• Estrutura e Funções da Imunoglobulinas
Os anticorpos, também denominados imunoglobulinas (Ig), consistem em proteínas produzidas em resposta à exposição a antígenos. Os anticorpos consistem nos mediadores da imunidade humoral contra todas as classes de microrganismos, alérgenos e proteínas próprias, pois apresentam grande diversidade e especificidade em reconhecer estruturas moleculares diferentes.
Os anticorpos são sintetizados somente por linfócitos B e existem em duas formas: ligados à membrana dos linfócitos B, onde funcionam como receptores de antígenos (BCR), e secretados, forma na qual atuam na neutralização de toxinas, prevenção da entrada e disseminação dos patógenos e eliminando os microrganismos.
O reconhecimento do antígeno pelos anticorpos ligados à membrana dos linfócitos B naive ativa essas células, iniciando a resposta imune humoral. As células B ativadas se diferenciam em plasmócitos e iniciam a secreção de anticorpos da mesma especificidade do receptor do antígeno.
• Estrutura dos anticorpos
Todas as moléculas de anticorpo possuem características estruturais básicas em comum, mas apresentam grande variabilidade nas regiões onde os antígenos se ligam, o que permite que diferentes anticorpos se liguem a diversos tipos de antígenos.
Uma molécula de anticorpo possui uma estrutura simétrica composta de duas cadeias leves iguais e duas cadeias pesadas iguais. Essas cadeias possuem uma série de unidades repetidas, cada um com aproximadamente 110 resíduos de aminoácidos de comprimento, que se dobram independentemente em um motivo globular chamado de domínio Ig. Estes domínios de Igs pertencem a um grande grupo de domínios proteicos, conhecidos como superfamília das imunoglobulinas.
Um domínio Ig apresenta duas camadas de folhas β-pregueadas, cada uma composta de três e cinco fitas de cadeia polipeptídica antiparalela. Essas camadas são unidas por pontes dissulfeto e as faixas adjacentes de cada folha β são conectadas por pequenas alças. Aminoácidos presentes em algumas dessas alças são os mais variáveis para o reconhecimento do antígeno (Fig. 1).
As cadeias leve e pesada consistem em regiões variáveis (V), que estão presentes na extremidade aminoterminal, e que participam do reconhecimento do antígeno, e regiões constantes (C), localizadas na extremidade carboxiterminal. As regiões C das cadeias pesadas medeiam as funções efetoras. Bioquimicamente, a molécula de anticorpo é composta por diversos domínios, que pertencem a superfamília das imunoglobulinas.
Figura 1 – Domínios de Ig na estrutura do anticorpo. VH – região variável da cadeia pesada; CH – região constante da cadeia pesada; VL – região variável da cadeia leve; CL – região constante da cadeia leve.
Fonte: <https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=25946518>.
Os domínios Ig da região C são distantes do local de ligação do antígeno e não participam no reconhecimento do antígeno. As regiões C da cadeia pesada interagem com outras moléculas efetoras e células do sistema imune e, dessa forma, medeiam diversas funções dos anticorpos.
As cadeias pesadas podem se apresentar de duas formas que diferem nas terminações carboxiterminais: uma ancora os anticorpos ligados à membrana nas membranas plasmáticas dos linfócitos B, e a outra, é encontrada somente nos anticorpos secretados. As regiões C das cadeias leves não participam das funções efetoras e não estão diretamente ligadas às membranas das células.
As cadeias pesadas e leves estão covalentemente ligadas por pontes dissulfeto formadas entre os resíduos de cisteína no carboxiterminal da cadeia leve e no domínio CH1 da cadeia pesada. As interações não covalentes entre os domínios CL e CH1 também podem contribuir para a associação das cadeias leves e pesadas (Fig. 1).
As duas cadeias pesadas de cada molécula de anticorpo estão covalentemente ligadas por pontes dissulfeto. Nos anticorpos IgG, essas ligações são formadas entre resíduos de cisteína nos domínios CH1, próximas à região chamada de dobradiça. A região de dobradiça é fundamental para que os dois sítios de ligação do anticorpo acomodem-se, de maneira ótima, a duas moléculas de antígeno. Isto permite maior flexibilidade, mesmo que as duas moléculas de antígeno estejam a distancias diferentes.
A relação entre as cadeias das moléculas de anticorpo e as funções das diferentes regiões foram identificadas a partir de experimentos de clivagem de IgG por enzimas proteolíticas em fragmentos distintos.
A enzima papaína, age na região de dobradiça e cliva a IgG em três pedaços. Dois são idênticos um ao outro e consistem na cadeia leve (VL e CL) completa associada a um fragmento VH-CH1 da cadeia pesada. Esses fragmentos possuem a capacidade de se ligar ao antígeno porque cada um apresenta domínios VL e CL pareados, assim, eles são chamados de Fab (fragmento de ligação ao antígeno) (Fig. 2).
O terceiro fragmento é formado por dois peptídeos idênticos ligados por pontes de dissulfeto, cada um com os domínios CH2 e CH3 da cadeia pesada. Esse fragmento pode se autoassociar e se cristalizar em forma de treliça, por isso é chamado de Fc (fragmento cristalizável).
Quando se utiliza a enzima pepsina, ao invés da papaína, na clivagem do IgG, a proteólise ocorre distal à região de dobradiça, gerando um fragmento F(ab’)2 com a dobradiça e as pontes dissulfeto intercadeias intactas e dois locais de ligação do antígeno idênticos (Fig. 2).
A maioria das diferenças de sequência e variabilidade entre os anticorpos deriva de três trechos na região V da cadeia pesada e três trechos na região V da cadeia leve. Esses trechos são denominados regiões hipervariáveis e consistem em três alças protuberantes conectando fitas adjacentes das cadeias β que formam os domínios V da cadeia pesada da Ig e as proteínas da cadeia leve.
As regiões hipervariáveis são compostas por 10 resíduos de aminoácidos cada, que podem ser mantidos pelas sequências mais conservadas que formam o domínio Ig da região V. No anticorpo, as três regiões hipervariáveis do domínio VL e as três regiões hipervariáveis do domínio VH são mantidas juntas para criar uma superfície de ligação ao antígeno.
Por essas sequências formarem uma superfície complementar à forma tridimensional do antígeno ligado, as regiões hipervariáveis também são denominadas de regiões de determinação de complementariedade (CDRs).
Essas regiões, chamadas de CDR1, CDR2 e CDR3 procedem de cada região aminoterminal VL ou VH, sendo que as CDR3s são as mais variáveis. As diferenças na sequência entre as CDRs de diferentes moléculas de anticorpo contribuem para superfícies distintas de interação e, assim, para as especificidades dos anticorpos individuais.
A ligação do antígeno pelas moléculas de anticorpo é uma função das região hipervariáveis de VL e VH. O contato mais extenso é com a terceira região hipervariável. Porém, a ligação do antígeno não é primariamente uma função dos CDRs e os resíduos do arcabouço também podem fazer contato com o antígeno. Além do mais, na ligação com alguns antígenos, um ou mais CDRs podem estar do lado de fora da região de contato com o antígeno, não participando da ligação com ele.
Figura 2 – Clivagem do anticorpo pela papaína em dois fragmentos Fab e um fragmento Fc (esquerda). Clivagem do anticorpo pela pepsina em um fragmento F(ab’)2 e fragmentos peptídicos (direita).
• Classes de Anticorpos
As moléculas de anticorpo podem ser classificadas a partir das diferenças presentes na estrutura das regiões C da cadeia pesada. As classes de anticorpos também são denominadas de isotipos e consistem na IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.
Em humanos, as classes IgA e IgG podem ser divididos em subclasses, denominadas IgA1 e IgA2, e IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, respectivamente.
As cadeias pesadas são designadas pela letra do alfabeto grego correspondente ao isotipo do anticorpo, assim: a IgA1 contém cadeias pesadas α1; a IgA2, α2; IgD, δ; IgE, ε; IgG1, γ1; IgG2, γ2; IgG3, γ3; IgG4, γ1; e IgM, μ.
As regiões C da IgG, IgA e IgD possuem somente três domínios Ig, que são genericamente chamados de domínios CH e são numerados sequencialmente a partir do aminoterminal para o carboxiterminal (por exemplo, CH1, CH2, assim por diante). Em cada isotipo, essa regiões podem ser denominadas especificamente, como exemplo, Cγ1, Cγ2 na IgG.
As diferentes classes e subclasses de anticorpos desempenham funções efetoras diversas. Isso ocorre porque a maioria das funções efetoras dos anticorpos é mediada pela ligação das regiões C da cadeia pesada nos receptores Fc (FcRs) presentes em células como fagócitos, células NK e mastócitos. As classes e subclasses de anticorpos são diferentes em suas regiões C, o que determina onde eles se ligam e quais funções irão desempenhar.
Há dois isotipos de cadeias leves denominados κ (kappa) e λ (lambda), que são diferenciados por suas regiões constantes (C) carboxiterminais. Cada molécula de anticorpo possui duas cadeias leves κ idênticas ou duas cadeias λ idênticas.
Anticorpos secretados e associados à membrana diferem na sequência de aminoácidos da porção carboxiterminal da região da cadeia pesada. Na forma secretada, a porção carboxiterminal é hidrofílica. Já a forma ligada a membrana contém um pedaço carboxiterminal que inclui uma região transmembrana hidrofóbica α-helicoidal e uma porção carregada positivamente na região intracelular, logo abaixo da membrana.
Os aminoácidos carregados positivamente se ligam aos grupos de cabeça fosfolipídica carregados negativamente na região interna da membrana plasmática e realizam a ancoragem da proteína na membrana.
Nas moléculas IgM e IgD da membrana, a porção citoplasmática da cadeia pesada é curta, pois possuem apenas três resíduos de aminoácidos de comprimento. Já nas moléculas de IgG e IgE de membrana, a porção citoplasmática da cadeia pesada pode chegar até 30 resíduos de aminoácidos de comprimento.
As moléculas de IgG e IgE secretadas e o BCR são monoméricas, reprsentando a unidade estrutural básica do anticorpo. Já as formas secretadas de IgM e IgA formam complexos multiméricos em que dois ou mais núcleos de quatro cadeias de unidades estruturais do anticorpo são ligadas covalentemente. A IgM secretada é um pentâmero. A IgA é frequentemente secretada como um dímero.
As moléculas multiméricas de IgM e IgA também possuem um polipeptídeo adicional denominado de cadeia (J) (não confundir com os genes J, envolvidos no rerranjo que codifica o TCR e o BCR), que é ligado por pontes dissulfeto aos pedaços das caudas e serve para estabilizar os complexos multiméricos.
• Cinética de Produção de lgs
As cadeias pesadas e leves da Ig são sintetizadas em ribossomos ligados à membrana no retículo endoplasmático rugoso. A proteína é translocada para o retículo endoplasmático e as cadeias pesadas da Ig são glicosiladas durante esse processo.
A dobra das cadeias pesadas da Ig e sua montagem com as cadeias leves são reguladas por proteínas presentes no retículo endoplasmático denominadas chaperonas. Essas proteínas, como a calnexina e a molécula BiP (proteína de ligação), se ligam a polipeptídeos Ig sintetizados e garantem que eles sejam retidos ou degradados, se não forem dobrados corretamente e encaixados em moléculas de Ig completas.
A associação covalente das cadeias pesadas e leves, estabilizada por pontes dissulfeto, também ocorre no retículo endoplasmático. Após a montagem, as moléculas de Ig são liberadas das chaperonas, transportadas para a cisterna do complexo de Golgi e encaminhadas para a membrana plasmática em vesículas. Os anticorpos de membrana são ancorados na membrana plasmática e os anticorpos secretados são transportados para fora da célula.
A maturação das células B é associada com alterações específicas na expressão do gene da Ig, o que gera a produção de moléculas de Ig de diferentes formas. A célula pré-B sintetiza a forma membranar da cadeia pesada μ. Essas cadeias μ se associam a proteínas denominadas cadeias leves substitutas, para formar o receptor da célula pré-B.
Células B imaturas e maduras produzem cadeias leves κ ou λ que se associam as proteínas μ para formar moléculas de IgM. As células B maduras expressam formas membranares de IgM e IgD. Esses receptores Ig de membrana servem como receptores de superfície celular que reconhecem antígenos e iniciam a ativação da célula B.
O receptor da célula pré-B e o receptor de antígeno da célula B estão não covalentemente associados a duas outras proteínas de membrana, Igα e Igβ, que atuam nas funções de sinalização e são muito importantes para a expressão de IgM e IgD na superfície.
Quando os linfócitos B são ativados por antígenos e outros estímulos, as células se diferenciam em células secretoras de anticorpos e, em conjunto, ocorrem mudanças no padrão de produção da Ig. Uma dessas alterações é o aumento da produção da forma secretada de Ig em relação à forma membranar.
• Funções efetoras de anticorpos
Neutralização de microrganismos e toxinas microbianas
Os anticorpos contra microrganismos e toxinas microbianas bloqueiam a ligação desses agentes e suas toxinas aos receptores celulares, neutralizando-os. Muitos microrganismos penetram nas células hospedeiras através da ligação de moléculas da superfície microbiana com proteínas ou lipídios de membrana das células hospedeiras.
Os anticorpos que se ligam nessas estruturas microbianas bloqueiam a possível interação destes com os receptores celulares, evitando a infecção. Muitas toxinas microbianas também desenvolvem seus efeitos patológicos através da ligação com receptores celulares, como a toxina tetânica e a toxina diftérica.
Anticorpos contra essas toxinas dificultam as interações das toxinas com as células hospedeiras, impedindo que as toxinas produzam lesão e doença.
A neutralização de microrganismos e toxinas pelos anticorpos necessita somente da participação das regiões de ligação ao antígeno. Assim, a neutralização pode ser mediada por anticorpos de qualquer isotipo presente na circulação e nas secreções mucosas.
Um mecanismo desenvolvido pelos microrganismos para evitar que os anticorpos sejam capazes de se ligar neles é a mutação de genes de antígenos de superfície, que são alvo dos anticorpos neutralizantes.
• Opsonização e fagocitose
Os anticorpos do isotipo IgG opsonizam (revestem) os microrganismos e induzem sua fagocitose pela ligação com fagócitos. Os fagócitos mononucleares e os neutrófilos possuem receptores para as porções Fc dos anticorpos IgG.
Esse processo de revestimento de partículas para promover a fagocitose é chamado de opsonização e substâncias que realizam esse processo, como anticorpos e proteínas do complemento, são chamados de opsoninas. A opsonização também pode ocorrer por meio de um subproduto da ativação do complemento, o C3b, que se liga a um receptor de leucócitos para C3b e estimula a fagocitose dos microrganismos.
As partículas opsonizadas são internalizadas em vesículas chamadas de fagossomos, que se fundem com os lisossomos para formar os fagolisossomos, nos quais as partículas são destruídas por substâncias microbicidas. As principais substâncias microbicidas produzidas nos fagócitos ativados são as espécies reativas de oxigênio, óxido nítrico e enzimas hidrolíticas.
Os fagócitos também possuem diversos receptores de superfície que se ligam aos microrganismos e os internalizam, mesmo sem haver anticorpos, constituindo um mecanismo da imunidade inata. Um exemplo são receptores do tipo lectina, que são capaz de reconhecer determinados resíduos de carboidratos na superfície dos microrganismos.
• Receptores Fc em leucócitos
Os leucócitos possuem receptores de Fc que se ligam as regiões constantes de anticorpos, gerando a fagocitose de partículas opsonizadas por Ig. Outros receptores de Fc medeiam o transporte de anticorpos para diversos locais.
Entre os tipos de receptores para Fc, os que são mais relevantes para a fagocitose de partículas opsonizadas são os receptores para a porção Fc de anticorpos IgG, chamados receptores Fcγ.
Entre os subtipos do receptor Fcγ em fagócitos, o principal é o FcyRI, expresso em macrófagos e neutrófilos, que se liga a IgG1 e IgG3 com alta afinidade, garantindo a fagocitose de células opsonizadas.
• Citotoxicidade celular dependente de anticorpo
As células natural killer (NK) e outros leucócitos se ligam a células opsonizadas com anticorpo através dos receptores de Fc e as destroem. Esse processo é chamado de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC).
As células NK expressam o receptor FcγRIIIA. O receptor FcγRIIIA possui baixa afinidade para a Fc da IgG, por isso ele se liga somente a moléculas de IgG agregadas nas superfícies das células e não em moléculas circulantes de IgG monomérica. Assim, a ADCC só ocorre quando a célula está revestida com moléculas de anticorpo.
A ligação entre a porção Fc dos anticorpos com o receptor FcγRIII ativa as células NK de forma que elas realizem a secreção de citocinas, como o IFN-γ, e a liberação do conteúdo dos seus grânulos para destruição da célula-alvo.
• Eliminação de helmintos
A eliminação de alguns parasitas helmínticos se dá pela ação de anticorpos, eosinófilos e mastócitos que controlam a morte e a expulsão desses parasitas. Os helmintos são organismos muito grandes para que os fagócitos os internalizem. Além disso, os tegumentos dos helmintos são resistentes as substancias microbicidas, presentes nos grânulos das células da imunidade inata.
Dessa forma, uma proteína catiônica tóxica, chamada de proteína básica principal (MBP, do inglês Major Basic Protein) dos grânulos de eosinófilos, que possui potencial para matar os helmintos. O conteúdo dos grânulos que contém essa substância são liberados através da ligação dos anticorpos, principalmente IgE, mas também em menor grau IgG , na superfície doa helmintos.
A IgE que reconhece os antígenos da superfície dos helmintos também podem realizar a desgranulação dos mastócitos e eosinófilos locais, através de sua ligação em receptores de alta afinidade para IgE, presente nestas células.
As substâncias liberadas pelos mastócitos também induzem broncoconstrição e aumento da motilidade local, contribuindo para a expulsão de vermes de locais como as vias aéreas e o trato gastrintestinal.
• Exames de anticorpos
Exames que analisam anticorpos são utilizados para detectar a presença de determinados isotipos e para quantificá-los em uma amostra, geralmente de sangue. Como já citado anteriormente, há cinco classes diferentes de imunoglobulinas: IgM, IgG, IgE, IgA e IgD.
As classe mais investigadas nos exames de anticorpos são a IgM, IgG, IgE e IgA. A IgM e a IgG estão relacionadas à imunidade imediata e a longo prazo nas infecções, respectivamente. Já os anticorpos IgE são investigados na suspeita de alergias. Os anticorpos IgA são pesquisados quando se suspeita de doença que acometa as mucosas, como o diagnóstico de doença celíaca.
Quando um indivíduo é exposto à um determinado agente infeccioso pela primeira vez, o sistema imune leva determinado tempo até reconhecer os antígenos relacionados e começar a produção de anticorpos específicos e em quantidade suficientes para combater o agente. Assim, a resposta inicial é composta por anticorpos IgM e, após algum tempo, o sistema imune começa a produção de anticorpos IgG.
Através da memória imunológica, se o indivíduo for exposto novamente à este agente infeccioso, sua resposta será mais rápida e intensa que da primeira vez, proporcionando defesa principalmente pelos anticorpos IgG.
As vacinas possuem o objetivo de estimular a produção de anticorpos no indivíduo antes que este seja exposto ao agente infeccioso. Elas utilizam uma versão atenuada do microrganismos, que não é capaz de causar infecção. Dessa forma, as vacinas realizam uma resposta inicial com produção de IgM seguida por uma produção de IgG.
Os exames de anticorpos podem ser utilizados para detectar a exposição a um agente infeccioso, avaliar o nível de imunidade contra determinado microrganismo, investigar uma doença autoimune, investigar rejeição em um transplante, diagnosticar uma alergia e controlar o desenvolvimento de uma infecção ou doença autoimune.
Durante os exames, mistura-se a amostra do paciente com um antígeno conhecido. Se houver a presença do anticorpo na amostra e ele se ligar ao antígeno, pode-se medir os complexos antígeno-anticorpo.
A concentração normal de anticorpos pode variar em diferentes indivíduos. Dessa forma, o resultado dos exames deverão levar em consideração a sintomatologia do paciente e a suspeita clínica.
O resultado pode ser qualitativo, indicando a presença ou não do anticorpo contra determinado agente infeccioso, ou quantitativo, indicando se o indivíduo apresenta quantidade suficiente de anticorpos para combater uma infecção ou não. Também podem ser identificados e descritos a quantidade presente de anticorpos.
Referente aos exames de IgM e IgG ao longo de uma infecção, pode-se obter os seguintes resultados:
Anticorpos Significado
IgM positivo e IgG negativo Infecção recente.
IgM negativo e IgG positivo
Paciente já desenvolveu a doença no passado e se curou; paciente possui
uma doença crônica; paciente é vacinado.
IgM negativo e IgG negativo Paciente não está doente e não tem imunidade contra o agente.
Referência bibliográfica
ABBAS, Abul K.; LICHTMAN, Andrew H.; PILLAI, Shiv. Imunologia celular e molecular. 8ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2015.