1. Introducere
1.1 Scurt istoric al studiilor asupra apoptozei
Moartea celulară este un element necesar în decursul vieţii unui
organism multicelular, îndeplinind numeroase funcţii.
Prima descriere a apoptozei în decursul dezvoltării embrionare a fost
realizată de Vogt1 în 1842, iar primul studiu integrativ care a propus
conceptul de “apoptoză” a fost realizat de către Kerr2 în 1972, care a
observat recurenţa fenomenului în timpul proliferării celulare sau în situaţii
patologice.
Numeroşi cercetători au propus termeni diferiţi pentru a descrie
fenomenul, cum ar fi anoikis, degenerare, autoliză, cromatoliză, sinucidere
celulară (vezi Majno şi Jolis, 1995)3, fapt care se datorează modelelor
diferite de cercetare.
Dacă înainte de precizarea terminologică termenul de “necroză” era
utilizat ca un termen general pentru a descrie toate tipurile de moarte
celulară, astăzi el este folosit cu un conţinut limitat la dezintegrarea pasivă a
celulei, diferită de distrugerea voluntară, programată a acesteia. Pe parcursul
acestei lucrări voi folosi termenul de “moarte celulară programată” (MCP)
ca fiind similar celui de “apoptoză”.
Analiza in vivo diferitelor tipuri de moarte celulară non-necrotică a
arătat existenţa unor trăsături comune, indiferent de originea celulei sau
stimulul utilizat.
Cu toate acestea, studiile in vitro au evidenţiat diferenţe în expresia
proceselor sau inexistenţa unor trăsături tipice în anumite cazuri. De pildă,
1
utilizarea staurosporinei pentru a induce apoptoză generează distrugerea
celulei fără formarea corpilor apoptotici, probabil datorită acţiunii inhibitorii
asupra unor kinaze implicate în apoptoza normală .4
De asemenea, metamorfoza insectelor diferă în anumite privinţe de
tipul descris ca universal 5, iar în anumite cazuri când apoptoza este genetic
imposibilă, distrugerea capătă o expresie diferită 6.
1.2 Necroza vs. Apoptoza
Despre diferenţele dintre necroză şi apoptoză până s-a scris o literatura
bogata, accentuându-se caracterul voluntar, controlat şi dinamic al
apoptozei, sau diferenţele morfologice caracteristice fiecărui proces în parte. 1
Există însă unele procese ce împărtăşesc cu apoptoza multe trăsături
dar cărora le lipsesc altele caracteristice acesteia, sau care încalcă modelul
descris ca fiind tipic. 2
S-a observat recurenţa necrozei în urma acelor procese de leziune
celulară brutală, cum ar fi atacul a numeroşi agenţi fizici sau chimici,
hipoxia, toxinele, infecţiile, fiind acceptat rolul necrozei în răspunsul generat
la adresa unor agenţi patogeni şi importanţa procesului imflamator. 3
Unele dintre elementele necrotice distinctive sunt scăderea ATP
citosolic, datorită creşterii permeabilităţii membranare, disfuncţia unor
canale cationice, degradarea fosfolipidelor şi creşterea calciului
intracitoplasmatic. 4
Are loc prin urmare dilatarea reticulului endoplasmatic, degradarea
membranelor mitocondriale şi modificarea activităţii translaţionale.
2
În a doua fază necrotică se declanşază o degradare accentuată a
membranelor celulare şi a organitelor, hidratarea mitocondriilor şi apariţia
unor agregate dense şi bogate în lipide.
Dacă în apoptoză celula în restrânge în mod treptat volumul, în
necroză are loc un proces invers; cromatina apare agregată haotic, fiind
împrăştiată aleatoriu. 5 Celulele devin eozinofile, iar citoplasma este
vacuolizată; degradarea finală a organitelor nu este urmată de apariţia unor
structuri similare corpilor apoptotici.
În apoptoză, modificarea volumului celular se realizează prin
pierderea de apă şi ioni, nu însă şi de macromolecule, membranele rămânând
relativ intacte; apar “cute” 6 la suprafaţa plasmalemală, iar organitele rămân
nedigerate până la final. Condensarea cromatinei este ordonată, are loc
fragmentarea şi condensarea sa în mase compacte distincte la nivelul laminei
celulare.
Caracteristica definitorie este fără îndoială formarea corpilor
apoptotici şi activarea programului fagocitar, ceea ce nu declanşază
inflamaţia.
Procesul apoptotic este controlat genetic, în etape distincte, fiind
declanşat ireversibil după depăşirea unui “punct critic” 7, iar sinteza proteică
nu cunoaşte un moment similar celui “catastrofic” necrotic. În acest caz sunt
activate endonucleazele (calciu şi magneziu dependente şi care sunt inhibate
de către Zn) care fragmentează ADN la nivelul fragmentelor linker,
rezultând fragmente de 180 – 200 perechi de baze 8.
La celulele anucleate apoptoza urmează acelaşi scenariu, chiar în
absenţa degradării nucleare.
Apoptoza necesită sinteza unor proteine cu rol apoptotic şi ca urmare
nu se produce o dezorganizare rapidă a procesului.
3
Recent s-a descoperit că procesul sintetic este inhibat prin distrugerea
factorului 4G eucariotic 9, ceea ce nu afectează sinteza proteinelor cu funcţie
prooncogenă de tip c – myc care necesită un segment intern de ataşare
ribozomal (IRES) localizat la segmentul 5’ reglator.
Pentru a sintetiza, apoptoza este caracterizată de următoarele trăsături: 10
1. membranele plasmatice rămân intacte, formând însă cute;
2. reducerea volumului celular ;
3. condensarea cromatinei la periferia nucleului, ce devine picnotic;
4. fragmentarea ADN si a nucleului;
5. distrugerea structurilor membranare;
6. vacuolizarea citoplasmei;
7. formarea corpilor apoptotici.
1.3 Funcţiile apoptozei
Acest proces nu este numai unul de “curăţare”, ci şi unul de
construcţie, având un rol hotărâtor în dezvoltare.
Apoptoza intervine în modelarea unor structuri (formarea unor
cavităţi) 1, eliminarea celulelor redundante (neuronii motori ai vertebratelor),
sau în turnover-ul tisular normal. 2
De asemenea, apoptoza are o funcţie esenţială în menţinerea
homeostaziei tisulare, cum ar fi cazul hematopoiezei, menţinând un echilibru
între proliferare şi eliminare. 3
Prin apoptoză sunt îndepărtate celulele sistemului imunitar care
recunosc antigenele self, celulele imunitare activate inutile, clonele care
generează anticorpi anti-self, si celulele T care nu recunosc CMH sau cele cu
mare afinitate pentru antigenele self. 4
4
Limfocitele T pot fi distruse în manieră Fas-independentă sau Fas-
dependentă.
Apoptoza reprezintă un mecanism fundamental de protecţie a
organismului în cazul infecţiei virale, când mecanismul de atac preferat al
virusurilor este sinteza proteinelor cu funcţie antiapoptotică, cum ar fi LPM
1 sau LPM 2, în cazul virusului Epstein – Barr 5, sau proteina Tat care
blochează apoptoza, în urma infecţiei cu HIV 6.
Alteori virusurile modifică proteina cu rol proapoptotic, pentru a
favoriza diseminarea.
La fel se întâmplă în cazul infecţiilor bacteriene, însă în timp de
virusurile au mecanisme eficiente de inhibare a apoptozei pentru a iniţia
propria replicare, bacteriile au nevoie de supravieţuirea celulelor infectate.
Apoptoza este necesară şi în procesul de eliminare a celulelor cu rol
imflamator, după îndeplinirea funcţiei. 7
Mecanismele apoptotice nefunctionale duc la apariţia tumorilor, dar,
dată fiind importanţa procesului, o vom trata într-un capitol separat. 8
Apoptoza este implicată în numeroase maladii dintre care cităm :
A) Boli neurodegenerative: Alzheimer, Parkinson, scleroză laterală
amiotrofică, degenerescenţă cerebrală;
B) Sindrom mielodisplazic;
C) Infarct miocardic.
5
1.4 Trăsături generale ale apoptozei
1.4.1 Apoptoza în cazul celulelor nucleate.
Putem clasifica trăsăturile apoptozei în esenţiale şi neesenţiale. Cea
mai importanţă trăsătură a celui de-al doilea tip este modificarea de la
nivelul nucleului, deoarece apoptoza are loc în aceeaşi formă şi în celulele
anucleate (Jacobson, 1994, Osthoff, 1994)1. Asemenea trăsături sunt
clasificate ca “postmortem”, putând fi absente în anumite cazuri, şi au loc
după “punctul de neîntoarcere” (point of no return).
În 1966 Tata2 a observat faptul că apoptoza necesită ARN şi sinteză
proteică, ceea ce a subliniat faptul că acest proces este unul activ, dinamic,
iar recurenta unor trăsături comune a generat speculaţia că procesul
apoptozei este reprezentat de catre o cale biochimică unică 3 fapt ce a fost
întărit de descoperirea existenţei aceloraşi principii de organizare si în cazul
C. elegans şi al omului.
Dar faptul care a generat o teorie unificată despre apoptoză a fost
descoperirea caspazelor, care au fost identificate în toate organismele, mai
puţin în drojdii, fiind identificate insa şi unele mecanisme apoptotice ce nu
necesită existenţa lor.
Ipoteza originală a fost aceea că apoptoza constă in primul rand în
distrugerea citoscheletului de către caspază, ceea ce a fost infirmat ulterior.
(Martin 1995) .4
6
1.4.2 Dinamica citoplasmatică
Schimbările sunt predominant biochimice, nu morfologice, cu
excepţia dispariţiei microvililor ce are loc în urma activării caspazelor şi
concomitent cu defosforilarea ezrinelor si a radixinelor care stabilizează
microvilii prin interacţiunea cu actina.
Schimbările plasmatice cele mai evidente sunt datorate semnalelor
fagocitice adresate celulelor înconjurătoare, ceea ce va activa ultima etapă a
apoptozei. 5
1.4.3 Schimbări la nivelul formei şi structurii
În timpul apoptozei, celula îşi modifică forma, distrugând relaţiile cu
vecinii, iar la suprafaţa membranei apar anumite cute (blebs) precedând
formarea corpilor apoptotici.
La nivelul citoplasmei apar uneori vacuole, proces ce urmează
distrugerii citoscheletului, in distrugerea acestuia un eveniment fundamental
constituiindu-l activarea caspazelor, care distrug direct gelsolina, fodrina,
actina sau Gas 2 (Kotha-Kota, Martin, Mashima). 6
La soarecii knok-out pentru caspaza 3 apoptoza hepatocitelor şi
timocitelor prezintă o formare mai redusă a cutelor, lucru observat şi în cazul
unei linii celulare derivate dintr-un cancer mamar uman. Dacă tratăm
celulele cu proteinază K, cutele se formează în mod normal, iar adăugarea
inhibitorilor caspazici anihilează această formare, ceea ce evidenţiază rolul
caspazelor.
Distrugerea citoscheletului 7 nu e haotică, ci organizată, ea necesitând
actina, care formează o structură asemănătoare unui cerc la periferie, şi
7
gelsolina modificată, soarecii K.O. pentru gelsolină – având o formare mai
întârziată a cutelor.
Odată declanşată de activarea caspazei 3 formarea acestora e
inevitabilă, chiar dacă sunt adăugaţi inhibitori caspazici.
La nivelul miozinei au loc fosforilări pa lanţul uşor de către MLCK
(miosin light chain kinase), care determină o nouă interacţie actină – lanţul
uşor al miozinei. 8
Reorganizarea citoscheletului necesită numeroase kinaze: MAP
kinaza ce fosforilează hs27 1, (II). Pak 2 ce activează p 21, în urma actiunii
caspazelor (III). SLK, Ste-20 kinaza, care e clivată de caspaza 3 şi care
rearanjează citoscheletul. Pak 2 e implicată în formarea corpilor apoptotici,
iar din moment ce acest proces este inhibat de citocalasina B, probabil ca e
implicată şi actina F.
Apariţia vacuolelor depinde de activarea caspazelor, o proteină
implicată fiind rabaptina 5 care afectează membrana celulară.9
1.4.4 Schimbări la nivelul organitelor citoplasmatice
Distrugerea acetora este tardivă, schimbări mai pronunţate apărând la
nivelul RE 10 care se dilată şi pierde ribozomii ataşaţi, iar proteina integrală
Bap 31 de leagă de Bcl 2 şi pro-caspaza 9, fiiind distrusa de către caspaze.
Clivarea rabaptinei 5 va afecta fuziunea endozomilor şi va dezorganiza
metabolismul. Daca sunt translocate caspaze sau numai factori activati de
catre acestea ramane de stabilit, in prezent ambele tabere avand argumente
pro si contra.
Clivarea laminelor A şi B are loc la început, însă caspazele nu distrug
proteinele direct , ci prin intermediul altor molecule care au funcţie specială
în apoptoză. 11
8
Distrugerea ADN se realizează la nivelul unor segmente 200 – 300
Kpb, iar proteinele numite ICAD/CAD/DFF45/DFF 40 au un rol important
în fragmentare, existând în formă inactivă ca dimeri, DFF 40 fiind
complexat de DFF 45 proteină chapperone. 12
DFF 45 e clivată de către caspază şi e eliberat DFF 40 care realizează
tăieturi dublu catenare, mai ales in segmentul de legătură dintre nucleosomi.
Şoarecii trasgenici cu defecte în CAD au o fragmentare incoerentă, iar
tratamentul celulelor cu caspază duce la condensarea cromatinei dar procesul
e inhibat in urma tratamenului cu DFF 45.
Recent a fost izolată o proteină numită Acinus 13 care e activată de
către caspază şi care induce fagocitoza corpilor apoptotici si acest lucru se
realizează atât in cazul fagocitelor cât şi in cel al celulelor nespecializate (de
exemplu celulele epiteliale).
Distrugerea celulei se face pe o cale lizozomală în primul rând în
celula apoptotică prin autofagie, fiind descrisă o proteină beclina, care se
leagă de Bcl 2 şi e implicată în fagocitoză.14
Alteori corpii apoptotici sunt digeraţi de către celulele vecine pe cale
lizozomală.
1.4.5. Mitocondria
Dincolo de funcţia apoptotică a mitocondriei datorită Bcl 2, unele
modificări apar la nivelul membranei externe care e ruptă în urma umflării
matrixului, ulterior apărând fenomenul de condensare.15 Există momentan o
dezbatere privind implicarea mitocondriei în apoptoză, ideea acceptată de
catre majoritatea comuniatii stiintifice a primatului ei în activarea caspazelor
fiind contestată de actre o minoritate cu solide argumente in spate. Li Hu de
9
la Burnham Institute a identificat un tip de “receptor nuclear” care părăseşte
nucleul şi intră în mitocondrie, eliberând citocromul c.
A. Marchenko (Stony Brook) a identificat un mecanism similar în
cazul p 53, care se poate localiza la nivelul mitocondriei generând o
apoptoză mai rapidă.
Alţii au subliniat influenţele tipurilor de modele de cercetare asupra
rezultatelor, studiile pe C. elegans sugerând o activare caspazică
independentă de modificarea permeabilităţii mitocondriale.
H. Steller a arătat că p 53, un inhibitor caspazic al unor virusuri,
previne apoptoza în retina unor insecte au o structură asemănătoare retinis
pigmentosa, ceea ce susţine ideea acţiunii caspazelor înaintea acţiunii
mitocondriei.
1.4.6 Nucleul
Trăsătura iniţială o constituie condensarea periferica a cromatinei, iar
ulterior apare fragmentarea nucleului şi dezintegrarea sa datorită degradării
ADN şi a proteinelor nucleare. 16
Caspazele 3 şi 6 atacă proteinele nucleare, cum ar fi lamine, proteinele
scaffold, si DFF 45 ( Inhibitor DNA fragmentating factor/ ICAD).
Nucleul este distrus şi integrat în corpii apoptotici; un alt factor
implicat în apoptoză, AIF, declaşază apoptoza independent de caspaze şi
determină condensarea parţială a cromatinei.
10
1.4.7 Reglarea volumului celular
Acesta nu este un mecanism pasiv, 17 pierderea volumului celular din
timpul apoptozei în opoziţie cu mecanismul necrotic de umplere, unde
membrana plasmatică este ruptă datorită pierderii timpurii de ATP care
opreşte transportul ionic, fiind controlata. Ruperea membranei plasmatice şi
eliberarea conţinutului celular duce la un răspuns inflamator, în timp ce
apoptoza este acompaniată de scăderea volumului celular şi menţinerea
integrităţii organitelor, iar integritatea plasmalemei se menţine până la
sfârşit. 18
Celula a dezvoltat mecanisme reglatorii prin utilizarea canalelor
ionice, transportorilor şi reorganizarea citoscheletului pentru a menţine ciclul
celular.
La mamifere rinichii joacă rolul de filtru ionic, însă datorită
modificării biochimice celulele trebuie să-şi ajusteze singure volumul prin
mecanisme de mărire (RVI) sau scădere (RVD) a volumului.
Principalii ioni sunt K+, Na+, Cl-, H+, HCO3-, iar elemetele implicate in
mentinerea nivelului osmotic includ aminoacizi, CH3 – NH2, polioli, zaharuri
şi uree (O’Neill, 1999 ).19
Canalele ionice sunt extrem de permeabile la apă, iar transportul ei
depinde de concentraţia ionică a aminoacizilor. Celulele în mediu hipertonic
suferă procesul de pierdere de apă, însă existenţa RVI permite
supravieţuirea, prin activarea transportorilor electroneutri precum Na+/ H+ şi
cotransportorul Na+/K+/2Cl-, si prin schimbări în mecanismul de fosforilare.
Antiporterul produce un influx de NaCl şi apă, fiind cuplat cu
antiporterul Cl-/HCO3-, iar creşterea sodiului intracelular duce la activarea
11
Na+/K+ ATP-azei, ceea ce duce la existenţa unui gradient electrochimic prin
menţinerea unei concentraţii scăzute de sodiu şi clor.
Celulele limfatice rareori apelează la RVI şi nu îşi refac volumul.
Celulele în medii hipotonice îşi activează RVD şi sunt cuplate cu o
pierdere intracelulară de potasiu, sodiu şi clor, si cu expulzarea apei din
celulă. Expulzarea potasiului şi clorului duce la reducerea volumului celular,
iar o concentraţie mare de potasiu inhibă RVD.
Există de asemenea şi alte mecanisme de reglaj prin intermediul unor
molecule sau transportori.
2. Etapele apoptozei
I. “Faza iniţiatoare”
Cuplarea liganzilor la receptori, alterarea semnalizării prosupravieţuire
din partea celulelor vecine sau incapacitatea reparării ADN duc la declanşare
apoptozei.1 Pentru un organism unicelular singura şansă de a supravieţui este
reapararea ADN lezat. La pluricelulare strategia este mai complexă,
implicând blocarea ciclului celular sau a creşterii şi apoptoza.
În cazul reparării ADN celula trebuie să decidă dacă materialul
genetic a fost corect reparat sau nu. Dacă nu, are loc blocarea ciclului celular
până la repararea ADN, sau se declanşază distrugerea prin apoptoză sau
“moarte replicativă”.2
II. “Faza de decizie“
12
Transducţia mesajului apoptotic prin intermediul mesagerilor
(ceramid, DAG, IP3, kinaze) duce la activarea genelor apoptotice, mai ales a
celor bcl – 2 sau ice.
Odată declanşat, procesul este ireversibil. 3
III. “Faza de execuţie”
Enzimele de tipul caspazelor sau factorii de genul AIF au rolul de a
degrada în mod direct organitele sau de a activa alte molecule cu rol efector.
Activarea endonucleazelor duce la degradarea ADN.4
IV. “Faza de fagocitare”
Corpii apoptotici sunt digeraţi de către celulele vecine sau de către
celulele specializate, în urma semnalizării profagocitare a celulei apoptotice.
În fagocitoză un rol fundamental îl au trombospondina,
fosfatidilserina şi NANA. 5
3. Elemente implicate in apoptoza
3.1 Receptorii apoptotici
Atunci când celulele sunt lipsite de semnale extracelulare de
supravieţuire, se declanşază apoptoza. Aceste semnale sunt produse de
celule identice (tip autocrin) sau diferite (tip paracrin).
Adesea apoptoza poate fi indusă de către molecule efectoare exprimate
pe surafaţa altor celule (NK) sau prin intermediul unor citokine.
13
Receptorii apoptotici sunt receptori transmembranari care după interacţiunea
cu ligandul transmit semnale apoptotice şi fac parte din suprafamilia TNFR
(tumor necrosis factor receptor) care posedă domenii extracelulare bogate în
cisteină. 1
De asemenea, receptorii apoptotici au o secvenţă intracitoplasmatică
numită “domeniul morţii”2 (death domain) care face legătura cu ansamblul
apoptotic intracelular care apare şi la alte molecule cu funcţie în
semnalizarea apoptozei.
Cei mai bine caracterizaţi receptori sunt CD 95 (Fas sau Apo1) şi
TNFR 1 3(p 55 sau CD 120 a). Alţi receptori apoptotici sunt CAR 1, DR 3,
DR 4, DR 5, iar receptorul pentru p 75 NGF are şi el un domeniu al morţii.4
Liganzii care activează aceşti receptori, cu excepţia lui NGF, sunt
molecule structural înrudite care aparţin suprafamiliei TNF. CD 95 L se
leagă de CD 95, Apo 3 de DR 3, iar Apo 2 de DR 4 şi DR 5. Încă nu se
cunoaşte ligandul pentru CAR 1.
a) CD 95
Fas este o proteină transmembranară formată din 325 de aminoacizi
(48 KDa); capătul aminoterminal este citoplasmatic, iar cel carboxiterminal
este extracitoplasmatic.
Receptorii pentru Fas sunt repartizaţi variabil pe diferite celule,
găsindu-se în număr mare pe timocite, hepatocite, miocard, ovar şi pe
suprafaţa celulelor tumorale.
Este codificat de către o genă localizată pe braţul lung al
cromozomului 10 la om şi 19 la şoarece, ambele gene având 9 exoni.
Ligandul pentru Fas are un domeniu de aminoacizi hidrofil la mijloc şi
un segment carboxiterminal la exterior.
14
Regiunea extracelulară are 150 de aminoacizi, fiind similară cu
regiunile omoloage ale familiei TNF
Este codificat la om şi şoarece de o genă de pe cromozomul 1, având 5
exoni.
CD 95 joacă un rol fundamental în principal în trei tipuri de apoptoză:
deleţia periferică a celulelor T mature la sfârşitul unui răspuns imun;
distrugerea unor celule infectate de virusuri sau a celulelor canceroase de
către celulele cititoxice T şi NK; distrugerea unor celule inflamate. Pacienţii
cu gene pentru CD 95 sau CD 95 L nefuncţionale prezintă o acumulare a
celulelor limfoide periferice, care se manifestă şi în cazul unui sindrom
autoimun fatal, caracterizat prin mărirea nodulilor limfatici. CD 95 şi
ligandul său sunt de asemenea implicaţi în anumite afecţiuni ale sistemului
imunitar.5
CD 95 L este o moleculă homotrimerică, iar studiile de cristalografie
sugerează faptul că CD 95 L se leagă de trei receptori CD 95.
Analizele RMN au sugerat o grupare (clustering) a domeniilor morţii
în urma interacţiei acestora cu ligandul.6
TNFR 1
TNF este o citokină a cărei funcţiei este distrugerea tumorilor, având
un rol secundar în răspunsul inflamator şi imunitar, acţionând pe limfocitele
T, B, neutrofile, fibroblaste.
Induce de asemenea exprimarea moleculelor de adeziune împreună cu
IL – 1.
TNF are două forme, α şi β, având o structură identică în proporţie de
28 %, fiind codificate de două gene diferite. TNF α este codificat de către
15
macrofage şi are un efect citotoxic pe celulele tumorale, iar TNF β este
codificat de către TH.
TNFR 1 este unul dintre primii receptori utilizaţi în răspunsul
inflamator, mediind secundar inflamarea unor structuri limfoide, cum ar fi
foliculii primari ai limfocitelor B.
Nu toţi membrii familiei TNF induc apoptoza după cuplarea cu
receptorul specific.
TNF este sintetizat mai ales de macrofagele active şi de celulele T ca
răspuns la infecţie 7. TNF după legare induce asocierea domeniilor morţii,
iar o proteină adaptoare, TRADD (TNFR associated death domain), se leagă
prin propriul domeniu al morţii de un domeniu al unui receptor.
TRADD funcţionează ca o “interfaţă” receptor – apoptoză, deoarece
activează multe molecule semnal: TRAF 2 (TNFR associated factor 2) şi
RIP (receptor – interacting protein) stimulează căi de semnalizare care duc la
activarea NFKB şi a JNK/AP 1 8, în timp ce FADD mediază activarea
apoptozei.
Numai RIP are o funcţie intrinsecă enzimatică, fiind o serin/treonin
kinază.
TRAF 2 şi RIP activează NFKB (NIK) care în continuare activează
kinaza factorului inhibitor (I – KB) IKK 9.
IKK fosforilează I – KB, ducând la degradarea lui şi permiţându-i lui
NF-KB să se deplaseze în nucleu. Calea de la TRAF 2 şi RIP la JNK implică
o cascadă de evenimente care include MAP kinazele MEKK 1 (MAP/Erk
kinaz kinaza 1).
MEKK 1 este asemeănătoare cu NIK şi este implicată deoarece
mutanţii MEKK 1 blochează activarea JNK de către TNF. MEKK 1 nu se
16
leagă de TRAF 2 sugerând faptul că o altă kinază pentru TRAF 2 acţionează
înainte de MEKK 1. 10
Celulele din şoareci knock-out pentru TRAF 2 sau din şoareci
transgenici ce au o mutaţie TRAF 2 dominant negativă au numai un uşor
defect în răspunsul lor la TNF.
TRAF 2 s-ar putea să fie neesenţial pentru activarea NF-KB prin TNF,
sau ar putea exista un alt membru al familiei TRAF care se leagă de TRADD
şi NK şi se substituie lui TRAF 2.
TNFR 1 activează factorii transcripţionali NF-KB şi AP 1, ducând la
activarea unor gene proinflamatorii şi imunomodulatorii.
TNF, spre deosebire de CD 95 L, declanşază apoptoza numai dacă este
blocată sinteza proteică, ceea ce sugerează existenţa unor factori celulari
care anulează semnalul apoptotic generat de către TNF.
Expresia acestor proteine supresoare se pare că este controlată prin
intermediul NF-KB şi JNK/AP 1.
TNF determină trimerizarea TNFR 1 după legare, inducând asocierea
domeniilor morţii.
DR 3
Acest receptor 11 este asemănător lui TNFR 1, însă in timp ce TNF este
fucţional mai ales în limfocite şi macrofagele activate, ARNm pentru DR 3
este exprimat în mod constitutiv în multe ţesuturi.
Receptori Apo 2 L sau TRAIL 12 generează la fel ca CD 95 L apoptoza
în multe celule canceroase, însă spre deosebire de ultimul, care este restrâns
la celule T şi NK, ARNm pentru Apo 2 L se exprimă în numeroase ţesuturi.
DR 3 are o similaritate cu TNFR 1, deoarece, la fel ca acesta din urmă,
activează NF-KB prin TRADD, TRAF 2, RIP şi apoptoza prin TRADD,
17
FADD şi caspaza 8. DR 3 se leagă la Apo 3 L, care este legat structural de
TNF.
Apo 3 L activează NF-KB prin TRADD, TRAF 2, RIP şi NIK şi
declanşază apoptoza prin TRADD şi FADD.
Receptorii apoptotici pot fi utilizaţi în oncologie, deoarece au acces
direct la caspaze şi în plus iniţiază apoptoza independent de gena supresoare
tumorală p 53 care este inactivată prin mutaţie în 50 % din cazuri.
Domeniul morţii al CD 95 interacţionează cu FADD (Fas associated
death domain) prin intermediul domeniului morţii al acestuia din urmă.
FADD are un “domeniu declanşator al morţii” (death effector domain) care
se leagă la un domeniu analog repetat în tandem cu forma zimogenă a
caspazei 8 (numită FLICE sau MACH).
DED este un tip particular al unui domeniu de interacţie homofilică
numit CARD (caspaze recruitment domain), care există în unele caspaze cu
prodomenii mari (2, 8, 9, 10) 13.
După activarea lui FADD oligomerizarea caspazei 8 duce la activarea
ei prin autoclivaj. Caspaza 8 activează alte caspaze efectorii , cum ar fi
caspaza 9 - proteina mamaliană omoloagă lui CED 3- ducând la apoptoză.
Şoarecii knock-out pentru FADD în celulele T au o sinteză redusă de
celule T ca răspuns la stimularea antigenică, iar deleţia FADD duce la
moartea embrionilor 14.
3.2 Bcl – 2
Este primul reglator mamalian care permite supravieţuirea celulelor
hematopoietice citokin-dependente, în absenţa citokinei 1, in etapa Go insa .
18
Această descoperire a sugerat că supravieţuirea şi proliferarea celulară sunt
controlate de mecanisme genetice diferite. Bcl – 2 înregistrează diferite
forme de leziuni celulare şi decide dacă celula trebuie să declanşeze sau nu
apoptoza. Anumite cai apoptotice, precum cele ce declansate de activarea
receptorului apoptotic CD 95 evita acest nivel controlat de Bcl – 2.
Până acum au fost identificaţi cel puţin 15 membri ai familiei Bcl – 2
în celula mamaliană, prezentând cel puţin unul dintre cele patru motive
conservate cunoscute ca domeniile de omologie Bcl – 2 (BH 1 – BH 4) 2.
Majoritatea claselor cu funcţie antiapoptotică prezintă cel puţin BH1 şi BH2,
iar cei similari lui Bcl – 2 au toate cele patru domenii (Bax, Bak, Bok, au
BH 1, 2, 3 şi sunt strâns înrudiţi cu Bcl – 2). Mai există de asemenea alte 7
tipuri de proteine înrudite cu Bcl – 2 ce au numai un segment parţial omolog
cu BH 3 3 (9 –16 aminoacizi), şi care în mod normal posedă o funcţie
apoptotică (EGL – 1 de la C. elegans care se leagă la CED – 9). Bax, Bak şi
Bok au o asemănare puternică cu BH 1, 2, 3 din Bcl – 2.
Proteinele pro- şi antiapoptotice pot heterodimeriza şi isi anihila
reciproc funcţiile, iar mutageneza dirijată a segmentelor BH 1, 2, 3
influenţează în mod clar dimerizarea, modelul fiind reprezentat de Bcl – XL.
Conformaţia BH 1, 2, 3 crează un spaţiu hidrofob la care segmentul
BH 3 α helix amfipatic se poate lega. Heterodimerizarea nu este esenţială
pentru supravieţuire, dar este insa pentru apoptoză.
Bcl – 2 rezidă pe faţa citoplasmatică a membranei mitocondriale
externe, a reticulului endoplasmatic şi a anvelopei nucleare şi înregistrează
dinamica proceselor măsurând fluxul moleculelor mici sau al peptideor.
Experienţele realizate pe C. elegans au sugerat că proteinele
antiapoptotice inhibă direct abilitatea CED – 4 de a activa caspazele.
19
CED – 9 şi Bcl – XL se pot lega de CED – 4, care se leagă la rându-i
de CED – 3 şi îi stimulează activitatea.
Regiunea BH 4 a Bcl – XL este esenţială în activitatea antiapoptotică
şi interacţiunea cu CED – 4 şi poate servi ca un locus de ataşare directă
pentru CED – 4 şi modula structura Bcl – XL.
S-a descoperit recent că Bcl – XL 4 se leagă de porţiunea
asemănătoare CED – 4 din Apaf – 1, în timp ce procaspaza 9 se leagă de
domeniul de recrutare caspazică NH2 – teminal (CARD), şi că Bcl – XL
poate inhiba asocierea lui Apaf – 1 cu procaspaza 9 si ii inhibă astfel
activarea.
Bcl – 2, direct sau indirect, previne eliberarea din mitocondrii a
citocromului c care cu ATP poate schimba structura Apaf – 1 şi poate activa
caspazele.
Structura lui Bcl – XL (segmentele 5 şi 6) se aseamănă cu insertia
membranară a toxinelor bacteriene, ducând la ideea că factorii cu BH 1, 2
funcţionează prin formarea de pori în membrane.
În timp ce proteinele proapoptotice antagonizează în mod direct cu
proteinele antiapoptotice prin intermediul liganzilor de tip BH 3, grupul Bax
poate distruge direct organitele , chiar în prezenţa inhibitorilor caspazei;
expresia proteinelor asemănătoare Bax poate ucide celulele, condensând
ADN şi alterând membranele fără activarea caspazelor, prin formarea unor
pori în membrane.
Familia Bcl – 2 este reglată de către citokine, unele gene
proapoptotice fiind induse de către acestea, iar bax este activat în cadrul
răspunsului mediat de p 53.
20
În celulele hematopoietice stimulate de IL – 3, Bad este fosforilat şi
produsul sechestrat în citosol, iar semnalul de la receptor pare a fi transmis
de PI 3 kinaza prin kinaza Akt la Bad.
Bcl – 2 poate fi activat prin fosforilarea Ser70 şi inactivat prin
fosforilare de către JNK.
Bcl – 2 protejază împotriva unor atacuri citotoxice (radiaţii γ, UV),
dexametazona, staurosporina, dar nu impotriva apoptozei declansata de
CD95.
Dacă şoarecii bcl – 2 -/- se dezvoltă normal până la o anumită vârstă,
cei bcl – x -/- mor in utero, iar cei bax -/- au celule T cu senzitivitate la γ –
iradieri; testele au arătat că Bax este responsabil pentru moartea anormală în
bcl – x -/- şi cea limfoidă în bcl – 2 -/-.
În condiţii suboptimale, bcl – 2 promovează intrarea în starea de
neactivitate şi întârzie declanşarea unui nou ciclu, iar acest efect este separat
genetic de funcţia de supravieţuire, deoarece inhibarea ciclului celular nu
inhibă supravieţuirea, care este afectată printr-o deleţie într-o buclă
neconservată, sau prin mutatie la nivelul tirozinei 28.
Inhibiţia poate implica o proteină care se leagă la regiunea Bcl – 2 ,
precum calcineurin fosfataza. Celulele T care exprimă Bcl – 2 sintetizează
mai puţină IL – 2, citokină necesară intrării în faza S, datorită translocării
nucleare reduse a NFAT, care cere calcineurina, pe care Bcl – 2 o poate
sechestra în membranele intracelulare.
Odată ce a fost descoperită funcţia apoptotică a lui Bcl – 2, a fost
analizată şi funcţia sa în oncogeneză.
În şoarecii transgenici Bcl – 2 se acumulează în exces celule B
mature, iar limfoamele prezintă adesea translocaţii Myc.
21
Sinergia myc şi bcl – 2 a fost demonstrată în cazul limfoamelor si a
cancerului mamar la şoarecii bitransgenici.
Toate genele bcl – 2 sunt potenţial oncogenice, iar unele mutaţii
probabil măresc expresia în mod indirect. În celulele hematopoietice Myb,
Ras, AML – 1 – ETO induc expresia bcl – 2 iar fenomenul de supraexpresie
este întâlnit în leucemia mieloidă.
3.3 Mitocondria şi apoptoza
Deşi inhibarea caspazelor blochează apoptoza indusă de etoposidă,
actinomicina D, UV, staurosporină, expresia c – myc, glucocorticoizi, nu
menţine însă capacitatea replicativă a celulei. În cele din urmă celula moare,
pe o cale nonapoptotică, probabil necrotică. 1
Proteinele antiapoptotice Bcl – 2, Bcl – XL şi Abl pot menţine
capacitatea de supravieţuire şi multiplicare chiar în urma tratamentelor, iar
Bax poate induce moartea celulei prin distrugerea mitocondriei chiar şi în
absenţa caspazelor. 2
Există cel puţin trei mecanisme de atac:
1. distrugerea lanţului transportor de electroni, a fosforilării oxidative
şi producerii ATP;
2. eliberarea proteinelor ce determină activarea caspazelor;3
3. alterarea potenţialului redox. 4
1. Radiaţiile γ induc apoptoza în timocite şi distrug lanţul
transportor de electroni, probabil la nivelul citocrom b – c 1 / citocrom c, prin
intermediul unui ceramid care funcţionează ca un mesager secundar , iar
ataşarea Fas duce la afectarea aceluiaşi transport la nivelul citocromului c.
22
O consecinţă a acestui mecanism este scăderea concentraţiei de ATP
care are loc târziu în apoptoză, şi probabil ca nu are o funcţie esenţială.
Importanţa mitocontriei în apoptoză a fost sugerată de către analizele
sistemelor noncelulare, unde condensarea nucleară şi fragmentarea ADN ce
era inhibată de Bcl – 2 era dependentă de existenţa mitocondriei.
Eliberarea citocromului c în citosol este inhibată de către Bcl – 2,
aceasta facand parte din “apoptozom” , format în plus de Apaf – 1 şi
procaspaza 9. 5
Activarea ultimei duce la activarea celorlaltor tipuri caspazice, iar
inhibitorii acestora nu previn eliberarea citocromului c indusă de UV,
staurosporină, Bax, dar o previn pe cea indusa de catre activarea Fas.
Consecinţa elliberării citocromului c depinde de tipul celular,
deoarece în acele celule unde citocromul c este în exces, caspazele sunt
activate, şi sufucient citocrom c rămâne depozitat datorită afinităţii ridicate
pentru citocromii b – c1, în acest caz consumul de oxigen şi producţia de
ATP putand continua în timp ce caspazele îşi continuă demersul.
Alternativ, în celulele ce conţin cantităţi mari de înhibitori ai
caspazelor, eliberarea citocromului c poate eşua în declanşarea apoptozei şi
poate genera un mecanism necrotic.
Mitocondria eliberează şi alţi mediatori apoptotici, cum ar fi
procaspaza 3, AIF, care este blocat de către Z VAD – Fmk, un inhibitor
caspazic general.
Un alt mecanism de distrugere îl constituie generarea anionului
superoxid 6 care creşte în timpul apoptozei, însă implicarea exactă nu a fost
precis lămurită.
Distrugerea potenţialului transmembranar se realizează prin
intermediul unui por special, 7 format din proteine ale membranei interne
23
(ANT) sau externe (porina) care funcţionează sinergistic, la punctele de
contact.
Deschiderea unui canal nonselectiv, în membrana internă generează un
echilibru ionic între matrice şi spaţiul intermitocondrial, anulând gradientul
de H+ şi generând o modificare de volum datorită diferenţei osmotice, ceea
ce distruge membrana externă, eliberând proteinele activatoare ale
caspazelor.
Blocanţii formării unui asemenea por (ciclosporinele şi acidul
bongkrekic ) anulează apoptoza, acelaşi efect avându-le şi Bcl – 2.
Un alt mecanism de distrugere a membranei mitocondriale externe,
implică hiperpolarizarea 8 membranei mitocondriale interne, datorită unui
export de protoni ce protonează acizii slabi, care difuzează liber prin
membrana internă, schimbând osmolaritatea, mărind matricea mitocondrială
şi rupand membrana externă.
O altă legătură între apoptoză şi fiziologia mitocondriei este sugerată
de prezenţa proteinelor familiei Bcl – 2 în membranele mitocondriale 9.
Omologul Bel – 2 din C. elegans CED – 9 este tradus de pe un ARNm
dicistronic care codifică atât pentru CED – 9 cât şi pentru citocromul b, ceea
ce implică că CED – 9 derivă din simbionţi promitocondriali, şi a fost
transferat în genomul nuclear.
Membrii Bcl – 2 sunt ancoraţi în membrana mitocondrială externă
printr-un segment hidrofobic de aminoacizi, localizat la capătul COOH, iar
restul proteinei orientat spre citosol.
O mare varietate de evenimente mitocondriale depind de Bcl – 2, ca de
pildă inhibarea eliberării Ca2+ din matrix indusă de decuplanţi ai respiraţiei.
24
Proteinele Bcl – XL sunt compuse din 7 α – helixuri legate prin bucle
flexibile şi au o mare asemănare cu domeniile formatoare de pori ale unor
tipuri de toxine bacteriene (toxina difterică, colicina) 10.
Pot forma canale ionice, iar deleţia helixurilor 5 şi 6 duce la inexistenţa
porilor. Bcl – 2 reglează o mare varietate de evenimente chiar în prezenţa
unor inhibitori ai caspazelor (Z VAD – Fmk) – inhibă nu numai apoptoza
dependentă de caspaze, ci şi necroza indusă de hipoxie – , iar Bax induce
eliberarea citocromului c şi apariţia apoptozei chiar la drojdii care nu au
caspaze.
Deşi implicarea mitocondrială şi a citocromului c poate nu este
universală, aceasta apare frecvent la eucariote. Până acum nu a fost găsită o
corelatie între citocromul c şi apoptoza la nematode şi insecte (la primele
activarea caspazelor prin interacţiunea cu CED – 4 se realizează fără
citocromul c).
3.4 Caspazele
Sunt o familie de cistein proteaze şi au capacitatea de a distruge
importante grupări proteice, proteoliza fiind un proces ireversibil.
Precursorii caspazelor nu au capacitate enzimatică, clivarea
proteolitică transformându-i în grupări active, aceasta realizându-se prin
intermediul altei proteaze sau prin autocataliză, datorita legării unor
cofactori sau al îndepărtării unor inhibitori.
Reacţiile proteolitice sunt de obicei specifice, aceasta fiind conferită
de combinarea structurilor secundare şi terţiare ale substratului.
Odată cu descoperirea faptului că CED – 3 1,2 , caspază existentă la
nematodul Caenorhabditis elegans, este înrudită cu enzima transformatoare
25
a interleukinei 1β (ICE, caspaza 1), a fost descoperit rolul apoptotic al
acestei familii de proteaze, acestea având similarităţi în secvenţa de
aminoacizi, structură şi specificitatea de substrat.
Sunt sintetizate ca proenzime (30 – 50 KDa), au un domeniu
aminoterminal cu rol reglator, o subunitate mare (20 KDa) şi una mică (10
KDa), iar activitatea implică procesări proteolitice între domenii, urmată de
ansamblarea subunităţilor într-un heterodimer.
Prin cuplarea a doi dimeri rezultă un tetramer cu două situsuri active,
cu funcţionare independentă. 3
Domeniul aminoterminal, cu o dimensiune variabilă, este implicat în
reglare, iar activare presupune recunoaşterea a cel puţin patru aminoacizi la
nivelul situsului de clivare, ceea ce este suficient.
Motivul de recunoaştere prezintă o diversitate la nivelul diferitelor
caspaze, ceea ce explică probabil diversitatea funcţiilor. 4
Cu toate acestea, nu toate proteinele ce conţin secvenţa de patru
aminoacizi sunt clivate, ceea ce constituie un argument pentru importanţa
structurilor tertiare şi cuaternare.
Clivarea proteolitică nu numai că este specifică, dar este şi eficientă
( kcat / Km > 106 M-1 S-1). Specificitatea extraordinară a caspazelor implică
faptul că proteoliza este extrem de selectivă, iar trăsăturile fundamentale ale
apoptozei (fragmentarea ADN, condensarea cromatinei, formarea corpilor
apoptotici) nu pot fi înţelese fără o aprofundare a mecanismelor de
funcţionare a caspazelor. Prima funcţie a caspazelor este aceea de a inactiva
proteinele care protejază celulele vii de apoptoză. În timpul apoptozei, ICAD
este inactivat de către caspaze, eliberând CAD 5. Pe de altă parte, CAD
eliberat în absenţa inhibitorului nu este funcţional, ceea ce argumentează în
favoarea unor modificări cotranslaţionale CAD - ICAD. 6
26
Caspazele contribuie la apoptoză prin dezansamblarea structurilor
celulare, precum lamina nucleară, formată din polimeri ai filamentelor
intermediare (laminele A, B, C) 7,8 . Caspazele clivează proteine implicate în
formarea citoscheletului,cum ar fi gelsolina, FAK ( focal adhesion kinase ),
sau PAK2 (kinaza 2 activata de p 21). 9
Un alt mecanism de acţiune îl reprezintă dezansamblare multimerilor,
prin atacarea în special a domeniilor reglatoare sau efectoare.
Strategia caspazelor constă în ruperea legăturilor celulei cu vecinii,
dezorganizarea citoscheletului, afectarea replicării şi reparării ADN, a
splicing-ului, ruperea ADN, a membranei celulare, si in determinarea
semnalizarea unor mesaje cu funcţie în fagocitoză şi formarea corpilor
apoptotici.
Reglarea activităţii caspazelor se realizează pe mai multe nivele.
Activarea caspazelor efectorii se realizează prin cascadă, semnalul
proapoptotic culminând cu activarea unei caspaze cu funcţie iniţiatoare, care
la rândul ei activează caspazele efectorii.
Există mai multe tipuri de caspaze care mediază seturi distincte de
semnale, ca de exemplu caspaza 8 care este asociată cu receptorii apoptotici,
în timp ce caspaza 9 este implicată în apoptoza indusă de agenţii citotoxici.10
Activarea caspazelor iniţiatoare. Acest proces implică legarea unor
cofactori specifici, fenomen declanşat de un semnal proapoptotic ce rezidă în
două motive structurale, unul în prodomeniul caspazei, iar celălalt în
cofactor. 11
Activarea procaspazei 8 necesită ataşarea FADD la DED, în timp ce
procaspaza 9 necesită citocromul c şi ATP, si legarea de CARD.
27
Modelul autoproteolitic descrie fenomenul prin preexistenţa unor
precursori în celule cu o conformaţie ce previne clivarea.
Cofactorii sunt similari în secvenţă cu procaspaza 8, exceptând faptul
că le lipsesc fragmentele cu funcţie catalitică. Aceste proteine
competiţionează cu procaspazele 8 pentru FADD, prevenind activarea
caspazelor.
Un alt mecanism de reglaj îl constituie compartimentalizarea, deoarece
extracte din celulă activează caspazele.
4 . Proteine cu funcţie adaptorie
După interacţia receptor-ligand are loc cuplarea acestora cu proteine
citoplasmatice care la rândul lor activează efectorii citoplasmatici.
Există două clase, prima cuprinzând TRADD, FADD, RIP, iar a doua
– TRAF 1, TRAF 2, TRAF 3.
TRADD 1 este asociată cu TNFR 1, are o masă de 32 KDa, şi
interacţionează cu domeniul morţii din receptor. Are un domeniu identic 25
% cu cel similar din receptor în zona carboxiterminală, zona aminoterminală
fiind identică.
FADD se cuplează cu domeniul morţii din Fas, iar segmentul DED
(domeniul apoptotic efector) se cuplează cu segmentul omolog al caspazei 8.
RIP 2 este o altă moleculă de 74 KDa care interacţionează cu domeniul
morţii al lui Fas, fiind implicată însă şi în inducerea NF-KB de TNFR 1.
Fiind o serin/treonin kinază, poate fi uşor activată şi pentru acest rol. RIP
poate interacţiona şi cu TRADD şi induce apoptoza.
RAIDD (RIP associated ICH – 1/CED 3 homologous protein with
death domain) este o altă moleculă adaptor care este implicată în
28
transmiterea semnalului apoptotic pe calea TNF, şi posedă un domeniu
CARD omolog cu altul de pe procaspaza 2.
TRAF. Există 6 tipuri de asemenea molecule, având în comun un
segment de 150 de aminoacizi, implicat în interacţiunea cu alte molecule.
TRAF se poate cupla şi cu TRADD, fiind implicată aşadar în
semnalizarea TNF 1, iar TRAF 2 activează NF-KB printr-un mecanism încă
necunoscut.
FLICE. 3Activarea adaptorilor duce la declanşarea atacului caspazic.
Caspazele se găsesc în celule sub forme inactive, activarea realizându-
se în cascadă. Proteinele FLICE (FADD-like ICE) au domenii de omologie
cu FADD şi cu ICE/CED 3 din clasa caspazelor.
Au două lanţuri aminoterminale de 60 de aminoacizi fiecare, având
similaritate de 35 % cu domeniul morţii din FADD. 4
MACH. 5 Este omoloagă cu CED 3, are o masă moleculară de 34 KDa
şi este monomerică. Diferitele forme au segmentul carboxiterminal variabil,
aici fiind localizate segmentele omoloage cu ICE/CED 3.
Regiunile omoloage au activitate proteazică de tip cazpază şi pot
induce activarea acestora.
FLASH 6Au aceeaşi funcţie de activare a caspazelor ca şi cele de
dinainte, având secvenţe similare cu domeniile morţii ce se pot cupla cu
regiuni omoloage din caspaze sau adaptor.7
5. AIF 1
Analiza mecanismelor apoptotice independente de apoptozom
(citocrom c/Apaf 1/caspaza 9)a dus la înţelegerea funcţiei factorului de
29
inducere a apoptozei (AIF) localizat la fel ca şi Bcl –2 în spaţiul
intermembranar mitocondrial.
Adiţia AIF la sisteme nucleare acelulare declanşază trăsăturile tipice
ale apoptozei, cum ar fi condensarea cromatinei şi fragmentarea ADN.
Liniile celulare aif -/y (gena AIF este X – likată) aveau o proliferare
normală in vitro, şi spre deosebire de citocrom c -/-, apaf -/-, caspaza 9 -/-,
aveau o susceptibilitate normală la apoptoză în urma anulării potenţialului
mitocondrial, tratamentului cu staurosporină, etopozida, azidă, ultraviolete,
anizomicină, lucru constatat chiar în prezenţa inhibitorului caspazic Z –
VAD-fmk.
Acest tip de apoptoză este necesar în decursul dezvoltării embrionare,
mai ales în momentul formării cavităţii amniotice, proces ce nu necesită
funcţionarea apoptozomului.
Calea este încă necunoscută.
6. ASPECTE GENTICE ALE APOPTOZEI
7.p 53 si cancerul
Apoptoza reprezintă ultima solutie pentru celula şi este folosită mai
ales în cazul celulelor care constituie un factor de risc neoplazic.
În procesele de răspuns la leziuni sunt implicate mai multe protein
kinaze, înrudite cu PI 3 kinaza 1, cum sunt ATM, ce suferă mutaţie în ataxia
telangiectasia şi DNA-PK 2, care are un rol important în recombinarea V(D)J
şi protejarea telomerelor.
30
Aceste două protein kinaze sunt omoloage cu Rad 3/MEC 1 de la
drojdii şi sunt implicate în strategia răspunsului la distrugere. p 53 este
eliberat de Mdm 2 datorită fosforilării acestuia de ADN – PK şi prin PK
activate de stress (SAPK/JNK), care este iniţiată prin MEKK 1 şi implică
fosforilări secvenţiale şi prin activarea căii SEK 1/ MEKK 4 sau SAPK/JAK
şi c – Jun.
Proteina cu rol în supresia tumorii (p 53), este menţinută în mod
normal la un nivel scăzut prin interacţia cu Mdm 2 care este implicată în
distrugerea sa.
Leziunile de la nivelul DNA induc fosforilarea p 53 sau Mdm 2
împiedicând interacţia lor şi activând p 53. Aceasta este ineficientă în
numeroase cancere, iar Mdm 2 este amplificată în unele tumori. 3
Concepţia clasică era cea a alternativei: reparare ADN sau moarte
pasivă. Datorită înţelegerii funcţiei p 53, astăzi ştim că se poate alege în
afară de reparare între blocarea ciclului celular şi apoptoză.
Dacă funcţia p 53 in cadrul ciclului celular si blocarea lui a fost
suficient studiată, rămâne obscură insa relaţia cu apoptoza.
Se ştie că Bax, IGF-1, IGF-BP3 sunt proteine ţintă ale p 53, dar nu se
cunosc exact relaţiile dintre ele. 4
p 53 este implicată şi în răspunsul celular la privare fizică, leziuni
fizice, şoc termic, hipoxie şi expresia myc sau E1A. 5
Prima proteină cu funcţie proapoptotică a fost c-myc, al cărei transcript
aparţine clasei bHLH zip. Un posibil factor implicat în funcţia apoptotică a
c-myc este clasa cdk. 6
Acstea sunt activate în apoptoza neuronilor “înfometaţi”, a limfocitelor
tratate cu citocalasina B, TNF, FAS sau proteina Tat virală, si in
diferenţierea miocitelor.
31
E1A este principala proteină oncogenică codificată de un adenovirus şi
la fel ca myc, este un inductor apoptotic.
O posibilă interpretare a apoptozei indusă de myc, E1A şi E2F, este
aceea că apare un conflict intre tendinţa de dezvoltare indusă de oncogenă şi
semnalele inhibitorii ale creşterii, ceea ce face loc acţiunii p 53.
În timpul infecţiei virale, E1A determină acumularea de p53 care ar
induce apoptoza dacă nu ar fi proteinele clasei E1B, p 19 şi p55 7. E1B 19 K
este un omolog al lui Bcl-2, iar 55 K se leagă de p 53 şi îl inactivează.
Apoptoza indusă de oncogene poate sugera interdependenţa dintre
sistemul apoptotic şi cel al creşterii celulare: prin modelul semnalizării
binare induce mesaje apoptotice care în mod normal sunt anihilate de către
mesajele de supravieţuire generate de către celelalte celule 8.
Relaţia este reciprocă deoarece în anumite circumstanţe anihilarea
apoptozei induce oprirea proliferării.
Deşi expresia Bcl-2 opreşte apoptoza, celulele afectate au probleme în
continuarea ciclului celular 9 şi, reciproc, Bax accelerează acest proces 10.
Un exemplu interesant îl constituie cazul oncoproteinei Ras care este
un transductor normal al Raf-MAP K şi al activării PI 3 K, AK 1 sau Bcl, în
urma cuplării receptorului IGFI 11.
Mutaţia oncogenică a lui Ras induce proliferarea celulară şi blocarea
apoptozei, însă exprimarea sa în celulele netransformate duce la efecte
contrarii, datorită Raf.
p 53
O trăsătură importantă a celulelor maligne o constituie proprietatea lor
de a supravieţui în condiţii de instabilitate genomică ridicată, care este
32
generată prin deleţia senzorilor de distrugere, atenuarea semnalelor
apoptotice şi prin creşterea semnalelor de supravieţuire (citokine solubile,
factori de creştere, contacte prin matricea celulară).
Aproape 50 % din cazurile de cancer implică o deficienţă în
funcţionarea p 53.
Timocitele p 53 -/- nu intră în apoptoză, însă adiţia de glucocorticoizi o
induce, ceea ce indică existenţa căilor p 53 independente; de asemenea
celulele bax -/- intră în apoptoza mediată de p 53.
p 53 este un factor de transcripţie cu localizare nucleară; are un
domeniu aminoterminal de activare şi unul central de interacţiune cu ADN la
nivelul unor secvenţe consensus, majoritatea mutaţiilor missense fiind
localizate aici.
Are un turn-over rapid (20’) şi este menţinut în stare inactivă prin
interacţie cu Mdm 2.
În urma leziunilor ADN p 53 este prelucrat posttranscripţional,
devenind astfel mai stabil. p 53 este esenţial în cazul apoptozei
folicoblastelor embrionare murine induse de E1A; de asemenea, activează p
21 prin inhibarea represorului. p 21 se leagă la complexele cdk – cicline
care intervin în tranziţia G1 / S şi previne fosforilarea Rb, blocând eliberarea
E 2 (factori transcripţionali) şi implicit blocând ciclul celular. p 21 se leagă
de asemenea la PCNA (factor al ADN – polimerazei δ) şi inhibă replicarea
ADN.
33
4. NF-kB si apoptoza 1
Citokinele TNF α sau IL – 2 induc translocaţia NF-kB prin dislocarea de
IkB, iar după aceasta are loc inducerea transcripţiei a numeroase gene care
reglează creşterea celulară, a unor receptori sau citokine.
Principala ţintă o constituie genele IAP care în mod normal inhibă
apoptoza.
NFkB este un heteodimer uzual de 50 KDa, însă a mai fost identificată
şi o a doua formă, de 65 de KDa.
Datorită activării TNFR 1, NF-kB est activat, protejând celula de
intrarea în apoptoză, iar activarea A1 / BFI – 1 determină inhibarea eliberării
citocromului c şi blocarea activării caspazei 3.
LMP 1 2 (proteina membranară a virusului Epstein – Barr) simulează
acţiunea lui TNFR 1 prin legarea la TRAFs şi TRADD şi induce sinteza NF-
KB.
7. MODIFICARI NUCLEARE IN APOPTOZA
Dinamica nucleară este de obicei caracterizată ca fiind dominată de
condensarea periferică a cromatinei, fragmentarea ADN şi formarea unor
corpi apoptotici care înglobează fragmente nucleare.
Cu toate acestea, apoptoza citoplasmatică decurge normal şi în
celulele care au mutaţii în genele implicate în dezintegrarea nucleului şi în
cele anucleate.
În 1994 Schulze-Osthoff 1 a evidenţiat faptul că în celulele anucleate
aparţinând liniei L 928 dintr-un fibrosarcom murin tratamentul cu
34
citocalazina B induce apoptoza clasică, si ca absenţa fragmentării nucleare
nu blochează calea apoptotică mediată de Apo 1 / Fas.
Mai mult, inhibitorii endonucleazelor nu blocau apoptoza indusă Apo
1 / Fas în celulele L 929.
TRASATURI STRUCTURALE
a) relatia condensare-apoptoza
S-a discutat mult timp despre relatia dintre condensarea cromatinei si
fragmentarea ADN. Prima etapă observabilă este condensarea cromatinei la
nivelul membranei celulare, ipoteză sugerată de inelul dens ce apare în
microscopia electronică2, condensare care cuprinde întreg nucleul, ulterior
acesta dezintegrându-se şi fiind înglobat în corpii apoptotici.
Caspazele 3 şi 6 sunt implicate în activarea DFF 40 (CAD), clivarea
PARP, laminelor şi a factorilor de ataşare la structuri scaffold. 3
Clivarea laminelor are loc în urma activării caspazei 6, iar mutanţii cu
lamine neclivabile A şi B prezintă o întârziere apreciabilă în ceea ce priveşte
fragmentarea nucleară. Alte studii insa au demonstrat faptul ca unele celule
incubate cu proteinaza K prezintă o clivare a laminei B, lucru care nu este
suficient totusi pentru a declanşa condensarea nucleară.
Ipoteza sugerata de alte studii este aceea că modificările structurale
nucleare nu necesită digestia proteinelor structurale, ultimul proces doar
acompaniind evenimentul apoptotic, şi că aceste schimbări se datorează unor
factori apoptotici nucleari activaţi prin caspaze (exceptând AIF). 4
Dupa asemenea studii clivarea caspazică nu este necesară în
condensarea primară însă este esenţială în separarea finală a nucleului.
35
Mutanţii care au lamine neclivabile erau rezistenti la proteoliză, fapt
care afecteaza condensarea nucleară şi distrugerea nucleului, care capata
aspect convolut, nucleul suferind colapsul chiar în absenţa condensării
nucleare, proces care are loc şi în urma inhibării proteazelor laminare.
Există trei posibile explicaţii pentru a împăca observaţiile uneori
conflictuale. 5
1. Inhibarea clivării laminare poate bloca detaşarea ADN de lamină,
care va colapsa în zona centrală.
2. Lamina neclivabila previne fragmentarea nucleară ca are loc în
mod normal prin agregarea cromatinei în corpi apoptotici.
3. Distrugerea laminei facilitează apoptoza prin deschiderea nucleului
şi expunerea lui la factori citoplasmatici cu rol în activarea
nucleazelor.
a) fragmentarea ADN – condensarea cromatinei
Aceasta are loc în etapa următoare la nivelul unor segmente de 30 – 50 Kpb
şi 200 – 300 Kpb.
Clivarea internucleozomală generează fragmente de ADN multipli ai
lungimii lui în jurul nucleozomului, fiind inhibată de zinc, inhibare care insa
nu afectează condensarea cromatinei.
Studiile lui Rao 6 pe celule infectate cu oncogena E1A au arătat că
deşi în faza iniţială are loc o accelerare a replicării ADN, ulterior acumularea
p 53 induce apoptoza. Acest proces este inhibat de către E1B 19 K care este
similar cu Bcl – 2 şi care probabil interacţionează cu lamina nucleară.
36
Familia caspazică ICE recunoaşte şi taie la nivelul unui aspartat în poziţia P
1 a unei secvenţe consensus. PARP este clivată de asemenea la nivelul unui
aspartat în secvenţa DEVD↓D.
Lamina A are două situsuri, 230 şi 446 în secvenţele EVDNG şi
EIDSG, iar aspartatul 230 este conservat la om, şoarece, pui, Xenopus,
Drosophila.
Fragmente din laminele A/B/C la nivel 220 – 390 au fost generate ca
proteine de fuziune cu GST (GST LA 220 – 390 / GST LB 220 – 390) şi au
fost purificate pe Sepharose, si s-a stabilit astfel ca substituţia în P 1 a
asparatului cu alanina generează mutanţi rezistenţi la clivaj.
Extracte citoplasmatice din celule trasformate cu E1A şi p 53 au fost
blottate folosind anticorpi anti-GST şi a fost evidenţiată o creştere a cantităţii
de fragmente raportată la timp.
Clivajul laminar se realizează la 32° C, dar nu la 38° C, ceea ce
fundamentează implicarea p 53, insa nici un fragment nu a fost observat în
celulele infestate cu E1B 19 K la 38° C sau 32° C, care previne de asemenea
procesarea CPP 32 şi clivarea PARP în linii CHO.
Inhibarea proteolizei laminare in vitro în urma tratamentului cu FLCK
blochează modificările nucleare, iar activarea nucleazelor este importantă în
apoptoza nucleară, fragmentarea ADN acompaniind pierderea viabilităţii în
apoptoza indusă E1A p 53 dependenta. Degradarea laminei B1 în timocite
precede fragmentarea ADN, dar inhibarea cu TLCK nu blochează clivarea
internucleozomală a ADN în sisteme noncelulare.
Mutanţii deficienţi în expresia laminelor au pierdut din viabilitate în
18 ore iar microscopul electronic a evidenţiat un nucleu cu lamină intactă, cu
un aspect inedit. În cele din urmă nucleii au suferit un colaps şi apoptoza a
continuat normal.
37
CIDE – N SI CIDE B
La vertebrate au fost descoperite două noi familii de gene, Cide N şi CIDE B 7, care codifică pentru două proteine omoloage segmentului aminoterminal
de la DFF 45. Segmentul carboxiterminal al CIDE are un domeniu efector
suficient degradării ADN, iar segmentul aminoternimal are funcţie
reglatoare.
Sunt omoloage cu DFF 45, au un segment aminoterminal similar
segmentului CIDE – N din CAD care are funcţie reglatorie, si un domeniu
carboxiterminal killer (CIDE – C).
În timp ce funcţia proapoptotică a moleculelor întregi de CIDE este
inhibată de către DFF 45, CIDE – C singura induce apoptoza, ceea ce
sugerează o funcţie reglatorie a CIDE – N.
CIDE – N are 5 lanţuri β – pliate şi 2 α – helixuri, aranjate într-o
pliere α /β. Studii NMR au evidenţiat faptul că CIDE – N reacţionează cu
CIDE – N din DFF 45 sau DFF 40. Suprafaţa de contact este polară şi are
două regiuni de semn contrar. Juxtapunerea inedită a regiunilor bazice şi
acide sugerează o interacţie bipolară electrostatică.
Lanţurile 1 şi 2 sunt legate printr-o buclă şi formează un ac de păr în
structură pliată, helixul 1 este împachetat în mod antiparalel faţă de lanţurile
4, 5, 6, iar segmentul 5 este paralel cu o parte din segmentul 1 şi formează
un complex β pliat.
Fenilalaninele 38, 39, 90 sunt incluse în nucleul hidrofob al moleculei,
triptofanul 108 împachetează bucla carboxiterminală înteracţionând cu
valina 76, alanina 83 şi metionina 100 din lanţurile 3 şi 5.
Reziduurile aromatice 90 şi 108 sunt conservate în toată familia
CIDE, mutaţiile la acest nivel afectând capacitatea nucleazică.
38
c) FRAGMENTAREA INTERNUCLEOZOMALA A ADN
O altă dogmă a studiilor despre apoptoză a fost aceea a
oligonucleozomizării. Studiul lui Oberhammer a evidenţiat o fragmentare la
nivelul de 300 Kpb şi 50 Kpb înainte de clivarea internucleozomală.
Existenţa a două tipuri de lungime a fost explicată prin funcţionarea a două
nucleaze diferite sau prin diferenţa topologică a cromatinei. 1
În timp ce clivarea la nivelul segmentelor 300 Kpb era explicata prin
localizarea la nivelul ADN a topoizomerazei II la distanţe de 300 Kpb,
facilitând detaşarea de proteinele scaffold, existenţa fragmentelor de 50kpb
se datora functonarii unor nucleaze specializate. Alti cercetatori au observat
ca pe masura ce cantitatea de fragmente 300kpb scadea, cea de 50kpb
crestea, ceea ce justifică ipoteza derivării fragmentelor de 50 Kpb din
primele. 2
Alte studii au arătat că fragmentarea ADN este independentă de
clivarea ADN linker şi că ultima depinde de acţiunea unor factori adiţionali
care afectează conformaţia nucleozomală.
Celulele 10T ½ intrate în apoptoză nu puteau fi distinse de timocitele
în aceeasi situatie, când analiza se făcea cu o mărire de cca. 25000 de ori la
microscop.
ADN extras din 10T ½ apoptozate (celule embrionare murine
pluripotente) era dublu catenar, de aproximativ 20 Kp, fără clivări
internucleozomale, existând modificări monocatenare prin introducerea
siturilor senzitive alkaline ca şi a celor S1 hipersenzitive. Analiza ADN
denaturat termic în gel de formaldehidă a arătat existenta unor fragmente
mai mici de 400 baze în celule apoptotice, ceea ce sugerează că cele doua
39
tipuri de situsuri senzitive sunt în aceleaşi regiuni, ocurenţa lor fiind de 177
– 180 pb. 3
Introducerea unor situsuri abazice în regiunea linker constituie o etapă
intermediară în degradarea ADN, ceea ce sugereaza ipoteza ca clivarea
internucleozomală nu este universală.
Situsurile S1 hipersenzitive sunt asociate cu modificări în conformaţia
ADN prin tranziţii B – Z, ceea ce produce afectarea torsiunii ADN şi
modificări helicale, datorită introducerii unor repetiţii de purine şi guanidine
identice. Asemenea situsuri pot explica dispariţia H1 în apoptoză. 4
d) ICAD
Au fost identificate până acum două forme de ICAD, L şi S, care
diferă prin lungime (331 respectiv 269 aminoacizi), si care sunt traduse de
pe două ARNm diferite, produse prin splicing alternativ. 5
ICAD – L este necesar pentru producerea unui CAD funcţional, nu S
insa, facilitându-i plierea corectă. Probabil că ICAD – S funcţionează ca un
factor de reglare negativă a funcţiei chapperone a ICAD – L, sau probabil că
ICAD – L este translat preferenţial în celule ce vor intra în apoptoză.
Liniile celulare din timocite DFF – 45 deficiente sunt rezistente la
fragmentarea ADN în urma tratamentului cu dexametazonă şi au trăsături
distincte faţă de tipul sălbatic.
Au fost identificaţi mai mulţi factori cu funcţie în apoptoza nucleară.
e) Acinus 6 este un precursor al unui factor de condensare nucleară,
clivarea lui la Asp 1093 de către caspaza 3 fiind un pas necesar dar
40
nu şi suficient pentru activarea sa. O protează încă necunoscută
clivează Ser 987, eliberând subunitatea activă.
f) DN-aza II 7 derivă de asemenea dintr-un inhibitor proteazic al
elastazei leucocitare, printr-o modificare posttranslaţională care
este declanşată de o acidifiere citosolică, o modificare metabolică
ce însoţeşte adesea apoptoza, şi care adăugată la nucleii purificaţi
determină condensarea cromatinei şi înglobarea ei în fragmente
cromozomale.
g) Catepsina B 8 este activată prin eliberarea sa din lizozomi şi are
funcţie similară.
h) AIF 9 este de asemenea un factor de inducere a condensării
cromatinei independentă de caspaze.
i) Modificari nucleozomale
Un proces important în condensarea cromatinei îl constituie fosforilarea
histonelor cromozomale. 10
H1 este în mod normal fosforilată de către cdc 2 / H1 Kinaza,
atingand un maxim în mitoză, mai ales la segmentele carboxi- şi
animoterminale, H3 este fosforilată la nivelul Ser 10 în segmentul
aminoterminal si in cazul condensarii premature a cromozomilor, iar H2A in
mod constant de-a lungul intregului ciclu celular. H3 în apoptoză nu mai este
fosforilată la nivelul situsurilor uzuale .
H2B este un marker important în apoptoză deoarece este fosforilat în
mod distinct la nivelul Ser32, specific pentru apoptoză. Procesul debutează
cu o fosforilare în momentul fragmentării ADN la nivel nucleozomal, fiind
41
inhibat de 2 – Asp– CH2 – DCB, un inhibitor nespecific al ICE. Încă nu se
cunoaşte mecanismul exact. Probabil ca fosforilarea H2B faciliteaza
disocierea partiala a ADN linker si faciliteaza fragmentarea endonucleazica.
DFF 40/45
Şoarecii knock-out DFF 45 sunt deficienţi în ceea ce priveşte
condensarea cromatinei sau fragmentarea ADN, iar existenţa omologilor sau
a altor sisteme nucleazice nu este suficientă. 11
DFF 45 este un inhibitor al lui DFF 40, iar studii aprofundate au
demonstrat funcţia sa de proteină chapperone. De asemenea DFF 45 are o
funcţie importantă în sinteza DFF 40, în plierea şi în localizarea sa corectă.
Activarea DFF 40 necesită activarea caspazei 3 care clivează DFF 45
la nivelul aminoacizilor 117 şi 224. 12
DFF a fost identificat prin experienţe în care nuclei normali din ficat
de hamster au fost incubaţi cu HeLa S – 100. Caspaza 3 nu putea induce
singură fragmentarea ADN şi nici fracţia citosolică din HeLa.
După incubarea cu caspaza 3 DFF 45 a fost în două fragmente, de 30,
respectiv 11 KDal, şi ulterior a fost cuantificată reducerea cantitatii de 30
KDal, şi marirea celei de 11 KDal, ceea ce a sugerat că fragmentul mare este
un intermediar pentru cel mic. 13
DFF 45 are un ORF de 331 de aminoacizi, cu o structură inedită. DFF
este localizat citosolic, iar după activare este transportat în nucleu, unde este
implicat în degradarea cromatinei.
Studii genetice au identificat o genă CAD pe 1p 36.3, asociată cu o
pseudogenă, iar deleţia acestui fragment a fost indentificată în numeroase
tumori, mai ales în neuroblastoma.
42
Are o funcţie DN-azică intrinsecă, 14 dar analiza BLAST a identificat
un domeniu de omologie de 80 de aminoacizi cu proteina murină, localizată
în regiunea aminoterminală. Aceste molecule au o identitate de 43,3 %, între
24 – 83.
DFF este similară DN-azelor bacteriene care sunt codificate de către
genele colicinelor şi care sunt sintetizate cuplat cu inhibitorii specifici şi cu
NFkB – IKB.
Capacitatea este accelerată de adăugarea H1 şi HMG. DFF 40 induce
condensarea cromatinei când este adăugat la nuclei izolaţi, proces care nu
este inhibat de Z – VAD – FMF, ce determină blocarea acţiunii AIF. 15
9. Noi familii de gene
În ultima perioadă au fost descoperite noi familii de gene la Drosophila
melanogaster, cum ar fi REAPER, HID şi GRIM, care codifică pentru
inductori puternici ai apoptozei, în cursul dezvoltării embrionare.
Reaper este o moleculă mică (65 aminoacizi), cu o secvenţă inedită,
neavând omologi la celelalte specii şi fără funcţie catalitică evidentă.1 Se
leagă la o proteină numită SCYTHE, 2 care eliberează citocromul c,
disociind complexul Scythe – represor. Scythe se leagă de asemenea şi la
alte două proteine cu funcţie reglatoare, GRIM şi Hid.
GRIM 3 este o proteină citoplasmatică care în timpul apoptozei este
traslocată în mitocondrie, putând fi clivată de către caspaze la nivelul
domeniului carboxiterminal. GRIM nu necesită activarea p 53, iar GRIM,
hip şi reaper acţionează prin inhibarea Drosophila IAP (DIAP1) .4
La Drosophila melanogaster a mai fost identificat un factor reglator
DREP 1 5, omolog DFF 45, care inhibă apoptoza indusă de CIDE A.
43
Recommended