CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS
AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD ZACATENCO
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR
ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE METILTRANSFERASAS DE
HISTONAS Y COMPONENTES DE LOS COMPLEJOS BAF
(SWI/SNF) DURANTE LA DIFERENCIACIÓN DE LA LÍNEA
CELULAR DE EPITELIO CORNEAL RCE1(5T5)
T E S I S
Que presenta
IBT. María Jimena García Murillo
Para obtener el grado de:
MAESTRA EN CIENCIAS
EN LA ESPECIALIDAD DE BIOLOGÍA CELULAR
Director de la Tesis:
Dr. José Federico Bernardo Castro Muñoz-ledo
Ciudad de México JULIO, 2018
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
1
Agradecimientos
De alguna manera llegue aquí, gracias a todos los que me tuvieron paciencia y no perdieron la
esperanza en mí, en que era capaz de hacerlo. A mis amigos, mi pareja, familia, y seres queridos.
Agradezco especialmente al Dr. Federico que me ayudo a desarrollar este trabajo, a integrar y analizar
críticamente mis resultados. A Erika Sánchez Guzmán que me apoyó constantemente en la parte
experimental y técnica, en estar al pendiente de mí y de mi trabajo, junto con mis compañeros quienes
me ayudaron a discutir activamente mis resultados y así poder hilar mis ideas, en especial a Tere.
Finalmente, a mis asesores por dar una opinión crítica y constructiva del trabajo.
Este trabajo fue realizado en el departamento de Biología Celular del Centro de Investigación y de
Estudios Avanzados del IPN, bajo la dirección del Dr. José Federico Bernardo Castro Muñoz-Ledo, y fue
financiado en parte gracias al donativo 219601 y la beca de maestría CVU: 706026, otorgados por el
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT).
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
2
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
3
ÍNDICE
ABREVIATURAS ........................................................................................................................................ 5
ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................................................... 6
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................................................. 6
RESUMEN ................................................................................................................................................ 9
ABSTRACT .............................................................................................................................................. 10
1 INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 11
2 MARCO TEÓRICO ........................................................................................................................... 12
2.1 Estructura de la cromatina .................................................................................................... 12
2.2 Epigenética ............................................................................................................................ 13
2.2.1 Los complejos remodeladores de la cromatina ............................................................ 16
2.2.2 Las monometiltransferasas de histonas ........................................................................ 28
2.3 La vía de NOTCH .................................................................................................................... 33
3 ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN. ................................................................................................ 37
4 HIPÓTESIS ...................................................................................................................................... 41
5 OBJETIVOS ..................................................................................................................................... 43
5.1 Objetivo general .................................................................................................................... 43
5.2 Objetivos particulares ........................................................................................................... 43
6 MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................................................. 45
6.1 Materiales ............................................................................................................................. 45
6.2 Métodos ................................................................................................................................ 47
6.2.1 Cultivo Celular ............................................................................................................... 47
6.2.2 Tinción con Rodamina B ................................................................................................ 47
6.2.3 Extracción de RNA Total ................................................................................................ 48
6.2.4 RT-PCR Punto Final ........................................................................................................ 48
6.2.5 RT-PCR Cuantitativa (RT-qPCR) ..................................................................................... 49
6.2.6 Extracción de proteínas totales ..................................................................................... 52
6.2.7 Cuantificación de proteínas .......................................................................................... 52
6.2.8 Fraccionamiento celular ................................................................................................ 52
6.2.9 Coinmunoprecipitación ................................................................................................. 53
6.2.10 SDS-PAGE y Western blot .............................................................................................. 53
6.3 Análisis Estadístico ................................................................................................................ 54
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
4
7 RESULTADOS .................................................................................................................................. 55
7.1 Expresión de los componentes del complejo de remodelación de cromatina BAF(SWI/SNF)
durante la proliferación y diferenciación de las células RCE1(5T5). ................................................. 55
7.1.1 Expresión de metiltransferasas de histonas durante la proliferación y diferenciación de
las células RCE1(5T5). .................................................................................................................... 62
7.2 Cinéticas de expresión de proteínas de Pax6, BRM, Brg1 y Prdm16..................................... 65
7.3 Análisis de la composición de los complejos remodeladores de cromatina por
coinmunoprecipitación...................................................................................................................... 69
7.4 Efecto de la activación de la vía de NOTCH sobre la expresión de los complejos
remodeladores de cromatina BAF y PBAF, y de las metiltransferasas de histonas, PRDM3 y
PRDM16. ............................................................................................................................................ 71
7.4.1 Los ligandos y receptores de la vía de Notch, modulan la expresión de Prdm16 y no así
la expresión de BAF250a,b /Arid1a,b y BAF200/Arid2. ................................................................. 73
8 DISCUSIÓN ..................................................................................................................................... 79
9 PERSPECTIVAS ................................................................................................................................ 88
10 CONCLUSIONES .............................................................................................................................. 89
11 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................ 90
12 MATERIAL SUPLEMENTARIO ....................................................................................................... 102
12.1 Apéndice 1 ........................................................................................................................... 102
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5
ABREVIATURAS
µg Microgramo
µm micrómetro
3T3 Línea celular de fibroblastos de ratón
BSA Albumina de suero bovino
cDNA Ácido desoxirribonucleico complementario
DMEM Dulbecco-Vôgt's Modified Eagle Medium
DNA Ácido desoxirribonucleico
EGF Factor de Crecimiento Epidermal
EtBr Bromuro de Etidio
FBS Suero fetal de bovino
K3 Citoqueratina 3
K5 Citoqueratina 5
kDa Kilo Dalton
mg Miligramo
min Minutos
ml Mililitro
mM Milimolar
NICD Dominio Intracelular de Notch
p/v Relación peso sobre volumen
pb Pares de bases
PBS Buffer Salino de Fosfatos
PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa
RCE1 (5T5) Rabbit Corneal Epithelial 1, línea celular
RNA Ácido ribonucleico
RNAm Ácido ribonucleico mensajero
rpm Revoluciones por minuto
seg segundos
TA Temperatura ambiente
v/v Relación volumen sobre volumen
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6
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Conservación de los componentes de los complejos SWI/SNF y RSC durante la
evolución ...................................................................................................................... 20
Tabla 2 Subunidades de los complejos BAF/PBAF ................................................................... 22
Tabla 3 Anticuerpos y condiciones experimentales utilizadas (concentración) ...................... 45
Tabla 4 Proteínas recombinantes (ligandos solubles) de la vía de NOTCH utilizados .............. 47
Tabla 5 Secuencia y características de los oligos utilizados para RT-qPCR .............................. 49
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Principales estructuras en la compactación del DNA ............................................... 12
Figura 2 Modelo solenoide de la fibra de cromatina condensada de 30nm, en una vista
lateral ........................................................................................................................ 12
Figura 3 Vista global del núcleo celular .................................................................................. 14
Figura 4 Ejemplos clave de la contribución de la cromatina a la función del epigenoma. ..... 15
Figura 5 Diferentes acciones de la actividad de remodelación de la cromatina dependiente
de ATP sobre el DNA nucleosomal ............................................................................ 16
Figura 6 Clasificación de los complejos remodeladores de la cromatina ATP-dependientes 17
Figura 7 Evolución de los complejos SWI/SNF desde levadura hasta los complejos BAP de la
mosca y BAF de los vertebrados. .............................................................................. 19
Figura 8 Predicción de la arquitectura de dominios en los componentes de los complejos
humanos BAF y PBAF ................................................................................................ 24
Figura 9 El ensamble combinatorial de los complejos remodeladores de la cromatina BAF
(Brahma-associated factor) produce especificidad biológica ................................... 26
Figura 10 Estructura y relaciones de los dominios de la familia de proteínas Prdm ................ 29
Figura 11 Funciones biológicas y bioquímicas de Evi-1/Prdm3 ................................................ 32
Figura 12 Estructura de PRDM16 .............................................................................................. 33
Figura 13 Vía metabólica de NOTCH ......................................................................................... 35
Figura 14 Esquematización de las condiciones de amplificación utilizadas en los protocolos de
RT-qPCR ..................................................................................................................... 49
Figura 15 Productos de amplificación de RT-qPCR de los oligonucleótidos diseñados. ........... 51
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7
Figura 16 Expresión de RNAm de Brg1/SMARCA4 y PAX6 en la diferenciación del epitelio
corneal (RCE-5T5)....................................................................................................... 56
Figura 17 RNAm de Brm/SMARCA2 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-
5T5) ............................................................................................................................ 57
Figura 18 RNAm de BAF45a/PHF10 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-
5T5) ............................................................................................................................ 58
Figura 19 RNAm de Arid1a/BAF250a y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-
5T5). ........................................................................................................................... 59
Figura 20 RNAm de Arid1b/BAF250b y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-
5T5). ........................................................................................................................... 60
Figura 21 RNAm de Arid2/BAF200 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-
5T5). ........................................................................................................................... 61
Figura 22 RNAm de Prdm3/Evi1 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). .. 62
Figura 23 RNAm de Prdm16 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). ........ 63
Figura 24 RNAm de CTBP2 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5)............ 64
Figura 25 Proteínas totales: expresión de PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-
5T5) ............................................................................................................................ 65
Figura 26 Proteínas totales: expresión de Brg1 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal
(RCE-5T5) ................................................................................................................... 66
Figura 27 Proteínas totales: expresión de BRM y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal
(RCE-5T5) ................................................................................................................... 67
Figura 28 Proteínas totales: expresión de Prdm16 y PAX6 en la diferenciación del epitelio
corneal (RCE-5T5)....................................................................................................... 68
Figura 29 Coinmunoprecipitación de las subunidades núcleo de los complejos BAF/PBAF por
sus ATPasas ................................................................................................................ 70
Figura 30 Efecto de las proteínas recombinantes rhNotch-1 y rmJagged-2 sobre la
proliferación celular ................................................................................................... 72
Figura 31 Cambios en la expresión de RNAm de (a)Pax6 y (b)K3 promovidos por las formas
recombinantes solubles de Notch-1 y Jagged-1 ........................................................ 74
Figura 32 Cambios en la expresión de RNAm de Arid1a/BAF250a, Arid1b/BAF250b y
Arid2/BAF200 promovidos por las formas recombinantes solubles de Notch-1 y
Jagged-1. .................................................................................................................... 75
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
8
Figura 33. Cambios en la expresión de los RNAm de Prdm16 y marcadores de diferenciación
K3 y Pax6 promovidos por las formas recombinantes solubles de Notch-1 y Jagged-
1. ................................................................................................................................ 77
Figura 34 Perfil general de expresión de los mRNA que codifican para las subunidades de los
complejos remodeladores de cromatina BAF y PBAF. .............................................. 81
Figura 35 Configuraciones propuestas de los posibles complejos remodeladores BAF y PBAF
en las diferentes etapas de la diferenciación del epitelio córneal............................ 85
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
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RESUMEN
La remodelación de la estructura tridimensional de la cromatina y la modificación covalente de
las histonas son parte de los mecanismos epigéneticos que participan en la diferenciación celular. En
este trabajo iniciamos el estudio de los complejos remodeladores de la cromatina BAF/PBAF y de las
monometiltransferasas de histonas PRDM16 y PRDM3, utilizando como modelo a la línea de epitelio
corneal de conejo RCE1(5T5). Detectamos cambios en la expresión de estos elementos, principalmente
durante la transición entre la proliferación y la formación del epitelio estratificado; las subunidades
que constituyen a los complejos aumentaron su expresión entre 2 y 10 veces los niveles iniciales,
mientras que PRDM3 y PRDM16 se incrementaron hasta 3 veces, con resultados similares en los
niveles de las proteínas correspondientes. Por otra parte, demostramos interacciones proteína-
proteína entre los complejos remodeladores de cromatina y el factor homeótico PAX6. Reportamos
que la activación de la vía de NOTCH aumenta la expresión de PRDM16 alrededor de 20 veces respecto
a su expresión basal, pero no así para los complejos remodeladores de cromatina estudiados. Es
probable que esta vía no regule a los complejos remodeladores, pero requiera la participación de
PRDM3 y PRDM16. Con base en los resultados, proponemos la composición de subunidades de los
complejos remodeladores BAF/PBAF que posiblemente predominen durante las etapas de
diferenciación observadas en cultivo. Mediante este análisis, sugerimos las posibles combinaciones de
las principales subunidades de los complejos que incluyen a las ATPasas Brg1 y BRM; a las subunidades
núcleo BAF170, BAF155, BAF47; y a las subunidades ARID1a/BAF250a, ARID1b/BAF250b y
ARID2/BAF200 que son indispensables para el ensamble de los complejos. Es posible que los elementos
epigenéticos estudiados participen tanto en etapas tempranas de la diferenciación (complejos que
contienen Brg1 con p63), como en el silenciamiento de los genes que no se expresan en el fenotipo
terminal. Éstos interactúan con la vía de NOTCH y con PAX6 durante la etapa de transición, donde
probablemente contribuyen a la modificación de la expresión genética asociada a la formación de un
epitelio corneal estratificado a partir de sus precursores proliferativos
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
10
ABSTRACT
Remodeling of Chromatin 3D structure and the covalent modification of histones constitute part
of the epigenetic mechanisms involved in cell differentiation. We started the study of chromatin
remodeling complexes BAF/PBAF and PRDM16 and PRDM3 methyltransferases during differentiation
of the rabbit corneal epithelial cell line RCE1(5T5). We observed changes in the expression of mRNAs
encoding these proteins, mainly during the transition between proliferation and the development of
a stratified epithelium. The remodeling complex subunits increased their expression from 2 to 10-fold,
depending on the analyzed subunit; in contrast, PRDM3 and PRDM16 increased up to 3–fold. Similar
results were observed when we determined the expression of the corresponding proteins. On the
other hand, we show the existence of protein-protein interactions among the chromatin remodeling
complexes and the homeotic factor PAX6. On the other hand, activation of NOTCH signaling
upregulates PRDM16 expression about 20-fold, contrasting with the subunits of the chromatin
remodeling complexes which did not show any significant modification. Therefore, NOTCH pathway
probably does not seem regulate the expression of chromatin remodelers, but it is required for PRDM3
and PRDM16 activation. Based in these results, we propose the possible configuration of the
predominant BAF/PBAF remodeling complexes along the differentiation stages identified in cell
culture. Through such analysis; we suggest the possible subunit combinations for BAF/PBAF
complexes, including BRG1 and BRM ATPases; the core subunits BAF170, BAF155, BAF47; and
ARID1a/BAF250a, ARID1b/BAF250b, and ARID2/BAF200 subunits, which are essential for complex
assembly. We propose that the studied epigenetic elements participate both in early determination
(complex containing BRG1 and p63), and in silencing of genes which are not required for terminal
phenotype expression. These elements interact with NOTCH pathway and the transcription factor
PAX6 during the transition stage, where they probably contribute to establish a stratified corneal
epithelium from its proliferative precursors.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
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1 INTRODUCCIÓN
Si todas las células somáticas de nuestro cuerpo comparten la misma información genética, ¿por
qué no todas se comportan de la misma manera? ¿por qué existen diversos tipos celulares? ¿qué las
hace diferentes? ¿por qué se “apagan” y “encienden” de manera coordinada distintos grupos de
genes? Estas y otras preguntas permitieron el descubrimiento de un sistema de regulación de la
expresión genética que utiliza al código genético como base y actúa gracias a otros factores, como las
proteínas asociadas a la cromatina, el plegamiento del material genético y los RNAs no codificantes.
La Epigenética (del griego epi, en o sobre, y genética [del griego antiguo: γενετικός, guennetikós,
‘genetivus’, y este de γένεσις, génesis, ‘origen’]) es la disciplina que estudia la función de estos
componentes, a través del análisis de todos los procesos que controlan la expresión genética sin
modificar o alterar a la secuencia del DNA.
Actualmente sabemos que el nivel de compactación de la cromatina es de suma importancia en
la regulación de la expresión genética, ya que implica qué tan accesible es ésta para su transcripción.
La estructura tridimensional o “arquitectura” de la cromatina es determinante para definir la identidad
celular y como consecuencia, ésta sufre cambios durante la transición entre estados de diferenciación
o en algunas patologías. Por ello, es importante explorar los mecanismos remodeladores de la
cromatina, en particular la expresión de los componentes de los complejos proteicos que realizan dicha
remodelación durante la diferenciación. En este trabajo estudiamos a los complejos remodeladores
BAF/PBAF/SWI-SNF que, junto con proteínas involucradas en la metilación de las histonas que
intervienen en la organización de la heterocromatina constitutiva, y con vías metabólicas previamente
identificadas en nuestro laboratorio, participan activamente en la diferenciación del epitelio corneal.
El presente proyecto explora por primera vez la importancia de los procesos que participan en la
modificación estructural de la cromatina durante la diferenciación del epitelio corneal y genera un
sinnúmero de preguntas al respecto. Primeramente, describiremos las características generales de los
complejos remodeladores de cromatina, de las enzimas involucradas en la modificación covalente de
las histonas, y de algunas de las vías de señalización que modifican la actividad de los mecanismos
epigenéticos; para después analizar sus patrones de expresión y algunas de las relaciones que
interconectan a estos elementos entre sí, y con factores de transcripción indispensables para la
diferenciación epitelial.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
12
2 MARCO TEÓRICO
2.1 Estructura de la cromatina
Los genomas se encuentran ordenados de manera tridimensional en el núcleo celular, iniciando
con el plegamiento de las fibras de DNA en torno a los nucleosomas, y culminando en la agregación de
dominios cromosómicos para formar territorios cromosómicos (Cavalli & Misteli, 2013).
Figura 1 Principales estructuras en la compactación del DNA, el nucleosoma, la fibra de 10 nm ("beads-on-a-string"), la fibra
de cromatina de 30 nm y el cromosoma en metafase (Wheeler R., obtenido de https://en.wikipedia.org/wiki/Chromatin en
2017)
Durante la interfase, cuando las células no se
dividen, el material genético se encuentra disperso en la
mayor parte del núcleo como un complejo de
nucleoproteínas llamado cromatina. Las proteínas más
abundantes asociadas al DNA eucarionte son las histonas,
una familia de proteínas básicas pequeñas, evolutivamente
muy conservadas. En las histonas, los aminoácidos con
carga eléctrica positiva se ponen en contacto con los grupos
fosfato del DNA con carga negativa aproximadamente cada
10.4 pb, proporcionando 14 puntos de contacto DNA-
histona relativamente débiles, que en conjunto proporcionan estabilidad posicional. El nucleosoma
canónico es un disco octamérico (Figura 2) de aproximadamente 10 nm de diámetro, compuesto por
dos copias de cada una de las cuatro histonas canónicas: H3, H4, H2A y H2B, alrededor del cual se
empaquetan aproximadamente 147 pb de DNA y que finalmente se asocian con una molécula de la
histona H1 (Lodish, et al., 2005) (Clapier & Cairns, 2009).
Figura 2 Modelo solenoide de la fibra de
cromatina condensada de 30nm, en una vista
lateral. (Adaptado de M. Grustein, 1992).
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
13
La cromatina es una forma de organización altamente dinámica que modula tanto la estabilidad
del DNA como los patrones de expresión genética. Esta regulación se da, entre otras cosas, gracias a
su estructura tridimensional dinámica, que a su vez es regulada sustancialmente por mecanismos
epigenéticos.
2.2 Epigenética
Actualmente sabemos que a pesar de que las células somáticas de un individuo comparten su
genoma, la expresión diferencial de distintos genes permite que cada célula manifieste una identidad
o fenotipo particular. En 1942, Conrad H. Waddington acuñó el término “epigénetica”, para definir a
todos los cambios que ocurren en el fenotipo sin que se presenten cambios en el genotipo, y de esta
manera explicar aspectos del desarrollo para los cuales existía poco entendimiento mecanístico.
Posteriormente, el avance del conocimiento y el desarrollo de metodologías más sensibles y con
mayor poder de resolución permitieron identificar a procesos como el empaquetamiento del DNA
como un mecanismo de regulación de la expresión genética. Actualmente se sabe que entre más
densamente empaquetados estén los nucleosomas, el DNA se encuentra más protegido del daño, pero
al mismo tiempo, es menos accesible para ser transcrito. A esta cromatina altamente compactada y
silenciada transcripcionalmente se le conoce como heterocromatina, la cual tiene funciones
importantes para la organización del genoma, la segregación de los cromosomas, la estabilidad de los
programas de expresión genética y la progresión del desarrollo (Oberdoerffer & Sinclair, 2007; Pinheiro
et al., 2012). Por otra parte, a la cromatina más accesible y transcripcionalmente activa se le conoce
como eucromatina (Grewal & Jia, 2007; Obe et al., 2002; Oberdoerffer & Sinclair, 2007).
Gracias al análisis de los territorios cromosómicos en numerosos tipos celulares y tejidos,
sabemos que la arquitectura de la cromatina no se establece al azar, sino que es específica para cada
caso (Misteli, 2008), y que se conserva a lo largo de la evolución (Tanabe et al., 2002). Este arreglo
tridimensional de la cromatina también se hereda parcialmente de células progenitoras a células hijas
que pertenecen a un mismo linaje (Shatskikh & Gvozdev, 2013; Tanabe et al., 2002), junto con los
patrones de distribución posicional de los genes, que cambian durante procesos fisiológicos como la
diferenciación, el envejecimiento, y distintas patologías (Cavalli & Misteli, 2013), determinando así la
aparición de los distintos tipos celulares terminales.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
14
Figura 3 Vista global del núcleo celular. Adaptado de (Cavalli & Misteli, 2013).
El descubrimiento de los fenómenos epigenéticos revolucionó el concepto de regulación
genética tal como se conocía. Esto debido a que: i) implica que las modificaciones realizadas a la
cromatina pueden ser reversibles; un ejemplo de ello son las proteínas que modifican covalentemente
a las histonas en los nucleosomas, como es el caso de las acetilasas, además de otras proteínas que
“leen” estas modificaciones; o las proteínas que remueven las marcas dependiendo del contexto
celular (Allis & Jenuwein, 2016). ii) También se demostró que el ambiente tiene impacto sobre la
expresión genética al promover la modificación de histonas y la metilación del DNA. iii) Condujo al
descubrimiento de los RNA no codificantes, entre los que se encuentran los siRNAs (small interfering
RNA), snoRNAs (small nucleolar RNA), lncRNAs (long non-coding RNA), etc., que no tienen una
traducción a proteína y que entre otras funciones, regulan a los RNA mensajeros. Finalmente, iv)
permitió descubrir que la estructura tridimensional de la cromatina se modifica gracias a la actividad
de reguladores como los complejos remodeladores de la cromatina y variantes de histonas, llevando
a la conclusión de que esta arquitectura tiene una función biológica en el control de la expresión
genética.
El plegamiento de los dominios de cromatina está determinado por la actividad transcripcional de las regiones genómicas.
Se forman límites en la interfase de las partes activas e inactivas del genoma. Los dominios grandes con un estado de
actividad similar se juntan para formar dominios cromosómicos. Las regiones represivas de los cromosomas tienden a
agruparse con otras regiones represivas en el mismo brazo cromosómico, mientras que los dominios activos se encuentran
más expuestos en el exterior de los territorios cromosómicos donde tienen más oportunidad de unirse a dominios activos
de otros cromosomas dando lugar a “superdominios” topológicos compuestos de dominios genómicos funcionalmente
similares. La ubicación de los territorios está limitada por su asociación con la periferia nuclear, burbujas de transcripción,
cuerpos nucleares y clusters de centrómeros, entre otros.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
15
En la Figura 4 se resumen las funciones del epigenoma, mencionando algunos de los ejemplos
más conocidos.
Figura 4 Ejemplos clave de la contribución de la cromatina a la función del epigenoma (Allis & Jenuwein, 2016). En el centro
de la figura se muestra la base de la cromatina con cuatro nucleosomas junto con los mecanismos principales, como las
modificaciones en las histonas (mod), la metilación del DNA (Me), variantes de histonas y la remodelación (nucleosoma
amarillo) y RNA no codificante (ncRNA; líneas azules curveadas), que modifican la estructura de la cromatina y su función de
manera inter-dependiente. Las distintas adaptaciones de esta cromatina base se asocian con las funciones del epigenoma
destacadas en los cuadros. Además, se ilustran algunos de los principales factores de la cromatina que regulan dichas
transiciones. Para una explicación más a fondo de ellos consulte la referencia:(Allis & Jenuwein, 2016). Abreviaturas: Air,
antisense insulin-like growth factor 2 receptor RNA; ATRX, α-thalassemia/mental retardation syndrome X-linked; BAF, BRG1-
associated factor; DAXX, death-domain-associated protein; CTCF, CCCTC-binding factor; DNA-me, DNA methylation; DNMT,
DNA (cytosine-5)- methyltransferase; EED, embryonic ectoderm development; ESET, ERG-associated protein with SET
domain; EZH2, Enhancer of zeste homologue 2; H2A.X, histone H2 variant; H3K4me3, histone H3 lysine 4 tri- methylation;
HAT, histone acetyltransferase; HP1, heterochromatin pro- tein 1; KMT, lysine methyltransferase; lncRNA, long non-coding
RNA; MLL, mixed-lineage leukaemia; PCAF, p300/CBP-associated factor; PRC, Polycomb repressive complex; RNAi, RNA-
mediated interference; SUV39H1, Su(var)3–9 homologue 1; TAFs, TATA-box binding protein associated factors; TET, ten-
eleven translocation; TFs, transcription factors; TGS, transcriptional gene silencing; TRR, Trithorax related; Xist, X-inactive
specific transcript.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
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2.2.1 Los complejos remodeladores de la cromatina
La estructura de la cromatina proporciona, simultáneamente, una solución para el
empaquetamiento de la información y un mecanismo sofisticado para la regulación de la expresión
genética (Tang et al., 2010). Para que esta estructura conserve su funcionalidad y fluidez, se requiere
de un control estricto de sus modificaciones. El remodelamiento de la cromatina se lleva a cabo gracias
a complejos multiproteícos de gran tamaño con gran afinidad por los nucleosomas. Estos complejos
pueden interactuar con otras proteínas, incluyendo otros complejos y factores de transcripción, así
como también con modificaciones covalentes de la cromatina y/o del genoma. Estos complejos tienen
el propósito de localizar sitios
específicos del genoma, y gracias a la
hidrólisis de ATP, modificar la
accesibilidad de la cromatina para que
otras proteínas de unión al DNA puedan
ingresar, contribuyendo así a la
regulación de la expresión genética.
Este remodelado dependiente de ATP
parece ser crucial, tanto para el
ensamble de estructuras de la
cromatina, como para su disolución
(Clapier & Cairns, 2009; J. I. Wu, 2012;
Wurster & Pazin, 2012; Yoo & Crabtree,
2009).
Asimismo, estos complejos se
requieren para empacar por completo al genoma, para especializar regiones de la cromatina y para
regular la accesibilidad al DNA en las regiones empaquetadas. Todos los remodeladores de cromatina
conocidos poseen cinco propiedades básicas: a) afinidad por el nucleosoma, más que hacia el DNA
mismo; b) capacidad de reconocer las modificaciones covalentes en las histonas a través de sus
dominios proteicos; c) poseen un dominio ATPasa dependiente de DNA requerido para el
remodelamiento, que funciona como un motor de translocación para romper los contactos DNA-
histonas; d) poseen dominios y/o proteínas reguladoras del dominio ATPasa; y e) contienen dominios
y/o proteínas que permiten la interacción con otros factores de transcripción, o con la cromatina. En
conjunto, estas propiedades compartidas permiten el acoplamiento, selección y remodelado de los
Figura 5. Diferentes acciones de la actividad de remodelación de la
cromatina dependiente de ATP sobre el DNA nucleosomal. Figura
tomada de (Tang et al., 2010). DBP indica: “DNA binding proteín”
proteína de unión a DNA
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
17
nucleosomas. Sin embargo, sabemos que según su composición combinatorial pueden tener distintos
blancos y tareas (Clapier & Cairns, 2009).
Como se muestra en la Figura 5, después de la hidrólisis de ATP, una región protegida de la
cromatina se puede volver accesible a complejos de proteínas de unión al DNA tales como factores de
transcripción (en verde). Los nucleosomas se pueden desenvolver, movilizar o remover para permitir
estos procesos. En algunos casos, los complejos remodeladores dependientes de ATP pueden utilizar
el ATP para introducir variantes de histonas dentro del nucleosoma mediante un proceso llamado
intercambio de dímero (Tang et al., 2010).
Los complejos remodeladores de cromatina-ATP dependientes son complejos multiproteícos
grandes (>1 MDa) que constan de 4 a 17 subunidades y se encuentran altamente conservados en
eucariotas. Se caracterizan por la presencia de una subunidad ATPasa que pertenece a la superfamilia
II de proteínas relacionadas con helicasas (Singleton & Wigley, 2002). Las proteínas que pertenecen a
esta clase contienen un dominio ATPasa que está formado de dos partes, la región DExx y la región
HELICc, separadas entre sí por un segmento de unión (linker). Esta clase se puede subdividir en al
menos 4 familias diferentes con base en la presencia adicional de dominios únicos dentro o adyacentes
al dominio con actividad
ATPasa: SWI/SNF, ISWI,
NURD/Mi-2/CHD e INO80
(Cigall Kadoch et al., 2016).
Figura 6 Clasificación de los
complejos remodeladores de la
cromatina ATP-dependientes.
Figura tomada de (Clapier & Cairns,
2009):
Como se muestra en la Figura 6, la familia SWI/SNF contiene un dominio HSA, involucrado en
la unión a actina y a proteínas relacionadas con actina, y un bromodominio importante para su unión
a histonas que contienen lisinas acetiladas. La familia ISWI contiene los dominios SANT y SLIDE,
importantes para la unión a histonas (He & Cvekl, 2012). La familia CHD/NURD/Mi-2 contiene un
chromodominio en tándem, utilizado también para su unión a histonas. La familia INO80, al igual que
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
18
la familia SWI/SNF, contiene un dominio HSA pero también se caracteriza por la presencia de una
inserción más larga entre los dominios DExx y HELICc (Clapier & Cairns, 2009).
Los complejos SWI/SNF/RCS de mamíferos, también llamados complejos BAF/PBAF (Brama-
/Brg1- associated factor complex) están constituidos por 10 a 15 subunidades proteicas, tienen una
masa molecular aparente de 2 MDa (aproximadamente 12 veces el tamaño de un nucleosoma), y de
1.14 MDa en levadura. Éstos utilizan la energía derivada de la hidrólisis del ATP para conseguir la
movilización coordinada de nucleosomas y la modulación de la accesibilidad a la cromatina (Cigall
Kadoch, Copeland, et al., 2016). En términos de expresión genética, pueden servir tanto como
activadores y como represores. Existen alrededor de 300,000 complejos BAF por célula troncal de
ratón y parece que cerca de la mitad de ellos se encuentran en todo momento asociados a la cromatina
(C. Kadoch & Crabtree, 2015).
2.2.1.1 Historia
El complejo SWI/SNF se descubrió inicialmente por medio de dos tamizajes independientes
hechos en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Estos tamizajes buscaban identificar mutaciones en
los genes de inhibición del fenotipo “mating type switching” (SWI) y la vía de la fermentación de la
sacarosa (“Sucrose non fermenting” SNF) (Sudarsanam & Winston, 2000; Wang et al., 1996). En estos
estudios, se consiguió purificar a la proteína SWI/SNF2p que era parte de un complejo que contenía
11 polipéptidos adicionales, con un peso molecular combinado superior a 1.5 MDa. El complejo
SWI/SNF purificado, era capaz de alterar la estructura del nucleosoma de manera ATP-dependiente
(Kadoch et al., 2016; Masliah-Planchon et al., 2014; Vignali, et al., 2000; Workman & Kingston, 1998).
Actualmente se piensa que a lo largo de la evolución, los complejos remodeladores de
cromatina se modificaron según las necesidades de los organismos, utilizando como base un núcleo
de subunidades esenciales, pero ganando, perdiendo o cambiando subunidades accesorias,
probablemente para adaptarse a los cambios epigéneticos que ocurren en los organismos
multicelulares con genomas más grandes, y por lo tanto, con una necesidad de regulación más estricta
(Figura 7) (Cigall Kadoch, Copeland, et al., 2016).
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
19
Figura 7 Evolución de los complejos SWI/SNF desde levadura hasta los complejos BAP de la mosca y BAF de los vertebrados,
tomada de (Kadoch & Crabtree, 2015). Se muestra el cambio en la estructura de las subunidades de estos complejos,
relacionados entre sí, a lo largo de los últimos 500 millones de años de evolución. Los colores se utilizan para indicar
homología.
De esta manera, el desarrollo de multicelularidad y la necesidad de reprimir a la mayoría de
los genes, estuvieron vinculados evolutivamente a la aparición de la represión mediada por polycomb
(Pc), a la regulación mediada por la histona H1, y a la existencia de grandes modificaciones en la
estructura de las subunidades de SWI/SNF de levaduras en su transición hacia los complejos BAP en
las moscas. Posteriormente, el aumento en el tamaño y complejidad del genoma, así como la
metilación del DNA, condujeron a que en los vertebrados se presentara una transición en la estructura
de las subunidades y del ensamble combinatorial. Finalmente, con la aparición de un sistema nervioso
complejo, cuatro subunidades específicas para las neuronas esenciales para la morfogénesis
dendrítica, la sinaptogénesis y la conectividad en el sistema nervioso (Kadoch & Crabtree, 2015), se
añadieron al multímero.
Mientras en levaduras existen dos complejos remodeladores distintos SWI/SNF y RSC, en
Drosophila los dos complejos ortólogos se llaman BAP (Brahma associated proteins) y PBAP
(Polybromo associated BAP complexes). En mamíferos, estos dos complejos se llaman BAF (Brg1
associated factors) y PBAF (Polybromo associated BAF). De esta manera, las células eucarióticas
poseen dos subfamilias de los complejos remodeladores de la cromatina SWI/SNF, que se diferencian
entre sí por la presencia de componentes particulares. Estas dos subfamilias son: SWI/SNF/BAP/BAF y
RSC/PBAP/PBAF, las cuales poseen componentes característicos que son mutualmente excluyentes
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
20
(Kadoch & Crabtree, 2015; Masliah-Planchon et al., 2014; Tang et al., 2010) y se resumen en la Tabla
1.
Tabla 1 Conservación de los componentes de los complejos SWI/SNF y RSC durante la evolución (adaptada de Euskirchen,
Auerbach, & Snyder, 2012; Tang et al., 2010).
Organismo
Saccharomyces cerevisiae Drosophila melanogaster Homo sapiens
Complejo Swi/Snf RSC BAP PBAP BAF PBAF
Componentes ortologos entre las especies
Swi2/Snf2p Sth1 BRM/Bhrama Brg1 o hBRM
Brg1
Swi3 Rsc8/Swh3 MOIRA/BAP155 BAF155 y BAF170
Swil/Adr6 OSA BAF250 a, b
Rcs9 BAP170 BAF200
Rsc1,2,3,4 Polybromo BAF180
Snf12/Swp73 Rsc6 BAP60 BAF60 a, b, c
Snf5 Sfh1 BAP45/SNR1 INI1/BAF47/hSNF5
BAP111 BAF57
BAF45 a, b, c, d
Arp 7,9 BAP55/BAP47 BAF53 a, b
Actina β-actina
BRD7
Swp82
Snf6
Snf11
Taf14
Rtt102
Rcs5, 7, 9, 10, 14, 30,
58
Htl1
2.2.1.2 Composición
Las subunidades de los complejos BAF o PBAF son codificadas comúnmente por más de un
gen, permitiendo su ensamblaje combinatorial, lo que conlleva a la formación de gran diversidad de
complejos remodeladores de cromatina, cuya expresión puede ser modulada a lo largo del desarrollo
y la diferenciación celular (Euskirchen et al., 2012).
En mamíferos, los complejos se encuentran energizados por una de dos subunidades parálogas
con actividad de ATPasa BRG1 (SMARCA4) y BRM (SMARCA2), y que son ortólogas a la proteína Snf2p
de la levadura (Tabla 1). Estas ATPasas se ensamblan en los complejos de manera mutuamente
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
21
excluyente (Euskirchen et al., 2012). El complejo BAF puede contener cualquiera de las dos ATPasas
BRM (Brahma) o BRG1 (Brahma-related gene 1); por el contrario, PBAF solo puede contener a la
ATPasa BRG1.
Además, ambos complejos contienen subunidades “núcleo” comunes: BAF47/Ini1 (“Integrase
interactor 1” codificada por el gen SMARCB1), BAF155 (“Brg1 Associated Factor” codificada por el gen
SMARCC1), y BAF170 (gen SMARCC2), y de 7 a 15 subunidades accesorias que complementan el
complejo, una de las cuales es la β-actina (Euskirchen et al., 2012; Masliah-Planchon et al., 2014).
Por otro lado, la presencia de algunas subunidades excluyentes determina su pertenencia a
una de las dos categorías (BAF o PBAF), que corresponden a sus ortólogos en levadura (SWI/SNF o
RSC). Los complejos BAF contienen una proteína de la familia OSA/BAF250/ARID1a/b homóloga a
Swi1 y por lo tanto se identifican como ortólogos de SWI/SNF. Los complejos PBAF contienen a la
subunidad BAP180/BAF180 (PBRM1) ortóloga a Polybromo en levaduras, y a la subunidad
BAP170/BAF200 (ARID2) ortóloga a RSC9 en levadura, lo cual los identifica como ortólogos del
complejo RSC de levadura (Euskirchen et al., 2012; Mohrmann & Verrijzer, 2005; Sudarsanam &
Winston, 2000).
Las otras proteínas que también forman parte de cualquiera de los dos tipos de complejo
pertenecen a las familias génicas: BAF60a/b/c, BAF45a/b/c/d, BAF57, BAF53a/b (una variante a la
vez); además de algunas otras subunidades no identificadas a la fecha. Cabe mencionar que las ARP
(actin related protein) nucleares son componentes de las familias de complejos remodeladores de la
cromatina SWI/SNF e INO80 (Clapier & Cairns, 2009; Kadoch & Crabtree, 2015). Todas estas
subunidades han sido estudiadas por separado y sus características se resumen a continuación (ver
Tabla 2).
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
22
Tabla 2 Subunidades de los complejos BAF/PBAF adaptado de (Masliah-Planchon et al., 2014)
Subunidad Gen (alias) Peso molecular predicho (kDa)
Tipo de complejo SWI/SNF
Dominio Función conocida
BRG1 SMARCA4 184.5 Subunidad núcleo
ATPasa/bromo Subunidad catalítica ATPasa y helicasa
BRM SMARCA2 181 Subunidad núcleo de BAF
ATPasa/bromo Subunidad catalítica ATPasa y helicasa
BAF47/INI1 SMARCB1 (bSNF5, INI1)
44 Subunidad núcleo
SNF5 Desconocida
BAF155 SMARCC1 (SWI3) 123 Subunidad núcleo
Cromo/SANT/BRCT Desconocida
BAF170 SMARCC2 133 Subunidad núcleo
Cromo/SANT/BRCT Desconocida
BAF250a ARID1A (SMARCF1)
242 Subunidad núcleo de BAF
ARID Unión al DNA
BAF250b ARID1B 236 Subunidad núcleo de BAF
ARID Unión al DNA
BAF200 ARID2 197 BAF/PBAF ARID Unión al DNA
BAF57 SMARCE1 47 BAF/PBAF HMG Desconocida
BAF45a PHF10 56 BAF/PBAF Dedos de zinc_RING Desconocida
BAF45b/c/d DPF1/3/2 42.5/43/44 BAF/PBAF Dedos de zinc_RING Desconocida
BAF53a/b ACTL6A/B 47.5/47 BAF/PBAF Actina Asociación a cromatina / matriz nuclear, potenciador
de actividad ATPasa
Β-actina ACTB 41.5 BAF/PBAF Actina Desconocida
BAF60a/b/c SMARCD1/2/3 58/59/55 BAF/PBAF SWIB/MDM2 Desconocida
BCL7A/B/C BCL7A/B/C 23/23/23.5 BAF Desconocido Desconocida
BCL11A/B BCL11A/B 91/95.5 BAF Dedos de zinc_C2H2 Desconocida
BRD9 BRD9 67 BAF Bromo Unión a H3 acetilada
SYT SS18 46 BAF Desconocido Coactivador transcripcional
BAF180 PBRM1 193 PBAF BAH/HMG/Bromo Desconocida
BRD7 BRD7 74 PBAF Bromo Desconocida
La mayoría de las subunidades de los complejos SWI/SNF son capaces de unirse al DNA o a la
cromatina. Algunos dominios proteicos que cumplen con este objetivo y que están presentes en las
diferentes subunidades del complejo son los dominios HMG, ARID (AT-rich interaction domain), SANT,
y Krüppel (J. I. Wu, Lessard, & Crabtree, 2009). Aún no se determina claramente si existe una
identificación secuencia específica; sin embargo, algunas estructuras de la cromatina pueden estar
favorecidas para su unión, como ocurre para el surco menor de la doble hélice del DNA, o las uniones
helicoidales de cuatro vías (Das et al., 2009; Euskirchen et al., 2012; Morozov et al., 1998; Wang et al.,
1998).
Por otro lado, las modificaciones epigenéticas también contribuyen a la asociación de los
complejos remodeladores a zonas específicas de la cromatina, como ocurre para las modificaciones
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
23
covalentes en residuos localizados en la cola de las histonas (metilación, ubiquitinación, formilación,
acetilación, entre otras), y que por lo tanto permiten el reconocimiento de sitios específicos según el
patrón de modificación, la arquitectura del sitio y las proteínas asociadas, más que por el reclutamiento
de factores de transcripción. Cabe señalar que estas modificaciones específicas de sitio pueden actuar
colectivamente para orquestar la estabilidad genómica y la expresión o represión de genes. De las
numerosas modificaciones que pueden sufrir las histonas, la acetilación de lisinas es una de las más
dinámicas (Allfrey et al., 1964) ya que parece dirigir tanto cambios estructurales como la actividad
transcripcional (Berger, 2002; Turner, 1998). Esta función dinámica de la acetilación de lisinas es en
parte resultado de la existencia de bromodominios en las proteínas que interaccionan con la
cromatina. Los bromodominios (BRD) son los únicos dominios proteicos conocidos que actúan como
dominios que unen grupos acetil-lisina (Zeng & Zhou, 2002), y las proteínas que los contienen parecen
participar en procesos como el cáncer, la inflamación y la replicación viral (Zeng & Zhou, 2002).
En mamíferos, los complejos BAF (mSWI/SNF) y PBAF(mRSC) contienen ocho bromodominios:
(seis en PBRM1, uno en la subunidad ATPasa [ya sea BRG1 o BRM], y uno en BRD7), dos proteínas con
dedos PHD (que corresponden a las subunidades BAF45), dos cromodominios (BAF155 y BAF170), y
entre siete y nueve dominios de unión al DNA que reconocen características arquitectónicas como
pueden ser las estructuras cruciformes del DNA, las secuencias ricas en AT, o bien, características de
reconocimiento HMG (Kadoch & Crabtree, 2015).
Los complejos SWI/SNF y RSC tienen entre sus componentes a diferentes módulos de interacción
proteína-proteína o proteína-DNA, que cooperan para efectuar la actividad remodeladora del
nucleosoma. La subunidad catalítica ATPasa BRG1/BRM contiene a los dominios catalíticos HELIC y
DExx, a cuatro dominios de interacción proteína-proteína; un dominio QLQ, un dominio HSA,
involucrado en la unión a la beta actina y a BAF53a/b (Szerlong et al., 2008), un dominio BRK (función
desconocida) y un bromo dominio, un motivo con un haz de cuatro hélices importante para la unión
de histonas acetiladas (Haynes et al., 1992). A continuación, mencionamos algunas de las funciones
conocidas de las proteínas de los complejos, destacando el tipo de dominios que poseen:
BAF170 y BAF155 son proteínas de andamiaje importantes para el ensamble de muchos
componentes de ambos complejos (Chen & Archer, 2005). Cada una contiene un dominio
CHROMO (CHRomatin Organization MOdifier), constituido por 60 aminoácidos, importante
para la identificación de la cromatina como blanco (Koonin et al., 1995); lo que indica una alta
afinidad por histonas metiladas (Brehm et al., 2004); un dominio SANT que es un motivo de
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
24
aproximadamente 50 aminoácidos que posiblemente funciona como un módulo que acopla la
unión de colas de histonas con la catálisis, y adicionalmente, un módulo de unión al DNA,
secuencia especifico (Ogata et al., 1994).
BAP180/BAF180 (PBRM1) ortóloga a Polybromo, es importante en la unión de histonas
acetiladas (Kadoch & Crabtree, 2015).
BRD7 y Polybromo (BAF180) contienen bromodominios, encontrados también en ambas
ATPasas y en muchas otras subunidades de los complejos SWI/SNF. Se sugiere que reconocen
histonas acetiladas en lisinas (Singh et al., 2007).
BAF200 y BAF250 son dos proteínas de unión a regiones de DNA ricas en AT para lo cual utilizan
su dominio BRIGHT (Kortschak et al., 2000). BAF200 además poseen dos dominios de dedos
de Zinc C2H2 canónicos importantes en la unión al DNA de manera secuencia dependiente, así
como en interacciones proteína-proteína (Lessard et al., 2007).
BAF45 contiene dos dominios similares (Lessard et al., 2007) que en conjunto conforman un
dominio PHD doble (dedo C4HC3 Zn) (Lessard et al., 2007). Encontrado en otros complejos que
involucran interacciones proteína-proteína (Tang et al., 2010). Además, se sospecha que sus
homeodominios “PLANT” interpretan modificaciones particulares en las histonas (Euskirchen
et al., 2012; Musselman & Kutateladze, 2011).
BAF57 contiene a una región “coiled coil” importante en la homodimerización con la región
“coiled coil” de las subunidades BAF155/BAF170 (Chen & Archer, 2005; Tang et al., 2010).
Figura 8 Predicción de la arquitectura de dominios
en los componentes de los complejos humanos BAF
y PBAF. Las proteínas y los dominios se encuentran
aproximadamente en escala. Los módulos rosas sin
etiqueta indican regiones de baja complejidad.
Tomado de: (Tang et al., 2010).
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
25
2.2.1.3 Los complejos BAF y el desarrollo
La evidencia acumulada hasta la fecha sugiere que la composición de los complejos SWI/SNF
es altamente variable y depende de los contextos celulares y de la etapa del desarrollo embrionario
(Masliah-Planchon et al., 2014; Mohrmann & Verrijzer, 2005; Wang et al., 1996). Por ejemplo, en
humanos, BAF60, BAF45, BAF53 y BAF250 existen como diferentes isoformas provenientes de
diferentes genes, pero sólo uno de cada uno puede incorporarse en un tejido especifico o a un
complejo remodelador especifico del tipo celular (Euskirchen et al., 2012). BRG1 (SMARCA4) y BRM
(SMARCA2) se coexpresan en la mayoría de los tejidos, con excepción de las células troncales
embrionarias, donde BRG1 (SMARCA4) es la única ATPasa que se expresa (Kadoch, Williams, et al.,
2016; Kadoch, Copeland, et al., 2016) .
Durante el desarrollo del sistema nervioso, los estudios genéticos indican que el intercambio
de subunidades ayuda a dirigir la transición de células pluripotenciales a células multipotenciales y
finalmente, hasta neuronas postmitóticas comprometidas (Yoo & Crabtree, 2009). Complejos
BAF/PBAF especializados, como los encontrados en las células troncales embrionarias, incluyen a
BRG1, BAF155, y BAF60A, pero excluyen a BRM, BAF170, y BAF60C (Ho et al., 2009; Kaeser, Aslanian,
Dong, Yates, & Emerson, 2008). Al perecer se requiere una composición particular para cada estado
celular, y por ello, se les ha llegado a denominar de manera diferente.
En la Figura 9 se ilustra la composición de los complejos BAF en algunos de los tipos celulares
caracterizados hasta ahora. Las unidades análogas de cada complejo se presentan como formas
similares en el mismo color, ocupando posiciones específicas en la ilustración del complejo, como si se
tratara de un rompecabezas. Los dominios que le permiten a las subunidades interactuar con el DNA
se muestran en la superficie de cada proteína, como se explica en el pie de figura. En cada caso, las
subunidades son miembros estables del complejo; en algunos casos se demostró que éstas no son
intercambiables mediante desafíos experimentales con una subunidad sintetizada in vitro. Para las
subunidades marcadas con un signo de interrogación, no es claro cuál miembro de la familia está
presente en dicha posición. Las subunidades variables que distinguen a los complejos mostrados se
encuentran destacadas con negritas.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
26
Figura 9 El ensamble combinatorial de los complejos remodeladores de la cromatina BAF (Brahma-associated factor)
produce especificidad biológica. Tomado de (Ho & Crabtree, 2010) BAF200, también conocida como ARID1A; BAF250,
también conocida como ARID2; BRD, proteína que contiene bromodominio; HDAC, desacetilaza de histonas; MBD, dominio
de unión a metil-CpG; PHD homeodiminio plant; RbBP, proteína de unión a retinoblastoma.
Al complejo BAF en las células troncales embrionarias (ESC) se le llamó esBAF; en los
progenitores neurales, npBAF, y en las neuronas, nBAF. En los progenitores cardiacos, la composición
del complejo BAF también es distinta pero no se ha caracterizado por análisis proteómico, a diferencia
del resto de los complejos ilustrados en la Figura 9. En los tipos celulares respectivos se demostró
experimentalmente que se trata de intermediarios de procesos específicos (los cuales se mencionan
debajo de cada complejo) que no pueden llevarse a cabo por medio de complejos con una composición
diferente. En algunos casos, se muestran factores de transcripción clave que trabajan en cooperación
con los complejos BAF (como son OCT4 y SOX2 en las ESC, CREST en las neuronas, y GATA4 y TBX5 en
los progenitores cardiacos).
Las funciones que desempeñan las proteínas que constituyen estos complejos durante el
desarrollo, se analizaron por separado mediante numerosas técnicas y modelos como Drosophila
melanogaster, ratón y en las células troncales embrionarias, entre otros (Ho & Crabtree, 2010; J. I. Wu,
2012; Yoo & Crabtree, 2009). Interesantemente, la localización de los complejos BAF/PBAF en el
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
27
genoma coincide con la de los principales factores que determinan el destino celular (Alver et al.,
2017). Se reportó que los complejos BAF tejido-específicos interaccionan con una variedad de factores
de transcripción en diferentes tipos celulares, permitiéndoles así tomar funciones contexto-
dependientes generadas por sus diferentes compañeros de interacción (Clapier & Cairns, 2009).
Estos complejos son cruciales para el desarrollo adecuado de los organismos donde fueron
estudiados. Tal es el caso del mantenimiento de la capacidad de autorenovación y de la
pluripotencialidad en las células troncales embrionarias de ratón (Ho et al., 2009). En este caso, la
deleción de BAF47 o BAF155 en el complejo esBAF es letal para el embrión antes de la implantación
(Lessard et al., 2007). Pero también son esenciales para la expresión de fenotipos diferenciados a
través de un cambio de subunidades que les permite interactuar con otros factores de transcripción
como ocurre durante el desarrollo neural (Kadoch et al., 2013; Yoo & Crabtree, 2009).
Se sabe que BRM está involucrada en la activación del genoma del zigoto (Bultman et al.,
2000), mientras que durante el crecimiento del blastocisto y su implantación, así como en la activación
de las células troncales embrionarias, BRG1, BAF155 y BAF47, tienen una función fundamental
(Bultman et al., 2000; Bultman et al., 2006; Kim et al., 2001; Klochendler-yeivin et al., 2000). Por otra
parte, mientras que para la gametogénesis y la fertilidad en individuos adultos se requiere de las
subunidades BRM, MOR y BAP60 en Drosophila melanogaster (Hansis et al., 2004; Ho & Crabtree,
2010); para la neurulación y el desarrollo del sistema nervioso central se necesitan BRG1, BAF53A,
BAF45A y BAF53B (Lessard et al., 2007; Yoo & Crabtree, 2009). En contraste, durante el desarrollo del
tubo cardíaco participan Polybromo, BAF60C y BAF45C (Singh & Archer, 2014); para la diferenciación
muscular se requiere de BRG1 (Lange et al., 2008), y de BRG1 y BAF57 para la diferenciación de
timocitos (Wurster & Pazin, 2012).
Además, el análisis de Brg1 demostró que esta enzima desempeña funciones tejido-específicas
en el desarrollo neuronal, retinal y del cristalino. Por ejemplo, estudios sobre la participación del gen
Young durante la diferenciación terminal de la retina del pez cebra, mostraron que Brg1 actúa rio abajo
de Shh y Ath5, induciendo la salida del ciclo celular y el inicio de la diferenciación (Leung etal., 2008).
Asimismo, se encontró que Brg1 es importante para el mantenimiento de las células troncales neurales
y de las células progenitoras en el ratón, además de participar en la regulación de componentes de la
cascada de señalización dependiente de Shh y Notch (Yoo & Crabtree, 2009).
En el cristalino, Brg1 promueve la diferenciación terminal y la enucleación (cariolisis) de las
fibras del cristalino (He et al., 2010). Se demostró que en cristalinos transgénicos la expresión de
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
28
dominantes negativas de Brg1 en las fibras postmitóticas evitan su diferenciación terminal. De manera
similar, se conocen varios defectos posteriores a la inactivación condicional de Brg1 en el ectodermo
superficial que da origen al cristalino y al epitelio corneal. En ambos modelos, los núcleos celulares de
las fibras del cristalino no se degradaron y la zona libre de organelos (OFZ) estaba ausente con la
consecuente pérdida de transparencia del mismo (He et al., 2010).
2.2.2 Las monometiltransferasas de histonas
Como se mencionó anteriormente, la unidad básica de la organización de la cromatina está
compuesta por proteínas envueltas por aproximadamente 147 pb de DNA dependiendo de la especie,
para formar un nucleosoma. En los nucleosomas se empaqueta una enorme cantidad de información
genética a pesar del diminuto espacio; sin embargo, la cromatina tiene suficiente fluidez para
remodelarse y conseguir la expresión o represión de distintos genes en respuesta a varios estímulos y
gracias a los distintos mecanismos epigenéticos. Entre estos, además de los complejos remodeladores,
se encuentran las modificaciones covalentes (metilación, acetilación, fosforilación, sumoilación,
ubiquitinación, etc.) de las histonas en aminoácidos localizados en posiciones específicas (Allis &
Jenuwein, 2016). Estas “etiquetas” permiten controlar la expresión genética gracias a un sistema de
enzimas que marcan a las histonas (“escritoras”), a otras que distinguen dichas marcas (“lectoras”), y
a otras que se encargan de eliminarlas de manera específica (“borradores”) (Hughes et al., 2013). Por
ejemplo, la metilación de histonas ocurre en los residuos de lisina, ya sea como mono, di o
trimetilaciones, como en el caso de la lisina nueve de la histona tres (H3K9me1, H3K9me2, y
H3K9me3); generando una marca asociada funcionalmente con la supresión de la expresión genética
y la conformación cerrada de la cromatina (heterocromatina) (Allis & Jenuwein, 2016). Como estas
existen más marcas especificas a las que se les atribuyen funciones de activación transcripcional (p.
ej., H3K4me), entre otras (Allis & Jenuwein, 2016). A continuación, se describen a detalle dos proteínas
involucradas en el marcaje o etiquetado de histonas.
2.2.2.1 La familia de proteínas PRDM
Prdm3 y Prdm16 son metiltransferasas que actúan sobre residuos de lisina (lisina-metil
transferasas, KMT). En particular, estas enzimas llevan a cabo en el citoplasma la metilación específica
de la lisina 9 de la histona H3 (H3K9me1), que sirve como base para generar su trimetilación asociada
a la estructura de la heterocromatina constitutiva (Pinheiro et al., 2012). Estas proteínas son parte de
la familia Prdm, que está definida con base en la presencia de un dominio N-terminal conservado; PR.
Este dominio se identificó originalmente como un motivo compartido por dos proteínas: PRDI-BFI
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
29
(positive regulatory domain I-binding factor 1), comúnmente llamada Prdm1 (PR domain containing
1); y RIZ1 (retinoblastoma protein-interacting zinc finger gene 1), ahora conocida como Prdm2 (Buyse
et al., 1995). A este dominio se le denominó PR por ser ortólogo a PRDI-BF1-RIZ1 (Herz et al., 2013) Los
dominios PR se relacionan con los dominios catalíticos SET (nombrados por los factores de Drosophila:
Suppressor of variegation 3-9, Enhancer of zeste y Trithorax), un módulo metiltransferasa que media
la transferencia de un grupo metilo de la S-adenosil-metionina al grupo ε-amino de la cadena lateral
de una lisina, y que define a un amplio grupo de metiltransferasas de histonas (HMT) (Huang et al.,
1998; Schneider et al., 2002; Sun et al., 2008; Wu et al., 2010). En todas, a excepción de Prdm11, el
dominio PR está seguido por arreglos repetidos de dedos de zinc que median la unión secuencia-
específica con el DNA, así como interacciones proteína-proteína (Hohenauer & Moore, 2012) (Figura
10).
Figura 10 Estructura y relaciones de los dominios de la familia de proteínas Prdm. (A) Se ilustra la estructura de los dominios
en cada miembro de la familia Prdm humana junto con las relaciones entre sus dominios “Positive regulatory” PR. Solamente
se muestra la isoforma más larga. Las líneas naranjas destacan los PR conservados en C. elegans y Drosophila. Las
características de las proteínas marcadas con asteriscos se derivan de UniProt. (B) Ejemplo de conservación de la estructura
de una Prdm entre especies. Se muestran los ortólogos Prdm3 de ratón, Hamlet de Drosophila y EGL-43 de C. elegans. Los
dedos de zinc con secuencia similar entre los ortólogos se muestran del mismo color, también se muestran las posiciones y
secuencias de los sitios de unión a CtBP compartidos. AWS, asociado con el dominio SET; CtBP, C-terminal Binding Protein;
KRAB, Krüppel-Associated Box; Rb, retinoblastoma; SSX, sarcoma sinovial X. Figura tomada de (Hohenauer & Moore, 2012)
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
30
La familia de proteínas PRDM está formada por 16 (en roedores) o 17 (en primates) miembros,
que funcionan como coreguladores de la transcripción durante la diferenciación, participando en una
amplia variedad de procesos durante el desarrollo, la proliferación y la señalización celular. Las
proteínas PRDM se expresan tanto en tejidos embrionarios/fetales como en adultos. Los genes que las
codifican se dividen en 5 subfamilias principales con base en su secuencia, en la estructura proteica y
en el número de repetidos de Zinc similares entre ellas. De esta manera, Prdm 2, 3 y 16 constituyen
una subfamilia (Ding et al., 2013; Hohenauer & Moore, 2012; Warner et al., 2014).
Algunas proteínas de la familia PRDM muestran actividad intrínseca de HMT; sin embargo, la
mayoría carece de esta función y por ello reclutan a enzimas modificadoras de histonas para mediar
su función. Así también, se asocian con desacetilasas de histonas (HDAC) para promover la represión
transcripcional, o bien, con histona acetiltransferasas (HAT) para la activación transcripcional (Allis &
Jenuwein, 2016). En algunos casos, el reclutamiento ocurre a través de los dedos de zinc; en otros, es
a través de dominios adicionales como los dominios ricos en prolina reportados para Prdm1, Prdm3,
Prdm6 y Prdm16. Dichos dedos de zinc pueden utilizarse para unirse directamente al DNA y en el caso
de algunas proteínas de la familia (como ocurre con Prdm1, Prdm3, Prdm5, Prdm9, Prdm14 y Prdm16),
para que la unión se lleve a cabo de manera específica de secuencia. Las proteínas PRDM también
reclutan co-represores que sucesivamente se asocian con enzimas modificadoras de histonas; por
ejemplo, Prdm2, Prdm3, Prdm16 y Hamlet se unen a CtBP (C-terminal binding protein) a través de
sitios canónicos PLDLS de unión a CtBP. Finalmente, cabe mencionar que el mismo factor Prdm puede
regular grupos divergentes de blancos en diferentes tipos celulares. Por lo tanto, la selección del blanco
de Prdm está bajo un control contexto-dependiente (Hohenauer & Moore, 2012).
2.2.2.2 H3K9me1: Prdm3/Evi1 y Prdm16
Originalmente, Prdm3 y Prdm16 se identificaron debido a que su desregulación causa
malignidades mieloides (Morishita, 2007). Ambas proteínas son ortólogos de Hamlet en Drosophila
(Herz et al., 2013). Prdm3 y Prdm16 son KMT esenciales para la formación de la heterocromatina, ya
que catalizan la metilación de la lisina 9 en la histona H3 (H3K9me1). Dicha marca sirve como base para
que esta posición sea trimetilada por la enzima Suv39h, generando un marcaje (H3K9me3) que es de
suma importancia para el mantenimiento de la heterocromatina constitutiva, implicada a su vez en la
organización tridimensional de la cromatina y la estructura de la lámina nuclear (Pinheiro et al., 2012).
Ambas metiltransferasas participan en el desarrollo. Como ejemplo, se describió que
intervienen en la formación del esqueleto craneofacial del pez cebra, lo que se demuestra al eliminar
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
31
a los genes Prdm3 o Prdm16, lo que reduce la expresión de los factores de transcripción dlx2a y barx1,
que son característicos de la cresta neural y genera defectos en el viscerocranium (o esqueleto facial)
y el neurocranium (bóveda craneal y base del cráneo) estudiados en pez cebra y defectos identificados
río abajo de la vía de señalización de shh (Ding et al., 2013). Asimismo, en ratones, la mutación de
Prdm16 causa anormalidades del desarrollo, que incluyen una mandíbula hipoplásica y el paladar
hendido (Bjork, Fujiwara, et al., 2010; Bjork et al., 2010; Horn et al., 2011). Debido a éstas y otras
evidencias, sabemos que las funciones de ambas proteínas se sobrelapan parcialmente, al igual que su
expresión durante el desarrollo de diversos tejidos, como el cerebro, los arcos faríngeos y las aletas
pectorales en el pez cebra. No obstante, al mismo tiempo Prdm3 y Prdm16 poseen funciones
independientes subordinadas al contexto (Ding et al., 2013).
2.2.2.3 Prdm3
El gen Prdm3/MDS1 (myelodysplasia síndrome 1) / EVI1-1 (ecotropic viral integration site 1) se
identificó inicialmente como un locus común para la integración retroviral en los tumores mieloides
de ratones AKXD. Estudios subsecuentes revelaron que dicho gen codifica un factor de transcripción
con dos dominios de dedos de zinc, que mapea en el locus 3q26n del cromosoma humano 3, y que
tiende a estar activado transcripcionalmente en leucemias mieloides humanas y en síndromes
mielodisplásicos debido a translocaciones e inversiones que involucran a dicho locus (Hirai, 1999).
Prdm3 posee dos dominios de dedos de zinc múltiples separados, con diferentes
especificidades de unión al DNA. Los dedos de zinc N-terminales se unen predominantemente a
motivos parecidos al factor de transcripción GATA; y los dedos de zinc C-terminales se unen a una
secuencia parecida a ETS. Cuando Prdm3 se une a secuencias parecidas a ETS, se encuentra cerca de
sitios de inicio de la transcripción (TSS), mientras que cuando se une a motivos parecidos a GATA,
tiende a localizarse más lejos de los TSS. De manera interesante, Prdm3 se une a cualquiera de estos
motivos, pero no interacciona de manera simultánea con ambos, ya que en contextos distintos se
genera una competencia entre los promotores (Hohenauer & Moore, 2012).
Evi-1 tiene la habilidad de reprimir la señalización de TGFβ con base en el primer dominio de
dedos de zinc, y potenciando la actividad de AP-1 a través del segundo dominio de dedos de zinc. El
primer dominio contribuye a reprimir la señalización que inhibe la proliferación celular al interactuar
físicamente con Smad3 (un mediador intercelular de la señalización por TGFβ) y por lo tanto
inactivando a esta proteína. Por otra parte, el segundo dominio de dedos de zinc promueve la
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
32
proliferación celular a través del promotor de c-fos. La expresión constitutiva de Evi-1 conduce a la
transformación maligna (Morishita, 2007). (Figura 11).
Figura 11 Funciones biológicas y bioquímicas de Evi-1/Prdm3. Figura tomada de (Hirai, 1999)
Actualmente se sabe que Evi1 interacciona con diversos genes blanco como GATA-2,
GADD45G, FOG2, SKI1 (SNON), KLF5 (BTEB2), DCN, y MAP3K14 (NIK). También se reportó que
interactúa con muchas otras proteínas, incluyendo a BRG1, CBP/p300, Dnmt3a/b, JNK, CTBP2, HDAC1,
HDAC4, RUNX1, UXT, MBD3, P/CAF, CTBP1, SMAD1/2, SMAD3, SUV39H1, complejos polycomb y GATA-
1 (Fog et al., 2011; Matsugi et al., 1990; Morishita, 2007). Morishita (2007) y por otra parte Fog y
colaboradores (2011), describieron que CBP y PCAF funcionan como coactivadores transcripcionales,
CTBP1 y CTBP2 funcionan como corepresores, y HDAC1 y HDAC4 funcionan como histona desacetilasas
para reprimir la transcripción (Fog et al., 2011; Morishita, 2007).
2.2.2.4 Prdm16
Prdm16 se identificó originalmente en estudios de síndromes mielodisplásicos, ya que una
translocación [t(1;3)(p36;q21)] coloca a Prdm16 bajo el control del gen constitutivo de la riboforina 1
(RPN1), generando la expresión ectópica de la isoforma de Prdm16 que carece del dominio PR,
causando leucemia mieloide (Chuikov et al., 2010; Morishita, 2007; Warner et al., 2014). Más
recientemente se demostró que este gen es crítico para la función de las células troncales
hematopoyéticas, al regular la renovación celular, la diferenciación y la apoptosis, aunque existe la
posibilidad de que el mantenimiento de la población de células troncales sea una función general de
Prdm16 (Chuikov et al., 2010).
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
33
Prdm16 presenta una homología cercana al 64% en su secuencia de nucleótidos y del 63% en
su estructura primaria con Prdm3, por lo cual se conoce también como MDS1/EVI1-like. Contiene 10
motivos de dedos de zinc, separados en dos clusters (7 dedos en uno y 3 en otro), y un dominio de
unión a CtBP. La molécula completa tiene 1275 aminoácidos de longitud, con una masa molecular
aproximada de 170 kDa. En la Figura 12 se ilustra también una variante de splicing con un dominio PR
más corto (Warner et al., 2014).
Figura 12 Estructura de PRDM16 (Warner et al., 2014)
Prdm16 posee diferentes actividades, algunas de las cuales están bien caracterizadas y se
relacionan con procesos de diferenciación, incluyendo la promoción de la diferenciación del tejido
adiposo pardo (BAT), a través de su interacción con los coactivadores transcripcionales PGC1α y
PGC1β, a la vez que simultáneamente reprime la formación del tejido adiposo blanco (WAT) al inhibir
la expresión de los genes específicos de este proceso, mediante su interacción con CtBP 1 y 2 (Warner
et al., 2014). Por otra parte, en el tejido hematopoyético y en el sistema nervioso, la deficiencia de
Prdm16 conduce a cambios en los niveles de especies reactivas de oxigeno (ROS) (Chuikov et al., 2010),
a la pérdida de las células troncales (Fog et al., 2011) y a un aumento en la muerte celular debido a
una distribución alterada del ciclo celular (Chuikov et al., 2010).
2.3 La vía de NOTCH
Actualmente se sabe que la señalización dependiente de NOTCH está involucrada tanto en el
desarrollo como en la renovación de tejidos. Considerando que NOTCH es importante en el
establecimiento de linajes celulares, así como en la proliferación, la apoptosis, la diferenciación y la
migración celular, y que estos procesos dependen de la estructura de la cromatina y de su
remodelación durante el desarrollo, existe un gran interés en establecer la relación que guardan los
procesos epigenéticos con esta ruta de señalización (revisado por Schwanbeck, 2015).
La familia de los receptores transmembranales de NOTCH es parte de una red de comunicación
célula-célula conservada evolutivamente. Se considera que esta ruta de señalización es uno de los
mecanismos involucrados en la determinación del destino celular, así como en la ejecución de
programas de diferenciación, en el control de la proliferación y del carácter troncal (Artavanis-
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
34
Tsakonas & Muskavitch, 2010; Fiuza & Arias, 2007; Rangarajan et al., 2001). Sin embargo, sus
interacciones dependen del contexto celular, y las consecuencias de su activación varían de un modelo
a otro (Liu et al., 2010). En mamíferos, existen cuatro receptores Notch (Notch1-4) y cinco ligandos:
tres ortólogos de Delta (Delta-like-1, -3 y -4) y dos de Serrated denominados Jagged-1 y Jagged-2. De
manera posterior al contacto entre una célula emisora y otra receptora, se presenta la Proteólisis
Intramembranal Regulada (RIP), que inicia un proceso de 3 cortes sucesivos que culmina en la
liberación del dominio intracelular de Notch (NICD). Éste se trasloca al núcleo donde desplaza a
moléculas co-represoras para formar un complejo activador de la transcripción junto con la proteína
CSL (CBF1 o RBPjκ en mamíferos, Suppressor of hairless en Drosophila y LAG-1 en Caenorhabditis
elegans) (Figura 13) (Bray, 2006; Fiuza & Arias, 2007; Gomperts et al., 2009; Gordon et al., 2008; Radtke
& Raj, 2003).
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
35
A continuación, se muestra un esquema de la activación de la vía de Notch:
Figura 13 Vía metabólica de NOTCH. Tomada de CST Signaling Pathway Diagrams for Development and Differentiation,
©2006–2015 Cell Signaling Technology, Inc.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
36
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
37
3 ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN.
A nivel mundial, alrededor de 12.7 millones de personas esperan un trasplante de córnea debido
que sufrieron la pérdida irreversible de su transparencia. Este padecimiento puede estar asociado a
un trauma o lesión que deja cicatrices, o deberse a infecciones como la queratitis herpética (Verdiguel-
sotelo et al., 2016), a condiciones hereditarias como la distrofia de Fuchs (CENATRA, 2016; Kim et al.,
2017; Verdiguel-sotelo et al., 2016) y ocasionalmente, puede ser consecuencia de una cirugía ocular
(Garralda et al., 2006). Debido a la escasez de donadores de tejidos, únicamente se satisface el
requerimiento de corneas para una de cada 70 personas. Por este motivo, el daño corneal es la tercera
causa de ceguera a nivel mundial después de las cataratas y el glaucoma. En promedio, 10 millones de
personas padecen ceguera corneal bilateral (Gain et al., 2016). En el caso de México, para el período
comprendido entre 1963 y diciembre de 2014 se trasplantaron 49,893 pacientes, donde en promedio,
extrapolado hasta los primeros semestres de 2016 y 2017, cerca de 1800 pacientes por año son
trasplantados con córneas provenientes de cadáver (CENATRA, 2016). Cabe señalar que, en nuestro
país el queratocono es la causa predominante del trasplante de córnea (Gain et al., 2016).
Para el desarrollo de alternativas terapéuticas, enfocadas en la reparación de la superficie ocular
o generar dispositivos que sustituyan a los tejidos provenientes de donadores, es indispensable la
comprensión de los procesos que dan lugar a la formación y reparación de un epitelio especializado
como el que recubre la córnea, además de adquirir la capacidad de regular los procesos de
diferenciación, migración, y proliferación epitelial. Por ello, se han desarrollado sistemas in vitro que
utilizan a las células epiteliales como modelo experimental, entre los que destacan los queratinocitos
de epidermis humana o de ratón (Hennings et al., 1980; Rheinwald & Green, 1975), y las células de
epitelio corneal del mamífero (revisado por Castro-Muñozledo, 2008). En particular, el control de la
proliferación y diferenciación del epitelio corneal de mamífero posee características distintivas que
hacen a este tejido un modelo relevante; entre éstas destacan: i) el que cada célula basal individual
está sometida a una demanda excepcionalmente alta de poder regenerativo, ya que el epitelio yace
sobre un estroma extremadamente plano, sin interdigitaciones, a diferencia de otros epitelios
estratificados. ii) Al estar completamente expuesto, el epitelio corneal es muy susceptible al daño por
agentes ambientales, por lo que requiere una alta capacidad de regeneración. iii) Dado que es un
epitelio no pigmentado, todas sus células basales están expuestas al efecto de la energía solar y de las
fuentes de radiación, lo que las hace susceptibles a sufrir mutaciones que alteren su funcionalidad y
regulación. iv) Paradójicamente, a pesar de su localización desprotegida, los carcinomas corneales son
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
38
poco frecuentes. v) gracias a marcadores moleculares, se postula al limbus como el nicho putativo
único para la localización de las células troncales del epitelio corneal (Cotsarelis et al., 1989; Keivyon
& Tseng, 1989; Schermer et al., 1986; Sun & Lavker, 2004; R. L. Wu et al., 1994). Finalmente, vi) debido
a que la estructura corneal se establece bajo condiciones que sólo se presentan durante el desarrollo
embrionario, el daño corneal en etapas postnatales implica, en gran cantidad de casos, cambios en la
organización estructural del tejido, lo que lleva a la pérdida de transparencia de la córnea y, por lo
tanto, a la pérdida de la capacidad visual del paciente (p. ej., quemaduras, procesos ulcerativos
asociados a infecciones virales como Herpes, etc.).
En nuestro laboratorio, se estableció una línea celular inmortal que replica in vitro el proceso de
diferenciación del epitelio corneal (Castro-Muñozledo, 1994). En este modelo, se buscaron marcadores
moleculares que permitieran monitorear los cambios tempranos del proceso de diferenciación,
anteriores a la expresión del fenotipo terminal, caracterizado por la expresión de las citoqueratinas K3
y K12 (Schermer et al., 1986; R. L. Wu et al., 1994). Estos estudios permitieron establecer que las
enzimas Lactato deshidrogenasa (LDH) y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH), normalmente
consideradas como enzimas “housekeeping”, anteceden por un día la expresión de las citoqueratinas
características del epitelio corneal (Garcia-Villegas et al., 2009; Hernández-Quintero, García-Villegas,
& Castro-Muñozledo, 2002). Además, de acuerdo con hallazgos de nuestro grupo y a estudios de otros
grupos de investigación, se concluyó que el factor de transcripción Pax6 controla la expresión del
programa de diferenciación (Garcia-Villegas et al., 2009; Kitazawa, Hikichi, Nakamura, & Sotozono,
2017; Sasamoto et al., 2016a), mientras que factores de transcripción como Sp1 y AP2 controlan la
expresión de las citoqueratinas específicas del tejido (Chen et al., 1997), y posiblemente participan en
la regulación tejido-específica (Adhikary et al., 2005; Banks et al., 1999; Gingras et al., 2003). Estas y
otras evidencias permitieron concluir que la diferenciación del epitelio corneal depende de una
compleja red de factores de transcripción entre los que destacan ∆Np63α (Di Iorio et al., 2005;
Robertson et al., 2009), AP1 (Adhikary et al., 2005; Adhikary et al., 2004), KLF6 (Chiambaretta et al.,
2002; Nakamura, Chiambaretta, Sugar, Sapin, & Yue, 2004), ESE-1 y los factores que responden a la
cascada de señalización de Wnt3a, Wnt6, y Wnt9b (Fokina & Frolova, 2006). Todos éstos regulan parte
del proceso de diferenciación corneal durante el desarrollo embrionario (Fokina & Frolova, 2006;
Nakamura et al., 2004) y en el adulto (Nakamura et al., 2004); siendo importantes para la expresión
correcta del fenotipo terminal (Adhikary et al., 2005; Adhikary et al., 2004).
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
39
Al revisar el conocimiento sobre esta intrincada red de regulación genética, que enfatiza la
participación de los factores de transcripción ∆Np63α y PAX6 (Di Iorio et al., 2005; Sasamoto et al.,
2016b; Simpson & Price, 2002), observamos que cada vez se estudia con mayor frecuencia la
participación de los mecanismos epigenéticos en los programas de diferenciación de diversos tejidos,
en particular, las modificaciones covalentes de histonas y sus enzimas asociadas. Aún más, se hace
evidente al remodelado de la cromatina como un proceso necesario para la progresión de la
diferenciación; ya que al determinar la estructura tridimensional de la cromatina también se afecta la
disponibilidad transcripcional del genoma. La evidencia sugiere que para lograr la expresión
coordinada de numerosos genes localizados en diferentes cromosomas y regiones cromosómicas, se
requieren complejos remodeladores de la cromatina como los complejos BAF, que pueden
relacionarse con distintos factores de transcripción y cuya actividad depende de su configuración
combinatorial (Ho & Crabtree, 2010), para culminar en la expresión del fenotipo terminal.
Hasta ahora, en células epiteliales la configuración temporal de los complejos remodeladores de
cromatina y la actividad de los mecanismos de modificación covalente de la cromatina no se han
descrito. Tomando en cuenta que ∆Np63α y PAX6 son indispensables para dirigir la diferenciación
adecuada del epitelio corneal (Di Iorio et al., 2005; Sasamoto et al., 2016b; Simpson & Price, 2002), y
que existen numerosos reportes sobre su interacción directa con proteínas de los complejos BAF y con
las metiltransferasas de histonas Prdm16 y Prm3, procesos promovidos en parte a través de la
estimulación de la vía de señalización dependiente de Notch (Bi et al., 2014; Endo et al., 2012; Kinameri
et al., 2008); en este trabajo nos propusimos iniciar el análisis de la participación de los complejos
remodeladores de la cromatina y de las metiltransferasas de histonas en la diferenciación de las células
RCE1(5T5) de epitelio corneal de conejo.
Existen reportes que sugieren que la expresión de Brg1 es regulada por p63 (Mardaryev et al.,
2014), y que ambas moléculas participan en el mantenimiento de la capacidad proliferativa de las
células progenitoras de la epidermis (Mardaryev et al., 2014). Más aún, p63 y el complejo BAF
refuerzan la actividad transcripcional de la cromatina durante la diferenciación de los queratinocitos
de epidermis humana (Bao et al., 2015). Por otra parte, también se describió que Brg1 interacciona
con Pax6, mostrando actividad diferencial dependiente del linaje celular, ya que esta interacción
permite la progresión de la diferenciación del cristalino en mamíferos (Y. Huang et al., 2010), en
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
40
contraste con su efecto en progenitores neurales de ratón, donde promueve el potencial proliferativo
(Ninkovic et al., 2013).
Adicionalmente, resultados de diferentes laboratorios demuestran que los complejos
remodeladores de cromatina regulan la expresión de ligandos de la vía de NOTCH (Leung et al., 2008),
hecho que conlleva a la generación de fenotipos diferenciados. Por ejemplo, en el órgano sensorial de
Drosophila se ha visto que las mutantes dominantes negativas de BRM carentes de actividad catalítica,
generan fenotipos similares a los obtenidos cuando se interrumpe la señalización de la vía de NOTCH
(Armstrong et al., 2005). Por otra parte, durante el desarrollo de la retina en el pez cebra, la eliminación
de Brg1 aumenta la expresión de genes asociados con la vía de señalización de Notch (Leung et al.,
2008). De manera importante, resultados de nuestro laboratorio sugieren que la expresión del
receptor Notch-1 es predominante durante la etapa proliferativa de las células epiteliales de la córnea,
mientras que Notch-2 es más abundante durante la diferenciación terminal (Mata-Lozano, 2012). En
particular, se demostró que la estimulación de la población celular con ligandos de Notch o con Notch,
promueve la estimulación diferencial de la proliferación o de la diferenciación: mientras Notch-1
soluble aumenta la capacidad proliferativa, la estimulación con Jagged-1 la disminuye, facilitando la
expresión del fenotipo terminal (Mata-Lozano, 2012). Es importante resaltar que esta vía participa en
el control de las PRDM, particularmente Prdm3 y 16. La interacción entre las metiltransferasas de
histonas y la vía de NOTCH parece ser importante durante el desarrollo del sistema nervioso central
de los mamíferos (Kinameri et al., 2008), así como para el desarrollo de las neuronas del receptor
olfatorio en Drosophila (Endo et al., 2012), y para el desarrollo del tejido adiposo pardo en ratón (Bi
et al., 2014). Curiosamente, en Drosophila melanogaster también se reportó la interacción de estas
proteínas con subunidades de los complejos remodeladores BAF, donde Osa (BAF250) induce a Hamlet
(Prdm16/Prdm3) para regular la amplificación transitoria de los progenitores neurales previa a la
expresión del fenotipo terminal (Eroglu et al., 2014a).
Por consiguiente, para conocer los mecanismos que regulan la diferenciación y la reparación de
la superficie ocular, el propósito de este trabajo consiste en iniciar el análisis de la regulación
epigenética de la proliferación y la diferenciación del epitelio corneal de mamífero. Es de nuestro
interés entender la participación de procesos epigenéticos como la remodelación de cromatina y su
modificación covalente sobre el control del programa de diferenciación, y a largo plazo, establecer la
conexión entre estos procesos, la vía de señalización de Notch y la actividad de los factores de
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
41
transcripción p63 y Pax6; la cual parece ser crucial en el programa de diferenciación. Para este trabajo
utilizaremos a la línea celular inmortal RCE1(5T5), que replica el proceso de diferenciación del epitelio
corneal. Más aún, con base en la evidencia acumulada en nuestro laboratorio (Castro-Muñozledo et
al., 2017; T. Chen et al., 1997; Garcia-Villegas et al., 2009; Gomez-Flores et al., 2010), ha sido posible
distinguir tres etapas distintivas del programa de diferenciación: la primera consiste en una etapa
proliferativa “no diferenciada”; la segunda corresponde al cese de la proliferación ocasionado por la
confluencia en cultivo y el subsecuente inicio del programa de diferenciación, y finalmente, la
expresión del fenotipo terminal. Considerando estos antecedentes nos hemos planteado la siguiente
hipótesis:
4 HIPÓTESIS
Los complejos remodeladores de la cromatina SWI/SNF y las metiltransferasas de histonas
Prdm16 y Prdm3 presentan cambios en su expresión relacionados con el inicio del programa de
diferenciación y con la manifestación del fenotipo terminal. Dichos cambios, tienen una función
relevante como elementos rio arriba del factor de transcripción Pax6, considerado el gen maestro del
programa de diferenciación, a la vez que su actividad es modulada a través de la vía de señalización de
NOTCH.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
42
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
43
5 OBJETIVOS
5.1 Objetivo general
Caracterización de la expresión de los complejos de remodelación de cromatina y proteínas
asociadas durante la diferenciación y proliferación de la línea celular de epitelio corneal de conejo
RCE1(5T5).
5.2 Objetivos particulares
Establecer las cinéticas de expresión de los mensajeros que codifican para las proteínas:
Arid1a/BAF250a, Arid1b/BAF250b, Arid2/BAF200, BAF45a, Brg1, Brahma y Oct4 durante la
proliferación y la diferenciación de la línea celular de epitelio corneal de conejo RCE1(5T5).
Determinar las cinéticas de expresión de los mensajeros que codifican para las
metiltransferasas de histonas Prdm3 y Prdm16, durante la proliferación y la diferenciación de
las células RCE1(5T5).
Analizar los cambios en la expresión de Arid1a y Prdm16 en respuesta a la estimulación con
efectores de la vía de NOTCH.
Analizar mediante western blot, los cambios en los niveles de las proteínas correspondientes.
Analizar la composición del complejo remodelador de la cromatina SWI/SNF por medio de
coinmunoprecipitación con las ATPasas Brg1 y Brahma y western blot en diferentes etapas de
la diferenciación.
Analizar si existen interacciones proteína-proteína entre los complejos y el factor de
transcripción Pax6 durante las diferentes etapas de la diferenciación.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
44
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
45
6 MATERIALES Y MÉTODOS
6.1 Materiales
El suero fetal de bovino, el suero de ternera, el TRIzol™ y la reverso transcriptasa SuperScript™
II, se adquirieron de Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). El Taq PCR Core Kit fue de Qiagen (Valencia, CA) y
el Kit Maxima™ SYBR Green/Rox qPCR Master Mix (2X) fue de Fermentas, Inc (Waltham, MA, USA). Las
pastillas de inhibidores de proteasas COMPLETE™ (No. Cat. 11836753001) fueron de Roche Applied
Science (Penzberg, Alemania). Las Dynabeads® Protein G (No. catálogo 10009D) se adquirieron a
Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, USA); las Membranas de PVDF de 0.45 µm (Cat. no.
IPVH000010) marca Immobilon-P®, se obtuvieron de Merck KGaA (Darmstadt, Alemania); y el Sustrato
quimio luminiscente WesternSure® ECL PREMIUM (No. de producto 926-95000) fue de ©LI-COR
(Lincoln, Nebraska USA). El Tween® 20, el Triton X-100, y la albúmina de suero bovino (BSA) se
compraron a Sigma-Aldrich. Inc (St Louis Mo.). Los anticuerpos utilizados en este proyecto se
enumeran, junto con el proveedor correspondiente, en la Tabla 3. Los ligandos solubles utilizados se
obtuvieron de R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, USA) (Tabla 4). El resto de los reactivos fue grado
analítico.
Tabla 3 Anticuerpos y condiciones experimentales utilizadas (concentración)
Antígeno Descripción PM
(kDa) Fuente
Concentración WB
Pax6 (Cat. sc-32766)
IgG1 monoclonal de ratón (clona AD2.38), dirigido contra los
aminoácidos 1–206 en el extremo N-terminal de Pax-6 humana
43 Santa Cruz Biotechnology Inc.
1:1000
Prdm16 (Cat. no. PA5-20872)
IgG de conejo, policlonal, dirigido contra un péptido de 17
aminoácidos del carboxilo terminal de la PRDM16 humana. Reactividad
con humano, ratón y rata.
120 - 140
Thermo Fisher Scientific Inc.
1:5000
Prdm3/Evi1 ab (47AT612.84.88) (Cat.
no. MA5-11142)
IgG1 de ratón, monoclonal, dirigido contra una proteína de fusión con
GST que codificaba para el extremo N-terminal de la EVI1 humana.
Reactividad con humano y ratón.
117-139
Thermo Fisher Scientific Inc.
1:100 a 1:2000
Arid1a/BAF250A (D2A8U) (Cat. no.
12354)
IgG de conejo, monoclonal dirigido contra un péptido sintético
correspondiente a los residuos alrededor de la Gly1293 de Arid1a/BAF250a humana.
250 Cell Signaling Technology, Inc.
1:1000
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
46
Reactividad con humano, ratón, rata y mono.
Brg-1(G-7) (Cat. no. sc-17796)
IgG1 de ratón, monoclonal, dirigido contra los aminoácidos 209-296 mapeados cerca del extremo N-
terminal de la Brg1 humana. Reactividad con humano, ratón y
rata.
220 Santa Cruz Biotechnology Inc.
1:2000
Brm (Cat. no. ab15597)
IgG de conejo, policlonal, dirigido contra la proteína de fusión
BRM/SMARCA2 de ratón derivada de los residuos 48-214 de la
secuencia humana correspondiente. Reactividad con humano, ratón y
rata.
200 Abcam plc. 1:3000
BAF47/ SMARCB1 (D8M1X)
(Cat. no. 91735)
IgG de conejo, monoclonal, dirigido contra un péptido sintético
correspondiente a los residuos alrededor de la Leu120 de la BAF155/SMARCC1 humana.
Reactividad con humano, ratón, rata y mono.
44 Cell Signaling Technology, Inc.
1:2000
BAF155/SMARCC1 (D7F8S)
(Cat. no. 11956)
IgG de conejo, monoclonal, dirigido contra un péptido sintético
correspondiente a los residuos alrededor de la Gly975 de la BAF155/SMARCC1 humana.
Reactividad con humano, ratón, rata y mono.
155 Cell Signaling Technology, Inc.
1:2000
BAF170/SMARCC2 (D809V)
(Cat. no. 12760)
IgG de conejo, monoclonal, dirigido contra un péptido sintético
correspondiente a los residuos alrededor de la Ile818 de la BAF170/SMARCC2 humana.
Reactividad con humano, ratón, rata y mono.
162, 170
Cell Signaling Technology, Inc.
1:2000
Actina Anticuerpo monoclonal contra actina muscular de conejo
amablemente proporcionado por el Dr. José Manuel Hernández de
nuestro departamento.
41.7 Departamento biología celular,
CINVESTAV
1:3000
Anti-ratón (Cat. no. 31430)
Anticuerpo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano dirigido
contra IgGs de ratón (H+L)
-- Pierce Biotechnology,
Thermo Scientific
1:4000
Anti-conejo (Cat. no. 65-6120)
Anticuerpo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano dirigido contra IgGs de conejo (H+L) *
-- Invitrogen Corporation
1:2000
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
47
Tabla 4 Proteínas recombinantes (ligandos solubles) de la vía de NOTCH utilizados
Nombre Origen No. de catálogo Fuente
rrNotch-1/Fc chimera Rata 1057-TK ©2018 R&D Systems,
Inc. rhNotch-1/Fc chimera Humano 3647-TK
rrJagged-1/Fc chimera Rata 599-JG
rmJagged-2/Fc chimera Ratón 4748-JG
rrDLL1/Fc chimera Rata 3970-DL
rhDLL1/Fc chimera Humano 1818-DL
6.2 Métodos
6.2.1 Cultivo Celular
Las células RCE1 (5T5) se sembraron a una densidad de 2.7 x 103 células/cm2 (Castro-
Muñozledo, 1994) en presencia de 2.2 x 104 células/cm2 fibroblastos 3T3 tratados con mitomicina-C (4
µg/ml) como células alimentadoras (Rheinwald & Green, 1975, 1977). Los cultivos se suplementaron
con DMEM/F12-Ham (3:1) conteniendo 5% (v/v) de FBS, 5 µg/ml de insulina, 0.4 µg/ml de
hidrocortisona, 2x10-9 M de triiodotironina (L-T3), 1 x10-10 M de toxina del cólera, 24.3 mg/L de adenina
y 10 ng/ml de EGF (Castro-Muñozledo, 1994). Los fibroblastos 3T3 (Todaro & Green, 1963) se
cultivaron como ya se ha descrito (Castro-Muñozledo et al., 1997). Los cultivos se mantuvieron a 36°C
en una atmósfera humidificada de 10% CO2 -90% aire. En todos los experimentos el medio se cambió
cada tercer día. Para los estudios de proliferación y diferenciación en presencia de las formas
recombinantes de Notch o Jagged-1, éstas se añadieron a las concentraciones finales indicadas para
cada experimento. En este último caso, los cultivos se mantuvieron en medio suplementado con 0.5%
(v/v) de FBS, y sin la adición correspondiente de 10 ng/ml EGF.
6.2.2 Tinción con Rodamina B
Este método se basa en la tinción específica de queratinocitos mediante el colorante Rodamina
B (Castro-Muñozledo et al., 1997). Brevemente, una vez que se retiró el medio de cultivo y se lavó con
PBS, las cajas de cultivo se fijaron con formalina al 10% (v/v) en PBS durante 2 horas a 4°C.
Posteriormente, los cultivos se lavaron con agua corriente, y se tiñeron con una solución acuosa de
Rodamina B al 2% (p/v), por 30 minutos a temperatura ambiente (TA). Enseguida, se removió el
colorante y los cultivos se lavaron con HCl 0.1N para eliminar el exceso del mismo; las cajas se dejaron
secar durante toda la noche. Para la cuantificación del número de células, se extrajo el colorante con
una mezcla 1:1 de NaOH 0.4N y SDS 5% (p/v), incubando 10 minutos a TA. El colorante extraído de las
células epiteliales se recuperó con una pipeta y se determinó su absorbancia a 550nm, empleando
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
48
como blanco de reactivos cultivos de fibroblastos 3T3 a las densidades indicadas (ver párrafos
anteriores) para eliminar la absorbancia asociada a la tinción inespecífica.
6.2.3 Extracción de RNA Total
El RNA total se extrajo de cultivos de células RCE1 (5T5) a diferentes tiempos como se indica
para cada experimento. Para ello, las células se cultivaron en cajas de 60 mm. Para la extracción, se
retiró el medio y las células se lavaron dos veces con PBS-DEPC frío. Posteriormente las células se
lisaron con TRIzol™ por 5 min a TA. Se añadieron 500 µl de cloroformo por cada mililitro de lisado,
incubando 3 min a TA y se centrifugó a 12,000 rpm por 15 min a 4°C. Se colectó la fase acuosa
resultante y el RNA se precipitó por 10 min mediante la adición de isopropanol a TA. Se volvió a
centrifugar a 12,000 rpm durante 10 min a 4°C, la pastilla se lavó con etanol al 75% (v/v) en H2O DEPC,
y se centrifugó nuevamente a 7500 rpm por 5 min a 4°C. Finalmente la muestra se resuspendió en
agua DEPC para su posterior uso. La integridad del RNA se verificó por la presencia de los RNAs
ribosomales 28s y 18s en un gel de agarosa al 1% (p/v) con 0.5 mg/ml de Bromuro de Etidio (EtBr) a
una concentración final de 1.25 mM. La concentración y pureza del RNA se determinó
espectrofotométricamente registrando la absorbancia a 260 nm y a 280 nm utilizando un
espectrofotómetro Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.; Waltham, MA.). El RNA se almacenó
a -70°C hasta su uso.
6.2.4 RT-PCR Punto Final
Una alícuota del extracto de RNA total, conteniendo 4 μg de RNA, se sometió a transcripción
reversa con SuperScript™ II Reverse Transcriptase, para obtener cDNA total siguiendo las instrucciones
del fabricante. Para ello, el cDNA se amplificó utilizando el Taq PCR Core Kit. Todas las reacciones de
PCR punto final se llevaron a cabo bajo el mismo programa: [1 min de desnaturalización a 94°C, 1 min
de alineamiento a 55°C y 1 min de extensión a 72°C] 30X y una extensión final a 72°C por 10 min. Como
control endógeno se utilizaron oligonucleótidos para amplificar al mensajero que codifica a la proteína
ribosomal acídica P0 (PR-P0) (Gomez-Flores et al., 2010). Para las reacciones de PCR se utilizó un
termociclador MyCycler™ (Bio-Rad Laboratories; Hercules, CA). Los productos de PCR se analizaron
por electroforesis en un gel de agarosa al 1% (p/v) conteniendo 0.5 mg/ml de EtBr.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
49
6.2.5 RT-PCR Cuantitativa (RT-qPCR)
Se obtuvo cDNA a partir de RNA total aislado de células RCE1 (5T5) cultivadas durante 3-10
días en tres experimentos independientes. La amplificación se hizo mediante RT-qPCR utilizando el kit
MaximaTM SYBR Green/Rox qPCR Master Mix (2X) siguiendo las especificaciones del fabricante. Estos
experimentos se llevaron a cabo en un termociclador StepOne™ system (Applied Biosystems, Life
technologies).
Los oligonucleótidos utilizados se enlistan en la Tabla 5 y las condiciones de amplificación se
muestran en la Figura 14. El punto de adquisición del SYBR Green se fijó al final del paso de extensión
(72°C- 35 s). La curva de especificidad de productos (Melt) se llevó a cabo como un gradiente de 50°C
a 95°C, con una duración de 45 segundos en el primer paso y 5 segundos en cada temperatura
posterior (Mata-Lozano, 2012).
Tabla 5 Secuencia y características de los oligonucleótidos utilizados para RT-qPCR
Gen Secuencia (5’3’) Longitud %GC Tm(°C) Producto
(pb)
Pax6†† Fw: CATCTCCCGAATTCTGCAGGTGTC 24 54.17 63.52
207 Rv: CCCTCGGACAGTAATCTGTCTCGG 24 58.33 64.05
∆Np63ᆆ† Fw: TGACCACCATCTATCAGATTGAGCATTACT 30 40 63.79
77 Rv: ATGTCGAAATTGCTCAGGGATTTTCAGA 28 39.29 63.44
K3† Fw: TCCGTCACAGGCACCAAC 18 61.1 59.89
175 Rv: TGCGTTTGTTGATTTCGTCT 20 40 56.59
Oct4† Fw: GTGGAGGAAGCCGACAACAAT 21 52.38 60.88
171 Rv: GGCGATGTGTCTGATCTGCTG 21 57.14 61.40
Brg1 / SMARCA4*
Fw: ACCCTCAGGACAACATGCAC 20 55.00 60.25 108
Rv: ACCGCATCCCCATTCCTTTC 20 55.00 60.40
Figura 14 Esquematización de las condiciones de amplificación utilizadas en los protocolos de RT-qPCR.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
50
Brm / SMARCA2*
Fw: AAGTGACGCACACGGAAAC 19 52.63 58.99 149
Rv: CTCCTCCTCGTAATCGGAATCA 22 50.00 59.11
Arid1a† Fw: GGGATTTCCAGCAGCCAAGG 20 60 58.9
150 Rv: GAGTGGTCCTGAGCGAGAT 20 60 58.7
Arid1b* Fw: CGTTCTCAGATGTGGGTGATT 21 47.62 58.02
126 Rv: GGTCCTTGTTGGGCTCATAG 20 55.00 57.96
Arid2* Fw: AGTTCATACCCACCAGCAGC 20 55.00 60.04
137 Rv: CCACAGCAAGGCTAACAGGA 20 55.00 59.96
BAF45a/PHD10*
Fw: GAAGGGTAAGGAGTCCAACAAG 22 50.00 58.32 99
Rv: GTGCTCATATCCAGGCAAGAA 21 47.62 58.08
Prdm3* Fw: TTTCACGGACCCTAGCA 17 52.94 54.74
105 Rv: CCTGACGAAGTGGCAAAT 18 50.00 55.25
Prdm16† Fw: TGGCTCAAGTACATCCGTGT 20 50 56.2
64 Rv: TGATCTGACACATGGTGAGG 20 50 54.2
CTBP2* Fw: TCAAGGAGGGCAGGATACGA 20 55.00 60.03
94 Rv: AGGTTCGGGGCATCTTTCAG 20 55.00 60.04
PR-P0‡ Fw: GCAGGTGTTTGACAATGGCAGC 22 54.5 59.7
231 Rv: GCCTTGACCTTTTCAGCAAGTGG 23 52.2 58.9
*Diseñados para este trabajo; †Diseñados previamente en nuestro laboratorio; ‡(García-Villegas et al., 2007); ††(Garcia-Villegas et al., 2009); †††(Castro-Muñozledo et al., 2017).
El diseño de los oligonucleótidos para este trabajo siguió las siguientes pautas recomendadas para el
sistema:
Longitud óptima: aproximadamente 18-22 bp
Temperatura de fusión (Tm): dentro del rango de 52-60°C
Contenido de GC: 40-60%
Verificación de la presencia de bases G y C en las últimas 5 bases de los extremos 3’ de los
oligonucleótidos, evitando más de 3 G o C’s en el extremo 3’, con el propósito de promover la
unión específica de los oligonucleótidos a sus secuencias blanco.
Evitar secuencias de dinucleótidos repetidas. El máximo aceptable fue de 4 dinucleótidos
Evitar secuencias de bases repetidas (más de 4)
Evitar secuencias del molde que formen estructuras secundarias durante la reacción de PCR
Longitud del amplicón: entre 70 y 150 bp
Temperatura de alineamiento similar
El diseño se realizó con las herramientas Primer-BLAST© de NCBI y PrimerQuest Tool© de
Integrated DNA Technologies, Inc. Primero, se realizaron alineamientos de las variantes de RNAm de
los genes/proteínas de interés del conejo a partir de la base de datos de NCBI. Puesto que el genoma
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
51
del conejo no está completamente anotado, si la secuencia para conejo aparecía como “predicha”
también se incluían las secuencias de humano, rata, y ratón. Los alineamientos se realizaron con la
herramienta Clustal Omega© del EMBL-EBI. Posteriormente, se identificaron los segmentos
conservados de las secuencias, se colocaron en el software de diseño de los oligonucleótidos y se
ajustaron los parámetros correspondientes para obtener de 10 a 30 pares de oligonucleótidos. Estos
se evaluaron con las herramientas OligoAnalyzer 3.1© de Integrated DNA Technologies y Primer-
BLAST© del NCBI para establecer la especificidad de la unión y por lo tanto favorecer la posibilidad de
amplificación de un solo producto para la especie de interés; asimismo se evaluó su capacidad para la
formación de homodímeros, heterodímeros y horquillas. Después, se eligió el par más adecuado y se
adquirieron mediante el sistema de adquisición de oligonucleótidos personalizados de Sigma-Aldrich
©Merck KGaA. Una vez en el laboratorio se resuspendieron según las instrucciones del proveedor, se
probaron en el sistema verificando la amplificación única del material previsto con el software del
sistema (StepOne™ versión 2.3 de Life Technologies Corp.) y un gel de agarosa al 3% p/v en
amortiguador TBE con 0.5 mg/ml de EtBr como se muestra en la Figura 15.
Figura 15 Productos de amplificación de RT-qPCR de los oligonucleótidos diseñados. (1) Brg1/ SMARCA4; (2) Brm/ SMARCA2;
(3) Arid1b/BAF250b; (4) Arid2/BAF200; (5) BAF45a/PHD10; (6) Prdm3/Evi1; (7) CTBP2; (8) PRP0. Productos de amplificación
RT-qPCR en gel de agarosa al 2% (p/v) en TBE 1x, marcador de peso molecular MassRuler™ DNA Ladder Mix, ready-to-use,
©Thermo Fisher Scientific Inc.
Los datos obtenidos para la Ct de cada amplicón de interés se evaluaron según los métodos
del equipo StepOne™ versión 2.3 de Life Technologies con la metodología de 2-∆∆Ct utilizando como
referencia interna al gen constitutivo PR-P0 (según los métodos estándar de laboratorio; (Garcia-
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
52
Villegas et al., 2009). Además de la referencia correspondiente según el experimento, para establecer
las cinéticas de expresión se utilizó la expresión basal correspondiente de cada gen (valor al día 3 de
cultivo) según lo descrito en la Sección 8.1 y para los tratamientos con proteínas recombinantes se
utilizó la condición de medio basal, detallada posteriormente (ver Sección 8.4.2).
6.2.6 Extracción de proteínas totales
Se removió el medio de las cajas de cultivo y se lavaron dos veces con PBS frío. A continuación,
se les agregó el volumen suficiente de amortiguador RIPA (1ml por caja de 60 mm) que contenía coctel
inhibidor de proteasas cOmplete™ (No. Cat. 11836753001; Roche Applied Science, Alemania);
posteriormente se incubaron en frío durante 20 min para después raspar con gendarme y pasar a un
tubo Eppendorf de 1.5 ml. A continuación, se sonicó en hielo mediante 3 pulsos de 10 segundos (30
segundos totales), a una potencia de 30W. El sonicado se centrifugo 15 min a ~ 14 000 xg para hacer
una pastilla con los restos celulares, la cual se desechó. Se colectó el sobrenadante pasándolo a un
tubo nuevo, tomando una alícuota para determinación de la concentración de proteínas.
6.2.7 Cuantificación de proteínas
Se utilizó el método de Lowry (Lowry et al., 1951), teniendo como referencia concentraciones
conocidas de albumina bovina preparadas como diluciones seriadas a partir de una concentración
inicial de 1 mg/ml y los siguientes reactivos: PBS o amortiguador de lisis. Las determinaciones se
registraron a una longitud de onda de 750nm.
6.2.8 Fraccionamiento celular
Se obtuvieron extractos de núcleos y citoplasma mediante el protocolo de fraccionamiento
subcelular descrito por (Patten, 2016) publicado por abcam®
(“http://www.abcam.com/protocols/subcellular-fractionation-protocol” consulta de abril del 2018,
©1998-2018 Abcam plc.). Primero, se remueve el medio de cultivo de las cajas, y se lavan dos veces
con PBS frío. A continuación, se agregan 500 µl/caja de 60mm de amortiguador de fraccionamiento
HEPES 20mM pH 7.4 + Sacarosa 250mM + KCl 10mM + MgCl2 1.5mM + EDTA 1mM + EGTA 1mM + DTT
1mM + coctel inhibidor de proteasas cOmplete™. Se raspa con gendarme y se coloca en un tubo
Eppendorf de 1.5 ml enfriado previamente. A continuación, la muestra se lisa pasando por una jeringa
calibre 25 Ga al menos 15 veces y se incuba en hielo 20 minutos. Posteriormente las muestras se
centrifugan 5 min a 3000 rpm para separar los núcleos del extracto citoplasmático. El extracto
citoplasmático, que contiene lo restos de membrana celular, se transfiere a un tubo nuevo y se
almacena a -70°C hasta su uso. Subsecuentemente, la pastilla que contiene los núcleos se lava dos
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
53
veces con 500 µl de amortiguador de fraccionamiento, dispersando con pipeta y pasando 10 veces a
través de una jeringa 25 Ga, para centrifugar 10 min a 3000 rpm. A continuación, se descarta el
amortiguador y los núcleos se resuspenden en amortiguador de lisis estándar conteniendo 10% (v/v)
de glicerol 0.1% (p/v) de SDS. Finalmente, se sónica brevemente (3 segundos a 30W de potencia) en
hielo.
6.2.9 Coinmunoprecipitación
Los experimentos de coinmunoprecipitación se realizaron utilizando una adaptación al
protocolo de abcam© (2016) (“http://www.abcam.com/protocols/immunoprecipitation-protocol-1”,
consulta abril 2018, ©1998-2018 Abcam plc.). En forma breve, a la pastilla de núcleos congelada, se
resuspendió en amortiguador de lisis no desnaturalizante (20 mM Tris HCl pH 7.9, 137 mM NaCl, 10%
glicerol, 1% Nonidet P-40 (NP-40), 2 mM EDTA) al que se le agregó coctel inhibidor de proteasas
COMPLETE™. Posteriormente, se homogenizó con pipeta, se incubó con agitación constante 2h a 4°C
y el extracto se pasó por una jeringa calibre 25 Ga al menos 15 veces, y se incubó en hielo 10 minutos
y se sometió a un spin para precipitar los restos celulares. A continuación, 250 µg del extracto nuclear
se incubaron con 2 µg del anticuerpo indicado, completando a un volumen de 100 µl con PBS. Esta
suspensión se dejó en agitación toda la noche a 4°C, para posteriormente mezclarla con 15 l de perlas
magnéticas Dynabeads® Protein G previamente preparadas de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Después, se incubaron con agitación rotacional durante una hora a temperatura ambiente
para formar los complejos Dynabeads® Protein G + anticuerpo + proteína del extracto nuclear. En
siguiente término, los complejos se separaron de la suspensión mediante el uso de un imán y de ser
necesario un spin. La pastilla con el inmunoprecipitado se lavó dos veces con PBS + 0.1% (v/v) Tween
20. Finalmente, la pastilla de perlas se resuspendió con 10 µl de PBS a los que se le agregaron 20 µl de
amortiguador de carga para electroforesis Laemmli (Tris-HCl 62.5 mM pH 6.8, glicerol 25% (v/v), SDS
2% (p/v), azul de bromofenol 0.01% (p/v)), hirviéndose durante 10 minutos para separar el complejo
y las perlas. Las perlas magnéticas se separaron del sobrenadante mediante el uso de un imán y el
líquido se utilizó directamente para SDS-PAGE.
6.2.10 SDS-PAGE y Western blot
Se realizaron geles desnaturalizantes de acrilamida/bisacrilamida (30:1) al 12.5% o al 8%, para
separar las proteínas por peso molecular (Arndt et al., 2012). Las proteínas se desnaturalizaron al
mezclar con amortiguador Laemmli y hervir durante 10 min. Se cargaron 15 µg de proteína total por
muestra en las cinéticas de expresión. Los geles se corrieron en amortiguador (Tris 0.6% (p/v), Glicina
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
54
2.88% (p/v), SDS 0.1% (p/v)) a corriente constante de 15-45 mA/gel. A continuación, se realizó la
transferencia húmeda de las proteínas a membranas de PVDF activadas previamente con metanol
absoluto durante un minuto. Se utilizó amortiguador de transferencia húmeda Tris 25 mM, Glicina 192
mM, SDS 0.01% (p/v), Metanol 20%) en un sistema Mini Trans-Blot® de Bio-Rad Laboratories. La
transferencia se realizó a corriente constante ~ 100 mA a 4°C toda la noche. Tras la transferencia las
membranas se bloquearon con leche en polvo libre de grasa al 5% (p/v) en PBS + 0.1%(v/v) Tween 20,
durante al menos 2 horas. Se realizaron las incubaciones con los anticuerpos primario y secundario
correspondientes (Tabla 3). Entre cada una de las incubaciones, se realizaron 5 lavados de 10 min con
PBS + 0.1%(v/v) Tween 20. Finalmente, las membranas se revelaron con el sustrato
quimioluminiscente WesternSure® PREMIUM según las instrucciones del fabricante. Los resultados se
cuantificaron con el software Image Studio Versión 5.2.5 (©LI-COR, EUA, 2015).
Cuando fue necesario, se realizó un protocolo suave de stripping (abcam, 2017) para remover
los anticuerpos y reutilizar la membrana, utilizando el amortiguador de stripping suave glicina 1.5%
(p/v), SDS 0.1% (p/v), Tween 20 1% (v/v) en agua acidificada a pH 2.2. De manera posterior al stripping,
se siguió el protocolo de Western blot a partir del bloqueo.
6.3 Análisis Estadístico
Los datos se presentan como las medias más su desviación estándar. Se realizaron pruebas t de
Student para comparar dos grupos o ANOVA (p-valor < 0.05) seguida por prueba de Tukey para
comparar grupos experimentales cuando se indique significancia. Cada experimento se realizó al
menos tres veces, con excepción del experimento de coinmunoprecipitación que se realizó una sola
vez.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
55
7 RESULTADOS
7.1 Expresión de los componentes del complejo de remodelación de cromatina
BAF(SWI/SNF) durante la proliferación y diferenciación de las células
RCE1(5T5).
Considerando que la composición temporal y espacial del complejo de remodelación de
cromatina BAF se asocia tanto a cambios específicos en la capacidad de expresión génica relacionados
a la progresión del ciclo celular (Hah et al., 2010; Ruijtenberg & Van Den Heuvel, 2015), como a cambios
asociados con el carácter troncal (Kaeser et al., 2008), con el reprogramado de células (Kleger et al.,
2012), con la amplificación transitoria de poblaciones celulares que inician el proceso de diferenciación
(Eroglu et al., 2014b; Krasteva et al., 2012; Lamba et al., 2008) o con la expresión del fenotipo terminal
(Albini et al., 2015; He et al., 2010), exploramos los cambios en la expresión de los mensajeros que
codifican a las principales subunidades de los complejos remodeladores de cromatina BAF y cuya
expresión se ha asociado a procesos de diferenciación celular. Para ello, las células RCE1(5T5) se
cultivaron y diariamente se extrajo RNA total a partir del tercer día después de la siembra, para
determinar por RT-qPCR los niveles de expresión de los mensajeros correspondientes a lo largo de la
proliferación y diferenciación. Como controles del experimento, cultivos paralelos se tripsinizaron para
establecer el cambio en el número de células (Apéndice 1, Figura suplementaria 1); y con el propósito
de referir las curvas de expresión de estos mensajeros respecto a la expresión de marcadores
moleculares del proceso de diferenciación. En este caso, se emplearon como referencia el mRNA que
codifica al factor de transcripción Pax6, considerado como el gen maestro que enciende el programa
de diferenciación (Garcia-Villegas et al., 2009) y el mRNA del factor de transcripción Np63,
relacionado con el potencial proliferativo y la potencialidad de las células epiteliales (Di Iorio et al.,
2005; Pellegrini et al., 2001).
Al examinar la expresión de los mensajeros que codifican a Pax6 y Np63 , se observaron los
patrones típicos encontrados durante el crecimiento y la diferenciación del epitelio corneal. Mientras
Pax6 aumenta paulatinamente a partir del cuarto día de cultivo hasta alcanzar en el décimo día de
cultivo niveles 5 veces superiores a los detectados al inicio del experimento (ver Apéndice 1, Figura
suplementaria 2) siguiendo un comportamiento similar a la curva de proliferación de la población
celular, los niveles del mensajero de Np63 alcanzaron un máximo de 3 veces los valores de
expresión basal al alcanzarse la confluencia (6° día en cultivo), disminuyendo paulatinamente una vez
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
56
que las células estratifican y se diferencian terminalmente (Apéndice 1, Figura suplementaria 2). En
contraste, la expresión de los mensajeros de las ATPasas Brg1/SMARCA4 y Brm/SMARCA2, cuya
presencia en el complejo BAF es mutuamente excluyente, muestran un marcado aumento a partir del
día 3 de cultivo y alcanzan un máximo al estar los cultivos cercanos a la confluencia (5-6 día de cultivo;
ver Figuras 16 y 17), para luego disminuir y mantenerse en niveles estables, similares a los basales en
el caso de Brg1, y 3 veces superiores a los basales en el caso de Brm. En transcripción relativa a sus
niveles basales, mientras Brg1 aumenta sólo 2 veces entre los días 4 y 5 (Figura 16), Brm se incrementa
cerca de 10 veces entre los días 3 y 5 después de la siembra (Figura 17).
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Pax6 (n = 5)
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AR
CA
4 (
No
rma
liz
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a)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Brg1/SMARCA4 (n = 4)
Figura 16 Expresión de RNAm de Brg1/SMARCA4 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Durante el
cultivo se extrajo el RNA total diariamente a partir del tercer día de cultivo después de la siembra, se obtuvo cDNA y por RT-
qPCR se determinaron los niveles de expresión de los RNAm correspondientes. Se muestra la expresión promedio normalizada
al día 3 de cultivo con la desviación estándar calculada para al menos cuatro repeticiones biológicas en cada punto de BRG1
en verde. También se muestra el número de células (línea punteada) y la expresión de pax6 (línea roja) con fines de referencia,
consulte las Figuras suplementarias 1 y 2 para más información.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
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Días de cultivo celular
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A2
(N
orm
aliz
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0
2
4
6
8
10
12
Brm/SMARCA2 (n = 4)
Figura 17 RNAm de Brm/SMARCA2 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Durante el cultivo se extrajo
el RNA total diariamente a partir del tercer día de cultivo después de la siembra, se obtuvo cDNA y por RT-qPCR se
determinaron los niveles de expresión de los RNAm correspondientes. Se muestra la expresión promedio normalizada al día 3
de cultivo con la desviación estándar calculada para al menos cuatro repeticiones biológicas en cada punto de BRM en verde
seco. También se muestra el número de células (línea punteada) y la expresión de pax6 (línea roja) con fines de referencia,
consulte las Figuras suplementarias 1 y 2 para más información.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
58
Por otra parte se evalúo la subunidad BAF45a/PHF10, conocida por ser la variante de la familia
de genes presente en el complejo BAF durante la proliferación de progenitores neurales (npBAF); en
la transición de células troncales/progenitoras hacia neuronas postmitóticas (Lessard et al., 2007), así
como para el mantenimiento de células troncales hematopoyéticas, donde es una subunidad exclusiva
del complejo PBAF a diferencia de BAF45d que es exclusiva del complejo BAF (Krasteva et al., 2017).
Esta subunidad mostró una expresión ligeramente mayor durante la fase de crecimiento exponencial
en las células corneales cultivadas y disminuyó un 25% al estar los cultivos confluentes, para finalmente
reducirse aproximadamente a la mitad de su expresión al formarse un epitelio estratificado (Figura
18).
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10
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a)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0BAF45a / PHF10 (n = 4)
Figura 18 RNAm de BAF45a/PHF10 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Durante el cultivo se extrajo
el RNA total diariamente a partir del tercer día de cultivo después de la siembra, se obtuvo cDNA y por RT-qPCR se
determinaron los niveles de expresión de los RNAm correspondientes. Se muestra la expresión promedio normalizada al día 3
de cultivo con la desviación estándar calculada para al menos cuatro repeticiones biológicas en cada punto de BAF45a en azul
verde. También se muestra el número de células (línea punteada) y la expresión de pax6 (línea roja) con fines de referencia,
consulte las Figuras suplementarias 1 y 2 para más información.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
59
En siguiente término se estableció el patrón de expresión de los mensajeros que codifican a
las tres subunidades nucleares mutuamente excluyentes que determinan el tipo de complejo
remodelador de cromatina. Estas subunidades son dos de la misma familia Arid1a/BAF250a/SMARCF1
y Arid1b/BAF250b, que forman parte del complejo BAF; y Arid2/BAF200 que forma parte del complejo
PBAF.
En el caso de Arid1a/BAF250a, observamos que su expresión se incrementa aproximadamente
2.5 veces entre los días 5 y 6 de cultivo, que corresponden al período en el que las células inician la
formación de un epitelio estratificado, de manera casi simultánea con el aumento en la expresión de
Pax6. Posteriormente la expresión decae a sus niveles basales que se mantienen prácticamente hasta
el 9-10 día en cultivo (Figura 19).
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0.0
0.5
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1.5
2.0
2.5
3.0Arid1a / BAF250a (n = 4)
Figura 19 RNAm de Arid1a/BAF250a y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Durante el cultivo se extrajo
el RNA total diariamente a partir del tercer día de cultivo después de la siembra, se obtuvo cDNA y por RT-qPCR se
determinaron los niveles de expresión de los RNAm correspondientes. Se muestra la expresión promedio normalizada al día 3
de cultivo con la desviación estándar calculada para al menos cuatro repeticiones biológicas en cada punto de
Arid1a/BAF250a en rosa. También se muestra el número de células (línea punteada) y la expresión de pax6 (línea roja) con
fines de referencia, consulte las Figuras suplementarias 1 y 2 para más información.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
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Arid1b /BAF250b (n = 3)
Figura 20 RNAm de Arid1b/BAF250b y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Durante el cultivo se extrajo
el RNA total diariamente a partir del tercer día de cultivo después de la siembra, se obtuvo cDNA y por RT-qPCR se
determinaron los niveles de expresión de los RNAm correspondientes. Se muestra la expresión promedio normalizada al día 3
de cultivo con la desviación estándar calculada para al menos cuatro repeticiones biológicas en cada punto de
Arid1b/BAF250b en café. También se muestra el número de células (línea punteada) y la expresión de pax6 (línea roja) con
fines de referencia, consulte las Figuras suplementarias 1 y 2 para más información.
Por otro lado, Arid1b/BAF250b y Arid2/BAF200 presentaron cambios de magnitud superior en
su expresión. Mientras que BAF250b aumentó 5.5 veces entre el día 3 y el día 6 de cultivo para luego
decaer a niveles basales el día 10 después de la siembra (Figura 20), BAF200 mostró un cambio muy
marcado entre los días 3 y 6 de cultivo, alcanzando niveles máximos el día 6, cuando se encontraron
niveles de transcripción correspondientes a un incremento de 10 veces los detectados el día 3 de
cultivo cuando las células aún estaban en su fase de crecimiento exponencial (Figura 21).
Subsecuentemente, a partir de día 7 los niveles de Arid2/BAF200 disminuyeron y se mantuvieron en
niveles 4 veces superiores a los iniciales hasta finalizar el experimento (Figura 21).
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
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20
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0
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Arid2 / BAF200 (n = 3)
Figura 21 RNAm de Arid2/BAF200 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Durante el cultivo se extrajo el
RNA total diariamente a partir del tercer día de cultivo después de la siembra, se obtuvo cDNA y por RT-qPCR se determinaron
los niveles de expresión de los RNAm correspondientes. Se muestra la expresión promedio normalizada al día 3 de cultivo con
la desviación estándar calculada para al menos cuatro repeticiones biológicas en cada punto de Arid2/BAF200 en azul.
También se muestra el número de células (línea punteada) y la expresión de pax6 (línea roja) con fines de referencia, consulte
las Figuras suplementarias 1 y 2 para más información.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
62
7.1.1 Expresión de metiltransferasas de histonas durante la proliferación y diferenciación de
las células RCE1(5T5).
Considerando que las familias de metiltransferasas de histonas participan en el mantenimiento
de la integridad estructural de la heterocromatina (Harms et al., 2015; Pinheiro et al., 2012), así como
en el control de la expresión genética durante el desarrollo (Y. Chen et al., 2016; Horn et al., 2011;
Watanabe & Murakami, 2016), la diferenciación (Bi et al., 2014; Ding et al., 2013; Frühbeck et al., 2009;
Khani et al., 2017; Lussi et al., 2016) y la expresión del fenotipo terminal (Benitez et al., 2014; Harms
et al., 2014), establecimos las cinéticas de expresión de PRDM3 y PRDM16 durante la proliferación y
diferenciación de las células RCE1(5T5) mediante RT-qPCR. Como se muestra en la Figura 22, la
expresión de Prdm3 aumentó a los días 5 y 6 de cultivo, que corresponden al momento en que las
células alcanzan la confluencia; encontrándose un máximo el día 5 de cultivo, cuando se llegó a niveles
de expresión 2.5 veces superiores a los niveles basales detectados el día 3 posterior a la siembra.
Posteriormente su expresión se redujo hasta niveles menores a los basales cuando los epitelios se
encuentran completamente estructurados (día 10 después de la siembra) (Figura 22).
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2.0
2.5
3.0Prdm3 / EVI1 (n = 5)
Figura 22 RNAm de Prdm3/Evi1 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Durante el cultivo se extrajo el
RNA total diariamente a partir del tercer día de cultivo después de la siembra, se obtuvo cDNA y por RT-qPCR se determinaron
los niveles de expresión de los RNAm correspondientes. Se muestra la expresión promedio normalizada al día 3 de cultivo con
la desviación estándar calculada para al menos cuatro repeticiones biológicas en cada punto de PRDM3 en azul claro. También
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
63
se muestra el número de células (línea punteada) y la expresión de pax6 (línea roja) con fines de referencia, consulte las
Figuras suplementarias 1 y 2 para más información.
Por otra parte, al medir los niveles de expresión de PRDM16, se encontró un comportamiento
similar al de PRDM3, observándose que el aumento en los niveles del mensajero correspondiente
ocurrió entre los días 5 y 6 después de la siembra; y un incremento máximo de 3 veces los niveles
basales se tuvo al día 6 de cultivo. Cabe mencionar que en el caso de Prdm16, se presentó una
disminución abrupta los días 7, 8 y 9 de cultivo hasta alcanzar niveles dos veces superiores a los
detectados al inicio del experimento (Figura 23). Finalmente, el mRNA de Prdm16 aumentó
nuevamente hasta 3 veces los niveles iniciales (Figura 23).
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Prdm16 (n = 4)
Figura 23 RNAm de Prdm16 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Durante el cultivo se extrajo el RNA
total diariamente a partir del tercer día de cultivo después de la siembra, se obtuvo cDNA y por RT-qPCR se determinaron los
niveles de expresión de los RNAm correspondientes. Se muestra la expresión promedio normalizada al día 3 de cultivo con la
desviación estándar calculada para al menos cuatro repeticiones biológicas en cada punto de PRDM3 en azul claro. También
se muestra el número de células (línea punteada) y la expresión de pax6 (línea roja) con fines de referencia, consulte las
Figuras suplementarias 1 y 2 para más información.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
64
Adicionalmente, se evaluó CtBP2 (C-terminal binding protein 2) una proteína de represión
transcripcional que recluta a las metiltransferasas PRDM3 y PRDM16, junto con otras proteínas para
formar complejos represores y así ejercer su efecto (Stankiewicz et al., 2014). Este reclutamiento es
posible gracias a que PRDM3 y PRDM16 contienen dominios de unión a esta familia de proteínas (Di
Zazzo et al., 2013). Además, las CtBP participan en la regulación de la proliferación y supervivencia
celular (Touitou et al., 2001; Zhao et al., 2014). En el cultivo de epitelio corneal, se observó que la
expresión de mensajero de esta proteína prácticamente no se modifica, ya que su expresión máxima
alcanzada el día 7 de cultivo, es apenas 1.3 veces el valor basal no encontrándose diferencias
significativas. Sin embargo, cuando las células se encuentran terminalmente diferenciadas formando
un epitelio (día 10), la expresión se deprimió aproximadamente a un 50% del valor basal como se
observa en la Figura 24.
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TB
P2
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0.0
0.5
1.0
1.5
2.0CTBP2 (n = 4)
Figura 24 RNAm de CTBP2 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Durante el cultivo se extrajo el RNA
total diariamente a partir del tercer día de cultivo después de la siembra, se obtuvo cDNA y por RT-qPCR se determinaron los
niveles de expresión de los RNAm correspondientes. Se muestra la expresión promedio normalizada al día 3 de cultivo con la
desviación estándar calculada para al menos cuatro repeticiones biológicas en cada punto de CTBP2 en azul claro. También
se muestra el número de células (línea punteada) y la expresión de pax6 (línea roja) con fines de referencia, consulte las
Figuras suplementarias 1 y 2 para más información.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
65
7.2 Cinéticas de expresión de proteínas de Pax6, BRM, Brg1 y Prdm16
Con el propósito de definir si los cambios en la expresión de los mensajeros que codifican para
el factor Pax6, así como para las ATPasas Brg1 y BRM, y la metiltransferasa de histonas Prdm16
corresponden a cambios en los niveles de las proteínas respectivas. Se obtuvieron diariamente
extractos de proteínas totales de los cultivos, abarcando desde la etapa proliferativa y hasta la
diferenciación de las células epiteliales. Estos extractos fueron procesados mediante electroforesis en
geles de poliacrilamida-SDS e inmunotransferidos para determinar la cantidad de proteína por
inmunotinción con los anticuerpos respectivos. Como era de esperarse, en el caso del factor de
transcripción Pax6, propuesto como la proteína cuya expresión dirige el programa de diferenciación
del epitelio corneal (García-Villegas et al., 2009), los niveles aumentaron de manera constante a partir
del 4 día de cultivo, alcanzando un máximo al finalizar el experimento (Figura 25) con un aumento de
cerca de 80 veces la cantidad relativa de proteína basal cuando se ha constituido un epitelio
estratificado con 4 o 5 capas de células (día 10).
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40
60
80
Pax6
Figura 25 Proteínas totales: expresión de PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Se cultivaron cajas de
células RCE-5T5, a partir del tercer día de cultivo se extrajo una caja 24 h y se obtuvieron extractos de proteínas totales, las
muestras se cuantificaron y se cargaron en un gel desnaturalizante SDS-PAGE al 12%. Posteriormente se transfirieron a
membranas de PVDF y se realizó la inmunotinción con el anticuerpo correspondiente y su control de carga, actina. Se
realizaron al menos cuatro repeticiones, se cuantificaron y se muestran los promedios para cada día junto con su desviación
estándar para PAX6 en rojo. La línea punteada indica la cantidad de células según el Apéndice 1 Figura suplementaria 1.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
66
Por otra parte, la cantidad de la ATPasa Brg1 aumentó cerca de dos veces los niveles basales
(Figura 26), siguiendo una cinética similar a la expresión de su RNA mensajero, con un máximo a los 5
días en cultivo, para luego decrecer a los niveles encontrados al inicio del experimento (Figura 26).
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2.0
2.5
3.0Brg1
Nú
me
ro d
e c
élu
las
105
106
107
No. de células
Ex
pre
sió
n d
e P
ax
6 (N
orm
aliz
ad
a)
0
20
40
60
80Pax6
Figura 26 Proteínas totales: expresión de Brg1 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Se cultivaron cajas
de células RCE-5T5, a partir del tercer día de cultivo se extrajo una caja 24 h y se obtuvieron extractos de proteínas totales,
las muestras se cuantificaron y se cargaron en un gel desnaturalizante SDS-PAGE al 12%. Posteriormente se transfirieron a
membranas de PVDF y se realizó la inmunotinción con el anticuerpo correspondiente y su control de carga, actina. Se
realizaron al menos cuatro repeticiones, se cuantificaron y se muestran los promedios para cada día junto con su desviación
estándar para BRG1 en verde y PAX6 en rojo como marcador. La línea punteada indica la cantidad de células según el Apéndice
1 Figura suplementaria 1.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
67
Para la ATPasa BRM se encontró que la cantidad de proteína sólo aumentó cerca de dos veces
los niveles encontrados en el día 3 de cultivo (Figura 27), contrastando con el aumento pronunciado
del mensajero que la codifica, cuyos niveles aumentaron cerca de 10 veces (ver Figura 17). No
obstante, la cantidad de repeticiones biológicas no fue suficiente para obtener datos medios
confiables, como lo muestran las barras de desviación estándar de cada punto, principalmente a partir
del día 6 (Figura 27).
Nú
me
ro d
e c
élu
las
105
106
107
No. de células
Ex
pre
sió
n d
e P
ax
6 (N
orm
aliz
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a)
0
20
40
60
80Pax6
Días de cultivo celular
0 2 4 6 8 10 12
Ex
pre
sió
n d
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RM
(N
orm
aliz
ad
a)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0BRM
Figura 27 Proteínas totales: expresión de BRM y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Se cultivaron cajas
de células RCE-5T5, a partir del tercer día de cultivo se extrajo una caja 24 h y se obtuvieron extractos de proteínas totales,
las muestras se cuantificaron y se cargaron en un gel desnaturalizante SDS-PAGE al 12%. Posteriormente se transfirieron a
membranas de PVDF y se realizó la inmunotinción con el anticuerpo correspondiente y su control de carga, actina. Se
realizaron al menos cuatro repeticiones, se cuantificaron y se muestran los promedios para cada día junto con su desviación
estándar para BRM en verde seco y PAX6 en rojo como marcador. La línea punteada indica la cantidad de células según el
Apéndice 1 Figura suplementaria 1.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
68
Finalmente, al evaluar los niveles de la proteína PRDM16 encontramos un aumento de 6 veces
a partir del valor basal en el momento en que las células inician la estratificación una vez que se alcanza
la confluencia en cultivo (Figura 28). Cabe señalar que el patrón de expresión de la proteína concuerda
con el RNA mensajero que la codifica en temporalidad. Sin embargo, en magnitud la proteína alcanza
valores equivalentes a 6 veces el basal en comparación con las 3 veces que aumenta el mensajero (ver
Figura 23).
No
. de
cé
lula
s
105
106
107
No. de células
Días de cultivo celular
0 2 4 6 8 10 12
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8.0Prdm16
0 2 4 6 8 10 12
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pre
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ax
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aliz
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0
20
40
60
80Pax6
Figura 28 Proteínas totales: expresión de Prdm16 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Se cultivaron
cajas de células RCE-5T5, a partir del tercer día de cultivo se extrajo una caja 24 h y se obtuvieron extractos de proteínas
totales, las muestras se cuantificaron y se cargaron en un gel desnaturalizante SDS-PAGE al 12%. Posteriormente se
transfirieron a membranas de PVDF y se realizó la inmunotinción con el anticuerpo correspondiente y su control de carga,
actina. Se realizaron al menos cuatro repeticiones, se cuantificaron y se muestran los promedios para cada día junto con su
desviación estándar para Prdm16 en azul marino y PAX6 en rojo como marcador. La línea punteada indica la cantidad de
células según el Apéndice 1 Figura suplementaria 1.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
69
7.3 Análisis de la composición de los complejos remodeladores de cromatina
por coinmunoprecipitación.
Una vez establecido el patrón de expresión de las principales subunidades de los complejos
remodeladores de cromatina, y tomando en cuenta que éstos complejos cambian de composición
durante el proceso de diferenciación (Ho & Crabtree, 2010; Yoo & Crabtree, 2009), a continuación
exploramos el cambio en la composición de los complejos durante el crecimiento y la diferenciación
de las células de epitelio corneal. Para ello, se llevaron a cabo experimentos de coinmunoprecipitación
con extractos nucleares obtenidos de cultivos de células RCE1(5T5) a los 3, 5, 6 y 10 días después de la
siembra. Estos tiempos corresponden a las tres etapas del programa de diferenciación identificadas:
cultivos proliferativos “no diferenciados” (3 días después de la siembra); cultivos confluentes que han
iniciado el programa de diferenciación (5 y 6 días); y cultivos diferenciados, consistentes en epitelios
estratificados compuestos por 4 o 5 capas de células (10 días). En estos experimentos, la
inmunoprecipitación se llevó a cabo con un anticuerpo dirigido contra la ATPasa BRM, o con un
anticuerpo dirigido contra la ATPasa Brg1. La identidad del material que coinmunoprecipitó se
determinó en experimentos de Western blot mediante anticuerpos dirigidos contra las proteínas
BAF155, BAF47 y BAF170, que son componentes del núcleo de los complejos BAF y PBAF, además, con
anticuerpos contra la proteína Arid1a que es característica del complejo BAF, y con anticuerpos
dirigidos contra el factor de transcripción Pax6.
Como se observa en la Figura 29, los componentes núcleo de los complejos remodeladores de
cromatina se encuentran en los precipitados obtenidos con anticuerpos dirigidos contra Brg-1 o contra
BRM a lo largo del crecimiento y la diferenciación de las células de epitelio corneal de conejo. Es
notable que coexisten al menos dos tipos de complejo remodelador de cromatina; el primero está
constituido por la ATPasa Brg1 y las subunidades Arid1a/BAF250a, BAF170, BAF155 y BAF47, y el
segundo por la ATPasa BRM y las subunidades Arid1a/BAF250a, BAF170, BAF155 y BAF47. Ambos tipos
de complejo se expresaron principalmente durante la fase proliferativa y en el momento en que las
células alcanzan la confluencia (5° día de cultivo). Posteriormente, a partir del 6° día de cultivo, parecen
disminuir los niveles de ambos complejos (Figura 29). Una de las subunidades que mostró mayor
variación en ambos casos fue Arid1a, que mostró niveles mayores en cultivos
preconfluentes/confluentes, para disminuir al 6° día, y desaparecer casi por completo en el complejo
asociado a Brg1. En contraste, el complejo asociado a BRM tuvo su mayor expresión al día 10 en cultivo
(Figura 29).
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
70
Figura 29 Coinmunoprecipitación de las subunidades núcleo de los complejos BAF/PBAF por sus ATPasas. Se sembraron
cajas de 60mm en condiciones normales de cultivo, a partir del día 3 y en los días 5, 6 y 10 se tomó una muestra adecuada y
se procesó para separar los núcleos del resto de la célula y extraer sus proteínas. Después de cuantificar proteína, se tomaron
300 µg de extracto nuclear y se incubaron con 2 µg de anticuerpo (antí-Brg1 o anti-BRM según corresponda) toda la noche a
4°C. Posteriormente el complejo Ag-Ab se atrapó con 15 µl de perlas magnéticas ligadas a proteína G Dynabeads® a
temperatura ambiente durante 30 min. El complejo se precipito con un imán para separar el precipitado y sobrenadante, el
precipitado se resuspendió en 20 µl de amortiguador Laemmli + 30 µl de PBS, se procedió a hervir la muestra y continuar con
SDS-PAGE y western blot contra los anticuerpos que se muestran en la figura. Los sobrenadantes de la precipitación se
corrieron simultáneamente (WB) para verificar que la mayoría de la proteína se mantuviera en el precipitado (resultados no
mostrados). Se muestran imágenes de western blots realizados por separado por lo cual la exposición en el revelado varía. Se
muestran las imágenes para una sola repetición biológica de ambas precipitaciones, la imagen puede no ser representativa.
Mientras que, BAF47 mostró tener niveles altos en cada uno de los complejos y en los tiempos
de cultivo examinados (Figura 29), así como BAF 155 mantuvo niveles bajos en todas las condiciones
ensayadas (Figura 29). Asimismo, parece que BAF170 disminuyó para el 10 día de cultivo, cuando el
cultivo se ha constituido como un epitelio estratificado. De manera muy interesante, se observó que
Pax6 coinmunoprecipitó con el complejo asociado a Brg1, sugiriendo que este complejo tiene una
actividad biológica importante para el desarrollo del programa de diferenciación; por otro lado, esta
interacción no se observó al precipitar con BRM (Figura 29). Asimismo, los resultados sugieren que
ambos complejos remodeladores de cromatina se requieren para la activación del programa de
diferenciación, la cual ocurre alrededor del 5to y 6to día en cultivo.
n = 1
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
71
7.4 Efecto de la activación de la vía de NOTCH sobre la expresión de los
complejos remodeladores de cromatina BAF y PBAF, y de las
metiltransferasas de histonas, PRDM3 y PRDM16.
Los resultados anteriores nos sugieren que tanto los componentes clave de los complejos
remodeladores BAF y PBAF, como las metiltransferasas de histonas podrían cumplir una función
relevante en la progresión de la diferenciación de la línea celular RCE1 (5T5), ya que sus patrones de
expresión revelan un aumento en la actividad de estos elementos al 5 y/o 6 día de cultivo, cuando se
inicia la expresión de los marcadores asociados a la diferenciación terminal, en especial PAX6 con el
que pueden establecer una interacción proteína-proteína (He et al., 2010; He & Cvekl, 2012; Jaglin &
Fishell, 2013; Ninkovic et al., 2013). Los componentes epigenéticos examinados sufren cambios que
sugieren una coordinación con la expresión del marcador de proliferación epitelial Np63 (Pellegrini
et al., 2001). Éstos parecen desencadenarse en el momento que el cultivo alcanza la confluencia,
implicando al establecimiento de contactos célula-célula como un requisito para iniciar la
estratificación.
Uno de los sistemas activados por contacto es la vía de señalización de NOTCH, la cual participa
en la diversificación de las neuronas del sistema olfatorio en Drosophila (Endo et al., 2011), así como
también, junto con el factor de transcripción p63, en la regulación de la autorenovación y
diferenciación de los queratinocitos epidermales de ratón y de humano, (Nguyen et al., 2005).
Tomando en cuenta los numerosos reportes que demuestran interacciones entre elementos de la vía
de Notch, los complejos remodeladores de la cromatina y las metiltransferasas de histonas, en
siguiente término evaluamos el efecto de estimular a las células RCE1(5T5) con las formas
recombinantes solubles de Notch y de sus ligandos Jagged y Delta.
Para determinar la concentración óptima del ligando o receptor recombinante necesarios en
estos experimentos las células se alimentaron a partir del primer día en cultivo con medio
suplementado con una baja concentración de suero (ver Métodos), y concentraciones crecientes de
las formas solubles recombinantes del receptor o ligando correspondiente (ver Tabla 4 para más
detalles sobre estas proteínas recombinantes). Las células RCE1(5T5) se estimularon con 10, 25, 50,
100 o 200 ng/ml de la forma recombinante soluble de alguno de los ligandos Jagged-2, Delta-1 y Notch-
1. Cultivos paralelos se mantuvieron en el medio basal sin ningún factor añadido (control, sin EGF), y
otros se suplementaron con medio al que se le añadieron 10 ng/ml de EGF, condición que promueve
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
72
la mayor respuesta proliferativa de las células epiteliales (testigo positivo). Se realizó cambio de medio
cada tercer día y a los 4 o 5 días después de la siembra, antes de que el cultivo alcanzara confluencia,
los cultivos se fijaron y tiñeron con Rodamina B.
Como se observa en la Figura 30a, cuando la forma recombinante de Jagged-2 de ratón
(rmJagged-2) se añadió a una concentración de 200 ng/ml, inhibió un 30% la proliferación de las células
RCE1(5T5), respecto a los cultivos control que se mantuvieron en medio basal sin aditivos y contrastó
con el incremento del 30% observado en aquellos cultivos estimulados con 10 ng/ml de EGF (Figura
30a), ambos estadísticamente significativos. En contraste, la estimulación con la forma recombinante
soluble de Notch-1 de humano (rhNotch-1) incrementó aproximadamente un 20% la proliferación de
las células epiteliales corneales cuando se añadió a concentraciones de 200 ng/ml (Figura 30b); no
obstante, este efecto no fue significativo. Por otra parte, los ligandos tipo Delta-1 (DLL-1)
(a) (b)
Figura 30 Efecto de las proteínas recombinantes rhNotch-1 y rmJagged-2 sobre la proliferación celular. (a) Tratamientos
con Jagged-2 recombinante de ratón; (b) Tratamientos con Notch-1 recombinante de humano. Además, se muestran el testigo
negativo (medio basal) y el testigo positivo (medio con EGF [10 ng/ml]). Todos los experimentos se llevaron a cabo en
condiciones de bajo suero. Se incluye una fotografía representativa del experimento en cajas de 24 pozos y la cantidad de
repeticiones biológicas por experimento, se utilizaron pozos con únicamente células alimentadoras como control basal del
color. Las cajas se procesaron según la metodología de tinción con rodamina B. En los gráficos de barras las líneas de error
indican la desviación estándar calculada entre repeticiones biológicas y el color muestra la concentración del tratamiento
(entre más claro, menor es la concentración). Finalmente, se realizó un ANOVA (p-valor < 0.005) seguida por una prueba de
Tukey para determinar significancia estadística por pares la cual se indica con asterisco. En (a) tanto 200 ng/ml como el control
proliferativo (c/EGF) son significativamente diferentes al resto de las barras, además existe una diferencia significativa entre
la dosis de 100 ng/ml y 10 ng/ml, el resto de las comparaciones pareadas no fueron significativas. En (b) no hubo diferencias
estadísticamente significativas.
*
* *
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
73
recombinantes de humano (rhDLL-1) y de rata (rrDLL-1) no tuvieron efecto significativo respecto a los
cultivos control (resultados que no se muestran). Cabe señalar que el comportamiento observado al
estimular a las células con el ligando Jagged-2 es similar al descrito previamente en nuestro laboratorio
para Jagged-1 (Mata-Lozano, 2012). En ese caso, Jagged-1 inhibió de manera dependiente de la
concentración la proliferación de las células epiteliales corneales al estimular la expresión del
programa de diferenciación, y alcanzando un 70% de inhibición cuando las células se estimularon con
200 ng/ml de este ligando (Mata-Lozano, 2012).
Con base en estos resultados, en los experimentos subsecuentes se analizaron los cambios en
la expresión de los elementos de interés gracias a los estímulos de las poblaciones celulares con 200
ng/ml de cada una de estas proteínas recombinantes (rmJagged2, rhNotch1, rrNotch1 y rrJagged1).
7.4.1 Los ligandos y receptores de la vía de Notch, modulan la expresión de Prdm16 y no así
la expresión de BAF250a,b /Arid1a,b y BAF200/Arid2.
Considerando que la activación de la vía de Notch promueve la diferenciación terminal de la
epidermis (Blanpain, Lowry, Pasolli, & Fuchs, 2006; Lowell, Jones, Le Roux, Dunne, & Watt, 2000;
Rangarajan et al., 2001), así como la diferenciación del epitelio corneal cuando éste es activado por
Jagged1 (Djalilian et al., 2008; Mata-Lozano, 2012) es posible que esta vía participe el establecimiento
del destino celular (Vauclair et al., 2007), y regule a la población de células troncales de la córnea (Li
et al., 2007). Por ello, nos planteamos establecer el efecto de la estimulación de la vía de Notch por el
receptor Notch soluble o sus ligandos sobre la expresión de componentes específicos del complejo de
remodelación de cromatina BAF y sobre la expresión de las metiltransferasas de histonas. Para ello,
las células RCE1(5T5) se estimularon, a partir del primer día después de la siembra con 200ng/ml de
rrNotch-1, rhNotch-1 ó Jagged-1 (ver Métodos). Cultivos paralelos, se suplementaron con medio basal
sin ningún aditivo o con medio suplementado con 10 ng/ml de EGF. Cuando los cultivos estuvieron
preconfluentes (4to día de cultivo), se extrajo el RNA total, y se determinó por RT-qPCR (ver Materiales
y Métodos), la expresión de los mensajeros que codifican a las proteínas Arid1a/BAF250a,
Arid1b/BAF250b, Arid2/BAF200 y a la metiltransferasa de histonas Prdm16. Para correlacionar los
niveles de estos mensajeros con el grado de diferenciación de los cultivos, también se determinó la
expresión del factor de transcripción Pax6, postulado como gen maestro del programa de
diferenciación del epitelio corneal (Garcia-Villegas et al., 2009; Sasamoto et al., 2016), y de la
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
74
citoqueratina 3 (KRT3), cuya expresión está ligada al fenotipo terminal (T. Chen et al., 1997; Schermer
et al., 1986).
Figura 31 Cambios en la expresión de RNAm de (a)Pax6 y (b)K3 promovidos por las formas recombinantes solubles de
Notch-1 y Jagged-1. Después de 4 días, se extrajo el RNA de cultivos paralelos tratadas con 200 ng/ml de Notch-1 de rata
(rrNotch-1), Notch-1 de humano (rhNotch-1), y Jagged-1 de rata (rr-Jagged-1). Los controles correspondientes consistieron en
células cultivadas en presencia de 10 ng/ml de EGF, o medio basal sin aditivos (s/EGF). Se cuantificó la expresión por RT-qPCR
y se normalizó al medio basal (s/EGF). Posteriormente se realizó un ANOVA (p-valor < 0.005) seguida por una prueba de Tukey
para determinar significancia estadística por pares la cual se indica con asterisco sobre la línea que compara dos barras. Las
barras representan los promedios más la desviación estándar de al menos 3 repeticiones biológicas. Los colores indican los
diferentes tratamientos.
(b)
(a)
(b)
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
75
Como se observa en la Figura 31, el tratamiento con la forma soluble del receptor de Notch-1
de rata o de humano disminuyó significativamente la expresión de Pax6 en un 50% respecto a los
cultivos control estimulados con EGF o que no recibieron ningún estímulo (Figura 31a). En contraste,
el tratamiento con estas formas solubles promovió la expresión de la citoqueratina 3 (KRT3), cuyos
niveles fueron superiores a los encontrados en los cultivos no tratados (cambio no significativo) y 4
veces superiores comparados con la muestra estimulada con EGF (diferencia significativa) (Figura 31b).
Por otro lado, Jagged1 promovió una ligera disminución (no significativa) en la expresión de Pax6 y de
KRT3 respecto al control que no recibió tratamiento alguno (Figura 31a y b). Es importante señalar que
la estimulación con 10 ng/ml EGF provocó una disminución del 50% en la expresión de KRT3, como se
ha reportado previamente tanto a nivel de mensajero como de proteína; mientras que no tuvo efecto
en la expresión de Pax6 (Figura 31a y b). Posteriormente, también se examinó el efecto de estimular
con 200 ng/ml de rrNotch-1, rhNotch-1 o rrJagged-1, sobre la expresión de los mensajeros que
codifican a Arid1a/BAF250a, Arid1b/BAF250b, Arid2/BAF200, proteínas que determinan la identidad
de los complejos BAF y PBAF.
Figura 32 Cambios en la expresión de RNAm de Arid1a/BAF250a, Arid1b/BAF250b y Arid2/BAF200 promovidos por las
formas recombinantes solubles de Notch-1 y Jagged-1. 4 días después de la siembra, se extrajo el RNA de cultivos paralelos
tratados con 200 ng/ml de la proteína recombinante soluble correspondiente. Los controles consistieron en cultivos paralelos
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
76
suplementados con medio basal que contenía o no 10 ng/ml de EGF. Se cuantificó la expresión de Arid1a/BAF250a,
Arid1b/BAF250b y Arid2/BAF200 por RT-qPCR y se normalizó utilizando como referencia a los cultivos mantenidos en medio
basal (s/EGF). Posteriormente se realizó un ANOVA (p-valor < 0.005) seguida por una prueba de Tukey para determinar
significancia estadística por pares la cual se indica con asterisco sobre la línea que compara dos barras. Las barras representan
los promedios más la desviación estándar de al menos 3 repeticiones biológicas. Los colores indican los diferentes
tratamientos. Para Arid1b/BAF250b y Arid2/BAF200 no se probaron los tratamientos con rrNotch-1.
Como se aprecia en la Figura 32, ninguno de los tratamientos, provocó diferencias
significativas en la expresión de los mensajeros que codifican a estas proteínas en comparación con el
control suplementado con medio basal sin aditivos, o el control suplementado con EGF (Figura 32).
Estos resultados sugieren que estas subunidades no responden directamente a la estimulación de la
vía de Notch. Considerando que estas subunidades son estructuralmente necesarias para que se
ensamblen los complejos remodeladores de cromatina (Clapier & Cairns, 2009), es factible descartar
que los complejos BAF/PBAF se encuentren bajo el control de la vía de Notch.
Por otro lado, considerando que en experimentos anteriores PRDM16 fue la metiltransferasa
de histonas más abundante y con cambios más dramáticos durante el crecimiento y diferenciación de
las células RCE1(5T5), analizamos si la expresión del mensajero que codifica para esta enzima se
modifica por la estimulación con las formas recombinantes solubles rrNotch-1, rhNotch-1 o rrJagged-
1. De manera interesante, mientras la estimulación de las células con EGF promovió un aumento no
significativo, de un 50% en la expresión de PRDM16 (ver Figura 33), la adición de rrNotch1, incrementó
cerca de 25 veces la expresión de la metiltransferasa de histonas (Figura 33). De manera similar, un
aumento de alrededor de 18 veces se obtuvo cuando se utilizó la forma soluble de Notch humana
(rhNotch1; Figura 33, P<0.005). Este resultado contrasta con los cultivos estimulados con la forma
soluble del ligando Jagged-1, en donde no se observó cambio significativo (Figura 33). Estos resultados
apoyan la posibilidad de que las metiltransferasas de histonas son reguladas por la vía de NOTCH, lo
cual sugiere que el contacto célula-célula desencadena modificaciones en la heterocromatina
constitutiva y, por lo tanto, altera la disponibilidad transcripcional de secuencias genéticas específicas.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
77
Figura 33. Cambios en la expresión de los RNAm de Prdm16 y marcadores de diferenciación K3 y Pax6 promovidos por las
formas recombinantes solubles de Notch-1 y Jagged-1. 4 días después de la siembra, se extrajo el RNA de cultivos paralelos
tratadas con 200 ng/ml de rrNotch-1, rhNotch-1 y rrJagged-1. Los controles correspondientes consistieron en cultivos
paralelos mantenidos con (medio basal, o suplementados con medio al que se le añadieron 10 ng/ml de EGF. Se cuantificó la
expresión por RT-qPCR y se normalizó al medio basal (s/EGF). Posteriormente se realizó un ANOVA (p-valor < 0.005) seguida
por una prueba de Tukey para determinar significancia estadística por pares la cual se indica con asterisco sobre la línea que
compara dos barras. Las barras representan los promedios más la desviación estándar de al menos 3 repeticiones biológicas.
Los colores indican los diferentes tratamientos.
La comparación entre los resultados obtenidos para los distintos genes (Figura 33) sugiere que las
metiltransferasas de histonas aumentan su expresión cuando se inicia el proceso de diferenciación, o
bien, cuando las células son estimuladas con agentes que promueven cambios en la expresión del
estado diferenciado posteriores al contacto celular. En contraste, los complejos BAF no parecen
modificarse bajo las diferentes condiciones ensayadas.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
78
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
79
8 DISCUSIÓN
Hasta ahora, numerosos estudios de diferentes grupos de investigación permitieron establecer
que la diferenciación del epitelio corneal es controlada por una compleja red de factores de
transcripción entre los que destaca Pax6, que funciona como un gen maestro que determina la
expresión de todo el programa de diferenciación (Garcia-Villegas et al., 2009; Kitazawa et al., 2017;
Sasamoto et al., 2016a). Sin embargo, la evidencia acumulada también sugiere que otros mecanismos
de control operan para generar características mucho más finas del fenotipo terminalmente
diferenciado y la correcta expresión del fenotipo terminal (Adhikary et al., 2005, 2004; Banks et al.,
1999; T. Chen et al., 1997; Gingras et al., 2003). Como parte de esta regulación fina existen preguntas
que aún no somos capaces de contestar. ¿Por qué la expresión del fenotipo terminalmente
diferenciado se puede modificar con distintos factores? ¿Cómo algunas colecciones o grupos de genes
se inactivan de manera coordinada y otros se encienden siguiendo secuencias específicas? ¿Por qué la
determinación hacia un linaje específico es irreversible? ¿La estructura tridimensional del genoma
participa activamente en la regulación de la expresión genética? ¿Quién programa a las células
troncales hacía un fenotipo terminal, los factores de transcripción maestros, los complejos
remodeladores que modifican la capacidad transcripcional del genoma, o ambos?
Hasta ahora, los resultados de diferentes grupos hacen evidente que los procesos de
diferenciación y de desarrollo no sólo se deben a la existencia de un programa predeterminado
genéticamente. Por el contrario, dependen de una serie de mecanismos que, sin modificar la secuencia
del genoma, modifican su capacidad de expresión; a estos mecanismos se les conoce como procesos
epigenéticos. De manera importante, su estudio se encuentra en una fase de crecimiento exponencial
y se enfoca en la arquitectura y remodelado de la cromatina, en las modificaciones covalentes de
histonas y en la metilación de secuencias del material genético, considerando la localización nuclear
de las secuencias disponibles para su transcripción (revisado por Cremer, 2001 y Shchuka et al., 2015).
Dado que la modificación epigenética es necesaria para la progresión de la diferenciación, y
tomando en cuenta que en células epiteliales la configuración temporal de los complejos
remodeladores de cromatina y la actividad de los mecanismos de modificación covalente de la
cromatina no están descritos, en este trabajo iniciamos el estudio de la regulación epigenética de la
proliferación y la diferenciación del epitelio corneal de mamífero. Con este propósito decidimos
analizar la expresión de los componentes de los complejos remodeladores de la cromatina BAF y PBAF,
cuya participación en procesos de diferenciación neuronal, cardiaca, entre otros; ha sido demostrada
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
80
(Ho et al., 2009; Kaeser et al., 2008; Yoo & Crabtree, 2009). También estudiamos la expresión de las
metiltransferasas de histonas Prdm3 y Prdm16, y cómo las expresiones de estos componentes de los
procesos epigenéticos se modulan por la activación de la vía de señalización dependiente de Notch.
Los resultados obtenidos muestran que los componentes de los complejos remodeladores de la
cromatina y las metiltransferasas de histonas se expresan a lo largo del crecimiento y la diferenciación
en cultivo, con un máximo de expresión evidente cuando las células alcanzan el estado de confluencia
e inician la formación de un epitelio estratificado entre los días 5 y 6 de cultivo (ver Figura 34). Este
máximo en expresión coincide con la rápida disminución en la expresión del mensajero que codifica
para el factor de proliferación Np63 (Castro-Muñozledo et al., 2017), y resultados de este trabajo) y
el aumento del mensajero que codifica para el factor de transcripción homeótico Pax6 (Garcia-Villegas
et al., 2009 y resultados de este trabajo). Además, con base en el análisis bioinformático del
transcriptoma donde se compararon las tres etapas de diferenciación de las células; durante esta fase
de transición (al día 6 de cultivo) se detectó el aumento en la expresión de al menos 628 genes y la
disminución de otros 1195, todos ellos cambios previos a la expresión del fenotipo terminal (Ortiz-
Melo, et al., datos no publicados). Esto sugiere que esta etapa debe ser crucial para la restructuración
tridimensional de la cromatina y, por lo tanto, la modificación de la accesibilidad de la maquinaria de
transcripción a secuencias específicas cuya modificación de la expresión conlleva probablemente a la
expresión del fenotipo diferenciado. Por ello, los resultados anteriores nos permiten sugerir que los
complejos remodeladores y las metiltransferasas de histonas analizadas en este trabajo, desempeñan
una función fundamental durante el proceso de diferenciación del epitelio corneal, principalmente en
esta etapa de transición en la que las células quedan programadas hacia el fenotipo diferenciado.
Nuestro análisis muestra que los complejos remodeladores de cromatina existen en todas las
etapas del desarrollo, presentando al menos las subunidades básicas BAF170, BAF155 y BAF47, que
forman el núcleo básico de los complejos BAF/PBAF (Clapier & Cairns, 2009). Los resultados
demuestran también que coexisten varias configuraciones de los complejos, ya que las células de
epitelio corneal expresan de manera simultánea, con patrones de expresión diferenciales,
subunidades mutualmente excluyentes como las ATPasas y las proteínas ARID (Euskirchen et al., 2012).
Estas variaciones en la expresión de las subunidades, junto con los reportes que describen los distintos
ensamblajes de subunidades y la participación de los diferentes complejos en procesos de
diferenciación de acuerdo con el contexto tisular y de etapa de desarrollo (Ho et al., 2009; Krasteva
et al., 2012, 2017; Lessard et al., 2007; Masliah-Planchon et al., 2014) nos permiten especular acerca
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
81
de la abundancia y composición de los diferentes complejos BAF/PBAF posibles a lo largo de la
proliferación y diferenciación del epitelio corneal.
Días de cultivo celular
0 2 4 6 8 10 12
Nú
me
ro d
e c
élu
las
105
106
107
No. de células E
xp
res
ión
re
lati
va
de
mR
NA
(N
orm
aliz
ad
a)
0
2
4
6
8
10
12
Arid2 / BAF200Arid1b / BAF250b
Arid1a / BAF250a
Brg1 / SMARCA4
Brm / SMARCA2
BAF45a / PHF10
Figura 34 Perfil general de expresión de los mRNA que codifican para las subunidades de los complejos remodeladores de
cromatina BAF y PBAF. La modificación de la expresión se normalizó tomando como 1 la expresión al día 3 de cultivo para
cada uno de los genes analizados. Se utilizaron los mismos datos que para las gráficas individuales mostradas en resultados,
pero se ajustaron para utilizar la misma escala en todos los datos. Además, se incluye en línea punteada el conteo de células
en cada día de cultivo en escala logarítmica y la flecha indica el día en el que las células llegan a confluencia.
Tal es el caso de BAF45a, Brg1 y Arid1a/BAF250a, subunidades con cinéticas similares, con
niveles de expresión máxima al día 5 de cultivo y que alcanzan magnitudes similares (2 veces los niveles
basales) lo que podría indicar que estas subunidades se expresan formando parte del mismo complejo
en células proliferativas. Esta combinatoria es similar a la reportada para el complejo esBAF, que es
indispensable para la autorrenovación y pluripotencia de las células troncales embrionarias,
probablemente gracias a que puede interaccionar con factores de transcripción como Oct4 y Sox2 (Ho
et al., 2009). Es de notarse que estas tres subunidades, después de alcanzar su máxima expresión
sufren un decremento hasta niveles menores a los basales, hecho que es evidente para Brg1 y
Arid1a/BAF250a, cuya expresión concuerda con los niveles de proteína detectados por western blot.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
82
Por otro lado, la configuración que incluye a BAF45a, Brg1 y Arid1a/BAF250a concuerda con
reportes individuales en los que cada una de estas subunidades se expresa en células con alta
capacidad proliferativa (Lessard et al., 2007), como ocurre para BAF45a en progenitores neurales
(Bachmann etal., 2016), en células troncales hematopoyéticas (Krasteva et al., 2012, 2017) y en células
troncales embrionarias de ratón (Ho et al., 2009), donde contribuye al mantenimiento de la capacidad
proliferativa de las mismas (Banga, Peng, Dasgupta, Palejwala, & Ozer, 2009; Krasteva et al., 2017; C.
Li et al., 2012; W. Li et al., 2007). Además, su expresión disminuye a medida que avanza el programa
de diferenciación, probablemente para ser reemplazada por otra proteína de su familia, como se ha
visto durante el desarrollo neural, donde es sustituida por BAF45b/c (Lessard et al., 2007). De la misma
manera, Brg1 aparece en células troncales neurales (Matsumoto et al., 2006) y en el folículo piloso
(Xiong et al., 2013), donde se le atribuyen funciones que contribuyen a la regeneración tisular y al
mantenimiento del carácter troncal. De manera importante, en tejidos oculares, Brg1 interacciona con
PAX6; esta interacción contribuye a iniciar el programa de diferenciación del cristalino (He et al., 2010;
Yang et al., 2006) así como también ocurre durante la neurogénesis en el ratón (Ninkovic et al., 2013),
al permitir a la maquinaria de transcripción el acceso a genes específicos de tipo celular. En nuestro
sistema experimental observamos esta interacción en los experimentos de inmunoprecipitación (ver
resultados); siendo interesante encontrar una fuerte asociación de Brg1 con Pax6 aun cuando la
expresión de Pax6 en las etapas tempranas de cultivo es baja en comparación con etapas posteriores.
Más aún, en epidermis de ratón, el gen Brg1 es blanco directo del factor de transcripción p63 y su
interacción permite la remodelación del complejo de diferenciación epidermal (EDC) a un sitio de la
eucromatina, de manera previa a la expresión completa de los genes de este complejo; que a su vez
también está regulada por Brg1 (Mardaryev et al., 2014). En conjunto, esta evidencia podría indicar la
existencia de una cascada de señalización que involucre al menos a estos tres elementos y que da
como resultado el inicio del programa de diferenciación en su etapa más temprana. Contrario a esta
teoría, cabe mencionar que existe la posibilidad de que no exista esta inducción directa de Brg1 por
p63, tanto en el epitelio corneal como en nuestro modelo, ya que p63 completa no se expresa en este
tipo epitelial y sólo se encuentran las isoformas truncadas (Di Iorio et al., 2005; Kawasaki et al., 2006)
cuyas interacciones aún no están caracterizadas. A pesar de ello, esta evidencia destaca a Brg1 como
un probable responsable del inicio del programa de diferenciación del epitelio corneal.
Por otra parte, conforme avanza la diferenciación, en la etapa transición observamos que el
día 6 de cultivo las subunidades Brm y Arid2/BAF200 sufren cambios similares en su expresión,
alcanzando niveles aproximadamente 10 veces superiores a los iniciales; mientras que
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
83
Arid1b/BAF250b aumenta hasta alcanzar un nivel 5 veces la expresión detectada inicialmente. Estos
incrementos contrastan con el cambio que hemos discutido para Brg1, Arid1a/BAF250a y BAF45a,
cuyos incrementos no son mayores a 2 veces los niveles basales detectados al inicio de la fase de
crecimiento exponencial.
Los estudios realizados para cada una de las proteínas estudiadas relacionan su expresión con
características propias de células proliferativas o bien, de células terminalmente diferenciadas, que en
su mayoría concuerdan con nuestros resultados en el modelo de células RCE1(5T5). Así pues, a ARID1A
se le atribuye una función represora de genes asociados a la diferenciación (Singh & Archer, 2014), y
al control que restringe la autorrenovación y proliferación en células troncales (Gao et al., 2008).
Además de que modula la ocupación de Brg1 y es crucial para prevenir la hiperacetilación de la
cromatina limitando así la expresión inadecuada de genes durante la diferenciación cardiaca (Singh &
Archer, 2014). En contraste, se considera que la función de ARID1B es activadora (Inoue et al., 2011;
Nagl et al., 2007), ya que es indispensable para la progresión del ciclo celular (Flores-Alcantar et al.,
2011; Inoue et al., 2011; Nagl et al., 2007) y favorece la transcripción (Nagl et al., 2007). Finalmente,
ARID2 (formando parte del complejo PBAF) contribuye a mantener la identidad celular y a activar la
expresión genética tejido-especifica, como por ejemplo en osteoblastos (Xu et al., 2012). Estos datos
se reflejan en nuestros resultados, donde ARID1B/BAF250B y ARID2/BAF200 son posteriores a
ARID1A/BAF250A, en esta etapa de transición, probablemente para apoyar la correcta progresión
hacia el fenotipo diferenciado, a la vez que se limitan la proliferación.
Para el caso de las ATPasas, la expresión que observamos concuerda con lo reportado para
fibroblastos de embrión de ratón, donde BRG1 se mantiene constante durante el proceso de
diferenciación, mientras que BRM también se incrementa hasta 10 veces respecto a las células
troncales (Reyes et al., 1998). Al igual que en el caso de la familia Arid, BRM y BRG1 poseen funciones
parcialmente redundantes (Willis et al., 2012; Wilson et al., 2014) siendo intercambiables, aunque en
los complejos remodeladores de cromatina se encuentran en equilibrio, ya que si se elimina una de las
ATPasas la otra se sobreexpresa, o bien, si se sobreexpresa alguna se reduce la expresión de la otra
(Reyes et al., 1998). Por ello, los resultados sugieren que BRM puede reemplazar a BRG1 en los
complejos remodeladores de las células diferenciadas en el epitelio estratificado (día 10 de cultivo).
Estas células deben presentar una predominancia de complejos PBAF, gracias a la abundancia de la
subunidad característica Arid2/BAF200 la cual sólo puede interaccionar con Brg1.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
84
Por otra parte el aumento considerable en la expresión de Arid1b/BAF250b sugiere que ésta
proteína puede está formando complejos a partir del día 6 en cultivo con cualquiera de las dos ATPasas
BRG1 o BRM, ya que esta subunidad puede interaccionar con ambas (Gresh et al., 2005). Su actividad
es contrastante según el modelo, en células HeLa su inducción causa la limitación del crecimiento
celular y la acumulación de células en fase G0/G1, activa a p21 regulando a la baja a c-myc (Inoue et al.,
2011); también se requiere para diferenciación temprana del cerebro (Flores-Alcantar et al., 2011); y
por otro lado la inactivación de ARID1b en células troncales embrionarias causa una reducción de su
proliferación y un ciclo celular anormal (Yan et al., 2008). De manera adicional, probablemente en
células diferenciadas existen configuraciones poco abundantes como las de forma
Ard1a/BAF250a+BRM observada en la coinmunoprecipitación. Estas configuraciones concuerdan con
otras reportadas para células terminalmente diferenciadas, en donde es más común encontrar
complejos BRM/ARID1A en promotores reprimidos, en contraste con promotores activos donde se
asocian principalmente complejos BRG1/ARID1B (Flores-Alcantar et al., 2011).
Estos cambios estructurales en los complejos proporcionan una funcionalidad específica, por
lo que al ubicar la expresión de mensajero que codifica para ambas ATPasas en la progresión de la
diferenciación en cultivo Brg1 parece contribuir al encendido del programa de diferenciación bajo el
control de p63 (véase más arriba), para después mantenerse constante como se ha observado en otros
modelos de diferenciación (Albini et al., 2015; Muchardt et al., 1998; Reyes et al., 1998), y favorecer la
expresión de BRM durante la transición. Puesto que los complejos que contienen BRM participan en
la activación de genes del fenotipo diferenciado debido a su efecto facilitador sobre la transcripción
global mediada por la RNA-Pol II (Armstrong et al., 2002). Cabe mencionar que, de manera adicional,
se observa un aumento de su expresión, en células situadas en G0 y en células inducidas a
diferenciación (Muchardt et al., 1998; Reyes et al., 1998). Este intercambio de ATPasas ocurre de la
misma manera durante la diferenciación muscular, donde BRG1 se requiere en etapas tempranas y
BRM es necesaria para la represión de la Ciclina D1 y el cese de la proliferación justo antes de la
activación de los genes específicos de músculo (Albini et al., 2015). Dicho intercambio es interesante
ya que ambas ATPasas establecen interacciones proteína-proteína con moléculas completamente
diferentes. Mientras que BRG1 interacciona con elementos de la gran familia de proteínas con dedos
de zinc, BRM interacciona con proteínas que contienen dos repetidos de anquirina. Entre éstas se
encuentran proteínas de la familia de NOTCH (Kadam & Emerson, 2003).
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
85
Al concretar todas estas observaciones podemos proponer un esquema con las
configuraciones de los diferentes complejos remodeladores de cromatina que probablemente están
favorecidas durante las tres etapas del proceso de diferenciación in vitro del epitelio corneal, que se
muestra en la Figura 35.
Figura 35 Configuraciones propuestas de los posibles complejos remodeladores BAF y PBAF en las diferentes etapas de la
diferenciación del epitelio corneal.
Finalmente, al analizar el efecto que tiene la estimulación de las células RCE1(5T5) con las
formas recombinantes solubles de Notch1 y ligandos solubles Jagged1/2 y Delta1, con el fin de
relacionar a esta vía con los fenómenos epigenéticos estudiados, se observaron resultados
contradictorios. Previamente se demostró que mientras Jagged1 estimula la diferenciación e inhibe la
proliferación, Notch-1 promueve la proliferación de la línea celular RCE1 (5T5) (Mata-Lozano, 2012).
Además, Notch participa en la proliferación y/o en la diferenciación del epitelio corneal (Djalilian et al.,
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
86
2008; Lu et al., 2012; Xin et al., 2010). Sin embargo, encontramos que el tratamiento con las formas
recombinantes solubles de Notch-1 de rata y de humano estimuló la diferenciación como lo sugiere la
expresión de la citoqueratina K3 ligada al fenotipo terminal (Schermer et al., 1986), al mismo tiempo
que estimuló la expresión de PRDM16. En contraste, un factor que promueve la proliferación y la
migración como el EGF, no tuvo un efecto significativo sobre la expresión de esta metiltransferasa de
histonas, lo cual podría interpretarse como la activación de la metilación para reducir la disponibilidad
de secuencias específicas que deben apagarse para iniciar el programa de diferenciación. Por otra
parte, los elementos indispensables para el ensamble de los complejo BAF y PBAF, las proteínas ARID
no presentaron cambios significativos después de 4 días de tratamiento, hecho que podría
correlacionarse con el tiempo de cultivo en el que se obtuvo el RNA, donde normalmente sin
estimulación, las células todavía son proliferativas y no diferenciadas. En este aspecto, los resultados
obtenidos al intentar la activación de la vía de Notch no nos permitieron obtener resultados
concluyentes, por los que se necesita elaborar un mejor sistema de ensayo para analizar los efectos
de estas moléculas.
A pesar de ello, como lo indican los resultados, la activación de la vía en este sistema no influye
en la expresión de los componentes de estos complejos remodeladores. Por el contrario, es probable
que los complejos influyan sobre la expresión de receptores y ligandos de la vía de NOTCH, como se
observó en numerosos reportes (Armstrong et al., 2005; Kadam & Emerson, 2003; Leung et al., 2008;
X. Zeng et al., 2013). Así pues, el contacto célula-célula registrado gracias a la vía de NOTCH debe
ejercer un efecto sobre las metiltransferasas de histonas PRDM3 y 16, como se ha reportado para otros
sistemas. Esta relación es responsable de fijar destinos celulares específicos como ocurre durante de
la neurogénesis en el sistema nervioso central de mamífero (Horn et al., 2011; Kinameri et al., 2008);
o en el pardeamiento del tejido adiposo blanco (Bi et al., 2014). Además, Hamlet, una proteína
ortóloga a PRDM3 y PRDM16, cambia las respuestas transcripcionales a la vía de Notch multiplicando
la cantidad de destinos posibles durante el desarrollo de las neuronas del receptor olfatorio (ORN) en
Drosophila (Endo et al., 2012; Moore et al., 2002). Dicha evidencia concuerda con sus cinéticas de
expresión, donde la máxima expresión de ambas metiltransferasas se alcanza cuando se inicia la
disminución en el marcador de proliferación ∆Np63α y se presenta la expresión creciente del marcador
de diferenciación PAX6. Esta progresión pudiera estar relacionada con la preparación para fijar el
estado diferenciado de la cromatina, silenciando como heterocromatina a todo el material genético
que no sea parte de programa de diferenciación terminal (Pinheiro et al., 2012). Particularmente la
expresión de PRDM16 disminuye en los días posteriores al compromiso y se eleva cuando se forma un
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
87
epitelio estratificado maduro (10° día en cultivo), probablemente estructurando la heterocromatina
para mantener su arquitectura en las células que expresan el fenotipo diferenciado (Pinheiro et al.,
2012). Por otro lado, es de destacarse que la expresión PRDM16 es precedida ligeramente por la de
PRDM3 (máxima al 5to día de cultivo), lo que sugiere que ambas proteínas tienen funciones que sólo
se sobrelapan de manera parcial (Ding et al., 2013; Pinheiro et al., 2012). Este aumento de PRDM3, tan
temprano en el proceso de diferenciación, podría estar relacionado con su participación en la
regulación de otros fenómenos como la proliferación celular como fue descrito previamente (Hoyt
et al., 1997; Morishita, 2007; Yuasa et al., 2005). Además, la expresión de PRDM3 disminuye a niveles
menores a los basales el día 10 de cultivo, cuando el epitelio ya está estratificado, lo cual sugiere que
el mantenimiento de las marcas de heterocromatina constitutiva es responsabilidad de PRDM16 para
el caso del epitelio corneal.
Con respecto a CTBP2 a pesar de que funciona como parte del complejo silenciador de las
metiltransferasas PRDM (Stankiewicz et al., 2014) no observamos un patrón de expresión que
correlacione con su actividad. Podría ser que los cambios durante el desarrollo no modifiquen la
transcripción del gen, aunque la proteína correspondiente se regule diferencialmente a través de
mecanismos postraduccionales, o bien que su transcripción dependa de elementos que no ligados a
los cambios que ocurren durante la diferenciación, o alternativamente, simplemente se utilicen otras
proteínas de la misma familia como CTBP1, que participa en la vía de NOTCH (Bray, 2006; Schwanbeck,
2015). Sin embargo, necesitaríamos evaluar dicha interacción para resolver su mecanismo más a
fondo.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
88
9 PERSPECTIVAS A continuación, esta investigación puede ampliarse por tres direcciones concretas que
requieren distintas metodologías. Inicialmente se pude profundizar en la caracterización de los
complejos en las distintas etapas de la diferenciación en la línea celular e inclusive en tejido primario,
utilizando metodologías de purificación bioquímica adicionales, por ejemplo; utilizando gradientes de
glicerol combinados con secuenciación de proteínas como se realizó para otros modelos (Cigall Kadoch
et al., 2013), además de completar las cinéticas y coinmunoprecipitación de proteínas mostradas aquí.
Esto permitiría identificar a detalle el intercambio de subunidades en estos complejos junto con la
configuración predominante en cada población celular de tal manera que esta información se pueda
correlacionar con las funciones individuales atribuidas a cada subunidad.
Por otro lado, podría explorarse más a fondo la relación de los elementos epigéneticos
estudiados a nivel de regulación genética y vías de señalización con factores de transcripción como
p63 y Pax6 que son indispensables para la diferenciación del epitelio. Por ejemplo, por medio de la
exploración de secuencias consenso de la interacción Pax6-Brg1, o dentro de las secuencias de las
subunidades de los complejos y las metiltransferasas de histonas que les permitan ser controladas por
estos factores de transcripción y otros relevantes. También, la exploración por medio de secuenciación
masiva para identificar la participación de los complejos en la transcripción de algo similar al complejo
de diferenciación epidermal (EDC) (Botchkarev, 2015, 2017; Mardaryev et al., 2014), en córnea.
Finalmente, hace falta profundizar acerca de la participación de las metiltransferasas de
histonas en la vía de NOTCH, observamos que esta vía puede controlar de alguna manera la expresión
de Prdm16, hace falta explorar de primera instancia si ocurre algo similar para Prdm3 y ¿quién es
responsable de esta interacción? ¿cuáles son los receptores de la vía ligados directamente a la
modificación? ¿qué efectos conlleva esta modificación?, se espera una interacción regulatoria con
estos elementos en la toma de decisiones en la diferenciación, como se ha visto para otros modelos
(Schmucker & Hassan, 2012) por lo tanto se debe explorar si ocurre algo similar en la diferenciación
del epitelio corneal. Donde es posible que intervengan distintos complejos remodeladores de la
cromatina.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
89
10 CONCLUSIONES
Durante la diferenciación, la línea celular de epitelio corneal de conejo RCE1 (5T5) expresa los
complejos remodeladores de la cromatina BAF y PBAF y a las metiltransferasas de histonas PRDM16 y
PRDM3, con patrones que sugieren su participación en la transición que ocurre cuando las células
llegan a confluencia e inician la expresión del fenotipo terminal. Se comprobó que estos complejos
presentan todas las subunidades núcleo, subunidades identificadoras y ATPasas que los constituyen.
Es probable que, durante la diferenciación se presente el cambio y/o sustitución de subunidades,
permitiendo la expresión específica de tejido, y el apagado de genes que participan en otras funciones
celulares no esenciales para la especialización del tejido.
De manera importante, se comprobó la existencia de interacciones entre elementos del complejo
remodelador de cromatina y el factor de transcripción PAX6, que aparentemente funciona como gen
rector de la expresión de todo el programa de diferenciación. Esta interacción fue específica hacia la
ATPasa Brg1 y puede ser esencial para el inicio del proceso de desarrollo.
Por otra parte, establecimos un posible modelo de transición entre las tres etapas de
diferenciación distinguidas en nuestro laboratorio, en las que pueden asignarse algunas funciones a
cada uno de los complejos existentes en cada etapa. Observamos cómo la expresión de los complejos
no está dirigida por la vía de NOTCH lo cual sugiere que el detonante de su expresión es más temprano
a la confluencia y está involucrado con p63. Por el contrario, las metiltransferasas de histonas Prdm3
y 16 se encuentran bajo el control de esta vía. Lo cual implicaría que su expresión es posterior a la
llegada a confluencia, cuando las células sufren la polarización de sus receptores membranales; estos
cambios estructurales podrían estar detonados por la misma remodelación de la cromatina.
Finalmente, concluimos que estos complejos son sumamente importantes en la transición entre
estados celulares y no sería sorprendente que tuvieran una función biológica importante en la
dirección del proceso de diferenciación al controlar la expresión de elementos como los receptores de
la vía de NOTCH, y por lo tanto permitir la expresión del fenotipo epitelial terminal.
Como se puede apreciar, este trabajo es el inicio del abordaje de un proceso extremadamente
complejo. Más que resolver preguntas, hemos abierto un panorama que requiere el determinar qué
otras subunidades del complejo de remodelación de cromatina se encuentran en el epitelio corneal,
así como hace necesario el conocer las relaciones cuantitativas entre cada uno de los componentes de
los complejos y sus relaciones con el resto de los elementos en este sistema.
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
90
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ABSTRACT :, 5(January).
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
102
12 MATERIAL SUPLEMENTARIO
12.1 Apéndice 1
Para realizar el seguimiento de la población celular se realizó el conteo de células cada día a
partir del día 2 por medio de la tripsinización de cajas de cultivo de 35 mm de diámetro y conteo en
cámara de Neubauer posterior a la eliminación de las células alimentadoras (hasta el día 5) con verseno
(PBS 1x + EDTA 0.02% (p/v)) según los métodos habituales del laboratorio.
Numero de células vs. días de cultivo (Log10)
Días de cultivo celular
0 2 4 6 8 10 12
Nú
me
ro d
e c
élu
las
105
106
107
No. de células
Figura suplementaria 1 Progresión de la división celular (días de cultivo celular vs. número de células). Se muestra el valor
promedio de al menos 3 cajas cultivas en paralelo, las barras indican su desviación estándar correspondiente. La flecha indica
el día en el que las células alcanzaron confluencia.
Según los mismos métodos descritos en la Sección 8.1 se caracterizó la expresión de los
marcadores de diferenciación conocidos para la línea celular: Pax-6 (Garcia-Villegas et al., 2009) y el
marcador de proliferación de células epiteliales ∆Np63α (Pellegrini et al., 2001).
El factor de transcripción p63, es un conocido indicador de células proliferativas. Inicialmente
se propuso como un marcador de células troncales epidermales; además, el estudio de la distribución
de sus isoformas en el epitelio ocular (Kawasaki et al., 2006) mostró que únicamente las isoformas sin
región de transactivación (∆Np63) se encontraban en el epitelio y que específicamente la ∆Np63α que
tiene su máxima expresión en el nicho de células troncales del epitelio corneal; la sección basal del
Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal
103
limbo. Donde es responsable al menos en parte de la capacidad proliferativa y potencial migratorio de
las células troncales (Di Iorio et al., 2005; Robertson et al., 2009). Por lo cual, esperamos que las células
que son positivas para dicho factor se encuentran en un estado proliferativo. Por otro lado, PAX6 es
un factor de transcripción esencial para el desarrollo de tejidos que incluyen a los ojos, sistema
nervioso central y glándulas endocrinas en vertebrado e invertebrados (Simpson & Price, 2002) El
aumento en la expresión de PAX6 está relacionado a la progresión de la diferenciación del epitelio
corneal y se encuentra rio arriba de la expresión de las citoqueratinas 12/3, par relacionado con la
diferenciación terminal de la córnea (Sasamoto et al., 2016a).
Observamos que las proteínas utilizadas como controles Pax6 y ∆Np63α son adecuadas para
contrastar la progresión de la diferenciación con expresión de las proteínas de los complejos y
metiltransferasas de histonas involucradas ya que muestran el patrón de expresión reportado
anteriormente (Garcia-Villegas et al., 2009).
Días de cultivo celular
0 2 4 6 8 10 12
Nú
me
ro d
e c
élu
las
105
106
107
No. de células
Ex
pre
sió
n d
e P
ax
6 y
p6
3a
lfa
(N
orm
aliz
ad
a)
0
1
2
3
4
5
6
Pax6 (n=5)
p63alfa (n=4)
Figura suplementaria 2 Expresión de RNAm de ∆Np63α (azul) y PAX6 (rojo) en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-
5T5). Se realizó el cultivo celular y a partir del día 3 de cultivo se extrajo RNA diariamente, se preparó cDNA y se realizó la RT-
qPCR con las sondas correspondientes. Se grafico la expresión genética posterior al cálculo del 2-∆∆Ct tomando como referencia
su expresión basal en el día 3 y PR-P0. Los puntos indican el valor promedio, las barras indican su desviación estándar
correspondiente, “n” indica el número de repeticiones biológicas consideradas. La flecha indica el día en el que las células
alcanzaron confluencia. Se incluye la progresión de la división celular en escala logarítmica en línea punteada.