Cara Pengawetan dan Penyimpanan Biakan Fungi
Marlia Singgih WibowoSchool of Pharmacy
Institut Teknologi Bandung
Outline
• Prinsip Umum• Teknik Pengawetan (Preservation)• Keuntungan dan Kerugian• Pemilihan Metode
Prinsip UmumTujuan utama memelihara biakan suatu fungus adalah untuk menjaga galur fungus tersebut di dalam suatu media tanpa terjadi nya perubahan morfologi, fisiologi, atau genetik
Prinsip Umum
• Organisme dapat berasal dari berbagai sumber
• Contoh : Penicillium digitatum
Prinsip Umum
• Teknik pengawetan sangat bervariasi, dapat dengan mengurangi kecepatan metabolisme atau bahkan dapat menunda metabolisme mikroorganisme
• Pengawetan yang baik bila digunakan biakan yang sehat dan kondisi pertumbuhan yang optimum
• Microorganisme tumbuh dalam lingkungan dan kondisi yang berbeda-beda
• Beberapa diantaranya memiliki spesifisitas tertentu sebagai syarat pertumbuhannya
Prinsip Umum
• Umumnya Mikroorganisme tumbuh baik dalam media yang dibuat mendekati kondisi lingkungan tempat asalnya
• Contoh : tanah, bagian tanaman atau komponen air, dll.
Pertumbuhan Mikroorganisme• Media pertumbuhan dapat bervariasi.
Misalnya Raper & Thom (1949) menggunakan Czapek's Agar, Steep Agar and Malt Extract Agar untuk pertumbuhan Penicillia dan Aspergilli
• Pitt (1980) menganjurkan penggunaan recommends Czapek Yeast Autolysate (CYA) dan Malt Extract Agar (MEA) untuk penicillia
• Standarisasi of formula media penting dilakukan
• Media akan mempengaruhi morfologi dan warna koloni, karena kandungan media akan mempengaruhi pembentukan senyawa tertentu atau menginduksi sifat tertentu dari mikroorganisme
PertumbuhanPengaruh Media terhadap morfologi koloni
Kontaminasi pada kultur fungi• Biakan Fungi sering terkontaminasi oleh
Tyroglyphus or Tarsonemus• Di alam banyak terdapat pada tanah, dan
hampir semua bahan organik• Terbawa ke laboratorium dari bahan
tanaman, produk yang sudah kadaluarsa,pada sepatu, serangga atau biakanmikroorganisme lain.
• Cepat berkembang biak dalam keadaanlembab dan suhu ruang
• Biakan fungi menjadi rusak dan tidak dapat disimpan
Pencegahan Kontaminasi• Melakukan pekerjaan sesuai prosedur• Menjaga kebersihan dan kesehatan diri • Selalu memeriksa setiap barang yang masuk ke laboratorium • Menutup setiap biakan atau barang yang digunakan sesuai prosedur
Metode pencegahan kontaminasi
Hygiene• Bersihkan seluruh permukaan dan hindari
biakan dari udara luar dan debu• Cuci peralatan dengan desinfektan yang
sesuai.Fumigation• Digunakan selang waktu tertentu untuk ruang
laboratorium atau korikor. Pekerjaan ini harusdilakukan oleh yang berwenang
Mechanical and chemical barriers• Universal bottles, kapas lemak, tube
bersumbat
Metode pencegahan kontaminasi
• Tempat penyimpanan yang aman• Lemari pendingin 4-8°C• Lemari penyimpanan “deep freeze” (< -
20°C)• Menutup kultur dengan minyak mineral• Simpan dengan silica gel • Freeze-dry • Simpan di ultra-low temperatures case
Pengawetan dan Penyimpanan
• Continuous culturePada media padat atau cairRefrigerationDi bawah lapisan minyak mineralDi dalam air
• Pengeringan• Freeze drying• Cryopreservation
Pengawetan dan Penyimpanan
• Bagi biakan awal dan simpan 1 biakan sebagai seed stock
• Simpan satu biakan sebagai cadangan • Setelah pengawetan, viability, purity, dan
identitas harus di cek ulang dan dibandingkan dengan data aslinya atau referensi
• Morfologi, patogenitas, sifat-sifat fisik dan biokimia harus diuji
• Semua pengamatan harus dicatat dan disimpan untuk referensi di masa yad.
Metode Pengawetan mikroorganismePenumbuhan pada agar miring• Metode yang paling mudah dan murah • Disimpan di dalam lemari pendingin
dapat membantu mengurangi frekuensi sub-kultur
Metode pengawetan mikroorganisme
Kerugian metode sub-kultur pd agar• Kemungkinan terjadi variasi genetik
akibat pemindahan berulang, hilangnya sifat patogenitas atau karakteristik fisiologi dan morfologi lainnya
• Kemungkinan kontaminasi besar• Memerlukan pengawasan yang ketat
supaya biakan tidak tertukar atau terkontaminasi
Pengawetan dan PenyimpananKeuntungan metode sub-kultur pada agar :
• Koleksi biakan dapat disimpan dalam waktu cukup lama dibawah pengawasan ahlinya.
• Metodenya cukup murah dan tidak memerlukan teknisi khusus. Untuk jumlah koleksi yang sedikit, metode ini cukup menguntungkan
• Penumbuhan mudah karena tidak perlu waktu adaptasi yang lama.
• Periode pemindahan : 2 – 4 minggu atau 2 – 4 bulan
Di bawah minyak mineral
Biakan di atas agar miring di dalam 30 ml universal bottles lalu dituangkan minyak mineral di atasnya. Hal ini dapat mencegah dehidrasi dan memperlambat aktivitas metabolisme dan pertumbuhan karena kurangnya tekanan oksigen
Pengawetan dengan Minyak mineral
• Metode ini pertama kali digunakan oleh Buell &Weston (1947)
• Biakan sehat yang cukup usianya ditutup dengan 10mm minyak mineral steril (liquid paraffin or medicinalparaffin dengan specific gravity 0.830-0.890).
• Minyak disterilkan dengan autoklaf dua kali pada121°C selama 15 menit
• Penumbuhan kembali dari minyak dilakukan dengancara mengambil sejumlah koloni dengan jarumbiakan dan minyak dibuang sebanyak mungkin.
• Cara menginokulasi agar di posisi tengah-tengahkadangkala memberikan hasil yang lebih baiksehingga minyak dapat dikeluarkan dengan mudahmelalui slope
Pengawetan dalam Minyak mineral
Kerugian penyimpanan dalam minyak mineral :• Kontaminasi oleh spora mikroba dari udara• Hambatan pertumbuhan pada saat retrieval• Pertumbuhan terus terjadi di bawah kondisi
yang tidak nyaman dapat mengarah pada mutasi
Pengawetan dalam Minyak mineral
Keuntungan :• Peralatan murah dan pengerjaan mudah• Beberapa mikroorganisme hanya dapat
disimpan di dalam minyak mineral• Namun penyimpanan di bawah minyak mineral
disarankan untuk laboratorium yang memiliki keterbatasan sumbar daya dan fasilitas
Penyimpanan dalam air
Potongan agar atau suspensi spora dapat disimpan dalam air
Penyimpanan dalam airCara :1. Potongan agar ukuran 6 mm diambil dari
ujung pertumbuhan koloni jamur 2. Potongan tsb ditempatkan di dalam air steril
di dalam botol McCartney dan tutup erat , lalu disimpan pada suhu 20-25°C.
3. Peremajaan dilakukan dengan mengambil potongan agar tsb, tempatkan terbalik pada medium pertumbuhan yang sesuai
Penyimpanan dalam air
• Jangka waktu penyimpanan dapat mencapai 2-3 tahun , misalnya untuk spesies of Phytophthora dan Pythiumtanpa adanya perubahan fisik (Onions & Smith, 1984).
Penyimpanan dalam air• Pertama kali dilakukan oleh Castellani (1939,
1967) yang menyimpan fungi yang patogen thp manusia
• Figueiredo (1967) menyimpan 22 patogen tanaman tanpa kehilangan patogenitasnya.
• Figueiredo & Pimentel (1975) melaporkan penyimpanan dalam air bisa mencapai 10 years
• Boeswinkel (1976) menyimpan 650 patogen a.l. Oomycota, Ascomycota, Basidiomycotadan mitotic fungi selama 7 tahun.
• Ellis (1979) menyimpan Entomophthorales, Pyrenomycetes, Hymenomycetes, Gasteromycetes dan Hyphomycetes
Teknik pengeringan and freeze‐drying
• Penghilangan air akan mengurangi laju metabolisme sel
• Dapat dilakukan dengan pengeringan udara• Dapat pula dengan penambahan absorbant spt
tanah, silica gel, atau desiccant lain. • Cara Freeze-dry dengan vacuum dari keadaan
beku dengan cara sublimasi es
Response of cells to freezing. Slow cool: cells can maintaing osmostic equilibrium by water efflux; thus cells shrink and only extracellular ice forms. Rapid cool: cells cannot lose water rapidly enough to maintain osmotic equilibrium; thus cells shrink slightly and contain a few large ice crystals. Very rapid cool: cells contain a large number of small ice
crystals.
SLOWCOOL
RAPIDCOOL
VERYRAPIDCOOL
-2OC
-5OC
< -10OC
What happens to a cell when it freezes?
Penyimpanan dalam Silica Gel
• Sporulating fungi dpt disimpan selama 7-18 tahun • C.F. Roberts, University of Leicester menyimpan fungi
lebih dari 25 years menggunakan metode dari Perkins (1962), semua galur terbukti stabil.
Penyimpanan dalam Silica Gel
Cara :
1. Sepertiga penuh botol universal 30 ml isi dengan silica gel dansterilkan dengan dry heat (180°C selama 3 jam).
2. Tempatkan botol di dalam rak dengan air dan bekukan (nominal- 20°C).
3. Siapkan suspensi spora di dalam 5% (w/v) skimmed milk yangtelah didinginkan.
4. Tambahkan kira-kira 1 ml biakan tersebut ke dalam silica geldan goyangkan agar tercampur homogen.
5. Simpan botol dengan tutup longgar selama 10-14 hari pada25°C sampai silica gel crystals mengering dan siap untukdipisahkan.
6. Kencangkan tutupnya dan simpan botol pada 4°C dalam wadahkedap udara dengan indicator silica gel untuk mengabsorbsilembab.
Penyimpanan dalam Silica gel
• Banyak fungi yang tahan lama denganmetode ini (Perkins, 1962; Ogata, 1962;Onions, 1977; Smith & Onions, 1983).
• Spora yang berdinding tipis cenderung tidakdapat bertahan.
• Keberhasilannya tergantung biakan yangsehat, dan hal ini dapat ditunjukkan dariperbedaan biakan dari setiap isolat.
• Metode ini dpt digunakan bila fasilitas freeze-drying tidak tersedia, walaupun ada bbrpfungi yang tidak dapat bertahan lama dgncara ini.
Penyimpanan dalam Silica Gel
Penumbuhan kembali dgn cara menyebarkan beberapa kristal ke dalam medium pertumbuhan yang sesuai
Penyimpanan dalam Silica Gel
Kekurangan cara silica gel :• Hanya terbatas pada sporulating fungi, dan tidak
sesuai untuk Pythium, Phytophthora danbeberapa Oomycota, juga beberapa fungibermiselium yang memiliki spora yangkompleks.
• Kemungkinan terjadinya kontaminasi cukupbesar setelah beberapa kali peremajaan.
Penyimpanan dalam Silica Gel
Keuntungan cara silica gel :• Murah dan sederhana• Menghasilkan biakan yang stabil untuk
banyak sporulating fungi termasuk Basidiomycota.
• Kontaminasi dari bakteri dapat dihindari karena kondisi yang kering
• Peremajaan inokulum dapat dilakukan dengan mengmbil beberapa butir dari satu botol, walaupun disarankan tetap memisahkan biakan stock dari biakan kerja.
Penyimpanan dalam tanah
• Tanah harus diautoklaf dua kali (121 C for 15 min) sebelum diinokulasi dengan 1 ml suspensi spora dalam air steril
• Inkubasi pada 20-25 C selama 5-10 days tergantung pada laju pertumbuhan fungi
Penyimpanan dalam tanah
• Fusarium (Gordon, 1952; Booth, 1971)• Atkinson (1953) menyimpan Rhizopus, Alternaria,
Aspergillus, Circinella dan Penicillium.• Patogenitas Septoria dari sereal setelah 20 bulan
tetap tinggi (Shearer et al., 1974) dan jugaPseudocercosporella selama 1 tahun (Reinecke &Fokkema, 1979).
• Gordon's collection menunjukkan bahwa 76% isolatFusarium equiseti, 75% F. semitectum dan 50% F.acuminatum tumbuh tidak terkendali (Booth, 1971).
• Penyimpanan dalam tanah sebaiknya digunakanuntuk Fusarium dibandingkan di dalam minyakkarena adanya perubahan (variasi) terjadi dalamminyak.
Penyimpanan dalam tanah
Keuntungan :• Biakan dapat bertahan sampai 10
tahun.• Peremajaan berulang dapat dilakukan
dari sampel yang sama, walaupunsebaiknya stok harus ditempatkanterpisah.
• Biaya murah dan alat sederhana
Penyimpanan dalam tanah
Kerugian :• Kemungkinan terjadi variasi genetik• Beberapa fungi tidak dapat tahan di
desikasi • Kemungkinan kontaminasi lebih besar
Oomycota
• Paling baik disimpan di bawah nitrogen cairdengan kecepatan pendinginan 10°C min-1,walaupun beberapa galur tidak dapat disimpandengan cara ini.
• Di bawah minyak mineral dapat disimpansampai 6 bulan
• Tiga galur Phytophthora dapat tahan sampai 40tahun (laporan dari CABI-UK)
• Kultur dapat disimpan dalam air namun perlu ditransfer setiap 2 tahun
Zygomycota
• Nitrogen cair sangat disarankan untuk penyimpanan Mucor, Rhizopus dan genus lainnya
• Dapat pula dengan cara freeze-dried • Tidak semua genus tahan proses dehidrasi,
terutama dengan silica gel, misalnya Coemansia, Martensiomyces, Condiobolus, Entomophthora, Piptocephalis and Syzygites. Dari genus2 ini, hanya Piptocephalis dan Coemansia yang dapat di freeze dried.
Basidiomycota
• Umumnya tumbuh dalam bentuk miselium Fungi demikian hanya dapat disimpan dengan cara transfer regular pada agar dengan atau tanpa minyak, atau disimpan di nitrogen cair.
• Fungi tersebut menghasilkan dinding hifa yang tebal jadi mudah di freeze-dried tetapi sukar ditumbuhkan kembali
• Basidiospores yang diperoleh dari fungi yang tumbuh di alam, dapat di freeze-dried
Fungi Deuteromycota
• Fungi yang ber konidia reltif mudah di simpan
• Freeze-drying adalah teknik yang paling tepat.
• Aspergillus, Penicillium and Paecilomycesdapat disimpan mulai dari 6 bulan sampai 2 tahun pada agar miring pada -18°C.
Ragi
• Ragi (single celled vegetative yeasts)dapat disimpan dengan cara freeze-drying.
• Kebanyakan spesies dapat tahandisimpan dalam silica gel namun sukarditumbuhkan kembali
• Liquid nitrogen adalah cara yang palingbaik.
RangkumanMethod Cost Stability Longevity
Cryopreservation below –130oC
High Excellent >10 000 years
Freeze-drying High Little change reported
4-40 years
Silica gel Low Little change reported
5-20 years
Water Low Variation linked to storage time
2-7 years
Soil Low Variation common
5-20 years
Oil Low Change expected with time
1-50 years
Growth 18-22 oC Low-Medium Change expected with time
2 weeks to 6 months
Growth 4-7 oC Medium Change expected with time
6-12 months