1 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
National Center of Competence in Research“Nanoscale Science”
PD Dr. Martin HegnerNCCR Nanoscale ScienceInstitut für PhysikUniversität BaselKlingelbergstrasse 82CH-4052 Basel
Molekulare ErkennungMolekulare ErkennungEinzelnen Molekülen auf den Einzelnen Molekülen auf den Zahn gefühltZahn gefühlt
Vorlesung zu finden auf:monet.physik.unibas.ch/~hegner/molrec.pdf
2 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Ligand
Rezeptor
Ligand/Rezeptor InteraktionenProtein Faltung
AFM Federbalken Tip
Molekulare Erkennung / Experimente Molekulare Erkennung / Experimente @ IfP@ IfP
AFM FederbalkenAFM Federbalken
fluid chamber
bead
micropipette
Dynamische Kraft Spektroskopie Optische Pinzetten
Federbalken Arrays
3 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Ziel dieser VorlesungZiel dieser Vorlesung
1. Was für Fragestellungen beschäftigen uns?
2. Wie können wir die Probleme untersuchen?
3. Was können wir daraus lernen?
4 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Biophysik mit einzelnen MolekülenBiophysik mit einzelnen Molekülen
Physik Chemie
Biologie
Nanoscience
5 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
ÜbersichtÜbersicht• Molekulare Erkennung• Dimensionen und Kräfte• Moleküle und Grenzflächen• Oberflächen Funktionalisierung• Dynamische Kraft Spektroskopie• Optische Pinzetten• Einzel Molekül Anwendungen• Federbalken Array
6 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Was bedeutet molekulare Erkennung?Was bedeutet molekulare Erkennung?
“Unspezifische Erkennung” “Spezifische Erkennung”
7 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Was bedeutet molekulare Erkennung?Was bedeutet molekulare Erkennung?
Eukaryontische Zelle
Signale auf die eine Zelle reagiert
II
III
I
8 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Wie interagieren Moleküle?Wie interagieren Moleküle?• Ionische Kräfte z.B. Amino Säuren mit RestenR-NH3
+ <-> R-COO-
Typ. Energie in Wasser 4-7 kcal/mol (6-12 kBT)
• Wasserstoff Brücken z.B. DNATeilen eines H Atoms zwischen zwei Molekülen die elektro-negative Atometragen (meistens N und O)Starke Dipol-Dipol Interaktion mit gerichtetem Charakter•Typ. Enegie in Wasser: 3-6 kcal/mol (5-10 kBT)
• Van der Waals KräfteSchwache, lang-reichweitige Interaktion zwischennicht-polaren MolekülenTyp. Energie in Wasser ≤ 1 kcal/mol (≤ 2 kBT)
9 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Wie gross ist ein einzelnes Wie gross ist ein einzelnes BiomolekülBiomolekül??
DNADNA--ProteinProtein KomplexeKomplexeDNA Durchmesser 2 nmDNA Durchmesser 2 nm
Menschliches HaarMenschliches HaarDurchmesser ~20 Durchmesser ~20 µµmm
10 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Cro ProteinCro Protein--DNA InteraktionDNA Interaktion(molekulare Erkennung einer DNA Sequenz)(molekulare Erkennung einer DNA Sequenz)
11 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Abbilden von NucleoAbbilden von Nucleo-- / Protein / Protein KomplexenKomplexen
Plasmid DNA geschnitten mit Restriktions Enzym HindIII
Protein filament (Titin)
Tip
2Rm
RcR’c
W
12 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Wo wirken Kräfte in Wo wirken Kräfte in PicoPico--NewtonNewton ??
1 nm3 Wasser (33 Moleküle) erfahren eine Gewichtskraft von FG=10-23 N = 0.00000000001 pN
Die Kraft, die zu einer chemischen Bindung führt, kann man ableiten als:Fchem= 1 eV / 0.1 nm = 1600 pN
Na Cl
Die Kraft, die der stärkste bio-molekulare Motor generieren kann beträgt ~ 60 pN
13 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
WieWie misstmisst manman PicoPico--NewtonNewton ? ? InstrumenteInstrumenteKraftmikroskopieKraftmikroskopie
Positionsdetektor
Federbalken
Spitze
In Lösung
Optische PinzettenOptische Pinzetten
Der Kraft-Sensor ist einekleine Plastik Kugel,
die mit Licht festgehalten wird
0.05 – 10 µm
14 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Moleküle an GrenzflächenMoleküle an GrenzflächenMotivation:Abbilden einzelner Biomoleküle und Messen von kleinen Kräften zwischen Molekülen in einer natürlichen Umgebung (Lösung) ist möglich, wenn man Raster-Kraft Mikroskopie oder Optische Pinzetten benützt.
Was berücksichtigt werden muss:• Beeinflusst die Deposition eines Moleküls auf einer
Oberfläche die biologische Funktion?• Die Oberflächen müssen bio-kompatibel sein• Eine Methode für die spezifische Verankerung muss
entwickelt werden
15 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Chemische Aktivierung einer Chemische Aktivierung einer OberflächeOberfläche
16 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Oberflächen AktivierungOberflächen AktivierungInterketten Interaktionen(van der Waals,Elektrostatisch)
Oberflächen-aktive Kopfgruppe
Substrat
ω -funktionalisierte Interface Gruppe
X X XX
SiO
SiO
SiO
Si
SiO
SiO
SiO
SiO
O O OO
Monolayer mit einem kovalenten Poly-siloxane Netzwerk resultierend ausSilanisierung einer Glas Oberflächemit einem ω-funktionalisiertemOrganosilan.
S S S S S
X X X X X
Au(111)
Θ~30°
Chemisorption eines ω-funktionalisiertenAlkanthiols auf Au(111), führt zu einemdicht-gepackten MonolayerArrangement
SiO, Ta2O5, Au, Pt
STM Bild eines SAM
17 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner MH, IfP Uni Basel
Synthese eines Synthese eines SAM MolekülsSAM Moleküls
OOHBr 1
OOHS
OHO S 3
I2
OOHSS
O
O
-O 2S2O32-
NHS/DCC oder MAL/DCC
DSUDMU SSNO
OOO
O
NO
O
O
DMU
S
HS
pH 6.5-7.5
DSU auf GoldWagner et al. Biophys. J. 70 (1996) 2052Hegner et al. J. Vac. Sci. Technol. B 14 (1996) 1418
18 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Messung der InteraktionenMessung der InteraktionenMotivationMotivation• Ist es möglich einzelne Interaktionen
von Biomolekülen zu detektieren?
• Können wir die Kraft einer einzelnenbiomolekularen Bindung quantifizieren?
• Besteht ein Zusammenhang zwischenden gemessenen Einzel-Molekül KraftMessungen und den thermodynamischen Daten?
• Ist es möglich neue Biosensorenbasierend auf dem EinzelmolekülExperiment zu entwickeln?
19 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
EnsembEnsemblele MessungenMessungenEinzelEinzel--MoleMolekükül Experimentl Experimentee
Ensemble Individuum
20 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
EnsembEnsemblele MessungenMessungenEinzelEinzel--MoleMolekükül Experimentl Experimentee
Mehr als eine Mesung ist nötig um Einblick in dieUntersuchten Eigenschaften zu ermöglichen (Statistik)Zugang zu Eigenschaften welche im gemittelten Resultatuntergehen
Ensemble Experimente:e.g. nM Konzentration (0,000000001M)Messung von 60’000’000’000’000 Moleküle / ZeitGemittelte Eigenschaften der Parameter werdengemessen
Einzel-Molekül Experimente:Messung an einem Molekül / Zeit
21 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Mechanik + KinetikMechanik + Kinetik
FZell Adhesion
AFMF
Dissoziations KonstanteAB A + BKDiss = [A]*[B]/[A*B]Affinität:Chemische Anziehung; Biomolekulare Interaktion dieeine Spezifität zeigt
22 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Raster Kraft MikroskopRaster Kraft Mikroskop
Z
X
Y
A
B
Detektor
KraftBewegungAblenkung
Laser Quelle
Piezo Bewegung
Spitze
Oberfläche
A-B
23 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Dynamische Kraft SpektroskopieDynamische Kraft Spektroskopie
24 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Dynamische Kraft SpektroskopieDynamische Kraft Spektroskopie(Kraft Auflösung > 10 pN)(Kraft Auflösung > 10 pN)Motivation:• Ist es möglich einen Einblick in die Bindungs-Eigenschaften einer
einzelnen bio-molekularen Bindung zu gewinnen? • Hat das Experiment, das an einem Molekül gemessen wird einen
Bezug zu den Daten die wir am Ensemble messen?
50 nm
50 p
N
Forc
e
Piezo Position Einzel-Molekül Experimente korrelieren direkt mitthermodynamischen Experimenten (∆G; ∆H; ∆S)
25 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Dynamische Kraft SpektroskopieDynamische Kraft Spektroskopie
Zeit die benötigt wird bis sich eine Bindung löst(Bell, Science 1978)
• Keine spezifische Stärkeeiner Interaktion
• τoff reduziert aufSekunden wenn externeKraft angelegt wird
( )
−∆=
TkWGW
BDoff expττ
Ziehen eines einzelnen Moleküls mit variierenden Geschwindigkeiten
F ∆x=W
∆x Reaktions-Koordinate
Ener
gie
26 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Dynamische Kraft SpektroskopieDynamische Kraft Spektroskopie
Wahrscheinlichste Kaft F* für Bindungs-Dissoziation(Evans and Ritchie, Biophys. J. 1997)
F*
0FxTkB =
∆
offτ∝ rln(Beladungs-Rate)
- keine spezifische Kraft für die Dissoziation!- DFS misst makroskopische und mikroskopische Parameter
27 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Ist die gemessene Interaktion spezifisch?Ist die gemessene Interaktion spezifisch?
00.0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
50 100
spezifischunspezifisch
Kraft (pN)
Wah
rsch
einl
ichk
eit
Spezifische Verankerung der Moleküle auf Oberflächen
SubstratFunktionalität
Spacer
Bioreaktive Gruppe
Biomolekül
Wagner et al. Biophys. J. 70 (1996) 2052Hegner et al. PNAS 96 (1999) 10109
28 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Lebenszeit einer einzelnen BindungLebenszeit einer einzelnen Bindung
Steigung des linearen Fit : ∆H
TJ ~ 375 (±16) kJ/molDFM ~ 300 (±42) kJ/mol
3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7
-101234567
logτ (0
)[s ]
1/T x103 K-1][
DFMTJ
TATTAATATCAAGTTG
Lebe
nsda
uer
Schumakovitch et al. Biophys. J. 82 (2002) 517
∆G = ∆H - T∆S
Eine Bindung die man aufheizt hält weniger lang
29 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Optische PinzetteOptische Pinzette Flüssigkeits-Kammer
∆830 nm
Laser
Mikropipette
OBJ O
BJ
EinzelnesMolekül resp.Rezeptor/Ligand
30 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
659 - 769455 - 390Violett
610 - 659492 - 455Blau
520 - 610577 - 492Grün
503 - 520597 - 577Gelb
482 - 503622 - 597Orange
384 - 482780 - 622Rot
Frequenz (THz)
Wellenlänge (nm)Farbe
Spektrum des LichtsSpektrum des LichtsUngefähre Wellenlänge (in Vakuum) undFrequenz Bereiche für die verschiedenen Farben
1 terahertz (THz) = 103 GHz = 106 MHz = 1012 Hz,1 nm = 10-3 µm = 10-6 mm = 10-9 m.Das weisse licht ist eine Mischung aller Farben des sichtbaren Spektrums.
Sichtbares LichtRegion des Electromagnetischen
Spektrums
0.7µm
0.6µm
0.5µm
0.4µm
Infrarot
Ultraviolett
31 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Warum können wir Partikel mit Warum können wir Partikel mit Licht festhaltenLicht festhalten??
Anetto Kraft
StrahlIntensität
Strahl Achseθ
A) Ein Licht brechendes Kügelchen wird in das intensivere Zentrum des Strahls gezogen, wird aber vom Licht von der Lichtquelle weg bewegt.
(B) Ein konvergierender Laserstrahl, fokusiert durch ein Linse, hält ein Kügelchen in einer konstanten axialen Position
BNettoKraft
Reflektiert
Reflektiert
Linse
Mikroskop Linse mitGrosser Nummerischer Appertur
32 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Doppel Strahl Laser PinzetteDoppel Strahl Laser Pinzette
pbs obj obj
diode laser
diode laser
spatial filter
x-y-z transl.
ccd camera
psd
pbs pbspbs
x-y-z transl.
White light
Faraday isolator
L1 L1
Faraday isolator
psd
flow cham
ber
qwp qwp
0.1 atten.0.1 atten.
blue filter
Grange W. et al. Rev. Sci. Instr. 73 (2002) 2308
33 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Manipulation von Mikro Kugeln mit Manipulation von Mikro Kugeln mit optischen Pinzettenoptischen Pinzetten
Kugel Plazierung aufPipette und in 1er Trap
3 µm
Kugel in derDoppel-Trap
Kugel in 3Dbeweglicher Trap
Kugel gehalten mit Saugkraft aufbeweglicher Pipette
34 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Experimente mit optischer PinzetteExperimente mit optischer Pinzette
fixiert in 3Dbeweglich in 3D
Pipette beweglichin 3D
2µm
Molekül
Protein mitAffinität zu DNA
Geeignet für Experimente mit Einzel-Molekülen, Mechanikund Motor Proteine
Ziehen eines einzelnen DNA Moleküls
DNA Molekül ist an den Enden an die Oberfläche der Polystyrol Kugel gekuppeltBewegliche PipetteKugel Durchmesser ~2 µm
Husale S. et al. Single Mol. 3 (2002) 91
35 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Strahl SteuerungStrahl Steuerung
Kippen der optischen Ebene innerhalb der Rück-Appertur
Bewegen des ganzen Strahls innerhalb der Rück-Appertur
Kein Verlust vonLicht (Energie)innerhalb derFalle
Verlust von Licht(Energie)innerhalb der Falle, asymmetrisches‚trapping‘
36 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Laufende Entwicklungen am InstrumentLaufende Entwicklungen am InstrumentMotivation:• Biosensor mit sub pN Sensitivität für biologische Untersuchungen
an einzelnen Molekülen in Puffer Lösungen• Optischer Weg des Instruments erlaubt Kombination mit
Licht Spektroskopie
Inter oder intra Protein Rearrangierung nach Ligand Interaktion innerhalb Filament Protein-Komplexes (Aktin; Intermediäre Filamente, Transport durchNPC,…)
Simultane Einzel-Molekül Mechanik undFluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET)gemessen mit optischen Pinzetten
A
Exitation
Emission
EmissionA
D
Exitation
A
D
A
F
37 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Jedem Gerät seinen AufgabenbereichJedem Gerät seinen Aufgabenbereich
Optische Pinzetten (∆F ~ 200 fN)Mechanische EigenschaftenMolekulare MotorenAuffalten von einzelnen MolekülenOptische Spektroskopie
Raster Kraft Mikroskop (∆F ~ 10 pN)Molekulare ErkennungMechanische DeformationAuffalten von einzelnen Molekülen
Mechanische Eigenschaften von dsDNA
38 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Elastizität von einzelnen DNA Elastizität von einzelnen DNA FragmentenFragmenten
Ausdehnung [µm]0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0
Kraft [pN]
05
101520253035404550556065707580
inextensibleworm like chain(WLC)
elastischer Modulusvon B-DNA
S-DNAÜbergang
extensible WLC
ssDNAextensible WLC
41)1(4
1 2 −−+= −
Lx
Lx
TkFAB
A: Molekül Persistenz LängeL: Kontur Länge
Inextensibles ‚worm like chain‘ Modell:
3/12*
41
=
ATSkF B
S: Stretch modulus
Kleine Moleküle die an die DNA binden,verändern ihre mechanische Eigenschaftgrundlegend
39 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
COOHmodifiziert
NH2modifiziert
BiotinNH2
EDCS-NHS
S-SMCC
DNAmodifiziert
DNAmodifiziert
b
bb
b
b
b
9931 bp
10456 bp
HS Biotin
DNA Kupplung an Polystyrol KugelnDNA Kupplung an Polystyrol Kugeln
Hegner, M. Single Mol. 1 (2000) 139
Kenntnisse von Oberflächen und Chemie
Auslenkung [µm]0 1 2 3 4 5 6 7
Kraf
t[pN
]
0
20
40
60
80
100
120
140
160
*
ds DNA
ss DNA ssDNA-RecAFilament
Kraft – Auslenkung Graph von ssDNA-RecA Filament
Hegner, M., Smith, S. & Bustamante, C. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 96 (1999)10109
Mechanische Eigenschaften von Mechanische Eigenschaften von Protein Protein –– NukleinNuklein--Säuren KomplexenSäuren Komplexen
P
RecA Filament: Nano Feder mitmolekularem Griff
41 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Molekulare Motoren (Molekulare Motoren (z.B.z.B. KinesinKinesin))
R. Milligan, Scripps Institute, http://www.scripps.edu/milligan
Kraft~ 4 pN
42 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Der stärkste bekannte BioDer stärkste bekannte Bio--MotorMotor((BacteriophageBacteriophage DNA packaging DNA packaging Motor)Motor)
43 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
DNA DNA packaging packaging motormotor
Tans, S. et al. Nature 2001
44 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
ZusammenfassungZusammenfassungTechniken Kraft-Regime Beispiele
10
100
Kraf
t [p
N]
1000Au-S
Si-C
Kova
lent
eBi
ndun
gen
AFM
Bio
mem
bran
Mik
ropi
pett
eO
ptis
che
Pin
zett
enM
agn
etis
che
Ku
geln
Poly
mer
Def
orm
atio
n
DextranHeparinAmylose
ssD
NA/
dsD
NA/
PEG
Poly
mer
Ela
stiz
ität
ssD
NA-
ssD
NA
Antig
en-A
ntik
örpe
r
Dis
sozi
atio
ns K
räft
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Abhä
ngig
!
Biot
in-(
Stre
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Prot
ein
/ RN
A
Konf
orm
atio
nelle
Fal
tung
Rat
en A
bhän
gig!
MyosinKinesin
RNAP
Mol
ekul
are
Mot
oren
DNAP
PagenMotor
45 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
(Bio(Bio--) Chemische Sensoren) Chemische Sensoren
opticalelectricalmagneticalthermalchemicalmechanical Signal
RekorderTransducerSensor Schicht
Analyte
Polymer Schicht
Immobilisierte Rezeptoren
MolekulareErkennung
Affinität
Bindungkonvertiert
in Signal
Verstärkungund Auslesen mit PC
46 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Federbalken ArraysFederbalken ArraysMotivation:• Biomolekulare Detektion mittels Federbalken Arrays• Brauchbar für Genomics (SNPs), Proteomics?• Echt Zeit Detektion am Spital Bett?
Mikro fabriziert(skalierbar), schnelleAntwort, autonomNächste GenerationBio-Sensor?Minimum von 2 Federbalken auf einem Chip
cantilever array
47 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
GeneGene--Chip Chip vonvon AffymetrixAffymetrix
~4000 sFr. / chip
Probe Molekülemüssen markiert sein
48 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Federbalken Array Sensor AufbauFederbalken Array Sensor Aufbau
49 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
DNA Hybridisation gemessen mit DNA Hybridisation gemessen mit Federbalken ArraysFederbalken Arrays
Federbalken array Sensorfunktionalisiert mit verschiedenen12 mer Oligonukleotiden
Injektion von komplementären 12 mer Oligonukleotiden Bio B1C in die Flüssigkeits-Zelle ergibt ev. Hybridisation
Der korrespondierende Federbalken Bio B1 verbiegt sich und ein Ablenkung-Signal wird messbar
Injektion von Mittel das die Interaktion löst (e.g. H2O pur) löst die Bindung und der Federbalken bieg sich zurück
Injektion von Bio B2C biegt den Federbalken Bio B2
McKendry et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 9783 50 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Detektion von Zielsubstanz in Detektion von Zielsubstanz in Überschuss von ‚junk‘ MolekülenÜberschuss von ‚junk‘ Molekülen
Injektion von250 nM B1Cund 20 µM B7C
51 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Schnelle (mobile) Diagnose am Spitalbett für Intensiv-Station Patienten
Verschiedene Parameter (Herz Schlag Rate, ECG, Atmung, ...) werden ‚online‘ überwacht mit verschiedenen Instrumenten in der Intensiv Station.
Y. Arntz et al. Nanotechnology 14 (2003) 86-90
CardiovaskulCardiovaskulääre re ApplikationApplikation
52 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Herz Infarkt Symptome: Brust Schmerzen, Schwierigkeiten beim AtmenMögliche Diagnose: Abnormitäten im ECG, Blut Test (Biomarker Expression), etc.
• Biomarker Detektion: Ausschüttung von Creatine Kinase, Troponin, Myoglobin~ 1-2 Std. nach der Beschädigung der Herz Muskulatur (tote Muskel Zellen) Konzentration indiziert Ausmass des Herz Infarkts
Heutige Test werden mittels ELISA durchgeführt (enzyme linked immuno sorbentassay)
Ein Federbalken array Gerät würde eine ‚online‘ Überwachung ermöglichen. Labor Test würde entfallen.
Diagnose mittels Federbalken ArraysDiagnose mittels Federbalken Arrays
53 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Proteomics mittels Federbalken Proteomics mittels Federbalken Arrays?Arrays?
Antikörper
Crosslinker
20nm Au 2nm Ti
Si
Silanisierung
NHS PEG
Ablenkungs Mechanismus
Ablenkung resultiert aus Stress induziertdurch die Interaktion des Analytsmit der sensitiven Schicht
Mehrere Schrittefür Funktionalisierung einzelner
Federbalken
Funktionalisierung des Federbalkens
Mikro-Kapillare
54 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Mehrfach Antikörper Federbalken ArrayMehrfach Antikörper Federbalken Array
Myoglobin 50 µg/mlCreatine Kinase 50 µg/mlHintergrund 100 µg/ml BSA
Schnelle Diagnostik?
-80
-60
-40
-20
0
20
40
Dif
fere
nti
elle
Abl
enku
ng
[nm
]
0 5000 10000 15000
Zeit [s]
Myo proBuffer Buffer CK pro Buffer
55 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Federbalken Federbalken -- SchlussfolgerungenSchlussfolgerungen• Wir können DNA und Proteine detektieren, die spezifisch an
die Federbalken Oberfläche binden. Die Interaktion bewirkteine mechanische Ablenkung der Federbalken. Die Ablenkungist proportional zu der Menge Moleküle die wir einspritzen.
• Ein differentielles Auslesen des Signals ist nötig
• Statischer Modus (Oberflächen Stress): Verbiegen des FederbalkenAsymmetrisches Funktionalisierung notwendigdicht gepackter Bio-Moleküle Monolayer notwendig
• Dynamischer Modus: Eine Massenzunahme wird detektiertFrequenz/Phasen Verschiebung der resonanz Frequenz
• Federbalken Bio-Sensoren werden wichtige Sensoren für dieBio-Diagnostik
56 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Cantilever
xxx xxx xxxxxxxxx xxxxxxxxxxx x x x xxx xx x x
K+
Top Nano 21 Programm:Top Nano 21 Programm:Funktionalisierte Federbalken ArraysFunktionalisierte Federbalken Arrays
Ibuprofin
Modul 2:Protein FederbalkenArray
Modul 3:Schnelle Mikro-organismenDetektion
Modul 4:Verstärkung mitDendrimeren
Modul 5:Enantio spezifischeDetektion
Modul 6: Beschichtungs-Prozeduren
Modul 7:Molekulares Imprinting
Modul 8:Ökonomie: MarktForschung
Modul 1:SAM und PlasmaDeposition
Leitung M. Hegner Start 9/02Leitung M. Hegner Start 9/02
57 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Biophysik Gruppe am Institut für Biophysik Gruppe am Institut für PhysikPhysik
Personen die diese Resultate ermöglicht haben:Dr. Y. ArntzDr. P. BertonciniDr. T. BraunDr. G. BumbuDr. K. GfellerDr. W. GrangeDr. E. RebourtDr. N. NugaevaDr. J. ZhangA. BreedekampS. Husale
PI M. Hegner
58 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Herzlichen Dank für Eure Herzlichen Dank für Eure AufmerksamkeitAufmerksamkeit
‘Nano’ Smiley (DNA-protein co deposition)
59 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
AnhangAnhang
60 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
FlussFluss derder genetischengenetischen InformationInformation
DNA
RNA
Protein
Transkription
Translation
Replikation DNA Polymerase
RNA Polymerase
Ribosom
Molekulare MotorenPrionen
61 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Grenzflächen Grenzflächen z.B.z.B. GoldGold
Gold mittlere Rauheit ca. 4 - 5 Å über 100 µm2
1.2.
3.
4.
5.
GlimmerGold
Silizium WaferOder Deckglass
Epoxy-Leim (EPO-TEK 377)
Ultraflaches Gold
STM Bilder: Tunnel Strom(Itun) 1 nA und Spitzen
Spannung (Vbias) - 200 mV
Hegner et al. Surf. Sci. 291 (1993) 39Wagner et al. Langmuir11 (1995) 3867
vorher
2 µm
2 µmnachher TSG
Z = 50 nm
Z = 50 nm Z = 5 nm
Auf Gold können wir Biomoleküle spezifisch verankern
62 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Momentum eines PhotonsMomentum eines PhotonsF = dP/dT
P = h/λ
Bead∆P
P1
P2Θ
Sammel-Linse transformiert Austrittswinkel in Strahlen Offset(nach Abbe sine Bedingungen): Xi = RL nb sinΘi
Positions-sensitiver Licht Detektor summiertüber alle Licht Strahlen und ergibt ein Signal
S = ΣXiWi
Externe Kraft wird berechnet nach:F = S/RLc
Reaktions Kraft auf Kügelchen: |F| = (W/c) nb sinΘ
Unabhängig von Partikel Grösse, Form oder Brechungsindex des Puffers
P = Momentum des PhotonW = Energie des Lasersc = Lichtgeschwindigkeitnb= Refraktiver Index des MediuRL= Fokal Länge der Linse
63 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Kraft Messung mittels Momentum des Kraft Messung mittels Momentum des LichtsLichts
Wellenlänge: 830 nmIntensität: 200mW (per Laserdiode)
OBJOBJPuffer Luft
OBJOBJ
ExterneKraft ∆X R
EX
2RL
Detektor Detektor
Maximum Kraft der Falle (~220 pN @ IfP)F =(W/c)/(r -r )/R LMax Rück-Appertur Strahl
Diese Art Messung sollte nicht benützt werden in einer Einzel-StrahlFalle, weil ein solch schmaler Licht Konus (wie oben gezeigt) ein Objekt nicht effizient festhalten kann. Wenn man die Rück-Appertur komplett ausfüllt, dann hat man einen grossen Gradienten der einObjekt festhalten kann, aber dann kann man nach einer Ablenkung nicht alle Photonen auf dem Detektor einsammeln.
64 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner
Layout des ‚Herz‘ des InstrumentsLayout des ‚Herz‘ des Instruments
Flüssigkeits-Kammer:Zwei Deckgläser mitParafilm; Kanal für Mikro-Pipette
Olympus 1,2 N.A.60xWasser ImmersionWD 280 µm
Flüssigkeits-Zufuhr
Expansions-FlaschenVakuum-Druck Automatische
Spritze