INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
“EFECTO DE LA Spirulina maxima CONTRA LA
TERATOGENICIDAD Y GENOTOXICIDAD
PRODUCIDAS POR HIDROXIUREA”
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DOCTOR EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS
P R E S E N T A :
JORGE VÁZQUEZ SÁNCHEZ
DIRECTORES DE TESIS:
DR. GERMÁN ALBERTO CHAMORRO CEVALLOS
DR. RICARDO PÉREZ PASTÉN BORJA
MÉXICO, D. F. 2009
1
Este trabajo se realizó bajo la dirección de los doctores Germán Chamorro
Cevallos y Ricardo Pérez Pastén Borja, en el Laboratorio de Toxicología
Preclínica, del Departamento de Farmacia, de la Escuela Nacional de
Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, con apoyo del
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, beca con número de registro
185528.
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ÍNDICE GENERAL
ABREVIATURAS v
ÍNDICE DE FIGURAS vii
ÍNDICE DE TABLAS ix
RESUMEN xi
ABSTRACT xii
1. INTRODUCCIÓN 1
1.1 ANTECEDENTES 1
1.2 TERATOGÉNESIS 3
1.2.1 Estudios de teratogénesis 3
1.3 ESTUDIOS DE GENOTOXICIDAD 4
1.4 RELACIÓN ENTRE TERATOGÉNESIS Y GENOTOXICIDAD 5
1.4.1 Mecanismos de teratogenicidad 6
1.4.2 Teratogénesis mediada por ERO 7
1.4.2.1 Especies reactivas de oxígeno (ERO) 7
1.4.2.2 Producción de ERO en organismos vivos 8
1.4.2.3 Daño a macromoléculas causado por ERO 9
1.4.2.3.1 Daño a proteínas 10
1.4.2.3.2 Daño a lípidos 10
1.4.2.3.3 Daño al ADN 11
1.4.3 Inducción de teratogénesis mediada por ERO 12
1.5 HIDROXIUREA 14
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1.5.1 Características generales 14
1.5.2 Inducción de teratogénesis mediada por HU 16
1.6 MECANISMOS DE PROTECCIÓN ANTIOXIDANTE 19
1.6.1 Protección antioxidante contra agentes teratógenos 20
1.7 Spirulina 21
1.7.1 Características 21
1.7.2 Actividad antioxidante del alga Spirulina 25
1.7.3 C-ficocianina 25
1.7.4 Actividad antigenotóxica del alga Spirulina 27
2. JUSTIFICACIÓN 29
3. OBJETIVOS 30
3.1 OBJETIVO GENERAL 30
3.2 OBJETIVOS PARTICULARES 30
4. HIPÓTESIS 31
5. MATERIAL Y MÉTODOS 32
5.1 OBTENCIÓN DEL EXTRACTO DE C-FICOCIANINA 32
5.2 ANIMALES Y ACOPLAMIENTOS 33
5.3 ESTUDIO DE TERATOGÉNESIS 34
5.4 ESTUDIO DE PEROXIDACIÓN LIPÍDICA Y CUANTIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS 35
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5.5 CULTIVOS PRIMARIOS DE CÉLULAS EMBRIONARIAS DE
EMBRIONES COMPLETOS, ENCÉFALO Y PRIMORDIOS DE
EXTREMIDADES ANTERIORES 36
5.5.1 Pruebas de citotoxicidad para S. maxima, el extracto de c-
ficocianina e HU 37
5.5.2 Determinación del efecto protector de S. maxima y el
extracto de c-ficocianina sobre la citotoxicidad producida por
HU 39
5.6 DETERMINACIÓN DEL EFECTO PROTECTOR DE S. maxima
Y EL EXTRACTO DE C-FICOCIANINA SOBRE LA
GENOTOXICIDAD PRODUCIDA POR HU 39
5.7 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 41
6. RESULTADOS 42
6.1 EXTRACTO DE C-FICOCIANINA 42
6.2 ESTUDIO DE TERATOGÉNESIS 43
6.2.1 Grupo testigo de agua 43
6.2.2 Grupo testigo de tween 80 43
6.2.3 Teratogenicidad in vivo de S. maxima 44
6.2.4 Teratogenicidad in vivo inducida con hidroxiurea 44
6.2.5 Efecto de S. maxima sobre la teratogénesis inducida con
HU 45
6.3 DETERMINACIÓN DE LA PEROXIDACIÓN LIPÍDICA Y
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS 50
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6.4 DETERMINACIÓN DE LA CITOTOXICIDAD DE S. maxima, EL
EXTRACTO DE C-FICOCIANINA E HU EN CULTIVOS
PRIMARIOS DE CÉLULAS EMBRIONARIAS DE EMBRIONES
COMPLETOS, ENCÉFALO Y PRIMORDIOS DE EXTREMIDADES
ANTERIORES 51
6.5 DETERMINACIÓN DEL EFECTO PROTECTOR DE S. maxima
Y EL EXTRACTO DE C-FICOCIANINA SOBRE LA
CITOTOXICIDAD PRODUCIDA POR HU 51
6.6 DETERMINACIÓN DEL EFECTO PROTECTOR DE S. maxima
Y EL EXTRACTO DE C-FICOCIANINA SOBRE LA
GENOTOXICIDAD PRODUCIDA POR HU 56
7. DISCUSIÓN 59
8. CONCLUSIONES 69
9. BIBLIOGRAFÍA 71
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ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS
·OH Radical hidroxilo
1O2 Singlete de oxígeno
3O2 Oxígeno molecular en estado de triplete
4-HNE 4-hidroxinonenal
CO2 Dióxido de carbono
COX-2 Ciclooxigenasa-2
CYPs Citocromo P450
DSV Diámetro del saco vitelino
EMN Eritrocitos micronucleados
EPC Eritrocitos policromáticos
EPCMN Eritrocitos policromáticos micronucleados
ERN Especies reactivas del nitrógeno
ERO Especies reactivas del oxígeno
ET Eritrocitos totales
GPx Elutatión peroxidasa
GSH Glutatión reducido
GST Glutatión-S-transferasa
H2O2 Peróxido de hidrógeno
HU Hidroxiurea
KDa Kilo-Daltones
L-arg L-arginina
LC Longitud
LCR Longitud coronilla-grupa
LPO Lipoperoxidasa
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MDA Malondialdehído
NAD(P)H Fosfato de nicotin-adenin-dinucleótido
NADH Nicotin-adenin-dinucleótido
NO- Anión nitroxilo
NO+ Catión nitrosonio
NO· Radical del óxido nítrico
NO2· Radical del dióxido de nitrógeno
NOS Óxido nítrico sintasa
-O2 Anión superóxido
ONOO- Peroxinitrito
p Probabilidad
PBS Solución amortiguadora de fosfatos
PHSs Prostaglandin-H sintetasas
RRND-I Reductasa de ribonucleótidos-difosfato clase I
S. maxima Spirulina maxima
S. platensis Spirulina platensis
SDS-PAGE Electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida
SOD Superóxido dismutasa
TBARS Especies reactivas al ácido tiobarbitúrico
TNF- Factor de necrosis tumoral-alfa
URF Unidades relativas de fluorescencia
UV Ultravioleta
VSV Vascularidad del saco vitelino
2 Prueba de chi-cuadrada
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Vías bioquímicas involucradas en los mecanismos y
determinantes de riesgo de teratogénesis química mediada
por ERO 7
Figura 2 Vías de producción y degradación de ERO 9
Figura 3 Activación de xenobióticos por las vías de la PHS y LPO 13
Figura 4 Mecanismo de acción de la hidroxiurea 15
Figura 5 Formación del NO y sus metabolitos, a partir de HU 16
Figura 6 Fotografías de embriones de 11 días cuyas madres no
tratadas y tratadas con HU 17
Figura 7 Formación de radicales libres hidroxilo a partir de la reacción
química de hidroxiurea con oxígeno en fluidos biológicos 18
Figura 8 Balance entre la producción de ERO y varios tipos de
mecanismos antioxidantes 19
Figura 9 Alga Spirulina 22
Figura 10 C-ficocianina 27
Figura 11 Fotografías de embriones de 11 días en las que se muestran
las partes de los embriones que se utilizaron para el cultivo
primario de células 37
Figura 12 Diseño de la microplaca utilizado para la determinación de la
CL50 y del efecto protector del alga o el extracto sobre la
citotoxicidad producida por HU 38
Figura 13 SDS-PAGE al 12 % 42
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Figura 14 Espectro UV del extracto de c-ficocianina 43
Figura 15 Comparación de los grupos testigo, tween 80, HU, y S.
maxima 48
Figura 16 Comparación de los grupos testigo, HU, S. maxima (1000
mg/kg), y S. maxima (1000 mg/kg), + HU 49
Figura 17 Contenido embrionario de MDA 50
Figura 18 Determinación del efecto citotóxico de Spirulina y el extracto
de c-ficocianina para cultivos primarios de encéfalo 52
Figura 19 Determinación del efecto citotóxico de la HU para cultivos
primarios 53
Figura 20 Determinación del efecto protector del extracto de c-
ficocianina sobre la citotoxicidad producida por HU 54
Figura 21 Determinación del efecto protector del extracto de c-
ficocianina sobre la citotoxicidad producida por HU 55
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ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Etiología de las malformaciones congénitas humanas 2
Tabla 2 Principales ensayos para la determinación de
genotoxicidad 5
Tabla 3 Actividades farmacológicas reportadas para el alga
Spirulina y algunos de sus componentes 24-5
Tabla 4 Composición del SDS-PAGE al 10 % 33
Tabla 5 Tratamientos a los que se sometió a los diferentes grupos 34
Tabla 6 Tratamientos a los que se sometió a los grupos adicionales
para el estudio de TBARS y la cuantificación de proteínas 35
Tabla 7 Concentraciones de S. maxima, extracto de c-ficocianina e
HU a las que se sometió a las células de los diferentes
cultivos 38
Tabla 8 Tratamientos a los que se sometió a los diferentes grupos
para el estudio de genotoxicidad 40
Tabla 9 Parámetros generales que muestran el efecto de S.
maxima sobre la teratogénesis in vivo inducida por HU en
ratón 46
Tabla 10 Efecto de S. maxima sobre el grado de desarrollo
embrionario in vivo en embriones cuyas madres fueron
tratadas con HU 47
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Tabla 11 Efecto de S. maxima y el extracto de c-ficocianina sobre la
genotoxicidad in vivo en fetos cuyas madres fueron
tratadas con HU 57
Tabla 12 Efecto de S. maxima y el extracto de c-ficocianina sobre la
genotoxicidad in vivo en hembras gestantes tratadas con
HU 58
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RESUMEN
Las malformaciones congénitas son una de las primeras causas de
mortalidad infantil a nivel mundial. Algunos xenobióticos pueden reaccionar en el
embrión y producir intermediarios muy tóxicos como electrófilos y radicales libres,
que al causar alteraciones celulares interfieren con el desarrollo embrionario/fetal.
Spirulina maxima y su extracto proteico, cuyo componente principal es la c-
ficocianina, han sido ampliamente estudiadas por sus propiedades antioxidantes.
La hidroxiurea es un potente teratógeno que causa rápida muerte celular e
inhibición profunda de la síntesis de ADN en mamíferos; algunos antioxidantes
bloquean la primera pero no la inhibición de la síntesis de ADN, por lo que se ha
sugerido que este fármaco reacciona en el embrión, produciendo ERO que son las
responsables de la muerte celular temprana.
El objetivo de este trabajo, fue investigar el posible efecto protector de S.
maxima y el extracto de c-ficocianina sobre la teratogénesis, la citotoxicidad y la
genotoxicidad, inducidas con hidroxiurea, mediante diferentes modelos
experimentales y asociar los resultados obtenidos a las propiedades antioxidantes
de ambas sustancias.
Ratones ICR gestantes, fueron distribuidos para los diferentes estudios. Se
realizaron pruebas de teratogénesis y TBARS en las cuales la evaluación se hizo
en embriones de 11 días de gestación. Un ensayo de citotoxicidad en el que se
utilizaron cultivos primarios de células de primordios, encéfalo y embriones
completos. Para el experimento de genotoxicidad se tomaron muestras de sangre
periférica de hembras de 20 días de gestación y de sus fetos para la prueba de
micronúcleos.
Los resultados indican que el empleo de S. maxima y del extracto de c-
ficocianina, no sólo no han causado alteración alguna en los animales/cultivos
celulares expuestos a ellas, sino que han sido efectivas en la prevención de los
daños causados por la hidroxiurea y los animales que recibieron al fármaco en
combinación con el alga o su extracto proteico, presentaron una reducción de los
efectos tóxicos hasta valores semejantes a los de los testigos negativos, lo cual
fue relacionado principalmente a las propiedades antioxidantes de ambas.
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ABSTRACT
Congenital malformations are one of the major causes of child mortality all
over the world. A number of xenobiotics can react within the embryo to produce
highly toxic electrophilic or free radical reactive intermediates. This could result in
cellular damage and may interfere with embryonic and/or fetal development.
Spirulina maxima and its protein extract, which major component is c-
phycocyanin, have been extensively studied because their antioxidant properties.
Hydroxyurea is a potent mammalian teratogen. It causes fast cellular death
and deep embryonic DNA-synthesis inhibition. Some antioxidants block the former
but DNA-synthesis inhibition, it was suggested that hydroxyurea reacts within
embryos to give hydrogen peroxide and free radicals, which causes early cellular
death.
The aim of this work was to investigate the possible protector effect of
Spirulina maxima and the extract of c-phycocyanin over the hydroxyurea
teratogenicity, citotoxicity and genotoxicity in different experimental tests and to
associate the findings with their antioxidant properties.
Pregnant ICR mice were randomly divided into the different tests.
Teratogenesis and TBARS were evaluated in 11th day old embryos. To the
citotoxicity assay there were used cells from complete embryos, their fore limbs
and encephalons. Finally to the genotoxicity experiment it was used the peripheral
blood of the gestated dams and their 20th day old fetuses for micronucleus test.
Results showed that neither Spirulina maxima nor the extract of c-phycocyanin
caused any alteration in animals/cell cultures exposed to them; nevertheless, they
have been effective in the prevention of damages induced by hydroxyurea. The
animals which received the drug and the alga or its protein extract, presented a
reduction in the toxic effects of hydroxyurea and achieved similar quantities to the
control groups. Results were related to the antioxidant properties of both Spirulina
maxima and the extract of c-phycocyanin.
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1. INTRODUCCIÓN
1.1 ANTECEDENTES
Las malformaciones congénitas representan una de las primeras de causas de
mortalidad infantil a nivel mundial. En países desarrollados ocupan el primer lugar,
en tanto que en los que están en vías de desarrollo se encuentran en el segundo o
tercero (OMS, 2008). En México, se ubican como la segunda causa de mortalidad
infantil a nivel nacional (INEGI, 2009).
Las malformaciones congénitas son causadas por diversos factores, tales como:
exposición a fármacos y otros agentes químicos, hipertermia, infecciones, estados
anormales del metabolismo materno e incluso factores físicos (Brent y Beckman,
1990), (Tabla 1). Los mecanismos de la teratogénesis química, comprenden la
interacción del embrión durante la fase de organogénesis con sustancias que
pueden interactuar, de forma directa o indirecta, e interferir una variedad de eventos
celulares que se llevan a cabo en tiempos precisos, como: proliferación, migración,
asociación, diferenciación y apoptosis (Schmid, 1985). Para protegerse, los
organismos vivos han desarrollado diversos mecanismos que los protegen de
factores físicos como: impactos mecánicos, variaciones en la temperatura y algunas
clases de radiaciones; e incluso modulan otros factores de naturaleza química, ya
sea impidiendo que estos lleguen o al menos reduciendo su concentración en el
embrión (Wilson, 1973; Cohen, 1990).
Asimismo, la interferencia química de algunas sustancias con gametos y
embriones o durante el desarrollo fetal, causa infertilidad, pérdida del producto
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durante la concepción o defectos en el mismo. Ciertos compuestos inducen
malformaciones estructurales, disfunciones fisiológicas o metabólicas, alteraciones
en el comportamiento o psicológicas, o déficit en los productos, tanto al nacimiento
como en un determinado período postnatal; por ello se hace necesaria la detección
de sustancias que interfieran o alteren cualquier etapa de la reproducción
(Ecobichon, 1997). Se ha observado que las mutaciones en genes y cromosomas,
no sólo juegan un papel importante en el proceso de carcinogénesis sino también,
pueden estar involucradas en la producción de malformaciones en neonatos y en
otras enfermedades (Gómez-Meda y col., 2004).
Dentro de los estudios que se realizan para determinar si una sustancia es
segura para su uso en humanos se encuentran las pruebas de teratogenicidad y
genotoxicidad; un requerimiento básico de estos estudios es que se realicen en al
menos dos especies, de las cuales una debe ser preferentemente no-roedora
(Ecobichon, 1997).
Tabla 1. Etiología de las malformaciones congénitas humanas.
Causas Porcentaje
Genéticas 15-25
Enfermedades genéticas autosómicas
Citogenéticas (anormalidades cromosómicas)
Desconocidas 65
Poligenéticas
Multifactoriales (interacciones genoma-ambiente)
Alteraciones espontáneas en el desarrollo
Interacciones sinergistas entre teratógenos
Ambientales 9
Condiciones maternas (diabetes, endocrinopatías, deficiencias nutricionales, uso de sustancias de abuso)
Infecciones maternas (rubeola, toxoplasmosis, sífilis, herpes, varicela)
Problemas físicos (constricciones anormales del cordón, disparidad uterina)
Exposición a químicos, fármacos, radiación <1
Modificada de Brent and Beckman, 1990.
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1.2 TERATOGÉNESIS
Teratogénesis deriva del término griego “monstruo”; regularmente se refiere a
defectos estructurales, como los causados por la exposición de un embrión a la
talidomida, que provoca focomeli o amelia. Sin embargo, en un contexto más
amplio, la teratogénesis incluye defectos funcionales y estructurales, los cuales
pueden resultar letales para el infante, antes o poco después del nacimiento (Wells
y col., 2005).
Un agente teratógeno es aquel que induce malformaciones estructurales,
disfunciones metabólicas o fisiológicas, alteraciones psicológicas o en el
comportamiento, o déficit en los productos, ya sea al nacimiento o en un período
postnatal definido (Ecobichon, 1997).
En la actualidad, existe un gran número de nuevos productos químicos y
farmacéuticos que son utilizados en la vida cotidiana y que pueden inducir defectos
de nacimiento; asimismo, hay otros que se encuentran en pruebas para determinar
sus posibles efectos durante el periodo perinatal.
Las pruebas para la realización de estudios de teratogénesis incluyen una
batería de ensayos in vivo e in vitro.
1.2.1 Estudios de teratogénesis
Un requerimiento básico para las pruebas de teratogénesis de una sustancia
es que deben efectuarse en al menos dos especies, una de las cuales tiene que ser
preferentemente no-roedora. Generalmente se administran compuestos de prueba a
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hembras gestantes durante el período de la organogénesis (diferenciación
embrionaria), y se utilizan tres grupos con una dosis diferente cada uno, un testigo
negativo y uno positivo (Wilson, 1977).
Las hembras se sacrifican uno o dos días antes del día del parto, son contados
el número de fetos vivos y muertos, los cuales se pesan y examinan externa e
internamente y se determinan anormalidades en tejido blando y esqueleto. En
algunos casos se permite el nacimiento y maduración para determinar latencia
fisiológica o déficit en la conducta (Coyle y col., 1976; Schmid y col., 1997).
Asimismo, se explantan embriones o partes de ellos (extremidades, órganos,
tejidos), ya sea para ser analizados o para cultivarlos y tratarlos in vitro y estudiar el
desarrollo embrionario bajo condiciones definidas (Schmid, 1985). Las
malformaciones se detectan mediante la observación del esqueleto, vísceras y
partes externas del cuerpo tanto en embriones, fetos y neonatos (Wilson, 1973).
1.3 ESTUDIOS DE GENOTOXICIDAD
Las pruebas para la detección de agentes que dañan al ADN, no sólo nos
proporcionan información sobre la capacidad de dichos agentes para dañar a
material genético de los organismos, sino que están relacionadas a la inducción de
mutaciones, tanto en células somáticas como germinales; al proceso de
envejecimiento, al desarrollo de ciertos tipos de cánceres e inclusive a la presencia
de malformaciones congénitas.
Las pruebas para la determinación de genotoxicidad de un xenobiótico se
dividen en dos etapas, la primera de las cuales sólo considera algunos ensayos que
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sirven como pruebas preliminares y proporcionan información sobre la parte del
material genético que es afectada por los xenobióticos (genes o cromosomas). La
segunda etapa, incluye ensayos que proporcionan extensa información acerca de
los mecanismos y los tipos específicos de mutación que pueden ocurrir, así como
las consecuencias de las mismas. En esta etapa se incluyen pruebas en células y
organismos completos (Preston y Hoffman, 2008), (tabla 2).
Tabla 2. Principales ensayos para la determinación de genotoxicidad.
Ensayos
Ensayos iniciales
Determinación de mutaciones en genes (prueba de Ames)
Determinación de mutaciones en cromosomas (prueba de micronúcleos)
Ensayos que ofrecen información extensa o específica
Mutaciones de genes (reversión de mutaciones, mutaciones en cultivos celulares, dominantes letales en Drosophila)
Análisis citogenético en cultivos celulares de células de hámster o humanas
(aberraciones cromosómicas, micronúcleos y aneuploidias)
Otros indicadores de daño genético (ensayos de daño y reparación de ADN y de
recombinación mitótica)
Pruebas en células germinales de mamíferos (locus-específico, mutaciones
esqueléticas, análisis citogenético, translocaciones de tipo heredable y daño y reparación de ADN).
Modificada de Preston y Hoffman, 2008.
1.4 RELACIÓN ENTRE TERATOGÉNESIS Y GENOTOXICIDAD
Muchos de los compuestos que están clasificados como teratógenos tienen un
potencial genotóxico y varios de los mecanismos relacionados en estos procesos
involucran la producción de micronúcleos.
Los micronúcleos han sido utilizados en diversos estudios para tratar de
relacionar el daño genotóxico con la teratogenicidad de algunos compuestos, por
ejemplo: la frecuencia de micronúcleos ha sido determinada en células de hígado
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fetal de ratas, cricetos y ratones, en sangre fetal de ratón, sangre de ratón neonato
y cultivos de linfocitos humanos de cordón umbilical (Gómez-Meda y col., 2004).
1.4.1 Mecanismos de teratogenicidad
Los mecanismos generales de la teratogénesis incluyen la unión reversible de
los xenobióticos a receptores, provocando respuestas embriopáticas por el
incremento en la concentración de dichos agentes, debido a sobrexposición y
deficiencias en las vías metabólicas o de eliminación maternas. Por otro lado,
algunos xenobióticos, también llamados “proteratógenos”, que son poco o nada
tóxicos al ser enzimáticamente bioactivados y producen sustancias electrofílicas o
radicales libres altamente tóxicos. Las primeras pueden unirse covalentemente a
macromoléculas celulares, como el ADN; en tanto que las segundas reaccionarían
de forma directa o indirecta con el oxígeno molecular e iniciar la formación de
especies reactivas del oxígeno (ERO), o del nitrógeno (ERN), dando como resultado
al anión superóxido (-O2), peróxido de hidrógeno (H2O2), y radicales hidroxilo (·OH);
así como, el radical del óxido nítrico (NO·), el peroxinitrito (ONOO-), el catión
nitrosonio (NO+), el anión nitroxilo (NO-), y el radical del dióxido de nitrógeno (NO2·),
respectivamente, que causan daño celular oxidativo (Figura 1), (Parman y col.,
1999; Deeb y col., 2000; Bath y Madyastha, 2001; Dröge, 2002; Chen y col., 2004;
Touyz, 2004, Wells y col., 2005).
Con frecuencia, diferentes ERO coexisten en un ambiente reactivo, lo que hace
difícil la identificación de qué agente es responsable de un efecto biológico
determinado. Pero, sí el daño a macromoléculas no es reparado, puede interferir
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con el desarrollo embrionario y/o fetal (Parman y col., 1999; Deeb y col., 2000; Chen
y col., 2004; Wells y col., 2005).
Se ha descrito que muchos compuestos químicos causan teratogénesis
mediante el daño por ERO, como: hidroxiurea, fenitoína, benzo-a-pireno, cocaína y
ácido valproico, entre otros (DeSesso y Goeringer, 1990a; DeSesso y col., 1994;
Deeb y col., 2000; Wells y col., 2005). Asimismo, algunos de dichos compuestos
han sido descritos como reconocidos agentes genotóxicos (Tanaka y Shimizu,
2000; Nersesyan y Kaiser, 2002; Avlasevich y col., 2006).
Figura 1. Vías bioquímicas involucradas en los mecanismos y determinantes de riesgo de
teratogénesis química mediada por ERO. El riesgo está determinado por el balance entre la
bioactivación embrionaria y las vías de eliminación materna y la destoxificación de
intermediarios reactivos embrionarios, citoprotección y reparación de daño a
macromoléculas (Wells y col., 2005).
1.4.2 Teratogénesis mediada por ERO
1.4.2.1 Especies reactivas de oxígeno (ERO)
XENOBIÓTICOS INTERMEDIARIOS
REACTIVOS BLANCO
MOLECULAR
•Fárnacos
•Qímicos ambientales
•PHS
•Peroxidación lipídica
•Citocromo P450
•ADN
•Proteínas
•Lípidos
•Aductos
•Oxidación
•UDP-glucorosil-
transferasa •GHS
•GSH S-transferasa
•Epóxido hidrolasa
•p53
•ATM
•Ogg1
•GSH
•GSH peroxidasa
•GSH S-transferasa
•Epóxido reductasa
TERATOGÉNESIS ALTAMENTE TÓXICOS NO-TÓXICOS
PROTERATÓGENOS
•Sustancias
electrofílicas
•Radicales
libres
Especies reactivas
de oxígeno
•SOD
•G6PD
•Catalasa
DAÑO
REPARACIÓN CITOPROTECCIÓN DESTOXIFICACIÓN ELIMINACIÓN
BIOACTIVACIÓN
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Las ERO son entidades químicas extremadamente reactivas que contienen
oxígeno en su composición. Se clasifican en radicales libres y especies reactivas
no radicales. A concentraciones bajas, juegan un papel muy importante como
reguladores en procesos de señalización celular. Sin embargo, a altas
concentraciones, son peligrosas para los organismos, ya que dañan los
constituyentes celulares importantes y se ha observado que están involucrados en
la patogénesis del cáncer, diabetes mellitus, aterosclerosis, enfermedades
neurodegenerativas, artritis reumatoide, isquemia, apnea y otros padecimientos.
Asimismo, los radicales libres están implicados en los mecanismos de
senescencia (Dröge, 2002; Sastre y col., 2003).
1.4.2.2 Producción de ERO en organismos vivos
En las células existen mecanismos enzimáticos cuya función es la producción de
ERO, así como su degradación. El -O2, se forma mediante la reducción del oxígeno
molecular en estado de triplete (3O2). Este proceso se realiza por enzimas como las
NAD(P)H y xantina oxidasas, o vía no-enzimática por compuestos redox reactivos,
como la semi-ubiquinona de la cadena transportadora de electrones en las
mitocondrias. Después, la enzima superóxido dismutasa (SOD), convierte al -O2 en
H2O2. En los tejidos el -O2 puede transformarse de forma no-enzimática en H2O2 ó
en el singlete de oxígeno (1O2). En presencia de metales de transición (como los
iones de hierro y cobre), el H2O2 es convertido en el altamente reactivo ·OH, o en
agua por las enzimas catalasa y glutatión peroxidasa (Figura 2), (Mason y Chignell,
1982; Dröge, 2002; Genova y col., 2003; Sastre y col., 2003; Giordano, 2005).
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Otros de los compuestos que se originan son los que se clasifican dentro de las
especies reactivas del nitrógeno. El NO·, se produce en organismos superiores por
la oxidación de uno de los nitrógenos (guanidino terminal), de la L-arginina (L-arg),
mediante la acción catalítica de la enzima óxido nítrico sintasa (NOS). El NO· puede
reaccionar con ERO y producir el ONOO-, el NO+, el NO-, y el NO2· (Figura 2). El
ONOO- es un intermediario muy reactivo que al comenzar la nitración de lípidos,
proteínas y ADN o producir el ·OH también produciría daño oxidativo (Figura 2),
(Bath y Madyastha, 2001; Dröge, 2002; Touyz, 2004; Wells y col., 2005).
Figura 2. Vías de producción y degradación de ERO. La producción de ERO puede ser a
partir de compuestos de oxígeno o de nitrógeno, en ambos casos el altamente reactivo ·OH
puede ser el producto final (Modificado de Dröge, 2002).
1.4.2.3 Daño a macromoléculas causado por ERO
Como ya se mencionó, las ERO comprenden a los radicales libres y a las
especies no-radicales libres. Los primeros son átomos o moléculas inestables, con
O2 O2
. -
Xantina
oxidasa
NAD(P)H
oxidasas
Hipoxantina
Xantina
Xantina
ácido úrico
Mitocondria
Semi-
ubiquinona
SOD
H2O2
Catalasa
H2O
GSH
peroxidasa
GSH GSSG
Tejidos Fe2+/ Cu
2+
Fe3+/ Cu
3+ .OH 1
O2
L-arginina NOS
NO· NO2
· ONOO
-
NO+
NO-
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un electrón desapareado, que para estabilizarse deben tomar un electrón de otra
molécula estable, causando una reacción en cadena que lleva a la
desestabilización de otras moléculas. Las especies no-radicales tienes sus
electrones pareados, pero su inestabilidad natural, debida principalmente a
átomos muy electronegativos en su composición, hace que se conviertan
fácilmente en radicales libres o se unan covalentemente a sustancias electrofílicas
(Binda y col., 2003; Sastre y col., 2003).
1.4.2.3.1 Daño a proteínas
Los aminoácidos de las proteínas que presentan un grupo sulfhidrilo en su
cadena lateral (cisteína, metionina e histidina), son especialmente susceptibles a
ser atacados y oxidados por el ·OH. Los procesos de oxidación por ERO pueden
generar cambios en la estructura tridimensional de las proteínas, dando como
resultado procesos de fragmentación, agregación, entrecruzamiento e inactivación.
Finalmente, la oxidación de la proteína conllevará a un proceso de degradación por
procesos celulares encargados de la eliminación de proteínas dañadas (Deans y
col., 1997; Wu y Canderbaum, 2003).
1.4.2.3.2 Daño a lípidos
Los fosfolípidos son componentes esenciales en las membranas y otras partes
de la célula. Los ácidos grasos poliinsaturados son uno de los constituyentes más
importantes de las membranas fosfolipídicas y son particularmente sensibles al
ataque del ·OH y otros oxidantes, ya que estos, al sustraer hidrógenos de sus
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moléculas inician el proceso de peroxidación de muchos ácidos grasos, debido a
que es una reacción en cadena (Wu y Canderbaum, 2003). Lo anterior permite la
acumulación de hidroperóxidos que finalmente se descomponen en una gran
variedad de productos terminales como el malondialdehído (MDA), el hexanal, y el
4-hidroxinonenal (4-HNE). Sustancias como el MDA se utilizan como marcadores de
peroxidación lipídica ya que fácilmente reaccionan con el ácido tiobarbitúrico, por
ello se les designa como especies reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS), y se
pueden cuantificar mediante métodos espectrofotométricos (Zenteno y Saldaña,
2008).
1.4.2.3.3 Daño al ADN
Si bien es cierto que existen varias formas de daño al ADN, el producido por
ERO y ERN, es el que se presenta en mayor cantidad. Este, puede causar
rompimiento de hebras de la doble hélice, remoción y cambios químicos en las
bases orgánicas de los nucleótidos y entrecruzamientos de las proteínas con el
ADN, entre otros; que tienen consecuencias biológicas serias como mutaciones y
transformaciones carcinogénicas, e incluso la muerte celular (Bath y Madyastha,
2001; Wu y Canderbaum, 2003; Wells y col., 2005).
Las ERO y ERN son capaces también de causar daños de forma indirecta al
ADN al afectar la transducción de señales, la proliferación celular y la
comunicación intercelular (Medeiros, 2008).
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1.4.3 Inducción de teratogénesis mediada por ERO
A pesar de que muchas células eucariontes poseen mecanismos de defensa
antioxidante, que incluyen la neutralización no enzimática y la destoxificación
enzimática de ERO, es de esperarse que esto no sea así en etapas tempranas del
desarrollo embrionario ya que la cantidad de O2 presente en su metabolismo es
muy baja. Consecuentemente, la exposición a ERO, incluso en pequeñas
concentraciones durante dichos períodos, puede ser peligroso para los embriones
(Parman y col., 1999; Ornoy y col., 1999).
La mayoría de las enzimas de la familia de los citocromos P450 (CYPs), no
se han expresado en el período embrionario. Sin embargo, las pocas que existen
parecen ser suficientes para llevar a cabo la bioactivación de los xenobióticos, ya
que, a excepción del NO, las ERO y las ERN no son difusibles y generalmente se
degradan en el sitio en el que se producen. Por otro lado, la familia de las
prostaglandin-H sintetasas (PHSs), está expresada de forma relativamente alta
durante los períodos embrionario y fetal, por lo que se les atribuye la bioactivación
de proteratógenos (Figura 3), (Wells y col., 2005).
En algunos estudios se reduce la teratogenicidad de muchos compuestos
químicos compuestos al utilizar animales sin PHS (como ciclooxigenasa e
hidroperoxidasa), inhibidores de estas enzimas y atrapadores de radicales libres
(Wells y col., 2005).
Investigaciones recientes realizadas en conejos, sobre el mecanismo de
teratogenicidad de la talidomida ([+]--phtalimidoglutarimide), indican que ésta es
bioactivada por una peroxidasa, produciendo oxidación del ADN y el glutatión,
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indicando estrés oxidativo inducido por radicales libres. En contraste, en ratones
no se produce oxidación al ADN, incluso a concentraciones 300 % mayores que
las usadas en conejos, lo que explicaría la resistencia de esta especie a la
teratogénesis mediada por talidomida (Parman y col., 1999).
Figura 3. Activación de xenobióticos por las vías de la PHS y LPO. Durante la síntesis de
eicosanoides, las hidroperoxidasas pueden oxidar compuestos a radicales libres que
reaccionan directa o indirectamente con el O2 para producir ERO (Wells y col., 2005).
Las malformaciones que induce el etanol en las extremidades de varias especies
animales, han sido asociadas con la producción de radicales libres por su vía
metabólica (sistema de oxidación microsomal), así como la excesiva generación de
NADH y los disturbios en la cadena transportadora de electrones que éste provoca
(Chen y col., 2004).
Otros compuestos, también han sido objeto de estudio por inducir teratogénesis
mediante la producción de ERO como: fenitoína, benzo-a-pireno, cocaína, ácido
Prostaglandina H sintasa Lipooxigenasa
5-HPETE -OOH PPG2
PPH2 -OH
PHS
Hidroperoxidasa Hidroperoxidasa
5-HETE
Xenobiótico
Radical libre
intermediario
Estrés oxidativo
TERATOGÉNESIS
Fosfolípidos de membrana
Fosfolipasa A
Ácido araquidónico
Vía LPO Vía PHS
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valproico e hidroxiurea, entre otros (DeSesso y Goeringer, 1990a; DeSesso y
Goeringer, 1990b; DeSesso y col, 1994; Deeb y col., 2000; Wells y col., 2005).
1.5 HIDROXIUREA (HU)
1.5.1 Características generales
La hidroxiurea es un potente teratógeno que causa la muerte de células
embrionarias en proliferación e inhibe la síntesis de ADN. Se ha demostrado que
tiene actividad antineoplásica contra el sarcoma 180; se usa para tratar leucemia
granulocítica crónica, policitemia vera y trombocitosis esencial, además de que se
ha observado que tiene actividad contra el virus de la inmunodeficiencia humana y
el de la viruela. Su sitio de acción es la enzima reductasa de ribonucleótidos-
difosfato clase I (RRND-I), que cataliza la conversión de ribonucleótido a
desoxirribonucleótido necesario para la síntesis de ADN.
El mecanismo de acción de este fármaco consiste en la inhibición de un radical
libre tirosilo en el centro catalítico de la enzima y actúa específicamente en la fase S
del ciclo celular ocasionando la detención en la interfase G1-S (Figura 4), (Gao y
col., 1995; Hendricks y Mathews, 1998; Rodríguez y col., 1998; Hayashi y col.,
2003; Yan y Hales, 2005). Este tipo de enzima se encuentra en células de
mamíferos y se ha visto que el fármaco tiene diferentes efectos sobre los 4
desoxiribonucleótidos afectando más sobre la síntesis de adenina que a los de
citosina y guanina y por último al de timina (Hendricks y Mathews, 1998).
En investigaciones recientes, se ha observado que la HU es transformada
en NO∙. Al entrar en el organismo, la HU sería convertida a la hidroxilamina por
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medio de una ureasa, y en esta forma reaccionaría rápidamente con proteínas de
grupo “hemo” para producir el NO. Esta reacción ocurriría en el intestino, con la
intervención de bacterias, ya que los mamíferos no tienen este tipo de enzima
(Figura 5), (Cokic y col., 2003; King, 2003).
Figura 4. Mecanismo de acción de la hidroxiurea. Éste fármaco inhibe a la RRND-I,
que produce los desoxirribonucleótidos necesarios para la síntesis de ADN. El
fármaco es específico de la fase S del ciclo celular.
In vitro, se sabe que al hacer reaccionar HU con H2O y sulfato de cobre,
peroxidasa y hemoglobina, ésta se descompone a NO. In vivo, se sabe que esta
transformación también sucede, ya que se han detectado aductos como la nitroxil-
hemoglobina y nitroxil-hemoproteínas en hígados de raras tratadas con HU (Figura
5), (Jiang y col., 1997).
Se ha reportado que la HU también puede sufrir un proceso de peroxidación.
Una vez transformada en la hidroxilamina de HU, puede ser oxidada por una
lipoperoxidasa (LPO), por la peroxidasa/H2O y por el grupo tiroxilo de la RRND-1
para formar el correspondiente nitróxido (Figura 5), (Jiang y col., 1997; King, 2004).
Reductasa de
ribonucleótidos-difosfato I
ADN HIDROXIUREA
G1
S
G2
I ó G0
Ribonucleótido Desoxirribonucleótido
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Por último, en recientes investigaciones, se observó que el NO puede ser
producido por la oxidación de HU por la enzima catalasa en hígado de rata (Figura
5), (Huang y col., 2006).
Figura 5. Formación del NO y sus metabolitos, a partir de HU.
1.5.2 Inducción de teratogénesis mediada por HU
La HU es un potente teratógeno, entre 2 h y 4 h después de su administración
a hembras en gestación, causa un episodio rápido de muerte celular y una profunda
inhibición de la síntesis de ADN en los embriones. En estudios efectuados en
conejo la hidroxiurea causa una disminución rápida y pronunciada de la circulación
utero-placental y conduce a cambios cardiovasculares y hemorragia en los
embriones. Asimismo, los fetos presentan una disminución en el peso corporal,
Ureasa
bacteriana
H2N
O
NHOH NHOH
LPO
Peroxidasa/H2O
Tiroxilo de RRND-1
NO
In vivo
In vitro
H20 + CuSO4
Peroxidasa
Hemoglobina NO
∙
NO2∙
ONOO-
Catalasa
(hígado)
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malformaciones en las extremidades y adactilia, labio y paladar hendidos y
micrognatia (DeSesso y col., 1994; DeSesso, 1981).
En ratas se ha observado que incrementa el número de reabsorciones
embrionarias y, los fetos presentan malformaciones como paladar hendido,
ausencia del hueso del martillo, parte trasera del cuerpo mal posicionada, pérdida
de vértebras caudales y anomalías en tejido blando, entre otras (Chahoud y col.,
2002).
Figura 6. Fotografías de embriones de 11 días cuyas madres no tratadas y tratadas con
HU. En a, b, c se observan embriones de 11 días con un desarrollo normal. Los embriones del
grupo de HU (300mg/kg), presentaron defectos en cierre del tubo neural, proceso maxilar, arcos
branquiales y desarrollo de sistemas óptico, ótico y olfativo (d); así como interrupción en el giro
y falta de desarrollo de extremidades anteriores y posteriores (e), y alteraciones en la
circulación de saco vitelino (f). Las regiones mencionadas se señalan con flechas azules.
En estudios realizados en embriones de pollo in ovo, dosis de 800 g de HU
inducen malformaciones a nivel de extremidades (Iwama y col., 1983).
En estudios llevados a cabo in vivo e in vitro en ratón, la hidroxiurea provoca
excencefalia, focomelia, poli y sindactilia, fusión de algunos huesos del cráneo y
a b
d e
c
f
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esternebras, rotación incompleta y disminución de la circulación en vasos del saco
vitelino (Figura 6), (Warner y col., 1983; Herken, 1985; Platzek y Schwave, 1999;
Yan y Hales, 2005; Woo y col., 2006; Vázquez-Sánchez, 2006).
Se han investigado algunos antioxidantes y atrapadores de radicales libres
como: propil-galato, etoxiquina, ácido nordihidroguaiarético y D-manitol, que han
reducido la tasa de muerte y la incidencia de malformaciones en los embriones,
provocados por hidroxiurea. Ninguna de estas sustancias bloquea la inhibición de
la síntesis de ADN, pero sí detienen la muerte de células embrionarias inducida
por hidroxiurea indicando claramente, que ésta no es causada por ello. Esto
sugiere que el mecanismo de muerte celular está basado en la producción de
radicales libres y otras ERO (Figura 7), (Herken, 1985; DeSesso y Goeringer,
1990a; DeSesso y Goeringer, 1990b; DeSesso y col, 1994; Woo y col., 2006).
Figura 7. Formación de radicales libres hidroxilo a partir de la reacción química de
hidroxiurea con oxígeno en fluidos biológicos. a) Una molécula de HU reacciona con
el O2 y produce H2O2, que al reaccionar, b) con una segunda molécula de HU, da
lugar a la formación de radicales libres (DeSesso y col, 1994).
Por otro lado, en cultivos celulares se ha determinado la protección de: -
tocoferol, benzoato de sodio, ácido acetilsalicílico, catalasa, peroxidasa y
H2N
O
NHOH + O2
H2N
O
N=O + H2O2
H2N
O
N=O + H2O2
H2N
O
NHO˙ + ̇ OH +
a)
b) H2O
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superóxido dismutasa contra la toxicidad causada por hidroxiurea y se ha
observado que se presenta un efecto protector durante las primeras horas de
cultivo, sin embargo la mortalidad celular posterior es la misma en grupos tratados
con HU sola o en combinación con los agentes protectores (Przybyszewski y Malec
1982; Przybyszewski y col., 1987).
1.6 MECANISMOS DE PROTECCIÓN ANTIOXIDANTE
Las células y tejidos se encuentran en un estado estable de producción y
destrucción de ERO. En algunos organismos estos eventos son regulados por la
activación de sistemas que generan ERN y ERO. Sin embargo, las mismas
respuestas pueden ser generadas por factores ambientales. Si el incremento inicial
de ERO es relativamente pequeño, la respuesta antioxidante será suficiente para
compensarlo y regresar al estado de equilibrio basal (Figura 8), (Dröge, 2002).
Figura 8. Balance entre la producción de ERO y varios tipos de mecanismos antioxidantes. En
las sustancias antioxidantes se incluyen las enzimas. En un estado normal en el que se
producen cantidades bajas de sustancias oxidantes, los sistemas antioxidantes del organismo
tienen la capacidad de destruirlas y mantener el equilibrio entre su producción-degradación
(Modificado de Dröge, 2002).
Generación
de ERO Proteínas Aminoácidos
(Baja reactividad pero
alta concentración)
(Alta reactividad pero
baja concentración)
Sustancias
antioxidantes
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La capacidad de los agentes antioxidantes (GSH, ácido cafeico, vitaminas,
ácidos fólico y pantenoico), quelantes de hierro (desferoxamina), atrapadores de
radicales libres (tiourea, D-manitol), y enzimas antioxidantes (catalasa, SOD), para
reducir el daño oxidativo macromolecular y la teratogenicidad causada por diversos
compuestos, les confiere un papel crítico en los mecanismos de teratogénesis
(DeSesso y col., 1994; Deeb y col., 2000; Araújo y col., 2001; Chen y col., 2004;
Dawson y col., 2006). Además de ello, la variación interindividual en los niveles de
los antioxidantes embrionarios y de las actividades de enzimas antioxidantes
particulares son una determinante importante en el riesgo teratogénico (Wells y col.,
2005).
1.6.1 Protección antioxidante contra agentes teratógenos
Entre las enzimas más importantes con función antioxidante se pueden contar
la SOD, la catalasa y la GSH-peroxidasa. La SOD convierte al -O2 en H2O2,
mientras que la catalasa y la GSH-peroxidasa son las encargadas de transformar el
H2O2 en agua (Figura 4), (Mason y Chignell, 1982; Dröge, 2002). Estas enzimas son
la forma de control más importante de las células, ya que su actividad es mucho
mayor en comparación con sistemas no enzimáticos (Figura 8), (Dröge, 2002).
Compuestos como el EUK-134, tienen un mecanismo que mimetiza al de las
enzimas mencionadas, ha sido utilizado para proteger a ratones de las
malformaciones en extremidades producidas por el etanol (Chen y col., 2004). La
catalasa disminuye la mortalidad temprana de células tratadas con hidroxiurea
(Przybyszewiski y col., 1982).
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Los agentes antioxidantes, quelantes y atrapadores de radicales libres aunque
presentan poca actividad se encuentran en grandes cantidades en la células (Figura
8). Muchos agentes atrapadores de radicales libres han sido utilizados para
contrarrestar los daños provocados por sustancias que al entrar en el organismo,
son bioactivados a este tipo de compuestos. La -feni-L-t-butilnitrona, revirtió la
teratogenicidad inducida con talidomida a conejos (Parman y col., 1999). La
vitamina E, uno de los más potentes antioxidantes fisiológicos, ha sido usada para
proteger de las malformaciones provocadas por fármacos como el ácido valproico y
la hidroxiurea (Przybyszewiski y col., 1987; Deeb y col., 2000).
Diversas sustancias que poseen propiedades antioxidantes y atrapadoras de
radicales libres pueden ayudar a proteger a los embriones de daños provocados por
ERO y ERN, una de ellas es la c-ficocianina, una proteína que proviene de diversas
especies de cianobacterias como Spirulina (Romay y col, 1998a; Bhat y Madyastha,
2000; Estrada y col, 2001; Bhat y Madyastha, 2001; Vázquez-Sánchez, 2006).
1.7 Spirulina
1.7.1 Características
Spirulina es una cianobacteria filamentosa multicelular que contiene del 60 % al
71 % de proteína cruda, lo cual la hace una excelente fuente de proteínas, en
comparación con el maíz, el arroz y la soya. Esta cianobacteria crece en aguas
volcánicas con pH alcalino y se tienen registros de su existencia que datan desde
hace aproximadamente 3.5 mil millones de años. Su estructura celular es de forma
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espiral y similar a la de los procariotes simples (Figura 9), (Ciferri, 1983; Becker,
1983; Campanella y col., 1999).
En 1940 el fisiólogo francés Dangeard describió que la población nativa africana,
que vivía en las inmediaciones del lago Chad, consumía un alga microscópica en
forma de panes llamados dihé. Veinticinco años después el botánico J. Leonard,
confirmó que el dihé estaba constituido por masas secas de Spirulina platensis,
colectada de los lagos alcalinos de la zona. Al mismo tiempo, un grupo francés
investigaba otra especie de la cianobacteria, Spirulina maxima, que crecía en el
lago de Texcoco, cerca de la Ciudad de México. La literatura histórica reveló que
ésta era cosechada, secada y consumida por los indígenas con el nombre de
Tecuitlat, costumbre que desapareció después de la conquista española (Ciferri,
1983).
Figura 9. Alga Spirulina. a) Micrografía electrónica del alga Spirulina sp. (Ceferri, 1983), b)
micrografía electrónica coloreada (mx.encarta.msn.com/Algas_verdeazuladas.htmL).
a) b)
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Su consumo como fuente de alimentación es uno de los mejor documentados.
Las especies de Spirulina más utilizadas para consumo humano, son S. platensis y
S. maxima; su producción rebasa las mil toneladas métricas anuales. Esta alga
crece en muchas regiones del mundo incluyendo a México (Ciferri, 1983; Dillon y
col., 1995; Khan y col., 2005).
En diversos estudios relacionados con su composición química y
nutrimental, se ha observado que Spirulina es una fuente importante de proteínas,
vitaminas, aminoácidos y ácidos grasos esenciales, minerales, compuestos
fenólicos y otros constituyentes con beneficios potenciales para la salud como la c-
ficocianina y calcio spirulan. (Campanella y col., 1999; Belay, 2002; Chamorro y
col., 2002; Mendes y col., 2003).
Spirulina spp posee actividades biológicas y farmacológicas que han sido
reportadas por muchos autores y que se encuentran resumidas en revisiones
hechas por: Belay y col., (1993, 2002), Chamorro y col., (1996, 2002, 2008), y
Khan y col., (2005). Muchas de estas propiedades han sido relacionadas o
atribuidas principalmente a su capacidad antioxidante mediante la destrucción de
ERO y ERN (Hayashi y col., 1993; Romay y col., 1998b; Torres-Durán, y col.,
1998; González y col., 1999; Torres-Durán, y col., 1999; Reddy y col., 2000; Hong-
Quan y col., 2001; Bhat y Madyastha, 2001; Pardhasaradhi y col., 2003; Teas y
col., 2004; Torres-Durán, y col., 2006), (Tabla 3).
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Tabla 3. Actividades farmacológicas reportadas para el alga Spirulina y algunos de sus
componentes.
Efecto Referencias
Antialérgico Cingi y col., 2008; Mao y col., 2005; Remirez y col., 2005; Remirez y col.,
2002a
Antiartrítica Remirez y col., 1999
Antibacterial Mendiola y col., 2007; Ozdemir y col., 2004; Varga y col., 2002
Anticancerígeno Chen y col., 2008; Roy y col., 2007; Wang y col., 2007; Li y col., 2006; Li y
col., 2005; Subhashini y col., 2004; Pardhasaradhi y col., 2003; Reddy y
col., 2003; Bobbili y col., 2003; Schwartz y Shklar, 1987
Anticoagulante Hsiao y col., 2005; Yamamoto y col., 2005; Kaji y col., 2002
Antigenotóxica Chamorro y col., 2007; Premkumar y col., 2004; Ruiz y col., 2003;
Prenkumar y col., 2001
Antihipertensivo Mascher y col., 2006; Suetsuna y Chen, 2001
Antiinflamatoria Dartsch., 2008; Cherng y col., 2007; Remirez y col., 2002c; Romay y col.,
2001; Reddy y col., 2000; González y col., 1999; Romay y col., 1998a;
Romay y col., 1998b
Antioxidante Bermejo-Bescós y col., 2008; López-Alarcón, y col., 2007; Mendiola y col.,
2007; Wang col., 2007; Huang y col., 2006; Ge y col., 2006; Wu y col.,
2005; Bhat y Madyastha, 2001; Estrada y col., 2001; Kaushik y col., 2001;
Bhat y Madyastha, 2000; Romay y col., 1998a
Antitóxica
Misbahuddin y col., 2006; Jeyaprakash and Chinnaswamy, 2005; Sharma
y col., 2005; Saxena and Kumar, 2004; Sánchez y col., 2003; Upasani y
Balaraman, 2003
Antiviral Lee y col., 2007; Rahman y col., 2005; Teas y col., 2004; Lee y col., 2001;
Hayashi y col., 1993
Hepatoprotectora Karadeniz y col., 2008; Torres-Durán y col., 2006; Sathyasaikumar y col.,
2007; Wu y col., 2005; Blé-Castillo y col., 2002; Remírez y col., 2002b;
Vadiraja y col., 1998; Bhat y col., 1998
Hipocolesterolemiante Park y col., 2008; Torres-Duran y col., 2007; Riss y col., 2007; Nagaoka y
col., 2005
Inhibe la producción
del TNF- y NO
Romay y col., 2001
Inmunoestimulante Løbner y col., 2008; Del Valle y col., 2008; Watanuki y col., 2006
Nefroprotectora Avdagić y col., 2008; Khan y col., 2006; Sharma y col., 2007; Farooq y
col., 2006; Farooq y col., 2005; Farooq y col., 2004a; Farooq y col.,
2004b; Sharma y col., 2004
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Tabla 3. Actividades farmacológicas reportadas para el alga Spirulina y algunos de sus
componentes (continuación).
Efecto Referencias
Neuroprotectora Wang y col., 2005; Stromberg y col., 2005; Gemma y col., 2002; Rimbau y
col., 1999
Nutricional Simsek y col., 2008; Simpore y col., 2006; Simpore y col., 2005
Quimio y
radioprotectora
Hong-Quan, 2001
Otras Voltarelli y col., 2008; Kim y col., 2008; Karaca y Simsek, 2007;
Madhyastha y col., 2006; Ishimi y col., 2006
1.7.2 Actividad antioxidante del alga Spirulina
La actividad antioxidante de diversos componentes de Spirulina ha sido objeto
de numerosas investigaciones. Piñero y col. (2001), observaron que las
ficobiliproteínas que el alga contiene (ficocianina, aloficocianina y ficoeritrina), son
potentes atrapadores de radicales libres e inhiben la peroxidación lipídica y
demostraron que la actividad antioxidante de las proteínas juntas es mayor que
cuando están puras.
Además de estas proteínas, Spirulina cuenta con numerosos componentes
como: flavonoides, fenoles, vitaminas C y E, -caroteno y glutatión en su forma
reducida (GSH), cuyas propiedades antioxidantes ya han sido estudiadas en el alga
(Jeyaprakash y Chinnaswamy, 2005; Saxena y Kumar, 2004; Miranda y col., 1998).
1.7.3 C-ficocianina
La c-ficocianina es una ficobiliproteína, soluble en agua, que se puede obtener
de diferentes especies de algas verde-azules o cianobacterias, como Spirulina sp
(agua dulce), Phormidium sp (agua salada), y Lyngbya sp (agua salada), en las que
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se encuentra en una concentración muy alta en comparación con otros pigmentos
que contienen. La c-ficocianina es una proteína compuesta por dos subunidades:
(~17 KDa) y (~18 KDa). En su estructura se encuentra un cromóforo tetrapirrólico
de cadena abierta (ficocianobilina), unido covalentemente a la apoproteína, una
molécula a la subunidad y dos a la (Figura 10). Esta proteína sirve como fuente
de nitrógeno en condiciones desfavorables para las células y como un transmisor de
la energía luminosa, proveniente del Sol, a los cloroplastos en la célula (Patel y col.,
2005; Yoshida y col, 1996; Zhang y Chen, 1999; Herrera y col, 1989; Boussiba and
Richmond, 1980 y 1979; Berns y col., 1962).
La c-ficocianina posee propiedades antioxidantes (Bermejo-Bescós y col., 2008;
Huang y col., 2006; Estrada y col, 2001; Romay y col, 1998a), como atrapadora de
radicales libres (Bhat y Madyastha, 2001; Bhat y Madyastha, 2000), inhibidora
selectiva de la ciclooxigenasa-2 (COX-2), (Reddy y col., 2000; González y col.,
1999; Romay y col., 1998b), e inhibidora de la producción del factor de necrosis
tumoral-alfa (TNF-) y del NO (Romay y col., 2000). En realidad, muchos de los
efectos de Spirulina están o han sido relacionados a esta proteína.
La propiedad de atrapador de radicales libres de la c-ficocianina fue establecida
en estudios en los cuales se probó su reactividad con radicales peroxilo, hidroxilo y
superóxido; y se sugirió que el efecto estaba dado por el grupo cromóforo, pero
después se observó que su actividad era mayor que la de la ficocianobilina,
sugiriéndose que algunos residuos de tirosina y triptofano podrían tener
interacciones con los radicales y así aumentar su actividad (Bhat y Madyastha, 2001
y 2000). Asimismo, se ha evidenciado su efecto protector contra los daños al ADN
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(rompimiento de hebras), producidos por el ONOO-, en forma dependiente de la
dosis (Bhat y Madyastha, 2001).
Figura 10. C-ficocianina. a) Estructura tridimensional de la c-ficocianina (Wang y col., 2003), b)
estructura química y tridiensional de los tetrapirroles de cadena abierta de la c-ficocianina
(Kunk, 2003).
1.7.4 Actividad antigenotóxica del alga Spirulina
Se han publicado varios trabajos de investigación en los que se evidencia el
papel de Spirulina en la protección contra el daño genotóxico causado por diversos
agentes como: ciclofosfamida (Chamorro-Cevallos y col., 2007), ciclofosfamida y
mitomicina-c (Premkumar y col., 2001), ciclofosfamida y radiación con 60Co-
(Hong-Quan y col., 2001), y rayos-X (Klingler y col., 2002), y rayos- (Quishen y col.,
1989), hidracida maleica (Ruiz y col., 2003), y cisplatino y uretano (Premkumar y
col., 2004).
b)
a)
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En las investigaciones realizadas por Premkumar y col. (2001 y 2004), se
relacionó la protección del alga contra los efectos genotóxicos de los compuestos
cisplatino, uretano, ciclofosfamida y mitomicina-C, con sus propiedades
antioxidantes por medio de la medición de los niveles de GSH y peróxidos lipídicos
y la actividad de enzimas como: glutatión peroxidasa (GPx), glutatión-S-transferasa
(GST), superóxido dismutasa (SOD), y catalasa.
Por otro lado, Ruiz y col. (2003), propusieron que la protección contra la
hidracida maleica estaba dada por diversos componentes del alga, tales como:
clorofilina, -caroteno, ácido palmítico, glucanos y luteína, conocidos compuestos
antigenotóxicos.
Por último, Hong-Quan y col. (2001), además de relacionar el efecto protector de
Spirulina a sus propiedades antioxidantes, también lo hicieron a su efecto como
estimulador de la proliferación celular, actividad atribuida a un polisacárido
encontrado en la membrana del alga.
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2. JUSTIFICACIÓN
Las malformaciones congénitas representan una de las primeras de causas de
mortalidad infantil a nivel mundial. En México, se ubican como la segunda causa. Lo
anterior hace necesaria la búsqueda de sustancias que puedan ser incorporadas
como parte de la dieta y que ayuden a la prevención de anormalidades en el
desarrollo al interferir con los mecanismos por los cuales dichas sustancias
provocan sus efectos tóxicos.
Spirulina maxima es una cianobacteria que ha sido utilizada desde épocas
prehispánicas por sus propiedades nutricionales y presenta una actividad
importante como antioxidante, La cual se ha atribuido principalmente a su extracto
proteico, el cual presenta una cantidad importante de la ficobiliproteína c-ficocianina.
Asimismo, ambas sustancias han sido utilizadas para proteger contra los efectos de
varios compuestos y agentes genotóxicos. Por otro lado los mecanismos por los
que la hidroxiurea causa toxicidad son la generación de radicales libres, especies
reactivas de oxígeno y la inhibición de la síntesis de ADN. Por esta razón se desea
determinar si Spirulina maxima y el extracto de c-ficocianina son capaces de
proteger de los efectos teratogénicos, citotóxicos y genotóxicos provocados por la
hidroxiurea.
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3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL
Estudiar el efecto de Spirulina maxima y del extracto de c-ficocianina contra la
teratogenia y genotoxicidad producidas por hidroxiurea.
3.2 OBJETIVOS PARTICULARES
Obtener e identificar el extracto de c-ficocianina a partir del alga Spirulina
maxima.
Determinar si Spirulina maxima puede proteger contra la teratogénesis producida
por hidroxiurea en un modelo murino in vivo.
Investigar si el efecto protector de Spirulina máxima y el extracto de c-ficocianina
puede deberse a su actividad antioxidante.
Observar si Spirulina maxima y el extracto de c-ficocianina protegen de la muerte
celular inducida con HU a cultivos primarios de fibroblastos de embriones
completos de ratón de 11 días, así como de sus primordios y encéfalo, antes y
después de la 24 h de iniciado el cultivo.
Establecer los efectos de Spirulina máxima y el extracto de c-ficocianina sobre la
genotoxicidad provocada por hidroxiurea en ratones gestantes y sus productos.
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4. HIPÓTESIS
Si S. maxima y el extracto de c-ficocianina son capaces de bloquear los
mecanismos por los cuales la hidroxiurea produce teratogenicidad, citotoxicidad y
genotoxicidad, (inhibición de la síntesis de ADN y producción de radicales libres y
especies reactivas de oxígeno), entonces podrán proteger el desarrollo
embrionario, a las células en cultivo y al ADN de los efectos tóxicos de la
hidroxiurea.
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5. MATERIAL Y METODOS
5.1 OBTENCIÓN DEL EXTRACTO C-FICOCIANINA
El extracto de c-ficocianina se obtuvo del alga Spirulina maxima mediante el
siguiente procedimiento: un gramo del alga (base seca) se resuspendió en 10 mL
de solución amortiguadora de fosfatos (PBS), pH 7.2 (NaCl, 8.0 g/L; KCl, 0.2 g/L;
Na2HPO4, 2.9 g/L y KH2PO4, 0.8 g/L), y se mantuvo en la oscuridad a 4 °C
durante 16 h. El extracto crudo se centrifugó a 13 000 rpm x 2 y a 35 000 rpm x 2
durante 15 min y 30 min, respectivamente, a 4 °C. En ambos casos se eliminó el
precipitado que contenía los restos celulares (color verde), y se utilizó el
sobrenadante que contenía la c-ficocianina (color azul).
El extracto clarificado, que se obtuvo de la ultracentrifugación, se dializó en
solución de fosfatos 0.01 M a 4 °C, en oscuridad, utilizando una membrana de 12
000 Da de poro durante 5 días, al término de los cuales fue liofilizado.
Alícuotas de 30 μl del extracto clarificado-dializado, sobrenadantes y
precipitados de los extractos clarificado y crudo, c-ficocianina (SIGMA®), y
marcador de peso molecular SIGMAMARKER (SIGMA®), se corrieron en una
electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida al 10 % (SDS-PAGE). El
gel se preparó como se indica en la tabla 4.
Para determinar la concentración de la c-ficocianina en las diferentes muestras,
se hicieron lecturas en un espectrofotómetro de UV a 620 nm, 650 nm y 280 nm y
se calculó el coeficiente “r” (que indica de forma relativa cuanta c-ficocianina hay en
la muestra, es decir, su pureza), utilizando las siguientes fórmulas (Pádula y col.,
1996):
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r = 620 / 280
Cc-ficocianina = (166 x 620) – (108 x 650)
r = índice de pureza de c-ficocianina en la muestra
280 = Absorbancia a una longitud de onda de 280 mn
620 = Absorbancia a una longitud de onda de 620 mn
650 = Absorbancia a una longitud de onda de 650 mn
Tabla 4. Composición del SDS-PAGE al 10 %.
Componentes Gel
concentrador (mL)
Gel
separador (mL)
Acrilamida 2.12 0.50 Amortiguador 1.35 0.41
TEMED 0.005 0.003 Agua milliQ 1.47 2.1
Persulfato de amonio
(PSA) al 10% 0.05 0.03
Nota: SDS-PAGE al 10 % permite caracterizar las proteínas de 10 000 a 100 000 Da de peso molecular que
conforman el extracto clarificado.
Asimismo, se obtuvo el espectro ultravioleta (UV), del extracto, con la finalidad
de corroborar su presencia en el mismo por medio de la máxima longitud de onda
de absorción, que en el caso de la c-ficocianina es de aproximadamente 620 nm.
5.2 ANIMALES Y ACOPLAMIENTOS
Para todos los experimentos se utilizaron ratones machos y hembras de la cepa
ICR, de 25 ± 2 g de peso, los cuales se aclimataron durante un período de 14 días,
bajo condiciones de temperatura y humedad controladas; así como un ciclo de luz-
oscuridad de 12 h (iluminación a las 9 h), alimento y agua ad libitum. Las hembras
se dispusieron a razón de 3/jaula y los machos 1/jaula (por separado).
Una vez concluido el período de aclimatación se procedió a realizar los
acoplamientos, para lo cual se colocaron los machos con las hembras durante dos
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horas, antes del inicio del ciclo de luz, al término de las cuales se regresaron los
machos a sus jaulas y se verificó el acoplamiento mediante la presencia del tapón
espermático en la vagina de las hembras. Las hembras que presentaron el tapón
fueron separadas del resto, se pesaron y distribuyeron aleatoriamente en los
diferentes grupos para los estudios correspondientes.
5.3 ESTUDIO DE TERATOGÉNESIS
Las animales gestantes se distribuyeron aleatoriamente en 7 grupos, de 10
animales cada uno, con diferentes tratamientos (Tabla 5).
Tabla 5. Tratamientos a los que se sometieronlos diferentes grupos.
Grupo Tratamiento Concentración
(mg/kg) Días de
administración Día de
sacrificio 1 Vehículo -------------- 0-10 11
2 HU (SIGMA®) 300 8 11
3 Solución de tween 80 -------------- 0-10 11
4 S. maxima 1000 0-10 11
5 HU* (300mg/kg) + S.
maxima
100 0-10 11
6 500 0-10 11
7 1000 0-10 11
La HU se administró sólo el día 8, una hora después de Spirulina. El agua y la solución de
tween 80 se administraron vía oral del día 0 al 10. El tween 80 se utiliza para suspender
Spirulina en agua. Spirulina y la HU se administraron vía oral e i.p., respectivamente.
Las hembras se sacrificaron el día 10 de la gestación, de acuerdo a Warner y
col. (1983), y se explantaron los embriones de la siguiente manera: se realizó un
corte en “V” en la región abdominal de la hembra, se retiraron los cuernos uterinos
y se obtuvieron los embriones con sus diferentes cubiertas embrionarias. Se
limpiaron del trofoblasto y determinó la frecuencia cardiaca embrionaria y el
diámetro (DSV), y vascularidad del saco vitelino (VSV). Posteriormente, se
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retiraron las membranas vitelina y amniótica, se midieron en los embriones las
longitudes coronilla-grupa (LCG), y cefálica (LC), además se evaluó el desarrollo
morfológico con base en la escala de calificación propuesta por Brown y Fabro en
1981. Únicamente se evaluaron los embriones que presentaron latido cardiaco.
Los que tuvieron 1 ó más diferencias en el desarrollo se consideraron anormales y
se registraron las alteraciones por tipo y localización.
5.4 ESTUDIO DE PEROXIDACIÓN LIPÍDICA Y
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
El estudio de peroxidación lipídica se realizó mediante la cuantificación de
TBARS; para ello, se obtuvieron 6 embriones de cada una de 5 hembras
gestantes de los grupos 1, 2, 3, 4, 5 y de 2 grupos adicionales tratados con el
extracto de c-ficocianina e HU (Tabla 6).
Tabla 6. Tratamientos a los que se sometieron los grupos adicionales para el estudio de
TBARS y la cuantificación de proteínas.
Grupo Tratamiento Concentración
(mg/kg)
Días de
administración
Día de
sacrificio
8 Extracto de c-ficocianina 400 0-10 11
9 HU* (300mg/kg) +
extracto de c-ficocianina 400 0-10 11
La HU sólo se administró i.p. el día 8, una hora después del extracto de c-ficocianina vía oral.
Se limpió a los embriones de sus cubiertas embrionarias y se colocaron a razón
de 6 en 2 mL de solución reguladora de fosfatos (PBS), pH 7.4, se sonicaron y se
realizó la prueba de TBARS en 1 mL de la suspensión. Con la suspensión restante
se realizó la cuantificación de proteínas por el método de Bradford (1976). Con los
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resultados de ambos métodos se cuantificó el contenido de MDA, en los embriones
de acuerdo a Paniagua-Castro y col. (2008).
5.5 CULTIVOS PRIMARIOS DE CÉLULAS EMBRIONARIAS DE
EMBRIONES COMPLETOS, ENCÉFALO Y PRIMORDIOS DE
EXTREMIDADES ANTERIORES
Los cultivos celulares fueron realizados a partir de embriones explantados de
11 días de gestación. Para la explantanción se siguió el mismo procedimiento que
en el estudio de teratogénesis in vivo pero en condiciones asépticas. Los úteros se
colocaron en PBS-antibiótico (100:1), pH de 7.2, se abrieron y sacaron los
embriones con su trofoblasto mismos que se transfirieron a otra caja petri con PBS.
Se les retiraron el trofoblasto y el saco vitelino y nuevamente se transfirieron a otra
caja petri con PBS limpio. Una vez ahí los embriones fueron seccionados de la parte
cefálica, desde el diencéfalo hasta el mielencéfalo, evitando tomar parte de las
vesículas ópticas y óticas (Figura 11). También se utilizaron los primordios de las
extremidades delanteras los cuales fueron cortados desde su base (Figura 11).
Embriones completos, la parte cefálica y primordios fueron transferidos, por
separado, a matraces Erlenmeyer con 10 mL de una solución de PBS-tripsina
(250:1), y se mantuvieron en agitación por 15 min. Pasado ese tiempo, se
adicionaron 3 mL de medio de cultivo Ham F12-DMEM modificado, complementado
con suero y antibiótico (100:10:1.5), (medio Ham F12-DMEM), para neutralizar la
tripsina. La suspensión celular se filtró con tela de nylon de aproximadamente 0.25
m de porosidad y se centrifugó a 800 rpm durante 10 min. El sobrenadante se
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decantó y las células fueron resuspendidas en 3 mL de medio de cultivo Ham F12-
DMEM. La viabilidad y concentración celulares fueron evaluadas mediante la
técnica de exclusión de azul de tripano en una cámara de Neubauer.
Figura 11. Fotografías de embriones de 11 días en las que se muestran las partes de los
embriones que se utilizaron para el cultivo primario de células. a) Parte del encéfalo y b)
primordios de extremidades delanteras.
Con las suspensiones celulares se sembraron microplacas de 96 pozos, con
una concentración celular de 10000 células por pozo, en un volumen final de 100 l,
para determinar el efecto citotóxico de S. máxima, el extracto de c-ficocianina e HU
y el efecto protector de S. máxima y el extracto de c-ficocianina contra la
citotoxicidad producida por HU. De todas las placas se hicieron cultivos simultáneos
para 4 tiempos de medición (2h, 4h, 24h y 48h). Las microplacas fueron incubadas
por 4 h a 37 °C, en atmósfera al 5 % de dióxido de carbono (CO2), y humedad.
5.5.1 Pruebas de citotoxicidad para S. maxima, el extracto de c-
ficocianina e HU
Después de 4 h de incubación, a las microplacas se les retiró el medio de
cultivo Ham F12-DMEM y se reemplazó por medio fresco en todos los pozos,
a b
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excepto en aquellos cuya células fueron tratadas con S. máxima, el extracto de c-
ficocianina o HU, en los que se adicionó el medio con las diferentes
concentraciones de estos (Figura 12, Tabla 7).
Figura 12. Diseño de la microplaca utilizado para la determinación de la a) CL50 y b) del
efecto protector del alga o el extracto sobre la citotoxicidad producida por HU.
Las placas se incubaron por 48 h más, durante las cuales se leyeron en un
espectrofluorómetro a los tiempos de 2 h, 4 h, 24 h y 48 h, para ello, se adicionaron,
30 min antes, 20 l de una solución del colorante resasurina al 0.015%. El estudio
se realizó por cuadruplicado para cada tratamiento.
Tabla 7. Concentraciones de S. maxima, extracto de c-ficocianina e HU a las que se sometió a
las células de los diferentes cultivos.
Concentraciones S. máxima/ extracto de c-
ficocianina (mg/mL)
HU
(mM)
Concentraciones S. máxima/ extracto de c-
ficocianina (mg/mL)
HU
(mM)
1 16 2.0 5 1 0.12
2 8 1.0 6 0.5 0.06
3 4 0.5 7 0.25 0.03
4 2 0.25 8 0.125 0.015
b) a)
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5.5.2 Determinación del efecto protector de S. máxima y el
extracto de c-ficocianina sobre la citotoxicidad producida por HU
Una vez que se cumplieron 4 h de iniciado el cultivo, se retiró el medio y se adicionó
otro fresco a todos los pozos, excepto a los tratados con S. máxima, a los que se
les agregaron suspensiones y soluciones con las diferentes concentraciones del
alga y el extracto, respectivamente, y se incubaron por otras 24 h. Pasado este
tiempo, se retiró el medio y se adicionó nuevo a todos los pozos, excepto a los
tratados con hidroxiurea a los que se les agregó medio con el fármaco a una
concentración de 0.5 mM (Figura 12). La placa se mantuvo en incubación 48 h más,
durante las cuales se tomaron lecturas en un espectrofluorómetro a los tiempos de
2 h, 4 h, 24 h y 48 h, utilizando el colorante resasurina (0.015%). El estudio se
realizó por cuadruplicado para cada tratamiento.
5.6 DETERMINACIÓN DEL EFECTO PROTECTOR DE S. maxima
Y EL EXTRACTO DE C-FICOCIANINA SOBRE LA GENOTOXICIDAD
PRODUCIDA POR HU
Para la determinación del efecto de S. máxima y el extracto de c-ficocianina
sobre la genotoxicidad inducida con hidroxiurea se utilizaron hembras acopladas,
las cuales fueron distribuidas en 11 grupos de 2 animales cada uno (Tabla 8). Las
hembras se pesaron y sacrificaron el día 19 de la gestación y se explantaron los
fetos de la siguiente manera: se realizó un corte en “V” a la hembra en la región
abdominal, se retiraron los cuernos uterinos y se obtuvieron los fetos con su
placenta y saco vitelino. Se retiraron la placenta y el saco vitelino; se limpiaron,
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sexaron, midieron, pesaron y verificaron malformaciones externas en los fetos. La
placenta también se limpió, midió y pesó.
A 3 fetos machos y 3 hembras de cada madre, se les realizó un corte en el
cuello para preparar dos frotis sanguíneos de cada uno. A la madre se le realizó un
corte en la cola para hacer frotis. Todos fueron fijados en metanol, durante 10 min, y
teñidos con el colorante de Giemsa para el recuento de micronúcleos.
Se contaron los eritrocitos micronucleados (EMN), en un total de 10000
eritrocitos totales (ET), los eritrocitos policromáticos micronucleados (EPCMN), en
1000 eritrocitos policromáticos (EPC), y finalmente los EPC en 1000 ET.
Tabla 8. Tratamientos a los que se sometieron los diferentes grupos para el estudio de
genotoxicidad.
Grupo Tratamiento Agua Agua + Tween
80
Spirulina (mg/kg)
Extracto de c-ficocianina
(mg/kg) HU
(300 mg/kg)
100 500 1000 100 200 400
1 Testigo X
2 Tween 80
X
3 Hidroxiurea
X
4 Spirulina
X
5
Spirulina + HU
X
X
6
X
X
7
X X
8 Extracto de c-ficocianina
X
9
Extracto de c-ficocianina + HU
X X
10
X X
11
X X
La HU se administró i.p., sólo el día 16, una hora después de Spirulina y del extracto. El agua y
la solución de tween 80 se administraron vía oral del día 10 al 18. El tween 80 se utiliza para
suspender Spirulina en agua. Spirulina y el extracto se administraron del día 10 al 18, vía oral.
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5.7 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
El análisis estadístico de las variables DSV, LCG, LC del número de somitas y
calificación morfológica, se realizó con ANOVA de una vía y se utilizó la prueba de
Tukey en los casos en los que se observó diferencia significativa. Las
anormalidades y su frecuencia se analizaron por medio de las pruebas de chi-
cuadrada (2), y exacta de Fisher. Asimismo, el análisis estadístico de TBARS,
proteínas y micronúcleos se realizó con ANOVA de una vía y se utilizó la prueba de
Tukey, cuando se presentó diferencia significativa. Para el análisis de los resultados
de los cultivos celulares las lecturas de unidades relativas de fluorescencia (URF),
fueron transformadas en porcentajes y después en valores paramétricos por medio
del arco-seno de la razón del porcentaje en fracciones de uno. La variación entre las
concentraciones fue determinada por una ANOVA bifactorial de una vía y se aplicó
la prueba de Tukey cuando se encontró diferencia significativa.
En todos los casos la diferencia significativa se determinó con una probabilidad
menor al 0.05 (p < 0.05), y todo el análisis se realizó con los programas Microsoft
Excel 2003® y Sigma Stat® Statistical Software versión 2.03.
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6. RESULTADOS
6.1 EXTRACTO DE C-FICOCIANINA
Una vez que se obtuvo el extracto, se procedió a realizar los cálculos para
determinar la concentración de c-ficocianina y su pureza, las cuales fueron de 172.9
± 0.013 g/mL y 2.21, respectivamente.
Mediante la SDS-PAGE al 10 %, se comprobó la presencia de la c-ficocianina
en las muestras del extracto clarificado-dializado. En la figura 13 sólo se muestra la
SDS-PAGE para la c-ficocianina (SIGMA®), el extracto clarificado y el extracto
clarificado dializado, con un marcador de peso molecular (Sigmamarker-Sigma®).
Figura 13. SDS-PAGE al 12 %. En los círculos se observan las áreas en las que se encontraba la
c-ficocianina.
El espectro de UV del extracto de c-ficocianina, también confirmó su presencia,
obteniéndose un pico máximo de absorción de 620.74 (Figura 14).
C-ficocianina
(SIGMA)Extracto de c-ficocianinaMarcador de peso
molecular (Kda)
C-FICOCIANINA
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Figura 14. Espectro UV del extracto de c-ficocianina. Señalado con la línea verde se observa el
pico máximo de absorción del extracto, el cual corresponde al reportado para c-ficocianina.
6.2 ESTUDIO DE TERATOGÉNESIS
6.2.1 Grupo testigo de agua
De los 152 embriones procedentes de 10 hembras, 150 fueron viables y se
analizaron, encontrándose que 4 presentaban anormalidades como: retraso en el
desarrollo de extremidades, falta de cierre del tubo neural e interrupción en el giro,
mientras que los otros tenían un desarrollo normal. Se observó que de las 10
camadas evaluadas, en 2 se presentaron defectos en el desarrollo y los promedios
de DSV, CR y LC fueron parecidos a los de otros grupos (Tablas 9, 10 y figuras 15 y
16).
6.2.2 Grupo testigo de tween 80
El tween 80 se utilizó para poder suspender S. maxima en agua, por lo que se
consideró necesario tener un grupo testigo de este agente tensoactivo. De los 161
449.7 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 701.6
0.06
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
2.8
3.06
nm
A
620.74
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embriones, procedentes de 10 hembras, 158 fueron viables y se analizaron,
encontrándose que 3 presentaban anormalidades en el desarrollo parecidas a las
del grupo testigo y los promedios de DSV, LCG y LC fueron parecidos a los de otros
grupos (Tablas 9 y 10 y figura 15).
6.2.3 Teratogenicidad in vivo de S. maxima
En las tablas 9 y 10 se observa que S. maxima no produjo alteraciones en el
desarrollo embrionario a la concentración utilizada para el estudio. Al comparar
parámetros como el DSV, LCG y LC, no se observan diferencias, tampoco en la
viabilidad y mortalidad embrionarias, ni en el número de camadas afectadas con
respecto al testigo. Solo los sacos vitelinos de los embriones cuyas madres
recibieron S. maxima presentaron mayor vascularización con vasos de mayor
diámetro (Figuras 15 y 16).
6.2.4 Teratogenicidad in vivo inducida con hidroxiurea
En el grupo tratado con HU se observó una disminución en la viabilidad y
calificación morfológica. Hubo aumento en el número y tipo de alteraciones en el
desarrollo embrionario, en el DSV, LCG, LC y en las camadas afectadas. De los 159
embriones explantados, 85 no eran viables y 53 presentaban defectos (Tablas 9 y
10). Entre las alteraciones observadas se encuentran falta de cierre de tubo neural y
de los procesos nasal y mandibular, falta de desarrollo en las extremidades,
interrupción en el giro. En la mayoría de los casos el tubo neural caudal estaba
cerrado pero no había fusión de pliegues. En su parte posterior (metencéfalo), el
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cerebro presentaba un neuroporo abierto y en las partes media y posterior
(mesencéfalo y telencéfalo), los pliegues neurales estaban formados pero no se
habían cerrado. También los procesos nasal y maxilar estaban separados y el
mandibular presentaba barras branquiales sin fusionar. En los primordios de
extremidades anteriores no se observaba la parte distal diferente y en algunos casos
no se formaba la paleta, mientras que en las posteriores solo se presentaban las
yemas. Por último se observaron diferencias significativas en el puntaje morfológico
y en el contenido de proteína (Figuras 15 y 16).
6.2.5 Efecto de S. maxima sobre la teratogénesis inducida con
HU
En los grupos tratados simultáneamente con S. maxima e HU se observó una
disminución en la mortalidad embrionaria y en el número de camadas afectadas
(Tabla 9). Asimismo, se presentaron defectos en el desarrollo en 23, 9 y 7 embriones
de los grupos tratados con HU y 100 mg/kg, 500 mg/kg y 1000 mg/kg de S. maxima
respectivamente. La vascularización del SV y su circulación se incrementaron. Los
vasos del SV de estos embriones fueron más gruesos, similar a los del grupo que
sólo recibió S. maxima. El número de embriones afectados disminuyó con respecto
al grupo de HU. Sin embargo, en el grupo de 100 mg/kg de S. maxima + HU se
observaron algunos de los defectos encontrados en el grupo tratado con HU, y al
realizar el análisis estadístico se observaron diferencias significativas con respecto al
testigo. Asimismo se observó que los valores de puntaje morfológico y contenido
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proteico no presentaron diferencia con respecto a los del testigo negativo (Tablas 9 y
10 y figuras 15 y 16).
Tabla 9.- Parámetros generales que muestran el efecto de S. maxima sobre la teratogénesis in
vivo inducida por HU en ratón.
Grupo Tratamiento
(mg/kg)
Hembras (madres)
Embriones
Total Con
embriones anormales
Total Implantes muertos
No viables
Viables Anormales
1 Agua 10 4b 152 3 10b 142b 5b
2 Tween 80 (0.005%)
10 2b 161 3 3b 158b 3b
3 HU 300 10 8 152 4 74 78 53
4 Spirulina 1000
10 1b 148 2 0b 148b 2b
5 Spirulina 100 + HU
10 4b 150 3 3b 147b 23
6 Spirulina 500 + HU
10 2b 149 5 4b 145b 9b
7 Spirulina 1000 + HU
10 1b 157 3 5b 152b 7b
a diferencia estadística con los grupos 1 and 2.
b diferencia estadística con el grupo 3.
p ≤ 0.05. HU: Hidroxiurea (300mg/kg).
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Tabla 10.- Efecto de S. maxima sobre el grado de desarrollo embrionario in vivo en embriones
cuyas madres fueron tratadas con HU.
Grupo Tratamiento
(mg/kg)
Parámetros embrionarios
DSV LCG LC Puntaje morfológico
Número de
somitas
Contenido de
proteínas (mg)
1 Agua 4.69 ± 0.03
4.38 ± 0.03
2.19 ± 0.03
60.11 ± 0.03b
39.78 ± 0.16
291.77 ± 0.43b
2 Tween 80 (0.005%)
4.67 ± 0.04
4.36 ± 0.05
2.14 ± 0.04
60.29 ± 0.21b
39.75 ± 0.12
290.87 ± 0.52b
3 HU 300 4.57 ± 0.03
4.32 ± 0.03
2.18 ± 0.03
55.15 ± 0.75
39.68 ± 0.13
261.26 ± 0.87
4 Spirulina 1000 4.68 ± 0.03
4.34 ± 0.03
2.25 ± 0.03
60.42 ± 0.04b
39.76 ± 0.11
285.96 ± 0.64b
5 Spirulina 100 + HU
4.61 ± 0.03
4.34 ± 0.04
2.23 ± 0.03
60.23 ± 0.02b
39.79 ± 0.10
288.25 ± 0.43b
6 Spirulina 500 + HU
4.65 ± 0.03
4.29 ± 0.03
2.19 ± 0.02
60.22 ± 0.03b
39.75 ± 0.12
293.72 ± 0.32b
7 Spirulina 1000 + HU
4.72 ± 0.03
4.36 ± 0.03
2.24 ± 0.03
60.37 ± 0.04b
39.78 ± 0.09
311.04 ± 0.15a, b
a diferencia estadística con los grupos 1 and 2.
b diferencia estadística con el grupo 3.
p ≤ 0.05. HU: Hidroxiurea (300mg/kg).
DSV: diámetro del saco vitelino; LCG: longitud coronilla-grupa; LC: longitud cefálica.
El puntaje morfológico se evaluó de acuerdo a la escala de calificación de Brown y Fabro
(1981).
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Figura 15. Comparación de los grupos testigo (fila a), tween 80 (fila b), HU (fila c), y S. maxima
(fila d). Los grupos testigo, tween 80 y S. maxima presentaron un desarrollo normal, mientras
que en el de HU se pudieron observar varios tipos de alteraciones en el desarrollo. En la fila c se
observan las alteraciones que ocasionó la HU, la figura de la izquierda corresponde al saco
vitelino en el cual se observa una disminución de la vascularidad del SV, en las 2 siguientes, la
falta de cierre del tubo neural, y en la última, el retraso en el desarrollo de los procesos
mandibular y maxilar. Las flechas señalan las partes en las que la HU indujo defectos en el
desarrollo.
a)
b)
c)
d)
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Figura 16. Comparación de los grupos testigo (fila a), HU (fila b), S. maxima (1000 mg/kg), (fila
c), y S. maxima (1000 mg/kg), + HU (fila d). Los grupos testigo y S. maxima presentaron un
desarrollo normal, mientras que en el de HU se pudieron observar varios tipos de afecciones. En
la fila b se observan las alteraciones que ocasionó la HU, la figura de la izquierda corresponde a
la falta de cierre del tubo neural y de desarrollo en las extremidades delanteras, la segunda a la
interrupción en el giro y la última al retraso en el desarrollo de los procesos mandibular y
maxilar. Al administrar S. maxima a grupos tratados con hidroxiurea, se observó que ésta
previno sus efectos teratogénicos. Las flechas señalan las partes en las que la HU indujo defectos
en el desarrollo.
a)
b)
c)
d)
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6.3 DETERMINACIÓN DE LA PEROXIDACIÓN LIPÍDICA Y
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
El contenido de proteínas en los embriones cuyas madres fueron tratadas con
HU fue menor que en el resto de los grupos. Por otro lado, se observó que en los
animales tratados con la dosis más alta de Spirulina (1000 mg/kg), así como con el
extracto de c-ficocianina (400 mg/kg), el contenido de proteína fue mayor incluso al
de los testigos (Tabla 10). En la figura 17 se observa el contenido embrionario de
MDA. Los niveles de la peroxidación lipídica fueron mayores en el grupo de HU, con
respecto a todos los demás. Los grupos tratados solamente con Spirulina y el
extracto de c-ficocianina, presentaron un contenido de MDA mayor que los testigos.
Finalmente, los animales tratados con el alga y el extracto más la HU tuvieron
concentraciones menores incluso que los testigos.
Figura 17. Contenido embrionario de malondialdehído. a Diferencia significativa con el grupo HU;
b Diferencia significativa con los grupos testigos de agua y de tween 80;
c Diferencia significativa con los grupos Spirulina y extracto de c-ficocianina. p ≤ 0.05.
HU: hidroxiurea (300mg/kg); Spirulina (1000mg/kg); extracto de c-ficocianina (400mg/kg)
0
50
100
150
200
250
300
nM
MD
A/m
g p
rote
ína
a, b, c
a a
a, b
a, ba, b, c
Testigo agua
Testigo tween
HU Spirulina Extracto de c-ficocianina
Spirulina+ HU
Extracto de c-ficocianina
+ HUTratamientos
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6.4 DETERMINACIÓN DE LA CITOTOXICIDAD DE S. maxima, EL
EXTRACTO DE C-FICOCIANINA E HU EN CULTIVOS PRIMARIOS DE
CÉLULAS EMBRIONARIAS DE EMBRIONES COMPLETOS,
ENCÉFALO Y PRIMORDIOS DE EXTREMIDADES ANTERIORES
Para determinar la citotoxicidad de Spirulina y del extracto de c-ficocianina, se
utilizaron 8 diluciones geométricas a partir de 16 mg/mL y hasta 0.125 mg/mL. Se
observó que ninguna de las 8 concentraciones probadas fue tóxica para las células
del cultivo primario en ninguno de los tiempos de medición e incluso que las células
a las que se les adicionaron las concentraciones más altas del alga y el extracto
presentaron un incremento en su proliferación y viabilidad (Figura 18).
En la determinación de la citoxicidad para la HU se utilizaron 8 diluciones
geométricas a partir de 2.0 mM y hasta 0.015 mM. Se observó que las 8
concentraciones utilizadas de HU fueron tóxicas para los tres tipos de células de
los cultivos primarios, en todos de los tiempos de medición. A las 48 h de
exposición sólo las células de encéfalo expuestas a concentraciones menores a
0.25 mM de HU, presentaron un incremento en la viabilidad, llegando a alcanzar
porcentajes como los del testigo sin HU (Figura 19).
6.5 DETERMINACIÓN DEL EFECTO PROTECTOR DE S.
maxima Y EL EXTRACTO DE C-FICOCIANINA SOBRE LA
CITOTOXICIDAD PRODUCIDA POR HU
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Para el estudio se seleccionó una concentración de 0.25 mM de HU, la cual fue
probada contra las 8 concentraciones de Spirulina y el extracto de c-ficocianina.
Como se observa en las figuras 20 y 21, tanto Spirulina como el extracto de
ficocianina presentaron un efecto protector en forma dependiente de la
concentración para todos los cultivos primarios. Sin embargo, dicha protección fue
más evidente en las células de los primordios. Asimismo, las concentraciones que
mejores efectos tuvieron, fueron las mayores a 1 mg/mL en tiempos de 24 h y 48 h.
Figura 18. Determinación del efecto citotóxico de Spirulina y el extracto de c-ficocianina para
cultivos primarios de encéfalo. En la figura superior a), se observa el efecto que tuvo Spirulina
sobre la viabilidad celular, a las 2 h, 4 h, 24 h y 48 h, de exposición. En la figura inferior b), se
presentan los resultados para el extracto de c-ficocianina. ECF.- Extracto de c-ficocianina.
80.00
90.00
100.00
110.00
120.00
130.00
140.00
2h
4h
24h
48h
0 0.125 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0 Spirulina (mg/ml)
Viab
ilida
d (%
)
a)
80.00
90.00
100.00
110.00
120.00
130.00
140.00
2h
4h
24h
48h
0 0.125 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0 ECF (mg/ml)
Viab
ilida
d (%
)
b)
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Figura 19. Determinación del efecto citotóxico de la HU para cultivos primarios. En las figuras
superior a), central b), e inferior c), se observa el efecto que tuvo la HU sobre la viabilidad
celular, a las 2 h, 4 h, 24 h y 48 h, de exposición, para los cultivos de células de embriones
completos, encéfalos y primordios, respectivamente.
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
2h
4h
24h
48h
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
2h
4h
24h
48h
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
2h
4h
24h
48h
0 0.015 0.03 0.06 0.12 0.25 0.50 1.00 2.00
0 0.015 0.03 0.06 0.12 0.25 0.50 1.00 2.00
0 0.015 0.03 0.06 0.12 0.25 0.50 1.00 2.00
HU (Mm)
HU (Mm)
HU (Mm)
Via
bili
dad
(%
)V
iab
ilid
ad (
%)
Via
bili
dad
(%
)
a)
b)
c)
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Figura 20. Determinación del efecto protector del extracto de c-ficocianina sobre la
citotoxicidad producida por HU. En las figuras superior a), central b), e inferior c), se observa
el efecto que tuvo el extracto de c-ficocianina sobre la citotoxicidad producida por HU, a las 2
h, 4 h, 24 h y 48 h, de exposición, para los cultivos de células de embriones completos, de
primordios y encéfalos, respectivamente. Spirulina (mg/mL). HU.- hidroxiurea (0.25mM).
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
140.00
160.00
180.00
200.00
2h
4h
24h
48h
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
140.00
160.00
180.00
200.00
2h
4h
24h
48h
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
140.00
160.00
180.00
200.00
2h
4h
24h
48h
Via
bili
dad
(%
)V
iab
ilid
ad (
%)
Via
bili
dad
(%
)
T HU Spirulina 0.125 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0Spirulina + HU
T HU Spirulina 0.125 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0Spirulina+ HU
T HU Spirulina 0.125 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0Spirulina + HU
a)
b)
c)
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Figura 21. Determinación del efecto protector del extracto de c-ficocianina sobre la
citotoxicidad producida por HU. En las figuras superior a), central b), e inferior c), se observa
el efecto que tuvo el extracto de c-ficocianina sobre la citotoxicidad producida por HU, a las 2
h, 4 h, 24 h y 48 h, de exposición, para los cultivos de células de embriones completos, de
primordios y encéfalos, respectivamente. ECF.- Extracto de c-ficocianina (mg/mL). HU.- hidroxiurea (0.25mM).
a)
b)
c)
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
140.00
160.00
180.00
200.00
2h
4h
24h
48h
Via
bili
dad
(%
)
T HU ECF 0.125 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0ECF + HU
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
2h
4h
24h
48h
Via
bili
dad
(%
)
T HU ECF 0.125 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0ECF+ HU
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
140.00
160.00
180.00
200.00
2h
4h
24h
48h
Via
bili
dad
(%
)
T HU ECF 0.125 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0ECF + HU
a)
b)
c)
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6.6 DETERMINACIÓN DEL EFECTO PROTECTOR DE S. maxima
Y EL EXTRACTO DE C-FICOCIANINA SOBRE LA GENOTOXICIDAD
PRODUCIDA POR HU
Los resultados de este estudio muestran que tanto las madres como los fetos
de los grupos testigos de agua, tween 80, Spirulina y el extracto de c-ficocianina,
presentan una cantidad relativamente baja de EMN comparados con el número de
ET, así como de los EPCMN en un total de 1000 EPC. Por otro lado, la cantidad de
EPC en 1000 ET, si varió de las madres a los fetos, encóntrandose que en las
primeras el promedio de EPC era de 100-120, y en los fetos se encontraba en
valores de 700-800 EPC, aproximadamente, en un total de 1000 ET.
En general, todos los grupos tratados con HU presentaron un aumento en la
cantidad de EMN y EPCMN y una disminución, que sólo fue significativa en el caso
de las madres, de los niveles de EPC. Sin embargo, en los grupos que recibieron
Spirulina y el extracto de c-ficocianina, además de la HU, se observó una
disminución de los EMN y los EPCMN, y un aumento en los EPC, en una forma
dependiente de las dosis (Tablas 11 y 12).
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Tabla 11.- Efecto de S. maxima y del extracto de c-ficocianina sobre la genotoxicidad in vivo en
fetos cuyas madres fueron tratadas con HU.
GRUPO TRATAMIENTOS
PROMEDIO ± EE
EMN/
10000 ET
EPCMN/
1000 EPC
EPC/
1000 ET
1 Agua 29.39 ± 7.3 7.1 ± 1.3 825.48 ± 70.2
2 Tween 80 (0.005%) 30.45 ± 10.11 6.3 ± 0.95 837.4 ± 100.5
3 HU 300 349.3 ± 37.4 34 ± 7.4 705.43 ± 103.1
4 Spirulina 1000 24.6 ± 6.7 5.2 ± 1.23 840.62 ± 74.89
5 Spirulina 1000 + HU 217.94 ± 48.1 28.2 ± 7.3 760 ± 56.8
6 Spirulina 500 + HU 250.33 ± 40.8 27.3 ± 5.43 758.1 ± 48.9
7 Spirulina 100 + HU 275.4 ± 50.4 22.1 ± 6.32 765.3 ± 45.67
8 C-ficocianina (400) 27.83 ± 8.4 4.5 ± 1.42 832.3 ± 57.93
9 C-ficocianina (100) +
HU 207.9 ± 50.43 25.89 ± 7.4 743.17 ± 62.5
10 C-ficocianina (200) +
HU 235.2 ± 30.82 27.32 ± 6.24 758.7 ± 54.7
11 C-ficocianina (400) +
HU 250.22 ± 60.31 24.6 ± 9.25 779.34 ± 57.34
n=6 a
diferencia estadística con los grupos 1 and 2. b
diferencia estadística con el grupo 3.
p ≤ 0.05. HU: Hidroxiurea (300mg/kg).
EMN: eritrocitos micronucleados; EPCMN: eritrocitos policromáticos micronucleados; EPC:
eritrocitos policromáticos; ET: eritrocitos totales.
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Tabla 12.- Efecto de S. maxima y el extracto de c-ficocianina sobre la genotoxicidad in vivo en
hembras gestantes tratadas con HU.
GRUPO TRATAMIENTOS
PROMEDIO ± EE
EMN/
10000 ET
EPCMN/
1000 EPC
EPC/
1000 ET
1 Agua 77.8 ± 3.83 12.6 ± 1.34 124.2 ± 3.98
2 Tween 80
(0.005%) 83.3 ± 5.42 10.4 ± 2.07 122.5 ± 4.52
3 HU 300 322.2 ± 21.04 29 ± 2.78 85.2 ± 7.38
4 Spirulina 1000 67.6 ± 5.4 8.8 ± 1.85 129.2 ± 6.44
5 Spirulina 100 +
HU 283.4 ± 25.3 26.4 ± 4.5 98.71 ± 10.2
6 Spirulina 500 +
HU 244.9 ± 35.6 20.3 ± 4.38 105.8 ± 8.44
7 Spirulina 1000 +
HU 198.24 ± 28.9 13.5 ± 6.3 118.4 ± 6.34
8 C-ficocianina
(400) 72.5 ± 9.1 9.3 ± 2.14 128.5 ± 5.33
9 C-ficocianina
(100) + HU 205.3 ± 34.6 15.3 ± 6.43 117.9 ± 7.95
10 C-ficocianina
(200) + HU 267.4 ± 42.7 25.2 ± 7.22 102.8 ± 11.7
11 C-ficocianina
(400) + HU 298.42 ± 34.86 21.8 ± 3.9 118.3 ± 5.49
n=5 a
diferencia estadística con los grupos 1 and 2. b
diferencia estadística con el grupo 3.
p ≤ 0.05. HU: Hidroxiurea (300mg/kg). EMN: eritrocitos micronucleados; EPCMN:
eritrocitos policromáticos micronucleados; EPC: eritrocitos policromáticos; ET: eritrocitos
totales.
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7. DISCUSIÓN
Spirulina es una cianobacteria que ha sido utilizada en México desde tiempos
prehispánicos como alimento o como suplemento alimenticio (Ciferri., 1983). Se
sabe que tiene un contenido importante de proteínas, vitaminas, minerales,
aminoácidos y ácidos grasos esenciales que la hacen una excelente fuente
nutricional (Campanella y col., 1999; Mendes y col., 2003). Asimismo, se le han
atribuido diversas propiedades farmacológicas, la mayoría de las cuales están
dadas o se relacionan a la actividad antioxidante de algunos de sus componentes,
como las ficobiliproteínas (Pardhasaradhi y col., 2003; Reddy y col., 2003;
Madhyastha y col., 2006). Al respecto, Piñero y col. (2001), y Bermejo y col.,
(2008), demostraron que la actividad antioxidante del extracto proteico de Spirulina
está dada principalmente por la c-ficocianina, pero que dicha actividad no mejora
significativamente si la proteína se encuentra pura.
En el presente estudio se obtuvo un extracto proteico que contiene c-
ficocianina, cuyo coeficiente r es muy similar al que describieron Piñero y col.
(2001), para la fracción proteica que presenta la misma actividad antioxidante que
la c-ficocianina pura (2.22 vs 2.16 de Piñero y col., 2001). Por medio de la SDS-
PAGE y del espectro UV se demostró que la c-ficocianina es la principal proteína
en el extracto.
Las dosis utilizadas para los estudios in vivo con Spirulina se eligieron en
base a diversos trabajos en los que se reporta que dosis de 100 mg/kg, 500 mg/kg
y 1000 mg/kg, del alga presentan actividad antioxidante (Kaushik y col., 2001;
Upasani y Balaraman, 2003; Dartsch., 2008). Para el extracto de c-ficocianina se
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utilizaron las dosis de 100 mg/kg, 200 mg/kg y 400 mg/kg, mismas que ya habían
sido probadas con anterioridad (Vázquez-Sánchez, 2006). Asimismo, se ha
demostrado que, tanto Spirulina como el extracto de c-ficocianina son agentes que
tiene mayor efecto cuando se utilizan como profilácticos que cuando se
administran al mismo tiempo o después del agente tóxico (Rimbau y col., 1999;
Gemma y col., 2002; Farooq y col, 2004a; Farooq y col, 2004b; Stromberg y col.,
2005; Farooq y col, 2006), por esta razón, ambos se administraron durante varios
días antes a la exposición a HU.
Para evaluar el efecto protector de Spirulina sobre el desarrollo embrionario,
la viabilidad de cultivos primarios y la genotoxicidad, se eligió el agente
teratogénico y genotóxico HU, ya que uno de sus mecanismos de acción se asocia
a la producción de radicales libres y especies reactivas del oxígeno.
Las malformaciones congénitas están ubicadas entre las principales causas
de mortalidad infantil a nivel mundial (OMS, 2008), por los que se hace necesario
evaluar diversas sustancias que puedan ser incorporadas como parte de la dieta,
con el conocimiento de que su consumo puede prevenir o proteger contra el daño
causado por una gran variedad de xenobióticos.
La HU es un fármaco que ha sido utilizado para diversos tipos de
padecimientos, entre los que se pueden destacar: cáncer, enfermedades virales,
anemia falciforme y policitemia vera (Gao y col., 1995; Hendricks y Mathews,
1998; Rodríguez y col., 1998; Hayashi y col., 2003; Yan y Hales, 2005). Sin
embargo, a pesar de ser tan útil, es un reconocido agente teratogénico y
genotóxico (Warner y col., 1983; Herken, 1985; DeSesso y Goeringer, 1990a;
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DeSesso y Goeringer, 1990b; DeSesso y col, 1994; Platzek y Schwave, 1999;
Valovicová y Gávelová, 2004; Yan y Hales, 2005; Woo y col., 2006).
Se ha observado que, después de 2 h de haber sido administrada, la HU
causa episodios rápidos de muerte celular en tejidos en proliferación o en
embriones de animales como ratones, ratas y conejos (Scott y col., 1971;
DeSesso, 1981; DeSesso y col., 1994; Yan y Hales, 2005; Woo y col., 2006).
Dependiendo de la edad gestacional de los productos se pueden presentar
alteraciones en el desarrollo de diversos órganos.
En el presente estudio se observaron todas las alteraciones en el desarrollo
reportadas por Warner y col. (1983), en casi el 50% de los embriones de ratón de
11 días, cuyas madres fueron administradas con HU i.p. el día 8 de la gestación.
Ellos incluyeron: falta de cierre del tubo neural, retardo en el desarrollo de
extremidades, rotación incompleta y retraso en el desarrollo de los procesos
mandibular, maxilar y branquial y de las vesículas óticas y ópticas. Cabe
mencionar que no todos los productos presentaron el mismo tipo, número y grado
de daño, y no todas las camadas fueron afectadas. Asimismo, en este grupo se
presentó el mayor número de productos muertos, lo que pudiera ser interpretado
como algo normal, ya que la HU provoca una profunda inhibición de la síntesis de
ADN en los embriones que los lleva a la muerte.
Al administrar Spirulina a las hembras gestantes, que también recibieron una
dosis de HU, se observó que disminuyó la mortalidad embrionaria y se previnieron
las alteraciones en el desarrollo provocadas por HU. En los grupos de 500 mg/kg y
1000 mg/kg del alga, que fueron administrados además con HU, se encontró que
el número de embriones muertos y con alteraciones fue prácticamente igual al del
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grupo testigo. Sin embargo, en el grupo que sólo recibió Spirulina a una
concentración de 100 mg/kg, la mortalidad no mostró diferencias significativas con
respecto al testigo, pero el número de embriones con alteraciones en el desarrollo
fue estadísticamente mayor, igual al grupo tratado únicamente con HU. Lo anterior
podría indicar que el efecto protector del extracto de Spirulina está en función de la
dosis empleada. El diámetro del saco vitelino en los tres grupos fue menor que en
el grupo de HU y la vascularización que presentaban era muy parecida al de los
grupos tratados sólo con el extracto (vasos con mayor diámetro).
Con la finalidad de elucidar el mecanismo de protección, se realizó la prueba
de TBARS, para la determinación del grado de peroxidación lipídica por medio de
la cuantificación de MDA. Lo anterior, con base en algunos estudios en los que se
ha demostrado que la inhibición de la síntesis del ADN no explica la rápida muerte
celular inducida por HU, por ello se ha planteado, como un mecanismo alternativo,
que el grupo hidroxilamina (-NHOH), en la HU, es capaz de reaccionar con el O2
para producir H2O2 que después es transformado en ∙OH, para así producir el
efecto tóxico (Herken, 1985; DeSesso y col. 1994; Woo y col., 2006). Así, la
muerte celular temprana provocada por HU, podría ser prevenida por el efecto
antioxidante de Spirulina. Esta hipótesis, además sería soportada por los trabajos
en los que sustancias como el propil-galato, la etoxiquina, el ácido
nordihidroguaiarético y el D-manitol, han reducido la tasa de muerte y la incidencia
de alteraciones en el desarrollo en los embriones expuestos a hidroxiurea. Hasta
donde se sabe, ninguna de estas sustancias bloquea la inhibición de la síntesis de
ADN, pero sí detienen la muerte de células embrionarias inducida por hidroxiurea
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indicando claramente que ésta no es causada por ello (DeSesso y Goeringer,
1990a; DeSesso y Goeringer, 1990b; DeSesso y col, 1994).
El contenido de MDA en los embriones expuestos a HU y Spirulina, hace
suponer que algunos de los componentes antioxidantes del alga como: fenoles,
vitaminas C y E, -caroteno, glutatión reducido y las ficobiliproteínas (Miranda y
col., 1998; Saxena and Kumar, 2004; Jeyaprakash and Chinnaswamy, 2005),
podrían estar involucrados en la disminución del MDA; sin embargo, en el grupo
expuesto al extracto de c-ficocianina se observa un mejor efecto antioxidante, lo
que indicaría que es esta proteína la que más participación tiene en el mismo.
Esto podría deberse a que el contenido de c-ficocianina en el extracto es mucho
mayor que en Spirulina, ya que está concentrada. La ficocianina, una proteína
formada por dos subunidades con varios tetrapirroles de cadena abierta y gran
cantidad de residuos de tirosina y triptófano en su superficie, que poseen una
actividad muy grande como atrapadores de radicales libres (Bhat y Madyastha,
2000 y 2001), estaría en la posibilidad de reaccionar con radicales peroxinirito y
otras ERN y ERO, que son generadas por el metabolismo de la HU en el
organismo (Jiang y col., 1997; Cokic y col., 2003; King, 2003). Sumado a esto,
Romay y col. (1998), observaron que la c-ficocianina actúa como un atrapador de
radicales lipídicos como el MDA.
Por otro lado, se observó que el contenido de MDA en el grupo que sólo
recibió Spirulina, fue significativamente mayor que en los grupos testigos, este
efecto nunca había sido reportado para Spirulina. El mecanismo involucrado en
dicho efecto no es claro; sin embargo, podría ser que la especie de Spirulina
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utilizada (S. máxima), tuviera algunas sustancias que pudieran reaccionar con el
ácido tiobarbitúrico de forma inespecífica y dar como resultado un incremento en
la cantidad de MDA cuantificado (Thomas y col., 1997). Lo anterior, ya que
Spirulina no indujo ninguna alteración en el desarrollo embrionario ni en los
parámetros de las hembras gestantes y si redujo el contenido de MDA en los
embriones de las madres expuestas a la HU. Por otro lado, el extracto de c-
ficocianina presentó una disminución significativa de los niveles de MDA con
respecto a los grupos testigos, tanto sólo como en combinación con HU.
Los cultivos celulares se hicieron de embriones completos, encéfalos y
primordios de extremidades anteriores debido a que en la mayoría de los trabajos
publicados sobre teratogénesis provocada por HU, tanto la parte cefálica del tubo
neural, como las extremidades anteriores son las más afectadas (Scott y col.,
1971; DeSesso, 1981; DeSesso y col., 1994; Yan y Hales, 2005; Woo y col.,
2006). Asimismo, los tiempos de lectura se establecieron en base a los reportes
que indican que entre las 2 y las 4 horas, después de una administración única por
vía intraperitoneal a animales gestantes, la HU causa un episodio rápido de
muerte celular embrionaria (DeSesso y col., 1994), durante las primeras 24 h, en
células expuestas al fármaco, se presenta un deceso de cerca del 20 % de la
población y que pasadas las 24 h de cultivo muere más del 80 % de las células en
cultivo (Przybyszewski y Malec 1982; Przybyszewski y col., 1987).
Como se pudo observar ni Spirulina, ni el extracto de c-ficocianina,
produjeron efectos tóxicos en las células de ninguno de los tres tipos de cultivos
primarios y, por el contrario, en las concentraciones más altas (>1 mg/mL), hubo
un incremento en la proliferación y la viabilidad celulares, el cual fue mayor en el
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extracto que en el alga. Lo anterior puede ser explicado por las propiedades
nutricionales de Spirulina (Cases y col., 2002; Planes y col., 2002; Simpore y col.,
2006) y por el alto contenido de proteína del extracto, comparado con el alga
completa.
Por otro lado, los cultivos que fueron expuestos a HU presentaron
sensibilidades diferentes al fármaco, las cuales podrían ser atribuidas a la tasa de
proliferación celular de cada cultivo, ya que la HU tiene mayores efectos tóxicos
sobre las células en proliferación (DeSesso y col., 1994), y a los 11 días de edad
los primordios se encuentran en proliferación más que en diferenciación y por el
contrario las células del encéfalo se encuentran en período de diferenciación al
igual que muchas otras células del embrión completo (Brown y Fabro, 1981).
DeSesso y Goeringer (1990), demostraron que la muerte celular no era causada
por la inhibición de la síntesis de ADN. El mecanismo de muerte celular en este
caso incluiría la reacción de la HU al interior de las células para producir ERO
como el ∙OH, el cual sería responsable de la muerte celular. Algunos reportes
indican que la muerte de las células puede ser prevenida por la presencia de
antioxidantes hasta las 24 h pos-exposición (Przybyszewski y Malec, 1982;
Przybyszewski y col., 1987).
En el estudio del efecto protector de Spirulina y el extracto de c-ficocianina se
observó que concentraciones de ambos, mayores a 1 mg/mL, continuaron
protegiendo hasta las 48 h de exposición a HU. Esto se podría explicar por
algunas interacciones entre la HU o sus metabolitos, como el NO, con los residuos
de tirosina y triptófano que la c-ficocianina tiene en su superficie (Bhat y
Madyastha, 2001).
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En los resultados del estudio de genotoxicidad se observó que tanto las madres
como los fetos de los grupos testigos de agua, tween 80, Spirulina y el extracto de c-
ficocianina, presentaron valores normales en las cantidades de EMN, EPCMN y EPC
(Gómez-Meda y col., 2004). Lo que confirma, lo reportado en la bibliografía, que ni
Spirulina completa, ni su extracto proteico, son genotóxicos (Hong-Quan y col., 2001;
Premkumar y col., 2001; Klingler y col., 2002; Ruiz y col., 2003; Premkumar y col.,
2004; Chamorro-Cevallos y col., 2007).
Asimismo, el efecto genotóxico de la HU se observó en todos los grupos cuyas
madres recibieron el fármaco, comparados con los grupos testigos. Se ha reportado
que la HU es un agente genotóxico que induce la formación de micronúcleos
(Shimizu y col., 1998; Tanaka y Shimizu, 2000), dicho efecto se observó con el
aumento en la cantidad de EMN y EPCMN, en madres y fetos. En cuanto al efecto
citotóxico del fármaco, sólo se encontró una disminución de los niveles de EPC en
las madres tratadas con el fármaco. En lo general, tanto en fetos como en las
madres se encontraron los mismos resultados, lo que nos indicaría que la HU puede
atravesar libremente la barrera placentaria y que el mecanismo por el cual ejerce sus
efectos podría ser el mismo para ambos. En los grupos que recibieron Spirulina y el
extracto de c-ficocianina, además de la HU, se observó un efecto protector por parte
de ambas y, al igual que en los estudios antes mencionados, la protección fue en
forma dependiente de la dosis. El daño al material genético, así como en general el
daño celular, podría deberse a la inhibición de la RRND-I y a la formación de
radicales libres, vía el metabolismo enzimático o no enzimático que tiene el fármaco
en el organismo (Herken, 1985; DeSesso y col. 1994; Woo y col., 2006), que
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estarían involucrados directamente en el daño al ADN (Medeiros, 2008), y la
formación de micronúcleos.
Así, la HU es uno de los teratógenos y genotóxicos más estudiados, ya que los
mecanismos por los que provoca el daño al material genético, e incluso la muerte
celular, implican una relación muy grande con la generación de estrés oxidativo en
las células. Cuando esto ocurre, se dan una serie de reacciones que llevan a la
oxidación de diversas macromoléculas como los ácidos grasos poliinsaturados
ubicados en las membranas celulares. Uno de los productos de estos procesos de
oxidación es el 4-HNE, un aldehído insaturado derivado de ácidos grasos de 6
carbonos. El 4-HNE tiene la característica de ser más estable que la mayoría de los
radicales libres, de esta forma, su paso a través de los compartimientos celulares es
relativamente fácil, una vez ahí, puede reaccionar con los grupos tioles y aminos de
una gran variedad de macromoléculas (Wu y Canderbaum, 2003; Schaur, 2003;
Zenteno y Saldaña, 2008). Una vez formados los aductos de proteínas, el 4-HNE,
interfiere con la activación de varias vías de señalización que pueden llevar a la
interrupción de los diferentes procesos celulares e incluso a la apoptosis
(Leonarduzzi y col., 2004). En el presente trabajo, se ha demostrado como la HU
puede, por medio de la generación de ERO, producir desde daño al material
genético, mediante la formación de micronúcleos, hasta la muerte célular, con las
consecuencias consiguientes en el desarrollo embrionario.
Por otro lado, también ha quedado demostrado como el uso de Spirulina
maxima y de su extracto proteico, que contiene a la c-ficocianina como principal
componente, no sólo no han causado alteración alguna en los animales/cultivos
celulares expuestos a ellas, sino que han sido efectivas en la prevención de los
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EFECTO DE LA Spirulina maxima CONTRA LA TERATOGENICIDAD Y GENOTOXICIDAD PRODUCIDAS POR HIDROXIUREA
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daños causados por la HU hasta el punto de que los animales que recibieron al
fármaco en combinación con el alga o su extracto proteico, presentaron una
reducción hasta valores semejantes a los de los testigos negativos de dichos
efectos.
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8. CONCLUSIONES
El componente principal del extracto proteico clarificado-dializado de Spirulina
maxima es la proteína c-ficocianina.
Spirulina maxima no produjo efectos tóxicos sobre el desarrollo embrionario
de ratones ICR a dosis de 100 mg/kg, 500 mg/kg y 1000 mg/kg y por el contrario,
los embriones de las madres tratadas con la cianobacteria presentaron un
incremento en tamaño y mayor vascularización del saco vitelino.
Spirulina maxima y el extracto de c-ficocianina no provocaron ni materno-
toxicidad, efectos citotóxicos, ni genotóxicos sobre los cultivos celulares y fetos
expuestos a ellas.
Las alteraciones encontradas en los embriones del grupo tratado con
hidroxiurea (falta de cierre del tubo neural, retardo en el desarrollo de
extremidades, rotación incompleta, retraso en el desarrollo de los procesos
mandibular, maxilar y branquial y disminución de la vascularidad del SV), y los
efectos citotóxicos en cultivos primarios, coinciden con los reportados en la
bibliografía, para una dosis de 300 mg/kg y una concentración de 0.25 mM,
respectivamente.
Los efectos genotóxicos de la HU se observaron con el aumento en la
cantidad de EMN y EPCMN, en hembras gestantes y sus productos, para una
dosis de 300 mg/kg.
Tanto Spirulina maxima como su extracto proteico, que contiene a la c-
ficocianina como principal componente, fueron efectivas en la prevención de los
daños causados por la HU, en los modelos de teratogénesis, genotoxicidad y
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citotoxicidad realizados en el presente esudio, en forma dependiente de la
dosis/concentración.
Con base en los resultados de la prueba de TBARS y la evidencia
bibliográfica se presume que el mecanismo de protección de Spirulina maxima
y su extracto proteico, sobre los efectos tóxicos causados por la HU en los
diferentes modelos, se deben principalmente a sus propiedades como
antioxidantes. Asimismo, se evidenció que la c-ficocianina fue el responsable
mayoritario de dicha actividad.
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B
I
B
L
I
O
G
R
A
F
Í
A
9. BIBLIOGRAFÍA
Araújo, M. C. P., Antunes, L. M. G. y Takahashi, C. S. (2001). Protective effect of
thiourea, a hydroxyl-radical scavenger, on curcumin-induced chromosomal
aberrations in an in vitro mammalian cell system. Teratogenesis, Carcinogenesis,
and Mutagenesis, 21: 175-180.
Avdagić, N., Cosović, E., Nakas-Ićindić, E., Mornjaković, Z., Zaciragić, A. y
Hadzović-Dzuvo, A. (2008), Spirulina platensis protects against renal injury in rats
with gentamicin-induced acute tubular necrosis, Bosnian Journal of Basic Medical
Sciences, 8 (4): 331-336.
Becker, E. W. (1983), Production and utilization of the bleu-green alga Spirulina in
India, Biomass, 4: 105-125.
Belay, A. (1993), Current knowledge on potential health benefits of Spirulina,
Journal of applied phycology 5: 235.
Belay, A. (2002), The potential application of Spirulina (Arthrospira) as a
nutritional and therapeutic supplement in health management, Journal of the
American Nutraceutical Association, 5 (2): 27-48.
Bermejo, P., Piñero, E. y Villar, A. (2008), Iron-chelating ability and antioxidant
properties of phycocyanin isolated from a protean extract of Spirulina platensis,
Food Chemistry, 110: 436-445.
Bermejo-Bescós, P., Piñero-Estrada, E. y Villar del Fresno, A. M. (2008),
Neuroprotection by Spirulina platensis protean extract and phycocyanin against
iron-induced toxicity in SH-SY5Y neuroblastoma cells, Toxicology in vitro, 22 (6):
1496-502.
Berns, D. S., Crespi, H. L. y Katz, J. J. (1962). Isolation, amino acid composition
and some physico-chemical properties of the protein deuterio-phycocyanin.
Chemistry Division, Argonne National Laboratory, Argonne Ill, 85: 8-14.
Bhat, V. B. y Madyastha, K. M. (2000). C-phycocyanin: a potent scavenger in vivo
and in vitro, Biochemical and Biophysical Research Communications, 275(1): 20-
25.
72
EFECTO DE LA Spirulina maxima CONTRA LA TERATOGENICIDAD Y GENOTOXICIDAD PRODUCIDAS POR HIDROXIUREA
B
I
B
L
I
O
G
R
A
F
Í
A
Bhat, V. B. y Madyastha, K. M. (2001). Scavenging of peroxinitrite by phycocyanin
and phycocyanobilin from Spirulina platensis: protection against oxidative damage
to DNA. Biochemical and Biophysical Research Comunications, 2858 (2): 262-
266.
Bhat, V. B., Gaikwad, W. y Madyastha, K. M. (1998), Hepatoprotective effect of c-
phycocyanin: protection for carbon tetrachloride and R-(+)-pulegone-mediated
hepatotoxicty in rats, Biochemical and Biophysical Research Comunications, 249:
228-231.
Binda, M. M., Molinas, C. R. y Koninkx, P. R. (2003). Reactive oxygen species and
adhesion formation. Human Reproduction, 18 (12), 2503-2507.
Blé-Castillo, J. L., Rodríguez-Hernández, A., Miranda-Zamora, R., Juárez-Oropeza,
M. A. and Díaz-Zagoya, J. C. (2002), Atrospira maxima prevents the acute fatty
liver induced by the administration of simvastatin, etanol and a
hypercholesterolemic diet to mice, Life sciences, 70: 2665-2673.
Boussiba, S., Richmond, A. E. (1979) Isolation and characterization of
phycocyanins from blue-green alga Spirulina platensis. Archives of Microbiology,
120: 155-159.
Boussiba, S., Richmond, A. E. (1980) C-phycocyanin as a storage protein in the
blue alga Spirulina platensis. Archives of Microbiology, 125: 143-147.
Bradford, M. M., (1976), A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding,
Annals of Biochemistry 72. 248-254.
Brown, N. A., Fabro, S. (1981). Quantitation of rat embryonic development in vitro:
a morphological scoring system. Teratology, 24: 65-78.
Campanella, L., Crescentini, G. and Avino, P. (1999), Chemical composition and
nutritional evaluation of some natural and commercial food products based on
Spirulina, Analusis, 27: 533-540.
Chahoud, I., Kuriyama, S. N. y Paumgartten, J. R. (2002), Maternal protein-and-
energy restriction reduces de developmental toxicity of cyclophosphamide and
hydroxyurea in rats. Toxicology. 179. 137-149.
73
EFECTO DE LA Spirulina maxima CONTRA LA TERATOGENICIDAD Y GENOTOXICIDAD PRODUCIDAS POR HIDROXIUREA
B
I
B
L
I
O
G
R
A
F
Í
A
Chamorro-Cevallos, G., Barrón, B. L., Vázquez-Sánchez, J. (2008), Toxicologic
studies and antitoxic properties of Spirulina, en Spirulina in human nutrition and
health, Editado por Gershwin, M. E. y Belay, A. Capítulo 2, CRC Press, USA, pp
27-50.
Chamorro, G., Salazar, M., (1990). Teratogenic study of Spirulina in mice.
Archivos Latinoamericanos de Nutrición, 40 (1): 86-94.
Chamorro, G., Salazar. M., Favila, L. y Bourges, H. (1996), Pharmacology and
Toxicology of Spirulina alga, Revista de investigación clínica, 48 (5): 389-399.
Chamorro, G., Salazar, M., Gomes, L. A. K., Pereira, D. S. C., Ceballos, G. y
Fabila, C. L. (2002), Actualización en la farmacología de Spirulina (Arthrospira),
un alimento no convencional, Archivos Latinoamericanos de Nutrición, 52 (3): 232.
Chamorro, G., Salazar, M., Salazar, S. (1989). Teratogenic study of Spirulina in
rats. Archivos Latinoamericanos de Nutrición, 39 (4): 641-9.
Chamorro-Cevallos, G., Garduño-Siciliano, L., Barrón, B.L., Madrigal-Bujaidar, E.,
Cruz-Vega, D.E. y Pages, N. (2007), Chemoprotective effect of Spirulina
(Arthrospira) against cyclophosphamide-induced mutagenicity in mice, Food and
Chemical Toxicology, 46: 567–574.
Chen, T. y Wong, Y. S. (2008), In vitro antioxidant and antiproliferative activities
of selenium-containing phycocyanin from selenium-enriched Spirulina platensis,
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56 (12): 4352-4358.
Chen, S., Dehart, D. B. and Sulik, K. K. (2004), Protection from ethanol-induced
limb malformations by the superoxide dismutase/catalase mimetic, EUK-134. The
FASEB Journal Express Article 10.1096/fj.03-0850fje.
Cherng, S.C., Cheng, S. N., Tarn, A. y Chou, T. C. (2007), Anti-inflammatory
activity of c-phycocyanin in lipopolysacharide-stimulated Raw 264.7 macrophages,
Life Science, 81 (19-20): 1431-1435.
Ciferri, O. (1983), Spirulina, the edible microorganism, Microbiological Reviews,
551-578.
Cingi, C., Conk-Dalay, M., Cakli, H. y Bal, C. (2008), The effect of Spirulina on
allergic rhinitis. European Archives of oto-rhino-laryngology,
DOI:10.1007/s00405-008-0642-8
74
EFECTO DE LA Spirulina maxima CONTRA LA TERATOGENICIDAD Y GENOTOXICIDAD PRODUCIDAS POR HIDROXIUREA
B
I
B
L
I
O
G
R
A
F
Í
A
Cohen, M. M. (1990). Syndromology: an undated conceptual overview, VII.
Aspects of Teratogenesis, 19: 26-32.
Cokic, V. P., Smith, R. D., Beleslin-Cokic, B. B., Njoroge J. M., Miller J. L.,
Gladwin M. T., y Schechter A. N. (2003), Hydroxyurea induces fetal hemoglobin
by the nitric oxide-dependent activation of soluble guanylyl cyclase, Journal of
Clinical Investigation, 111: 231-39.
Dartsch, P. C. (2008), Antioxidant potential of selected Spirulina platensis
preparations, Phytotherapy Research, 22: 627-633.
Dawson, J. E., Raymond, A. M., Winn, L. M. (2006). Folic acid and panthenic acid
protection against valproic acid-induced neural tube defects in CD-1 mice.
Toxicology and Applied Pharmacology, 211: 124-32.
Deans, R., Fu, S., Stockler, R., y Davies, M. J., (1997), Biochemistry and pathology
of radical mediated protein oxidation. Biochemical Journal, 324: 1-18.
Deeb, S. A., Moutaery, K. A., Arshaduddin, M. and Tariq M. (2000), Vitamin E
decreases valproic acid induced neural tube defects in mice, Neuroscience Letters,
292: 179-182.
Del Valle Pérez, L. O., Socarrás Ferrer, B. B., Suárez, V. M., Leyva, I. T., Segura,
M. S., Padrón, Y. C., Abraham, C. M., Ramírez, P. H. y Ballester Santovenia, J. M.
(2008), In vitro effect of Spirulina on the human lymphocytes of healthy donors and
patients with cellular immunodeficiency. Revista Cubana de Hematología,
Inmunología y Hemoterapia, 24 (1).
DeSesso, J. M. (1981). Comparative ultraestructural alterations in rabbit limb-buds
after a teratogenic dose of either hydroxyurea or methotrexate. Teratology, 23: 197-
215.
DeSesso, J. M. and Goeringer, G. C. (1990a), Ethoxyquin and nordihydroguaiaretic
acids reduce hydroxyurea developmental toxicity, Reproductive Toxicology, 4:
267-275.
DeSesso, J. M. and Goeringer, G. C. (1990b), The nature of the embryo-protective
interaction of propel gallate with hydroxyurea, Reproductive Toxicology, 4: 145-
152.
75
EFECTO DE LA Spirulina maxima CONTRA LA TERATOGENICIDAD Y GENOTOXICIDAD PRODUCIDAS POR HIDROXIUREA
B
I
B
L
I
O
G
R
A
F
Í
A
DeSesso, J. M., Scialli, A. R. and Georinger, G. C. (1994), D-manitol, a specific
hydroxyl free radical scavenger, reduces the developmental toxicity of hydroxyurea
in rabbits, Teratology, 49: 248-259.
Dillon, J. C., Phuc, A. P. and Dubacq, J. P. (1995), Nutritional Value of the alga
Spirulina, World Review of Nutrition and Dietetics, 77: 32-46.
Dröge, W. (2002), Free radicals in the physiological control of cell function,
Physiological Reviews, 82: 47-95.
Ecobichon, D. J. (1997), The basis of toxicity testing, CRC Press, New Yok, 2nd
edition, 117-150.
Estrada, J. E., Bermejo, B. P. and Villar, F. A. M. (2001), Antioxidant activity of
different fractions of Spirulina platenses protean extract, Editions Scientifiques et
Médicales, Elsevier SAS, 56: 497-500.
Farooq, S. M., Asokan, D., Kalaiselvi, P., Sakthivel, R. y Varalakshmi, P. (2004a),
Prophylactic role of phycocyanin: a study of oxalate mediated renal cell injury,
Chemico-Biological Interactions, 149: 1-7.
Farooq, S. M., Asokan, D., Sakthivel, R., Kalaiselvi, P. y Varalakshmi, P. (2004b),
Salubrious effect of C-phycocyanin against oxalate-mediated renal cell injury,
Clinica Chimica Acta, 348: 199-205.
Farooq, S. M., Ebrahim, A. S., Asokan, D., Sakthivel, R., Savitha, S., Rajesh, N. G.
y Varalakshmi, P. (2005), Credentials of Spirulina diet on stability and flux related
properties on the biomineralization process during oxalate mediated renal
calcification in rats, Clinical Nutrition, 24: 932-942.
Farooq, S. M., Ebrahim, A. S., Subramhanya, K. H., Sakthivel, R., Rajesh, N. G. y
Varalakshmi, P. (2006), Oxalate mediated nephronal impairment and its inhibition
by c-phycocyanin: A study on urolithic rats, Molecular and Cellular Biochemistry,
284, 95-101.
Gao, W. Y., Johns, D. G., Chokekijchai, S. y Mitzuya, H. (1995), Disparate actions
of hydroxyurea in potentiation of purine and pyrimidine 2´,3´-dideoxynucleoside
activities against replication of human immunodeficiency virus, Pharmacology, 92:
8333-8337.
76
EFECTO DE LA Spirulina maxima CONTRA LA TERATOGENICIDAD Y GENOTOXICIDAD PRODUCIDAS POR HIDROXIUREA
B
I
B
L
I
O
G
R
A
F
Í
A
Gemma, C., Mesches, M. H., Sepesi, B., Choo, K., Holmes, D. B. y Bickford, P. C.
(2002), Diets enriched in foods with high atioxidant activity reverse age-induced
decreases in cerebellar b-adrenergic function and increases in proinflammatory
cytokines, The Journal of Neuroscience, 22(14), 6114-20.
Genova, M. L., Pich, M. M., Biondi, A., Bernacchia, A., Falasca, A., Bovina, C.,
Formiggini, G., Castelli, G. P., Lenaz, G. (2003), Mitochondrial production of
oxygen radical species and the role of coenzima Q as antioxidant, Mitochondrial
oxygen radicals, 5006-5013.
Giordano, F. J. (2005), Oxygen, oxidative stress, hypoxia and heart failure, The
Journal of Clinical Investigation, 115 (3): 500-508.
Glover, R. E., Ivy E. D., Orringer E. P., Maeda H., Mason R. P. (1999), Detection
of nitrosyl hemoglobin in venous blood in the treatment of sickle cell anemia with
hydroxyurea, Molecular Pharmacology, 55, 1006-1010.
Gómez-Meda, B., Zuñiga-González, G. M., Zamora-Pérez, A., Ramos-Ibarra, M.
L., Bautista-González, C. M. and Torres-Mendoza, B. M. (2004), Folate
supplementation of cyclophosphamide-treated mothers diminishes micronucleated
erythrocytes in peripheral blood of newborns, Environmental and Molecular
Mutagenesis, 44: 174-178.
González, R., Rodríguez, S., Romay, S., Ancheta, O., González, A., Armesto, J.,
Ramírez, D. and Merino, N. (1999), Anti-inflammatory activity of phycocyanin
extract in acid-induced colitis in rats, Pharmacological Research, 39: 55-59.
Goodman and Gilman (2002), Las bases farmacológicas de la terapéutica, 9ª
edición, Mc Graww Hill, México.
Hayashi, K., Hayashi, T. and Morita, N. (1993), An extract from Spirulina platensis
is a selective inhibitor of herpes simplex virus type 1 penetration into HeLa cells,
Phytotherapy research, 7: 7-80.
Hayashi, M., Hamasu, T., Endoh, D., Shimohima, R. and Okui, T. (2003),
Inhibition of replicatin induces non-apoptotic cell death in fibroblast cell lines
derived from LEC rats, Full paper, Journal of Veterinarian Medical Science, 65:
249-254.
77
EFECTO DE LA Spirulina maxima CONTRA LA TERATOGENICIDAD Y GENOTOXICIDAD PRODUCIDAS POR HIDROXIUREA
B
I
B
L
I
O
G
R
A
F
Í
A
Hendricks, S. P. and Mathews, C. (1998), Differential effects of hydroxyurea upon
desoxyrribonucleoside triphosphate pools, analyzed with vaccinia virus
ribonucleotide reductase, The Journal or Biological Chemistry, 273: 29519-29523.
Herken, R. (1985), Ultrastructural changes in the neural tube of 10-day-old mouse
embryos exposed to colchicines and hydroxyurea, Teratology, 31: 345-352.
Herrera, A., Boussiba, S., Napoleone, V., Hohlberg, A. (1989), Recovery of c-
phycocyanin from the cyanobacterium Spirulina maxima, Kluwer Academic
Publishers, 325-331.
Hong, C. and Shan-Shan, P. (2005), Bioremediation potential of spirulina: toxicity
and biorsorption studies of lead, Journal of Zhejiang University Science, 3: 171-174
Hong-Quan, Z., An-Pind, L., Yun, S. and Yang-Mei, D. (2001), Chemo- and radio-
protective effects of polysacaride of Spirulina platensis on hemopoietic system of
mice and dogs, Acta Pharmacologica Sinica, 12: 1121-1124.
Huang, Z., Guo, B. J., Wong, R. N. S. and Jiang, Y. (2006), Characterization and
antioxidant activity of selenium-containing phycocyanin isolated from Spirulina
platensis, Food Chemistry, 1137-1143.
Instituto Nacional de Estadística, Geografía e Informática (2007), Defunciones,
principales causas, 2007, Nacional, Estadísticas de Mortalidad, México.
Iwama, M., Sakamoto, Y., Honda, A. y Mori, Y. (1983), Limb deformity induced in
chick embryo by hydroxyurea, Journal of Pharmacobiodynamia, 6 (11): 836-843.
Jeyaprakash, K. and Chinnaswamy, P. (2005), Effect of Spirulina and Liv-52 on
cadmium induced toxicity in albino rats, Indian Journal of Experimental Biology,
43: 773-781.
Jiang, J., Jordan, S. J., Barr, D. P., Gunther, M. R., Maeda, H. and Mason, R. P.
(1997), In vivo production of nitric oxide in rats alters administration of
hydroxyurea, Molecular Pharmacology 52: 1081-1086.
Kaji, T., Fujiwara, Y., Hamada, C., Yamamoto, C., Shimada, S., Lee, J. L. and
Hayashi, T. (2002), Inhibition of cultured bovine aortic endothelial cell proliferation
by sodium spirulan, a new sulfated polyssacharide isolated from Spirulina platensis,
Planta Medica, 68: 505-509.
78
EFECTO DE LA Spirulina maxima CONTRA LA TERATOGENICIDAD Y GENOTOXICIDAD PRODUCIDAS POR HIDROXIUREA
B
I
B
L
I
O
G
R
A
F
Í
A
Kaji, T., Fujiwara, Y., Inomata, Y., Hamada, C., Yamamoto, C., Shimada, S., Lee,
J. L. and Hayashi, T. (2002), Repair of wounded monolayers of cultured bovine
aortic endothelial cells is inhibited by calcium spirulan, a novel sulfated
polysaccharide isolated from Spirulina platensis, Life Sciences, 70: 1841-48.
Kaji, T., Okabe,M., Shimada, S., Yamamoto, C., Fujiwara, Y., Lee, J. L. and
Hayashi, T. (2004), Sodium spirulan as a potent inhibitor of arterial smooth muscle
cell proliferation in vitro, Life Sciences, 74: 2431-39.
Karadeniz, A., Yildirim, A., Simsek, N., Kalkan, Y. y Celebi, F. (2008), Spirulina
platensis protects against gentamicin-induced nephrotoxicity in rats, Phytotherapy
Research, 22 (11): 1506-1510.
Karaka, T. y Simsek, N. (2007), Effects of Spirulina on the number of ovary mast
cells in lead-induced toxicity in rats, Phytotherapy Research, 21: 44.
Kaushik, T., Shyam, R., Vats, P., Suri, S., Kumria. M. M. L., Sharma, P. C. y
Singh, S. N. (2001), Glutathione metabolism in rats exposed to high-fluoride water
and effect of Spirulina treatment, Research Report, 34 (2): 132-138.
Khan, M., Varadharaj, S., Ganesan, L. P., Shobha, J. C., Naidu, M. U., Parinandi,
N. L., Tridandapani, S., Kutala, V. K. and Kuppusami, P. (2005), C-phycocyanin
protects against ischemia-reperfusion injury of heart through involvement of p38
MAPK and ERK signaling, American Journal of Physiology and Heart Circulation
Physiology, 1-37.
Kim, N. H., Jeong, H. J., Lee, J. Y., Go, H., Ko, S. G., Hong, S. H., Kim, H. M. y
Um, J. Y. (2008), The effect of hydrolyzed Spirulina by malted barley on forced
swimming test in ICR mice, The International Journal of Neuroscience, 118 (11):
1523-1533.
King, S. B. (2003), A role for nitric oxide in hydoxyurea-mediated fetal hemoglobin
induction, Journal of Clinical Investigation, 111: 171-172.
Klingler, W., Kreja, L., Nothdurft, W. and Selig, C. (2002), Influence of different
radioprotective compounds on radiotolerance and cell cycle distribution of human
progenitor cells of granulocytopoiesis in vitro, British Journal of Haematology, 199:
144-254.
79
EFECTO DE LA Spirulina maxima CONTRA LA TERATOGENICIDAD Y GENOTOXICIDAD PRODUCIDAS POR HIDROXIUREA
B
I
B
L
I
O
G
R
A
F
Í
A
Kunk, S. D. (2003), From microbes to mice: solving problems with magnetic
resonance, www.wellesley.edu/Chemistry/ nhk/ppt_cyano/sl_1_intro.htmL.
Lee, J. B., Hou, X., Hayashi, K. and Hayashi, T. (2007), Effect of partial
desulfation and oversulfation of sodium spirulan on the potency of anti-herpetic
activities, Carbohydrate Polymers, 69: 651-658.
Lee, J. B., Srisomporn, P., Hayashi, S., Tanaka, T., Sankawa, U. and Hayashi, T.
(2001), Effects of structural modification of calcium spirulan, a sulfated
polysaccharide from Spirulina platensis, on antiviral activity, Chemical and
Pharmaceutical Bulletin, 49: 108-110.
Li, B., Gao, M., Zang, X. and Chu, X. M. (2006), Molecular immune mechanism of
c-phycocyanin from Spirulina platensis induces apoptosis in HeLa cells in vitro,
Biotechnology and Applied Biochemistry, 43: 155-164.
Li, B., Zang, X., Gao, M. and Chu, X. (2005), Effects of CD59 on antitumoral
activities of phycocyanin from Spirulina platensis, Biomedicine and
Pharmacotherapy, 59: 551-560.
Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K. y Nielsen, C. H. (2008),
Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-
molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira
platensis, Journal of Medicinal Food, 11 (2): 313-322.
López-Alarcón, C., Aspée, A. and Lissi, E. (2007), Antioxidant reactivity evaluated
by competitive kinetics: Influence of the target molecule concentration, Food
Chemistry, 104: 1430-1435.
Mao, T. K., Van de Water, J. and Gershwin, M. E. (2005), Effects of a Spirulina-
based dietary supplement on cytokine production from allergic rhinitis patients,
Journal of Medical Food, 8(1): 27-30.
Mascher, D., Paredes-Carbajal, M. C., Torres-Durán, P. V., Zamora-González, J.,
Díaz-Zagoya, J. C. and Juárez-Oropeza, M. A. (2006), Ethanolic extract of
Spirulina maxima alters the vasomotor reactivity of aortic rings from obese rats,
Archives of Medical Research, 37: 50-57.
Mason, R. P. y Chignell, C. F. (1982), Free radicals in pharmacology and
toxicology-selected topics, Parmacological reviews, 33 (4): 189-211.
80
EFECTO DE LA Spirulina maxima CONTRA LA TERATOGENICIDAD Y GENOTOXICIDAD PRODUCIDAS POR HIDROXIUREA
B
I
B
L
I
O
G
R
A
F
Í
A
Medeiros, M. H. G. (2008), Daño al DNA, en Radicales libres y estrés oxidativo.
Aplicaciones médicas, editado por Konigsberg, F. M., Manual Moderno, pp. 119-
134.
Mendes, R. L., Nobre, B. P., Cardoso, M. T., Pereira, A. P. y Palavra, A. F. (2003),
Supercritical carbon dioxide extraction of compounds with pharmaceutical
importance from microalgae, Inorganica Chimica Acta, 356: 328-334.
Mendiola, J. A., Jaime, L, Santoyo, S., Reglero, G., Cifuentes, A., Ibañez, E. y
Señoráns, F. J. (2007), Screening of functional compounds in supercritical fluid
extracts from Spirulina platensis, Food Chemistry, 102: 1357-1367.
Miranda, M. S., Cintra, R. G., Barros, S. B. M. y Mancini-Filho, J. (1998),
Antioxidant activity of the microalga Spirulina maxima, Brazilian Journal of
Medical and Biological Research, 31: 1075-1079.
Nagaoka, S., Shimizu, K., Kaneko, H., Shibayama, F., Morikawa, K., Kanamaru,
Y., Otsuka, A., Hirahashi, T. y Kato, T. (2005), A Novel Protein C-Phycocyanin
Plays a Crucial Role in the Hypocholesterolemic Action of Spirulina platensis
Concentrate in Rats, Journal of Nutrition, 135 (10): 2425-2430.
Nelson, K. y Holmes, L. B. (1989), Malformations due to presumed spontaneous
mutations in newborns infants, N. English Journal of Medicine, 320: 19-23.
New, D. (1978), Whole embryo culture and the study of mammalian embryos
during organogenesis, Biology Review, 53: 81-122.
Organización Mundial de la Salud (2008), La atención primaria de la salud, más
necesaria que nunca, Informe sobre la salud en el mundo 2008, Ginebra, Suiza.
Ornoy, A., Zaken, V. y Kohen, R. (1999), Role of reactve oxygen species (ROS), in
the diabetes-induced anomalies in rat embryos in vitro: rediction in antioxidant
enzymes and low-molecular-weight antioxidants (LMWA), may be the causative
factor for increased anomalies, Teratology, 60: 376-86.
Ozdemir, G., Karabay, N. U., Dalay, M. C. y Pazarbasi, B. (2004), Antibacterial
activity of volatile component and various extracts of Spirulina platensis,
Phytotherapy Research, 18: 754-757.
81
EFECTO DE LA Spirulina maxima CONTRA LA TERATOGENICIDAD Y GENOTOXICIDAD PRODUCIDAS POR HIDROXIUREA
B
I
B
L
I
O
G
R
A
F
Í
A
Pádula, M., Boiteux, S, Felzenszwalb, I. y Menezes, S. (1996), Photodinamic action
of phycocyanin: damage and repair, Journal of Photochemistry and Photobiology,
B. Biology 32: 19-26.
Paniagua-Castro, N., Escalona-Cardoso, G. Madrigal-Bujaidar, E., Martínez-
Galero, E. y Chamorro-Cevallos, G. (2008), Protection against cadmium-induced
teratogenicity in vitro by glycine. Toxicology in vitro, 22: 75-79.
Pardhasaradhi, B. V. V., Ali, A. M., Kumari, A. L., Reddanna, P. y Khar A. (2003),
Phycocyanin-mediated apoptosis in AK-5 tumor cells involves down-regulation of
Bcl-2 and generation of ROS, Molecular Cancer Therapeutics, 1165-1170.
Park, H. J., Lee, Y. J., Ryu, H. K., Kim, M. H., Chung, H. W. y Kim, W. Y. (2008),
A randomized double-blind, placebo-controlled study to establish the effects of
Spirulina in elderly Koreans, Annals of Nutrition and Metabolism, 19 (4): 322-328.
Parman, T., Wiley, M. J. y Wells, P. G. (1999), Free radical-mediated oxidative
DNA damage in the mechanism of thalidomide teratogenicity, Nature Medicine, 5
(2): 582-585.
Patel, A., Mishra, S., Pawar, R. y Ghosh, P. K. (2005), Purification and
characterization of c-phcocyanin from cyanobacterial species of marine and
freshwater habitat, Protein Expression and Purification, 40: 248-255.
Piñero, E. J. E., Bermejo, B. P. y Villar, F. A. M. (2001), Antioxidant activity of
different fractions of Spirulina platensis protean extract, Il Farmaco, 56: 497-500.
Platzek, T. y Schwabe, A. R. (1999), Combined prenatal toxicity of 6-
mercaptopurine riboside and hydroxyurea in mice, Teratogenesis, Carcinogenesis, y
Mutagenesis, 19: 223-232.
Premkumar, K., Abraham, S. K., Santhiya, S. T. and Ramesh, A. (2004), Protective
effect of Spirulina fsiformis on chemical-induced genotoxicity in mice, Fitoterapia,
75: 24-31.
Premkumar, K., Pachiappan, A., Abraham, S. K., Santhiya, S. T., Gopinath, P. M. y
Ramesh, A. (2001), Effect of Spirulina fusiformis on cyclophosphamide amd
mitomycin-C induced genotoxicity and oxidative stress in mice, Fitoterapia, 72:
906-911.
82
EFECTO DE LA Spirulina maxima CONTRA LA TERATOGENICIDAD Y GENOTOXICIDAD PRODUCIDAS POR HIDROXIUREA
B
I
B
L
I
O
G
R
A
F
Í
A
Preston, R. J. y Hoffman, G. R. (2009), Genetic Toxicology, en Casarett and
Doull´s, The basic science of poisons, 7th edition, editado por Klaassen C. D.,
McGraw-Hill, pp. 381-414.
Przybyssewski, W. M., Kopeć-Szlezak, J. y Malec, J. (1987), Protection of L5178Y
cells by vitamin E against acute hydroxyurea toxicity does not change de efficiency
of ribonucleotide reductase-mediated hydroxyurea-induced cytotoxic events,
Cancer Letters, 34: 337-344.
Przybyszewski, W. M. y Malec, J. (1982), Protection against hydroxyurea-induced
cytotoxiceffects in L5178Y cells by free radical scavengers, Cancer Letters, 17:
223-228.
Qishen, P., Bajojiang, G. and Kolman, A. (1998), Radioprotective effect of extract
from Spirulina platensis in mouse bone marrow cells studied by using the
micronucleus test, Toxicology Letters, 48: 165-169.
Rahman, M. M., Escobedo-Bonilla, C. M., Wille, M., Sanz, V. A., Audoorn, L.,
Neyts, J., Pensaert, M. B., Sorgeloos, P. and Nauwynck, H. J. (2005), Clinical effect
of cidofovir and a diet supplemented with Spirulina platensis in white spot
syndrome virus (WSSV) infected specific pathogen-free Litopenaeus vannamei
juveniles, Aquaculture, 1-6.
Reddy, M. C., Bhat, V. B., Kiranmai, G., Reddy M. N., Reddana, P. and
Madyastha, K. M. (2000), Selective inhibition of coclooxygenase-2 by c-
phycocyanin, a biliprotein from Spirulina platensis, Biochemical and Biophysical
Research Comunications, 277: 599-603.
Reddy, M. C., Subhashini, J., Mahipal, S. V. K., Bhat, V. B., Reddy, P. S.,
Kiranmai, G., Madyastha, K. M. and Reddanna, P. (2003), C-phycocyanin, a
selective cclooxygenase-2 inhibitor, induces apoptosis in lipoppolysaccharide-
stimulated RAW 264.7 macrophages, Biochemical and Biophysical Research
Communications, 304: 385-392.
Remirez, D., Fernández, V., Tapia, G., González, R. and Videla, A. (2002b),
Influence of c-phycocyanin on hepatocellular parameters related to liver oxidative
stress and Kupffer cell functioning, Inflammation Research, 51: 351-56.
83
EFECTO DE LA Spirulina maxima CONTRA LA TERATOGENICIDAD Y GENOTOXICIDAD PRODUCIDAS POR HIDROXIUREA
B
I
B
L
I
O
G
R
A
F
Í
A
Remirez, D., González, A., Merino, N., González, R., Ancheta, O., Romay, C. and
Rodríguez, S. (1999), Effect of phycocyanin in zymosan-induced arthritis in mice -
phycocyanin as an antiarthritic compound, Drug Development Research, 48: 70-75.
Remirez, D., González, R., Merino, M., Rodríguez, S. and Ancheta, O. (2002a),
Inhibitory effects of Spirulina in zimosan-induced arthritis in mice, Mediators of
Inflammation, 11: 75-79.
Remirez, D., Ledón, N., González, R. (2002c), Role of histamine in the inhibitory
effects of phycocyanin in experimental models of allergic inflammatory response,
Mediators of Inflammation, 11 (2): 75-79.
Remirez, D., Ledón, N. and González, R. (2005), Role of histamine in the inhibitory
effects of phycocyanin in experimental models of allergic inflammatory response,
Mediators of Inflammation, 11: 81-85.
Rimbau, V., Camins, A., Romay, C., González, R. and Pallas, M. (1999), Protective
effects of c-phycocyanin aganst kainic acid-induced neuronal damage in rat
hippocampus, Neuroscience Letters, 276: 75-78.
Rodríguez, G. I., Kuhn, J. G., Weiss, G. R., Hilsenbeck, S. G., Eckardt, J. R.,
Thurman, A., Rinaldi, D. A., Hodges, S., Von Hoff, D. D. y Rowinsky, E. K.
(1998). A bioavailability and pharmacokinetic study of oral and intravenous
hydroxyurea, Blood, 91 (5): 1533-1541.
Romay, C., Ledón, N. y González, R. (1998a), Further studies on anti-inflammatory
activity of phycocyanin in some animal models of inflammation, Inflammation
Research, 47: 334-338.
Romay, S., Delgado, R., Ramírez, D., González, R. y Rojas, A. (2000). Effects of c-
phycocyanin extract on tumor necrosis factor- and nirite levels in serum of mice
treated with endotoxin, Arsneim-Forch/Drug Research, 51 (2): 733-736.
Romay, S., Armesto, J., Ramírez, D., González, R., Ledon, N. y García, I. (1998b),
Anti-oxidant and anti-inflammatory properties of c-phycocyanin from blue-green
algae, Inflammation Research, 47: 36-41.
Romay, S., Delgado, R., Ramírez, D., González, R., y Rojas, A. (2001), Effects of
c-phycocyanin extract on tumor necrosis factor-a and nirite levels in serum of mice
treated with endotoxin, Arsneim-Forch/Drug Research, vol. 51: 733-736.
84
EFECTO DE LA Spirulina maxima CONTRA LA TERATOGENICIDAD Y GENOTOXICIDAD PRODUCIDAS POR HIDROXIUREA
B
I
B
L
I
O
G
R
A
F
Í
A
Roy, K. R., Arunasree, K. M., Dhoot, A., Aparna, R., Reddy, G. V., Vali, S. y
Reddanna, P. (2007), C-phycocyanin inhibits 2-acetaminofluorene-induced
expression of MDR1 in mouse macrophage cells: ROS mediate pathway
determined via combination of experimental and In silico analysis, Archives of
Biochemistry and Biophysics, 459: 169-177.
Ruiz, F. L. E., Madrigal-Bujaidar, E., Salazar, M. y Chamorro, G. (2003),
Anticlastogenic effect of Spirulina maxima extract on the micronuclei induced by
maleic hydrazide in Tradescantia, Life Sciences, 72: 1345-1351.
Sakano, K., Oikawa, S., Hasegawa, K. y Kawanishy, S. (2001). Hydroxyurea
induces site-specific DNA damage via formation of hydrogen peroxide and nitric
oxide. Japanese Journal of Cancer Research, 92 (11): 1166-1174.
Salazar, M., Chamorro, G. A., Salazar, S. y Steele C. E. (1996). Effect of Spirulina
maxima consumption on reproduction and peri- and postnatal development in rats.
Food and Chemical Toxicology, 34 (4): 353-359
Sathyasaikumar, K. V., Swapna, I., Reddy, P. V. B., Murthy, Ch. R. K., Roy, K. R.,
Grupta, A. D., Senthilkumaran, B. y Reddanna, P. (2007), Journal of the
Neurological Sciences, 252: 67-75.
Saxena, P. S. y Kumar, M. (2004), Modulatory potencial of Spirulina fusiformis on
testicular phosphatases in Swiss albino mice against mercury intoxication, Indian
Journal of Experimental Biology, 42: 998-1002.
Schmid, B. P. (1985). Action sites of know in vivo teratogens in extracorporeally
exposed rat embryos. Concepts of Toxicology, 3: 74-85.
Schmid, B., Bechter, R. y Kucera, P. (1997), Use of whole embryo cultures in in
vitro teratogenecity testing, In vitro Methods in Pharmaceutical Research, 353-372.
Schwartz, J. y Shklar, G. (1987), Regression of experimental hamster cancer by
beta carotene and algae extracts, Journal of Oral Maxilofacial Surgery, 45: 510-515.
Sharma, M. K., Kumar, M. y Kumar, A. (2003), Modifying effect of Spirulina
fusiformis against mercury induced renel damages in Swiss albino mice, Toxicology
Letters, 144, S1, s141.
85
EFECTO DE LA Spirulina maxima CONTRA LA TERATOGENICIDAD Y GENOTOXICIDAD PRODUCIDAS POR HIDROXIUREA
B
I
B
L
I
O
G
R
A
F
Í
A
Sharma, M. K., Sharma, A., Kumar, A. y Kumar, M. (2007), Evaluation of
protective efficacy of Spirulina fusiformis against mercury induced nephrotoxicity
in Swiss albino mice, Food and Chemical Toxicology, 45: 879-887.
Simpore, J., Kabore, F., Zongo, F., Dansou, D., Bere, A., Pignatelli, S., Biondi, D.
M., Ruperto, G. y Musumeci, S. (2006), Nutrition rehabilitation of undernourished
children utilizing Spirulina and MISOLA, Nutrition Journal, 5:3, Article URL
http://www.nuttritionj.com/content/5/1/3.
Simpore, J., Zongo, F., Kabore, F., Dansou, D., Bere, A., Nikiema, J. B., Pignatelli,
S., Biondi, D. M., Ruperto, G. y Musumeci, S. (2005), Nutrition rehabilitation of
HIV-infected and HIV-negative undernourished children utilizing Spirulina, Annals
of Nutrition and Metabolism, 49: 373-80.
Simsek, N., Karadeniz, A, Kalkan, Y., Keles, O. N., y Unal, B. (2008), Spirulina
platensis feeding inhibited the anemia-and leucopenia-induced lead and cadmium in
rats, Journal of Hazardous Materials, 164 (2-3): 1304-1309.
Strömberg, I., Gemma, C., Vila, J. y Bickford, P. C. (2005), Blueberry- and
spirulina-enriched diets enhance strial dopamine recovery and induce a rapid,
transient micriglia activation after injury of the rat nigrostriatal dopamine system,
Experimental Neurology, 196: 298-307.
Subhashini, J., Mahipal, S. V. K. , Reddy, M. C. , Reddy, M. M., Rachamallu, A. y
Reddanna, P. (2004), Molecular mechanisms in c-phycocyanin induced apoptosis in
human chronic myeloid leukemia cell line-K562, Biochemical Pharmacology, 68:
453-462.
Suetsuna, K. y Chen, J. R. (2001), Identification of antihypertensive peptides from
peptic digest of two microalgae, Chlorella vulgaris and Spirulina platensis, Marine
Biotechnology, 3: 305-9.
Teas, J., Herbert, J.R., Fitton, J. H. y Zimba, P. V. (2004), Algae – a poor man´s
HAART?, Medical Hypotheses, 62: 507-510.
Tiselius, A., Hjertén, S. y Levin, O. (1956), Protein chromatography on calcium
phosphate columns, Archives of Biochemical and Biophysics, 65: 132-155.
Torres-Duran, P. V., Ferreira-Hermosillo, A. y Juarez-Oropeza M. A. (2007),
Antihyperlipemic and antihypertensive effects of Spirulina maxima in an open
86
EFECTO DE LA Spirulina maxima CONTRA LA TERATOGENICIDAD Y GENOTOXICIDAD PRODUCIDAS POR HIDROXIUREA
B
I
B
L
I
O
G
R
A
F
Í
A
sample of Mexican population: a preliminary report, Lipids Health Disease, 26 (6):
33.
Torres-Durán, P. V., Miranda-Zamora, R., Paredes-Carbajal, M. C., Mascher, D.,
Blé-Castillo, J., Díaz-Zagoya, J. C. y Juárez-Oropeza, M. A. (1999), Studies on the
preventive effect of Spirulina maxima on fatty liver development induced by carbon
tetrachloride, in the rat, Journal of Ethnopharmacol, 64 (2): 141-7.
Torres-Durán, P. V., Miranda-Zamora, R., Paredes-Carbajal, M. C., Mascher, D.,
Díaz-Zagoya, J. C. y Juárez-Oropeza, M. A. (1998), Spirulina maxima prevents
induction of fatty liver by carbon tetrachloride in the rat, Biochemistry and
Molecular Biology Int., 44 (4): 787-793.
Torres-Durán, P. V., Paredes-Carbajal, M. C., Mascher, D., Zamora-González, J.,
Díaz-Zagoya, J. C. y Juárez-Oropeza, M. A. (2006), Protective effect of Arthrospira
maxima on fatty acid composition in fatty liver, Archives of Medical Research, 37
(4): 479-483.
Touyz, R. M. (2004). Reactive oxygen species, vascular oxidative stress, and redox
signaling in hypertension, what is the clinical significance?, Hypertension, 44: 248-
252.
Vadiraja, B. B., Gaikuad, N. W. y Madyastha, K. M. (1998), Hepatoprotective
effect of c-phycocyanin: protection for carbon tetrachloride and R-(+)-pulegone-
mediated hepatotoxicity in rats, Biochemical and Biophysical Research
Communication, 249: 428-31.
Varga, L., Szigeti, J., Kovács, R., Földes, T. y Buti, S. (2002), Influence of a
Spirulina platensis biomass on the microflora of fermented ABT milks during
storage (R1), Journal of Dairy Sciences, 85: 1031-1038.
Vázquez-Sánchez, J. (2006), Efecto de la c-ficocianina contra la teratogénesis
producida por hidroxiurea, Tesis, IPN, México.
Voltarelli, F. A. y de Mello, M. A. (2008), Spirulina enhanced the skeletal muscle
protein in growing rats, European Journal of Nutrition, 47 (7): 393-400.
Wang, H., Liu, Y., Gao, X., Carter, C. L. y Liu, Z. R. (2007), The recombinant
subunit of c-phycocyanin inhibits cell proliferation and induces apoptosis, Cancer
Letters, 247: 150-158.
87
EFECTO DE LA Spirulina maxima CONTRA LA TERATOGENICIDAD Y GENOTOXICIDAD PRODUCIDAS POR HIDROXIUREA
B
I
B
L
I
O
G
R
A
F
Í
A
Wang, L., Pan, B., Sheng, J., Xu, J. y Hu, Q. (2007), Antioxidant activity of
Spirulina platensis extracts by supercritical carbon dioxide extraction, Food
Chemistry.
Wang, X.Q., Li, L.N., Chang, W.R., Zhang, J.P., Gui, L.L., Guo, B.J. y Liang, D.C.
(2001). Structure of C-phycocyanin from Spirulina platensis at 2.2 A resolution: a
novel monoclinic crystal form for phycobiliproteins in phycobilisomes. Acta
Crystallographic, Section Dv 57: 784-792.
Wang, Y., Chang, C. F., Chou, J., Chen, H. L., Deng, X., Harvey, B. K., Cadet, J. L.
y Bickford, P. C. (2005), Dietary supplementation with blueberries, spinach, or
spirulina reduces ischemic brain damage, Experimental Neurology, 193: 75-84.
Warner, C. W., Sadler, T. W. Shockey, J. y Smith, M. K. (1983), A comparison of
the in vivo and in vitro response of mammalian embryos to a teratogenic insult,
Toxicology, 28: 271-282.
Watanuki, H., Ota, K., Tossaka, A. C. M. A. P., Kato, T., Sakai, M. (2006),
Immunoestimulant effects of dietary Spirulina platensis on carp, Ciprinus carpio;
Aquaculture, 258: 157.
Wells, P. G., Bhuller, Y., Chen, C. S., Jeng, W., Kasapinovic, S., Kennedy, J. C.,
Kim, P. M., Laposa, R. R., McCallum, G. P., Nicol, C. J., Parman, T., Wiley, M. J.
y Wong, A. W. (2005), Molecular and biochemical mechanisms in teratogenesis
involving reactive oxygen species, Toxicology and Applied Pharmacology, 207:
S354-S366.
Wilson, J. G. (1973). Mechanisms of teratogenesis. The American Journal of
Anatomy, 136 (2): 129-131.
Wilson, J. G. (1977). Teratogenic effects of environmental chemicals. Fed. Proc.,
36: 1698-1703.
Woo, G. H., Bak, E. J., Nakayama, H. y Doi, K. (2006). Molecular mechanisms of
hydroxyurea (HU).-induced apoptosis in the mouse fetal brain. Neurotoxicology
and teratology, 28: 125-134.
Wu, D. y Canderbaum, A. I. (2003). Alcohol, oxidative stress, and free radical
damage. Alcohol Research and Health, 27 (4): 277-284.
88
EFECTO DE LA Spirulina maxima CONTRA LA TERATOGENICIDAD Y GENOTOXICIDAD PRODUCIDAS POR HIDROXIUREA
B
I
B
L
I
O
G
R
A
F
Í
A
Wu, L. C., Ho, J. A., Shien, M. C. y Lu, I. W. (2005), Antioxidant and
antiproliferative activities of Spirulina and Chlorella water extracts, Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 53: 4207-12.
Yamamoto, C., Shimada, Fujiwara, Y., Lee, J. L., S., Hayashi, T. y Kaji, T. (2005),
Proteoglicans relased from cultured bovine aortic endothelial cell layers by sodium
spirulan are both perlecan and biglycan, Biological and Pharmaceutical Bulletin,
28: 32-36.
Yan, J. y Hales, B. F. (2005). Activator protein-1 (AP-1). DNA binding activity is
induced by hydroxurea in organogenesis stage mouse embryos. Toxicological
Sciences, 85: 1013-1023.
Yoshida, A., Takagaki, Y. y Nishimune, T. (1996). Enzyme immunoassay for
phycocyanin as the main component of Spirulina color in foods. Biosciences
Biotechnology Biochemistry, 60 (1): 57-60.
Zetenco, S. T. y Saldaña, B. Y. (2008), Daño a lípidos, en Radicales libres y estrés
oxidativo. Aplicaciones médicas, editado por Konigsberg, F. M., Manual Moderno,
pp. 135-146.
Zhang, Y. M. y Chen, F. (1999) A simple method for efficient separation and
purification of c-phycocyanin and allophycocyanin from Spirulina platensis.
Biotechnology Techniques, 13: 601-603.
Direcciones electrónicas
http.//www.mx.encarta.msn.com/Algas_verdeazuladas.htmL
90
91
92
93
94