoacute en 6 geacuteneros de los cuales 5 corresponden a la clasificacioacuten propuesta por Bradley
los grupos T4 λ φX174 MS2 y fd Los fagos pueden tener cola larga y flexible no contraacutectil
(Siphoviridae) cola larga y contraacutectil (Myoviridae) o cola corta (Podoviridae) como se observa
en la tabla 4 Para la clasificacioacuten de los fagos se aplican propiedades como el rango de
hueacutespedes y las relaciones inmunoloacutegicas sin embargo las maacutes importantes son su
morfologiacutea y las caracteriacutesticas de su aacutecido nucleico el cual se adsorbe a componentes de la
superficie celular que actuacutean como receptores especiacuteficos La zona de adsorcioacuten del virus es
complementaria al receptor celular por lo tanto un determinado fago soacutelo puede infectar un
nuacutemero limitado de cepas celulares que contengan a un determinado receptor La naturaleza
de la zona de adsorcioacuten variacutea con el tipo de fago En el T4 se localiza en el extremo de la cola
en donde se encuentran la placa basal las espiacuteculas y las fibras de la cola Las formas maacutes
complejas corresponden a los fagos con colas contraacutectiles (Atterbury et al 2003)
Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos
(Ackermann 2003)
Antecedentes
39
E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico
La multiplicacioacuten de los fagos (figura 4) ADN produce la destruccioacuten de la ceacutelula hueacutesped
mediante lisis lo que provoca su liberacioacuten El ciclo vital de un fago que culmina con el
estallido de la ceacutelula hueacutesped y la liberacioacuten de viriones recibe el nombre de ciclo liacutetico Los
acontecimientos que tienen lugar durante el ciclo liacutetico se revisaraacuten en esta seccioacuten con
especial atencioacuten a los fagos T-par de E coli Estos son fagos de ADN bicatenario con colas
contraacutectiles complejas de la familia Myoviridae son algunos de los virus maacutes complejos
conocidos (Fernaacutendez 2008)
Figura 4 Adsorcioacuten del fago T4 e inyeccioacuten del ADN (Leverentz et al 2003)
Los fagos podriacutean infectar hasta un 70 de la poblacioacuten de procariotas marinos y ser
responsables de la tercera parte de la mortalidad bacteriana acuaacutetica Tambieacuten se han
detectado virus que infectan diatomeas y otras algas importantes del fitoplancton marino lo
cual es de gran transcendencia ecoloacutegica ya que la multiplicacioacuten de bacterias marinas
supera la capacidad de reproduccioacuten de los protozoos La lisis por virus de ceacutelulas procariotas
y de algas puede tambieacuten contribuir enormemente en los ciclos del carbono y nitroacutegeno en las
cadenas troacuteficas marinas incluso podriacutea reducir el nivel de productividad marina como la de
moluscos y peces (Muniesa et al 2005)
E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten
Los fagos no se unen al azar a la superficie de una ceacutelula hueacutesped por el contrario se fijan
a receptores especiacuteficos La naturaleza de estos receptores variacutea de acuerdo al fago pueden
Antecedentes
40
ser lipopolisacaacuteridos y proteiacutenas de la pared celular aacutecidos teicoicos flagelos y pili Los fagos
T-par de E coli en particular utilizan lipopolisacaacuteridos o proteiacutenas de la pared celular como
receptores Las variaciones en las propiedades del receptor son parcialmente responsables
de las preferencias del fagos por el hueacutesped (Muniesa et al 2005 Leeuw et al 2017)
La adsorcioacuten de fagos T-par estaacute relacionada con diversas estructuras del tallo La fijacioacuten
del fago comienza cuando una fibra del tallo establece contacto con los receptores adecuados
a medida que maacutes fibras contactan con los receptores la placa basal se asienta en la
superficie La unioacuten se debe probablemente a interacciones electrostaacuteticas y se ve influida por
el pH y por la presencia de iones como Mg+2 y Ca+2 Una vez que la placa basal estaacute
firmemente asentada en la superficie celular se producen cambios conformacionales en ella
y en la vaina del tallo Esta uacuteltima se reorganiza de tal forma que se contrae pasando de una
conformacioacuten en cilindro de 24 anillos a otra de 12 anillos de longitud maacutes corta y ancha es
entonces cuando el tubo central es empujado a traveacutes de la pared celular bacteriana
Finalmente el ADN es extruido de la cabeza pasa a traveacutes del tubo del tallo y penetra en la
ceacutelula hueacutesped Parece ser que el tubo interacciona con la membrana plasmaacutetica para formar
un poro a traveacutes del cual pasa el ADN los mecanismos de penetracioacuten de otros fagos difieren
a menudo de los fagos T-par aunque no se han estudiado en detalle (Leverentz et al 2003)
F Biofilm
Las bacterias existen en la naturaleza bajo dos formas o estados a) bacterias planctoacutenicas
de libre flotacioacuten y b) bacterias biofilm en colonias de microorganismos seacutesiles (Nazar 2007)
Un biofilm se define como una agrupacioacuten de comunidades seacutesiles microbianas que se fijan a
superficies las ceacutelulas estaacuten incrustadas en una matriz autoproducida que actuacutea como
proteccioacuten quiacutemica y mecaacutenica del entorno asiacute estas bacterias presentan mayor resistencia
a desinfectantes y el secado (Vestby et al 2009) Las bacterias pueden crear condiciones
para formar biofilms casi en cualquier ambiente liacutequido La interfase soacutelido-liacutequido entre una
superficie y un medio acuoso (vgr leche) proporciona un entorno ideal para la fijacioacuten y
crecimiento de microorganismos (Fakruddin et al 2014)
Antecedentes
41
G Microscopiacutea electroacutenica
Los microscopios electroacutenicos se usan habitualmente para el estudio detallado de
estructuras celulares (Bradley 1967) Para analizar las estructuras internas es esencial el
microscopio electroacutenico de transmisioacuten MET En el MET se utilizan electrones en lugar de rayo
de luz las lentes son electromagneacuteticas y se opera en todo momento a alto vaciacuteo
(Ackermann 2003) El poder de resolucioacuten del microscopio electroacutenico es mucho mayor que
el del microscopio oacuteptico incluso pueden observarse estructuras moleculares como proteiacutenas
y aacutecidos nucleicos Sin embargo los haces de electrones tienen escaso poder de penetracioacuten
y una ceacutelula aislada es demasiado gruesa para poder visualizarse directamente por este
motivo se emplean teacutecnicas especiales para la obtencioacuten de cortes ultrafinos a fin de poder
observar las muestras Una ceacutelula bacteriana por ejemplo se corta con una cuchilla especial
en varios cortes ultrafinos de 20-60 nm de espesor que son posteriormente examinados de
manera individual en el microscopio electroacutenico (Fuster-Valls et al 2008) Para obtener
suficiente contraste las preparaciones se tintildeen previamente mediante tratamiento con
compuestos como aacutecido oacutesmico permanganato sales de uranilo o de lantano o plomo Como
estas sustancias poseen aacutetomos pesados son capaces de desviar los electrones y aumentar
el contraste (Madigan y Martinko 2006)
La microscopiacutea electroacutenica es el mejor meacutetodo para estudiar la forma de las bacterias Los
virus bacterianos por tener un diaacutemetro menor de 1000 Aring estaacuten por debajo del liacutemite de
resolucioacuten del microscopio oacuteptico sin embargo es posible observarlos mediante el
microscopio electroacutenico porque eacuteste utiliza una radiacioacuten de longitud de onda maacutes corta que
permite aumentar 100 mil veces una resolucioacuten de 10 Aring (Kruger et al 2000 Ackermann
2003) Para observar detenidamente la morfologiacutea se requiere el microscopio electroacutenico con
especificaciones precisas como el de barrido lo cual es una herramienta indispensable en
biologia molecular (Guzmaacuten 2015)
Para la observacioacuten las partiacuteculas se suspenden en un medio volaacutetil por lo general una
solucioacuten de acetato de amonio y se colocan sobre una membrana sostenida por una rejilla
metaacutelica que praacutecticamente no absorbe electrones El problema teacutecnico maacutes frecuente es la
falta de contraste como la imagen obtenida es el resultado de la dispersioacuten de electrones por
los aacutetomos de la partiacutecula se necesita una diferencia apreciable de poder dispersivo entre las
partiacuteculas y el medio de soporte generalmente se emplean teacutecnicas tradicionales La maacutes
utilizada se conoce como tincioacuten negativa consiste en mezclar la suspensioacuten del fago con
Antecedentes
42
fosfovolframato de sodio o acetato de uranilo a pH neutro A este pH las sales no se combinan
con el fago al secarse forman una capa uniforme y opaca a los electrones en la cual los fagos
destacan como partiacuteculas maacutes claras Como las sales en solucioacuten penetran las irregularidades
en la superficie de la partiacutecula la micrografiacutea revela los detalles finos de los fagos (Fuster-
Valls et al 2008 Montantildeez et al 2012)
La forma del fago se establece de manera visual que es directa de la placa cuando las
UFP que se observan a simple vista como placas liacuteticas a contraluz (APHA 2005) Y para
estudiar la adhesioacuten y formacioacuten celular en diversas superficies se han desarrollado varias
teacutecnicas de microscopiacutea entre las cuales se distinguen la microscopiacutea electroacutenica de barrido
y de transmisioacuten asiacute como la microscopiacutea de epifluorescencia (Fuster-Valls et al 2008) la
cual se basa en los mismos principios de oacuteptica de la microscopiacutea comuacuten con diferencias en
el manejo y el disentildeo relacionadas con la generacioacuten y transmisioacuten de longitudes de onda
adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar ya sean propios de la muestra o de
la coloracioacuten utilizada (Franco 2005)
El fundamento de la teacutecnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o
compuestos fluorescentes denominados fluorocromos en fijarse a los anticuerpos mediante
un enlace quiacutemico estable que no puede romperse durante el curso de la reaccioacuten
inmunoloacutegica La espectroscopia de fluorescencia es la teacutecnica de deteccioacuten oacuteptica maacutes
sensible En el caso de la deteccioacuten en ceacutelulas se exponen a alta energiacutea utilizando laacutemparas
de xenon excitando por varios nanosegundos y asiacute emitiendo una longitud de onda de baja
energiacutea (Franz y Jendreizik 2015)
H Fagoterapia
Las enfermedades infecciosas estaacuten catalogadas entre las primeras causas de muerte en
el mundo y por lo tanto son consideradas un problema de salud puacuteblica Entre ellas las
infecciones bacterianas causan gran preocupacioacuten dado que las bacterias adquieren diacutea a
diacutea mayor resistencia a los antibioacuteticos esto ocurre por medio de diversos mecanismos
fisioloacutegicos y moleculares que les permiten a estos microorganismos adaptarse raacutepidamente
a condiciones adversas (Prada-Pentildearanda et al 2015)
El descubrimiento de los fagos por dacuteHerelle se desarrolloacute cuando eacuteste buscaba una
Antecedentes
43
vacuna que pudiera combatir la crisis de disenteriacutea hemorraacutegica que se presentoacute en 1915 en
las afueras de Francia dacuteHerelle observoacute que tras aislar lisados libres de bacterias de la
materia fecal de los enfermos las bacterias eran destruidas por un agente desconocido
invisible capaz de destruir cultivos de bacterias o producir pequentildeas aacutereas de color maacutes claro
cuando las bacterias eran crecidas en confluencia en placas de medio soacutelido y publicoacute sus
observaciones en el artiacuteculo titulado ldquoSobre un microbio invisible antagonista de los bacilos
de la disenteriacuteardquo (Szafranski et al 2017)
El uso de los fagos como agentes terapeacuteuticos comenzoacute hace maacutes de 80 antildeos Entre los
ejemplos maacutes destacados y recientes de la utilizacioacuten exitosa de la fagoterapia cabe citar el
uso de fagos especiacuteficos en el control bioloacutegico de E coli O157H7 productora de colitis
hemorraacutegica (en alimentos) Tambieacuten se ha estudiado el uso de fagos en el tratamiento de
infecciones peritoneales y otitis externa en la erradicacioacuten de P aeruginosa en pacientes con
fibrosis quiacutestica en el tratamiento de infecciones urinarias y osteomielitis por S aureus y en
la descolonizacioacuten intestinal para combatir las infecciones por Enterococcus faecium
resistente a vancomicina entre otros Los efectos favorables de la fagoterapia podriacutean
exceder incluso su actividad antibacteriana Hay datos sorprendentes acerca de la actividad
in vivo de los fagos el conocido fago T4 de E coli podriacutea inhibir la adsorcioacuten y la replicacioacuten
de adenovirus en sus ceacutelulas blanco y el fago Pf4 de P aeruginosa habriacutea sido capaz de
inhibir el desarrollo de cepas de Aspergillus por secuestro de hierro (Lopardo 2017)
El estudio y desarrollo de nuevos tratamientos alternativos es de particular intereacutes en la
lucha contra la resistencia bacteriana Los fagos presentan caracteriacutesticas que los hace una
excelente herramienta contra las bacterias patoacutegenas debido a su especificidad y seguridad
ecoloacutegica Los fagos no solo son atractivos desde un punto de vista cliacutenico Se han utilizaacutedo
como potenciales aplicaciones en otras aacutereas como la agricultura el control de alimentos o
la industria como a continuacioacuten se describe en la siguiente tabla 5 Los fagos son una
solucioacuten ecoloacutegica ubicua para desarrollar nuevos tratamientos contra las bacterias aunque
se deben realizar maacutes estudios para comprender mejor la relacioacuten entre ellos y las bacterias
antes de su aplicacioacuten (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)
Antecedentes
44
Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos la naturaleza lugares
urbanizados y cuerpo humano (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)
Fuente Sitio encontrado
Naturaleza
Suelo y superficie terrestre
Agua continental y oceaacutenica
Ambientes extremos hielo marino pared de
algas zonas hipersalinas etc
Lugares artificiales
Hospitales y zonas similares
Planta de tratamiento de aguas negras
Algunas zonas bajo el impacto humano
Cuerpo de animales
Tracto digestivo y vagina
Tracto respiratorio y oral
Piel y epitelio mucoso
Los productos comerciales para terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones
Los fagos se pueden distribuir liofilizados y se disuelven antes de la administracioacuten por viacutea
intravenosa en un soporte adecuado como por ejemplo una solucioacuten acuosa o tampoacuten o
suspenderse en cualquier liacutequido adecuado coloidal o de la matriz de poliacutemeros para crear
bactericidas el principio activo se puede administrar de una manera conveniente como por
inyeccioacuten (subcutaacutenea intravenosa administracioacuten etc) por viacutea oral pulmonar (por ejemplo
aerosoles o por otros dispositivos a los pulmones) spray nasal intramuscular intraperitoneal
intrahecal intraviacutetrea vaginal rectal la puncioacuten lumbar y la aplicacioacuten directa Dependiendo
de la viacutea de administracioacuten el principio activo puede estar recubierto de un material que
preserve la sustancia de la accioacuten de enzimas aacutecidos y otras condiciones naturales que
pueden inactivar la sustancia (por ejemplo comprimidos recubiertos enteacutericos o pastillas)
Empresas dedicadas a la biotecnologiacutea se dedicaron a desarrollar productos utilizando fagos
especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan ETA la Food and Drug Administration de
los EE UU (FDA) incluye a los fagos en la categoriacutea de aditivos alimentarios la FDA ha
publicado la aprobacioacuten de seis fagos para usar en alimentos listos para comer (ready to eat)
efectivos para L monocytogenes de la compantildeiacutea Intralytix La compantildeiacutea Omnilytics ofrece
productos de control bacterial para varias aacutereas como son agricultura agua y alimentos
industrias que se pueden observar en su paacutegina web (httpswwwomnilyticscom) y otras
empresas como Biophage Pharma Inc (Canada) Exponential Biotherapies (EE UU)
(Segundo 2010)
Antecedentes
45
Estas nuevas estrategias de intervencioacuten eco-amigable son requeridas como agente de
biocontrol en contra de Salmonella Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos
antildeos debido a sus caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutef ico sin
dantildear la micro-flora en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros
distribucioacuten de esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla
algunos ejemplos de la aplicacioacuten de los fagos son los descritos en la siguiente tabla 6 (Oh y
Park 2017)
Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria (Oh y
Park 2017)
Compantildeiacutea Producto del fago Organismo hueacutesped
FINK TEC GmbH (Alemania) Secure Shield E1 E coli
Intralytix Inc
(EE UU)
Ecolicidereg (EcolicidePXtrade) E coli O157H7
EcoShieldtrade E coli O157H7
ListShieldtrade L monocytogenes
SalmoFreshtrade Salmonella spp
ShigaShieldtrade
(ShigActivetrade) Shigella spp
Micreos Food Safety
(Holanda)
PhageGuard Listextrade L monocytogenes
PhageGuard Strade Salmonella spp
E coli O157H7
Passport Food Safety Solutions
(EE UU) Finalysereg E coli O157H7
Phagelux (China)
AgriPhag
Xanthomonas campestris pv
vesicatoria Pseudomonas
syringae
pv tomato
SalmoProreg Salmonella spp
Salmonella spp
Antecedentes
46
47
III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO
48
Objetivos y plan de trabajo
49
A Objetivo general
El objetivo general de este estudio es aislar y caracterizar fagos frente Salmonella spp a
partir de diversas fuentes ambientales para su uso potencial en el control bioloacutegico
El control de Salmonella spp es de gran intereacutes para la industria alimentaria por lo que
encontrar alternativas para su eliminacioacuten es de gran impacto en la salud puacuteblica
B Objetivos especiacuteficos
1- Aislar fagos de Salmonella proveniente de muestras de aguas residuales de la ZMM y
muestras de lavado de carne pollo de un establecimiento donde se comercializa esta carne
2- Caracterizar parcialmente los fagos aislados en base a su morfologiacutea por TEM y el
anaacutelisis de sensibilidad frente a diversas cepas bacterianas
3- Estudiar el efecto de los fagos previamente aislados desarrollando un biofilm de
Salmonella spp sobre discos de acero inoxidable utilizando la DEM
C Plan de trabajo
Para alcanzar los objetivos establecidos se considera la ubicacioacuten de las fuentes para la
obtencioacuten de los fagos en este caso el medio seleccionado son riacuteos arroyos asiacute como un
establecimiento donde se procesan canales de pollo en la ZMM y las lagunas de oxidacioacuten
de aguas residuales en Mariacuten ambas localidades en Nuevo Leoacuten Meacutexico
Posteriormentese utilizaraacute la teacutecnica ADC y se verificaraacute en cual de estas muestras se
podriacutean encontrar fagos que sean liacuteticos para Salmonella enterica y posteriormente se
realizaraacuten pruebas de selectividad con la meta de caracterizar los fagos aislados frente a
diferentes hueacutesped (cepas de Salmonella spp y de E coli) y la observacioacuten de la morfologiacutea
se realizaraacute por el TEM
Salmonella spp presenta un periacuteodo de incubacioacuten por lo general entre 12 y 36 horas
tras el cual el derarrollo bacteriano en las superficies puede dar como resultado la formacioacuten
de un biofilm Para este estudio se desarrollaraacute un biofilm de Salmonella spp sobre discos
de acero inoxidable en condiciones de humedad esto es importante por la fase de eclipse
Objetivos y plan de trabajo
50
(momento en el cual atacan y se desarrollan los fagos) Se probaraacuten 3 concentraciones de
fago 6 7 y 8 UFPmL Se realizaraacuten recuentos durante un periacuteodo de incubacioacuten de 72 h
Con el fin de conseguir estos objetivos el presente trabajo se ha estructurado en tres
secciones las cuales se pueden observar en la figura 5 incluyendo las pruebas con DEM
en los discos de acero inoxidable
Figura 5 Diagrama general de trabajo
51
IV MATERIALES Y MEacuteTODOS
52
Materiales y meacutetodos
53
A Toma de muestras
Las muestras para obtencioacuten de fagos se recolectaron en diez sitios del aacuterea metropolitana
de Monterrey y del municipio de Mariacuten Nuevo Leoacuten (tabla 7) El meacutetodo que se utilizoacute para
aislar fagos de diversas fuentes medio ambientales y su posterior traslado al laboratorio fue
el descrito por Higgins et al (2005) Se obtuvieron las muestras provenientes de aguas
residuales y riacuteos se emplearon frascos de 450 mL previamente lavados y secos que
posteriormente se impregnaron con una solucioacuten de tiosulfato de sodio (Na2S2O3bull5H2O) al
10 (pv) (Sigma-Aldrich EE UU) y se esterilizaron en autoclave 121ordmC15min Al momento
de hacer la recoleccioacuten en campo los frascos fueron abiertos cuidadosamente y se llenaron
con el liacutequido se almacenaron en hieleras para su traslado al laboratorio el tiempo que
transcurrioacute desde la toma de la muestra hasta la llegada al laboratorio fue entre 1 y 3 h
posteriormente las muestras se centrifugaron el mismo diacutea y los sobrenadantes se
almacenaron 4oC hasta su uso (Vidales-Contreras et al 2006)
A cada una de las muestras obtenidas en el muestreo se le agregoacute 25 de cloroformo
(grado de reactivo 995 Sigma-Aldrich EE UU) para conservarlas en condiciones oacuteptimas
para su posterior llegar al laboratorio se mantuvieron a 4degC durante toda la noche para
permitir que el material grueso decante Mientras tanto en lo referente a las muestras
obtenidas de aguas provenientes de los establecimientos expendedores de pollos las
muestras se trataron igual pero como el sobrenadante contiene grasa se optoacute por filtrar y
posteriormente se realizoacute el mismo procedimiento antes descrito
Materiales y meacutetodos
54
Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos
B Obtencioacuten de fagos
Para aislar los fagos se utilizoacute la teacutecnica descrita por Sambrook y Russell (2001) la cual se
describe a continuacioacuten En un tubo de ensayo (16150 mm Fisherbrand EE UU)
conteniendo 45 mL de agar suave (AS) (Bioxon Meacutexico) mantenieacutendose a temperatura de
40C (en una cuba hidroneumaacutetica con agua) se colocaron 500 L de un cultivo de S
Enteritidis (provenientes del cepario del CINSP) en fase logariacutetmica y se agregaron 300 L
de las muestras recolectadas en las que se presume conteniacutean los fagos especiacuteficos para
esta cepa Se agitoacute el tubo de ensayo mezclando con movimientos circulares suaves para
evitar la formacioacuten de burbujas este procedimiento se realizoacute aproximadamente por 5
segundos El contenido se vertioacute uniformemente sobre una caja de Petri (10015 mm
Fisherbrand EE UU) conteniendo agar soya tripticasa (AST) (Bioxon Meacutexico) y se dejoacute a
temperatura ambiente hasta solidificar la ADC Se incuboacute a 37C por 24h Al momento de
observar el desarrollo de las placas de lisis (calvas) se procedioacute al aislamiento de los fagos
Su cuantificacioacuten se realizoacute de manera directa e inmediata ya que las calvas son visibles con
una iluminacioacuten de contraste (Breeuwer et al 2003) Posteriormente los fagos que si formaron
halos de inhibicioacuten fueron aislados de manera directa o siguiendo uno de los dos protocolos
(enriquecimiento y sin enriquecer) debido a que depende principalmente de la amplificacioacuten
del fago y las caracteriacutesticas de cada uno se describen a continuacioacuten
Municipio Sitio de la toma
Monterrey
Parque Fundidora
Riacuteo Santa Catarina
Establecimiento de comida
Av Conductores
Mariacuten Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal
Riacuteo La Libertad
Guadalupe Alcantarillas de la colonia La Azteca
Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados
San Nicolaacutes de los Garza Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac
Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea
Materiales y meacutetodos
55
B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos
Con el protocolo de enriquecimiento se proporcionoacute las condiciones oacuteptimas de desarrollo
al cultivo de la bacteria hueacutesped y la muestra al inocular el cultivo en la muestra y de esta
manera amplificar los posibles fagos que presentes en la muestra de agua
Se realizoacute este protocolo de la siguiente manera primero se seleccionoacute la cepa bacteriana
que seraacute el hueacutesped esto se consiguioacute haciendo un cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y
se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por otra parte se prepararon
aliacutecuotas (10 mL cada una) de cada una de las muestras recolectadas (enriquecidas con
cultivo bacteriano) y se centrifugan a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a
4degC despueacutes el sobrenadante se pasoacute por jeringa y con filtros de 022 microm (Millex-GP
polyethersulfone 33 mm radio-sterilized) Estas dos entidades biloacutegicas se unieron en un
matraz de capacidad de 50 mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon
Meacutexico) a doble concentracioacuten (20) En este matraz se agregaron 300 microL de la muestra
previamente filtrada con fagos y 500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incuboacute a 37degC por
24 h posteriormente por medio de la teacutecnica de ADC se pudo observar la formacioacuten de halos
de lisis de los fagos (Vidales-Contreras et al 2006)
B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos
El protocolo se emplea para adicionar directamente de la muestra una aliacutecuota y testarla
con la bacteria hueacutesped Se siguieron los pasos anteriormente descritos a este protocolo
primero se seleccionoacute la cepa bacteriana (hueacutesped) esto se realizoacute haciendo un cultivo fresco
(AST) (Bioxon Meacutexico) y se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por
otra parte se preparoacute aliacutecuotas (10 mL) de cada una de las muestras recolectadas y se
centrifugaron a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a 4degC despueacutes el
sobrenadante se pasoacute por jeringa con filtros de 022 microm (Millex-GP polyethersulfone 33 mm
radio-sterilized) Estas dos entidades bioloacutegicas se unieron en un matraz de capacidad de 50
mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon Meacutexico) a doble
concentracioacuten (20) A este matraz se agregaron 300 microL de la muestra filtrada con fagos y
500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incubaron a 37degC por 24h posteriormente por medio
de la teacutecnica de ADC se observaron la formacioacuten de halos de lisis de los fagos (Vidales-
Materiales y meacutetodos
56
Contreras et al 2006)
B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas
Despueacutes de que los cultivos bacterianos se reactivaron la preparacioacuten para trabajar con
ellos fue la siguiente se tomoacute una asada de una colonia bacteriana bien diferenciada y se
incuboacute en un tubo inclinado (punta de flauta) se dejoacute el cultivo toda la noche y posteriormente
se traspasoacute a un subcultivo en caldo con infusioacuten cerebro-corazoacuten (BHI Merck Alemania) e
incuboacute a 37degC durante 24 h posteriormente se subcultivoacute en BHI en las mismas condiciones
Una colonia aislada en tubo punta de flauta se inoculoacute en 9 mL de agua peptonada (3M
Meacutexico) y se incuboacute a 37degC durante 24 h luego se realizaron mezclas seriadas en diluyente
(1 gL triptona 85 gL NaCl pH 72) (Merck Alemania) y se implantaron en las superficies de
los discos de acero inoxidable tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm con
un volumen inferior a 50 microL Como control del inoacuteculo se prepararon 5 placas de TSA
En el caso del fago obtenido se amplificoacute realizando la infeccioacuten en repetidas ocasiones
hasta alcanzar una concentracioacuten de 1x107 UFPmL
B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos
Para la realizacioacuten de este estudio se utilizaron cepas bacterianas de Salmonella enterica
y E coli provenientes de diversas colecciones de los laboratorios involucrados tambieacuten se
utilizoacute un fago de prueba (PRD1) para ser utilizado como control positivo en los aislamientos
En la tabla 8 se muestran las bacterias y el fago indicando su denominacioacuten y origen asiacute como
las condiciones de conservacioacuten
Materiales y meacutetodos
57
Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten
Origen Cepa bacteriana fagos Clave Condiciones de conservacioacuten
FaSPyN
S Typhimurium ATCC 13311
Glicerol a -20degC S Paratyphi ATCC 9150
S Enteritidis ATCC 13076
FCB S Typhi ATCC 19430 BGA TSA 4degC
FAUANL
S Typhimurium TSA 4degC
Fago PRD1
Tampoacuten fosfato 4degC
E coli CECT 515
E coli K12
E coli ATCC 10536
E coli O157H7 CECT 4783
S bongori ATCC 43975
UAB
S enterica LT2
Vial liofilizado a -20degC
S enterica sub enterica CECT 4138
S enterica sub enterica CECT 4594
S enterica sub enterica CECT409
S enterica sub enterica CECT 698
S Typhimurium CCUG 29478
Para la reactivacioacuten de los cultivos que se almacenan a 4degC se dejaron a temperatura
ambiente igualmente para los congelados Posteriormente para sacarlos del estreacutes se
sembraron en medio de cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y se incubaron a 37degC por 24
horas tras estas condiciones ya se pudieron utilizar en los ensayos (McLaughlin et al 2006)
A continuacioacuten se describe la forma en que se reactivaron los cultivos en este estudio de
acuerdo a la forma en que estaban almacenados
a) Cultivos almacenados en glicerol
Se descongelaron los viales a temperatura ambiente
Materiales y meacutetodos
58
Se transfirieron 5 microL de cultivo en 20 mL de TSB (Becton Dickinson Co) y se incuboacute a
37degC toda la noche
Se sembroacute en tres campos en caja de Petri de 90 mm con TSA (Becton Dickinson Co)
Se incuboacute a 37degC por 24h
Se seleccionoacute una colonia aislada y bien diferenciada
El cultivo (colonia) se incuboacute en 20 mL de TSB a 37degC toda la noche
b) En caso de los cultivos liofilizados
En el vial se hidrataron los cultivos agregando 1 mL de TSB e incubando 1h a 37degC
Se vertioacute el cultivo en 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC toda la noche
Se realizoacute el mismo proceso anteriormente mencionado en a)
B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC)
La siembra o inoculacioacuten consistioacute en introducir artificialmente una porcioacuten de muestra
(inoacuteculo) en un medio adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano para su desarrollo
y multiplicacioacuten Una vez inoculado el medio se incuboacute a una temperatura adecuada para el
oacuteptimo crecimiento en promedio 37degC Los meacutetodos de conteo en placa como capa doble y
capa simple de agar se basan en la determinacioacuten de la concentracioacuten viral mediante el
conteo de UFP las cuales son zonas de aclaramiento circular o halo de inhibicioacuten de
crecimiento bacteriano que se producen en la capa o ceacutesped bacteriano debido a la lisis
producida por los fagos Inicialmente una partiacutecula de fago infecta a su bacteria hueacutesped se
replica y posteriormente se disemina generando una zona circular sin crecimiento de la
bacteria (Solano et al 2012) Por esta razoacuten en nuestro estudio se utilizoacute esta manera de
trabajar considerando las diferentes formas que se puede presentar los halos de inhibicioacuten
(forma tamantildeo densidad)
La teacutecnica se basoacute en mezclar el cultivo bacteriano en fase logariacutetmica y el fago en agar
suave (AS) tambieacuten llamado top agar cuando se aplica a la placa de Petri donde se realizoacute
el proceso de infeccioacuten El AS se preparoacute con TSB y agar bacterioloacutegico (15) para obtener
una consistencia semisoacutelida que permita el desarrollo de las calvas en el ceacutesped bacteriano
Se mantuvo a una temperatura adecuada para conservar el estado liacutequido y se agitoacute
cuidadosamente para dejar interactuar los cultivos fago-hueacutesped en el tubo de ensayo
Materiales y meacutetodos
59
posteriormente se dispersoacute de manera uniforme en placas de Petri de 90 mm de diaacutemetro con
15 mL de TSA La suspensioacuten (ceacutesped bacteriano en ADC) se dejoacute solidificar a temperatura
ambiente unos minutos y posteriormente se incuboacute 24h37degC (Vidales-Contreras et al 2006)
B6 Modelo de infeccioacuten
Las enzimas endolisinas de los fagos provocan la lisis debilitamiento y rompimiento de la
pared celular de las bacterias La lisis depende de la proporcioacuten de fagos y hueacutesped o
multiplicidad de infeccioacuten (Multiplicity of infection MOI) Cuando hay una MOI baja la relacioacuten
de fagos a bacterias no es superior a 21 Cuando la MOI es alta es decir muchos fagos frente
a pocas bacterias las ceacutelulas se lisan directamente (Dimmock et al 2007)
En ese sentido la Norma ISO 10705-11995 indica que durante el ensayo el fago en fase
de multiplicacioacuten experimenta varios ciclos de replicacioacuten lo que resulta en la muerte de la
ceacutelula hueacutesped que ha actuado como faacutebrica para la produccioacuten viral El modelo que se siguioacute
es para observar los halos de inhibicioacuten y contrastar los resultados En la figura 6 se presenta
el modelo de infeccioacuten utilizado con S Typhimurium y el fago PRD1 siguiendo el modelo de
Vidales-Contreras et al (2006) y la puesta a punto propuetas por Sambrook y Russell (2001)
Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten fago-hueacutesped
Materiales y meacutetodos
60
B7 Controles utilizados durante los ensayos
Se utilizoacute la cepa de S Typhimurium y el fago PRD1 como control positivo para observar
la formacioacuten de las calvas para el control negativo se utilizoacute agua esterilizada con esto se
asegurar que si existe infeccioacuten y evitar los falsos positivos que ocurren primordialmente por
contaminacioacuten
Para control negativo el ceacutesped bacteriano se obtuvo de la siguiente manera en un
tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de cultivo de S
Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de agua destilada esteacuteril la mezcla se vertioacute
en placa Petri con TSA
Como control positivo el ceacutesped bacteriano y las placas de lisis se obtuvieron como
sigue en un tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de
cultivo de S Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de fagos PRD1 la mezcla se
vertioacute en placa Petri con TSA
B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium
Para realizar los ensayos microbioloacutegicos se requirioacute trabajar con la misma cantidad de
biomasa en una fase de crecimiento similar El conteo en placa es un meacutetodo de medicioacuten de
biomasa que permite el recuento de ceacutelulas viables y consiste en determinar el nuacutemero de
ceacutelulas capaces de reproducirse y generar colonias sobre un medio soacutelido (cada ceacutelula viable
da origen a una colonia) Para este estudio y ver el efecto de los fagos sobre las bacterias
primeramente se calculoacute la curva de crecimiento celular pues es imprescindible para realizar
la infeccioacuten que la bacteria hueacutesped y se encuentre en fase logariacutetmica Es decir para
determinar la biomasa bacteriana se mide la cineacutetica de crecimiento celular y se considera
que se ha alcanzado la fase de crecimiento exponencial cuando la concentracioacuten es de 10⁸
UFCmL (McLaughlin et al 2006)
Para el conteo bacteriano se utilizoacute el meacutetodo de filtracioacuten por membrana
Se transfirioacute 1 mL del cultivo bacteriano fresco a 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC
Cada 30 minutos se recolectaron 300 microL de cultivo
A cada aliacutecuota recogida se le realizaron diluciones seriadas con 27 mL de agua
Materiales y meacutetodos
61
destilada esteacuteril hasta obtener un factor de 1010
De cada una de estas diluciones se obtuvieron 100 microL que se filtraron por membrana
de celulosa 045 microm (Millipore Corporation Billerica Ma 47 mm esteacuteril Cat No
JMX000089 Millipore) montada en un embudo de filtracioacuten magneacutetico de 47 mm (Pall
GELMAN Laboratory con capacidad de 300 mL) y con bomba de vaciacuteo (GM motors amp
industrial systems Modelo 5kh36kna510x)
Las membranas se colocaron en caja de Petri con TSA y se incubaron 24h a 37degC
C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos
Con excepcioacuten de la microscopiacutea electroacutenica los meacutetodos empleados para determinar el
tamantildeo forma y composicioacuten quiacutemica de los fago requieren una alta pureza de las partiacuteculas
virales El material de partida en cualquier estudio de este tipo para la obtencioacuten del fago es
cuando se presenten los halos de inhibicioacuten en el ADC en general ademaacutes de los fagos
estas zonas claras pueden contener los restos celulares de las bacterias como trozos de
pared membranas ribosomas ADN ARN proteiacutenas y otros componentes de peso molecular
maacutes bajo El contenido de fago en un lisado es del orden de 001 mg mL por lo que para
obtener la cantidad apropiada para su caracterizacioacuten es necesario partir de varios litros
(Leverentz et al 2003 Maestro y Sanz 2016)
Para llevar a cabo la purificacioacuten de los fagos se debe de realizar con concentraciones
superiores a 1010 UFPmL Uno de los meacutetodos maacutes utilizados es la centrifugacioacuten a alta
velocidad y posterior resuspensioacuten de las partiacuteculas sedimentadas en un volumen menor
Cuando es posible esta teacutecnica se reemplaza por un sistema de dos fases basado en la
propiedad que tienen algunos poliacutemeros de alto peso molecular como el polietilenglicol el
dextrasulfato de sodio y el dextrano al separarse estas fases por diferencia de pesos
moleculares los fagos se dispersan en este tipo de medios considerando las concentraciones
empleadas y las condiciones oacuteptimas de pH fuerza ioacutenica y temperatura y al pasar por el
proceso de centrifugacioacuten se concentran en una columna Una vez concentrado el fago en la
columna se puede recuperar faacutecilmente de la interfase Los procesos maacutes comuacutenmente
utilizados para la purificacioacuten posterior se basan en separar las partiacuteculas de fago ya sea por
su tamantildeo o densidad (Sambrook y Russell 2001 Vidales-Contreras et al 2006)
En la figura 7 se presenta el procedimiento para la amplificacioacuten de fagos que nos asegura
Materiales y meacutetodos
62
cultivos puros uniformes y con tiacutetulos altos lo cual es imprescindible para conseguir una
buena imagen en el microscopio electroacutenico
Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten de bacteriofagos aplicando la teacutecnica
de agar doble capa (ADC)
El meacutetodo utilizado para purificar los fagos que despueacutes de utilizaron para analizar su
morfologiacutea implicoacute el uso del kit Montage SEQ96 (Millipore Sequencing Reaction Cleanup Kit
Millipore Corporation EE UU)
En una placa de filtracioacuten (96 well SEQ plate by Millipore) se depositaron en cada
pocillo 15 microL de concentrado de fagos maacutes 5 microL de agua milli-Q (Injection Solution by
Millipore)
Materiales y meacutetodos
63
La separacioacuten se realizoacute por la exclusioacuten de lavados de la columna de gel aplicando
vaciacuteo por medio de una bomba (Millipore EE UU Vacuumpressure 220 V50 Hz 15 mm
Hg)
Posteriormente se resuspendioacute la muestra (Thermomixer comfort by Eppendorf) con
agitacioacuten durante 1 min a 500 rpm
Finalmente se agregoacute 10 microL de agua ultra pura Milli-Q para concentrar la muestra
(Injection Solution by Millipore)
Una de las modificaciones que se realizaron para obtener los fagos con elevada pureza y
concentracioacuten para ser utilizada en la microscopiacutea electroacutenica se realizoacute con el kit Montage
SEQ96 que se utiliza para la purificacioacuten de DNA y en este caso se utilizoacute para concentrar los
fagos (concentracioacuten 1012 UFPmL) El procedimiento se describe a continuacioacuten
Se antildeadieron 20 microL de buffer de inyeccioacuten a la placa donde se teniacutea la suspensioacuten de
fagos se resuspendioacute y transfirioacute todo el volumen a la placa azul de Millipore (kit Montage)
Se colocoacute la placa en la bomba del kit Montage de 2 a 3 min hasta que quedoacute seca
Es aconsejable no dejar maacutes tiempo del necesario para evitar un secado excesivo
Se limpioacute todo el exceso de liacutequido en la placa con papel filtro secando un par de
veces la placa sobre el papel Inmediatamente despueacutes se colocoacute la placa sobre el soporte
de la bomba evitando dejarla sobre el papel
Se antildeadieron 30 microL de buffer de inyeccioacuten
Se colocoacute la placa en la bomba unos 4-5 min hasta secarse
Con papel filtro se limpioacute todo el exceso de liacutequido que quedoacute en la placa y se colocoacute
en el soporte de la bomba
Se antildeadieron 30 microL maacutes de buffer de inyeccioacuten para resuspender
Se colocoacute la placa en agitacioacuten se centrifugoacute a 500 g por 10 min
Se traspasaron los 30 microL a un nuevo pocillo y se recolectoacute el sobrenadante
D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica
Con la concentracioacuten de fagos purificados se preparoacute la muestra para la observacioacuten al
microscopio electroacutenico y se procedioacute utilizando la teacutecnica de tincioacuten negativa tal como se
explica a continuacioacuten
Se depositaron 2 microL de suspensioacuten de fagos en un disco de capa fina de carbono y cobre
Materiales y meacutetodos
64
(200 Mesh Holes 100 microm square Ethene old 200 RU) despueacutes de 2 min de reposo a
temperatura ambiente se eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente Se antildeadieron 2
microL de agente de contraste solucioacuten tampoacuten 1 de acetato de uranilo (UO2middot (CH3COO)2middot2H2O)
(Merck Alemania) Se dejoacute actuar el colorante durante 2 min a temperatura ambiente y se
eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente y despueacutes se dejoacute el disco alrededor de 5
min a temperatura ambiente antes de observar en el microscopio
D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa
(DEM)
La microscopiacutea oacuteptica es el meacutetodo adecuado para la investigacioacuten de procesos celulares
ya que es menos agresivo para el manejo de la muestra Existen teacutecnicas de microscopiacutea con
otras especificaciones donde se aplican para estudiar la adhesioacuten celular y formacioacuten de
biofilms en superficies tales como el espectrofotoacutemetro infrarrojo transformada de Fourier el
laacuteser confocal de barrido y la microscopiacutea de fuerza atoacutemica estos microscopios se
caracterizada por detectar las ceacutelulas viables de las dantildeadas por medio de cromoacuteforos
(Montantildeez et al 2012) La microscopiacutea que estamos trabajando esta basada en fluorescencia
la cual utiliza cromoacuteforos para detectar DNA de ceacutelulas vivas (coloracioacuten verde) y ceacutelulas
muertas (coloracioacuten roja) y ha tenido grandes avances en la observacioacuten de tejidos ceacutelulas
moleacuteculas individuales y por consiguiente algunos restos celulares todos estos con una
excelente resolucioacuten (Pellegrotti et al 2014)
Para la observacioacuten de ceacutelulas mediante el DEM se utilizoacute el kit comercial de viabilidad Bac
Light (LIVEDEAD Bacterial Viability Kit L-13152 Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE
UU) que estaacute compuesto por dos colorantes fluorescentes de aacutecidos nucleicos (SYTOreg9 y
PISYTOreg9) que penetran tanto en las membranas intactas como en las lesionadas lo que
permite evaluar la vitalidad de las ceacutelulas bacterianas basaacutendose en la deteccioacuten de la
actividad de las oxidasas y reductasas bacterianas Se observa una sentildeal fluorescente
mejorada en ceacutelulas bacterianas con procesos metaboacutelicos activos En contraste PISYTOreg9
se manifiesta soacutelo en las ceacutelulas que presentan membranas lesionadas y desplaza el colorante
SYTOreg9 por la transferencia de energiacutea de la resonancia fluorescente Cuando se aplican
estos dos colorantes en proporcioacuten adecuada las ceacutelulas viables con membranas intactas
presentaraacuten fluorescencia verde y en contraste las ceacutelulas muertas o lesionadas tendraacuten
Materiales y meacutetodos
65
coloracioacuten roja (Berney et al 2007)
A continuacioacuten se describe la preparacioacuten de las muestras para ser observadas por el DEM
Se colocaron 2 microL de la concentracioacuten suspensioacuten de la muestra con fagos en una
concentracioacuten de 1x1012 UFCmL sobre un disco de acero inoxidable (tipo 14301 (2 cm de
diaacutemetro y 1 mm de grosor) ligeramente convexos con una altura maacutexima en el centro
de 1 mm
Se dejoacute secar a temperatura ambiente por espacio de 10 min
Posteriormente se aplicaron 2 microL de la solucioacuten vital de fluorescencia (LIVEDEAD Bac
Light Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE UU) que reacciona y da la coloracioacuten
al material geneacutetico de las bacterias
Para la observacioacuten de los discos se utilizoacute el microscopio de fluorescencia Olympus
BX51BX52 (Tokio Japoacuten) con caacutemara digital incorporada (DP 50 Olympus) equipado con
laacutempara de mercurio de 100 W (USH-103 OL Olympus) con filtro de doble paso (U-M51004
FR V2 Olympus)
Para enumerar las ceacutelulas bacterianas en el biofilm que se formo en los discos de
acero inoxidable se trabajoacute con un objetivo de 20X y se ubicaban 10 campos
aleatoriamente y los resultados se expresaron por cm2 Las imaacutegenes se revisaron con el
sistema de anaacutelisis de imagen (anaacutelisis 32 soft Imaging System GMBH Alemania)
El biofilm bacteriano se desarrolloacute en la superficie de discos de acero inoxidable tipo
14301 Antes de usarse deben limpiarse bien por inmersioacuten en una solucioacuten acuosa de
detergente (DINO-dis-Dipol Espantildea) al 5 en agua durante 1 h despueacutes se realizoacute la
inmersioacuten en bantildeo con alcohol isopropiacutelico (2-propanol) (Merck Alemania) al 70 en agua
durante 15 min Una vez secos se esterilizaron en autoclave a 121degC por 15 min
D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM
Se inocularon la superficie de los discos con 50 microL de cultivo de S enterica maacutes medio de
cultivo (TSB) para proporcionar en medio rico para que se forme el biofilm posteriormente se
colocaron en cajas de Petri esteacuteriles y se mantuvieron en condiciones de humedad a
temperatura ambiente durante periacuteodos de 24 48 y 72h realizaacutendoles el conteo
correspondiente para verificar el desarrollo del biofilm
Materiales y meacutetodos
66
Una vez formado el biofilm se inocularon los discos con 3 concentraciones diferentes de
fagos 6 7 y 8 logcm2 en un volumen inferior a 50 microL Las diluciones del fago se hicieron en
solucioacuten salina fisioloacutegica (SSF cloruro de sodio 080) (Merck Alemania) Se realizoacute la
infeccioacuten al inocular a los discos prueba y los discos de control con el mismo volumen de SSF
las condiciones de incubacioacuten se realizaron con humedad y a temperatura ambiente
Los discos de acero inoxidable que fueron inoculados con la infeccioacuten fago-bacteria se
analizaron en periacuteodos de 0 2 8 24 y 48 h Se utilizaron para la valoracioacuten de bacterias y
fagos y se distribuyeron los discos de la siguiente manera 2 para visualizacioacuten microscoacutepica
panoraacutemica 2 para recuento bacteriano por microscopiacutea y 2 para recuento bacteriano dando
un total de 6 discos por caja de Petri por duplicado y por cada concentracioacuten (3) por cada
ensayo (3) y por horarios (5) de dando un total de 540 discos
Para el conteo sobre cada disco se colocaron 20 microL del colorante (LIVEDEAD Pribes) y
se incubaron por 5 min a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad y se tomaron
fotografiacuteas a 10X 20X y 40X Para la microscopiacutea de conteo las fotografiacuteas se realizaron a
un aumento de 40X considerando 10 campos aleatorios
Cuando se formoacute el biofilm se requirioacute hacer los recuentos de bacterias y de fagos en ese
sentido para recuperar las bacterias los discos se colocaron en un frasco con 5 mL de TSB
con Tween 80 (TSBTW) (Merck Alemania) y 3 g de perlas de vidrio se homogeneizoacute la
muestra por 1 min en agitador voacutertex a maacutexima potencia para favorecer el desprendimiento
de los microorganismos y posteriormente se realizaron diluciones seriadas De este mismo
extracto se obtuvo el material necesario para hacer el conteo de fagos utilizando la teacutecnica de
ADC Y para el recuento de las bacterias viables se trabajoacute con cajas de Petri se sembroacute 1
mL en TSA con 06 de extracto de levadura (TSAYE Merck Alemania) y se incuboacute a 37degC
durante 24h (Fuster-Valls et al 2008)
67
V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Resultados y discusioacuten
68
Resultados y discusioacuten
69
A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras
De los 10 sitios de recoleccioacuten se lograron obtener un total de 39 muestras en junio de
2007 En la tabla 9 se presentan los sitios y el nuacutemero de muestras recogidas en cada sitio
En el caso del Riacuteo Santa Catarina se abarcoacute una distancia de 95 km la cual presentaba
diferentes zonas de descarga de aguas residuales y de ahiacute se hicieron las tomas en un periacuteodo
de estiaje En el caso de las lagunas de oxidacioacuten del municipio de Mariacuten esta zona presenta
tres lagunas con un aacuterea total de 16700 m2 se realizoacute el muestreo de manera aleatoria En
cuanto a las muestras que se obtuvieron en el sitio de comercializar carne de pollo se les tratoacute
de igual manera para comprobar si existiacutean fagos
Los lugares elegidos para la recoleccioacuten de muestras son similares a los reportados en la
literatura regularmente para el aislamiento de fagos del ambiente se utilizan aguas residuales
y establecimientos de manipulacioacuten yo venta de alimentos (Leeuw et al 2017) En
investigaciones previas se realizan muestreos de diversos sitios como en la piel y heces de
animales manos de los cuidadores superficies quiruacutergicas e instrumentos o utensilios usados
en los establecimientos hoteles y restaurantes (Ejo et al 2016 Yergeau et al 2016) Los
muestreos de aguas tambieacuten se pueden realizar en sitios cercanos a las salidas de drenaje
de hospitales esto es de gran importancia ya que donde hay bacterias posiblemente esteacuten
sus respectivos fagos (Tomat et al 2014 Mattila et al 2015 McShan y Nguyen 2016)
Resultados y discusioacuten
70
Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos
B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis
Para el aislamiento de los fagos especiacuteficos de Salmonella fue necesario la puesta a punto
de varios procedimientos la teacutecnica de agar doble capa (ADC) determinar la cineacutetica de
crecimiento de cultivos de Salmonella determinar la fase de eclipse en la relacioacuten fago-
bacteria (se utilizoacute como control la cepa S Typhimurium y el fago PRD1) y su puesta a punto
en el laboratorio de bioremediacioacuten de la Facultad de Agronomiacutea de la UANL
B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S
Typhimurium
La accioacuten liacutetica de los fagos sobre Salmonella se analizoacute utilizando la teacutecnica ADC
En este procedimiento es necesario tener un ceacutesped bacteriano uniforme entre dos capas
de medio soacutelido que puede ser agar-agar o agar-agarosa (Sambrook y Rusell 2001)
Con el objetivo de abaratar los costes y mejorar los resultados en este trabajo se empleoacute
esta teacutecnica con algunas modificaciones que se describen a continuacioacuten Asiacute pues se decidioacute
que las capas fueran agar-agar donde la primera capa fue de agar al 15 en medio TS y la
Municipio Sitio de la toma N de muestras
Tipo de agua
Monterrey
Parque Fundidora 3 Estanque y corriente
Riacuteo Santa Catarina 10 Corriente
Establecimiento de comida 2 Lavado del pollo
Av Conductores 2 Corriente
Mariacuten
Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal
10 Estanque y corriente
Riacuteo La Libertad 2 Corriente
Guadalupe
Alcantarillas de la colonia La Azteca
3 Corriente
Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados
2 Lavado del pollo
San Nicolaacutes de los Garza
Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac
2 Corriente
Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea 3 Corriente
Resultados y discusioacuten
71
segunda con agar a una menor concentracioacuten para hacer la capa menos firme por lo que fue
necesario poner a punto la teacutecnica probando diferentes concentraciones de agar en ambos
casos a pH 72 Ademaacutes esta adecuacioacuten es importante por el ahorro que se generoacute al utilizar
un componente maacutes econoacutemico que la agarosa lo cual repercutioacute favorablemente en el coste
de la prueba
Otra variable para poner a punto en la teacutecnica de ADC es el volumen de cultivo bacteriano
a utilizar para generar el ceacutesped de Salmonella y lograr una adecuada interaccioacuten con el fago
Se probaron 3 voluacutemenes diferentes de cultivo de S Typhimurium incubados 24 horas a 37oC
para alcanzar una concentracioacuten de 16 x 108 UFCmL Dependiendo de la cantidad de inoacuteculo
las caracteriacutesticas del ceacutesped bacteriano tienen diferente contraste lo cual puede facilitar o
dificultar la observacioacuten de las placas liacuteticas Finalmente el mejor resultado se obtuvo al
utilizar el volumen de 500 L ya que se logroacute una mejor observacioacuten del aclaramiento del
ceacutesped bacteriano al formar las placas liacuteticas En la tabla 10 se muestran las caracteriacutesticas
de las capas en la caja Petri para un buen manejo y desarrollo de la zona liacutetica producida por
el fago al multiplicarse
Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC
Paraacutemetro Condiciones
Agar suave (con agar) () 08
Temperatura del agar suave (degC) 49
pH del medio de cultivo (soacutelido y liacutequido) 72
Cantidad de agar suave (mL) 45
Cultivo bacteriano (microL) 500
Muestra tratada con fagos (microL) 100
Resultados y discusioacuten
72
B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium
El cultivo hueacutesped debe de encontrarse creciendo en medio liacutequido TS en fase logariacutetmica
al momento de mezclarlo con el fago Para identificar la fase logariacutetmica se probaron
diferentes tiempos de crecimiento Con todo ello se observa que la fase logariacutetmica de S
Typhimurium se encuentra en el minuto 150 coincidiendo con los datos reportados por
Vidales-Contreras et al (2006) Y siguiendo con mi tesis la determinacioacuten de la concentracioacuten
se realizoacute mediante el promedio de la enumeracioacuten de las UFC por placas Petri preparadas
por duplicado multiplicado por el factor de dilucioacuten el cual es el reciacuteproco del producto del
volumen ensayado y la dilucioacuten usada para el anaacutelisis Al final se observa cuando se ha
llegado a la fase estacionaria del desarrollo bacteriano (tabla 11) Se utiliza un factor de
dilucioacuten el cual se obtiene como el reciacuteproco de la multiplicacioacuten de volumen de ensayo y la
dilucioacuten usada en el anaacutelisis
Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium
Tiempo Minutos
(Acumulado) Dilucioacuten
UFCmL Promedio
F (Factor) Concentracioacuten
(UFCmL)
T0 0 1 x 10-5 9 plusmn 25 1 x 106 900 x 106
T1 30 1 x 10-5 13 plusmn 74 1 x 106 130 x 107
T2 60 1 x 10-5 24 plusmn 56 1 x 106 240 x 107
T3 90 1 x 10-5 51 plusmn 32 1 x 106 510 x 107
T4 123 1 x 10-5 211 plusmn 89 1 x 106 211 x 108
T5 150 1 x 10-6 215 plusmn 81 1 x 107 215 x 109
Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)
B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis
Las consideraciones tomadas del modelo infectivo S Typhimurium y el fago PRD1 y
utilizando la teacutecnica ADC se replican para poner a punto a la bacteria que se quiere probar
que en este caso es S Typhi ATCC 19430 Los resultados de estos ensayos se pueden
observar en la tabla 12 en la que se puede observar que es ligeramente mayor la etapa donde
Resultados y discusioacuten
73
se puede realizar la infeccioacuten (fase de eclipse) de los fagos aislados y la bacteria hueacutesped
Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis (108 UFCmL) (37 ordmC24h)
Tiempo Minutos (Acumulado)
Dilucioacuten UFCmL Promedio
F (Factor) Concentracioacuten (UFCmL)
T0 0 1 x 10-5 216 710 1 x 106 20 x 107
T1 60 1 x 10-5 260 608 1 x 106 20 x 107
T2 120 1 x 10-6 160 173 1 x 107 16 x 108
T3 180 1 x 10-6 244 208 1 x 107 24 x 108
T4 240 1 x 10-7 400 100 1 x 107 40 x 109
Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)
B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis
De los sitios muestreados se logro obtener 39 muestras y se obtuvo un total de 15 fagos
aislados a partir de dos fuentes de aguas residuales las del Riacuteo Santa Catarina y las lagunas
de oxidacioacuten de Mariacuten Los 15 fagos se nombraron consecutivamente como MRH 1-15 Los
15 fagos se probaron contra la cepa hueacutesped S Enteritidis (CINSP tabla 4) tras realizar de
3 a 4 amplificaciones la mayoriacutea (14 fagos) no presentoacute actividad liacutetica (formacioacuten de halos
de inhibicioacuten) de manera que fueron descartados para los siguientes estudios siendo
solamente uno proveniente de la muestra del Rio Santa Catarina el que produjo halos bien
definidos en el ceacutesped bacteriano y con eacuteste se continuoacute trabajando El fago que mantuvo la
actividad liacutetica fue el MRH6 Se propuso nombrarle como MRH considerando la M para
muestra la RH por el Rodrigo Hernaacutendez
B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten
La principal caracteriacutestica de los fagos es cuando forman halos de inhibicioacuten (tambieacuten
llamadas zonas liacuteticas o calvas) y en nuestro estudio las muestras de agua recolectadas
fueron tratadas y analizadas mediante la teacutecnica ADC observando los halos de inhibicioacuten
claros y de diferentes diaacutemetros estas observaciones son similares a las observadas por
Ackermann (2003) Tanto la cantidad de UFP que se pueden desarrollar y observar hecha por
Resultados y discusioacuten
74
los fagos y la pureza en que encuentren los bacterioacutefagos de las muestras obtenidas del medio
ambiente estaacuten directamente relacionadas la especificidad contra la bacteria Al sembrar por
vaciado en placa estos lisados sobre la cepa indicadora se obtuvieron diferentes tamantildeos de
placas liacuteticas
En la figura 8 se muestran los halos de inhibicioacuten en ceacutesped de Salmonella al realizar la
infeccioacuten se pueden observar los diferentes tamantildeos y la forma se da por la capacidad de
raacutefaga (nuacutemero de copias al realizar el proceso liacutetico) de los fagos de la progenie los fagos
suelen tener una raacutefaga de maacutes de 100 partiacuteculas infectivas producidas en un lapso de tiempo
de 05 ndash 20 h Algunos halos formados por el fago fueron claros lo que indica que es liacutetico de
acuerdo con diversos autores (Sambrook y Rusell 2001 Vidales-Contreras et al 2006 Wong
et al 2014) En nuestro estudio se batalloacute en encontrar fagos a pesar de buscar sitios
sentildealados por autores antes mencionados
Al intentar obtener fagos puede suceder que se encuentren en concentraciones tan
pequentildeas que al probarlos contra alguna cepa hueacutesped no sirven para trabajar por lo que se
llevoacute a cabo repeticiones seriadas (amplificacioacuten) asegurando que al formar una placa de Petri
en ADC con tamantildeos de los halos de inhibicioacuten iguales lo que nos indica que pertenecen a
una sola especie de fago
Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por fagos con halos de inihibicioacuten de
diferentes tamantildeos
Resultados y discusioacuten
75
C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli
La clasificacioacuten de los fagos se puede establer en base a su morfologiacutea al aacutecido nucleico
al espectro de accioacuten y algunas consideraciones inmunoloacutegicas (Criscuolo et al 2017) Al
realizar la infeccioacuten de fago-bacteria y observar la presencia de halos liacuteticos en las placas de
ceacutesped bacteriano se considera que se ha producido una infeccioacuten exitosa pero previamente
es necesario poner a punto el cultivo puro de ambos cultivos y considerar la concentracioacuten de
cultivos a utilizar
Al seleccionar los fagos que presentaron uniformidad en cuanto a la inhibicioacuten y posterior
evaluacioacuten de los fagos se consideraron varios factores entre ellos el tiempo que tarda la
replicacioacuten viral (lo cual es variable) siendo que en algunos casos se pueden replicar en
cuestioacuten de minutos A simple vista se pueden observar la formacioacuten de halos de lisis en el
ceacutesped bacteriano en las cajas de Petri
Asiacute pues la teacutecnica ADC se repitioacute varias veces hasta obtener placas liacuteticas con ideacutentica
morfologiacutea y tamantildeo En la tabla 13 se observa que hay diferentes tamantildeos de halos En los
primeros ensayos soacutelo cuatro muestras de agua (15 21 26 y 33) dieron halos de inhibicioacuten
pudieacutendose distinguir bien la forma y el tamantildeo Al realizar posteriores siembras los fagos
fueron perdiendo capacidad de infeccioacuten (fagos atemperados) y soacutelo la muestra 21 de las
lagunas de oxidacioacuten provenientes de Mariacuten presentoacute fagos con actividad liacutetica y el resto de
fagos no desarrolloacute actividad constante
Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten de S Enteritidis en ceacutesped
bacteriano
Diaacutemetro de halo grande ge 8mm mediano 8 lt X lt6mm pequentildeo le 5mm
Distribucioacuten de tamantildeos de halo
Muestra de agua Grande Mediano Pequentildeo
15 8 23 15
21 17 11 27
26 10 18 6
33 7 9 13
Diaacutemetro medio halo (mm) 1055 0671 0376
Resultados y discusioacuten
76
En la tabla 14 se presenta el listado de posibles hueacutespedes probados 12 cepas de
Salmonella y 4 de E coli que se probaron contra los 15 fagos aislados previamente Se puede
distinguir que afecta a algunas serovariedades de Salmonella y no tiene efecto en otras
serovariedades entericas No afecta nada a las cepas de E coli Se ve que la cepa maacutes
afectada por el fago es la S Typhi ATCC 19430 y otras cepas de Salmonella son afectadas
ligeramente
Resultados y discusioacuten
77
Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades de Salmonella spp y de E coli
serovariedades Fagos
M
R
H
1
M
R
H
2
M
R
H
3
M
R
H
4
M
R
H
5
M
R
H
6
M
R
H
7
M
R
H
8
M
R
H
9
M
R
H
1
0
M
R
H
1
1
M
R
H
1
2
M
R
H
1
3
M
R
H
1
4
MR
H15
S Typhimurium ATCC 13311
-
-
t
- -
t
- - - - - - - - -
S Paratyphi ATCC 9150 - - - - - - - - - - - - - - -
S Enteritidis ATCC 13076 - - - - - - - - - - - - - - -
S Typhi ATCC 19430 + + + + + t
c
+ + + n
d
n
d
n
d
n
d
nd +
S Typhimurium - - - - - - - - - - - - - - -
S Bongori ATCC 43975 - - - - - - - - - - - - - - -
S enterica LT2 - - - + + + - - - - - - - -
S sub enterica CECT 4138 - - - - + + + - - - - - - - -
S sub enterica CECT 4594
t
t
t
- + + + - - -
t
- - - -
S sub enterica CECT 409 - - - - n
d
- -
t
- - - - - - -
S sub enterica CECT 698 - - - - - t
c
- - - - - - - - -
S Typhimurium CCUG
29478
- - - + + - - - - - - - -
E coli CECT 515 - - - - - - - - - - - - - - -
E coli K12 - - - - - - - - - - - - - - -
E coli ATCC 10536 - - - - - - - - - - - - - -
E coli O157H7 CECT 4783 - - - - - - - - - - - - - - -
+ crecimiento y desarrollo de halo indica desarrollo muy pequentildeo o difuso del halo t indica desarrollo pequentildeo y turbio del halo tc indica turbio o con centro opaco en el centro del halo - no crecimiento o desarrollo de halo nd aparente baja efectividad o halo difuso
Resultados y discusioacuten
78
Resultados y discusioacuten
79
El fago que siacute mostroacute actividad (MRH6) y que mantuvo la capacidad liacutetica durante las
diferentes amplificaciones se trabajoacute de manera continua hasta obtener halos uniformes en el
tamantildeo y asiacute ya se considera como una entidad pura de fago Los resultados obtenidos en
este trabajo son semejantes a los mostrados por Thung et al (2017) En la figura 9 se
presentan las imaacutegenes donde se muestra el desarrollo de halos liacuteticos previamente
mencionados donde se puede observar los halos uniformes contra A) S Enteritidis (CINSP)
y B) S Typhi ATCC 19430 (UAB)
Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria A) S Enteritidis (CINSP) y B) S Typhi ATCC 19430
La especificidad de los fagos se encuentra generalmente a nivel de cepa y tambieacuten de
especie y maacutes raramente a nivel de geacutenero Es de intereacutes el garantizar una eficiente infeccioacuten
de la dupla fago-bacteria de esta manera se toman todas las medidas precautorias para
obtener resultados fiables en este sentido se requiere verificar todos los aspectos como son
los controles (positivo y negativo) En el caso del control negativo se verificoacute el desarrollo
solamente del ceacutesped bacteriano de la cepa hueacutesped con la teacutecnica ADC y como control
positivo se consideroacute el modelo del fago PRD 1 y S Typhimurium los fagos son altamente
especiacuteficos (no afecta a otros cultivos bacterianos) y no se puede descartar falsos positivos
por la presencia de restos celulares bacterianos (Segundo et al 2010 Szafranski et al 2017)
Resultados y discusioacuten
80
D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM
El ICTV clasifica a los fagos en 1 orden13 familias y 31 geacuteneros De los cuales se
observa al orden de los Caudovirales el cual comprende a la mayor parte de los fagos (en
torno a un 95)y estos estaacuten constituidos por 3 familias con cola Myoviridae Podoviridae
y Siphoviridae Con estas caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas mediante el TEM en la
figura 10 se presentan las imaacutegenes del fago MRH6
El anaacutelisis de una suspensioacuten de fagos con una concentracioacuten de 1x1012 UFPmL mediante
microscopiacutea electroacutenica muestra una distintiva morfologiacutea de cabeza icosaeacutedrica estructura
alargada y cola no contraacutectil La caacutepside tiene un diaacutemetro de 55-60 nm y la cola puede
alcanzar los 570 nm Estas caracteriacutesticas se corresponden con la familia Siphoviridae Yang
et al (2017) comentan que esta familia de fagos se encuentra frecuentemente en
enterobacterias
Figura 10 Imagen por TEM del fago MRH6 (X100 000) la barra representa 100nm (Servicio de Microscopiacutea UAB)
Resultados y discusioacuten
81
D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero
inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de
epifluorescencia directa (DEM)
Para corroborar la potencial condicioacuten como agente de desinfeccioacuten del fago MRH6 es
necesario observar su efectividad a traveacutes de la DEM con la que se pueden observar
bacterias viables y no viables Tambieacuten la materia orgaacutenica puede dar falsos positivos y se
debe tener en cuenta al comparar con otros meacutetodos de conteo (Montantildeez et al 2012)
En este trabajo S Typhi ATCC 19430 desarrolloacute biofilms en las superficies de acero
inoxidable (discos tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm) y consiguieron
niveles de 29 plusmn 02 UFCcm2 despueacutes de tener un maacuteximo de 72 h en incubacioacuten en
condiciones de humedad y temperatura ambiente tal como se puede observar en la figura 11
Estos biofilms tienen distinta intensidad seguacuten el tiempo de incubacioacuten siendo los periodos
evaluados de 24 48 y 72h respectivamente En estas condiciones se realizoacute el recuento en
tres zonas de cada disco para cada tiempo de incubacioacuten y los resultados se presentan en la
figura 12 Para tener fiabilidad de los resultados se realizaron los conteos por triplicado porque
el manejo de los discos es muy complejo y para evitar errores de manejo se consideroacute
necesario tener maacutes de una muestra otorgando ademaacutes la oportunidad de comparar
resultados y tener un margen de referencia en cuanto a los resultados obtenidos
Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 en
diferentes tiempos de incubacioacuten (24 48 y 72h) a temperatura ambiente
Resultados y discusioacuten
82
Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable incubados a temperatura ambiente n = 3
En este estudio se compararon 2 meacutetodos de conteo de bacterias despueacutes de ser atacadas
por los fagos eacutestos fueron el recuento en placa de agar y por otro lado la observacioacuten por
microscopiacutea de epifluorescencia y la relacioacuten entre ambos meacutetodos Desafortunadamente se
han perdido los resultados por un problema irresoluble pero si se puede comentar que existe
una relacioacuten ligeramente inferior a 09 (R2 ) Esta observacioacuten ya ha sido presentada
anteriormente por otros autores (Fuster-Valls et al 2008 Engelhardt et al 2014)
El cultivo bacteriano se puede contabilizar por conteo en placa directo (TSA) este meacutetodo
es utilizado generalmente para cultivos de geacutermenes no exigentes o moderadamente
exigentes y cuando se quiere visualizar como afecta el ataque de los fagos las ceacutelulas
bacterianas se visualizan por DEM (cuya coloracioacuten cambia a verde cuando han sido atacadas
por los fagos) y una forma de visualizar este ataque es por medio de TSA con la teacutecnica de
ADC
0
5
10
15
20
25
0 10 20 30 40 50 60
Co
nte
o (
Lo
g U
FC
cm
2)
Tiempo (h)
Crecimiento bacteriano
Resultados y discusioacuten
83
D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable
Se aplicoacute la DEM para evaluar la efectividad del fago MRH6 en el control de S Typhi ATCC
19430 sobre superficies de acero inoxidable en condiciones de humedad El fago MRH6 es
liacutetico capaz de disgregar los biofilms
El analizar la accioacuten liacutetica del fago sobre Salmonella por medio del DEM es muy importante
e innovador pero el material que se utiliza y la manera en que se comportan las diferentes
bacterias hacen que se deba ser muy precavido al considerar el uso de este meacutetodo como
adecuado para realizar conteos (Libuchi et al 2010) Por ejemplo se debe tener en cuenta
que existen bacterias que no forman un biofilm y presentan movimiento esto puede llegar a
complicar el visualizarlas si no estaacuten en el campo por lo que se podriacutea pensar que fueron
atacadas y eliminadas por los fagos o bien que por los diferentes lavados se barrieron
La DEM con la tincioacuten LIVEDEAD reveloacute la presencia de ceacutelulas viables con coloracioacuten
verde En la figura 13 se puede observar el efecto letal del fago MRH6 sobre la poblacioacuten de
S enteacuterica disminuyendo su cantidad considerablemente en base a el tiempo de incubacioacuten
en color verde Se observa que hay disminucioacuten de las ceacutelulas de S Typhi ATCC 19430 al ser
atacadas por el fago MRH6 Recordemos que la infeccioacuten con el MRH6 se realizoacute despueacutes de
formar un biofilm a temperatura ambiente y con humedad por espacio de 72h en 3
concentraciones 6 7 y 8 UFPmL Al paso del tiempo se aprecia que a las 48h hay pocas
ceacutelulas vivas al menos detectadas por la teacutecnica utilizada
Resultados y discusioacuten
84
a)
b)
c)
Figura 13 Secuencia de imaacutegenes de epifluorescencia que ilustran la destruccioacuten de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable causada por el fago MRH6 tras incubacioacuten de 0 8 24 y 48 h y con 3 concentraciones de fagos a) 6 b) 7 y c) 8 UFPmL respectivamente
La DEM es un meacutetodo altamente sensible que se caracteriza por la formacioacuten de imaacutegenes
amplificadas y es considerada una teacutecnica poderosa con altos niveles de sensibilidad y
resolucioacuten Tomando como referencia los resultados se considera que la DEM es una
herramienta eficaz para el conteo bacteriano pero hay que considerar la experiencia del
observador
Resultados y discusioacuten
85
En algunas ocasiones al observar las bacterias atacadas por los fago se pueden encontrar
muestras con material geneacutetico mezclado con restos celulares esta situacioacuten hace que
algunos investigadores recomienden extraer los fagos de la muestra antes de sembrar las
bacterias con el fin de determinar la reduccioacuten bacteriana uacutenicamente debida a la actividad
virulenta del fago sobre la muestra y no a la infeccioacuten por fagos libres presentes en el agar
(Sharma et al 2009) En ese sentido tal como reporta Fuster-Valls et al (2008) en su trabajo
observoacute que el limite de deteccioacuten de esta teacutecnica es de 279 log10 celulas por cm2 en cambio
en nuestro trabajo y tal como se observa en la figura 14 se pudo llegar a una sensibilidad
muy proacutexima a 2 y que coincide con las imaacutegenes de la figura 13 en las que a las 24 y 48
horas apenas se observan algunas manchas que corresponden al crecimiento bacteriano
Los fagos utilizan los recursos de la ceacutelula para hacer muchos fagos nuevos lo que causa
que la ceacutelula lise (estalle) y muera en el proceso La lisis en las uacuteltimas etapas del ciclo liacutetico
el fago expresa los genes para las proteiacutenas que hacen agujeros en la membrana plasmaacutetica
y la pared celular En la figura 14 se puede observar como el recuento de Salmonella Typhi
ATCC 19430 disminuye por el ataque del fago MRH6 El efecto del fago es muy fuerte y al
final los conteos son muy parecidos
Resultados y discusioacuten
86
Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 en superficies de acero inoxidable por el fago MRH6 con diferentes concentraciones y hasta 48 h de incubacioacuten
En este trabajo se buscoacute crear condiciones de infeccioacuten fago-bacteria en el laboratorio
como las que se pudieran presentar en la industria Los resultados de esta relacioacuten del fago
MRH6 y S Typhi ATCC 19430 muestran que la aplicacioacuten del fago es efectiva pero hay que
considerar que funciona mejor a altos tiacutetulos (108 UFCmL) y que deberaacute de potenciarse
cuando se trate de un coctel de fagos
Nuestros resultados sugieren que los fagos pueden ser utilizados como un meacutetodo para
controlar un biofilm formado por un bacteria especiacutefica
Al realizar la buacutesqueda de informacioacuten en diferentes motores de buacutesqueda una de las
plataformas de libre acceso (Pubmed) se obtuvo una relacioacuten de 5 en publicaciones de
00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Salm
on
ella
Typ
hi
AT
CC
19430
(lo
g1
0ceacutelu
las cm
2)
Tiempo (h)
Fago MRH6 a 6 Logml Fago MRH6 a 7 Logml Fago MRH6 a 8 Logml Control sin fago
Resultados y discusioacuten
87
fagos contra diferentes serovariedades de Salmonella spp lo que se puede traducir en que
hay un aacuterea de oportunidad latente
Las consideraciones que se enviacutean como propuesta es que existen en estos momentos
muchos trabajos sobre fagos pero aquiacute en Meacutexico no hay trabajos reportados y los que
existen estaacuten apenas en fases iniciales
Existe un enorme potencial de trabajo en esta aacuterea con los fagos tal es el caso de la
fagoterapia en otros sitos y en otros tiempos estaacuten realizando experimentos para ser
explotada como alternativa para todos los aacutembitos desde hogares industria salud animales
vegetales etc Por lo menos en EE UU tienen grandes avances en estudios relacionados
con la aplicacioacuten en bacterias multiresistentes que por el uso de antibioacuteticos han mutado esto
en el sector salud donde se estaacute perdiendo la batalla
Una de las fortalezas de estudiar a los fagos es que antes de que los antibioacuteticos fueran
descubiertos habiacutea investigacioacuten considerable sobre los fagos como tratamiento para las
enfermedades bacterianas humanas por lo menos en parte de Europa La aplcacion de los
fagos es potencialmente son buenos candidatos para tratar enfermedades bacterianas en
seres humanos inocuidad aliemnaria bioremediacioacuten y cada regioacuten tiene fagos endeacutemicos y
este tabajo representa de los primeros en llevarse en Monterrey
Ciertas limitaciones de los resultados se debiooacute a las condiciones que se presentaron al
realizar el estudio (laboratorio equipo conocimiento del tema) solamente se pudo aislar un
fago y lo recomendable es que sean varios fagos dado que son muy especiacuteficos de especie
o hasta de cepa Se proboacute su accioacuten sobre superficies con un solo cultivo bacteriano y en la
realidad las superficies se contaminan con diferentes bacterias
Lo que se vizualiza para nuestro estudio es sugerir varias liacuteneas de accioacuten a futuro Por
ejemplo el fago aislado podriacutea probarse in vivo sobre carne de pollo o fagoterapia tambieacuten
podriacutea continuar los estudios para aislar maacutes fagos y hacer mezclas (coacutecteles) que tuvieran
un mayor rango de actividad y combatir a diversas especies de Salmonella Con respecto al
tratamiento de superficies podriacutean utilizarse coacutecteles de fagos para tratar biofilms bacterianos
formados por maacutes de dos especies o inclusive podriacutean probarse en biopeliacuteculas industriales
reales
Resultados y discusioacuten
88
89
VI CONCLUSIONES
90
Conclusiones
91
De las 39 muestras de agua analizadas se aislaron tentativamente15 fagos de los que soacutelo 4
mantuvieron en un primer momento su actividad liacutetica estos fagos se correspondieron con las
muestras de agua 15 21 26 y 33 Se siguioacute trabajando con ellos y finalmente solo uno de
ellos el MRH6 mantuvo su actividad liacutetica despueacutes de varias amplificaciones este fago se
aisloacute de las aguas residuales de Mariacuten
Se consiguioacute optimizar la teacutecnica ADC cambiando la agarosa que tiene un alto costo por
agar-agar maacutes econoacutemico sin alterar la fiabilidad de la teacutecnica ademaacutes con este cambio se
facilita el manejo
En relacioacuten con la especificidad de los 15 fagos aislados frente a las 16 cepas de
enterobacterias probadas (12 cepas de Salmonella spp y 4 de E coli) se observa ciertas
tendencias marcadas Ninguno de los fagos ataca a las cepas de E coli probadas En cuanto
a Salmonella se observa una fuerte especificidad frente a S Typhi (ATCC 19430) una ligera
actividad frente a varias cepas de S enterica y no hubo efecto contra las demaacutes cepas de
Salmonella ensayadas lo cual confirma la elevada especificidad fago-hueacutesped
Las imaacutegenes obtenidas mediante DEM muestran una morfologiacutea caracteriacutestica de cabeza
icosaeacutedrica estructura alargada y cola no contraacutectil que sugieren que el fago MRH6 se puede
clasificar en la familia Siphoviridae
Se observa un efecto liacutetico progresivo del fago MRH6 frente a biofilms de Salmonella en
discos de acero inoxidable llegando a valores miacutenimos inferiores a 102 a las 48 horas de
incubacioacuten para todas las concentraciones de fago utilizadas (6 a 8 UFPmL)
Se comprueba que la DEM es un buen meacutetodo para la cuantificacioacuten del crecimiento de S
Typhi (ATCC 19430) sobre discos de acero inoxidable con una gran sensibilidad y resolucioacuten
ya que se observaron claras diferencias en los diversos tiempos de incubacioacuten ensayados y
a diferentes concentraciones del fago MRH6 Esto confirma que la teacutecnica es una herramienta
eficaz para valorar el efecto liacutetico de los fagos sobre biofilms
Ya que en este trabajo solamente se obtuvo un fago liacutetico se sugiere reflexionar acerca de
los factores que han dificultado la obtencioacuten de un nuacutemero maacutes amplio de fagos
Conclusiones
92
Este trabajo refleja el gran intereacutes por iniciar o regresar a trabajar con fagos tal como esta
sucediendo en otras partes del mundo Hasta el momento hay muchas espectaivas sin
embargo todaviacutea se necesita investigacioacuten para saber queacute tan seguros son
93
VII BIBLIOGRAFIacuteA
94
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