UNIWERSYTET RZESZOWSKI
AUTOREFERAT PRACY DOKTORSKIEJ
Roman Maślanka
Wpływ glukozy i jej metabolizmu na stan fizjologiczny,
potencjał reprodukcyjny i długość życia komórek
drożdży Saccharomyces cerevisiae
Promotor: dr hab. Renata Zadrąg-Tęcza, prof. UR
Promotor pomocniczy: dr Magdalena Kwolek-Mirek
Recenzenci:
Prof. dr hab. Janusz Maszewski, Uniwersytet Łódzki
Dr hab. Marek Skoneczny, IBB PAN
Dziedzina nauk ścisłych i przyrodniczych
Dyscyplina: nauki biologiczne
RZESZÓW 2019
2
Spis treści
1. Wprowadzenie .................................................................................................................... 3
2. Cel i zakres pracy ............................................................................................................... 5
3. Materiały i metody ............................................................................................................. 5
4. Struktura rozprawy doktorskiej .......................................................................................... 7
5. Wyniki badań ...................................................................................................................... 9
6. Podsumowanie .................................................................................................................... 18
Bibliografia ............................................................................................................................. 18
3
1. Wprowadzenie
Glukoza jest cząsteczką o niezwykle istotnym znaczeniu dla prawidłowej aktywności
komórek większości organizmów. Powszechnie uważa się ją za podstawowy substrat
energetyczny, bowiem wewnątrzkomórkowe procesy metaboliczne bazują na związkach
będących pochodnymi tej cząsteczki. Glukoza zapewnia także szkielet węglowy
wykorzystywany do biosyntezy makromolekuł komórki. Powoduje to konieczność ścisłego
wykrywania jej poziomu w otoczeniu komórki, o czym świadczy obecność szeregu
komórkowych białek spełniających m.in. rolę błonowych transporterów czy sensorów
glukozy (Magier i Jarzyna, 2013; Rødkaer i Faergeman, 2014). Jest to szczególnie widoczne
w przypadku organizmów jednokomórkowych, w tym drożdży Saccharomyces cerevisiae,
u których zmiana dostępności glukozy w środowisku determinuje sposób pozyskiwania
energii. Przy czym komórki drożdży preferencyjnie uzyskują energię na drodze fermentacji
alkoholowej, nawet w sytuacji pełnej dostępności tlenu w środowisku, co zwane jest efektem
Crabtree (Rodrigues i in., 2006). Ten swoisty paradoks energetyczny (preferencyjne
uzyskiwanie energii na drodze glikolizy w warunkach tlenowych) poza komórkami drożdży
obserwowany jest także w przypadku innych intensywnie proliferujących komórek w tym
komórek nowotworowych (Vander Heiden i in., 2009; Diaz-Ruiz i in., 2011) oraz komórek
macierzystych (Rafalski i in., 2012; Hu i in., 2016).
Glukoza jest przedmiotem wielu badań m.in. pod kątem jej wpływu na sprawność
fizjologiczną i długość życia szeregu organizmów (Lee i in., 2017). Prowadzone w tym
zakresie badania koncentrują się głównie wokół zagadnień związanych z ograniczeniem
podaży glukozy czyli z tzw. restrykcją kaloryczną (CR – ang. calorie restriction) (Roth
i Polotsky, 2012; Fontana i Partridge, 2015). Choć pozytywny wpływ CR na poprawę
sprawności fizjologicznej organizmów wydaje się być niekwestionowany (Fontana
i Partridge, 2015; Mattison i in., 2017), to jej wpływ na długość życia organizmów wydaje się
być sprawą mniej oczywistą i wciąż stanowiącą przedmiot dyskusji naukowej (Colman i in.,
2009; Austad, 2012; Mattison i in., 2012; Biliński i in., 2015). Szczególnie istotnych
obserwacji dotyczących CR dostarczyły badania prowadzone na małpach z rodzaju Rhesus
(Colman i in., 2009; Mattison i in., 2012). Okazało się w nich, że dostarczanie składników
odżywczych na zasadzie ad libitum, czyli nieograniczonego dostępu do pokarmu, może być
rozpatrywane jako stan nadmiaru kalorii (Colman i in., 2009; Austad, 2012; Mattison i in.,
2012). Nadmiar kalorii (CE – ang. calorie excess) oznacza stan, w którym ilość dostarczanych
4
składników odżywczych jest wyższa niż wynika to z rzeczywistego zapotrzebowania
energetycznego organizmu (Biliński i in., 2015). Kwestie nadmiaru kalorii nie są w pełni
poznane, w tym znacząco mało danych można znaleźć w odniesieniu do konsekwencji
nadmiaru kalorii obserwowanych na poziomie komórkowym. Analiza tego typu wydaje się
być szczególnie istotna ze względu na coraz częściej pojawiające się problemy związane
z nadmiarem glukozy dostarczanej organizmowi i zaburzeniami jej metabolizmu, zwłaszcza
w kontekście negatywnych zmian wywołanych otyłością czy cukrzycą typu 2.
W badaniach analizujących wpływ restrykcji kalorycznej na funkcjonowanie komórki
jako jeden z modeli badawczych wykorzystuje się komórki drożdży S. cerevisiae. Badania te
dotyczą głównie wpływu warunków CR na sprawność fizjologiczną i replikacyjną długość
życia komórek drożdży (Lin i in., 2002; Sharma i in., 2011; Schleit i in., 2013). Niemniej
jednak niewiele jest danych dotyczących zmian wywołanych działaniem nadmiaru kalorii,
wynikającym z wysokich stężeń glukozy w podłożu hodowlanym. Obecnie istnieją tylko
ograniczone dane pokazujące wpływ wysokiego stężenia glukozy na wybrane aspekty
fizjologii komórek drożdży (Weinberger i in., 2010; Zuin i in., 2010).
Przyjmuje się, że wyrazem sprawności fizjologicznej komórki są jej możliwości
proliferacyjne, bowiem proliferacja wymaga pełnej synchronizacji procesów metabolicznych
i znacznych nakładów inwestycyjnych. Zjawisko ograniczonej zdolności proliferacyjnej poza
komórkami ssaczymi (Tschen i in., 2009; Gunin i in., 2011), notowane jest także dla
pojedynczych komórek drożdży S. cerevisiae. Ich ograniczone możliwości reprodukcyjne
tłumaczy się biorąc pod uwagę różnorodne czynniki, w tym gromadzenie agregatów
białkowych, wzrost liczby pozachromosomalnych kółek rDNA czy akumulację uszkodzonych
mitochondriów (Smith i in., 2015). Alternatywnym wyjaśnieniem tej kwestii jest hipoteza
hipertrofii odnosząca się do relatywnie dużych rozmiarów uzyskiwanych przez komórki,
które zakończyły proliferację (Zadrag-Tecza i in., 2009; Biliński i in., 2012). Wskazuje ona
na istnienie ścisłego związku pomiędzy tempem wzrostu wielkości komórek a ich
możliwościami reprodukcyjnymi (Zadrag-Tecza i in., 2009; Biliński i in., 2012; Bilinski
i Zadrag-Tecza, 2017). Tempo przyrostu wielkości komórki a co za tym idzie szybkość
osiągania postulowanego stanu hipertrofii zależy od przebiegu procesów metabolicznych,
w tym procesów warunkujących możliwości biosyntetyczne komórki. Te z kolei mogą być
modyfikowane zarówno przez czynniki genetyczne jak też warunki środowiskowe, spośród
których szczególnie istotna wydaje się być dostępność składników odżywczych.
5
2. Cel i zakres pracy
Głównym celem badań było określenie wpływu glukozy i zmian jej stężenia na szeroko
pojęty stan fizjologiczny, metabolizm, potencjał reprodukcyjny i długość życia komórek
drożdży S. cerevisieae.
Postawiono hipotezę, zgodnie z którą różne stężenia glukozy, poprzez modyfikację
procesów metabolicznych, zmieniają potencjał reprodukcyjny komórek drożdży i regulują
długość ich życia. Dodatkową hipotezą było założenie, że wysoki poziom glukozy, będący
odpowiednikiem warunków nadmiaru kalorii, jest czynnikiem zaburzającym funkcjonowanie
komórek drożdży S. cerevisieae.
Dla realizacji wyznaczonych celów sformułowano określone zadania:
przedstawienie dotychczasowego stanu wiedzy na temat roli glukozy w odniesieniu do
metabolizmu komórki jak i funkcjonowania organizmu człowieka
opracowanie warunków eksperymentalnych umożliwiające porównanie komórek
drożdży wykazujących podobny typ metabolizmu niezależnie od stężenia glukozy
określenie konsekwencji wynikających z wpływu różnych stężeń glukozy na parametry
morfologiczne, stan fizjologiczny oraz możliwości biosyntetyczne komórek drożdży
analiza zdolności reprodukcyjnej i długości życia komórek drożdży w warunkach
różnego stężenia glukozy
zaproponowanie koncepcji wyjaśnienia związku między zależnymi od stężenia glukozy
zmianami metabolicznymi, możliwościami biosyntetycznymi a potencjałem
reprodukcyjnym komórki
3. Materiały i metody
W celu wieloaspektowej analizy wpływu glukozy na komórkę w badaniach
zastosowano układ eksperymentalny konfrontujący dwa czynniki tj. zarówno zmienne
genetyczne (zastosowanie szczepów drożdży pozbawionych wybranych genów biorących
udział w wykrywaniu i sygnalizacji zależnej od glukozy) jak i zmienne środowiskowe (różne
stężenia glukozy w podłożu hodowlanym). Materiał badawczy stanowiły komórki drożdży
Saccharomyces cerevisieae reprezentujące głównie tło genetyczne BY4741 (szczep dziki; WT
ang. wild type) oraz izogeniczne względem niego szczepy pozbawione wybranych genów
związanych z metabolizmem glukozy (Δgpa2; Δgpr1 oraz Δhxk2).
6
Jako podłoże hodowlane wykorzystywano podłoże YPD ze zmiennymi stężeniami
glukozy (0,5% - warunki restrykcji kalorycznej; 2% - warunki optymalne; 4% - warunki
nadmiaru kalorii).
Właściwą fazę badań poprzedziły analizy wstępne, dotyczące m.in. czasu prowadzenia
hodowli na poszczególnych podłożach, których celem było wykluczenie porównywania
komórek wyjściowo różniących się typem metabolizmu, bądź też znajdujących się
w warunkach, które mogłyby zainicjować odpowiedź na stres. Czas prowadzenia hodowli
został wybrany m.in. na podstawie analizy szybkości zużywania glukozy i produkcji etanolu.
Analizy rozpoczęto od określenia tempa pobierania glukozy, w tym celu zastosowano
(po raz pierwszy w przypadku określenia tempa pobierania glukozy w komórkach drożdży)
fluorescencyjny analog glukozy 6-NBDG. Użycie analogu glukozy 6-NBDG pozwoliło
dodatkowo na zobrazowanie i dokładne scharakteryzowanie zjawiska autofluorescencji
w komórkach drożdży, która ma znaczenie dla interpretacji wyników uzyskanych za pomocą
barwników fluorescencyjnych.
Stan fizjologiczny oraz parametry morfologiczne komórek drożdży hodowanych na
podłożach zawierających różne stężenia glukozy, oznaczono przy pomocy: testów
wzrostowych (wzrost komórek drożdży na podłożu stałym i płynnym); fluorymetrycznych
i fluorescencyjnych analiz żywotności i witalności komórek drożdży z wykorzystaniem
barwienia różnicującego z dioctanem fluoresceiny i jodkiem propidyny oraz przy użyciu
sondy fluorescencyjnej FUN-1; fluorescencyjnej wizualizacji struktury sieci mitochondrialnej
z wykorzystaniem barwnika fluorescencyjnego Rodamina B oraz fluorymetrycznej analizy
potencjału błonowego mitochondriów przy zastosowaniu barwnika Rodamina 123; pomiarów
morfometrycznych komórek na podstawie zdjęć mikroskopowych, dzięki którym określono
wielkość komórek drożdży w populacji; analizie zawartości suchej masy, pozwalającej na
oznaczenie biomasy komórki.
Zmiany biochemiczne i metaboliczne, wynikające z różnego stężenia glukozy
w podłożu hodowlanym, oceniane były na podstawie: analiz poziomu generacji reaktywnych
form tlenu (RFT) (generację RFT określono mierząc kinetykę przyrostu fluorescencji
z wykorzystaniem sond fluorescencyjnych: dihydroetydyny (DHET) i dioctanu 2',7'-
dichlorodihydrofluoresceiny (H2DCF-DA) a poziom generacji RFT oznaczono zarówno dla
komórek kompletnych (rho+) jak i niekompletnych oddechowo (rho
0)); analiz poziomu ATP;
aktywności enzymów szlaku pentozofosforanowego oraz oznaczeń całkowitej, zredukowanej
oraz utlenionej puli NADP(H).
7
W ostatnim etapie dokonano analizy potencjału reprodukcyjnego oraz całkowitej
długości życia komórek drożdży. Potencjał reprodukcyjny określono przy użyciu
mikromanipulatora analizując liczbę wytworzonych pączków przez pojedyncze komórki
„matki”. Natomiast czas życia komórek drożdży został oznaczony dzięki wprowadzeniu do
podłoża przyżyciowego barwnika – floksyny B, zgodnie z metodyką opisaną przez (Minois
i in., 2005) z późniejszymi modyfikacjami (Zadrag i in., 2008). Wszystkie eksperymenty,
wykonano w co najmniej trzech niezależnych powtórzeniach biologicznych.
Analizy statystyczne wykonano z wykorzystaniem programu STATISTICA 10.0.
Istotność statystyczną obserwowanych różnic oceniono przy zastosowaniu jednoczynnikowej
analizy wariancji (one-way ANOVA) i testów post-hoc (testu Dunnetta oraz testu Tukeya).
Korelację między wynikami wybranych parametrów określono poprzez obliczenie
współczynnika korelacji Pearsona, a w przypadku wielkości komórek skorzystano również
z hierarchicznej analizy skupień. Ponadto względem potencjału reprodukcyjnego i wielkości
komórek w populacji wykorzystano metodę histogramu w celu prezentacji rozkładu wartości
uzyskanych wyników. Dla uzyskanych wyników przyjęto poziom istotności p < 0,05.
4. Struktura rozprawy doktorskiej
Rozprawa doktorska obejmuje cykl 4 publikacji naukowych, których sumaryczny IF
(wg roku opublikowania) jest równy 8,233, natomiast liczba punktów MNiSW (zgodnie
z danymi podanymi w PBN) wynosi 95.
1. Maślanka R., Zadrąg-Tęcza R. (2017) Glukoza - substancja o istotnym znaczeniu dla
prawidłowego funkcjonowania komórki i organizmu. [W]: Wybrane substancje
o znaczeniu biologicznym. Spojrzenie młodych naukowców. Monografia 2017, red.
Magdalena Kwolek-Mirek, Mateusz Mołoń, Kraków: Creativetime, 108-115. ISBN 978-
83-63058-78-4.
liczba punktów MNiSW2017 – 5
2. Maslanka R., Kwolek-Mirek M., Zadrag-Tecza R. (2017) Consequences of calorie
restriction and calorie excess for the physiological parameters of the yeast Saccharomyces
cerevisiae cells. FEMS Yeast Research. 17(8):fox087. IF2017 – 2,609; IF5-letni – 3,022; liczba punktów MNiSW2017 – 30
3. Maslanka R., Kwolek-Mirek M., Zadrag-Tecza R. (2018) Autofluorescence of yeast
Saccharomyces cerevisiae cells caused by glucose metabolism products and its
methodological implications. Journal of Microbiological Methods. 146: 55-60. IF2017 – 1,701; IF5-letni – 1,961; liczba punktów MNiSW2017 – 25
8
4. Maslanka R., Zadrag-Tecza R. (2019) Less is more or more is less: implications of
glucose metabolism in the regulation of the reproductive potential and total lifespan of the
Saccharomyces cerevisiae yeast. Journal of Cellular Physiology. doi: 10.1002/jcp.28386;
dostępny on-line: 25 luty 2019.
IF2017 – 3,923; IF5-letni – 3,830; liczba punktów MNiSW2017 – 35
W pierwszej pracy z zaprezentowanego cyklu (Maślanka i Zadrąg-Tęcza, 2017)
przedstawiono przegląd aktualnej wiedzy na temat wieloaspektowej roli glukozy w regulacji
parametrów fizjologicznych na poziomie komórki i organizmu, ze szczególnym
uwzględnieniem konsekwencji zaburzenia homeostazy glukozy, będących podłożem rozwoju
chorób metabolicznych. Praca ta napisana w języku polskim, ma charakter przeglądowy,
przez co w szerokim kontekście opisuje istotę badań dotyczących metabolizmu glukozy.
W drugiej pracy (Maslanka i in., 2017) scharakteryzowano metodyczne i techniczne
aspekty warunków eksperymentalnych, umożliwiających porównywanie zmian zachodzących
w komórkach drożdży hodowanych na podłożach zawierających różne stężenia glukozy.
W pracy ujęto wyniki charakteryzujące stan fizjologiczny i parametry morfologiczne
analizowanych komórek drożdży hodowanych na podłożach zawierających różne stężania
glukozy. Ponadto zaprezentowano wyniki dotyczące generacji reaktywnych form tlenu (RFT).
Ocenę zależności między poziomem generowania przez komórki RFT a stężeniem glukozy
w podłożu, uzupełniono o analizy poziomu generacji RFT dla komórek niekompletnych
oddechowo (rho0). Zastosowanie tego dodatkowego układu eksperymentalnego, dało
podstawę do wnioskowania, że w komórkach drożdży istnieją poza-mitochonrialne źródła
generacji RFT. W opisywanej pracy zaprezentowano również wyniki dotyczące tempa
pobierania glukozy uzyskane dzięki zastosowaniu fluorescencyjnego analogu glukozy 6-
NBDG.
Analizy sprawdzające poprawność uzyskiwanych wyników związanych z pierwszym
zastosowaniem analogu 6-NBDG w przypadku określenia tempa pobierania glukozy przez
komórki drożdży, pozwoliły na zobrazowanie i dokładne scharakteryzowanie zjawiska
autofluorescencji, co zostało przedstawione w 3 pracy wchodzącej w skład cyklu (Maslanka
i in., 2018). Poza identyfikacją tryptofanu, ryboflawiny i pirydoksyny jako głównych
fluoroforów odpowiedzialnych za zjawisko autofluorescencji w komórkach drożdży, praca
obejmuje również wyniki prezentujące znaczenie wpływu zjawiska autofluorescencji na
wartości i problemy interpretacyjne wyników uzyskiwanych za pomocą metod opartych na
barwnikach fluorescencyjnych.
9
W ostatniej pracy z cyklu (Maslanka i Zadrag-Tecza, 2019) przedstawiono wyniki
parametrów biochemicznych związanych z metabolizmem komórki i jego zmianami
wynikającymi z różnego stężenia glukozy w podłożu hodowlanym. Jednakże, istotną część
wyników zaprezentowanych w tej pracy były dane dotyczące wpływu różnych stężeń glukozy
na potencjał reprodukcyjny oraz długość życia komórek drożdży. Przy czym prezentowane
analizy długości życia, obejmowały całkowity czas trwania życia komórki drożdży wraz
z jego podziałem na czas trwania fazy reprodukcyjnej i post-reprodukcyjnej. Na podstawie
szczegółowych analiz uzyskanych wyników i szerokiego przeglądu literatury w ostatniej
pracy z cyklu zaprezentowano również modele prezentujące zmiany metabolizmu komórki
w zależności od stężenia glukozy oraz ich wpływ na wielkość i potencjał reprodukcyjny
komórek drożdży, przez co praca ta stanowi pewnego rodzaju syntetyczne podsumowaniem
prowadzonych analiz.
5. Wyniki badań
Analizując tempo pobierania glukozy wykazano, że było ono znaczono niższe
w komórkach szczepów pozbawionych genów związanych z metabolizmem glukozy
(tj. Δgpa2; Δgpr1 i Δhxk2) niż w komórkach szczepu dzikiego (Ryc. 1). Dało do podstawę do
wnioskowania, iż wewnątrzkomórkowe
stężenie glukozy w komórkach szczepów
delecyjnych musi być niższe niż w szczepie
typu dzikiego. Wewnątrzkomórkowe
stężenie glukozy, będące zależne zarówno
od zewnątrzkomórkowego stężenia glukozy
jak i zdolności komórki do jej pobierania,
okazało się kluczowym determinantem
wpływającym na szereg parametrów
analizowanych komórek drożdży.
Jakkolwiek analizując wzrost komórek
wybranych szczepów drożdży hodowanych
na podłożach płynnych zawierających
różne stężenie glukozy, poza odmiennym czasem osiągania poziomu plateau krzywych
wzrostu dla komórek rosnących na podłożach zawierających glukozę w stężeniu 0,5; 2 i 4%,
RRyycciinnaa 11.. TTeemmppoo ppoobbiieerraanniiaa gglluukkoozzyy pprrzzeezz
kkoommóórrkkii aannaalliizzoowwaannyycchh sszzcczzeeppóóww ddrroożżddżżyy..
Oznaczanie tempa pobierania glukozy
przeprowadzono mierząc sygnał
fluorescencyjny po 1,5 h inkubacji z analogiem
glukozy 6-NBDG. *** p <0,001 w porównaniu
do szczepu dzikiego (WT).
10
nie zaobserwowano większych różnic. Nie odnotowano również różnic w tempie wzrostu
pomiędzy szczepem dzikim (WT) a szczepami Δgpa2; Δgpr1 i Δhxk2. Podobne zależności
zaobserwowano również we wzroście komórek na podłożu stałym. Komórki analizowanych
szczepów nie różniły się również znacząco pod względem witalności i żywotności. Wszystkie
analizowane komórki bez względu na stężenie glukozy w podłożu wykazały wysoki poziom
witalności w pomiarach fluorymetrycznych z wykorzystaniem sondy fluorescencyjnej FUN-1.
Aczkolwiek komórki szczepu Δhxk2 charakteryzowały się niższymi wartościami tego
parametru w porównaniu do komórek szczepu dzikiego oraz szczepów Δgpa2 i Δgpr1.
W mikroskopowej ocenie żywotności komórek, stwierdzono iż w populacji komórek
analizowanych szczepów, śmiertelność była na bardzo niskim poziomie. Na tym tle
wyróżniała się jedynie populacja komórek szczepu dzikiego hodowanych na podłożu
zawierającym 4% glukozy, gdzie odsetek martwych komórek sięgał 8%. Ewidentne różnice
odnotowano natomiast w przypadku pomiarów morfometrycznych komórek drożdży. Wraz ze
wzrostem stężenia glukozy wzrastała
średnia wielkość komórki w populacji,
a trend taki był najbardziej widoczny
dla komórek szczepu dzikiego. Średnia
wielkość komórek szczepów
delecyjnych była istotnie niższa od
średniej wielkości komórek szczepu
dzikiego (Ryc. 2A). Dodatkowo
przeprowadzona hierarchiczna analizę
skupień wykazała silne podobieństwo
(biorąc pod uwagę parametr wielkości)
między komórkami szczepów Δgpa2
i Δgpr1, z kolei najniższy poziom
podobieństwa i największa odległość
w dendrogramie wystąpiła między
komórkami WT a komórkami szczepu
Δhxk2 (Ryc. 2B).
RRyycciinnaa 22.. WWiieellkkoośśćć kkoommóórreekk ddrroożżddżżyy aannaalliizzoowwaannyycchh sszzcczzeeppóóww hhooddoowwaannyycchh nnaa ppooddłłoożżuu zz rróóżżnnyymm
ssttęężżeenniieemm gglluukkoozzyy ((AA)).. DDeennddrrooggrraamm ggrruuppuujjąąccyy sszzcczzeeppyy ddrroożżddżżyy wweeddłłuugg ppooddoobbiieeńńssttwwaa ww wwiieellkkoośśccii
kkoommóórrkkii ((BB)).. *** p <0,001 w porównaniu do szczepu dzikiego (WT) na tym samym typie podłoża.
Litery a, b, c wskazują różnice między wartościami obserwowanymi na różnych podłożach
w obrębie tego samego szczepu drożdży.
11
Analizowane zmiany stężenia glukozy w podłożu hodowlanym bardzo silnie wpłynęły
na szereg parametrów fizjologicznych komórek drożdży. Zaobserwowano zwiększoną
generację RFT wraz ze wzrostem stężenia glukozy w podłożu hodowlanym, a trend taki był
najbardziej widoczny dla komórek szczepu dzikiego. Największy poziom generacji RFT
odnotowywano dla komórek hodowanych na podłożu zawierającym 4% glukozy (warunki
nadmiaru kalorii) (Ryc. 3A i 3B).
Wynik ten w kontekście
obecnie przyjmowanej wiedzy,
postulującej z jednej strony represję
glukozową oddychania tlenowego
w komórkach drożdży hodowanych
na podłożach z wysoką zawartością
glukozy, a z drugiej strony uznającej
aktywność mitochondriów za
główne źródło RFT w komórce, był
nieco zaskakujący. Wobec tego oznaczono status funkcjonalny i strukturę sieci
mitochondrialnej w komórkach drożdży a ponadto sprawdzono poziom generacji RFT
z wykorzystaniem komórek drożdży niekompletnych oddechowo (rho0) tj. mogących
przeprowadzać tylko proces fermentacji. Nie odnotowano większych różnic w stanie
funkcjonalnym oraz strukturze sieci mitochondrialnej dla komórek drożdży hodowanych na
podłożach z różnym stężeniem glukozy (Ryc. 4). Z kolei w analizach wykorzystujących
komórki rho0
odnotowano, iż poziom generacji RFT jest w nich identyczny do tego
notowanego dla komórek mających zdolność prowadzenia oddychania tlenowego. Dało to
RRyycciinnaa 33.. PPoozziioomm ggeenneerraaccjjii RRFFTT
ww kkoommóórrkkaacchh ddrroożżddżżyy kkoommpplleettnnyycchh
ooddddeecchhoowwoo hhooddoowwaannyycchh nnaa ppooddłłoożżuu
zz rróóżżnnyymm ssttęężżeenniieemm gglluukkoozzyy.. GGeenneerraaccjjaa
RRFFTT oozznnaacczzoonnaa zz wwyykkoorrzzyyssttaanniieemm ssoonnddyy
fflluuoorreesscceennccyyjjnneejj DDHHEETT ((AA)) ii HH22DDCCFF--
DDAA ((BB)).. ** p <0,01; *** p <0,001
w porównaniu do szczepu dzikiego (WT)
na tym samym typie podłoża. Litery a, b,
c wskazują różnice między wartościami
obserwowanymi na różnych podłożach
w obrębie tego samego szczepu drożdży.
12
podstawę do wnioskowania, że na terenie komórki drożdży istnieją poza-mitochondrialne
źródła generacji RFT, co sugeruje potrzebę zmiany poglądu o mitochondriach jako o jedynym
źródle RFT w komórkach drożdży. Dodatkowo dzięki zastosowaniu sond fluorescencyjnych
reagujących specyficznie z określonymi rodzajami RFT oraz szczepów pozbawionych genów
kodujących dysmutazy ponadtlenkowe ustalono, iż prawdopodobnie główną RFT generowaną
poza-mitochondrialnie jest anionorodnik ponadtlenkowy.
Glukoza pobrana do wnętrza komórki, może być wykorzystana na drodze kilku
wzajemnie powiązanych szlaków metabolicznych, a jak pokazały analizy wybranych
parametrów biochemicznych istnieje między nimi „specyficzny kompromis metaboliczny”
(ang. metabolic trade-off). Stopień wykorzystania glukozy w różnych szlakach
metabolicznych jest modyfikowany w zależności od stężenia glukozy w podłożu hodowlanym
oraz tempa jej pobierania. Stwierdzono, iż wraz ze wzrostem stężenia glukozy w podłożu
spadał poziom ATP w komórkach, a tendencja ta była najbardziej widoczna dla komórek
szczepu dzikiego. Tendencja ta widoczna była również w dodatkowych testach dla komórek
rosnących na podłożach zawierających 8% i 10% glukozy. Zaobserwowane zmiany
RRyycciinnaa 44.. SSttrruukkttuurraa ssiieeccii
mmiittoocchhoonnddrriiaallnneejj.. SSieć
mitochondrialna była
oznaczana za pomocą
mikroskopii fluorescencyjnej
przy zastosowaniu barwnika
fluorescencyjnego Rodaminy
B. Parametry wzbudzenia
i emisji fluorescencji: λex =
555 nm i λem = 579 nm.
Zdjęcia zostały
zarejestrowane za pomocą
mikroskopu Olympus BX-51
wyposażonego w aparat
cyfrowy DP-72
i oprogramowanie CellSens
Dimension. Zdjęcia
przedstawiają typowe wyniki
z kolejnych powtórzeń
eksperymentu. Powiększenie
1000 ×
13
energetyczne wydają się być skutkiem przesunięcia równowagi metabolicznej od oddychania
tlenowego do fermentacji oraz jednoczesnego zwiększenia udziału szlaku
pentozofosforanowego (szlak PPP) w metabolizmie glukozy, zwłaszcza przy wyższych
stężeniach glukozy w podłożu hodowlanym. Taką możliwość pośrednio potwierdzono dzięki
analizie aktywności enzymów szlaku pentozofosforanowego (dokładnie dehydrogenazy
glukozo-6-fosforanowej - G6PD oraz dehydrogenazy 6-fosfoglukonianowej - 6-PGD).
Wykazano w ten sposób m.in., że komórki szczepu dzikiego, u których tempo pobierania
glukozy było najwyższe a spadek poziomu ATP wraz ze wzrostem stężenia glukozy
w podłożu hodowlanym najbardziej widoczny, charakteryzowały się wyższą aktywnością
szlaku PPP w porównaniu do komórek szczepu Δgpa2 i Δgpr1. Komórki szczepu dzikiego
miały przede wszystkim wyższą aktywność G6PD, co jest zgodne z danymi literaturowymi
wskazującymi na kluczową rolę aktywności tego enzymu dla działania szlaku PPP. Szlak PPP
stanowi źródło prekursorów węglowych wykorzystywanych do biosyntezy makromolekuł
komórki ale także prowadzi do wytworzenia NADPH. Poza funkcjami związanymi
z utrzymaniem wewnątrzkomórkowego poziomu zredukowanego glutationu i odpowiedniego
statusu redoks, NADPH jest kluczowym wewnątrzkomórkowym reduktantem
wykorzystywanym w szeregu reakcji metabolicznych, w tym w procesach biosyntetycznych.
Wyniki przeprowadzonych badań wykazały wyższy poziom zarówno NADPH jak i całej
komórkowej puli NADP+/NADPH w komórkach hodowanych na podłożu zawierającym 4%
glukozy względem komórek hodowanych na podłożu zawierającym 2% glukozy. Istotne
zależności wykazała także analiza udziału NADPH i NADP+ w całkowitej puli NADP(H).
Stwierdzono, wyższy udział NADP+ w całkowitej puli NADP(H) w komórkach hodowanych
na podłożu zawierającym 2 i 4% stężenie glukozy. Taka sytuacja może być konsekwencją
zwiększonego utleniania NADPH, co sugeruje większe wykorzystanie NADPH w procesach
biosyntetycznych dostosowanych do aktualnych potrzeb komórki. Biorąc pod uwagę
uzyskane wyniki dotyczące wpływu stężenia glukozy na tempo wzrostu populacji, wielkość
komórek, zmiany poziomu ATP, aktywność szlaku PPP oraz zmiany w wykorzystaniu
NADPH, istotnym stało się oznaczenie możliwości biosyntetycznych analizowanych
komórek drożdży, które określono za pomocą pomiaru suchej masy komórki obrazującej
ogólną wydajność procesów biosyntetycznych komórki. Zawartość suchej masy komórek
była istotnie wyższa dla komórek szczepu dzikiego względem komórek szczepów Δgpa2
i Δgpr1. Co więcej w przypadku komórek szczepu dzikiego zawartość suchej masy wzrastała
wraz ze wzrostem stężenia glukozy w podłożu hodowlanym i była najwyższa w warunkach
14
CE. Takiego wzrostu w zawartości suchej masy komórek nie obserwowano natomiast dla
komórek szczepów Δgpa2 i Δgpr1 (Ryc. 5).
Mając na względzie, założenie iż zdolność reprodukcyjna jest istotną miarą sprawności
fizjologicznej komórki w ostatnim zadaniu badawczym przeprowadzono analizę wpływu
różnych stężeń glukozy na zdolność reprodukcyjną i długość życia komórek drożdży.
Zaobserwowano znaczny spadek potencjału reprodukcyjnego komórek szczepu dzikiego
(zarówno wartości maksymalnych, średnich jak i występujących najczęściej) wraz ze
wzrostem stężenia glukozy w podłożu hodowlanym. Zależności takiej nie zaobserwowano dla
komórek szczepów Δgpa2 i Δgpr1, których potencjał reprodukcyjny nie ulegał zmianie
niezależnie od stężenia glukozy a obydwa szczepy wytwarzały więcej komórek potomnych
niż szczep dziki. Wartą podkreślenia jest niemal dwukrotna różnica wartości potencjału
reprodukcyjnego pomiędzy szczepem dzikim a szczepami Δgpa2 i Δgpr1 w warunkach
nadmiaru kalorii
(Ryc. 6).
RRyycciinnaa 55.. SSuucchhaa mmaassaa kkoommóórreekk
ddrroożżddżżyy hhooddoowwaannyycchh nnaa ppooddłłoożżuu
zz rróóżżnnyymm ssttęężżeenniieemm gglluukkoozzyy..
Dane wyrażono w przeliczeniu
na pojedynczą komórkę. ** p
<0,01; *** p <0,001
w porównaniu do szczepu
dzikiego (WT) na tym samym
typie podłoża. Litery a, b, c
wskazują różnice między
wartościami obserwowanymi na
różnych podłożach w obrębie
tego samego szczepu drożdży.
RRyycciinnaa 66..
PPootteennccjjaałł
rreepprroodduukkccyyjjnnyy
kkoommóórreekk
ddrroożżddżżyy
hhooddoowwaannyycchh
ww wwaarruunnkkaacchh
rróóżżnneeggoo ssttęężżeenniiaa
gglluukkoozzyy..
15
RRyycciinnaa 77.. RRoozzkkłłaadd wwaarrttoośśccii ppootteennccjjaałłuu rreepprroodduukkccyyjjnneeggoo kkoommóórreekk ddrroożżddżżyy hhooddoowwaannyycchh
ww wwaarruunnkkaacchh rróóżżnnyycchh ssttęężżeeńń gglluukkoozzyy.. κκ-- kkuurrttoozzaa;; γγ‐‐ sskkoośśnnoośśćć..
RRyycciinnaa 88.. RRoozzkkłłaadd wwaarrttoośśccii wwiieellkkoośśccii kkoommóórrkkii ww ppooppuullaaccjjii kkoommóórreekk ddrroożżddżżyy hhooddoowwaannyycchh
ww wwaarruunnkkaacchh rróóżżnnyycchh ssttęężżeeńń gglluukkoozzyy..
zzyy.. κκ-- kkuurrttoozzaa;; γγ‐‐ sskkoośśnnoośśćć..
16
Zestawiając ze sobą rozkład wartości potencjału reprodukcyjnego oraz rozkład
wielkości komórek badanych szczepów w warunkach różnego stężenia glukozy wykazano
istnienie związku między rozmiarem komórki a jej zdolnością do reprodukcji. Wzrostowi
wielkości komórki towarzyszyło zmniejszenie potencjału reprodukcyjnego i odwrotnie (Ryc.
7 i 8). Analiza korelacji potwierdziła istnienie negatywnej zależności między wielkością
komórki a potencjałem reprodukcyjnym (r = -0,82). Bardzo istotny (r = -0,96) okazał się
również poziom korelacji między możliwościami biosyntetycznymi komórki wyrażanymi
wartością suchej masy a potencjałem reprodukcyjnym komórki.
Analizując długość życia komórek drożdży wykazano, że post-reprodukcyjny czas życia
komórek drożdży jest ujemnie skorelowany z potencjałem reprodukcyjnym i reprodukcyjnym
czasem życia. Z kolei całkowita długość życia komórek drożdży okazała się być
porównywalna zarówno pomiędzy szczepami drożdży a także w warunkach optymalnych jak
i restrykcji kalorycznej. Ponadto wykazano, że całkowita długość życia ulega wyraźnemu
skróceniu w warunkach nadmiaru kalorii, co było najbardziej widoczne dla komórek szczepu
dzikiego (Ryc. 9). Na podstawie uzyskanych wyników i danych literaturowych, stworzono
modele prezentujące zmiany metabolizmu komórki w zależności od stężenia glukozy oraz ich
wpływ na wielkość i potencjał reprodukcyjny komórek drożdży (Ryc. 10).
RRyycciinnaa 99.. PPoorróówwnnaanniiee ccaałłkkoowwiitteejj ddłłuuggoośśccii żżyycciiaa kkoommóórreekk ddrroożżddżżyy hhooddoowwaannyycchh ww wwaarruunnkkaacchh
rróóżżnnyycchh ssttęężżeeńń gglluukkoozzyy.. Całkowitą długość życia komórek drożdży określono przy użyciu
mikromanipulatora analizując komórki hodowane na stałym podłożu zawierającym przyżyciowy
barwnik – floksynę B.
17
RRyycciinnaa 1100.. PPrraawwddooppooddoobbnnee rrooddzzaajjee „„mmeettaabboolliicczznneeggoo kkoommpprroommiissuu”” ww zzaalleeżżnnoośśccii oodd wwaarruunnkkóóww
ddoossttęęppnnoośśccii sskkłłaaddnniikkóóww ooddżżyywwcczzyycchh oorraazz iicchh wwppłłyyww nnaa wwiieellkkoośśćć ii ppootteennccjjaałł rreepprroodduukkccyyjjnnyy
kkoommóórreekk ddrroożżddżżyy.. Zastosowane skróty: ATP: trifosforan adenozyny; cAMP: cykliczny
monofosforan adenozyny; GPCR: receptor sprzężony z białkiem G; HXT: transporter heksozy;
PPP: szlak pentozofosforanowy; PKA: kinaza białkowa A.
18
6. Podsumowanie
Wyniki uzyskane w toku realizacji pracy doktorskiej pozwoliły na kompleksową analizę
konsekwencji nadmiaru i restrykcji kalorycznej dla komórek drożdży S. cerevisiae. W pracy
podjęto próbę wyjaśniania skomplikowanych zależności występujących między
wewnątrzkomórkowymi szlakami metabolizmu glukozy. Wnioski płynące z pracy pozwalają
na pełniejsze zrozumienie regulacji metabolizmu glukozy na poziomie komórkowym, przez
co mogą być pomocne w analizach dotyczących funkcjonowania komórek narażonych na
wysokie stężenia glukozy, co ma miejsce m.in. w przypadku osób chorych na cukrzycę.
Badania przeprowadzone w ramach niniejszej pracy doktorskiej pozwoliły sformułować
następujące wnioski:
(i) w komórce istnieje „specyficzny kompromis metaboliczny” pomiędzy różnymi
sposobami wykorzystania glukozy,
(ii) wewnątrzkomórkowe wykorzystanie glukozy jest zależne od jej stężeniem w otoczeniu
oraz tempa jej pobierania,
(iii) stężenie glukozy w podłożu hodowlanym ma wpływ na poziom generowanych
reaktywnych form tlenu, przy czym istotna część RFT w komórkach drożdży jest
generowana w sposób poza-mitochondrialny,
(iv) istnieje silna zależność między stężeniem glukozy, stanem fizjologicznym komórek
drożdży, ich wielkością i możliwościami biosyntetycznymi a potencjałem
reprodukcyjnym,
(v) warunki nadmiaru kalorii negatywnie wpływają na sprawność fizjologiczną, potencjał
reprodukcyjny a także całkowitą długość życia komórki.
Bibliografia
Austad SN (2012) Ageing: Mixed results for dieting monkeys. Nature 489: 210-11.
Biliński T, Paszkiewicz T, Zadrag-Tecza R (2015) Energy excess is the main cause of accelerated aging of
mammals. Oncotarget 6: 12909-19.
Bilinski T, Zadrag-Tecza R (2017) Yeast aging: Reproduction Strategies Determine the Longevity of
Buding and Fission Yeasts In Shefferson R, Owen J and R, S.-G. (Eds), The Evolution of Senescence in the Tree of Life, Cambridge University Press
Biliński T, Zadrąg-Tęcza R, Bartosz G (2012) Hypertrophy hypothesis as an alternative explanation of the
phenomenon of replicative aging of yeast. FEMS Yeast Res 12: 97-101.
Colman RJ, Anderson RM, Johnson SC, Kastman EK, Kosmatka KJ, i in. (2009) Caloric restriction delays
disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science 325: 201-4.
Diaz-Ruiz R, Rigoulet M, Devin A (2011) The Warburg and Crabtree effects: On the origin of cancer cell
energy metabolism and of yeast glucose repression. Biochim Biophys Acta 1807: 568-76.
Fontana L, Partridge L (2015) Promoting health and longevity through diet: from model organisms to humans. Cell 161: 106-18.
19
Gunin AG, Kornilova NK, Petrov VV, Vasil'eva OV (2011) [Age-related changes in the number and
proliferation of fibroblasts in the human skin]. Adv Gerontol 24: 43-7.
Hu C, Fan L, Cen P, Chen E, Jiang Z, i in. (2016) Energy Metabolism Plays a Critical Role in Stem Cell
Maintenance and Differentiation. Int J Mol Sci 17: 253.
Lee D, Son HG, Jung Y, Lee SV (2017) The role of dietary carbohydrates in organismal aging. Cell Mol
Life Sci 74: 1793-1803.
Lin SJ, Kaeberlein M, Andalis AA, Sturtz LA, Defossez PA, i in. (2002) Calorie restriction extends
Saccharomyces cerevisiae lifespan by increasing respiration. Nature 418: 344-8.
Magier Z, Jarzyna R (2013) [The role of glucose transporters in human metabolic regulation]. Postepy Biochem 59: 70-82.
Maslanka R, Kwolek-Mirek M, Zadrag-Tecza R (2017) Consequences of calorie restriction and calorie
excess for the physiological parameters of the yeast Saccharomyces cerevisiae cells. FEMS Yeast Res
17.
Maslanka R, Kwolek-Mirek M, Zadrag-Tecza R (2018) Autofluorescence of yeast Saccharomyces cerevisiae cells caused by glucose metabolism products and its methodological implications.
J Microbiol Methods 146: 55-60.
Maslanka R, Zadrag-Tecza R (2019) Less is more or more is less: Implications of glucose metabolism in
the regulation of the reproductive potential and total lifespan of the Saccharomyces cerevisiae yeast.
J Cell Physiol.
Mattison JA, Colman RJ, Beasley TM, Allison DB, Kemnitz JW, i in. (2017) Caloric restriction improves
health and survival of rhesus monkeys. Nat Commun 8: 14063.
Mattison JA, Roth GS, Beasley TM, Tilmont EM, Handy AM, i in. (2012) Impact of caloric restriction on
health and survival in rhesus monkeys from the NIA study. Nature 489: 318-21.
Minois N, Frajnt M, Wilson C, Vaupel JW (2005) Advances in measuring lifespan in the yeast
Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 402-6.
Rafalski VA, Mancini E, Brunet A (2012) Energy metabolism and energy-sensing pathways in mammalian
embryonic and adult stem cell fate. J Cell Sci 125: 5597-608.
Rødkaer SV, Faergeman NJ (2014) Glucose- and nitrogen sensing and regulatory mechanisms in
Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res 14: 683-96.
Rodrigues F, Ludovico P, Leão C (2006) Sugar Metabolism in Yeasts: an Overview of Aerobic and
Anaerobic Glucose Catabolism, Biodiversity and Ecophysiology of Yeasts. The Yeast Handbook.,
Springer: Berlin, pp. 101-121.
Roth LW, Polotsky AJ (2012) Can we live longer by eating less? A review of caloric restriction and
longevity. Maturitas 71: 315-9.
Schleit J, Johnson SC, Bennett CF, Simko M, Trongtham N, i in. (2013) Molecular mechanisms underlying
genotype-dependent responses to dietary restriction. Aging Cell 12: 1050-61.
Sharma PK, Agrawal V, Roy N (2011) Mitochondria-mediated hormetic response in life span extension of
calorie-restricted Saccharomyces cerevisiae. Age (Dordr) 33: 143-54.
Smith J, Wright J, Schneider BL (2015) A budding yeast's perspective on aging: the shape I'm in. Exp Biol
Med (Maywood) 240: 701-10.
Tschen SI, Dhawan S, Gurlo T, Bhushan A (2009) Age-dependent decline in beta-cell proliferation restricts
the capacity of beta-cell regeneration in mice. Diabetes 58: 1312-20.
Vander Heiden MG, Cantley LC, Thompson CB (2009) Understanding the Warburg effect: the metabolic
requirements of cell proliferation. Science 324: 1029-33.
Weinberger M, Mesquita A, Caroll T, Marks L, Yang H, i in. (2010) Growth signaling promotes
chronological aging in budding yeast by inducing superoxide anions that inhibit quiescence. Aging (Albany NY) 2: 709-26.
Zadrag-Tecza R, Kwolek-Mirek M, Bartosz G, Bilinski T (2009) Cell volume as a factor limiting the
replicative lifespan of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biogerontology 10: 481-8.
Zadrag R, Bartosz G, Bilinski T (2008) Is the yeast a relevant model for aging of multicellular organisms?
An insight from the total lifespan of Saccharomyces cerevisiae. Curr Aging Sci 1: 159-65.
Zuin A, Carmona M, Morales-Ivorra I, Gabrielli N, Vivancos AP, i in. (2010) Lifespan extension by calorie
restriction relies on the Sty1 MAP kinase stress pathway. EMBO J 29: 981-91.