Concetti basilari per lo studio del binding recettoriale
Incubando il tessuto contenente i recettori R ed il ligando
radiomarcato D in opportune condizioni sperimentali si formerà il
complesso RD secondo l’equazione
Quando il sistema raggiunge l’equilibrio in ogni provetta avremo:
I recettori sono presenti in concentrazioni molto piccole nei tessuti.
R + D RD
Il recettore libero R non potrà essere misurata ma possiamo misurare la quantità di complesso ligando-recettore RD.
Ligando radiomarcato D
Recettore libero R
Recettore RDEquilibrio
Incubazione
Radioligando Tessuto
Tampone di incubazione
Per poter calcolare la quantità del complesso RD è necessaria
un’operazione di separazione del legato (Bound) dalla quantità
di ligando radiomarcato D libero in soluzione non legato al
tessuto (Free).
Equilibrio Separazione
Metodi di separazione del RD dal mezzo di reazione
Filtrazione
Il metodo più semplice e classico è quello della
filtrazione su membrane in fibra di vetro
Whatman GF/A, GF/B, GF/C dove varia la porosità 0.7 m-2.7 m
Il tessuto contenente il recettore legato al radioligando
aderisce al filtro mentre il radioligando libero passa
attraverso la membrana.
Limiti e precauzioni della filtrazione
Le proteine ostruiscono il filtro
Il ligando radiomarcato tende a legarsi alle fibre del filtro.
Elevata velocità di filtrazione (deve essere completata in 4-5
secondi per evitare che il ligando radiomarcato si stacchi dal
recettore. In genere si perde il 5% di RD)
Centrifugazione
Limiti e precauzioni della centrifugazione
Una certa quantità di ligando radiomarcato (Free) potrebbe
restare intrappolato nel pellet.
Numero limitato degli alloggi nel rotore
Dialisi
Viene impiegata quando il recettore ha bassa affinità per il ligando
radiomarcato (micromolare).
Una piccola membrana simile alla cellulosa da dialisi separa
due camere
R LL L
LL
L
L
R
R
La membrana è scelta in modo tale che il ligando possa
passare mentre il recettore viene trattenuto.
Il ligando diffonde fino a raggiungere l’equilibrio.
Nella camera azzurra [L] sarà Ligando libero
Nella camera gialla [L]= ligando libero +ligando legato
La differenza fra questi valori è la concentrazione di ligando
legato.
Quella che viene misurata è la deplezione di ligando libero
Cromatografia per esclusione
Viene impiegata quando il recettore ha elevata affinità per il
ligando radiomarcato (picomolare).
Studi di binding
Analisi di saturazione
Analisi cinetica
Analisi di competizione
• Analisi di Scatchard• Analisi di Hill
• Cinetica di associazione • Cinetica di dissociazione
Analisi di saturazione
Recettore + Ligando Recettore-LigandoKon
Koff
Il binding avviene quando ligando e recettore collidono mediante
diffusione e quando la collisione ha un corretto orientamento e
sufficiente energia. La velocità di associazione è data dal
numero di eventi di binding per unità di tempo
Von = [Ligando] × [Recettore] × kon
numero di eventi per unità di tempo
Una volta avvenuto il binding, ligando e recettore restano legati
per un certo periodo di tempo.
La velocità di dissociazione del complesso è data dal
Voff = [ligando-recettore] × koff
Dopo la dissociazione il ligando e il recettore non devono aver
subito modifiche.
All’equilibrio avremo: Von = Voff
Riarrangiando l’equazione avremo:
Per meglio comprendere il significato della Kd poniamo
[Ligando] = Kd
L’equazione pertanto diviene:
[Recettore]
[Ligando-Recettore] = 1
da cui si evince che:
[Ligando] × [Recettore] × kon = [Ligando-Recettore] × koff
[Ligando] [Recettore]
[Ligando-Recettore] =
Koff
= KdKon
[Recettore] = [Ligando- Recettore]
Quando [Ligando] = Kd la quantità di recettore libero è
esattamente uguale alla quantità di recettore occupato.
I recettori totali sono la somma di quelli liberi più quelli legati al
ligando, e quando [Ligando] = Kd avremo che metà della
popolazione recettoriale sarà occupata all’equilibrio.
Se il ligando ha elevata affinità per il recettore, la Kd sarà
piccola perché basterà una piccola concentrazione di ligando per
legare la metà dei recettori.
Non bisogna confondere la Kd (costante di dissociazione
all’equilibrio) con Koff (costante di dissociazione). Non sono la
stessa cosa ed hanno dimensioni differenti.
Kon = costante di associazione (molare-1 min-1)
Koff = costante di dissociazione (min-1)
Kd = costante di dissociazione all’equilibrio (molare)
La legge di azione di massa permette di definire la frazione di
recettore occupata all’equilibrio in funzione della concentrazione di
ligando.
Frazione recettoriale occupata [RL]
[Rtot]=
[RL]
[R] + [RL]
Questa equazione non è utile perché non conosciamo la
concentrazione di recettore libero.
Poiché
[R] = [Rtot] - [RL]
e sapendo che:
[RL]
[R] [L]Kd =
[RL] =Kd
=([Rtot] - [RL]) [L][R] [L]
Kd
[RL] Kd + [RL] [L] = [Rtot] [L]
[Rtot] [L][RL] =
Kd + [L]
[RL] (Kd + [L] ) = [Rtot] [L]
[RL] Kd = [Rtot] [L] - [RL] [L]
da cui la frazione recettoriale occupata [RL]/ [Rtot] sarà:
[RL]
[Rtot]
[Ligando]
Ligando + Kd
=
[Ligando] Frazione recettoriale occupata
0 0%
1Kd 50%
4Kd 80%
9Kd 90%
99Kd 99%
La legge di azione di massa è un modello semplice che può
essere usato per spiegare alcuni dati sperimentali e non è utile in
tutte le situazioni.
Il modello assume che:
Tutti i recettori sono ugualmente accessibili al ligando
Il binding non deve alterare il ligando o il recettore
Il binding deve essere reversibile
I recettori sono liberi o legati con il ligando. Non devono esserci
differenti stati di affinità recettoriale o di binding parziale
Informazioni provenienti dall’analisi di saturazione
KD
Indica la concentrazione di radioligando che all’equilibrio
occupa il 50% dei recettori presenti nel preparato
biologico
Bmax
Indica la densità recettoriale nel tessuto studiato. Si
esprime in moli/mg di proteina.
Approccio sperimentale all’analisi di saturazione
L’esperimento di saturazione viene effettuato determinando il
Binding Totale e il Binding Non-Specifico a differenti
concentrazioni di ligando radiomarcato.
Binding Totale
Viene definito aggiungendo al tessuto concentrazioni crescenti di
radioligando
Binding Non-Specifico
Viene definito in presenza di ligando non marcato ad elevata concentrazione alla quale tutto il radioattivo viene spiazzato dai siti specifici di legame
Esempio: Vogliamo determinare il binding specifico all’equilibrio
per un determinato radioligando alla concentrazione di 0.5 nM
Provetta 1 (Binding totale)
Tessuto + Rx (0.5 nM)
Lettura radioattività =2500 cpm
Provetta 2 (Binding non specifico)
Tessuto + Rx (0.5 nM) + Ligando non marcato (10 M)
Lettura radioattività= 500 cpm
Alla concentrazione 0.5 nM di RX il complesso RD (Binding
Specifico, Bound) sarà : 2500-500= 2000 cpm.
Il valore 500 cpm rappresenta la quantità di RX che si è legato
a siti non specifici di legame.
Infatti l’impiego del ligando non marcato ad levata
concentrazione spiazza RX solo da tutti i siti specifici ma non
da quelli non specifici.
Realizzando differenti concentrazioni di RX e definendo per
ciascuna il Binding Totale e il binding Non-Specifico si
calcola il Binding Specifico.
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.60.00
0.05
0.10
0.15Binding totale
Binding specificoBinding non specifico
[3H]spiroperidolo, (nM)
Bo
un
d(p
mo
l/mg
pro
tein
)
Visualizzando solo la
curva del binding
specifico possiamo
individuare la Kd e la Bmax
Le tre curve corrispondenti
sono riportate in figura
0.00 0.25 0.50 0.75 1.000.000
0.025
0.050
0.075
0.100
Bmax
Kd
[3H]spiroperidolo, (nM)
Bou
nd(p
mol
/mg
prot
ein)
Come trasformare i cpm in concentrazione
Esempio:Un campione dal volume totale di un 1 mL fornisce
5000 cpm per un Rx di attività specifica 27 Ci/mmole
cpm
dpm
= efficienza (%)
Conoscendo l’efficienza strumentale (es 55%) 5000 cpm
corrispondono a 9090 dpm
Sapendo che 2.22 x 106 dpm corrispondono a 1 Ci
Avremo che 9090 dpm corrispondono a 4.1 x 10-3 Ci
Il campione in esame ha un volume totale di 1 mL
La concentrazione sarà: 1.52x10-10 M (0.152 nM).
Dall’attività specifica del radioligando sappiamo che 27 Ci
corrispondono ad 1 mmole. Cioè 27 x 106 Ci ad 1 mmole
Avremo che 4.1 x 10-3 Ci corrispondono a 1.52 x10-10 mmoli
Analisi di Scatchard
Partendo dall’equazione:[Rtot] [L]
[RL] =Kd + [L]
[RL] ([L] + Kd ) = [L] [Rtot]
[RL] [L] + [RL] Kd = [L] [Rtot]
dividendo tutto per [L] Kd avremo:
[RL] [L]
[L] Kd [L] Kd [L] Kd=+
[RL]Kd [Rtot] [L]
quindi:[RL]
[L]=
[Rtot]
Kd
-[RL]
Kd
Se indichiamo con B la concentrazione di ligando legato [RL];
con Bmax la quantità massima di ligando legato [Rtot];
con F la quantità di ligando libero [L]
avremo:B
F=
_ +B
Kd
Bmax
Kd
Riportando in grafico il rapporto tra la quantità di ligando legato e
ligando libero (B/F) rispetto alla quantità di ligando legato (B)
avremo:
Si ottiene una retta con
Slope = -1
Kd
L’intercetta sull’asse delle ascisse (B/F = 0) permette di ricavare Bmax che rappresenta la densità recettoriale.
0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 0.125 0.1500.00
0.25
0.50
0.75
1.00
Bound
B/F
Bmax
Se è presente un solo tipo di recettore lo Scatchard sarà lineare.Se sono presenti invece due tipi di recettore in uguale concentrazione ma con differenze in Kd per il radioligando avremo:
0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 0.125 0.1500.00
0.25
0.50
0.75
1.00
Bound
B/F
[radioligando]
Bin
ding
spe
cific
o
A B
Le curve dei singoli recettori sono riportate in rosso e azzurro
mentre in nero la curva somma del binding totale.
Nel grafico di Scatchard (B) la linea nera del binding totale
(inteso come somma del binding specifico delle popolazioni
recettoriali esistenti) evidenzia una curvatura e le due linee
tratteggiate rappresentano il binding specifico di ciascun
recettore.
Dall’analisi di Scatchard si può determinare l’omogeneità di
una popolazione recettoriale (sempre che vi siano differenze
evidenti tra i valori di Kd del radioligando per ciascun recettore).
In caso contrario avremo un’informazione apparente (di un’unica
popolazione recettoriale).
La soluzione del problema è realizzata ovviamente da radioligandi selettivi per ciascun tipo di recettore presente.
Analisi di Hill
Considerando l’equazione: [Rtot] [L]
[RL] =Kd + [L]
[RL] [L] + [RL] Kd = [Rtot] [L]
che può essere scritta:
[RL] Kd = [Rtot] [L] - [RL] [L]
[RL] =[L] ([Rtot] - [RL])
Kd
da cui: [RL]
[Rtot] - [RL]=
[L]
Kd
se il ligando L interagisce con n siti secondo l’equazione
nL + R RLn
[RL]
[Rtot] - [RL]=
[L]n
Kd
B
Bmax - B=
[L]n
Kd
avremo:
passando ai logaritmi:
dove n è il coefficiente di Hill (nH)
= n log [L] - log Kd
B
Bmax - Blog
log [L]
log B
Bmax - B
0
Se esiste un solo sito di interazione per recettore (n =1)
si ha una retta con pendenza = 1
Per calcolare la Kd bisogna porre
log B
Bmax - B= 0
pendenza = nH
Analisi cinetica
La quantità di binding aumenta nel tempo fino ad un valore
massimo (Ymax). Questo non corrisponde alla Bmax. Infatti Ymax è la
quantità di binding specifico all’equilibrio per una certa quantità di
ligando usato nell’esperimento di associazione. Bmax è la quantità
massima di binding estrapolata a concentrazioni molto alte di
ligando.
L’esperimento cinetico di associazione viene effettuato per
determinare la costante di velocità di associazione Kon e lo stato
stazionario.
Binding di associazione
La costante di velocità di dissociazione Koff (min-1).
La velocità con la quale incrementa il binding è dato da tre fattori
(oltre alle condizioni sperimentali come pH, temperatura):
La costante di velocità di associazione Kon (min-1 M-1).
La concentrazione del radioligando.
La concentrazione di recettore
libero ad ogni tempo di
misurazione corrisponde alla
Ymax meno il binding specifico
misurato allo stesso tempo.
Ymax
0 10 20 300
2500
5000
7500
Ymax
tempo (ore)
cpm
Effetto della concentrazione di Rx sul raggiungimento dello stato stazionario
Binding di dissociazione
tempo
Bin
din
g s
pec
ific
oBinding non specifico
Si porta sistema recettore-radioligando all’equilibrio e poi si
aggiunge il ligando freddo misurando il binding a diversi
intervalli di tempo.
Analisi di competizione
Il binding di competizione viene effettuato per determinare l’affinità
di un ligando per un dato recettore.
Viene utilizzata una concentrazione fissa di RX e di proteine
recettoriali.
Il sistema viene portato all’equilibrio in presenza di
concentrazioni differenti di ligando e quindi viene separato il
legato (Bound) da tutto il resto.
Binding totale
Il binding totale viene determinato in presenza del radioligando (in
questo caso [3H]-8-OH-DPAT) e del solo tessuto.
Binding non specifico
Viene determinato in presenza di 8-OH-DPAT ad elevate
concentrazioni (10 M) in modo che esso spiazzi dai siti
recettoriali specifici tutto [3H]-8-OH-DPAT.
La radioattività residua è data dal legame non specifico del
radioligando con proteine non recettoriali.
Binding specifico
Viene ottenuto per differenza tra il binding totale e quello non
specifico
Calcolo del valore di IC50
Concentrazione [3H]-8-OH-DPAT 0.81 nM
Binding totale 9200 cpm
Binding non specifico 920 cpm
Binding specifico 8280 cpm
[ ] 8-OH-DPAT
cpm
RX spiazzato Binding specifico Spiazzamento
percentuale
1 x 10-10 8700 9200-8700 500/8280 6 %
1 x 10-9 7500 9200-7500 1700/8280 21 %
1 x 10-8 2500 9200-2500 6700/8280 81 %
1 x 10-7 1800 9200-1800 7400/8280 89 %
1 x10-6 920 9200-920 8280/8280 100 %
Curva di spiazzamento del composto 8-OH-DPAT
Alla concentrazione 1x 10-6 viene definito il binding non specifico (920
cpm) che sottratto al binding totale (9200 cpm) fornisce il binding
specifico (8280 cpm). A questa concentrazione tutto il radioligando è
stato spiazzato dai siti recettoriali specifici (100 %).
Composto 1
cpm
RX spiazzato Binding specifico Spiazzamento
percentuale
9000 9200-9000 200/8280 2 %
8100 9200-8100 1100/8280 13 %
6500 9200-6500 2700/8280 33 %
2800 9200-2800 6400/8280 77 %
[ ]
1 x 10-10
1 x 10-9
1 x 10-8
1 x 10-7
1 x10-6 1720 9200-1720 7480/8280 90 %
Curva di spiazzamento del composto 1
Le curve di spiazzamento da cui ricavare il valore di IC50, si
ottengono riportando in grafico le percentuali di spiazzamento in
funzione del log della dose
10 -11 10 -10 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5
0
50
100
8-OH-DPAT IC50 = 3.02 nM Composto 1 IC50 = 20.6 nM
Log dose
% s
pia
zzam
ento
Il valore di IC50 indica la concentrazione di ligando in grado di
spiazzare il 50 % di radioligando dai siti recettoriali
all’equilibrio
E’ preferibile esprimere il valore di affinità come Ki in quanto si
eliminano le variabili
- concentrazione del radioligando utilizzato nel saggio di binding
- natura del radioligando impiegato
Equazione di Cheng-Prusoff
Ki =IC50
1 + [RX]
Kd