HLA-B27 pozitivitás vizsgálati lehetőségei
Pálinkás László, Uherkovichné Paál Mária, Berki Timea
Pécsi Tudományegyetem Klinikai Központ
Immunológiai és Biotechnológiai Intézet
HLA-B27Humán Leukocita Antigén B27 az I osztályú hisztokompatibilitási komplexhez (MHC-I) tartozó sejtfelszíni glikoprotein, amely a 6. kromoszóma B lókuszán kódolódik.
Mads Hald Andersen et al. 2005. Journal of Investigative Dermatology
Az MHC-I antigének az összes magvas sejtünk felszínén megtalálható, szerepük az intracelluláris antigének bemutatása a vírussal fertőzött, illetve daganatos sejtek elpusztítására képes CD8+ T –sejteknek.
Heterodimer protein: egy alfa láncból és egy béta 2 mikroglobulin alkotja.
A kaukázusi populációban 8%, az afrikaiban 4%, a kínaiban 2-9% és a japánban 0.1-0.5% hordozza a HLA-B27 antigént.
HLA-B27 és patológia
Gyakori HLA-B27 pozitivitással járó alcsoportok:* Spondylitis ankylopoetika (kaukáziusiaknál ~92%),* reaktív arthritisz (Reiter szindróma) (~60-80%),* gyulladásos bélbetegséggel társuló arthritisz (~60%),* pszoriázishoz tárusló artritisz (~60%),* izolált anterior uveitisz (~50%), * nem differenciált spondylarthropátiák (~20-25%).
Szeronegatív spondylarthropátiák – olyan gyulladásos izületi betegségek, ahol a szerológiai tesztek reuma faktor (RF) negatívak. A RF egy nem specifikus markere más reumás megbetegedéseknek (például a reumatoid artritisznek).
Spondylitis ankylopoeticaA Bechterew kór (más néven spondylitis ankylopoetica, rheumatoid spondylitis) esetén a betegek több mint 90%-a HLA-B27 pozitív. Az ankylosis rigidséget, merevséget jelent, a spondyl pedig a gyulladt gerincoszlopot jelzi.
Főleg fiatal férfiak betegsége, amely fájdalommal és gyulladással jár a keresztcsonti, a csigolyák közötti és a bordák izületeinél. Előrehaladott állapotban a mellkas és a gerinc teljes merevségéhez vezet. Ez nagyon kellemetlen, mivel végül egy görbe testhelyzetbe szorítja a beteget, amely szerencsére a mai kezelések hatására kevéssé gyakori végállapot.
Reiter szindrómaAz izületi gyulladások egy fajtája, reaktív artritisz. A szindrómához tartozik a reaktív artritisz mellett legalább egy nem izületi gyulladás, például: szem, bőr vagy izom érintettség.
A betegek kb. 80%-a HLA-B27 pozitív.
A reaktív artritisz tünetei általában napokkal vagy hetekkel a kiváltóinfekció után jelentkeznek.
A tünetek több hétes – hónapos időtartam alatt néha jelentkeznek, néha elmúlnak.
A reaktív izületi gyulladás sokáig diangosztizálatlan maradhat, mert a tünetek néha nagyon enyhék.
Kiváltó faktorok30-60 nappal az izületi gyulladás előtt:• enterális• urogenitális• néha pulmonális (légúti) infekciók.
Feltételezett infektív ágensek:• Salmonella ssp.• Yersinia enterocolitica• Chlamydia trachomatis
EFI standardok HLA tipizálásra
K2.000 Antigén vizsgálatK2.100 Kontroll sejteket kell vizsgálni minden új reagensnél.
- negatív sejt- pozitív sejt- keresztreagáló sejt
K2.200 Kontroll szérumot kell vizsgálni minden vizsgálatnál.- negatív szérum- pozitív szérum- keresztreagáló szérum
K3.000 Molekuláris technikaMinden vizsgálatnál szükséges
- pozitív DNS- negatív DNS használata.
5.6. kiadás (November 16, 2008)
K fejezet – Betegség asszociációnál egyetlen HLA típus vizsgálata European Federation for Immunogenetics
Áramlási citometria
Fizikai paraméterek
Forward scatter = méret
Side scatter = granularitás
FSC
SSC
LASER (488nm)
LASER
FSC-Height
SS
C-H
eigh
t
0 256 512 768 102410
0
101
102
103
104
Mo
Ly
Gr
Áramlási citometria
HLA-B27-FITC
CD3-PE
LASER
BDTM HLA-B27 System
Anti-HLA-B27 – FITC clone GS145.2 (IgG1, kappa)Anti-CD3 – PE clone SK7 (IgG1, kappa)
HLA-B27 szűrő tesztCD3-PE / HLA-B27-FITC
Cut off(setup beads)
Negatív minta
Pozitívminta
FSC-Height
SS
C-H
eigh
t
0 256 512 768 102410
0
101
102
103
104
Setup Beads
FSC-Height
CD
3 P
E
0 256 512 768 102410
0
101
102
103
104
CD3+
Méret
a-CD3-PE
Granularitás
a-HLA-B27 - FITC
HLA B27 FITC
Cou
nt
0 125 250 375 5000
23
47
70
93
MFI = 140
HLA B27 FITC
Cou
nt
0 125 250 375 5000
5
10
15
20
MFI > 140
HLA B27 FITC
Cou
nt
0 125 250 375 5000
16
31
47
62
MFI < 140
Cell count
Izotípus kontroll teszt
Simultest Control (Beckton Dickinson)Anti-keyhole limpet hemocyanin-FITC clone: X40 (IgG2a)Anti-keyhole limpet hemocyanin-PE clone: X39 (IgG1)
FSC-Height
SS
C-H
eigh
t
0 256 512 768 102410
0
101
102
103
104
LyLy
Limfociták kapuzása
Méret
Granularitás
Mouse IgG2a FITC
Mou
se Ig
G1
PE
100
101
102
103
104
101
102
103
104
0,02% 0,02%
99,97% 0,00%
Izotípus (negatív) kontroll
egér IgG2a - FITCegér IgG1 -PE
Konfirmáló HLA-B27 teszt
IOTest® (Bekman Coulter)Anti-HLA-B27-FITC clone: HLA-ABC-m3 (IgG2a)Anti-HLA-B7-PE clone: BB7.1 (IgG1)
HLA B27 FITC
HLA
B7
PE
100
101
102
103
104
101
102
103
104
0,10% 1,86%
1,07% 96,97%
0,10% 1,86%
1,07% 96,97%
a-HLA-B27 - FITCa-HLA-B7 -PE
HLA-B27 Pozitív
HLA B27 FITC
HLA
B7
PE
100
101
102
103
104
101
102
103
104
0,49% 0,00%
99,30% 0,21%
0,49% 0,00%
99,30% 0,21%
a-HLA-B27 - FITC
a-HLA-B7 -PE
HLA-B27 Negatív
Keresztreakció HLA-B7-tel
IOTest® (Bekman Coulter)Anti-HLA-B27-FITC clone: HLA-ABC-m3 (IgG2a)Anti-HLA-B7-PE clone: BB7.1 (IgG1)
HLA-B27 + / HLA-B7 +
HLA B27 FITC
HL
A B
7 P
E
100
101
102
103
104
101
102
103
104
10,73% 89,02%
0,21% 0,04%
a-HLA-B27 - FITCa-HLA-B7 -PE
a-HLA-B27 - FITC
HLA-B27 - / HLA-B7 +
HLA B27 FITC
HL
A B
7 P
E
100
101
102
103
104
101
102
103
104
93,96% 4,90%
1,14% 0,00%
93,96% 4,90%
1,14% 0,00%
a-HLA-B7 -PE
Molekuláris biológiai diagnosztika kétes esetekben
Olerup SSPTM HLA-B*27 alacsony felbontás
+ - Minta 1 Minta 2
100bp
200bp
300bp
400bp500bp GH - ktrl
(450bp)
HLA-B*27(180bp)
Minőségügyi szemlélet
MSZ EN ISO/IEC 17025:2005 Vizsgáló- és kalibrálólaboratóriumok felkészültségének általános követelményei
MSZ EN ISO 15189:2007 Orvosi laboratóriumok. A minőségre és a felkészültségre vonatkozó külön követelmények
2008 óta NAT-1/1552/2008 számon akkreditált vizsgáló laboratórium vagyunk.
Laboratóriumunk minőségirányítási rendszerét a következőISO standardok alapján építette ki:
HLA-B27 programjában.Részt veszünk a (United Kingdom National External Quality Assessment Service)
Vizsgálati eredmények
2009. I. félévében
6625 beteget vizsgáltunk, ebből 305 esetben (5%) kértek HLA-B27 kimutatást.
HLA-B27Negatív(68%)
HLA-B27 pozitív(19%)
Keresztreagáló pozitív(2%)
Keresztreagáló negatív(11%)