In der Zelle formt die DNA eine Doppelhelix mit zwei antiparallelen Ketten
PD-RPD-RPD-RPD-RPD-RPD-R PD-RPD-RPD-R PD-RPD-RPD-RPD-RPD-RPD-R PD-R
5´
3´
D-RPD-RPD-RPD-RPD-RPD-R PD-RPD-RPD-R PD-RPD-RPD-RPD-RPD-RPD-R PD-RP
5´
3´D-RPD-RPD-RPD-RPD-RPD-R PD-RPD-RPD-R PD-RPD-RPD-RPD-RPD-RPD-R PD-RP
5´
3´
Das Rückgrat jeder Kette ist der Phosphate (P)-----Desoxyribose (D-R) -Strang
Die Basen sind wie Rippen an diesem Rückgrat angeordnet, und jeweils an dieDesoxyribosen gebunden
Die beiden Stränge sind antiparallel angeordnet
5´ 3´3´ 5´
Die beiden Stränge treten entlangen der Basenzusammen und werden zusammengehaltendurch (i) Wasserstoffbrücken-Bindungen(ii) hydrophobe WechselwirkungenA und T bilden ein Basenpaar mit 2 H-BrückenG und C bilden ein Basenpaar mit 3 H-Brücken
Regeln bei der Watson-Crick-Basenpaarung (i) Wasserstoffbrücken-Bindungen (ii) hydrophobe Wechselwirkungen
Regeln bei der Watson-Crick-Basenpaarung (i) Wasserstoffbrücken-Bindungen
Regeln bei der Watson-Crick-Basenpaarung (i) Wasserstoffbrücken-Bindungen
0.27-0.31 nm
12 - 29 kJ/mol
biologisch releveant
Regeln bei der Watson-Crick-Basenpaarungdie beiden DNA-Stränge treten entlang der Basen zusammen und werden zusammen-gehalten durch (i) Wasserstoffbrücken-Bindungen (ii) hydrophobe Wechselwirkungen
die Basen auf den gegenüberliegenden Strängen stehen sich exakt gegenüber
A und T ein Basenpaar mit 2 H-Brücken G und C ein Basenpaar mit 3 H-Brücken
die Basen sind planar gebaut > Stapelung der Basenpaare in der Doppelhelix (´base stacking´)
5´
3´ 5´
3´
H-Brücken
Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung
G = C A+G = T+CA = T
Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung
Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung
Bei der doppelsträngigen DNA einer Zelle ist der Anteil an dGMP etwas 20 %.
Etwa wie hoch ist der Anteil an dAMP (nach der Chargaff-Regel)?
(A) 20 %
(B) 30 %
(C) 40 %
(D) 60 %
(E) 80 %
Strukturprinzip der Doppelhelix
das Desoxyribose-Phosphat-Rückgrat bildet eineHelix-Struktur aus
die Basen sind zum Innern der Helix gekehrt und die Desoxyribose/Phosphat-Reste liegen an der Außenseite
die Ringebenen der Basen stehen senkrecht zur Helixachse
die Zucker stehen fast im rechten Winkel zur Base
die genetische Information liegt in der Abfolge der Basenpaare TAGCGT
T
G C
AT
GC
A
AT
3'
3'
5'
5'
G C
Leiter-Modell Ribbon-Modell
Raumfüllendes Kalottenmodell
1. Strang (5´)
2. Strang (3´)
große Furche
kleine Furche
rote Linien verbinden die Phosphat-Reste
DNA-bindende Proteine können spezifischan die DNA binden. Dabei lagern sich die Proteinein die große bzw. kleine Furche ein und bekommendadurch Zugang zu den Basen. Dadurch ist die Erkennung einer spezifischen Basenabfolge möglich (z. B. Transkriptionsfaktoren, Restriktionsenzyme)
Rechtsläufige Doppelhelix Entspricht 99% der zellulären
DNA
GCGCGCGC Abfolge
Zick-Zack Verlauf des Phosphodiester-Bandes
Linksläufige DoppelhelixEntsteht bei drastischer Abnahmedes Wassergehalts
Rechtsläufige Doppelhelix
Basenpaare nicht senkrecht wie bei B-Form, sondern um 70° gekippt
Offener Raum im Molekülinneren
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Zusammenfassung der DNA Struktur
1953 haben Watson & Crick die drei-dimensionale Struktur der DNA -Doppelhelix aufgeklärt und sofort den Mechanismus derDNA-Replikation vorhergesagt
wichtig ist, daß die genetische Information (= Abfolge der Basensequenz in der DNA-Kette) während der Zellteilung exakt von der Mutterzelle auf die Tochterzelle übertragen wird
bei der Verdopplung fungieren beide Elternstränge der doppelsträngigen DNA als Matritze
Fehler können sich kastastrophal auf die Lebensfähigkeit der Zelle auswirken, oder Krebs entstehen lassen
bei der Verdopplung fungieren beide Elternstränge der doppelsträngigen DNA als Matritze
AT CG AT
5'A T
GA
TGA TGCC
AAAT CG ATTC A TT
5'
3'
3'
Met Gln Asp Ser StopSinnstrang
AT
C
G A TA
TGA
T
GA TG
CC
AA
ATC
GA
TTC
A TT 5'
3'
Met Gln Asp Ser Stop
5'
3'
AT
C
G A
T
A
TG
AT GATG
C AA
ATC
GA
TTC
A TT3'
5'
T
Fehler bei der VerdopplungT statt C
Mutterzelle
Tochterzelle
1. Replikation der DNA
AT
C
G A TA
TGA
T
GA TG
CC
AA
ATC
GA
TTC
A TT 5'
3'
Met Gln Asp Ser Stop
5'
3'
AT
C
G A
T
A
TG
AT GA TG
C AA
ATC
GA
TTC
A TT3'
5'
T
Fehler bei der VerdopplungT statt C
Mutterzelle
Tochterzelle
5'3'
5'
AT
C
G A TA
TGA
T
GATG C
AA
ATC
AA
TTC
A TT 5'
3'
Met
5'
3'
AT
C
G A
T
A
TG
AT GATG
C AA
ATC
GA
TTC
A TT3'
5'
T
C
Stop
Met Gln Asp Ser Stop
Replikation der DNA derTochterzelle Sinnstrang
Manifestation der Mutation (T::A) ineinem der beiden Stränge der 2.
Generation
AT CG AT
5'
A TG
AT
GA TGCC
AAAT CG ATTC A TT
5'
3'
3'
Elternstrang 1Elternstrang 2
Reißverschlußartige Trennung der beiden Elternsträngeentlang der Basenpaare
= Brechen der H-BrückenAT
C
G A TA
TGA
T
GA TG
CC
AA
ATC
GA
TTC
A TT 5'
5'
3'
AT
C
G A
T
A
TG
AT GATG
C AA
ATC
GA
TTC
A TT3'
5'
T
Elternstrang 1
Elternstrang 2
Tochterstrang 2
Tochterstrang 1
IdentischeVerdopplung
Parentale DNA-Doppelhelix
DNA-Molekülenach einerRunde der
Replikation
KonservativeReplikation
A1 A2
Semi-KonservativeReplikation
A1 A2
A1 A2 N1 N2 A1 A2 N2N1
Semi-konservative DNA-Verdopplung
wurde durch Watson & Crick (1953) vorhergesagt,aber erst durch ein klassisches Experiment (1959) bewiesen von
Meselson & Stahl
Der semi-konservative Replikationsmechanismus wurde zunächst für E. coli gezeigt, und später für alle Organismen einschließlich Homo sapiens bewiesen
Verfüttern von 15N-StickstoffNährmedium an E. coli
DNA enthält normalen = leichten 14N-Stickstoff
14
14
14
14
14
14
E. coli
„Leichte DNA“
DNA enthält jetzt ausschließlichschweren 15N-Stickstoff
„Schwere DNA“
Anschließende Analyse der DNA ob schwer, leicht oder Hybrid
durch CsCl-Dichtegradientzentrifugation
Rückführung der Bakterien in 14N-Stickstoff-Nährmedium
für eine Verdopplungszeit von 20 min
1. Verdopplungmit 14N-Stickstoff
(leicht = L)
2. Verdopplungmit 14N-Stickstoff
(leicht = L) Analyse der DNA ob schwer, leicht oder Hybrid
durch CsCl-Dichtegradientzentrifugation
S-S S-S
S-S S- LS- LL-L
S-S S- LS- LL-L L-L L-L L-LL-L
Semi-konservativkonservativ
Mögliche Ergebnisse Experimentelle Befunde(Meselson & Stahl, 1958)
Wachstum in 15N-MediumSchwere DNA(schwer = S)
S-S
S-L
L-L S-L
Das Beweis-Experiment, daß auch eukaryontische DNA semi-konservativ repliziert wird
Dazu wurden Wurzelzellen mit [3H]-Thymidin (radioaktiver Wasserstoff!)durchmarkiert, isoliert und anschließend autoradiographisch untersucht
Radioaktiv-markiert Probe (z. B. [3H]-Thymidin-markiertes Chromosom)
beim -Zerfall des Tritiums werden Elektronen frei, die den Röntgenfilm an den Stellen schwärzen (Ag-Körner), an denendie Chromosomen auf dem Film aufliegen.
Genauigkeit der Lokalisierung: ca. 0.5 - 1.0 m
Objektträger
Röntgen-Film mit AgBr-Emulsion
e-
…….semi-konservative Replikation von eukaryontischer DNA in Wurzelzellen
A1 A2A1 N1A2 N2
Teilung DNA-Replikationin nicht-radioaktivemMedium
DNA-Synthese inradioaktivem Medium [3H]-Thymidin
2n 1n2n
beide Schwester-Chromatide
sind markiert
Autoradiographie-Bild
nur ein Schwester-Chromatid
ist markiert
Autoradiographie-Bild
Die DNA-Replikation erfolgt bi-direktional
• Die Replikation der DNA erfolgt nicht spontan, sondern wird durch Enzyme (DNA-Polymerasen) katalysiert
• Grundsätzlich gilt, daß die DNA-Polymerasen die Replikation nicht an jeder beliebigen Stelle der DNA initiieren, sondern nur am Replikations-Startpunkt = “Origin“
Replikationsgabel
• am häufigsten findet man, daß die Replikation am Origin beginnt und sich von dort bi-direktional forstsetzt
• dadurch entstehen 2 Replikationsgabeln
• bei ringförmiger DNA (z. B. E. coli) genügt meist ein Origin. Die beiden dort entstehenden Replikationsgabeln verschmelzen schließlich auf der gegenüberliegendenen Seite des Origins nach erfolgter Replikation
Ende der Replikation
Wachstum in beide Richtungenrechte Wachstumsgabellinke Wachstumsgabel
• die langen, linearen eukaryontischen Chromosomen (= lineare DNA) haben viele DNA-Replikations-Startpunkte (vermutlich einige tausende bis zehntausende Origins beim Menschen)
• die bi-direktionalen Replikationsgabeln bewegen sich aufeinander zu, solange bis sich benachbarte Startpunkte begegnen
• durch das Vorhandensein von vielen Replikons (Replikations-Startstellen) schafft es die eukaryontische Zelle die ca. 1000-fach größere DNA (vgl. E. coli > Mensch) in der erforderlichen Zeit zu replizieren
• Der Nachweis der bi-direktionalen DNA-Replikation wurde durch Autoradiographie von radioaktiv markierter DNA, die aus Säugerzellen isoliert wurde, erbracht.
• Markierung der DNA erfolgte mit [3H]-Thymidin, zunächst von niedriger Radioaktivität.Nach Beginn der Replikation wurde die Menge an radioaktivem [3H]-Thymidin erhöht. Anschließend wurden die Chromsomen autoradiographiert.
Autoradiogramm
e-
hohe niedrige hohe Radioaktivität
hohe niedrige hohe Radioaktivität
Ori 1 Ori 2
[3H]-markierte DNA
• Elektronenmikroskopische Aufnahmen von sich replizierender DNA aus Drosophila-Zellen, die sich rasch teilen (= aktive DNA-Replikation). Die Pfeile zeigen Replikationsblasen, in denen bi-direktionale Replikation stattfindet.
1n DNA
Replikationsblase
2n DNA
Replikationsgabel
Sichtbarmachen von Replikationsblasen
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Wanderungs-Geschwindigkeit der Replikationsgabeln
hohe niedrige hohe Radioaktivität
Länge der radioaktiv markierten DNA (m) in Abhängigkeit der Replikationsdauer
t2
t3
OriC t1
• Zellen werden unterschiedlich lang mit [3H]-Thymidin markiert, bevor die DNA isoliert und autoradiographisch analysiert wird
• durch die Länge der Schwärzung auf dem Röntgenfilm kann die Geschwindigkeit, mit der sich die Replikationsgabel entlang der DNA bewegt, bestimmt werden
Wanderungs-Geschwindigkeit der Replikationsgabeln
Länge der DNA auf dem Autoradiogramm proportional zur Anzahl der replizierten Basenpaare> Bestimmung der Replikationsgeschwindigkeit = 1000 BP/sec/Gabel bei E.coli
Kleine Rechnungbei E. coli dauert die Replikation 20 min (Genomgröße = 3 x 106 BP)
bei 2 Replikationsgabeln mit einer V = 1000 BP/secstimmen theoretischer und errechneter Wert überein1200 sec x 1000 BP = 1.2 x 106 BP
bei 2 Gabeln: 2.4 x 106 BP
Homo sapiens ~ 100 BP/sec/Gabel(Autoradiographie)
bei 3 x 109 BP/Genom benötigt man ca. 1000 Replikationsgabeln für dieReplikation des gesamten Genoms (in ca.10 hr)
Wie funktioniert der einzige “Origin of Replication“ in E.
coli?
DnaA(ATPase)
Erkennung
Startkomplex
OffenerKomplex
30°CDnaB = HelikaseDnaCATP
„Prä-Priming“Komplex
- Primase- DNA-PolymeraseReplikation
leichtes „Schmelzen“ der
DNA
OriC