0086PreparaADNparaanálisede
sequenciaçãonoIlluminaMiSeq
HOLOTYPEHLA™96/7CONFIGURAÇÃOAECEECONFIGURAÇÃOBECE(REF:H32EREF:H34)INSTRUÇÕESDEUTILIZAÇÃO
VERSÃO1002-05-2018
OmixonBiocomputingLimited
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ÍndiceINFORMAÇÕESDOFABRICANTE...........................................................................................................................8
LEGENDADOSSÍMBOLOS.....................................................................................................................................8
CONTEÚDODOKITHOLOTYPEHLA-96/7CONFIGURAÇÃOAECE(REF:H32)OUCONFIGURAÇÃOBECE(REF:H34)9
CAIXADECOMPONENTEINICIADOR..................................................................................................................................9CAIXADECOMPONENTEDEREAGENTESDEPREPARAÇÃODEBIBLIOTECA..................................................................................9PLACAADAPTADORADE96POÇOS...................................................................................................................................9LIVRODOEXCEL.........................................................................................................................................................10SOFTWARE–OMIXONHLATWIN.................................................................................................................................10
EXPEDIÇÃOEARMAZENAMENTO.......................................................................................................................10
AVISOSEPRECAUÇÕES.......................................................................................................................................10
LIMITAÇÕESCONHECIDASDOPRODUTO..........................................................................................................................11
INFORMAÇÕESDESEGURANÇA..........................................................................................................................11
PARÂMETROSDEDESEMPENHO........................................................................................................................12
ASSISTÊNCIATÉCNICA........................................................................................................................................12
Suporteportelefone:.......................................................................................................................................12
EQUIPAMENTO,REAGENTESECONSUMÍVEIS.....................................................................................................13
RECOMENDAÇÕESTÉCNICASESOBREOEQUIPAMENTO......................................................................................................13RECOMENDAÇÕESRELATIVASAREAGENTESASSOCIADOS....................................................................................................13
CapacidadedokitdereagenteMiSeq..............................................................................................................14CONSUMÍVEISRECOMENDADOS.....................................................................................................................................14
AVISOLEGAL......................................................................................................................................................15
UTILIZAÇÃOPREVISTA........................................................................................................................................15
NOTAIMPORTANTEANTESDECOMEÇAR..........................................................................................................16
ISOLAMENTODEADNGENÓMICORECOMENDADO...........................................................................................................16
PRINCÍPIODOMÉTODO.....................................................................................................................................17
RESUMODEPASSOS...........................................................................................................................................18
GLOSSÁRIO/DEFINIÇÕES....................................................................................................................................19
PASSO1–PREPARAÇÃODAMISTURAPRINCIPALDEAMPLIFICAÇÃODEHLA....................................................20
LISTADEREAGENTES...................................................................................................................................................20PROTOCOLO..............................................................................................................................................................20
Misturaprincipal:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1eDQA1........................................................................................21Misturaprincipal:HLA-DQB1Conjunto3.........................................................................................................21
PASSO2–AMPLIFICAÇÃOHLACLASSESIEII......................................................................................................22
LISTADEREAGENTES...................................................................................................................................................22PROTOCOLO..............................................................................................................................................................22
MisturaprincipalcarregadadeTaqpolimerase:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1eDQA1........................................23MisturaprincipalcarregadadeTaqpolimerase:HLA-DQB1Conjunto3.........................................................23AmplificaçãoclasseI(HLA-A,BeC).................................................................................................................23AmplificaçãoclasseII(HLA-DRB1,DPB1,DQA1eDQB1).................................................................................24
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Tamanhosprevistosdeamplicon.....................................................................................................................24
PASSO3–QUANTIFICAÇÃOENORMALIZAÇÃODEAMPLICON(UTILIZANDOUMFLUORÓMETRODEPLACAS)...25
LISTADEREAGENTES...................................................................................................................................................25PROTOCOLO..............................................................................................................................................................25
Agrupamentodeamplicon...............................................................................................................................27PurificaçãoPCRdeExoSAP-iTExpress..............................................................................................................27
PASSO4–PREPARAÇÃODABIBLIOTECA............................................................................................................28
LISTADEREAGENTES...................................................................................................................................................28PROTOCOLO..............................................................................................................................................................28
Misturaprincipaldefragmentação.................................................................................................................29Programadefragmentação.............................................................................................................................29Misturaprincipaldereparaçãofinal................................................................................................................30Programadereparaçãofinal...........................................................................................................................30Misturaprincipaldeligação.............................................................................................................................31Programadeligação........................................................................................................................................31Purificaçãodebibliotecaeagrupamento........................................................................................................32
PASSO5–SELEÇÃODOTAMANHODABIBLIOTECA............................................................................................34
LISTADEREAGENTES...................................................................................................................................................34PROTOCOLO..............................................................................................................................................................34
PASSO6–QUANTIFICAÇÃODEBIBLIOTECAATRAVÉSDEUMINSTRUMENTOQPCR...........................................35
LISTADEREAGENTES...................................................................................................................................................35PROTOCOLO..............................................................................................................................................................35
MisturadeiniciadorqPCR................................................................................................................................35MisturaprincipalqPCR.....................................................................................................................................36
PASSO7–SEQUENCIAÇÃONOILLUMINAMISEQ...............................................................................................38
LISTADEREAGENTES...................................................................................................................................................38CapacidadedokitdereagenteMiSeq..............................................................................................................38
PROTOCOLO..............................................................................................................................................................38
PASSO8–ANÁLISEDEDADOSDESEQUENCIAÇÃOHLA......................................................................................40
PROTOCOLOAUTOMATIZADO........................................................................................................................................40InstalaçãoeconfiguraçãodeTI.......................................................................................................................40Protocoloporanálise.......................................................................................................................................40
PROTOCOLODESERVIDORMANUAL................................................................................................................................40InstalaçãoeconfiguraçãodeTI.......................................................................................................................40Protocoloporanálise.......................................................................................................................................40
PROTOCOLODEAMBIENTEDETRABALHOMANUAL............................................................................................................41InstalaçãoeconfiguraçãodeTI.......................................................................................................................41Protocoloporanálise.......................................................................................................................................41
VALORESCOMPLEMENTARES.............................................................................................................................42
EXEMPLODEPLACAPARAPLACADEAMPLICON,PLACADEAMPLIFICAÇÃO,PLACADEDILUIÇÃO,PLACADEQUANTIFICAÇÃODEAMPLICON(PARAUMLÓCUSINDIVIDUAL)EPLACADEREAÇÃO............................................................................................................42EXEMPLODEPLACADEQUANTIFICAÇÃODEPADRÕES.........................................................................................................42EXEMPLODEPLACAQPCRDEQUANTIFICAÇÃODEBIBLIOTECAKAPA...................................................................................43
ANEXO1:PIPPINPREP........................................................................................................................................44
PROGRAMAROPIPPINPREP.........................................................................................................................................44
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EXECUTAROPIPPINPREP.............................................................................................................................................44
ANEXO2:QUANTIFICAÇÃODEAMPLICONUTILIZANDOUMINSTRUMENTOQPCR.............................................47
LISTADEREAGENTES...................................................................................................................................................47PROTOCOLO..............................................................................................................................................................47
ANEXO3:QUANTIFICAÇÃODEBIBLIOTECA,UTILIZANDOUMCORANTEFLUORESCENTEDSADNINTERCALAR....49
LISTADEREAGENTES...................................................................................................................................................49PROTOCOLO..............................................................................................................................................................49
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Históricododocumento–Notaseatualizaçõesimportantes
Versão Data Autor Resumodealterações Autorizadopor
Datadeemissão
V1 05-12-2015 Robert
PollockProjetodaprimeiraversão Gergely
Tölgyesi05-12-2015
V2 18-01-2016 RobertPollock
Segundoprojeto,pequenascorreções GergelyTölgyesi
18-01-2016
V3 10-02-2016 RobertPollock
Terceiroprojeto,atualizaçãodaexplicaçãodossímbolos,atualizaçãodarecomendaçãodociclodecongelamento/descongelamento,atualizaçãodautilizaçãoprevista
GergelyTölgyesi
10-02-2016
V4 26-02-2016 RobertPollock
Quartoprojeto,atualizaçõesdasecçãodeinformaçõesdesegurança
GergelyTölgyesi
26-02-2016
V5 05-04-2016 RobertPollock
Quintaversão,recomendaçãoalternativaparaquantificaçãodeamplicon
EfiMelista 05-04-2016
V6 09-04-2016 EfiMelista
Pequenaalteraçãonaredaçãode«enzimaLR-PCR»para«Taqpolimerase»,combaseemalteraçãodadocumentaçãodaQiagen
GergelyTölgyesi
09-04-2016
V7 23-04-2016 EfiMelista
AtualizaçãodedeclaraçãoDQB1conjunto1econjunto2
GergelyTölgyesi
23-04-2016
V8 30-05-2016 GergelyTölgyesi
Atualizaçãodasmétricasdedesempenho,Atualizaçãodosvolumesdereagentesdepreparaçãodebiblioteca,AtualizaçãodasconfiguraçõesdeprodutoparaplacasadaptadorasindexadasA2/A3/A4
EfiMelista 30-05-2016
V9 21-08-2017 GergelyTölgyesi
Configuraçãodeplacaadaptadoraindexada96/7ConfiguraçãoBadicionada
EfiMelista 21-08-2017
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V10 14-12-2017 TündeVágó
Remoçãode«DQB»dosintensificadoresDQB,verificaçãodegelapósLR-PCRtornadaopcional,simplificaçãodaquantificaçãodeamplicon,alteraçãodovolumeporamostraemkitsde11lócus,substituiçãoExoSAP-ITporExoSAP-ITExpress,utilizaçãodeQubitparaquantificaçãodebiblioteca,misturadeiniciadoresDQB1conjunto1econjunto2substituídaporDQB1conjunto3,reduçãodotempodereaçãodereparaçãofinal,atualizaçãodométododequantificaçãodebibliotecadereduçãodotempodereaçãodeligação,fichadeamostrasremovidadosAnexos
EfiMelista 02/05/2018
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Isençãoderesponsabilidade
AOmixonenvidoutodososesforçosparagarantirqueestasInstruçõesdeutilização(IFU)sejamexatas.AOmixonnãoseresponsabilizaporquaisquerimprecisõesouomissõesquepossamterocorrido.Asinformaçõescontidasnestasinstruçõesdeutilizaçãoestãosujeitasaalterações,semavisoprévio.AOmixonnãoassumenenhumaresponsabilidadeporquaisquerimprecisõesquepossamexistirnestasinstruçõesdeutilização.
A Omixon reserva-se o direito de efetuarmelhorias nestas instruções de utilização e/ou aosprodutosnelasdescritos,aqualquermomento,semavisoprévio.
Casoencontreinformaçõesincorretas,inexatasouincompletasnestemanual,agradecemosquenosenvieosseuscomentáriosesugestõesparaoendereço:[email protected].
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InformaçõesdofabricanteNomedaempresa:OmixonBiocomputingLtd
Endereçoparavisitantes:Fehérváriút50-52/6
Cidade:Budapeste
Códigopostal:H-1117
País:Hungria
Legendadossímbolos
LOTE/númerodecarregamento
Referência/númerodecatálogo
Consultarasinstruçõesdeutilização
ContémreagenteparanúmeroNdeteste
Fabricantelegal.Adataassociadaaestesímbolorefere-seàdatadefabrico
Temperaturadearmazenamentorecomendada
Datadevalidade
Dispositivomédicodediagnósticoinvitro
ContémcomponentedesubstituiçãoComponentedesubstituição
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ConteúdodokitHolotypeHLA-96/7ConfiguraçãoAeCE(REF:H32)ouConfiguraçãoBeCE(REF:H34)
CaixadecomponenteiniciadorO componente iniciador fornece soluções de iniciador específicas, prontas a utilizar, paraamplificaçãoPCRdelongoalcancedirecionadadegenesHLAA,B,C,DPB1,DQA1eDQB1,eDRB1.Adicionalmente,tambémcontémdoistiposdeaditivosPCR(Intensificador1eIntensificador2).
Misturadeiniciador REF# Rxns Vol/tubo #Tubos CódigodecorHLA-A P012 96 220µl 1 AmareloHLA-B P022 96 220µl 1 VermelhoHLA-C P032 96 220µl 1 CordelaranjaHLA-DRB1 P042 96 220µl 1 VerdeHLA-DQB1(Conjunto3) P122 96 220µl 1 AzulHLA-DQA1 P072 96 220µl 1 CastanhoHLA-DPB1 P082 96 220µl 1 RoxoIntensificador1 E01 96 1100µl 1 TransparenteIntensificador2 E02 96 300µl 1 Transparente
CaixadecomponentedereagentesdepreparaçãodebibliotecaA caixa de componente de preparação de biblioteca fornece reagentes para a preparação dabiblioteca (fragmentação, extremidade romba e adenilato das extremidades dos amplicons,ligando-lhessequênciasadaptadorasindexadas)dosampliconsHLA.
Reagente REF# Rxns Vol/tubo #Tubos CódigodecorEnzimadefragmentação(A) R11 96 278µl 1 AmareloTampãodefragmentação(B) R21 96 278µl 1 VermelhoEnzimadereparaçãodeextremidade(C) R31 96 162µl 1 VerdeTampãodereparaçãodeextremidade(D) R41 96 324µl 1 CordelaranjaEnzimadeligação(E) R51 96 324µl 1 AzulTampãodeligação(F) R61 96 1800µl 2 Preto
Placaadaptadorade96poçosOcomponentedeplacaadaptadoraindexadade96poçoscontémadaptadoresNGSindexados(oligonucleótidos de ADN de cadeia dupla) em solução de 5 µl, prontos a utilizar, para gerarbibliotecas de NGS individuais. A placa adaptadora indexada de 96 poços contém um tiposuficiente de adaptadores indexados para geração de 96 bibliotecas NGS individuais e paraidentificaçãodeamostrasajusante.
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Versãodokit Reagente REF# Rxns Vol/poço #PlacasH32 PlacaadaptadoraA(i1-96) N1 96 5µl 1H34 PlacaadaptadoraB(i97-192) N2 96 5µl 1
LivrodoExcelÉfornecidoumlivrodoExcelparaapoiodoprotocoloHolotypeHLA96/7comcálculos,esquemasdeplacas,manutençãoderegistos,geraçãodefichadeamostrasMiSeqemuitomais.Casonãopossuaumacópia,[email protected].
Software–OmixonHLATwinContacte [email protected] para obtenção de créditos Omixon HLA Twin associados à suacompradokitHolotypeHLA96/7.
Notaimportante:UtilizarostrêscomponentesdokitOmixonHolotypeHLA96/7eosoftwareOmixonHLATwinnomesmofluxodetrabalhoparaconstituirumfluxodetrabalhoparautilizaçãoemdiagnósticoinvitro.ConsulteasecçãodeAvisoseprecauçõesparalimitaçõesdeutilizaçãodoproduto.
Os componentes de substituição encontram-se disponíveis mediante pedido específico doutilizador. Tenha em atenção que a Omixon substitui caixas de componentes e não [email protected]ções.
ExpediçãoearmazenamentoEnviadoempacotesdegelo secona caixade transportedepoliestirenoextrudidoedeve serarmazenadoa-20°Capóschegaraodestino.Valideoseucontrolodetemperaturaeprocessodemonitorizaçãodosseuscongeladores,procedendoregularmenteàmanutençãonecessária.
Oskitsnãoabertosmantêm-seestáveisatéàdatadevalidadedokit(indicadanaetiquetadokit),searmazenadosa-20°C.
Apósaaberturadoproduto,recomenda-seummáximodequatro(4)ciclosdecongelamento/descongelamento,paragarantiraestabilidadedoproduto.Oskitsabertosmantêm-seestáveisaté3meses,quandoarmazenadosa-20°C.
AvisoseprecauçõesLimitaçõesdeutilizaçãodoprodutoPara obter o melhor desempenho, utilize o fluxo de trabalho do kit Holotype HLA 96/7e o software Omixon HLA Twin para a tipificação HLA por NGS com os materiais, reagenteseequipamentosrecomendadosnasecção«Equipamentosereagentes».
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A utilizaçãodemateriais diferentes dos especificados na secção «Equipamentos e reagentes»deveserconfirmadaevalidadapeloutilizador.
Nãoreconstituirnemdiluirosreagentesemvolumesdiferentesdosdescritosnestasinstruçõesdeutilização.Nãoutilizarumvolumedosreagentesinferioraoespecificadonestasinstruçõesdeutilização.Estasaçõespodemprovocarerrosdedesempenho.
A Omixon não pode fornecer suporte técnico para nenhuns problemas resultantes do nãocumprimentodospassosdoprotocolodescritosnestasinstruçõesdeutilização.
Nãoutilizaroprodutoemcasodedanosdetetáveisnoscomponentes(frascosquebrados,placa,tampassoltas,etc.).
LimitaçõesconhecidasdoprodutoConsultar o documento Product Known Limitations Guide (Guia de limitações conhecidas doproduto), relativamente a ambiguidades conhecidas e limitações de software conhecidas doprodutoHolotypeHLA.OGuiaédistribuídocomasinstruçõesdeutilização,mastambémpodeser encontrado no Web site da Omixon em MyHolotype/Support and Services/HLA TwinInstructionsforUse,[email protected].
InformaçõesdesegurançaAntesdecomeçar,leiaassecções«Informaçõesdesegurança»e«Notasimportantes»relativasatodososreagentesoukitsespecificadosnasecção«Equipamento,reagenteseconsumíveis».
Ao trabalhar com produtos químicos, usar sempre bata de laboratório adequada, luvasdescartáveiseóculosdeproteção.Paraobtermaisinformações,consulteasFichasdedadosdesegurança(FDS)adequadas,disponíveisnofornecedordoprodutorespetivo.
Podeencontrar-seumadescriçãogeraldoscomponentesquímicosdosreagentesdoprodutonasFDSdokitHolotypeHLA96/7,estandodisponíveismediantepedido.
Eliminaroscomponentesdoprodutocomolixomédicogeral.
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ParâmetrosdedesempenhoParâmetros de desempenho principais, determinados em conformidade com a validação doproduto.
HLA-A HLA-B HLA-DRB1 HLA-C HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1
Sensibilidade 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724%
Especificidade 99,966% 99,982% 99,956% 99,863% 99,946% 99,881% 99,775%
Precisão 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724%
Exatidão 99,935% 99,965% 99,915% 99,736% 99,897% 99,785% 99,572%
Reprodutibilidade 100,00% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28%
Repetibilidade 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00%
AssistênciatécnicaParaobterassistênciageralrelativaaesteprotocolo,[email protected]
Suporteportelefone:EstadosUnidos|+1(617)500-0790Europa|+36705748001Restodomundo|+1(617)500-0790
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Equipamento,reagenteseconsumíveisRecomendaçõestécnicasesobreoequipamento
§ Termocicladorcomformatode96poços§ Fluorómetrodeplacas (ouqualquer instrumentocapazdedeteçãode fluorescênciaem
formatodeplacade96poços,parautilizaçãocomosistemaQuantiFluordsADNdaPromega)§ PippinPrep(n.ºcat.PIP0001)ouBluePippin(n.ºcat.BLU0001)daSAGEScience§ InstrumentoqPCRcomformatodeplacade96ou384poços§ FluorómetroQubit(n.ºcat.Q33216,ThermoFisherScientific)(opcional)§ IlluminaMiSeq(n.ºcat.SY-410-1003)§ Computadorde64bits,nomínimo,4coreecom16GBdeRAM§ Armazenamentodedadosalongoprazo(aproximadamente2TBdedadosporMiSeqporano)
Recomendaçõesrelativasareagentesassociados§ KitsLongRangePCRdaQiagen(n.ºcat.206401,206402ou206403)
§ Cadaamostranecessitade3,2µldeTaqpolimerase§ N.ºcat.206401KitLongRangePCR(20)contém8µldeTaqpolimerase§ N.ºcat.206402KitLongRangePCR(100)contém40µldeTaqpolimerase§ N.ºcat.206403KitLongRangePCR(250)contém100µldeTaqpolimerase
§ ExoSAP-ITdaAffymetrix(n.ºcat.75001-200,75001-1ML,75001-4X-1MLou75001-10ML)§ Cadaamostracompostanecessitade4µldeenzimaExoSAP-IT§ N.ºcat.75001-200contém200µldeenzimaExoSAP-ITExpress§ N.ºcat.75001-1-MLcontém1mldeenzimaExoSAP-ITExpress§ N.ºcat.75001-4X-1MLcontém4mldeenzimaExoSAP-ITExpress§ N.ºcat.75001-10MLcontém10mldeenzimaExoSAP-ITExpress
§ Kitdequantificaçãodebiblioteca–Illumina/UniversaldaKAPABiosystems(n.ºcat.KK4824)§ KitdeexameQubitdsADNBR(n.ºcat.Q32850ouQ32853)(opcional)
§ N.ºcat.Q32850contém100exames§ N.ºcat.Q32853contém500exames
§ SistemaQuantiFluordsADNdaPromega(n.cat.E2670)§ GrânulosAgencourtAMPureXPdaBeckmanCoulter(n.ºcat.A63880,A63881ouA63882)
§ Cada execução do Holotype HLA necessita de ummáximo de 900 µl de grânulosAMpureXP
§ N.ºcat.A63880contém5mldegrânulosAMPureXP§ N.ºcat.A63881contém60mldegrânulosAMPureXP§ N.ºcat.A63882contém450mldegrânulosAMPureXP
§ Cassetedegel,1,5%deagarose,semcorantescompadrãointerno(marcadorK/R2),paraoPippinPrep/BluePippin(n.ºcat.CDF1510paraPippinPrepeBDF1510paraBluePippin)
§ Etanoldegraumolecular(álcoolanidro)§ Águadegraumolecular(semDNasenemRNase)§ Hidróxidodesódio§ 1×tampãoTE(pH8,0)§ KitdereagenteMiSeqdaIllumina
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CapacidadedokitdereagenteMiSeq
KitdereagenteIlluminaMiSeq
PeríododetempoHoras
Amostras96/7
Ciclo500Std(MS-102-2003)
~39 96
Ciclo300Std(MS-102-2002)
~24 96
Microciclo300(MS-103-1002)
~19 28
Nanociclo500(MS-103-1003)
~28 12
Nanociclo300(MS-103-1001)
~17 6
Consumíveisrecomendados§ Tubosdemicrocentrifugação1,5ml§ Tubosdemicrocentrifugação1,5mldebaixaligação§ Tubosdemicrocentrifugação2,0mldebaixaligação(recomendadoEppendorfDNALoBind
n.ºcat.022431048)§ Tubosdeparede finade0,5mlpara instrumentoQubit (recomendado tubosdeexame
Qubitn.ºcat.Q32856)§ Pipetasdevolumeajustável(capacidadede1,0–1000µl)§ Pipetasdevolumeajustávelde8canais(capacidadede1,0–100µl)§ Placasde96poçoscompatíveiscomotermociclador§ Placasóticasde96poçoscompatíveiscomofluorómetrodeplacas§ Placasde96poçoscompatíveiscomoinstrumentoqPCR§ Vedantesdeplacaparautilizaçãogeral§ Vedantes de placas compatíveis com os termocicladores (testados para PCR de longo
alcance)§ VedantesdeplacasóticascompatíveiscomoinstrumentoqPCR(opcional)§ Suportemagnéticocompatívelcomtubosdemicrocentrifugaçãode2ml§ Suporterefrigeradorde96poços(2peças)§ Tuboscónicosde50ml§ Reservatóriosde50ml
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AvisoLegalAs instruções de utilização do Holotype HLA 96/7 e todos os conteúdos são propriedade daOmixonBiocomputingLimited(“Omixon”),edestinam-seexclusivamenteàutilizaçãocontratualpelorespetivocliente,relativamenteao(s)produto(s)descrito(s)eparanenhumoutrofim.Estedocumento e o respetivo conteúdonãodevem ser utilizados nemdistribuídos para qualqueroutra finalidade e/ou comunicados, divulgados ou reproduzidos de qualquer forma, semconsentimentoprévioporescritodaOmixon.AOmixonnãoconcedenenhumalicençasobosseusdireitosdepatentes,marcascomerciais,direitosdeautoroudireitoscomuns,nemdireitossemelhantesdequaisquerterceirosatravésdestedocumento.
OOmixonHLATwin(“software”)élicenciadoparaoclientesobostermosecondiçõesdoEULAdoOmixonHLATwin(www.omixon.com/hla-twin-eula/).Casonãoconcordecomosrespetivostermosecondições,aOmixonnãolicenciaoSoftwareparasi,nãodevendooutilizadorusarneminstalaroSoftware.
As instruções incluídas neste documento devem ser rigorosa e explicitamente seguidas porpessoalqualificadoedevidamenteformado,afimdeassegurarautilizaçãocorretaesegurado(s)produto(s)aquidescrito(s).Antesdeutilizartaisprodutos,todooconteúdodestedocumentodeveserlidoecompreendidointegralmente.
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PARAUTILIZAÇÃOEMDIAGNÓSTICOINVITRO©2017OmixonBiocomputingLtd.Todososdireitosreservados.
UtilizaçãoprevistaO produto Holotype HLA 96/7 – Configuração A e CE e Configuração B e CE (designado por«HolotypeHLA»)éumacombinaçãodereagentesdeexamedediagnósticoinvitrocomsoftwaredeanálisededados(OmixonHLATwin™),concebidoparaaidentificaçãoedefiniçãodeantígenosleucocitárioshumanos(HLA)declasseIeII,destinando-seautilizaçãonatipificaçãoHLA,atravésdautilizaçãodaplataformadadosdesequenciaçãodenovageraçãoIllumina®MiSeq.OHolotypeHLA disponibiliza informação de histocompatibilidade humana de loci HLA Classe I (A, B e C)eClasseII(DPB1,DQA1,DQB1eDRB1),atravésdeADNgenómicohumano.
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OsoftwareOmixonHLATwin™incluídonoprodutoHolotypeHLAestáconcebidoparainterpretarefazercorresponderdadosdesequenciaçãogeradosnosistemaIllumina®MiSeq,resultandoemtipificaçãoHLAdeníveldealelodepassagemúnica,dealtaprecisão,comtaxadeambiguidademuitobaixanoníveldecampo2.
O produto Holotype HLA está concebido para utilização em diagnóstico in vitro por pessoalprofissional de cuidados de saúde como, por exemplo, laboratórios técnicos e médicos, quetenhamtidoformaçãoemtipificaçãoHLAemlaboratóriosdediagnósticocomacreditaçãoEFIouASHIoulaboratórioscomcompetênciaparatrabalharemconformidadecomasespecificaçõesEFIouASHI.
Notaimportanteantesdecomeçar
IsolamentodeADNgenómicorecomendadoOADNgenómicohumanodeveserpreparadoemkitsdepreparaçãodeADNcomercialmentedisponíveisebemtestados,paragarantiraconsistênciadapreparação.Independentementedaabordagem,énecessáriaadeterminaçãoexatadeconcentraçãoepurezaparaumdesempenhorobustodoexame.
OADNdeveestarisentodecontaminantesquepossamafetarpassosposterioresdeamplificação,preparação da biblioteca e sequenciação (por exemplo, álcool, sais, detergentes, formaldeídoeheparina).Osanguenãodevesercolhidoemtubosheparinizados,nãodevendoserutilizadasamostrasdesanguedepacientessubmetidosaterapiacomheparina,nemamostraslipémicasouhemolisadas.
OADNgenómicopreparadopodeserutilizadodeimediatosepreparadoemáguasemnuclease,ouarmazenadoduranteperíodoslongosa-20°Coumenos.RecomendamosautilizaçãodeáguaparapreparaçãodegADN,poisoEDTAnotampãoTEpodeinibirreaçõesdePCRdelongoalcance.Deveserevitadoodescongelamentorepetidodecongelados,parareduziradegradação.
Éaltamenterecomendadaumaconcentraçãode20-30ng/µldeADNparafornecer100-150ngdeentradadeADNgenómicoporamplificaçãoPCR.ÉextremamenterecomendávelutilizarummétododequantificaçãobaseadoemfluorescênciaparadeterminaraconcentraçãodegADN.
Arelaçãodeabsorvênciade260nm/280nme260nm/230nmvaloresde1,7–2éaltamenterecomendada.
ParaaamplificaçãodeHLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-DRB1,HLA-DPB1,HLA-DQA1eHLA-DQB1,sãonecessários0,8-1,2µgdegADN.
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PrincípiodométodoDurantemuitosanos,acomunidadeHLAtemtrabalhadoparaaobtençãodeummétodoqueidentificará com precisão o extenso polimorfismo dos genes HLA e dos respetivos produtosgénicos.OadventodoPCR,combinadocomoutrastecnologias(sequenciaçãoSanger,SSOP,SSP,Luminex),forneceuumafórmulaparamelhorarsignificativamenteadeteçãodepolimorfismosHLA,porémcomvárias limitaçõesquecontinuama inibirnossacapacidadedecaracterizarosgenes HLA, de forma abrangente. As tecnologias desenvolvidas ao longo dos últimos anos,cumulativamentedesignadaspordadosdesequenciaçãodenovageração(NGS,NextGenerationSequencing),proporcionaramnovasoportunidadesquepermitemacompletacaracterizaçãodosgenes HLA demaneira haplóide. ANGS possui duas características distintas: 1) sequenciaçãoclonal de fragmentos de ADN e 2) capacidade de produção tremendamente alta. A NGSproporciona a capacidade de fasear polimorfismos, eliminando assim todas as ambiguidades,efornecetipificaçãoHLAnoníveldecampodetrêsaquatro,semtestesreflexivos,introduzindoassimumasoluçãopotencialmentecompletaparaoproblemadetipificaçãoHLA.OprotocoloaquidescritotirapartidodestatecnologiaecombinaaamplificaçãoporPCRdelongoalcancedosgenesHLAcomasequenciaçãonaplataformaIlluminaMiSeq.Maisespecificamente,osgenesHLAA,B,C,DQA1eDQB1sãoamplificadosemtodooseucomprimentodecodificação,incluindoelementosdasregiões5´e3´nãoconvertidas,enquantoDRB1éamplificadodointrão1aointrão4eDPB1éamplificadoapartirdo intrão1paraaregião3´nãoconvertida.Osampliconssãoentãoprocessadosatravésdeumasériedepassosque:
1. Fragmentam os amplicons para um tamanho adequado para sequenciação na plataformaIllumina,
2. Fazem uso de extremidades planas e com adenilato na extremidades dos ampliconsfragmentados
3. Sequências adaptadoras de ligação que são utilizadas em todo o processo noMiSeq paracaptar,amplificaresequenciaroADN.Osadaptadorestambémincluemumíndicequeéumasequência curta, exclusiva para cada adaptador, que identifica as origens da biblioteca(amostra/lócus).
Depois de agrupar as bibliotecas indexadas, selecionar o tamanho e quantificação, a amostraécarregadanoMiSeqparasequenciação.Oprocessocompletodemora3a5dias,dependendoda seleção da célula de fluxo na plataforma Illumina. O resumo dos passos do protocoloéapresentadonafiguraabaixo:
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Resumodepassos
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Glossário/Definições§ Placaamplicon–nomealternativoparaplacadeamplificação§ Placadequantificaçãodeamplicon–placade96poçoscompatívelcomofluorómetrode
placas,noqualosampliconsdiluídossãoquantificados§ Placadeamplificação–placade96poçosPCRutilizadaparaamplificaroslociHLA§ Bibliotecafinal–bibliotecaqueincluitodasasbibliotecasdeamostrasprontasparaserem
sequenciadasnumaexecuçãoúnicadeMiSeq§ Placa de reação – placa onde são realizadas as reações sequenciais que fragmentam,
terminamareparaçãoeligamosadaptadoresindexadosàsbibliotecasdeamostras§ Placa de reagente – placa utilizada para alíquotas de vários reagentes, utilizados para
preparaçãodasbibliotecas§ Bibliotecadeamostras–umabibliotecapreparadaparacombinar(agrupar)todososloci
HLAparaumadeterminadaamostra§ Placadeampliconsagrupados–placaqueincluiumabibliotecadeamostras(todososloci
combinados)porpoço§ Placadequantificaçãodepadrões–placade96poçoscompatívelcomofluorómetrode
placas,noqualospadrõesdeADNsãocolocadosparapermitiraquantificaçãodeamplicon
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Passo1–PreparaçãodamisturaprincipaldeamplificaçãodeHLADuração:~1hora45minutosO objetivo deste passo é preparar asmisturas principais específicas de lócus para amplificarindividualmentecadalócusHLAdeterminado.OslociamplificadoporesteprotocolosãoHLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-DRB1,HLA-DPB1,HLA-DQA1eHLA-DQB1.
Nota:Asmisturasprincipaispreparadasnestepassoincluemtodososreagentesnecessáriosparaamplificação,excetoaTaqpolimerase.
ListadereagentesItem Armazenamento Fornecidopor
MisturadeiniciadorHLA-A -20°C OmixonMisturadeiniciadorHLA-B -20°C OmixonMisturadeiniciadorHLA-C -20°C OmixonMisturadeiniciadorHLA-DRB1 -20°C OmixonMisturadeiniciadorHLA-DPB1 -20°C OmixonMisturadeiniciadorHLA-DQA1 -20°C OmixonMisturadeiniciadorHLA-DQB1(Conjunto3) -20°C OmixonIntensificador1 -20°C OmixonIntensificador2 -20°C OmixonTampãoLongRangePCR(10×) -20°C QiagendNTPs(10mMcada) -20°C QiagenGraumolecularH2O -20°C Qiagen
Protocolo1.1 –Removertodasasmisturasdeiniciadores,Intensificador1e2,osdNTPeotampãoPCR
delongoalcance(10×)doarmazenamentoedescongelaràtemperaturaambiente.
1.2 – Preparar o intensificador combinado: adicionar 132µl de Intensificador 2 no tubodoIntensificador1.MudaronomedaetiquetadotubodoIntensificador1paraIntensificadorcombinado.
1.3 –Prepararumamisturaprincipalparacadamisturadeiniciador,deacordocomastabelasabaixo:
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Misturaprincipal:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1eDQA1
Reagente Volume/amostra/lócus Volume/96amostras/lócusMisturadeiniciador 2µl 204µlTampãoLongRangePCR(10×) 2,5µl 255µlMisturadNTP(10mMcada) 1,25µl 127,5µlGraumolecularH2O 13,85µl 1412,7µlVolumetotal 19,6µl 1999,2µl
Misturaprincipal:HLA-DQB1Conjunto3
Reagente Volume/amostra/lócus Volume/96amostras/lócusMisturadeiniciador 2µl 204µlTampãoLongRangePCR(10×) 2,5µl 255µlMisturadNTP(10mMcada) 1,25µl 127,5µlIntensificadorcombinado 5,6µl 571,2µlGraumolecularH2O 7,85µl 800,7µlVolumetotal 19,2µl 1958,4µl
1.1 – Agitar e centrifugar cada mistura principal durante 1 segundo. Colocar as misturasprincipaisemgelo.
1.2 –DiluirtodoogADNnumaconcentraçãode30ng/µl(ovolumemínimoé45µl).
Nota:OHolotypeHLAincluireagentessuficientespara96reaçõesmaisvolumeadicionalparaperdadepipetagemefalhanaamplificação.
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Passo2–AmplificaçãoHLAClassesIeIIDuração:~7horas50minutosOobjetivodopasso2éamplificaros lociHLA.AsamplificaçõesHLAclasse Ieclasse II foramotimizadas,utilizandodoisconjuntosseparadosdecondiçõesPCR.ApósasreaçõesPCRestaremconcluídas,aamplificaçãoéconfirmadaporeletroforeseemgeldeagarose(opcional).
Sugestão breve – A eletroforese em gel de agarose (passo 2.5), emborarecomendada,nãoénecessáriaparaconcluircomêxitooprotocoloHolotypeHLA.Quandoosampliconssãoquantificados(Passo3),qualquerconcentraçãoacimade50ng/µléconsideradaumaamplificaçãobem-sucedida.Aeletroforeseemgelde agaroseéumpassode controlodequalidade importante, nãodevendo serignoradasemexperiênciasuficientecomoprotocoloHolotypeHLAcompleto.
ListadereagentesItem Armazenamento Fornecidopor
MisturaprincipalHLA-A -20°C Passo1MisturaprincipalHLA-B -20°C Passo1MisturaprincipalHLA-C -20°C Passo1MisturaprincipalHLA-DRB1 -20°C Passo1MisturaprincipalHLA-DPB1 -20°C Passo1MisturaprincipalHLA-DQA1 -20°C Passo1MisturaprincipalHLA-DQB1(Conjunto3) -20°C Passo1Taqpolimerase -20°C QiagengADN 4°C UtilizadorGraumolecularH2O 20°C Utilizador
Protocolo2.1 –RemoveraTaqpolimerasedoarmazenamento,centrifugá-laeadicioná-laacadamistura
principal, de acordo com as tabelas abaixo, enxaguando as pontas das pipetasexaustivamentenapipetagem:
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MisturaprincipalcarregadadeTaqpolimerase:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1eDQA1
Reagente Volume/amostra/lócus Volume/96amostras/lócusMisturaprincipaldopasso1 19,6µl 1999,2µlTaqpolimerase 0,4µl 40,8µlTotal 20µl 2040µl
MisturaprincipalcarregadadeTaqpolimerase:HLA-DQB1Conjunto3Reagente Volume/amostra/lócus Volume/96amostras/lócus
Misturaprincipaldopasso1 19,2µl 1958,4µlTaqpolimerase 0,8µl 81,6µlTotal 20µl 2040µl
2.2 – Agitar e centrifugar brevemente todas as misturas principais carregadas com Taqpolimerase.Alíquotade20µldecadamisturaprincipalcarregadacomTaqpolimeraseempoçosseparadosdeplacasde96poçosPCR.
Nota: As amplificações de classe I e classe II foram otimizadas utilizando duascondiçõesPCRdiferentes,por issoasmisturasprincipais classe Ieclasse IInãodevemestarnamesmaplaca.
2.3 –Adicionar5µldecadagADNdiluídonopoçoadequadodasplacaspreparadasnopassoanterior.Misturarporpipetagem.Vedá-loscomvedaçãotérmicaeinspecionarvisualmentecadapoço.Centrifugartodasasplacasdeamplificaçãonumacentrifugadora.
2.4 – Colocar as placas de amplificação nos termocicladores e executar os programas paraamplificaçãoclasseIeclasseII,deacordocomastabelasabaixo:
AmplificaçãoclasseI(HLA-A,BeC)
Númerodeciclos Temperatura Períododetempo1 95°C 3minutos 95°C 15segundos
35 65°C 30segundos 68°C 5minutos1 68°C 10minutos1 4°C ∞
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AmplificaçãoclasseII(HLA-DRB1,DPB1,DQA1eDQB1)
Númerodeciclos Temperatura Períododetempo1 95°C 3minutos 93°C 15segundos
35 60°C 30segundos 68°C 9minutos1 68°C 10minutos1 4°C ∞
Nota:Oêxitodaamplificaçãopodeserverificadoatravésdaaplicaçãode2µldecada amplicon em gel de agarose a 2% padrão a 250 V, durante 30 minutos.(Opcional)
Tamanhosprevistosdeamplicon
LócusHLA Tamanhosprevistosdeamplicon(kb)HLA-A,BeC ~3HLA-DRB1 ~4,3HLA-DPB1 ~6,7HLA-DQA1 ~6
HLA-DQB(Conjunto3) ~6,6
Pontodeparagemsegura.Osampliconspodemserarmazenadosa4°Cdeumdiaparaooutrooua-20°Cduranteperíodosmaiores.
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Passo 3 – Quantificação e normalização de amplicon(utilizandoumfluorómetrodeplacas)Duração:~1hora50minutosAquantificaçãoeanormalizaçãodeampliconsãorecomendadasparagarantirumaentradaexatanopassodepreparaçãodabiblioteca(opcional).AconcentraçãodeampliconémedidaatravésdosistemaQuantiFluordsADN,queincluiumcorantefluorescentedeligaçãoaoADNepadrãoADNparaquantificaçãosensíveldepequenasporçõesdeADNdecadeiadupla(dsADN).ConsultaroAnexo2paraobter instruçõessobrecomofazeraquantificaçãodeampliconutilizandoumamáquinaqPCR.
Sugestão breve – A quantificação de amplicon, embora recomendada, nãoénecessáriaparaconcluircomêxitooprotocoloHolotypeHLA.Anormalizaçãodeamplicon não necessita de medição exata da concentração de amplicon. Emalternativa,podeserutilizadaumaestimativadaconcentraçãodeamplicon,combase na experiência ou na eletroforese em gel de agarose. A quantificação deamplicon não deve ser ignorada sem experiência suficiente com o protocoloHolotypeHLAcompleto.
ListadereagentesItem Armazenamento Fornecidopor
PlacadeamplificaçãoclasseI 4°C Passo2PlacadeamplificaçãoclasseII 4°C Passo2PadrãoLambdaADN(100ng/µl) 4°C PromegaCoranteQuantiFluordsADN(200×) 4°C Promega20×tampãoTE(pH7,5) 4°C PromegaGraumolecularH2O 20°Ca25°C UtilizadorExoSAP-iTExpress -20°C Affymetrix
Protocolo3.1 – Preparar padrões ADN por diluição em série do padrão Lambda ADN (100 ng/µl),
fornecidonokitQuantiFluor,deacordocomatabeladediluiçãoabaixo:
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Etiquetanotubo EntradadeADN VolumeADN(µl) Volume1xTE(µl) Conc.Final(ng/µl)Padrão1 LambdaADN 7,5µl 492,5µl 1,5ng/µlPadrão2 Padrão1 250µl 250µl 0,75ng/µlPadrão3 Padrão2 250µl 250µl 0,38ng/µlPadrão4 Padrão3 250µl 250µl 0,19ng/µlPadrão5 Padrão4 250µl 250µl 0,09ng/µlPadrão6 Padrão5 250µl 250µl 0,05ng/µlVazio Vazio 0µl 250µl 0ng/µl
3.2 – Preparar as placas de quantificação de amplicon (consultar valores complementares).Alíquotade99µl1xtampãoTEnospoçosdeumaplacaóticade96poçosparaonúmerototaldeampliconsaseremquantificados.
3.3 –Adicionar1µldeampliconsdospoçoscorrespondentesnasplacasdeampliconparaospoçosindividuaisnasplacasdequantificaçãodeamplicon.Misturarporpipetagem.
3.4 –Preparar1×soluçãodetrabalhodecoranteQuantiFluor,utilizandoaseguintefórmula:0,5µlcoranteQuantiFluor(200X)+99,5µl1×tampãoTE.Preparar1×soluçãodetrabalhodecoranteQuantiFluorsuficiente,deformaaquecadaamostra(dototaldeamostrasnasplacasdeamplicon)epadrão(14nototal)recebamumaalíquotade100µl.
3.5 –Prepararumaplacadequantificaçãodepadrõeseplacasdequantificaçãodeamplicon.Alíquotade100µlde1×soluçãodetrabalhodecoranteQuantiFluorparapoçosdaplacaótica de 96 poços, que será a placa de quantificação de padrões, e para as placas dequantificaçãodeamplicondopasso3.2.
3.6 –Utilizandoospadrõespreparadosacima,adicionar100µldecadapadrão,emduplicado,nospoçosindividuaisnaplacadequantificaçãodepadrões(14poçosnototal).Misturarporpipetagem.
3.7 –Agitarbemparamisturarecentrifugar.
3.8 –Executaraplacadequantificaçãodepadrõesnofluorómetrodeplacase,emseguida,asplacasdequantificaçãodeamplicon.
3.9 –CalcularaconcentraçãodeADNnasplacasdequantificaçãodeamplicon,utilizandoosdadosRFUgeradospelofluorómetrodeplacas.Paraobterajudaparaoscálculos,consultaratabeladediluiçãonolivrofornecido.
3.10 –DiluiroADNnasplacasdeampliconcomgraumolecularH2O,paraqueaconcentraçãofinaldeADNsejaaproximadamentede67ng/µl.
§ SeaconcentraçãodeADNforigualousuperiora150ng/µl:adicionar25µldeH2O§ SeaconcentraçãodeADNsesituarentre100-150ng/µl:adicionar10µldeH2O§ SeaconcentraçãodeADNforinferiora100ng/µl:nãoadicionarH2O
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Agrupamentodeamplicon3.11 – Agrupar todos os loci de cada amostra numa única placa de amplicons agrupados.
Combinarosvolumesindicadosparacadalócus,conformeindicadonatabelaaseguir,paraobterumvolumefinalde35µl:
LócusHLA VolumeagrupadoA 5µlB 5µlC 5µl
DRB1 5µlDPB1 5µlDQA1 5µl
DQB1Conjunto3 5µl
3.12 –Adicionar4µldeExoSAP-iTExpressemcadabibliotecadeamostra.Enxaguaraspontesdaspipetas,parapipetagem.Vedaraplacacomvedantetérmicoecentrifugar.
3.13 – Colocar a placa de amplicons agrupados num termociclador e executar o seguinteprograma:
PurificaçãoPCRdeExoSAP-iTExpress
Númerodeciclos Temperatura Períododetempo1 37°C 4minutos1 80°C 1minuto1 4°C ∞
Pontodeparagemsegura.Osampliconspodemserarmazenadosa4°Cdeumdiaparaooutrooua-20°Cduranteperíodosmaiores.
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Passo4–PreparaçãodabibliotecaDuração:~3horasDurante este passo, os amplicons agrupados são preparados para sequenciação no IlluminaMiSeq. Os amplicons são fragmentados enzimaticamente, as extremidades são reparadaseadeniladaseosadaptadoresindexadossãoligadosàsextremidades.Asbibliotecassãoentãoagrupadas,seguindo-seumúnicopassodelimpezaeconcentração,realizadoutilizandogrânulosAMPureXP.
Nota:AOmixonrecomendavolumessuperioresaonecessáriopara96amostras,porquemuitasdasenzimasetampõessãoviscosos,resultandoemperdaexcessivaporpipetagem.
ListadereagentesItem Armazenamento Fornecidopor
Placadeampliconsagrupados 4°C Passo3Enzimadefragmentação(A) -20°C OmixonTampãodefragmentação(B) -20°C OmixonEnzimadereparaçãodeextremidade(C) -20°C OmixonTampãodereparaçãodeextremidade(D) -20°C OmixonEnzimadeligação(E) -20°C OmixonTampãodeligação(F) -20°C OmixonPlacaadaptadora -20°C OmixonGrânulosAMPureXP 4°C BeckmanCoulter80%etanol(preparadonomomento) 20°Ca25°C UtilizadorGraumolecularH2O 20°Ca25°C Utilizador
Protocolo4.1 –Ligarotermociclador.Verificarseatampaaquecidaestáaaquecer.
Nota:Antesdautilização,certifique-sedequeagitaexaustivamenteaenzimadefragmentação(A).
4.2 –Prepararamisturaprincipaldefragmentaçãodeacordocomatabelaabaixo:
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Misturaprincipaldefragmentação
Reagente Volumeporbiblioteca(µl)
Volumesrecomendadospara96bibliotecas(µl) Códigodecor
Enzimadefragmentação(A) 2µl 220,8µl AmareloTampãodefragmentação(B) 2µl 220,8µl VermelhoVolumetotal 4µl 441,6µl
4.3 –Prepararumaplacadereagente:colocarumanovaplacaPCRde96poçosnumsuportede refrigeração PCR, bem como alíquota e quantidade igual da mistura principal defragmentaçãoemcadapoçodeumaúnicacoluna.
Nota:AreaçãodefragmentaçãofoiconcebidaparafornecerADNdetamanhoidealpara sequenciação no IlluminaMiSeq. É importantemanter os reagentes frios atécomeçarareaçãonotermociclador,paraevitarfragmentaçãoexcessiva.Recomenda-se a utilização de pipetas multicanais, para minimizar as probabilidades defragmentaçãoexcessiva.
4.4 –Centrifugaraplacadeampliconsagrupadosdurante10segundosecolocá-laemgeloounumblocofrio.
4.5 –Prepararumaplacadereação:colocarumaplacade96poçosPCRnumblocofrioPCR.
4.6 –Adicionar4µldemisturaprincipaldefragmentaçãodaplacadereagentenospoçosdaplaca de reação, correspondentes às amostras na placa de amplicons agrupados.Recomenda-seautilizaçãodepipetasmulticanais.
4.7 – Transferir 16 µl de cada amplicon da placa de amplicons agrupados para o poçocorrespondente na placa de reação, utilizando uma pipeta multicanal. Misturar porpipetagem.
4.8 –Cobriraplacadereaçãocomovedantetérmicoecentrifugardurante10segundos.
4.9 –Deixarincubaraplacadereaçãonumtermocicladorcomoseguinteprograma:
Programadefragmentação
Númerodeciclos Temperatura Períododetempo1 37°C 10minutos1 70°C 15minutos1 4°C ∞
Pontodeparagemsegura.Asbibliotecapodemserarmazenadasa4°Cdeumdiaparaooutrooua-20°Cduranteperíodosmaiores.
4.10 –Prepararamisturaprincipaldereparaçãofinaldeacordocomatabelaabaixo:
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Misturaprincipaldereparaçãofinal
Reagente Volumeporbiblioteca(µl)
Volumesrecomendadospara96bibliotecas(µl)
Códigodecor
GraumolecularH2O 1,25µl 139,2µl Enzimadereparaçãodeextremidade(C) 1,25µl 139,2µl VerdeTampãodereparaçãodeextremidade(D) 2,5µl 278,4µl CordelaranjaVolumetotal 5µl µl
4.11 –Colocar alíquotanumaquantidade igualdemisturaprincipalde reparação finalnumacolunaúnicanãoutilizadadaplacadereagente.
4.12 – Centrifugar a placa de reação (que contém as amostras fragmentadas) durante10segundos.–Adicionar5µldemisturaprincipaldereparaçãofinadaplacadereagenteem cada poço da placa de reação. Recomenda-se a utilização de pipetas multicanais.Misturarporpipetagem.
4.13 –Cobriraplacadereaçãocomovedantetérmicoecentrifugardurante10segundos.
4.14 –Deixarincubaraplacadereaçãonumtermocicladorcomoseguinteprograma:
Programadereparaçãofinal
Númerodeciclos Temperatura Períododetempo1 20°C 30minutos1 70°C 5minutos1 4°C ∞
Pontodeparagemsegura.Asbibliotecapodemserarmazenadasa4°Cdeumdiaparaooutrooua-20°Cduranteperíodosmaiores.
4.15 – Remover a placa de adaptadores indexados do armazenamento e descongelaràtemperaturaambiente,apósoiníciodoprogramadereparaçãofinalnotermociclador.Quando a placa adaptadora estiver à temperatura ambiente, centrifugá-la durante3minutosa3000rpm.
4.16 –Puxarcomcuidadoavedaçãodaplacaadaptadora.Nãoagitaraplacaadaptadoradepoisdeavedaçãotersidoremovida,paraevitarcontaminaçãocruzada.
4.17 – Transferir todo o volume de cada poço da placa de reação (25 µl) para o poçocorrespondentenaplacaadaptadora.
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Nota:CasoNÃOsejautilizadaatotalidadedaplacaadaptadora,épossívelutilizarapenasonúmeronecessáriodeadaptadores.Cortaravedaçãodaplacaentreospoços a serem utilizados e os poços a serem mantidos. Puxar com cuidadoavedaçãodaplacaadaptadora,mantendoavedaçãosobreospoçosaconservar.
a. Transferir25μldecadaamostradeextremidadereparadadaplacadereaçãoparaumpoçonaplacaadaptadora,misturandobemcomumapipeta.
b. Transferiratotalidadedecadaamostradaplacaadaptadoraparaopoçooriginaldaplacadereação.
c. Voltaravedaraplacaadaptadoraevoltaracolocá-laa-20°C.Utilizaraplacadereação em vez da placa adaptadora para os passos restantes indicados nomanual.
4.18 –Prepararamisturaprincipaldeligação.Prepararmisturaprincipaldeligaçãosuficienteparacadaamostra.
Misturaprincipaldeligação
Reagente Volume(µl) Volumesrecomendadospara96bibliotecas(µl) Códigodecor
Enzimadeligação(E) 2,5µl 252,5µl AzulTampãodeligação(F) 30µl 3030µl PretoVolumetotal 32,5 3282,5µl
4.19 –Colocaralíquotadamisturaprincipaldeligaçãoem3colunasnãoutilizadasdaplacadereagente.Recomenda-seautilizaçãodepipetasmulticanais.
4.20 – Adicionar 32,5 µl de mistura principal de ligação em cada poço da placa de reação.Recomenda-seautilizaçãodepipetasmulticanais.Misturarporpipetagem.
4.21 –Cobriraplacadereaçãocomovedantetérmicoecentrifugardurante10segundos.
4.22 –Incubaraplacadereaçãonotermocicladorcomoseguinteprograma:
Programadeligação
Númerodeciclos Temperatura Períododetempo1 25°C 10minutos1 70°C 10minutos1 4°C ∞
Pontodeparagemsegura.Asbibliotecapodemserarmazenadasa4°Cdeumdiaparaooutrooua-20°Cduranteperíodosmaiores.
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Purificaçãodebibliotecaeagrupamento4.23 –PermitirqueosgrânulosAMPureXPatinjamatemperaturaambiente.Garantirquesão
homogéneos(semgrumosnempéletes).Prepararnomomento,com5mlde80%deetanol(4mlEtOH+1mlH2O).
4.24 – Criar a biblioteca, combinando uma alíquota de cada amplicon agrupado, agora umabibliotecaespecíficadeamostra,numtubodemicrocentrifugaçãoúnicode2,0mldebaixaligação.
I. Para 16 oumais amostras – calcular a quantidade de cada biblioteca de amostraaagrupar conjuntamentecomoumabibliotecaúnicacomvolume totalde900µl.Dividir900µlpelonúmerodebibliotecasdeamostra.Esteéovolumedealíquotaaextrairdecadabibliotecadeamostraeapipetarnabiblioteca.
II. Paramenosde16amostras–Transferir60µldecadabibliotecadeamostraparaumabiblioteca.
4.25 –Adicionar900µldegrânulosAMPureXPaotubodabiblioteca.Misturarexaustivamenteporagitaçãoecentrifugarbrevemente.Nãopermitirqueosgrânulosseseparem.Incubarabibliotecadurante10minutos,àtemperaturaambiente.
Nota:Casohajamenosde900µldebibliotecanoagrupamentofinal,adicionarumaquantidadeequivalentedegrânulosAMPureXP.Deveexistirumaproporção1:1deagrupamentofinaledegrânulosAMPureXP.
4.26 –Colocarotubodabibliotecanumsuportemagnéticoeincubardurante10minutos.
4.27 – Mantendo o tubo no suporte magnético, remover cuidadosamente e eliminarosobrenadantedotubodabiblioteca,semtocarnosgrânulos.
4.28 –Mantendootubonosuportemagnético,adicionar~1,5–2mlde80%deetanol,preparadonomomento,aotubodabiblioteca.Ovolumedeetanoladicionadodevesersuficienteparacobrirosgrânulos.
Nota:Aplicaroetanolnoladodotubosemgrânulos.
4.29 –Incubarotubodabibliotecaatemperaturaambientedurante30segundos;emseguida,removercuidadosamenteeeliminarosobrenadante.
4.30 –Repetirospassos4.28e4.29.
4.31 – Centrifugar brevemente o tubo de biblioteca e colocá-lo novamente no suportemagnético,comatampaaberta.Removeroetanolresidualcomumapipeta.Nãotocarnosgrânulos.
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Nota:Devecertificar-sedequeapéletedegrânulosnãocontémetanolresidual.Istopodeexigirarotaçãodotubonosuportemagnético,pararemoveroetanolsemperturbarapéletedegrânulos.
4.32 –Permitequeosgrânulossequemaoardurante5-8minutosnosuportemagnéticoatéqueapéletedegrânulosfiqueseca.
4.33 –Removerotubodebibliotecadosuportemagnéticoeeluirabibliotecacom31µldeáguadegraumolecular.Nãopermitirqueapipetatoquenosgrânulos,poisficarãoagarradosnela.
4.34 –Agitarabibliotecaparaqueosgrânulosfiquemdenovocompletamenteemsuspensão.Centrifugarbrevemente,casofiquemalgunspingosnasparedeslaterais.Garantirqueosgrânulospermanecememsuspensão.
4.35 –Incubarabibliotecaàtemperaturaambientedurante2minutos.
4.36 –Colocarabibliotecanosuportemagnéticodurante2minutos.
4.37 –Colherabiblioteca:mantendootubodabibliotecafinalnosuportemagnético,recolher31µldosobrenadantenumnovotubodemicrocentrifugaçãodebaixaligaçãode1,5ml.
Pontodeparagem segura.Asbibliotecaspodem ser armazenadas a -20 °Cduranteperíodosprolongados.
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Passo5–SeleçãodotamanhodabibliotecaDuração:~1horaOpasso5adotaabibliotecadopasso4e realizaaseleçãodo tamanho,utilizandoométodoPippin Prep. O Pippin Prep pode selecionar automaticamente um intervalo de tamanhos defragmentosdeADN,eluindo-osnumacâmaradecolheita.Nota:PodeserutilizadooBluePippin,emalternativaaoPippinPrep.ConsultaroAnexo1paraobterinstruçõesdeutilizaçãodoPippinPrep.
ListadereagentesItem Armazenamento Fornecidopor
Cassetede1,5%degeldeagarose,semcorante 20°Ca25°C SageScienceSoluçãocarregadadePippin/misturademarcador(cometiquetaK)
4°C SageScience
Bibliotecaagrupada 4°C Passo4
Nota:OmarcadorKéutilizadocomoPippinPrep.OBluePippinutilizaomarcadorR2.
Protocolo5.1 –ColocarasoluçãocarregadadomarcadorKàtemperaturaambiente.
5.2 –Combinar31µldoagrupamentocom10µldesoluçãocarregadadomarcadorK.
5.3 –Misturarporagitaçãoecentrifugação.
5.4 –ConfiguraroPippinPreppararecolherfragmentosdeADNentre650e1300bps.Carregara amostra de 40 µl na porta de amostra e executar. O tempo de execução é de45-50minutos.
5.5 –Recolhertodooconteúdo(aproximadamente40µl)daportadeeluiçãodoPippinPrepetransferi-loparaumnovotubodemicrocentrifugaçãodebaixa ligaçãode1,5ml.Estaéabibliotecaselecionadaportamanho.
Pontodeparagem segura.Asbibliotecaspodem ser armazenadas a -20 °Cduranteperíodosprolongados.
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Passo 6 – Quantificação de biblioteca através de uminstrumentoqPCRDuração:~1hora15minutosÉnecessárioquantificarabibliotecaselecionadaportamanhoparautilizarotimamenteasaídadosequenciadorIlluminaMiSeq.AconcentraçãodabibliotecaselecionadaportamanhopodesermedidacomexatidãopeloqPCR.Como opção, pode utilizar o kit Qubit dsADN BR e uma máquina Qubit para a medição daconcentraçãodabiblioteca.ConsultaroAnexo3,relativamenteaesteprotocolo.
ListadereagentesItem Armazenamento Fornecidopor
10×pré-misturadeiniciadorIllumina -20°C KAPABiosystems2×misturaprincipalKAPASYBRFASTqPCR -20°C KAPABiosystemsStd1(20,00pM) -20°C KAPABiosystemsStd2(2,00pM) -20°C KAPABiosystemsStd3(0,20pM) -20°C KAPABiosystemsStd4(0,02pM) -20°C KAPABiosystemsPadrõesADNIllumina -20°C KAPABiosystemsGraumolecularH2O 20°Ca25°C Utilizador1×tampãoTE(pH8,0) 20°Ca25°C UtilizadorBibliotecaselecionadaportamanho 4°C Passo5
Protocolo1 –PrepararamisturadeiniciadorqPCRutilizando10xpré-misturadeiniciadorIlluminae2×
misturaprincipalKAPASYBRFASTqPCR:
Nota: Os reagentes do kit KAPA SYBR FAST qPCR (mistura principal qPCR, pré-misturadeiniciadoresoluçõesROX)sãocombinadosduranteaprimeirautilizaçãodokit.Estasoluçãocombinadamantém-seestáveldurante,pelomenos,30ciclosde congelamento/descongelamento. Seguir a documentação KAPA paradeterminarseoROXérecomendadoparaorespetivoinstrumentoqPCR.
MisturadeiniciadorqPCR
Reagente Volume(ml)10×pré-misturadeiniciadorIllumina 1ml2×misturaprincipalKAPASYBRFASTqPCR 5mlVolumetotal 6ml
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2 –PrepararamisturaprincipalqPCR.
MisturaprincipalqPCR
Reagente Volume(µl)MisturadeiniciadorqPCR 228µlGraumolecularH2O 76µlVolumetotal 304µl
3 –Prepararumadiluiçãoemsériedabibliotecaselecionadapelotamanho.
a. Preparar uma diluição 1:1000, adicionando 1 µl da biblioteca selecionada pelotamanhoa999µlde1×tampãoTE(pH8,0),enxaguandoexaustivamenteapontadapipeta.Agitarecentrifugar.
b. Preparar uma diluição 1:2000, adicionando 100 µl da diluição 1:1000 a 100 µl 1×tampãoTE(pH8,0).Agitarecentrifugar.
4 – Preparar uma placa de quantificação qPCR numa placa PCR nova, compatível comorespetivosistemaqPCR.
5 – Colocar alíquota de 16 µl damistura principal qPCR em triplicado para padrões 1-4,adiluição1:1000eadiluição1:2000(consultarvalorescomplementares).
6 –Colocaralíquotade4µldepadrões1-4,adiluição1:1000eadiluição1:2000nospoçoscorrespondentes.
7 –VedaraplacadequantificaçãoqPCRecentrifugá-ladurante10segundos.
Nota: Evitar a criação de bolhas nos poços da placa de quantificação qPCR.Centrifugarconformenecessárioparaeliminarasbolhas.
8 –Definirostriplicados1:1000e1:2000comoamostras-alvoedefiniropadrões(pontos:4,concentraçãoinicial:20pM,diluição:1:10).ExecutaroseguinteprogramanamáquinaqPCRparadeterminaraconcentraçãodeADNdabibliotecaselecionadaportamanho:
Númerodeciclos Temperatura Períododetempo1 95°C 5minutos25
(semcurvadefusão)95°C 30segundos60°C 90segundos(aquisiçãodedados)
9 –ParaconverteroresultadodeqPCRdeconcentraçãopMparanM,introduzirosresultadosde «Quantidademédia» das duas réplicas de biblioteca no separador do livro Omixondesignadopor«LibraryQuantitation»(Quantificaçãodebiblioteca).
10 –Utilizandoosvolumesdolivro,diluir10µldabibliotecaselecionadaportamanhoparaumaconcentraçãode2nMcomH2Oesterilizada,numnovotubodemicrocentrifugaçãodebaixaligaçãode1,5ml.Armazenaraparterestantedabibliotecaselecionadaportamanhoa-20°C.
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Pontodeparagem segura.Asbibliotecaspodem ser armazenadas a -20 °Cduranteperíodosprolongados.Nocasodearmazenamentodelongaduração,éextremamenterecomendávelumanovaquantificaçãodabibliotecaantesdeaprocessarnoMiSeq.
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Passo7–SequenciaçãonoIlluminaMiSeqDuração:~24–40horasO Illumina MiSeq é um instrumento NGS automatizado, que pode sequenciar a bibliotecaselecionada por tamanho preparada nos passos anteriores. A desmultiplexação das amostrasindexadaséefetuadaautomaticamenteapósaconclusãodaexecuçãodesequenciação.
Sugestão breve – Pode utilizar um pico PhiX de 1% como controlo adicional paramonitorizarareaçãodesequenciação.ConsultaradocumentaçãoIlluminaparaobterinformaçõesadicionaissobreocontroloPhiX.
ListadereagentesItem Armazenamento Fornecidopor
Cartuchodereagente -20°C IlluminaHT1 -20°C IlluminaPR2 4°C IlluminaCéluladefluxoMiSeq 4°C IlluminaBibliotecaa2nM 4°C Passo6NaOH1Nou2N 20°Ca25°C UtilizadorGraumolecularH2O 20°Ca25°C Utilizador
CapacidadedokitdereagenteMiSeq
KitdereagenteIlluminaMiSeq
PeríododetempoHoras
Amostras96/7
Ciclo500Std(MS-102-2003)
~39 96
Ciclo300Std(MS-102-2002)
~24 96
Microciclo300(MS-103-1002)
~19 28
Nanociclo500(MS-103-1003)
~28 12
Nanociclo300(MS-103-1001)
~17 6
Protocolo7.1 –PrepararoMiSeqemconformidadecomosprotocolosIlluminapadrão.
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7.2 –Prepararumabibliotecadesnaturada1nM:Combinar10μlde0,2NdeNaOHrecém-preparadoe10µldadiluiçãode2nMdabibliotecaselecionadaportamanhonumnovotubodemicrocentrifugaçãodebaixaligaçãode1,5ml.Agitarecentrifugar.Incubarestabibliotecadesnaturadade1nMàtemperaturaambiente,durante5minutos.
7.3 –Prepararumabibliotecadesnaturadade20pM:Adicionar980µldeHT1refrigeradoaos20µldabibliotecadesnaturadade1nM.Agitarecentrifugar.
7.4 – Preparar uma biblioteca desnaturada de 9 pM: Adicionar 550 µl de HT1 refrigeradoe450µldabibliotecadesnaturadade20nMnumnovotubodemicrocentrifugaçãodebaixaligaçãode1,5ml.Agitarecentrifugar.
7.5 – Transferir 600µl dabibliotecadesnaturadade9pMparao reservatóriode amostrascarregadasdocartuchodereagenteMiSeq.
Sugestãobreve–ÉaconselhávelutilizarolivrofornecidoparacriarafichadeamostrasqueénecessáriaparaoMiseq.
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Passo8–AnálisededadosdesequenciaçãoHLAOIlluminaMiSeqprocessaabibliotecaagrupadade9pM,gerandodadosdesequenciaçãocomoficheirosfastq.ConsultaromanualdoHLATwinparaobterauxílioparaainstalaçãocorretadoHLATwin,bemcomoparaobterinformaçõessobreainterpretaçãodaanálisedegenotipificaçãodos respetivos dados de sequenciação. Para implementar o protocolo automatizadoe relativamente a questões sobre a instalação ou à análise de dados, [email protected].
Protocoloautomatizado
InstalaçãoeconfiguraçãodeTI1. InstalaroHLATwinServernoservidor.
§ InstalaroHLATwinClientnumcomputadorcliente–podemserligadosváriosHLATwinClientsaoservidor.
§ Paraobterinstruçõesdeinstalaçãopersonalizadasparaautomatização,contactarosuportetécnicodaOmixon([email protected]).
Protocoloporanálise1. IniciaroHLATwinClienteiniciarsessão.
2. Osdadosjáestãoprocessadosouestãoaserprocessados.Reverosresultados,utilizandoosistemadesemáforonoHLATwin.
3. Exportar os resultados de genotipificação e/ou as sequências de consenso, conformenecessário.
Protocolodeservidormanual
InstalaçãoeconfiguraçãodeTI§ InstalaroHLATwinServernoservidor.§ InstalaroHLATwinClientnumcomputadorcliente.
Protocoloporanálise§ IniciaroHLATwinClienteiniciarsessão.§ SelecionarosdadosMiSeqemformatofastqoufastq.gzeiniciaraexecuçãodetipificação
HolotypeHLA.§ ApósterconcluídoatipificaçãoHolotypeHLA,reverosresultados,utilizandoosistemade
semáforonoHLATwin.§ Exportar os resultados de genotipificação e/ou as sequências de consenso, conforme
necessário.
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Protocolodeambientedetrabalhomanual
InstalaçãoeconfiguraçãodeTI§ InstalaroambientedetrabalhoHLATwin.
Protocoloporanálise6 IniciaroHLATwineiniciarsessão.
7 SelecionarosdadosMiSeqemformatofastqoufastq.gzeiniciaraexecuçãodetipificaçãoHolotypeHLA.
8 ApósterconcluídoatipificaçãoHolotypeHLA,reverosresultados,utilizandoosistemadesemáforonoHLATwin.
9 Exportar os resultados de genotipificação e/ou as sequências de consenso, conformenecessário.
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Valorescomplementares
Exemplodeplacaparaplacadeamplicon,placadeamplificação,placade diluição, placa de quantificação de amplicon (para um lócusindividual)eplacadereação
Exemplodeplacadequantificaçãodepadrões
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ExemplodeplacaqPCRdequantificaçãodebibliotecaKAPA
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Anexo1:PippinPrep
ProgramaroPippinPrep1. ClicarnoseparadorEditordeprotocoloseclicarnobotão«New»(Novo).
2. Clicar no íconedapasta juntodo campoCassete e selecionar «1.5%DFMarker K»paraoPippinPrepou«1.5%DFMarkerR2»paraoBluePippin.
3. Nafaixaqueestáaprogramar:
a. Realçarocampo«Range»(Intervalo).b. Definira«RefLane»(Faixadereferência)paracorresponderaonúmerodefaixaem
queestiveratrabalhar.c. Definirocampo«Start*»(Iniciar)para650.d. Definirocampo«End*»(Terminar)para1300.
4. NocampoFaixadereferência,selecionarafaixaemqueestáatrabalhar.
5. Clicarnobotão«SaveAs»(Guardarcomo)eatribuirumnomeaoprograma.
ExecutaroPippinPrep1. AtivaroPippinPrep,premindoobotãodeligar/desligarnaparteposteriordodispositivo.
2. InspecionarvisualmenteoPippinPrep.Devecertificar-sedequeos5LEDseencontramligadosedequeointeriordodispositivoestálimpoeseco.
3. ClicarnologótipoSageScience,naparteinferiordireitadoecrã.Istopermitiraoutilizadorintroduzirumapalavra-passe.Apalavra-passepredefinidadefábricaé«pips».
4. ClicarnoseparadorConfiguraçãodefábricaecertificar-sedequeovalorbase-para-limiteestádefinidopara0,02.
5. ColocaroacessóriodecalibragemnointeriordoPippinPrep,certificando-sedequeafaixaescuraestávoltadaparabaixoesobreasluzesLED.
6. NoseparadorPrincipal,clicarnobotão«Calibration»(Calibragem).
7. NajanelaCalibragem,devecertificar-sedequeocampo«TargetIpHmA»estádefinidopara0,80(0,60paraBluePippin)e,emseguida,premirobotão«Calibrate»(Calibrar).
8. AcederaoseparadorProtocolos.Clicarnobotão«Load»(Carregar)eselecionaroprogramaparaHolotypeHLAeafaixaespecíficaquevaiutilizar.Certifique-sedeque:
a. Estáligadaafaixacorretab. Oindicadordeseleçãodeespetroamploestáativadoc. Afaixadereferênciaéamesmafaixaquevaiserexecutada.
9. AcederaoseparadorPrincipal.Certifique-sedeque:
a. Oprogramaquecarregouéoqueestáselecionado.
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b. Estáselecionadaafaixadereferênciaadequadaequesetratatambémdafaixaemqueaamostravaiserexecutada.
10. Inspecionaracassete.Antesderetirarafitadevedaçãodospoços,verificarsehábolhaspor trás da porta de eluição. Se houver bolhas por trás da porta de eluição, batersuavementeefazerdeslizaracassetenamãoparadesfazerasbolhas.
11. Colocaracassete,comafitaaindacolocadasobreospoços,dentrodoPippinPrep.
12. Retirarcuidadosamenteafita,certificando-sederemoverafitaapartirdoladolimpodacassete(faixa5)paraoladousadodacassete(faixa1).Tercuidadoparanãofazersalpicarlíquidoquandoafitaforremovida,paraevitarcontaminação.
13. Removertodoovolumedotampãodaportadeeluição,dafaixaquevaiutilizar,eadicionar40µldetampãodeeletroforeserecém-preparadonessaportadeeluição.
14. Adicionarumatirafinadefitanasportasdeeluição.
15. Osreservatórioscommenosde3/4deenchimentodevemserreabastecidoscomtampãodeeletroforese.Nãoencherospoçosexcessivamente!Abordadotampãodevealcançaroapenas plástico, não ultrapassando, para evitar arrastamento quando a tampa deslizar.Aplicarotampãoapartirdospoçoslimpos(faixa5)paraospoçososusados(faixa1).
16. Certificar-sedequecadaumdospoçosdecarregamento(poçoscomagarose)estejacheiocom tampão de eletroforese. O tampão deve encontrar-se «mesmo» sobre a agarose,parecendocompletamenteplano.
17. FecharoPippinPreplentamente,tendoematençãoquenenhumtampãoestejaatocarnatampaenquantoestiverafecharodispositivo.
18. Realizarotestedecontinuidade.Quandoossensoressecamligeiramente,écomumqueotestedecontinuidadefalheumavez.Seotestedecontinuidadefalhar,executá-lomaisumavez.Quandootestedecontinuidadeterminar,abriroPippinlentamente.Certificar-sedequenenhumfluidoestáaserpuxadoatravésdacassete,pelatampadoPippinPrep.
19. Agitarbrevementea soluçãocarregadadomarcadorKecentrifugar.Adicionar10µldasoluçãocarregadadomarcadorKàrespetivabibliotecade~30µl.
20. Agitarbrevementeabibliotecaecentrifugar.
21. Remover40µldotampãodopoçodaamostraqueseráutilizado.
22. Adicionar~40µldabibliotecacarregadacommarcadorKparaopoçodaamostraqueseráutilizado.
23. Marcarafaixaqueestáaserutilizadacomasiniciaisdotécnicoeadata.
24. FecharoPippinPrepeclicarnobotão«Start»(Iniciar).Certificar-sedequefoiativadaafaixacorreta.Aamostradeveserprocessadadurante45minutos.
25. Apósaconclusãodoprocessamento,abrircuidadosamenteoPippinPrep.Terematençãoseatampaarrastaqualquerlíquidoatravésdacassete.
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26. Removerafitasobreasportasdeeluição,tendocuidadoparanãofazersalpicarnenhumlíquido.
27. Transferirtodoovolumedaportadeeluiçãoparaumnovotubode1,5mldebaixaligação.
28. Cobrirtodosospoçosabertoscomdoispedaçosdefitadevedaçãodaplaca.Lembre-sededeixarumaabanoladolimpo.Istofacilitaráaremoçãodafitadoladolimpoparaousado.
29. Colocaracassetevedadanosacorespetivoeguardá-la.
30. Pegarnacassetedelavagemeenchê-lacomáguaMiliQ.FecharsuavementeatampadoPippin Prep, tendo em atenção se é derramado algum líquido através da cassete delavagem.
32. DeixaroPippinPrepfechadodurantealgunssegundos.
33. AbriroPippinPrep,tendoematençãoseéderramadoalgumlíquidoatravésdacassetedelavagem.
34. Removeracassetedeágua,esvaziá-laedeixá-lasecar.
35. LimpartodaaáguadoPippinPrepefechá-losuavemente.
36. Selecionarobotão«ShutDown»(Encerrar)nomenuPippinPrep.
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Anexo 2: Quantificação de amplicon utilizando uminstrumentoqPCRDuração:1hora50minutos
ListadereagentesItem Armazenamento Fornecidopor
20×tampãoTE(pH7,5) 4°C PromegaPadrãoLambdaADN(100ng/µl) 4°C Promega200×coranteQuantiFluordsADN 4°C PromegaH2Oesterilizada 20°Ca25°C UtilizadorPlaca(s)deamplificaçãoclasseI 4°C Passo2Placa(s)deamplificaçãoclasseII 4°C Passo2
Protocolo1. Criarumadiluiçãoemsérie,utilizandotubosdemicrocentrifugaçãode1,5mleopadrão
QuantiFluorLambdaADN(100ng/µl).Seguiratabeladediluiçãoabaixo:
Etiquetanotubo EntradadeADN VolumeADN(µl) Volume1xTE(µl) Conc.Final(ng/µl)Padrão1 LambdaADN 7,5µl 492,5µl 1,5ng/µlPadrão2 Padrão1 250µl 250µl 0,75ng/µlPadrão3 Padrão2 250µl 250µl 0,38ng/µlPadrão4 Padrão3 250µl 250µl 0,19ng/µlPadrão5 Padrão4 250µl 250µl 0,09ng/µlPadrão6 Padrão5 250µl 250µl 0,05ng/µlPadrão7,vazio Vazio 0µl 250µl 0ng/µl
2. Preparar as placas de quantificação de amplicon (consultar valores complementares).Alíquotade49,5µl1xtampãoTEnospoçosdeumaplacade96poçoslimpaparaonúmerototaldeampliconsaseremquantificados.
3. Adicionar0,5µldeampliconsdospoçoscorrespondentesnasplacasdeampliconparaospoçosindividuaisnasplacasdequantificaçãodeamplicon.Misturarporpipetagem.
4. Preparar 1× solução de trabalho de coranteQuantiFluor, utilizando a seguinte fórmula:0,25µlcoranteQuantiFluor(200X)+49,75µl1×tampãoTE.Preparar1×soluçãodetrabalhodecoranteQuantiFluorsuficiente,deformaaquecadaamostra(dototaldeamostrasnasplacasdeamplicon)epadrão(14nototal)recebamumaalíquotade50µl.
5. Prepararumaplacadequantificaçãodepadrõeseplacasdequantificaçãodeamplicon.Alíquotade50µlde1×soluçãodetrabalhodecoranteQuantiFluorparapoçosdaplacaóticade96poços,utilizandooformatodaplacadequantificaçãodepadrõeseasplacasdequantificaçãodeamplicon(consultarvalorescomplementares).
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6. Utilizandoospadrõespreparadosacima,adicionar50µldecadapadrão,emduplicado,nospoçosindividuaisnaplacadequantificaçãodepadrões(14poçosnototal).
7. Agitarparamisturarbemecentrifugar.
8. Colocar cada placa de quantificação na máquina qPCR, uma de cada vez, e executaroseguinteprograma:
Númerodeciclos Temperatura Períododetempo1 25°C 10segundos 25°C 15segundos2 25°C 30segundos(aquisiçãodedados)
9. Calcular a concentração deADNnas placas de quantificação de amplicon, utilizando osdadosRFUbrutosgeradospeloinstrumentoqPCR.
10. –DiluiroADNnasplacasdeampliconcomH2Oesterilizada,paraqueaconcentraçãofinaldeADNsejaaproximadamentede67ng/µl.
§ SeaconcentraçãodeADNforigualousuperiora150ng/µl:adicionar25µldeH2O§ SeaconcentraçãodeADNsesituarentre100-150ng/µl:adicionar10µldeH2O§ SeaconcentraçãodeADNforinferiora100ng/µl:adicionar0µldeH2O
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Anexo 3: Quantificação de biblioteca, utilizando umcorantefluorescentedsADNintercalarDuração:~15minutosAconcentraçãodabibliotecaselecionadaportamanhopodesermedidacomexatidãoatravésdeumcorantefluorescentededsADNintercalarcomo,porexemplo,SYBRverdeouequivalente.Oskitseinstrumentoscomercialmentedisponíveisparaestefimincluem,porexemplo,oleitorQubitdaThermoFisher(utilizaokitdeexameQubitBroad-RangedsADN),oleitorQuantusdaPromega(utilizaocorantefluorescenteQuantifluordsADN),entreoutros.Aqui,ométodoQubitédescritocomooinstrumentomaisutilizado.Casosejautilizadooutroinstrumentoekit,sigaasinstruçõespadrãodofabricante.
Nota: Estemétodo fluorométricodsADNéuma forma rápida, porémexata, dedeterminaraconcentraçãodabibliotecafinalselecionadapelotamanho.PermitemediratotalidadededsADNpresentenabiblioteca.
ListadereagentesItem Armazenamento Fornecidopor
KitdeexameQubitdsADNBR temperaturaambiente ThermoFisherPadrõesQubitdsADNBR 4°C ThermoFisherBibliotecaselecionadaportamanho 4°C Passo5
Protocolo6.1 – Colocar os padrões Qubit Standards à temperatura ambiente. Preparar tubos de
ensaioQubit(500µl,deparedefina)paraasuabibliotecaemduplicadoeosdoispadrões.Agitarecentrifugarospadrõeseabiblioteca.
6.2 –Adicionar995µldetampãoe5µldecorantenumtubodecentrifugaçãode1,5ml.Agitarecentrifugar.
6.3 – Transferir 190µl damistura de reagentes paraos tubosQubit, para os dois padrões.Transferir198µldamisturadereagentesparaosdoistubosQubit,paraosduplicadosdabiblioteca.
6.4 –Adicionar10µldopadrão1aotuboQubitcorrespondenteeagitardurante2segundos.Repetiroprocessoparaopadrão2.
6.5 –Adicionar 2 µl da biblioteca aos dois tubosQubit correspondentes e agitar durante 2segundos.
6.6 –IncubarostubosQubitàtemperaturaambientedurante2minutos.
6.7 –LigaramáquinaQubiteescolheroprotocoloBR.
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6.8 – Colocar o padrão 1 no tubo Qubit e premir GO (Acionar). Repetir o processo paraopadrão2.
6.9 –Colocaro tubodabibliotecanoQubitepremirGO (Acionar).Repetiroprocessoparaaréplica.
6.10 – Para converter o resultado de Qubit de concentração ng/µl para nM, introduzira concentração média das duas réplicas de biblioteca no separador do livro Omixondesignadopor«LibraryQuantitation»(Quantificaçãodebiblioteca).
6.11 – Utilizando os resultados damediçãoQubit, diluir 10 µl da biblioteca selecionada portamanho para uma concentração de 2 nM com H2O esterilizada, num novo tubo demicrocentrifugaçãodebaixa ligaçãode1,5ml.Armazenaraparterestantedabibliotecaselecionadaportamanhoa-20°C.
Pontodeparagemsegura.Asbibliotecaspodemserarmazenadasa-20°Cduranteperíodos prolongados. No caso de armazenamento de longa duração,é extremamente recomendável uma nova quantificação da biblioteca antes deaprocessarnoMiSeq.