7/24/2019 Browning Dan Kontaminasi
1/10
Pada kultur jaringan eksplan seringkali berubah menjadi coklat (browning) atau
hitam (blackening) sesaat setelah isolasi yang selanjutnya dapat menghambat
pertumbuhan dan akhirnya menyebabkan kematian jaringan. Pencoklatan sangat
umum terjadi pada spesies tanaman berkayu, terutama bila eksplan diambil dari pohon
dewasa. Penghambatan pertumbuhan biasanya sangat kuat pada beberapa spesies yangumumnya mengandung senyawa tanin atau hidroksifenol dengan konsentrasi tinggi.
Pencoklatan pada jaringan muda lebih sedikit dibandingkan dengan jaringan yang tua
(George dan Sherrington 1!"). #ang dan $ewton (%&&") juga melaporkan bahwa
pencoklatan jaringan sangat menurunkan regenerasi secara in vitro dari kultur kalus
pada beberapa tanaman berkayu, khususnya regenerasi tanaman melalui jalur
organogenesis. 'eskipun sebagian besar kultur kalus berubah menjadi coklat, ada
sebagian kecil tidak mencoklat selama proses regenerasi in vitro pada Virginiapine
(Pinus virginiana 'ill.). ultur kalus dari tunas pucukScots pine (Pinus silvestris .)
juga ditandai dengan pencoklatan secara cepat dan ketidakmampuan beregenerasi
(aukkanen et al. 1). Oxydative browning merupakan salah satu penyebab mengapa
Protea cynarioides tidak diperbanyak melalui teknik kultur jaringan (*u dan #oit
%&&"). +ghandi et al. (%&&%) melaporkan bahwa pencoklatan pada eksplan kalus tua
pistachio dan kultur media di sekitar kalus menjadi masalah pada fase inisiasi dan
proliferasi.
-eberapa macam tanaman khususnya tanaman tropika mempunyai kandungan
senyawa fenol yang tinggi yang teroksidasi ketika sel dilukai atau terjadi senesens
(George dan Sherrington 1!"). +kibatnya jaringan yang diisolasi menjadi coklat atau
kehitaman dan gagal tumbuh. Pencoklatan jaringan terjadi karena aktiitas enim
oksidase yang mengandung tembaga seperti polifenol oksidase dan tirosinase (erch1!1) yang dilepaskan atau disintesis dan tersedia pada kondisi oksidatif ketika
jaringan dilukai. Substrat untuk enim ini ada bermacam/macam pada jaringan yang
berbeda, yang umum adalah tirosin atau o/hidroksifenol seperti asam klorogenik.
0nim dan substrat dalam keadaan normal akan tertahan dalam ruang berbeda di
dalam sel dan akan keluar bersama/sama pada saat sel dilukai atau hampir mati. enol
mempunyai fungsi alami penting dalam mengatur oksidasi 2++. +pabila fenol yang
terlarut dalam air digunakan pada eksplan jambu biji maka pertumbuhan tunas dan
kalus akan terpacu (kemungkinan melalui sinergisme dengan auksin), dan akan
menjadi racun apabila konsentrasinya meningkat (3assman et al. 14!).
#oksisitas fenol kemungkinan disebabkan oleh ikatan reersibel antara hidrogen
dan protein. Penghambatan pertumbuhan yang tidak dapat diperbaiki terjadi ketika
fenol teroksidasi menjadi senyawa aktif 5uinon yang tinggi yang kemudian memutar,
memolimerase dan6atau mengoksidasi protein menjadi senyawa melanat yang makin
meningkat. 7uma et al. (1") meneliti kultur jaringan tanaman kopi dan menemukan
bahwa tingkat oksidasi fenol tergantung pada sumber potongan ruas batang sebagai
eksplan dan spesies tanaman. opi robusta cenderung lebih bermasalah dengan
pencoklatan dibandingkan dengan kopi arabica. 8yigit et al. (%&&4) melaporkan
bahwa terbentuknya senyawa fenol di/ pengaruhi oleh struktur kimianya, spesies
tanaman, proses biologi (organogenesis atau somatik embriogenesis), dan tahap
perkembangannya. 'etabolisme fenol mempengaruhi sistem kultur jaringan secara
7/24/2019 Browning Dan Kontaminasi
2/10
positif dengan metabolisme auksin (kecepatan pembelahan sel dan sintesis dinding sel
serta senyawasenyawa lain yang berhubungan), tetapi oksidasi fenol yang berubah
menjadi 5uinon dan senyawa lain (polimerasenya) yang sangat beracun menyebabkan
pencoklatan medium dan kematian eksplan. 9arm et al. (1!:) mengemukakan bahwa
betasianin dilepaskan ketika jaringan bit dilukai di dalam kultur. Substrat ini akancepat teroksidasi dan menjadi at penghambat secara sempurna.
'enurut 9uang et al. (%&&%) pencoklatan yang sering menyebabkan kematian
awal dari tunas bambu yang ditanam secara in vitro berkorelasi langsung dengan
aktiitas polifenol oksidase (PP8). Selama di dalam kultur, aktiitas PP8 paralel
dengan pencoklatan eksplan. ;aughn dan
7/24/2019 Browning Dan Kontaminasi
3/10
'enurut +hmad et al. (1A) waktu yang dibutuhkan untuk pencoklatan
Pistacia vera dipengaruhi oleh konsentrasi dan kombinasi at pengatur tumbuh dalam
media induksi. 2nduksi kalus dalam media yang mengandung $++ (% atau A mg6l) atau
$++ (A mg6l)C kinetin (%,A mg6l) dapat mempertahankan kalus tetap putih kehijauan
selama 1&/1: minggu. #ahtamouni et al. (%&&1) mempelajari pertumbuhan dan sifat pirliar (Pyrus syriaca -oiss.) dengan preserasi in vitro dalam 'S dengan osmotikum.
#unas mikro (&,1 cm) pada titik tumbuh disimpan dalam media yang mengandung :, @,
, atau 1%B baik sukrosa, sorbitol atau manitol. Pertumbuhan sangat terhambat
dengan bertambahnya konsentrasi osmotikum. #erjadi tahapan kerusakan fisiologis
(pencoklatan ujung tunas, pangkal tunas, dan pengguguran daun) dengan adanya
peningkatan osmotikum dan sepertinya periode preserasi diperpanjang.
7/24/2019 Browning Dan Kontaminasi
4/10
(P;P) (oomis dan -attail 1@@). Dntuk isolasi enim, P;P biasanya digunakan
bersamasama dengan senyawa reduksi seperti E/merkaptoetanol. enol diabsorbsi P;P
melalui ikatan hidrogen, untuk melindungi oksidasinya.
-att dan
7/24/2019 Browning Dan Kontaminasi
5/10
pencoklatan eksplan pada bambu. Pencoklatan tertinggi diperoleh dari medium dengan
p9 !, di mana p9 tersebut konsisten dengan p9 optimum enim pada bambu.
Stabilitas PP8 tertinggi pada bambu pada p9 1&.
+ktiitas enim, biosintesis, dan oksidasi fenol akan meningkat dengan adanya
cahaya (3reasy 1@!). Pencoklatan jaringan kemungkinan akan berkurang atau dapatdihindari apabila biakan baru disimpan di ruang gelap sampai 1" hari sebelum
ditransfer ke ruangan dengan intensitas cahaya rendah (A&&/1&&& lu). Pencoklatan
dari isolasi potongan batang Phalaenopsis telah berhasil ditanggulangi dengan
mengkulturkan eksplan selama % minggu pertama dalam ruang gelap dengan suhu
%@o3. Setelah itu kultur dipindah ke ruang terang dengan suhu %%o3 (Pieper dan
Fimmer 14@). *u dan #oit (%&&") melaporkan bahwa pengurangan oxydative
browning terbaik adalah dengan mengaduk eksplan selama 1 jam dalam larutan anti
oksidan yang mengandung asam askorbat 1&& mg6l dan asam sitrat 1A&& mg6l sebelum
ditanam dalam medium. ombinasi perlakuan tersebut dengan fotoperiodisitas 1@ jam,
mampu menghasilkan pertumbuhan tunas hingga 1&&B.
Penanggulangan yang Sering
7/24/2019 Browning Dan Kontaminasi
6/10
dalam anti oksidan dan absorben pada saat yang sama dapat menghilangkan beberapa
efek samping.
Pra/perlakuan dengan itamin 3 1& g6l dapat mengurangi kontaminasi dan
pencoklatan secara efektif. Suatu penelitian membuktikan bahwa faktor optimal dan
leel perlakuan -+ &,A mg6l, arang aktif %,& g6l, dan P;P 1,A g6l mengakibatkanpencoklatan hanya 1@,AB, dan secara umum disimpulkan bahwa waktu pengambilan
eksplan, bagian tanaman yang digunakan, dan pra/perlakuan eksplan adalah faktor
utama yang mempengaruhi kontaminasi dan pencoklatan pada fase inisiasi kultur
jaringanP. occidentalis .
Pra/kondisi pada media dasar
0ksplan dari beberapa spesies dapat terhindar dari pencoklatan apabila pada
awalnya dikulturkan dalam media tanpa at pengatur tumbuh. George dan
Sherrington (1!") menemukan bahwa ruas batang kedelai dapat berkembang menjadi
masa kalus yang friabel (yang menghambat pertumbuhan tunas secara langsung)
apabila segera dikulturkan pada media yang mengandung auksin dan sitokinin. 9al
tersebut diperkirakan karena tingginya konsentrasi auksin indogenous.
Potongan jaringan mula/mula dikulturkan dalam media dasar selama beberapa
hari sebelum ditransfer ke dalam media dengan 2-+ &,&&A mg6l dan -+P 1,1 mg6l.
7umlah tunas yang terbentuk meningkat dengan meningkatnya waktu pra/perlakuan
sampai %&/%A hari. +pabila diperpanjang lagi jumlah tunas akan menurun. $hut et al.
(%&&@) melaporkan hasil penelitiannya pada easter lily ("ilium longi!lorum) bahwa
pembentukan kalus embriogenik diperoleh dari kalus friabel yang dikulturkan baik
pada media padat6cair dengan olume yang berbeda mengandung H/naphthaleneacetic
acid ($++) 1,& mg6l dan thidiauron (#
7/24/2019 Browning Dan Kontaminasi
7/10
kerusakan. Pengendalian mikroorganisme ditujukan untuk mencegah penyebaran
penyakit, membasmi mikroorganisme pada inang, serta mencegah pembusukan dan
kerusakan bahan. 'ikroorganisme dapat dihambat atau dibunuh secara fisik dan
kimia. Secara fisik melalui suhu, tekanan, radiasi dan penyaringan, misalnya sterilisasi,
pembakaran atau sanitasi. Secara kimia melalui perubahan komposisi molekulmisalnya dengan senyawasenyawa fenolik, alkohol, klor, iodium dan etilen oksida.
eefektifan at antimikrobial tergantung konsentrasi, jumlah dan jenis
mikroorganisme, suhu, bahan organik terlarut dan p9 (Pelcar dan 3han, 1!!).
Sumber kontaminasi dapat berasal dari eksplan tumbuhan, organisme kecil
yangmasuk ke dalam media, alat yang tidak sterildan lingkungan kerja yang kotor.
Sehingga harus dilakukan= sterilisasi lingkungan kerja, alat/alat, media dan bahan
tanaman(Gunawan, 1!!).
Penanaman eksplan dan prosedur lain seperti isolasi protoplasma, sering
dilakukan dalam kotak pindah (trans!er box). otak ini biasanya terbuat dari kaca dan
tertutup.
7/24/2019 Browning Dan Kontaminasi
8/10
3iri morfologi koloni= hifa seperti benang putihJ bagian tertentu tampak
sporangium dan sporangiofor berupa titik/titik hitam seperti jarum pentul. 3iri
mikroskopis= hifa tanpa sekat, terdapat sporangium dan sporangiospora.
lasifikasi'hizopus
7/24/2019 Browning Dan Kontaminasi
9/10
pertumbuhan relatif lambat. 3endawan kelas
7/24/2019 Browning Dan Kontaminasi
10/10
apang lendir seluler merupakan organisme yang hidup bebas dan ameboidJ
plasmodiumnya tidak multi nukleat.