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AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE MICROORGANISMOS
TERMOFÍLOS CON POTENCIAL BIOTECNOLOGICO DEL MANANTIAL
TERMOMINERAL SANTA MONICA DEL MUNICIPIO DE CHOACHI
(CUNDINAMARCA)
LUIS ANDRES FORERO ZAMUDIO
Proyecto de Trabajo de Grado para optar al título de Licenciado en Biología
Dr. LUIS FRANCISCO BECERRA GALINDO
Licenciado en Biología. Msc. Ciencias Biológicas.
Director
Dra. MARIA AURORA LONDOÑO AVENDAÑO
Bióloga. PhD. Biología Molecular.
Co-directora
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
BOGOTÁ D.C.
2017
TABLA DE CONTENIDO
1. LISTA DE TABLAS …………….…………………………………………i
2. LISTA DE FOTOS ...……………………………………………………....ii
3. RESUMEN ………………………………………………………………….7
4. ABSTRACT……………………………………………………………....…7
5. INTRODUCCIÓN………………………………………………………….8
6. HIPOTESIS………………………………………………………………....9
7. MARCOTEÓRICO……………………………………………………….10
7.1 MICRORGANISMOS EN AMBIENTES EXTREMOS………………10
7.1.1 Clasificación de los organismos extremófilos……………………10
7.2 MICRORGANISMOS TERMÓFILOS……………………………….11
7.2.1 Generalidades…………………………………………………...12
7.2.2 Metabolismo de microrganismos termófilos……………………12
7.3 ENZIMAS TERMOESTABLES……………………………………….14
7.3.1 Clasificación de las enzimas termofílicas………………………14
7.3.1.1 Clase I…………………………………………………..14
7.3.1.2 Clase II………………………………………………….14
7.3.1.3 Clase III……………………………………………...…15
7.3.2 DNA polimerasas………………………………………………15
7.4 SECUENCIACION……………………………………………………15
7.4.1 El 16S rARN…………………………………………………...16
7.4.2 Identificación bacteriana a partir del 16S ARNr……………….16
8. OBJETIVOS……………………………………………………………....18
8.1 OBJETIVO GENERAL……………………………………………….18
8.2 OBETIVOS ESPECIFICOS……………………………………….......18
9. MATERIALES Y METODOS……………………………………...........19
9.1 DISEÑO EXPERIMENTAL……………………………………..........19
9.1.1 Población de estudio y muestra………………………………...20
9.1.2 Delimitación de la investigación……………………………….20
9.2 MUESTREO……………………………………..................................20
9.3 INOCULACIÓN……………………………………............................22
9.4 SELECION Y AISLAMIENTO……………………………………....24
9.5 CUANTIFICACIÓN DE LA MUESTRA AISLADA……………......25
9.6 CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA……………………………......26
9.6.1 Caracterización morfológica…………………………………...27
9.6.2 Coloración de Gram……………………………………............28
9.6.3 Actividad Catalasa……………………………………...............28
9.6.4 Agar Citrato de Simmons……………………………………....29
9.6.5 Agar Hierro-Triple Azúcar (Agar TSI) ………………………..30
9.6.6 Movilidad……………………………………............................31
9.6.7 Condición de anaerobiosis……………………………………..31
9.7 EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO………………………….......32
9.7.1 Cuantificación…………………………………….....................32
9.7.2 Digestión enzimática …………………………………….........32
9.7.3 Construcción de librerías genómicas…………………………..32
9.7.4 Pretratamiento de librerías genómicas…………………………32
9.7.5 Eliminación de adaptadores……………………………………33
9.8 ENSAMBLE DE NOVO……………………………………................33
9.8.1 Programa para el ensamblaje en SOAP……………………..…33
9.8.2 Scaffolding……………………………………..........................34
9.8.3 Mapeo contra la nueva referencia……………………………...34
10. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………........35
11. CONCLUSIONES……………………………………..............................54
12. RECOMENDACIONES……………………………………....................55
13. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICAS……………………………………56
i
1. LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación de organismos termófilos…………………………………11
Tabla 2. Reacciones de producción de energía……………………………………13
Tabla 3. Organismo de origen, DNA polimerasas termoestables…………………15
Tabla 4. Composición total del medio de cultivo………………………………...22
Tabla 5. Solución stock I (solución acida)……………………………………......24
Tabla 6. Solución stock II (solución alcalina)…………………………………....24
Tabla 7. Ítems morfológicos a evaluar……………………………………...........27
Tabla 8. Morfología de la colonia……………………………………..................42
Tabla 9. Morfología de la célula……………………………………....................42
Tabla 10. Resultados Agar TSI …………………………………….......................48
ii
2. LISTA DE TABLAS
Foto 1. Ubicación de la fuente termo mineral “Santa Mónica” Choachi-Cundinamarca
Foto 2. Muestreo manantial fuente termo mineral “Santa Mónica” Choachi-
Cundinamarca.
Foto 3. Muestreo del manantial fuente termo mineral “Santa Mónica” Choachi-
Cundinamarca.
Foto 4. Inoculo inicial.
Foto 5. Cámara de anaerobiosis con inoculo inicial y medios de enriquecimiento para
las colonias seleccionadas Ind 1 e Ind 2.
Foto 6. Cámara de anaerobiosis en incubación en horno a 59°C.
Foto 7. Cultivo de disolución seriada10-4.
Foto 8. Disolución seriada y placas 10-4, 10-5, 10-6.
Foto 9. Siembra en placa Petri de las colonias seleccionadas.
Foto 10. Colonias seleccionadas.
Foto 11. Prueba actividad catalasa.
Foto 12. Medios pruebas bioquímicas agar TSI y Citrato Simmons.
Foto 13. Resultados posibles de la prueba bioquímica Agar TSI
Foto 14. pH de la fuente termomineral Santa Mónica.
Foto 15. Medios turbios positivos para crecimiento microbiano.
Foto 16. Selección de colonias de la dilución 10-4.
Foto 17. Crecimiento positivo para disolución seriada 10-4.
Foto 18. Diferencial de Gram para disolución 10-4.
Foto 19. Crecimiento positivo para cepa aislada Ind 1.
Foto 20. Crecimiento positivo para cepa aislada Ind 2.
Foto 21. Conteo de colonias Ind 2.
Foto 22. Conteo de colonias Ind 1.
Foto 23. Cultivo de las cepas Ind 1 e Ind 2 en incubadora de CO2 en fase tardía.
Foto 24. Diferencial de Gram y tamaño de la célula de la cepa Ind 1.
Foto 25. Diferencial de Gram y tamaño de la célula de la cepa Ind 2.
Foto 26. Desprendimiento de O2 prueba actividad catalasa de la cepa Ind 1.
Foto 27. Desprendimiento de O2 prueba actividad catalasa de la cepa Ind 2.
Foto 28. Resultado de prueba Agar Citrato de Simmons de la cepa Ind 1.
Foto 29. Resultado de prueba Agar Citrato de Simmons de la cepa Ind 2.
Foto 30. Resultado de prueba Agar TSI.
Foto 31. Resultado de prueba movilidad de la cepa Ind 1.
Foto 32. Resultado de prueba de movilidad de la cepa Ind 2.
Foto 33. Anaerobiosis facultativa en incubadora de CO2.
Foto 33: cuantificación de la extracción de DNA de la cepa Ind 1.
7
3. RESUMEN
Los avances biotecnológicos y las caracterizaciones moleculares son temas que
han adquirido relevancia en las últimas décadas; Las nuevas formas de clasificación por
métodos moleculares y nuevos informes, muestran las ventajas que poseen algunos
organismos, mecanismos de supervivencia en ambientes extremos. Su gran resistencia
genera un especial interés en estos microorganismos por diferentes campos, entre ellos el
industrial, biotecnológico, médico, entre otros, centrados en sus biomoléculas y productos
metabólicos. En el presente trabajo se aislará y caracterizará una cepa de la fuente del
manantial termomineral MTM "Santa Mónica" ubicada en las coordenadas geográficas
4 ° 32'52.2 "N 73 ° 55'01.1" W, en el departamento de Cundinamarca. Se estudiarán
individuos termofílicos cuyo hábitat supere el rango de temperatura de 60 ° C para su
desarrollo, las muestras serán valoradas primero por pruebas bioquímicas para una
posterior selección y aislamiento, con lo cual se realizará una caracterización molecular
secuenciando el DNA y realizando un análisis bioinformático para lograr una
clasificación filogenética. Al igual que se identificará y analizará la secuencia que
codifica para la enzima DNA polimerasa.
Palabras clave: DNA polimerasa, termófilos, determinación molecular
4. ABSTRACT
Biotechnological advances and molecular characterizations are topics that have
acquired relevance in the last decades; The new forms of classification by molecular
methods and new reports, show the advantages that some organisms possess, the survival
methods in extreme environments. Its great resistance generates a special interest in these
microorganisms by different fields, among them the industrial, biotechnological, medical,
among others, focused on its biomolecules and metabolic products In the present work,
a strain of the MTM "Santa Mónica" thermomaterial source located in the geographical
coordinates 4 ° 32'52.2 "N 73 ° 55'01.1" W, in the department of Cundinamarca, was
isolated and characterized. It will be studied individuals whose habitat exceeds the
temperature range of 60 ° C for their development, the samples will be evaluated firstly
by biochemical tests, for subsequent selection and isolation, with which a molecular
characterization will be carried out by sequencing the DNA and performing a
bioinformatic analysis to achieve an optimal phylogenetic classification. In the same way
that the sequence coding for the enzyme DNA polymerase will be identified and analyzed.
Key words: DNA polymerase, thermophiles, molecular determination.
8
5. INTRODUCCIÓN
En este trabajo se busca hacer la estandarización de protocolos para el cultivo y
aislamiento, además de una determinación filogenética de una bacteria termófila
provenientes de fuentes manantiales termominerales, al igual que la identificación del gen
que codifica la enzima DNA polimerasa, a partir una bacteria termófila endémica,
empleando procedimientos de biología molecular. Las bacterias termófilas empleadas
fueron colectadas de la fuente termo mineral Santa Mónica, zona del altiplano
Cundiboyacense, el análisis bioinformático se realizara a partir de la secuenciación del
organismo. La DNA polimerasa, es un importante precursor en los procesos de PCR, que
permiten la amplificación de secuencias específicas de DNA o RNA, procesos empleados
en distintas aplicaciones biológicas, en diversos campos como: forense, medicina,
biotecnología, microbiología, etc., algunas de las aplicaciones de la técnica de PCR son
el diagnóstico molecular de enfermedades genéticas, infecciones bacterianas y virales,
investigación en evolución molecular, clonación, genética de poblaciones, identificación
de individuos, expresión de genes, etc. (Gomez. G.J. et al, 2002)
La DNA TAQ polimerasa es una enzima que multiplica el DNA, proveniente de
una bacteria termófila (thermophyllus aquaticus), la cual permite multiplicar una región
del DNA miles de veces, mediante el proceso de Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR), soportando altas temperaturas sin llegar a desnaturalizarse, lo que permite realizar
el proceso con solo una aplicación.
9
6. HIPÓTESIS
H0: Se espera que las bacterias termófilas puedan ser aisladas y replicadas en
cámara de anaerobiosis y cámara de CO2 en el laboratorio.
H0: Al secuenciar el DNA de la cepa seleccionada, se espera determinar
filogenéticamente a partir de la secuencia genómica e identificar la zona donde se ubica
el gen que codifica para la enzima DNA polimerasa.
H0: Se espera que existan diferencias significativas, en la confiabilidad de los
protocolos establecidos para determinar si los métodos de selección y aislamiento del
inoculo inicial son óptimos para la replicación de estos microrganismos en el laboratorio.
H1: Si por el contrario en ninguna de las especies de bacterias a estudiar pueden
ser aisladas y replicadas en cámara de anaerobiosis y/o cámara de CO2 en el laboratorio,
se podrían descartar los métodos empleados como óptimos para el desarrollo de futuras
investigaciones.
10
7. MARCO TEÓRICO
7.1. Microrganismos en ambientes extremos
La vida microbiana no se encuentra limitada a hábitats específicos con
condiciones definidas, es así como los estudios por décadas de diferentes bacterias,
muestran que las podemos encontrar en una gran diversidad de ambientes incluyendo las
que nosotros catalogamos como ambientes extremos(Van Den Burg, 2003), las
condiciones de estos ambientes extremos pueden hacer referencia a las condiciones
físicas extremas como temperatura, presión o radiación, sino también para condiciones
geo-químicas y bioquímicas extremas como salinidad, pH, osmolaridad o cambios de
anaerobiosis a aerobiosis y viceversa. Además, de condiciones mecánicas extremas como
compresión, y descompresión (Rossi et. al., 2003). Estos ambientes extremos se
encuentran colonizados por una amplia diversidad de microrganismos como bacterias,
cianobacterias, algas y levaduras que se han adaptado a las condiciones que predominan
en estos nichos ecológicos (Herbert, 1992).
La diversidad del ecosistema abarca las amplias diferencias entre los tipos de
ecosistemas, la diversidad de hábitats y los procesos ecológicos que ocurren dentro de
cada tipo de ecosistema. De igual modo la variedad de ambientes extremos es
considerable, hielos glaciares, hidrotermales submarinos, piscinas de lodo caliente, suelos
y manantiales salinos, lagos alcalinos y manantiales termales (Rossi et. al., 2003).
Los microrganismos procariontes pueden crecer y proliferar bajo una diversidad
de condiciones extremas o letales para la mayoría de especies, microrganismos que
sobreviven en altas y bajas temperaturas (110°C o -2°C), extrema acidez (pH menor a 3)
o alcalinidad (pH mayor a 10) altas concentraciones salinas entre 5% a 30% y elevadas
presiones(Cava, 2009).
7.1.1. Clasificación de los organismos extremófilos
Los microrganismos que habitan los ambientes extremos constituyen grupos que
se organizan según la condición extrema característica de su hábitat como psicrófilos,
alcalófilos, acidófilos, halófilos, termófilos e hipertermófilos (Rossi et. al., 2003).
11
Tabla 1. Clasificación de microorganismos extremófilos
EXTREMOFILOS MINIMO OPTIMO MAXIMO
Termófilos > 50°C >60°C
Termófilos extremos > 35°C > 65°C > 70°C
Hipertermófilos > 60° > 80°C > 85°C
Acidófilos pH > 0 2.5 < pH < 3.0 PH > 9.0
Alcalino tolerantes PH < 8.5 PH > 10
Alcalófilos PH > 8.5
Halófilos tolerantes 2% < NaCl < 5%
Halófilos moderados 5% < NaCl < 20%
Halófilos extremos 20% < NaCl < 30%
Psicrófilos = 0°C <25-30°C
Barófilos > 0.1 MPa =10-50 MPa Φ 100 MPa
Modificado a partir de: Heigel, 1998, citado por Olliver et al, 2000, Rubiano, 2006
La temperatura es uno de los parámetros físicos de crecimiento que permite
establecer una clasificación de estos microrganismos, en este sentido, los microrganismos
que crecen a temperaturas menores a 10°C se catalogan como psicrófilos, los que se
desarrollan entre los 10°C y 50°C se catalogan como mesófilos, los que proliferan entre
los 50°C y 75°C se catalogan como termófilos y por último los hipertermófilos que se
desarrollan a temperaturas superiores a 75°C (Navas, 2010).
7.2. Microrganismos termófilos
Diferentes ambientes extremos demuestran la gran capacidad adaptativa de la
vida, una clara muestra son los organismos capaces de vivir de manera óptima en áreas
de altas temperaturas, superiores a los 80ºC, estos ambientes proporcionan la demanda
nutricional y fisiológica de estos microrganismos, en este sentido sus componentes
celulares, ácidos nucleicos, proteínas, membranas deben ser termoestables, capaces de
soportar temperaturas superiores a los 100º C (Stetter 1999).
En estos ambientes extremos es donde estos microrganismos producen
biocatalizadores que funcionan en condiciones extremas, la funcionalidad de estos
productos ha aumentado sus aplicaciones en diversos procesos industriales (Van Den
Burg, 2003). Estos organismos se han aislado a partir de estos hábitats, no solo para la
12
explotación de nuevos procesos biotecnológicos, sino, además para investigar la forma
en que las biomoléculas se estabilizan cuando se someten a condiciones extremas
(Herbert, 1992).
Estos organismos incorporaron diversas adaptaciones a diferentes factores
ambientales tales como la composición de minerales y gases, pH, potencial reductor, la
salinidad y la temperatura (Stetter 1999).
7.2.1. Generalidades
En ambientes como los volcanes activos es común encontrar grandes cantidades
de dióxido de carbono, azufre, vapor de agua, sulfuro de hidrogeno y otras con tazas
variable como monóxido de carbono, metano, nitrógeno, hidrogeno y trazas de amoniaco.
Asimismo el sulfato se encuentra presente en los campos solfatáricos como en el agua de
mar. Si bien estos organismos no son capaces de prosperar a temperaturas ambientes o un
poco más bajas, estos organismos son capaces de sobrevivir en aquellos lugares (Stetter
1999).
El ácido sulfhídrico es toxico para la mayoría de formas de vida, existen
organismos especializados que obtienen su energía de los sulfuros y usan esa energía para
producir azucares simples y carbohidratos que en algunos hábitat sirven para alimentar
diversas formas en determinados hábitats que normalmente son extremos para la vida
como la conocemos. Microrganismos cuyos modos de desarrollo que no dependen de la
luz del sol, de procesos fotosintéticos para su libre desarrollo (Snow Peter, 2014).
7.2.2. Metabolismo de microrganismos termófilos
Las reacciones de producción energética en microrganismos hipertermófilos
quimiolitoautotróficos son de 2 tipos: anaeróbicas y aeróbicas de respiración, una gran
cantidad de estos microrganismos presentan un modo quimiolitoautotrófico de nutrición,
reacciones de reducción de compuestos inorgánicos se utilizan como fuentes de energía,
asimismo el CO2 es la única fuente de carbono necesario para construir el material celular
orgánico (autótrofos). Por lo tanto, estos organismos fijan CO2 por quimiosíntesis y se
designan quimiolitoautótrofos. De igual manera que organismos mesófilos algunos
organismos hipertermófilos pueden respirar utilizando oxigeno como aceptor de
electrones, estos se conocen como microaerofílicos, cuya característica es que pueden
proliferar donde la concentración puede ser altamente reducida, incluso tan baja con
concentraciones de 10 ppm. (Stetter 1999).
13
Varios organismos hipertermófilos quimiolitoautotróficos son heterótrofos
facultativos, siendo capaces de utilizar material orgánico, alternativamente, a los
nutrientes inorgánicos que son proporcionados por el medio como células en estado de
descomposición. De esta manera los organismos hipertermófilos heterótrofos obtienen
energía, ya sea por vía aeróbicas o por diferentes métodos de la respiración anaeróbica,
utilizando material orgánico como donadores de electrones, o por fermentación (Stetter
1999).
Microrganismos termófilos e hipertermófilos anaerobios se caracterizan por tener
2 tipos de metabolismo el quimiolitotrófico que radica en la obtención de energía
mediante la oxidación de compuestos inorgánicos o el quimiorganotrófico que consiste
en la obtención de energía por medio de la oxidación de compuestos orgánicos. Por
consiguiente sea cualquiera de los 2 tipos de metabolismo, estos organismos anaerobios
termófilos son capaces de recurrir a aceptores externos de electrones para oxidar de forma
más eficaz compuestos orgánicos e inorgánicos que utilizan como fuente de carbono
(Pachón y Posada, 2003; Rubiano 2006).
Ejemplos comunes de compuestos que intervienen en la respiración anaeróbica
son el nitrato, hierro férrico, Sulfato, respiraciones de dióxido de azufre y carbono (tabla
2).
Tabla 2. Reacciones productoras de energía
Reacción productora de energía
Género
4H2+CO2 CH4+2H4O Methanopyrus, Methanothermus,
Methanococcus
H2+S0 H2S Pyrodictium, Thermoproteus,
Pyrobaculum, Acidianus, Stygiolobus
4H2+H2SO4 H2S+4H2O Archaeoglobus
3H2+H2SO3 H2S+3H2O Archaeoglobus
5H2+S2O32- 2H2S+3H2O Pyrolobus, Archaeoglobus, Ferroglobus
H2+HNO3 HNO3+ 4H2O Pyrobaculum, Aquifex, Pyrolobus
H2+H++NO3-- NH4++OH--+2H2O Pyrolobus
H2+1/2O2 H2O Pyrolobus, Pyrobaculum, Aquifex,
Sulfolobus, Acidianus, Metallosphaera
S0+3O2+2H2O H2SO4 Aquifex, Sulfolobus
2FeS2+7O2+2H2O 2FeSO4+2H2SO4 Acidianus, Metallosphaera
NO 3 −+2 FeCO3+5H 2O NO2−+2
Fe(OH)3+2 HCO3−+2H
Ferroglobus
Modificado de: Huber & Stetter, 1998
14
7.3.Enzimas termoestables
La composición genética de microrganismos que proliferan a altas temperaturas
muestra que sus enzimas generalmente tienen actividad a estas mismas temperaturas.
Estas enzimas son de gran valor a nivel industrial en especial aquellas que son capaces de
degradar polímeros como xilanasas, proteasas, esterasas, lipasas, catalasas,
galactosidasas, también enzimas que son fundamentales en la replicación del DNA como
la DNA polimerasa (Navas, 2010).
Todos los microrganismos que habitan en los ambientes extremos cuyas
condiciones de desarrollo se encuentran en un rango mayor a los 70° C, desarrollan
biomoléculas dentro de las cuales se encuentran los biocatalizadores o enzimas necesarias
para su desarrollo metabólico, algunas de estas enzimas son activas por encima de los
100°C, por lo que al aumentar la temperatura también aumenta la velocidad de reacción
de las mismas, de esta manera al aumentar 10°C la temperatura, la velocidad de reacción
más o menos se duplica, disminuyendo en consecuencia la cantidad de enzima necesaria
(Suárez et al 2002).
7.3.1. Clasificación de las enzimas termofílicas
Las enzimas que provienen de organismos termofílicos se clasifican en 3 clases
(Díaz & Poutou, 1998, citado por Rubiano, 2006)
7.3.1.1. Clase I
Enzimas que son estables a temperatura de síntesis de 55°C a 65°C, pero son
inactivas a temperaturas superiores (Díaz & Poutou, 1998, citado por Rubiano, 2006).
7.3.1.2. Clase II
Enzimas que son inactivas a la temperatura de síntesis excepto cuando están en
presencia del sustrato (Díaz & Poutou, 1998, citado por Rubiano, 2006).
15
7.3.1.3. Clase III
Enzimas que son altamente resistentes al calor y estables a temperaturas
superiores a la temperatura de síntesis (Díaz & Poutou, 1998, citado por Rubiano, 2006).
7.3.2. DNA polimerasa
Las DNA polimerasas son enzimas fundamentales en procesos de replicación de
información celular presente en toda forma de vida, realizan la síntesis de una porción o
una nueva cadena de DNA según sea el caso, esta síntesis se realiza en la dirección 5’ a
3’ partiendo de una hebra o fragmento de ARN que funciona como molde. Muchos genes
de DNA polimerasa (tabla 3) se han clonado de organismos termófilos pertenecientes a
los dominios Archea y Bacteria (Chien et al 1976; Suárez et al 2002).
Tabla 3. DNA polimerasas termoestables, aplicación y organismo de origen
Organismo Polimerasa PCR
Thermus aquaticus
Thermus Thermophilus
Thermus filiformis
Thermus flavus
Thermus caldophilus GK24
Bacillus stearothermophilus
Thermotoga marítima
Pyrococcus woesei
Pyrococcus furiosus
Pyrococcus sp. GB-D
Pyrococcus KODI
Thermococcus litoralis
Hermococcus sp. 9°N-7
Bacterias Taq pol I
Tth pol
Tfi pol
Tfi pol
Tca pol
BstL pol
Tma pol
Archea Pwo pol
Pfu pol
Deep Vent pol
KODI pol
Vent pol
9°N-7pol
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Modificado de: Suárez et al 2002.
7.4.Secuenciación del organismo
Afirmar que existe un genoma único dentro de una misma clase de individuos no
es posible, ya que cada individuo tiene sus propias particularidades y cambios a lo que se
16
podría considerar como una secuencia “consenso”. En lo que parece ser, los organismos
de una misma especie comparten más de un 99,9 % de su genoma, pero existe un pequeño
porcentaje de diferencia que indica que presentan una cantidad considerable de posiciones
no coincidentes respecto a cualquier otro individuo de la misma especie. Estas variantes
son las que promueven el estudio del genoma de cada individuo. La forma en que dichas
variantes afectan el desarrollo metabólico se puede traducir en la inducción de
modificaciones en proteínas efectoras, cambiar la expresión de ciertos genes y/o afectar
a otros mecanismos aún desconocidos. (Ruiz, 2013).
7.4.1. El 16S rARN
Se halla codificado por el gen rrs, el 16S rARN es un polirribonucleótido de
aproximadamente 1.500 pb, que se caracteriza por la existencia de segmentos de doble
cadena, alternando con regiones de cadena sencilla, hace parte de las subunidad pequeña
de los ribosomas, presentan una alto grado de conservación, presentando regiones
comunes a todos los organismos con variaciones que se presentan en zonas específicas.
Características relevantes del 16S rARN son: su presencia en todas las bacterias, su
estructura y función han permanecido constantes en un largo periodo de tiempo, su
tamaño es relativamente pequeño lo que reduce las incertidumbres en estudios
bioestadísticas y/o bioinformáticos, su estructura secundaria permite alineamientos de
mayor precisión y la constante actualización de las bases de datos que reportan este tipo
secuencias resulta cada día más amplia (Rodicio y Mendoza, 2004).
Análisis pasados de secuencias de ARNr 16S, permitieron el reconocimiento de
una o más secuencias características que se denominaron oligonucleótidos firma, que se
establecen como secuencias específicas cortas que aparecen en todos o en la mayor parte
de los miembros de un determinado grupo filogenético, y nunca o raramente se
encuentran presentes en otros grupos, ni siquiera en los más cercanos, por consiguiente
los oligonucleótidos firma se pueden emplear en la ubicación de bacterias bajo un
determinado grupo. La variabilidad en cuanto al número de copias del operón ribosómico
por genoma bacteriano puede presentar un rango de 1 a 15, siendo parcialmente constante
a niveles de especie, género e incluso familia. (Rodicio y Mendoza, 2004).
7.4.2. Identificación bacteriana a partir del 16S rARN
Desde los años 70 el estudio de la macromolécula de ARN ribosómico 16S ARNr
es frecuentemente empleada para la realización de estudios que permitan establecer
relaciones filogénicas y taxonómicas para microrganismos bacterianos. La utilización de
17
la técnica de identificación mediante el rARN 16S como cronometro molecular propuesta
por el investigador Carl Woese en permitió una nueva forma de clasificación taxonómica
de los procariotas en los dominios de Bacteria y Archea como los conocemos actualmente
y en general de todos los organismos vivientes reportados hasta la fecha, esta herramienta
ha permitido la identificación de bacterias donde su identificación resulta difícil,
demorada o imposible con la utilización de otro tipo de técnicas debido a sus
características. Sin embargo, la comparación de genomas completos, y no la comparación
de los 16S DNAr, es la que realmente contribuye a una predicción más exacta de las
relaciones evolutivas, pero en ausencia de la secuencia competa se puede definir
taxonómicamente como “el conjunto de cepas que comparten el 70% de similitud en
experimentos de reasociación DNA-DNA”, esto demostró que las cepas que compartían
este nivel de similitud en sus secuencias totales, presentan un nivel de similitud del 97%
en sus secuencias de ARNr 16S, como complemento se emplean comparaciones
fenotípicas para que la identificación bacteriana sea una identificación polifásica (Rodicio
y Mendoza, 2004).
18
8. OBJETIVOS
8.1.Objetivo general
Identificar la secuencia de la enzima termoestable DNA polimerasa a partir de una
cepa endémica de arqueo bacteria extraída de la fuente termo mineral de Santa
Mónica, municipio de Choachi, Cundinamarca.
8.2.Objetivos específicos
Definir protocolos de cultivo, aislamiento y posterior almacenamiento la cepa
seleccionada dentro del cepario de la Universidad Distrital FJDC.
Extraer DNA total de la cepa seleccionada.
Amplificar las secuencias que codifican para los genes 16s y DNA polimerasa por
PCR convencional.
19
9. MATERIALES Y MÉTODO
9.1.Diseño de la investigación
Las muestras con las cuales se realizó este estudio proceden de la zona ubicada en
la vertiente oriental de la Cordillera Oriental en la región geográfica del altiplano
Cundiboyacense, a 1.923 metros sobre el nivel del mar, con una temperatura promedio
de 18ºC, de coordenadas geográficas 4°32'52.2"N 73°55'01.1"W, en el departamento
Cundinamarca, municipio de Choachi, Vereda Resguardo, a 2,5 km del casco urbano
donde se encuentra la fuente manantial termo mineral MTM “Santa Mónica”, con aguas
de tipo telúrico, no magmáticas, lo que significa que no vienen de ningún volcán, sino
que han adquirido su temperatura a través del traspaso por las capas tectónicas de la tierra.
Partiendo de dichas muestras, se busca indagar a individuos termófilos cuyo hábitat tenga
el rango > de los 60° C, de los cuales se aislara un individuo muestra problema.
En este trabajo las muestras de bacterias termófilas serán aisladas de la fuente
termo mineral de Santa Mónica, las bacterias se replicaron en frascos estériles y también
se realizaron cultivos en placas de Petri para asegurar más probabilidades y posterior
replicación, se evaluará el pH de la fuente termal usando papel de pH marca Macherey-
Nagel y la temperatura de la fuente usando un termómetro de mercurio tipo sama de
referencia 6333n.
Foto 1: ubicación de la fuente termo mineral “Santa Mónica” Choachi-Cundinamarca
tomada de Google maps.
20
9.1.1. Población de estudio y muestra
Las bacterias que fueron aisladas, fueron las que presentaron un hábitat que entre
los 60 a 70 ° C, ya que esto puede asegurar una mayor estabilidad de la enzima a las altas
temperaturas de los ciclos de la PCR, además de restringir el crecimiento de colonias
mesófilas que puedan contaminar el cultivo. Las muestras estudiadas corresponden al
MTM de una zona volcánica de la región Andina, del departamento de Cundinamarca
zona del “altiplano Cundiboyacense” de Colombia, de las cuales se estudiarán 3 muestras.
9.1.2. Delimitación
El presente estudio se realizó durante los años 2016-2017, en los cuales se
estandarizo un protocolo de cultivo y aislamiento para termófilos en cámaras de
anaerobiosis y/o incubadora de CO2, se seleccionó una de las colonias que alcanzó los
60º C de temperatura. Posterior a ello, se caracterizó filogenéticamente una muestra a
partir de la secuenciación del genoma, encaminada además, a determinar la región de
DNA que presenta un gen que codifique para la enzima DNA polimerasa termoestable
que pueda ser empleada en procesos de PCR.
Este trabajo se realizó en los laboratorios del grupo de investigación de Biología
Molecular de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas en la sede de la Macarena
B.
9.2.Muestreo
Las muestras del MTM Santa Mónica se tomaron usando 3 recipientes para
conservar líquidos calientes esterilizados previamente, 2 con capacidad de 2 litros, uno
con capacidad para 1 litro y uno no convencional de 300 ml, marcados respectiva mente
TA, TP, TB.
21
Foto 2: muestreo manantial fuente termo mineral “Santa Mónica” Choachi-
Cundinamarca.
Foto 3: muestreo del manantial fuente termo mineral “Santa Mónica” Choachi-
Cundinamarca.
22
9.3.Inoculación
Al llegar las muestras al laboratorio, se replicaron invitro en cámara de
anaerobiosis, usando medio básico (la misma agua de la fuente), suplementado con las
soluciones stock I y II (tabla 5 y 6) y extracto de levadura (tabla 4), en 4 tubos para cultivo
líquido marcados MT1 x2, MT1 x2. El pH a utilizado fue de 7 ± 0,2, el medio anaerobio
al interior de la cámara de anaerobiosis se garantizó con el uso de AnaeroGen
COMPACT, un sistema anaerobio en bolsita marca OXOID y un sistema para
intercambio de atmosfera interna realizado por 2 agujas de jeringas de 5 ml ubicadas en
el tapón de caucho en la tapa. Los medios de cultivo se inocularon a 60 °C de temperatura,
de los cuales se obtuvieron replicas biológicas pasados 7 días. Se almacenaron copias de
1 ml de muestra de cada tubo de cultivo con 1 ml de glicerol en tubos eppendorfs, de 2
ml a -4 °C.
Foto 4: inoculo inicial
Tabla 4. Composición total del medio de cultivo
Sustancia g/L
Medio Básico 1000 ml
Solución stock I 1 ml
Solución stock II 1 ml
Extracto de levadura 0.05 g
23
Foto 5: cámara de anaerobiosis con inoculo inicial (tubos) y medios de
enriquecimiento para las colonias seleccionadas Ind 1 e Ind 2(placas de Petri)
Foto 6: cámara de anaerobiosis en incubación en horno a 59°C.
24
9.4.Selección y aislamiento
Una nueva inoculación se realizó después de 7 horas y 7 días de crecimiento en
medio liquido (Montes M., 2005), seguido a ello se procedió a generar un banco de
diluciones del tubo que presento mayor turbidez con la finalidad de conseguir cepas puras,
del cual se sembraron 100 μl en tubos con 2 ml de medio TSA suplementado con las
soluciones stock I, II y extracto de levadura. De las colonias presentes en las diluciones
10-3 y 10-4 pasados 7 días, se seleccionaron 2 colonias que resultaron de la inoculación, se
enumeraron y se aislaron en colonias individuales en cajas de Petri con medio TSA
suplementado de igual manera. Se seleccionó una cepa para las posteriores pruebas y
análisis; esta y las demás cepas fueron almacenadas en tubos eppendorfs de 2ml con 1 ml
de glicerol en nevera a -4°C.
Tabla 5. Solución stock I (solución acida)
COMPUESTO CONCENTRACION CANTIDAD/L
HCl 50 mM 1.8 g
H3BO3 1 mM 61.8 mg
MnCl2*4H2O 0.5 mM 96.76 mg
FeCl2*4H2O 7.5 mM 1.479 g
CoCl2*6H2O 0.5 mM 118,2 mg
NiCl2*6H2O 1 mM 23.57 mg
ZnCl2 0.5 mM 67.7 mg
Modificado de Rubiano 2006
Tabla 6. Solución stock II (solución alcalina)
COMPUESTO CONCENTRACION CANTIDAD/L
NaOH 10 mM 400 mg
Se 0.1 mM 11.58 mg
NaWO4*2H2O 0.1 mM 33 mg
NaMoO4*2H2O 0.1 mM 24.53 mg
Modificado de Rubiano 2006
25
Foto 7: cultivo de disolución seriada10-4.
9.5.Cuantificación de la muestra aislada
La valoración turbidimétrica del crecimiento microbiano en un medio de cultivo
se basa en que un cultivo bacteriano actúa como una suspensión coloidal, bloqueando y
reflejando la luz que pasa a través de él. Por tanto, al aplicar la turbidimétrica, es decir, la
medida del porcentaje de absorción de luz, a una suspensión bacteriana, se puede estimar
el número de células presentes. La turbidez se suele expresar como densidad óptica (D.
O.), la cual es directamente proporcional a la concentración de células (Universidad de
Murcia, 2010).
D. O. = log 100 - log de la lectura en el espectrofotómetro.
La cuantificación de microorganismos se realizó mediante la técnica de
turbimetrica, midiendo su absorbancia y transmitancia en un equipo de foto
espectrometría, ajustando la longitud de onda a 250nm, calibrando el instrumento a 0%
de transmitancia, colocando una celda con medio de cultivo sin inocular y posteriormente
se calibrando el instrumento a 100% de transmitancia, procediendo a medir las muestras
(Aquiahuatl & Pérez, 2004).
26
Como complemento se realizó la técnica de dilución seriada y siembra en placas
de Petri, las diluciones se realizaron en condiciones estériles hasta 10-5, se tomaron 0.1
ml de la disolución y se inocularon en cajas de Petri distribuyendo cuidadosamente el
inoculo en toda la placa con la ayuda de un triángulo de siembra dejando que el medio
absorba el líquido durante 10 min. Se incubaron de forma invertida a 50 °C en incubadora
de CO2 de 24 a 48 horas, donde se contaron las colonias de las placas, seleccionando las
placas que presentaron un número de colonias entre 30 y 300. Se calculó el número de
colonias por dilución, número que se multiplico por el inverso de la dilución X10, para
obtener el número total de unidades formadoras de colonias (UFC)/mL en la muestra
original (Universidad de Murcia, 2010).
(N° de colonias) x (inverso del factor de dilución) = N° (UFC)/ml
Foto 8: disolución seriada y placas 10-4, 10-5, 10-6.
9.6.Caracterizaron fenotípica
Se caracterizaron las cepas, evaluando morfología (color y forma de la colonia),
coloración de Gram, actividad catalasa, movilidad, condición de anaerobiosis.
27
Foto 9: siembra en placa Petri de las colonias seleccionadas.
9.6.1. Caracterización morfológica
La morfología fue descrita usando un microscopio óptico marca LEICA DM500
equipado con cámara digital de referencia LEICA ICC50 HD. Determinando forma y
tamaño de la célula, estructuras visibles y aislamiento (Tabla 7).
Tabla 7.
Tinción Uniforme, regular, irregular, unipolar, bipolar, etc.
Forma Cocos, bacilos, cocobacilos, etc.
Diferencial de Gram Positivo o negativo
Tamaño Cortos, largos
Disposición Parejas, cadenas, tétradas, racimos, etc.
Formas irregulares Variación en forma y tamaño, ramificados, fusiformes,
etc.
Modificado de Núñez, 1996, citado por Naranjo C.
28
Foto 10: colonias seleccionadas.
9.6.2. Coloración de Gram
La coloración de Gram se realizó según la técnica de Gram con la metodología de
Hucker (Doetsch 1981, Rubio 2015). Se emplearon cultivos bacterianos crecidos en
medio agua termal suplementada con soluciones stock I, II, extracto de levadura y medio
TSA sólido suplementado con soluciones stock I, II y extracto de levadura, la tinción se
realizó luego de 24 horas de incubación a 50 - 57ºC.
9.6.3. Actividad Catalasa
La catalasa es una enzima que descompone el agua oxigenada en agua y oxígeno
molecular que se libera en forma de burbujas, presente en la mayoría de los
microorganismos que poseen citocromos. Las bacterias lo usan como sistema de defensa,
debido a que la enzima catalasa degrada el peróxido de hidrógeno que se produce como
consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es tóxica. La prueba se
realizó al colocar una cantidad de colonia en un porta objetos, posteriormente se añadió
una gota de agua de peróxido de hidrogeno H2O2 sobre la muestra, la reacción será
positiva si se observa la formación de burbujas en la mezcla (Naranjo, 2015).
29
Foto 11: prueba actividad catalasa.
9.6.4. Agar Citrato de Simmons
Esta prueba permite diferenciar un grupo de bacterias que son capaces de crecer
con citrato como única fuente de carbono y sales amónicas inorgánicas como única fuente
de nitrógeno, provocando la alcalinización del medio. Se determinó si los
microorganismos son capaces de emplear el citrato como única fuente de carbono y
compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su desarrollo metabólico,
induciendo una alcalinización del medio. El microorganismo se cultivó en el agar citrato
de Simmons, colocando el agar en forma inclinada. El resultado de esta prueba será
positivo si el color del medio cambia de verde a azul. (Fernández et. al 2010)
30
Foto 12: medios pruebas bioquímicas agar TSI y Citrato Simmons.
9.6.5. Agar Hierro-Triple Azúcar (Agar TSI)
Se emplea para detectar la fermentación de lactosa, sacarosa y/o glucosa, con
formación de ácido y gas, y también para detectar producción de ácido sulfhídrico.
La evaluación de la prueba se realizó bajo las siguientes con indicaciones:
Taco ácido (amarillo): Glucosa fermentada.
Bisel ácido (amarillo): Lactosa y/o sacarosa fermentada.
Taco ácido (amarillo): Glucosa fermentada.
Bisel alcalino (rojo): Lactosa y/o sacarosa no fermentada.
Taco alcalino (rojo) y bisel alcalino (rojo): Ninguno de los tres glúcidos es fermentado
La aparición de burbujas en el taco indica que la fermentación se ha efectuado con
producción de gas.
Un ennegrecimiento en el medio indica la producción de ácido sulfhídrico.
31
Foto 13: resultados posibles de la prueba bioquímica Agar TSI, modificado de
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/tsi.pdf.
A Glucosa, lactosa y/o sacarosa fermentada
B Glucosa fermentada con producción de ácido sulfhídrico y gas
C Glucosa fermentada con producción de ácido sulfhídrico
D Ninguno de los tres azúcares es fermentado
9.6.6. Movilidad
La movilidad se determinó a partir de la siembra de la muestra en tubos con 5 ml
de medio de cultivo suplementado con las soluciones stock I y II, se inoculará haciendo
uso de un asa de siembra mediante la técnica de picadura, donde se inoculó hasta 1 cm
por arriba del medio de cultivo durante 48 horas (Fernández et. al 2010). La movilidad
será positiva si el crecimiento del individuo va más allá de la zona de inoculación, en caso
de solo reportar crecimiento en la picadura de siembra la movilidad será negativa.
9.6.7. Condición de anaerobiosis facultativa
Para determinar la anaerobiosis de las cepas, se inocularon en medio TSA sólido
suplementado con soluciones stock I, II y extracto de levadura, las cajas de Petri fueron
incubadas a 49°C en incubadora de CO2 con un volumen de inyección de CO2 al 2%, la
prueba será positiva si se registra crecimiento en las placas de Petri.
32
9.7.Extracción de DNA genómico
El proceso de extracción de DNA se realizó posterior al cultivo de la cepa pura y
seleccionada durante el proceso de aislamiento en frascos de penicilina 50 ml de medio
básico suplementado con soluciones stock I, II y extracto de levadura, posteriormente se
centrifugó el cultivo a 120000 rpm durante 5 min para agrupar la biomasa.
Las extracciones de DNA se realizaron con el kit de extracción facilitado por el
Grupo de Biología Molecular a dicho kit.
9.7.1. Cuantificación de DNA
Estas extracciones fueron cuantificadas a partir del uso de la maquinaria
NanoDrop 2000, en laboratorio de PCR.
9.7.2. Digestión enzimática
La digestión enzimática se realizó en 5 muestras de aproximadamente 10 ng/ul
de DNA genómico, utilizando la enzima de restricción Hind III (New England Biolabs)
de acuerdo al protocolo de la enzima.
9.7.3. Construcción de librerías genómicas
Para la digestión y la generación de las librerías se utilizaron 96 barcodes únicos
para la secuenciación con la plataforma NGS Illumina/HiSeq
9.7.4. Pre tratamiento de librerías genómicas
Previo al tratamiento bioinformático, es necesario realizar un pretratamiento para
eliminar regiones que contengan bases con baja o mala calidad, bases altamente repetidas
(elementos transponibles) y/o adaptadores propios de la secuenciación, ya que estas
interfieren con el ensamblaje y/o mapeo.
33
9.7.5. Eliminación de adaptadores
Se utilizó el software Trimmomatic para cortar entre 4 a 8 bases de adaptador
(específico para cada librería) indicando que el barcode está ubicado en el extremo 5’ de
cada lectura de los fragmentos secuenciados.
9.8.Ensamble de Novo
Para el ensamblaje se realizó una prueba con diferentes valores de kmer ,Previo
al se tomó un subgrupo de 5 librerías con cuatro valores de kmer diferentes para el
software SOAPdenovo2 (Luo et al. 2012): k=33, k=41, k=45, k=55 y cuatro valores kmer,
k=33, k=41, k=45, k=5 para el software ABySS (Simpson et al. 2009).
Se descargaron 2 librerías SRA (Sequence Read Archive, archivo de lectura de
secuencias) de un genotipo de E.coli disponibles en la base de datos SRX079805 y
SRR292770 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/ ) para incrementar la información, de esta
manera, realizar una referencia más robusta. Estas librerías genómicas de tipo paired-
end secuenciadas por la tecnología Illumina (Illumina Genome Analyzer II), con lecturas
de 300 pb, fueron procesadas 5 por el mismo pretratamiento utilizado anteriormente, con
los mismos parámetros para ambos software, antes de ser ensambladas por SOAPdenovo2
y ABySS.
9.8.1. Programa para el ensamblaje en SOAP
La programación que se utilizó para el ensamble de Novo en el software
SOAPdenovo2 fue:
~/bacex_soap$ pwd
/home/ngs_user/bacex_soap
~/bacex_soap$ tar -xvzf bacex_reads.tar.gz
~/bacex_soap$ ls
bacex_reads_pe1.fastq.gz mito_reads_pe2.fastq.gz bacex
_reads.tar.gz
#maximal read length
34
max_rd_len=101
[LIB]
#average insert size
avg_ins=450
#if sequence needs to be reversed
reverse_seq=0
#in which part(s) the reads are used
asm_flags=3
#use only first 100 bps of each read
rd_len_cutoff=100
#in which order the reads are used while scaffolding
rank=1
# cutoff of pair number for a reliable connection (at least
3 for short insert size)
pair_num_cutoff=3
#minimum aligned length to contigs for a reliable read
location (at least 32 for short insert size)
map_len=32
#a pair of fastq file, read 1 file should always be
followed by read 2 file
q1=/home/ngs_user/bacex_soap/bacex_reads_pe1.fastq
q2=/home/ngs_user/bacex_soap/bacex_reads_pe2.fastq
9.8.2. Scaffolding
El scaffolding se realizó con el software Sspace utilizando el input scafSeq
obtenido a partir del ensamble realizado por SOAPdenovo2 y ABySS.
9.9.Mapeo contra la nueva referencia
Para realizar el mapeo de cada librería con la nueva referencia de E. coli
ensamblada previamente mediante SOAPdenovo2, se utilizó Bowtie2, utilizando un phred
score de 33 para el mapeo. Los datos del mapeo se observan utilizando Qualimap, pero
previamente las librerías mapeadas deben ser transformadas a formato sorted.bam.
35
10. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
10.1. Estrategia de cultivo y aislamiento
Las muestras fueron tomadas de la fuente del manantial termomineral de la fuente
manantial termo mineral MTM “Santa Mónica” de temperatura de 80°C y con un pH 7
(foto 14). En la observación microscópica de micropreparados en fresco posterior a la
llegada de las muestras al laboratorio, se encontraron múltiples microorganismos
unicelulares que permitieron evaluar la viabilidad de las muestras colectadas, verificación
que sirvió para dar inicio a los procesos de inoculación y aislamiento.
Foto 14: pH de la fuente termomineral Santa Mónica.
Para el aislamiento de microorganismos termófilos anaerobios facultativos se
evaluaron 2 estrategias de cultivo, la primera con el objetivo de emular las condiciones
del hábitat natural siendo de tipo oligotrófico como un método efectivo para el
aislamiento de microorganismos de ambientes acuáticos, debido a que estos
microorganismos se caracterizan por subsistir en condiciones restringidas de nutrientes
(Fry J. 2004). Después de 7 días se reportó un notable crecimiento microbiano
evidenciado por la turbidez del medio de cultivo (foto 15), se almacenaron copias de 1 ml
de muestra de cada tubo de cultivo con 1 ml de glicerol en tubos eppendorfs, de 2 ml a -
4 °C.
36
Fotos 15: medios turbios positivos para crecimiento microbiano.
Fotos 16: selección de colonias del tubo con la dilución 10-4.
Una nueva inoculación se realizó después de 7 días de crecimiento en medio
liquido (Montes M., 2005), realizando un banco de diluciones del tubo MT 1.1(foto 8), el
cual presento una mayor turbidez, del cual se sembraron 100 μl de su disolución seriada
10-4 en 2 tubos estériles (foto 17), haciendo uso de la técnica de tubo rodado de Hungate
modificado con un leve factor de inclinación de 30°, con un contenido de 2 mL de medio
TSA suplementado con las soluciones stock I, II y extracto de levadura, segunda estrategia
de cultivo y método de enriquecimiento para su optimo crecimiento según lo reportado
por Rubiano en 2006. Se seleccionó el medio de cultivo TSA debido a su aporte
nutricional rico en péptidos, aminoácidos libres, bases púricas y pirimídicas, minerales y
37
vitaminas, método de enriquecimiento. Las nuevas inoculaciones se incubaron en cámara
de anaerobiosis con temperaturas entre los 50°C y 60°C (foto 6), rango de temperaturas
que registraron un crecimiento positivo. Pasadas 12 horas de cultivo mediante la técnica
diferencial de Gram, se evidenció al microscopio una gran variedad de microorganismos
tanto Gram positivos como Gram negativos entre bacilos, estreptococos y cocos
registrados en fotos de los micropreparados (foto 18). Es Probable que los
microorganismos presentes hicieran uso del extracto de levadura manifestando ser
posiblemente sacaroliticos (Rubiano, C. 2006), de igual manera se puede decir que las
soluciones stock estimularon el crecimiento de microorganismos por su contenido de
trazas de cobalto, níquel, zinc, selenio, molibdeno, hierro y magnesio necesarios para el
desarrollo. El crecimiento a temperaturas entre los 50°C y los 60°C represento un factor
importante en la estrategia de aislamiento, suprimiendo la contaminación de los medios
de cultivo con microorganismos mesófilos, facilitando el procedimiento de aislamiento
efectivo de las cepas.
Foto 17: crecimiento positivo para disolución seriada 10-4.
38
Foto 18: diferencial de Gram para disolución 10-4, en 100x de aumento.
Se seleccionaron 2 de las colonias presentes en el tubo 10-4 (foto 16) marcadas
como Ind 1 e Ind 2 (foto 10), para su aislamiento efectivo en placas de Petri con medio
TSA, suplementado con las soluciones stock I, II y extracto de levadura, incubadas en
cámara de anaerobiosis a temperatura entre los 50°C y 60°C (foto 5). Para garantizar la
pureza de las cepas a secuenciar, se realizaron replicaciones (fotos 19 y 20) hasta obtener
microorganismos puros, los cuales se verificaron bajo la técnica de diferencial de Gram
(fotos 24 y 25).
39
Foto 19: crecimiento positivo para cepa aislada Ind 1.
Foto 20: crecimiento positivo para cepa aislada Ind 2.
10.2. Cuantificación de la muestra aislada
Los resultados de las cuantificaciones mediantes las tecinas turbidimétrica y
cuenta viable en placa, los cuales son métodos indirectos para cuantificar el número de
microorganismos presentes en el medio de cultivo variaron significativamente mostrando
diferencias entre las dos cepas aisladas debido a que los resultados de los recuentos no
fueron similares, teniendo en cuenta que ambas cepas fueron inoculadas bajo los mismas
condiciones de medios de cultivo, temperatura horas de inoculación y métodos de
evaluación.
Después de medir el blanco que es representado por medio sin inocular y las 2
cepas aisladas el equipo de foto espectrometría arrojo los siguientes resultados:
Absorbancia = Ind 1 = 0,075 / Ind 2 = 0, 182
Transmitancia = T = Ind 1 = 84,1 / Ind 2 = 65,7
40
Los resultados del equipo de fotoespectometría donde se midieron la absorbancia
y la transmitancia fueron contrastados con la siguiente ecuación matemática
Absorbancia = D. O.
D. O. = log 100 - log de la lectura en el espectrofotómetro.
Cepa Ind 1 D. O. log 100 - log 84,1 = 0,075
Cepa Ind 2 D. O. log 100 - log 65,7 = 0,182
En el recuento en placa mediante diluciones seriadas y siembra en placas de Petri,
las diluciones seleccionadas para los recuentos fueron diferentes, para la cepa Ind 1 se
tomó para el recuento la placa la dilución 10-6 y para la cepa In 2 se seleccionó 10-5, placas
que se encontraban dentro del rango de 30 – 300 colonias. Para la cepa Ind 1 el resultado
del cuenta colonias fue de 52 colonias, a diferencia de la cepa Ind 2 para la cual el conteo
del cuenta colonias fue de 205 colonias, a partir de estos resultados se realizó el cálculo
para obtener el número total de unidades formadoras de colonias (UFC)/ml en la muestra
original.
(N° de colonias) x (inverso del factor de dilución) = N° (UFC)/ml
Ind 1: 52 x 106 = 5,2 x 107 (UFC)/ml
Ind 2: 205 x 105 = 2,05 x 107 (UFC)/ml
Foto 21: Conteo de colonias Ind 2.
41
Foto 22: conteo de colonias Ind 1.
10.3. Caracterizaron morfológica
La descripción morfológica de las cepas aisladas comprende la descripción
macroscópica de la colonia y la descripción microscópica de la célula, a nivel
macroscópico se evaluaron los siguientes características color, borde, textura, elevación
y grado de transparencia, a nivel microscópico en la descripción de la célula se tomaron
en cuenta las siguientes características, la forma, el tamaño de las células, el diferencial
de Gram, el grado de tinción, disposición y movilidad, datos que se recopilan en las tablas
11 y 12.
Macroscópicamente las características de las 2 cepas Ind1 e Ind2 son
estrechamente similares en todas sus características macroscópicas solo presentando
algunas diferencias en las características de la célula. Las colonias son de color blanco
inicial o exponencial (fotos 19 y 20) y crema en fase tardía (foto23), con bordes dentados,
de elevación plana en fase exponencial temprana y umbilicada en fase tardía, son de forma
irregular, con una textura lisa en fase exponencial temprana y plegada en fase tardía,
además de presentar una alta traslucidez. Las características microscópicas de las 2 cepas
solo difieren en el tamaño de la célula, las 2 cepas aisladas son de forma bacilar, se
disponen solos, en parejas y la cepa Ind 1 presenta una disposición en cadenas, ambas
cepas son Gram positivas y presentan una tinción uniforme y ninguna de las cepas
aisladas reporto movilidad; sin embargo presentan variaciones en su morfología lo cual
permite establecer diferencias entre ellas: la cepa Ind1 a diferencia de la cepa Ind 2 es de
mayor tamaño, el tamaño de las células de la cepa Ind1 alcanzaba en fase tardía
42
exponencial longitudes hasta de 3,33 µm de largo, a diferencia de la cepa Ind2 con
longitudes en fase tardía exponencial de 2,50 µm, catalogándose la cepa Ind 1 como
bacilo de tamaño largo y la cepa Ind 2 bacilo de corto tamaño. Los rangos de temperatura
donde se desarrollan las cepas aisladas varían entre los 30 °C y los 60 °C donde la
temperatura óptima de crecimiento para ambas cepas se encuentra en los 50 °C
Tabla 8. Morfología de la colonia
Organismo Ind 1 Ind 2
Color de la colonia Blanco/Crema Blanco/Crema
Borde Dentado Dentado
Textura Lisa/plegada en fase tardía Lisa/plegada en fase tardía
Elevación Plana Plana
Forma Irregular Irregular
Grado de transparencia Translucida Translucida
Tabla 9. Morfología de la célula
Organismo Ind 1 Ind 2
Forma Bacilos Bacilos
Tamaño Largos Cortos
Diferencial de Gram Positivos Positivos
Tinción Uniforme Uniforme
Disposición Solos, parejas y cadenas Solos y en parejas
Movilidad Negativa Negativa
10.4. Diferencial de Gram
La coloración de Gram realizada para las 2 cepas aisladas muestra que ambas
variedades son Gram positivas. Según Koneman y colaboradores en 2008 en Naranjo
2015, el material de la pared celular bacteriana que confiere la rigidez es el
peptidoglicano, a diferencia de algunas arqueobacterias que poseen una pared celular
formada por un compuesto similar al peptidoglicano de las bacterias denominado
pseudopeptidoglicano.
Continuando con Koneman y colaboradores en 2008 en Naranjo 2015,
generalmente, 80%-90% de la pared de la célula Gram positiva es peptidoglicano, la pared
de la célula bacteriana ayuda tanto en el tamaño y forma, así como para prevenir la lisis
osmótica. La pared de la célula Gram positiva es gruesa y consiste en varias capas
interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico, en el caso de las
arqueo-bacterias los enlaces glucosídicos son 1,3 en lugar de los 1,4 de los
peptidoglicano.
43
Foto 24: Diferencial de Gram y tamaño de la célula de la cepa Ind 1 en 100x de
aumento.
Foto 25: Diferencial de Gram y tamaño de la célula de la cepa Ind 2 en 100x de
aumento.
44
10.5. Anaerobiosis facultativa
En esta prueba las 2 cepas presentaron crecimiento en atmosfera anaerobia,
exhibiendo un crecimiento igual tanto en condiciones aerobias como anaerobias a la
misma velocidad de crecimiento exponencial que presentaron las 2 cepas en el medio
aerobio. Esta característica fenotípica se presenta en las dos cepas aisladas.
Debido a la baja solubilidad del oxígeno a altas temperaturas y a la presencia de
gases reducidos en ambientes hidrotermales como el manantial termomineral Santa
Mónica, es muy alta la posibilidad de encontrar microorganismos anaerobios estrictos, ya
que estas condiciones favorecen la proliferación de microorganismos que crecen en
ausencia de oxígeno. Sin embargo, en este tipo de ambientes extremos las superficies
expuestas al aire pueden tener cantidades razonables de oxígeno lo cual permite también
el crecimiento de microorganismos aerobios facultativos o microaerofílicos (Huber &
Stetter, 1998), de esta manera se presenta para las 2 cepas aisladas Ind 1 e Ind 2, las cuales
se desarrollaron en ambas condiciones tanto de aerobiosis como de anaerobiosis en igual
proporción
Para las 2 cepas el crecimiento después de 24 horas reportaba una fase exponencial
bastante alta, una característica importante que se reportó durante el desarrollo de este
trabajo fue el poco tiempo requerido por ambas cepas en la formación de colonias
prominentes en tiempos menores a 4 horas después de su inoculación tanto en medios
líquidos como en medios solidos ya fuese en tubos o placas de Petri, además de
presentarse esta misma condición en medios aerobios como anaerobios, con colonias bien
desarrolladas y en crecimiento (foto 33), alcanzando su fase exponencial tardía 7 días
después (foto 23).
Foto 23: Cultivo de las cepas Ind 1 e Ind 2 en incubadora de CO2
en fase tardía.
45
10.6. Actividad Catalasa
Las pruebas bioquímicas son un conjunto de reacciones mediante las cuales vamos
a poder determinar de una manera clara y precisa la presencia o ausencia de una enzima,
o la actividad de una vía metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio
de cultivo, partiendo de ello, la presencia de la enzima que descompone el peróxido de
hidrogeno H2O2 en agua y oxigeno molecular fue positiva para las cepas aisladas Ind 1 e
Ind 2, al presentar un fuerte desprendimiento de burbujas al agregar peróxido de
hidrogeno (H2O2) a una muestra de cada cepa sobre una lámina portaobjetos, por lo que
puede afirmarse que hay producción de oxigeno molecular y por esto se deduce la
presencia de la enzima catalasa en las 2 muestras evaluadas (Naranjo, 2015).
Foto 26: desprendimiento de O2 prueba actividad catalasa de la cepa Ind 1.
46
Foto 27: desprendimiento de O2 prueba actividad catalasa de la cepa Ind 2.
10.7. Agar Citrato de Simmons
Para esta prueba, se inoculó en el agar inclinado en una sola estría, Se utilizó un
cultivo de un medio sólido, se incubó a 55°C durante 24 y 48 horas. El ensayo es negativo
aun cuando se observó crecimiento a lo largo de la estría, el indicador nunca cambio verde
a azul. Según Fernández A. y colaboradores, sólo las bacterias capaces de metabolizar el
citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con el
metabolismo del citrato, generará una fuerte alcalinización del medio que será aparente
por un cambio de color del mismo de verde a azul.
No obstante la evaluación de la prueba fue negativa para las 2 cepas aisladas, es
de resaltar que el medio no cambio de color verde a azul sin embargo tanto la cepa Ind 1
como la cepa Ind 2 crecieron positivamente en el medio (fotos 28 y 29), contrario a lo
que se cita que “solo las bacterias que son capaces de metabolizar el citrato son capaces
47
de crecer en este medio”, el crecimiento fue abundante por la estría de siembra, además
de haber sido en un corto espacio de tiempo.
Foto 28: resultado de prueba Agar Citrato de Simmons de la cepa Ind 1.
Foto 29: resultado de prueba Agar Citrato de Simmons de la cepa Ind 2.
48
10.8. Agar Hierro-Triple Azúcar (Agar TSI)
Para esta prueba, se inoculó en el agar inclinado en una sola estría, Se utilizó un
cultivo de un medio sólido, se incubó a 55°C, este medio lleva incorporado lactosa,
sacarosa, glucosa y un indicador (rojo de fenol). Este medio es de tonalidad rosado,
Pasadas 48 horas de haber incubado, las 2 cepas metabolizaron los 3 azucares, como
resultado del metabolismo de estos azucares, se producen principalmente ácidos, que
resulta en la acidificación del medio, lo que hace que el indicador de pH pase de rojo a
amarillo, ausencia de producción de ácido sulfhídrico debido a que no se presentó un
precipitado de color negro en el tubo, la producción de gas también fue negativa, ninguno
de los medios fue desplazado dentro del tubo, los resultados que se observaron se
consignan en la tabla 13.
Tabla 10. Resultados Agar TSI
Organismo Ind 1 Ind 2
Fermentación de lactosa Positivo Positivo
Fermentación de sacarosa Positivo Positivo
Fermentación de glucosa Positivo Positivo
Producción de H2S Negativo Negativo
Producción de gas Negativo Negativo
Foto 30: resultado de prueba Agar TSI a la izquierda la cepa Ind 1, al centro el control
y a la derecha la cepa Ind 2.
49
10.9. Movilidad
En esta prueba después de la inoculación por punción y posterior incubación no
se registra movilidad para ninguna de las 2 cepas aisladas, el crecimiento solo se presentó
en a través de la picadura mas no se expandió radialmente en el medio de cultivo, aunque
se realizó la observación en los tiempos de 24 y 48 horas de incubación hasta los 7 días
posteriores el resultado fue negativo.
Aunque la experiencia se realizó 2 veces para obtener una confirmación tampoco
se obtuvo un resultado positivo en ambas cepas aisladas, por lo que podría decirse que
ambas cepas carecen de estructuras que les permitan el desplazamiento por el medio.
Foto 31: resultado de prueba movilidad de la cepa Ind 1.
50
Foto 32: resultado de prueba de movilidad de la cepa Ind 2.
.
Foto 33: Anaerobiosis facultativa en incubadora de CO2 al fondo de las cepas Ind 1 e Ind 2, después de 24 horas.
51
10.10. Extracción de DNA genómico
Para las extracciones de DNA primero se seleccionó la cepa Ind 1, se realizó un
nuevo cultivo con medio básico suplementado, se inculco durante 48 horas en cámara de
anaerobiosis con una temperatura de 50° C. Las extracciones se realizaron con el
siguiente protocolo:
Tomar 300 µl de muestra y colocarlos en un tubo Eppendorf.
Agregar 900 µl de lisis 1, mezclar por inversión 10 veces.
Centrifugar a 12000 rpm por 10 min.
Descartar el sobrenadante y limpiar el pellet.
Resuspender con 300 µl de lisis 2.
Agitar por vortex durante 2 min.
Agregar 300 µl de lisis 3.
Agitar por vortex durante 3 min.
Centrifugar a 12000 rpm por 10 min.
Recolectar el sobrenadante en un nuevo tubo Eppendorf.
Agregar 300 µl de isopropanol frio, mezclar por inversión 5 veces.
Centrifugar a 12000 rpm por 10 min.
Descartar el isopropanol, dejar secar durante 10 min.
Resuspender 300 µl de etanol frio.
Centrifugar a 12000 rpm durante 10 min.
Descartar el etanol, dejar secar durante 10 min.
Agregar 25 v de lisis 7.
Almacenar a -20 °C.
Después del uso de diversos protocolos de extracción y diferentes kits de
extracción tanto comerciales como caseros, de este protocolo se obtiene una cantidad
suficiente de DNA para realizar el proceso PCR.
10.11. Cuantificación de DNA en el equipo NanoDrop2000®.
La calidad de la muestra de DNA obtenida mediante la extracción de DNA total,
se evaluó tomando en cuenta los rangos 260/280 y 260/230 ratios. De la extracción se
obtuvo un volumen de 30 ng/μl de DNA concentrado (foto 33), con mediciones de 1.38
para el rango 260/280 y 0,85 para el rango 260/230, indicativo que la muestra está
contaminada con hidratos de carbono, péptidos u otras sustancias.
52
Foto 33: cuantificación de la extracción de DNA de la cepa Ind 1.
10.12. Tratamiento calidad de secuencias
Mínimo y máximo de secuencias antes del filtrado:
Min:
143.157
Max:
15.761.239
Número total de secuencias
1.115.163.456
Promedio de secuencias 1.672.246
53
10.13. Post-tratamiento limpieza y pre mapeo:
Min:
133,705
Max:
13.843.208
Número total de secuencias
1.036.297.707
Promedio de secuencias 1.672.246
Promedio largo secuencias 101 pb 88
10.14. Resultados ensamblaje
Software Parámetros K3 K41 K45 K50
Ensamble con SOAP denovo2
Contigs 2.000.400 2.137.924 2.109.396 2.254.664
N50 1.200 1.000 935 500
Saffolding con
Sspace
Scaffolds 412.444 300.599 182.170 159.440
N50 978 152 152 308
Resumen de datos del ensamble de Novo obtenidos con SOAPdenovo2.
Ensamble de Novo
con SOAPdenovo2
Contigs y singleton 1.044.170
Suma (pb) 1043.210.15222
Gaps (pb) 756.321
Contig más largo (pb) 45.278
Contig más pequeño (pb) 110
N50 916
Promedio de tamaño del contig (pb) 316
54
11. CONCLUSIONES
En este estudio se aislaron 2 cepas bacterianas, de las cuales 1 cepa fue
identificada molecularmente. Se encontró que la cepa “Ind 1” es una especie de Bacillus,
positiva y facultativamente aeróbica, Gram-positiva, presentando características de una
especie del género Anoxybacillus.
Se determinó que el medio de cultivo de la estrategia inicial, el cual contiene agua
de la fuente manantial termomineral, extracto de levadura (0.05 g/L), soluciones stock I
y II de oligoelementos (1 ml/L) es propicio para cultivo inicial de microorganismos
termófilos.
Se estableció que el medio de cultivo de la estrategia de enriquecimiento, el cual
contiene agar TSI, extracto de levadura (0.05 g/L), soluciones stock I y II de
oligoelementos (1 ml/L) es óptima para el aislamiento y mantenimiento de
microorganismos termófilos, bajo condiciones similares a las originales.
Los 2 clones aislados presentaron actividad sacarolitica, fermentación de
azucares, actividad catalasa positiva, proliferación a pesar de no usar el citrato como única
fuente de carbono y movilidad negativa.
De acuerdo a la caracterización genotípica de la cepa Ind 1, se ensambla el
primer borrador de la secuencia de la bacteria anoxybacillus flavitermus con un
porcentaje de ensamblaje aceptado del 65 %.
Para la extracción de la enzima termoestable DNA polimerasa con un alto grado
de calidad, es necesario realizar cultivos de estos microorganismos a temperaturas
superiores de los 80° C, para garantizar su actividad a temperaturas superiores a las de
síntesis catalogadas como termo enzimas de clase III.
55
12. RECOMENDACIONES
Probar el uso de purificantes, dado los resultados de las cuantificaciones, para
posteriores estudios con las muestras de extracción se recomienda usar el kit de
purificación Wizard genomic de la casa comercial Promega.
Para la clonación, expresión y purificación de una enzima termoestable de calidad, se
recomienda la incubación de estos microorganismos en equipos que puedan obtener
temperaturas constantes y alcanzar temperaturas superiores a los 80° C de temperatura
Generar mejores condiciones para próximas investigaciones, se recomienda la
implementación de más cámaras de anaerobiosis y otra incubadora de CO2, así como la
construcción de un bioreactor, que permitan una mayor producción de cultivos de los
clones aislados, para la obtención de proteína suficiente, garantizando así mayor material
de investigación, asimismo ensayos bajo atmosferas totalmente anaerobias que permitan
trabajar con una variedad más amplia de estos microrganismos.
Evaluar en futuros estudios las actividades enzimáticas de la cepa Ind 1 debido a la
potencial biotecnológico que tienen.
Profundizar en la optimización del protocolo de extracción de DNA, para obtener
una mayor cantidad de DNA con un alto grado de pureza.
56
13. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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