Estudio Virológico por Estudio Virológico por
PCR en tiempo realPCR en tiempo real
Diagnóstico Molecular de Herpes virus
MSc. Mónica Cappetta
Lab. Biología Molecular, AEPSM
• Los métodos moleculares han potenciado la capacidad de los
laboratorios de identificar y caracterizar los agentes infecciosos en
profundidad.
• Las aplicaciones incluyen:
detección cualitativa y cuantitativa
genotipado y detección de subtipos
testeo de resistencia molecular
• Cuando se aplican estas metodologías selectivamente en un
laboratorio se potencian los diagnósticos y el manejo clínico de los
pacientes.
Biología Molecular en la Clínica
Agentes Virales
Detección viral directa por amplificación de ác. nucleicos:
- Eliminación en algunos casos de la utilización de métodos indirectos.
- Eliminación del cultivo viral altamente complejo.
- Rápido diagnóstico de infecciones virales.
- Alta sensibilidad y especificidad
Familia Herpes virus
• Principal causa de enfermedad humana viral luego de la gripe.
• Infección – latencia – reactivación
• 25 tipos 8 infectan al hombre.
• Mayoría de población humana infectada; adultos en gral. con Ac para la mayoría de los herpes virus excepto HHV-8.
• Virus envueltos de ADN doble cadena.
• Se clasifican por su localización en el estado latente.
Propiedades de los virus Herpes humanos
Tipo Nombre Sub Familia Células blanco Latencia Transmisión
1 Herpes simplex-1 (HSV-1) Alfaherpesvirinae Mucoepitelio NeuronaContacto cercanoContacto sexualMadre-bebé
2 Herpes simplex-2 (HSV-2) Alfaherpesvirinae Mucoepitelio NeuronaContacto cercano Contacto sexualMadre-bebé
3 Varicella Zoster virus (VSV) Alfaherpesvirinae Mucoepitelio Neurona Contacto
4 Epstein-Barr Virus (EBV) Gamaherpesvirinae Linfocito B, epitelio Linfocito B Saliva, ruta
respiratoria
5 Cytomegalovirus (CMV) BetaherpesvirinaeEpitelio,
monocitos, linfocitos
Monocitos, linfocitos y otros
Secreciones, transfusión sangre, transplan-te, congenita
6 Herpes lymphotropic virus Betaherpesvirinae Linfocitos T y otros
Linfocitos T y otros
Contacto, ruta respiratoria
7 Human herpes virus-7 (HHV-7) Betaherpesvirinae Linfocitos T y
otrosLinfocitos T y
otros Desconocido
8 Human herpes virus-8 (HHV-8) Gamaherpesvirinae Cél. endoteliales Desconocido Intercambio de
fluido corporales?
Manifestaciones clínicas
HSV 1 y 2: Lesiones
VZV: varicela (niños) herpes zoster (adultos/react.)
EBV: Asintomático (niños) Mononucleosis (jóvenes/adultos)
CMV: asintomático
Encefalitis (HSV, VZV)
Neumonia (VZV)
Linfomas luego de transplantes o SIDA (EBV)
Infección congénita (VZV, CMV)
Retinitis, neumonia, esofagitis, encefalitis en inmunodeprimidos (CMV)
Complicaciones
Diagnóstico Molecular de Herpes virus
Encefalitis virales : estudio de LCR
Pacientes inmunodeprimidos
Herpes virus y encefalitis
Agente causal de infecciones SNC
(10% encefalitis virales)
70% tasa mortalidad
diagnóstico precoz - terapia antiviralmorbilidad/moratlidad 20%
en Uruguay: 9% encefalitis viral por HSV
Menos agresivo: Biopsia cerebro vs Punción LCR
Ejemplo Citomegalovirus:
• Las pruebas serológicas presentan un uso limitado:
- individuos con infección latente
- anticuerpos aparecen 2 semanas después de la infección aguda
• Se produce la enfermedad al reactivarse como resultado de
Inmunodepresión: ej transplantes, SIDA, etc.
• La detección del ADN del CMV en plasma permite detectar
esta reactivación.
• Seguimiento de respuesta al tratamiento: carga viral.
Reactivación en inmunodeprimidos
ADN
PCR
2do. round1er. round
2n copiasDNA
Productonested-PCR
Electroforesisen gel
LCROrinaPlasmaBiopsia
Diagnóstico por real time-PCR
Detección rápida.
Detección cualitativa y cuantitativa.
No requiere manipulación post-PCR.
Menor probabilidad de contaminación o errores
de manipulación.
• Detección cualitativa de familia Herpes virus en LCR por PCR en tiempo real:
- Entrega de resultados en unas horas
• Cuantificación de CMV y EBV por PCR en tiempo real:
- Seguimiento de pacientes con reactivación
- Evaluación de tratamientos
Implementación en el laboratorio
Detección cualitativa de familia Herpes por Real time
3 Reacciones de amplificación:
HSV / CMV
EBV / HHV-6
VZV
6 diagnósticos en la misma corrida de amplificación.
Detección por Sybergreen Tm específica
Utilización de Uraciloglicosilasa durante la implementación en el laboratorio del protocolo.
Multiplex
• La Tm depende de la secuencia del ADN, el largo del producto y el contenido de GC.
• La Tm puede variar para:
- Prod. de igual tamaño pero distinto contenido de GC
- Prod. de igual tamaño y %GC pero con una distribución
de GC diferente
- Productos que difieran en 1 o más bases.
Identificación de productos de PCR por perfiles de Curvas de Melting
Análisis:
Se monitorea la fluorescencia de la muestra mientras la T° aumenta.
Se grafica la d/dT de la Fluorescencia en función de la Temp (°C).
Análisis de Tm de los productos amplificados
EBVVZVHHV6
Diagnóstico de Herpes virus: PCR vs PCR en tiempo real
PCR
24-36 hrs
2-4 cicladores
Alta manipulación
Riesgo de contaminación
Utilización de Kit comercial
Costos más elevados
Diagnóstico de Herpes virus: PCR vs PCR en tiempo real
PCR
24-36 hrs
2-4 cicladores
Alta manipulación
Riesgo de contaminación
Áreas pre y post-amplificación físicamente separadas
Cabina de UV
Diagnóstico de Herpes virus: PCR vs PCR en tiempo real
PCR
24-36 hrs
2-4 cicladores
Alta manipulación
Riesgo de contaminación
PCR tiempo real
2-3 hrs
LightCycler
Poca manipulación
Riesgo de contaminación
Multiplex con Sybergreen
Menor costo que Kit comercial
MUCHAS GRACIAS !!