Sveučilište u Zagrebu
Prirodoslovno-matematički fakultet
Biološki odsjek
Jure Krasić
Učinci vazodilatacijskih i antikoagulacijskih lijekova na
oksidativni stres u mozgu štakora
Diplomski rad
Zagreb, 2015.
Ovaj rad je izrađen na Zavodu za animalnu fiziologiju Prirodoslovno-matematičkog fakulteta
Sveučilišta u Zagrebu, pod vodstvom izv.prof.dr.sc. Domagoja Đikića, Rad je predan na
ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi
stjecanja zvanja magistra eksperimentalne biologije.
TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA
Sveučilište u Zagrebu
Prirodoslovno-matematički fakultet
Biološki odsjek Diplomski rad
Učinci vazodilatacijskih i antikoagulacijskih lijekova na oksidativni
stres u mozgu štakora
Jure Krasić
Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb, Hrvatska
Prethodna toksikološka istraţivanja ukazuju da su krvno moţdana barijera i cirkulacija
središnjeg ţivčanog sustava vrlo osjetljivi na učinke lijekova s vazodilatacijskim ili
antikoagulativnim svojstvima. Na staničnoj razini, dobro su opisani štetni učinci oksidativnog
stresa uzrokovanog lijekovima uobičajenima u domaćinstvu, koji se uzimaju bez recepta
(acetilsalicilna kiselina) te biljnih lijekova i tableta (npr. ginko) ili lijekova na recept s
antikoagulativnim svojstvima (varfarin). Mnogo manje se zna o međusobnim interakcijama
navedenih tvari na razine oksidativnog stresa, osobito u mozgu. U okviru ovog rada štakori
soja Y59 tretirani su dnevno s odgovarajućim preporučenim dozama kombinacija
acetilsalicilne kiseline, ginka i varfarina, tijekom 15 dana. Razina oksidativnog stresa
procijenjena je mjerenjem četiri markera oksidativnog stresa; superoksid dismutaze (SOD),
katalaze (CAT), glutationa (GSH) i malondialdehida (MDA) u različitim regijama mozga.
Rezultati su pokazali promijenjene razine oksidacijskog stresa u prefrontalnom korteksu,
kortikalnoj regiji i malom mozgu izloţenih ţivotinja. Ove promjene ukazuju na sinergistički
toksični potencijal izazvan simultanim uzimanjem navedenih lijekova.
(47 stranica, 4 tablice, 22 slike, 35 literaturna navoda, jezik izvornika: Hrvatski)
Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjiţnici
Ključne riječi: aspirin, varfarin, ginko (Ginkgo biloba), Centella asiatica,
oksidativni stres, mozak
Voditelj: izv. prof. dr. sc. Domagoj Đikić,
Ocjenitelji:
Rad prihvaćen:
BASIC DOCUMENTATION CARD
University of Zagreb
Faculty of Science
Division of Biology Graduation Thesis
The effects of vasodilators and anticoagulants on the oxidative stress
levels of the rat brain
Jure Krasić
Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb, Croatia
Previous toxicological research showed that blood brain barrier and brain vascular system are
highly susceptible to the effects of pharmaceuticals with vasodilatation or anticoagulative
properties. The adverse effects on cellular oxidative stress caused by over the counter (OTC)
household drugs (acetylsalicylic acid), herbal remedies and pills (for example ginkgo) or
prescription drugs (warfarin) are well described. Much less is known about mutual interaction
between these substances on oxidative stress levels especially in the brain. Within this study
Y59 rats were treated daily with corresponding recommended doses and combinations of
acetylsalicylic acid, ginkgo and warfarine during 15 days. Four markers of oxidative stress
were assessed; superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), gluthathione (GSH) and
malondialdehyde (MDA) in various brain regions. The results have shown changes of
oxidative stress levels in prefrontal cortex, cortical regions and cerebellum of exposed
animals. These changes implicate synergistic and potentiated toxic potential of combinations
of named drugs.
(47 pages, 4 tables, 22 figures, 35 references, original in: Croatian)
Thesis deposited in the Central Biological Library
Key words: aspirin, warfarine, ginkgo (Ginkgo biloba), Centella asiatica,
oxidative stress, brain
Supervisor: Dr. Domagoj Đikić, Assoc. Prof.
Reviewers:
Thesis accepted:
Sadržaj:
1 Uvod
1.1 Oksidativni stres 1
1.1.1 Superoksid dismutaza (SOD 4
1.1.2 Katalaza 5
1.1.3 Glutation peroksidaza (GPx) 6
1.2 Mozak 7
1.3 Klasični lijekovi 9
1.3.1 Acetilsalicilna kiselina 9
1.3.2 Varfarin 11
1.4 Biljni pripravci 13
1.4.1 Regulacija biljnih pripravaka u Europskoj Uniji 13
1.4.2 Ginko 14
1.4.3 Gotu kola 16
1.4.4 Borovnica 17
1.4.5 Vulkan 17
1.5 Interakcije klasičnih lijekova i biljnih pripravaka 17
1.5.1 Ginko i varfarin 18
1.5.2 Ginko i acetilsalicilna kiselina 18
1.6 Cilj istraţivanja 18
2 Materijali i metode 19
2.1 Materijali 19
2.2 Metode 20
2.2.1 Tretman ţivotinja 20
2.2.2 Izolacija organa i obrada tkiva 22
2.2.3 Određivanje proteina metodom po Lowryju 22
2.2.4 Količina ukupnog glutationa (GSH) 23
2.2.5 Mjerenje enzimske aktivnosti superoksid dismutaze (SOD) 24
2.2.6 Mjerenje enzimske aktivnosti katalaze 24
2.2.7 Mjerenje količine lipidne peroksidacije 24
2.2.8 Statistička analiza podataka 25
3 Rezultati 26
3.1 Aktivnost katalaze 26
3.2 Aktivnost SOD 29
3.3 Koncentracija GSH 32
3.4 Koncentracija MDA 35
3.5 Saţeti prikaz promjena u uzorcima 38
4 Rasprava 40
5 Zaključak 43
6 Popis literature 44
1. Uvod
1.1 Oksidativni stres
Neravnoteţa između oksidansa i antioksidansa (u korist oksidansa) se naziva oksidativnim
stresom. Oksidativni stres uzrokuje štetne događaje poput lipidne peroksidacije i oksidativnog
oštećenja DNA, ali i regulira fiziološke procese i unutarstanični prijenos signala. Oksidansima
nazivamo molekule i ione koji imaju nesparene elektrone pa su zbog toga reaktivniji i
nestabilniji. Najčešći oksidansi su reaktivni kisikovi radikali (ROS) i reaktivni dušikovi
radikali (RNS) (Yoshikawa i Naito 2002). Oksidansi nastaju endogenim metaboličkim
reakcijama, kao posljedica ionizirajućeg zračenja, hiperoksije, izloţenosti ozonu i dimu te u
reakcijama s teškim metalima (Birben i sur. 2012).
Slika 1. Prikaz ravnoteţe i neravnoteţe sustava oksidativnog stresa (Preuzeto od -
http://jmas.in/2ndissue/JMAS%202nd%20issue%20PDF%20for%20Print/Free%20radicals,%
20oxidative%20stress%20and%20importance%20of%20antioxidants%20in%20human%20he
alth.pdf )
ROS (eng. Reactive oxygen species) su najprisutniji izvor oksidativnog stresa u stanicama, a u
njih ubrajamo superoksidni radikal (O2-), hidroksilni radikal (
.OH) koji je najreaktivniji,
peroksilni radikal (R.O2), alkoksilni radikal (RO
.), hipokloritnu kiselinu (HClO), ozon (O3),
singletni kisik (1∆gO2) i vodikov peroksid (H2O2) (Slika 2.) (Birben i sur. 2012).
Slika 2. Najčešći kisikovi radikali i reakcije koje ih proizvode (Preuzeto s -
http://www.waojournal.org/content/pdf/1939-4551-5-1-9.pdf)
ROS-ovi nastaju neezimatski, Fentonovom i Haberovom reakcijom (Slika 3.) i enzimatski
(monoamin oksidazom u mitohondrijima u procesu nastanka ATP-a, NADPH
oksidazom/oksidativnim praskom, ksantin oksidoreduktazom, mijeloperoksidazom u
eozinofilima i neutrofilima, u procesu stvaranja hipoklorične kiseline itd.). Funkcija ROS-ova
u stanicama je raznolika: posreduju fagocitozu, apoptozu, reakcije detoksifikacije, sudjeluju u
inflamatornim procesima, uključeni su u signalne puteve odrţavanja stanične homeostaze itd.
ROS-ovi reguliraju razne metaboličke i stanične procese uključujući proliferaciju i migraciju
stanica, ekspresiju gena, imunost i zacjeljivanje. Glavna mjesta nastanka ROS-ova u
stanicama su mitohondriji i endoplazmatski retikulum (Birben i sur. 2012).
Slika 3. Fentonova i Haber-Weissova reakcija (Preuzeto s -
http://www.waojournal.org/content/pdf/1939-4551-5-1-9.pdf)
Oksidativni stres je povezan s patogenezom brojnih bolesti poput astme (disfunckija
mitohondrija), ateroskleroze (oksidativna modifikacija LDL-a), Alzheimerove i Parkinsonove
bolesti (Noori 2012). Stanične membrane lako oksidiraju u prisutnosti reaktivnih radikala
zbog velike koncentracije nezasićenih masnih kiselina u membranama. Reakcija reaktivnih
radikala i lipidne membrane uzrokuje lipidnu peroksidaciju, koja rezultira formiranjem
lipidnog hidroperoksida, koji se moţe dalje razgraditi u aldehid poput malonaldehida ili 4-
hidroksi-nonenala. Posljedice lipidne peroksidacije su promijenjena membranska fluidnost,
„cross-linking“ membranskih proteina te nastajanje lipid-protein i lipid-DNA udruţivanja koji
mogu oteţavati funkcioniranje stanice. Proteini mogu biti direktno i indirektno oštećeni u
interakciji s reaktivnim radikalima, što rezultira peroksidacijom, promjenama u tercijarnoj
strukturi, proteolitičkom degradacijom i fragmentacijama. DNA, unatoč tome što je stabilna i
dobro zaštićena molekula, moţe doći u interakciju s reaktivnim radikalima i proći razna
oštećenja, poput modifikacije DNA baza, jednolančanih i dvolančanih lomova DNA, gubitka
purina, oštećenja na deoksiriboznim šećerima i oštećenja sustava popravka DNA. Posljedica
oštećenja DNA je modifikacija genetskog materijala koja rezultira staničnom smrti,
mutacijama, karcinogenezom i starenjem (Kunwar i Priyadarsini, 2011).
Nekontrolirana proizvodnja reaktivnih radikala moţe dovesti do njihove akumulacije i
uzrokovati oksidativni stres u stanicama. Zbog toga su stanice evolucijski stekle brojne
obrambene mehanizme (Kunwar i Priyadarsini 2011). Prva linija obrane je prevencija
stvaranja reaktivnih radikala, bilo izbjegavanjem sunčevog zračenja traţenjem zaklona ili
pakiranjem DNA u kromatin da bi se zaštitio genetski materijal. Kelacija metala je bitan
faktor u kontroli lipidne peroksidacije i fragmentacije DNA, tako da su metal-vezujući
proteini (feritin, transferin itd.) bitni u prevenciji oštećenja. Također postoje i enzimatski
sustavi, poput glutation-S-transferaze, koji sprječavaju formiranja reaktivnih radikala
katalizom stvaranja tioetera iz tiola i glutationa djelovanjem citokroma P450. Druga linija
obrane je presretanje postojećih reaktivnih radikala koje moţe biti posredovano neezimatskim
antioksidansima ili enzimatskim antioksidansima. Neenzimatsko presretanje uključuje
prijenos od osjetljivijih dijelova stanice do specijalnih kompartimenata gdje se reaktivni
radikali prevode u nereaktivne i neradikalne metabolite - tu spadaju vitamini C i E, glutation
itd.. Sve stanice eukariotskih organizama sadrţe jake antioksidativne enzime. Tri glavne
skupine tih enzima su superoksid dismutaze (SOD), katalaze i glutation peroksidaze (GPx).
Zadnji korak obrane je faza popravka staničnim mehanizmima (Slika 4.) (Sies 1997).
Slika 4. Shematski prikaz enzimatskog i neenzimatskog antioksidativnog sustava (Preuzeto s -
http://www.intechopen.com/books/oxidative-stress-and-chronic-degenerative-diseases-a-role-
for-antioxidants/oxidative-stress-in-diabetes-mellitus-and-the-role-of-vitamins-with-
antioxidant-actions )
1.1.1 Superoksid dismutaza (SOD)
Superoksid dismutaza je najvaţniji antioksidativni enzim za sve tipove stanice jer je
superoksid najčešći ROS proizveden iz raznih izvora. SOD ima tri oblika, CuZn-SOD, Mn-
SOD i EC-SOD koji su široko rasprostranjeni u svim tkivima čovjeka. Mn-SOD je lokaliziran
u mitohondrijskom matriksu. EC-SOD je primarno lokaliziran u ekstracelularnom matriksu,
osobito u područjima koja sadrţe velike količine kolagenih vlakana tipa I i oko plućnih i
sistemskih ţila. Općenito, CuZn-SOD i Mn-SOD se smatraju glavnim presretačima
superoksidnih radikala. SOD prevodi superoksidne radikale nastale aerobnim metabolizmom
u manje reaktivne vrste (kisik i vodikov peroksid) (Slika 5.), čija se redukcija dalje nastavlja s
katalazom i glutation peroksidazom (Birben i sur., 2012).
Slika 5. Shema djelovanja SOD-a u mitohondrijima (Preuzeto s -
http://www.trevigen.com/item/5/25/0/636/HT_Superoxide_Dismutase_Assay_Kit/)
1.1.2 Katalaza
Katalaza je tetramerni enzim koji se sastoji od četiri identične podjedinice, od kojih svaka
sadrţi jednu hem grupu. Pri visokim koncentracijama vodikovog peroksida u stanici katalizira
reakciju dvije molekule vodikovog peroksida u dvije molekule vode i molekularni kisik. Pri
niskim koncentracijama vodikovog peroksida, uz prisutnost donora vodika, djeluje
peroksidativno, uklanja vodikov peroksid uz oksidaciju supstrata (Slika 6.). Katalaza štiti
stanice od endogeno proizvedenog vodikovog peroksida. Iako katalaza nije esencijalna za sve
tipove stanica u standardnim uvjetima, igra vaţnu ulogu u stjecanju tolerancije na oksidatvni
stres u adaptivnom odgovoru stanica. Stopa preţivljavanja štakora izloţenih 100% kisiku je
povećana kad su se liposomi koji sadrţe SOD i katalazu ubrizgali intravenozno prije i za
vrijeme izloţenosti 100% kisiku (Mates i sur. 1999). Katalaza veţe NADPH radi sprječavanja
oksidativne inaktivacije vodikovim peroksidom dok ga reducira u vodu (Birben i sur., 2012).
Slika 6. Reakcije katalizirane katalazom (Preuzeto s - http://www.science-
projects.com/catalasekinetics.htm)
1.1.3 Glutation peroksidaza (GPx)
Glutation peroksidaza je glikoprotein koji sadrţi seleno-cisteinski ostatak u svakoj od svoje
četiri podjedinice i esencijalan je za enzimsku aktivnost. Glutation peroksidaza katalizira
redukciju hidroperoksida pomoću glutationa, štiteći time stanice sisavaca od oksidativnog
oštećenja. Metabolizam glutationa je jedan od esencijalnih antioksidativnih obrambenih
mehanizama. Kod sisavaca postoji pet izoenzima GPX, koji su prisutni u svim stanicama i
tkivima i čija razina ovisi o tipu tkiva. Glutation peroksidaza reducira lipidne hidroperokside i
vodikov peroksid u odgovarajuće alkohole i vodu, koristeći glutation kao donor elektrona koji
se oksidira do glutationdisulfida (GSSG) (Slika 7.). Iako GPX i katalaza oboje kataliziraju
redukciju vodikovog peroksida, samo GPX moţe reducirati lipidne i druge organske
hidroperokside koji su glavni uzrok niskih razina oksidativnog stresa (Mates i sur. 1999).
Slika 7. Shema djelovanja glutation peroksidaze (Preuzeto s -
http://cancerres.aacrjournals.org/content/60/14/3927.figures-only)
1.2 Mozak
Mozak je središnji organ ţivčanog sustava kod svih kraljeţnjaka i većine beskraljeţnjaka.
Mozak se nalazi u glavi, smješten blizu primarnih senzoričkih organa i najkompleksniji je
organ u kraljeţnjaka. Fiziološka funkcija mozga je ispoljavanje centralizirane kontrole nad
organima tijela, što omogućuje brze i koordinirane odgovore na promjene u okolišu. Osnovni
tipovi odgovora, poput refleksa, mogu biti posredovani leđnom moţdinom ili periferalnim
ganglijima, ali sofisticirana usmjerena kontrola ponašanja, zasnovana na kompleksnim
senzoričkim ulaznim signalima, zahtijeva sposobnosti integriranja informacija kakve ima
centralizirani mozak (Pelvig i sur. 2008).
Mozak se primarno sastoji od dvije skupine stanica - neurona i glija stanica. Glija stanice
sluţe za strukturalnu potporu, metaboličke funkcije, izolaciju, obranu, usmjeravanje razvoja i
popravak, dok neuroni imaju jedinstvenu sposobnost slanja signala specifičnim stanicama
preko velikih udaljenosti. Signali putuju preko aksona (mijelinizirano tanko protoplazmičko
vlakno neurona) u obliku elektrokemijskih izboja (akcijskog potencijala), a podraţuju druge
neurone preko sinapsi (specijalizirane pukotine). Akcijski potencijal putuje niz akson, dolazi
do sinapse, potiče lučenje neurotransmitera u sinapsu, koji se veţu na receptorne molekule u
membrani ciljne stanice (Kandel i sur. 2000).
Eksperimentalno, studijama oksidativne ravnoteţe se pristupa na dva načina: genetskom
eliminacijom antioksidativnog mehanizma i augmentacijom antioksidativne obrane. Prvim
načinom je pokazano kako je utišavanje Cu/Zn SOD u miševa povezano s povećanom stopom
neuronalnih oštećenja i smrti. Eliminacija mitohondrijskog SOD-a je pokazala drastičnije
učinke, koji su letalni u neonatalnom periodu. Miševi bez ekspresije Mn-SOD, uz zatajenje
srca, pate od poremećaja u CNS-u poput mitohondrijske vakuolizacije i oksidacije lipidnih
zaliha. Miševi s niskim razinama glutation peroksidaze su osjetljiviji na ishemiju i
neurotoksine. Miševi deficijentni u transportnom proteinu vitamina E razvijaju ataksiju i
neurodegenerativne bolesti, dok je povećan unos vitamina E pokazao da usporava progresiju
Alzheimerove bolesti (Browne i sur. 1999).
Povećana koncentracija metala (poput bakra i cinka) ubrzava nakupljanje amiloida. Za redoks
aktivne metale (poput bakra i ţeljeza) se pretpostavlja da sudjeluju u raznim oksidativnim
procesima, poput oksidacije proteina inducirane Aβ peptidom i inaktivacije antioksidativnih
mehanizama poput hem oksigenaze. Kelacija bakra Clioquinolom je pokazala da usporava
nakupljanje amiloidnih naslaga u Alzheimereovoj bolesti kod miševa (Huang i sur. 1999).
Genetski i biokemijski pristupi poboljšavanju antioksidativne obrane idu u prilog teoriji kako
je oksidativni stres kritičan mehanizam u neurodegeneracijskim putevima. Prekomjerna
ekspersija Cu/Zn SOD-a kod transgeničnih miševa i štakora pruţa značajnu zaštitu od
ishemije, hladnog edema i neurotoksina i promiče preţivljavanje neurona u kulturi stanica i
nakon transplantacije. Genetski inducirana povećana ekspresija Tn-SOD-a djeluje protektivno
na mitohondrije i stanice od oksidativnog stresa. Povećana ekspresija vanstaničnog SOD-a ili
glutation peroksidaze je pokazala protektivan učinak od raznih neurotoksina na CNS. Studije
na mušicama i gujavicama su pokazale da povećana ekspresija SOD-a i katalaze značajno
produţuje njihov ţivotni vijek. Kod knockout mušica, moţe se povećati ţivotni vijek do 60%
ţivotnog vijeka divljeg tipa ekspresijom SOD-a u motornim neuronima. Nova saznanja
impliciraju da antioksidativni enzimi i mali antioksidansi (vitamin E i C, kelacija metala)
igraju vaţnu ulogu u zaštiti CNS-a (Ischiropoulos i Beckman 2003).
Slobodne radikale mogu proizvesti sve stanice mozga, npr. NADPH oksidazu (enzim koji
katalizira produkciju superoksida kod fagocita) ne eksprimiraju samo mikroglija stanice, već i
neuroni i astroglija. Superoksid ni vodikov peroksid nisu osobito toksični, dok se hidroksilni
radikal često navodi kao jedan od najtoksičnijih slobodnih radikala in vivo. Proizvodnja
hidroksilnog radikala Haber-Weissovom ili Fentonovom reakcijom je prespora i
prenespecifično je reaktivan da bi bio značajno toksičan. Da bi se u kulturi stanica primijetila
toksičnost vodikovog peroksida, njegova koncentracija mora biti veća od koncentracije kisika
u mediju (Tammariello i sur. 2000).
Dva su moguća puta povećanja toksičnosti djelomično reduciranih kisikovih radikala. Upalne
stanice uvelike povećavaju toksičnost vodikovog peroksida lučenjem peroksida i produkcijom
hipokloraste kiseline i drugih hipohalogenih kiselina. Stanice mogu povećati toksičnost
superoksida produkcijom dušikovog monoksida, koji zajedno reagiraju i proizvode
peroksinitrit, najbrţom reakcijom poznatoj biologiji. U prisutnosti ugljikovog dioksida,
peroksinitrit modificira proteine u nitrotirozine. Nitrotirozini mogu biti formirani
peroksidaznom oksidacijom nitrita (nusprodukta metabolizma dušikovog monoksida) i
vodikovog peroksida (Slika 8.). Doprinos dušikovog monoksida neuralnim oštećenjima je
pokazan uporabom inhibitora sintaze dušikovog monoksida (NOS) na sojevima miševa
deficijentnim za neuralnu izoformu NOS-a (NOS1). Miševi deficijentni u NOS1 imalisu
manju incidenciju moţdanog udara, veću otpornost na neurotoksičnost N-metil-D-aspartatom
i 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridinom. Uz NOS1, studije su pokazale i učinak NOS2
(inducibilna forma NOS-a, primarno nađena u glija stanicama) na neuralna oštećenja. Plakovi
pacijenata oboljelih od multiple skleroze su pokazali povećanu imunoreaktivnost na NOS2 i
nitrotirozin. Nitracija je povezana s kompromitiranjem integriteta krvno moţdane barijere kod
multiple skleroze. Kod ţivotinjskih modela multiple skleroze i moţdanog udara, urična
kiselina se pokazala inhibitorom nitracije tirozina i pokazala je protektivan učinak na krvno
moţdanu barijeru. Blokada aktivacije NOS2 i mikroglija je pokazala neuroprotektivan učinak
kod Parkinsonove i Alzheimerove bolesti. Aktivacija mikroglija stanica (koja dovodi do
formiranja peroksinitrita) je povezana s Aβ peptidom uzrokovanom neurotoksičnosti
(Ischiropoulos i Beckman 2003).
Slika 8. Shema reakcija kisikovih radikala i dušikovog monoksida (Preuzeto s -
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC151889/)
1.3 Klasični lijekovi
1.3.1 Acetilsalicilna kiselina
Acetilsalicilna kiselina (aspirin) je trenutno nakorišteniji lijek na planeti, on je nesteroidni
antiinflammatorni lijek antipiretičkog i analgetičkog učinka. Glavni mehanizam njegovog
djelovanja je sprječavanje biosinteze prostaglandina preko inhibicije ciklooksigenaznih
enzima (Vane i Botting 2003).
Aspirin interferira s biosintezom cikličnih prostanoida (tromboksana A2 – TXA2 i
prostaciklina) i drugih prostaglandina (PGE2 i PGI2). Prostanoidi nastaju enzimski
kataliziranom oksidacijom arahidonske kiseline (iz membranskim fosfolipida). Prostaglandin
H-sintetaza metabolizira arahidonsku kiselinu u PGG2 i PGH2 zbog svog ciklooksigenaznog i
peroksidaznog učinka (Slika 9.). PGG2 dalje modificiraju specifične sintetaze do TXA2 i
prostaciklina.
Prostaglandin H-sintetaza (COX) postoji u dvije izoforme koje imaju velik postotak
homologije u aminokiselinskoj sekvenci. Prva izoforma (COX-1) je eksprimirana u
endoplazmatskom retikulumu većine stanica i sintetizira homeostatske prostaglandine
zasluţne za obavljanje normalnih staničnih funkcija, poput zaštite ţeluca mukoznim
sekretom, odrţavanja normalnog bubreţnog optoka krvi i regulacije aktivnosti i agregacije
trombocita. Druga izoforma (COX-2) se ne nalazi aktivna u većini stanica sisavaca, ali je brzo
induciraju inflamatorni signali i faktori rasta, što rezultira u sintezi prostaglandina koji
doprinose upalnom odgovoru.
Slika 9. Shema sinteze prostaglandina iz arahidonske kiseline (Preuzeto s -
http://circ.ahajournals.org/content/101/10/1206.full.pdf)
Aspirin ima značajan antitrombotičan učinak koji ostvaruje preko inhibicije PGH-sintaze
(COX) ireverzibilnom actilacijom Ser530 (u COX-1 izoformi) ili Ser516 (u COX-2 izoformi).
Aspirin potpuno inaktivira COX-1, dok COX-2 ne inaktivira potpuno, već mu mijenja
djelovanje tako da arahidoničnu kiselinu ne metabolizira u PGH2, već u 15-R-HETE. Kako
prisustvo aspirina onemogućuje produkciju PGH2, kod obje izoforme (nuţan korak u
produkciji prostanoida) dolazi do smanjene produkcije prostaglandina i tromboksana, što je
odgovorno za pozitivne i negativne učinke aspirina.
Aspirin također štiti LDL od oksidativnih modifikacija te tako sprječava ili usporava
aterosklerozu (Awtry i Loscalzo 2000).
Aspirin smanjuje razinu vaskularne produkcije O2-
smanjivanjem NAD(P)H oksidazne
aktivnosti (Tauseef i sur. 2008).
Predloţeno je nekoliko mehanizama antioksidativnog učinka aspirina. Salicilat je inhibitor
indukcije ovisne o citokinu genske ekspresije NOS-II preko mehanizma koji uključuje
aktivaciju NF-kB, što dovodi do smanjenja oksidativnog stresa koji prati produkciju citokina.
Aspirin redukcijom hidroksilnih radikala prelazi u derivate 2,3- i 2,5-dihidroksibenzoata, koji
sluţe kao markeri oksidativnog stresa i smanjuju protok oksidativnih radikala. Aspirin moţe
acetilirati lizinske nastavke proteina što sprječava njihovu oksidaciju, što je bitan faktor u
antioksidativnoj zaštiti lipoproteina i fibrinogena (Awtry i Loscalzo 2000).
Nedavna istraţivanja na ljudskim HepG2 stanicama raka su pokazala da aspirin pokreće
apoptozu kod stanica raka. Aspirin u stanicama raka povećava produkciju slobodnih radikala,
smanjuje dostupnost staničnog glutationa i inhibira aktivnost kompleks respiratornih
mitohondrijskih enzima, NADH-ubiquinon oksidoreduktaze (kompleks 1), citokrom c
oksidaze (kompleks 4) enzim mitohondrijskog matriksa, akonitazu. Apoptozu pokreće
promjena u mitohondrijskoj permeabilnosti, inhibicija sinteze ATP-a, smanjena ekspresija
antiapoptotičkog proteina Bcl-2, oslobađanje citokroma c i aktivacija proapoptotičke kaspaze-
3 i enzima popravka DNA PARP (Raza i sur. 2010).
1.3.2 Varfarin
Varfarin je derivat kumarina s antikoagulativnim učinkom, kojeg ostvaruje interferiranjem u
interkonverziji vitamina K i njegovog 2,3-epoksida. Vitamin K je kofaktor za karboksilaciju
glutamatnih nastavaka do γ-karboksiglutamata na N-terminalnim regijama vitamin K ovisnih
proteina (među njima su koagulacijski faktori 2, 7, 9 i 10). Inhibicijom interkonverzijskog
ciklusa vitamina K, varfarin inducira jetrenu produkciju djelomično dekarboksiliranih
proteina s reduciranom koagulantskom aktivnosti.
Karboksilacija potiče vezanje vitamin K ovisnih koagulacijskih faktora na fosfolipidne
površine (što ubrzava koagulaciju krvi). Za γ-karboksilaciju je potreban reducirani oblik
vitamina K (vitamin KH2). Kumarin sprječava formiranje vitamina KH2 inhibicijom enzima
vitamin K epoksid reduktaze i time ograničava γ-karboksilaciju Vitamin K ovisnih
koagulacijskih proteina (Slika 10.). Uz to, antagonisti vitamina K inhibiraju karboksilaciju
regulatornih antikoagulacijskih proteina C i S. Antikoagulativne efekte kurmarina moguće je
nadvladati niskim dozama vitamina K1 jer vitamin K1 zaobilazi vitamin K epoksid
reduktazu.Varfarin također interferira u karboksilaciji Gla proteina sintetiziranih u kostima.
Slika 10. Prikaz djelovanja varfarina na ciklus vitamina K (Preuzeto s -
http://content.onlinejacc.org/article.aspx?articleid=1132287)
Varfarin je racemična mješavina dva optički aktivna izomera, R i S forme, u otprilike
jednakim odnosima. Brzo se upija kroz probavni sustav, ima visoku biodostupnost te doseţe
najvišu koncentraciju u krvi za 90 minuta nakon oralnog uzimanja. Racemični varfarin ima
poluţivot između 36 i 42 sata, cirkulira vezan za proteine plazme (najčešće albumine) i
nakuplja se u jetri gdje dva izomera prolaze različite metaboličke puteve (Hirsh i sur. 2003).
S-varfarin se metabolizira u neaktivne metabolite (S-7 hidroksivarfarin) izoenzimom
CYP2C9, dok se R-varfarin metabolizira izoenzimima CYP1A2, CYP2C19 i CYP3A4 u 6-,
8- i 10-hidroksivarfarin. Neaktivni metaboliti se izlučuju urinom i fecesom (Teles i sur. 2012).
Odnos između doze varfarina i njegovog odgovora je uvjetovan genetskim i okolišnim
faktorima. Bitni genetski faktori su učestale mutacije u genu za kodiranje citokroma P450,
jetrenog enzima odgovornog za metabolizam S izomera varfarina. Opisano je nekoliko
genetskih polimorfizama za enzim, koji su povezani uz niţe potrebne doze i veću stopu
nuspojava krvarenja u odnosu na divlji tip enzima CYP2C9 i VKORC1. Uz brojne genetske i
okolišne faktore, na odgovor varfarina utječu drugi lijekovi, prehrana i brojne bolesti (Hirsh i
sur. 2003).
Interakcije varfarina s drugim supstancama se dijele u dvije kategorije: farmakokinetske i
farmakodinamičke efekte.
Interakcije koje modificiraju farmakokinetiku varfarina uključuju promjene u apsorpciji (koja
smanjuje antikoagulacijski efekt), metabolizmu (induciranjem izoenzima CYP2C9 što
smanjuje antikoagulativan učinak, enzimskom inhibicijom CYP2C9 koja povećava
antikoagulativan učinak) i transportu (spojevi koji se veţu na proteine plazme, osobito
albumin, dislociraju vezani varfarin što povećava koncentraciju slobodnog varfarina u krvi i
antikoagulativan učinak).
Interakcije koje modificiraju farmakodinamiku varfarina uključuju sinergizme (djelovanje na
hemostazu i smanjivanje sinteze koagulacijskih faktora), kompetitivni antagonizam (vitamin
K) i promjene u fiziološkoj kontroli ciklusa vitamina K (nasljedna otpornost na oralne
antikoagulante) (Teles i sur. 2012).
1.4 Biljni pripravci
1.4.1 Regulacija biljnih pripravaka u Europskoj Uniji
Od početaka ljudske civilizacije, biljni pripravci su se koristili za liječenje raznih bolesti i
poboljšanje zdravlja. Prema procjenama Svjetske zdravstvene organizacije 80% svjetske
populacije koristi biljne pripravke u nekom obliku iz zdravstvenih razloga. Veliki razlog
njihove popularnosti leţi u njihovoj lakoj dostupnosti i u tome što se smatraju zdravima, jer su
prirodni. Unatoč tome, mnogi od njih imaju ozbiljne nuspojave, bilo zbog direktnog toksičnog
učinka biljke, alergijskih reakcija, utjecaja kontaminanata, bilo zbog prisutnosti teških metala,
interakcije s klasičnim lijekovima ili nenavedenih farmaceutskih spojeva, namjerno i ilegalno
dodanih da bi se postigao ţeljeni učinak (Dulger, 2012.).
U skladu s europskim zakonodavstvom, da bi medicinski pripravci koji sadrţe biljne
supstance/preparate mogli biti pušteni na trţište, moraju spadati u jednu od tri navedene
kategorije:
1.) Proizvod se moţe svrstati u kategoriju medicinski tradicionalne upotrebe. Mora
postojati dovoljno informacija o njegovoj sigurnosti i njegova učinkovitost mora biti
uvjerljiva.
2.) Proizvod se moţe svrstati u kategoriju utemeljene upotrebe za medicinske svrhe.
Kriterij za to je znanstvena literatura koja potvrđuje da se aktivne supstance proizvoda
utemeljeno koriste u medicinske svrhe unutar Unije bar deset godina, s utvrđenom
učinkovitošću i prihvaćenom razinom sigurnosti.
3.) Proizvod se moţe odobriti nakon provjere prijave za puštanje na trţište koja se sastoji
od podataka o sigurnosti i učinkovitosti iz firme proizvođača (samostojeća studija) ili
kombinacije vlastitih podataka firme i postojećih bibliografskih podataka (mješovita
aplikacija). (DIRECTIVE 2001/83/EC)
1.4.2 Ginko
Ginko (Ginkgo biloba) je jedini ţivući član porodice Ginkgoaceae i spada u „žive fosile“
(najduţe ţivuće vrste na planeti), budući da postoje fosilni nalazi stari 150 milijuna godina.
Lišće i plodovi ginka su često korišteni u tradicionalnoj kineskoj medicini za liječenje
plućnih, srčanih i mokraćnih problema te koţnih bolesti. Prije dvadesetak godina
standardiziran je ekstrakt lista ginka, Egb761, i najčešće se koristi kao suplement za
kognitivne probleme.
Standardizirani ekstrakt lista ginka Egb 761 sadrţi 24 % flavonoidnih glikozida, 6 %
terpenskih laktona, i manje od 5 ppm ginkolične kiseline (Droy-Lefaix, 2005).
Glavni farmakološki aktivni spojevi u ekstraktu lista ginka su flavonoidi i terpenoidi.
Flavonoidi prisutni u ekstraktu lista ginka su flavoni, flavonoli, tanini, biflavoni i vezani
glikozidi kvercitina i kamferola na 3-ramnozidima i p-kumarinskim esterima. Oni djeluju kao
antioksidansi, inhibitori enzima i kelatori kationa. Flavonoidni sastav listova ginka varira
između sezona. Biodostupnost flavonoida je relativno niska zbog ograničene apsorpcije i brze
eliminacije. Glikozidni oblik flavonoida se slabo apsorbira u crijevu, samo aglikonični oblik
se moţe direktno apsorbirati. Neapsorbirane flavonoide koji dospiju u debelo crijevo
metaboliziraju bakterije a nakon toga se apsorbiraju u crijevu. Apsorbirani flavonoidi
dospijevaju do jetre, ondje se metaboliziraju u konjugirane derivate čija biološka aktivnost
nije uvijek ista kao u originalnih spojeva. Dva su tipa terpenoida prisutna u ekstraktu lista
ginka: ginkolidi i bilobalid (Bilia, 2002).
Ekstrakt lista ginka je pokazao pozitivne učinke u liječenju neurodegenerativnih bolesti poput
Alzheimerove, kardiovaskularnih bolesti, raka, stresa, gubitka pamćenja, tinitusa, bolesti
vezanih uz starenje i psihijatrijskih poremećaja poput šizofrenije. Ti učinci se objašnjavaju s
više mehanizama, poput antioksidativnog učinka, antiagregacijskog učinka (za srčane i krvno-
moţdane bolesti), inhibicije agregacije beta amiloidnih peptida (za usporavanje progresije
Alzheimerove) i smanjene ekspresije perifernih benzodiazepinskih receptora (za olakšanje
stresa i poboljšanje cirkulacije) (McKenna i sur. 2001).
Smatra se da je glavni mehanizam terapeutskog učinka ekstrakta lista ginka na kronične
bolesti (neurodegenerativne i kardiovaskularne bolesti i rak) njegovo antioksidativno
djelovanje. Dva su predloţena mehanizma njegovog djelovanja: vezanja slobodnih radikala i
indirektna inhibicija formiranja slobodnih radikala. Ekstrakt lista ginka moţe vezati kisikove
radikale poput hidroksilnih radikala, peroksidne radikale, superoksidnog aniona, NO-,
vodikovog peroksida i ţeljezne ione. Ekstrakt lista ginka moţe pojačati aktivnost
antioksidativnih enzima poput superoksid dismutaze, glutation peroksidaze katalaze i hem-
oksigenaze-1 i tako indirektno djelovati kao antioksidant. Studije također pokazuju da
ekstrakt lista ginka povećava ekspresiju mitohondrijskih enzima poput NADH dehidrogenaze,
što utječe na stvaranje kisikovih radikala u mitohondrijima, jer djeluje izravno na oksidativnu
fosforilaciju, što povećava razinu ATP-a i regulaciju energetskog metabolizma. U usporedbi s
drugim antioksidansima, ekstrakt lista ginka je regulativan i adaptivan, moţe dilatirati i
kontrahirati krvne ţile i kontrolirati neurokemikalije i neuroendokrine indikatore ovisno o
situaciji. Glavne aktivne tvari tih mehanizama su flavonoidi (kvercetin kempferol) i terpenoidi
(ginkolidi i bilobalid), koji doprinose antioksidativnom učinku na različite načine. Flavonoidi
djeluju preko inhibicije enzima ciklooksienaze 2 (COX2), koja je dio ciklusa sinteze
prostaglandina. Bilobalid povećava aktivnost antioksidativnih enzima (SOD-a i katalaze) i
poboljšava vijabilnost stanica.
Proantocijanidini prisutni u ekstraktu lista ginka se veţu na proteine i inaktiviraju
antioksidativne enzime (katalazu, glutation peroksidazu i laktat dehidrogenazu), tako da
njihova prisutnost u ekstraktu moţe smanjivati antioksidativni učinak ginka (Mahadevan i
Park, 2008).
1.4.3 Gotu kola
Gotu kola (Centella asiatica) je penjačica koja spada u porodicu Apiaceae, a nalazi se u
tropskom i suptropskom području Indije, Pakistana, Šri Lanke, Madagaskara, Juţne Afrike i
Istočne Europe. Cijela biljka se koristila za medicinske svrhe u tradicionalnoj indijskoj i
kineskoj medicini, za liječenje visokog tlaka, revitalizaciju moţdanih stanica i ţivaca,
emocionalne poremećaje i koţne bolesti (Gohil i sur. 2010).
Farmakološki aktivni spojevi gotu kole su triterpenski saponini (triterpenoidi) podnazivom
aziatikozidi od kojih su najpoznatiji madekasozid i madazijatska kiselina. Ti triterpeni saponini
i njihovi sapogenini se smatraju odgovornima za zaliječivanje rana i vaskualrno djelovanje
produkcijom kolagena na mjestu rane. Drugi spojevi izolirani iz gotu kole, poput brahmozida
i brahminozida, mogu biti odgovorni za djelovanje na CNS i relaksantno djelovanje, ali
njihovo djelovanje još nije klinički potvrđeno. Ekstrakti gotu kole sadrţe glikozide koji su
pokazali antifertilni učinak kod miševa. Centelozid i njegovi derivati su se pokazali
efikasnima u tretmanima venske hipertenzije. Među ekstraktima gotu kole se nalaze biljni
steroli, flavonoidi i spojevi za koje se ne zna farmakološka aktivnost (tanini, esencijalne
kiseline, fitosteroli, slobodne aminokiseline, flavonoidi, alkaloidi i masne kiseline)
(Srivastava i sur. 1997).
Gotu kola revitalizira mozak i ţivčani sustav, povećava koncentraciju i usporava starenje.
Studija na štakorima je pokazala antioksidativan učinak i kognitivno stimulirajući učinak.
Štakori tretirani s gotu kolom pokazuju dozno ovisan napredak kognitivnog ponašanja u
testovima pasivnog izbjegavanja i labirintskim testovima. Značajno smanjenje razine MDA i
povećanje razine katalaze i SOD-a je primijećeno kod štakora tretiranih visokim dozama gotu
kole (Hussin i sur. 2005). Također je dokazana povećana razina fosforilacije CREB-a (cyclic
AMP response element binding proteina) u kulturi stanica neuroblastoma i embrijskim
kortikalnim stanicama štakora tretiranih ekstraktom gotu kole. Pretpostavlja se da je za to
djelovanje odgovoran signalni putERK/RSK (extra cellular signal-regulated kinase-ribosomal
S6 kinaza). Studija na miševima, koji su oralno uzimali ekstrakt gotu kole 14 dana, pokazala
je povećanje razine antioksidativnih enzima (SOD-a, katalaze i glutation peroksidaze).
Derivati azijatske kiseline povećavaju razine antioksidativnih enzima u kulturi kortikalnih
stanica pa se pretpostavlja da štite stanice od oksidativne štete nastale zbog izloţenosti višim
razinama glutamata u ţivčanim stanicama. Azijatikozidni derivati su djelovali protektivno na
beta-amiloid neurotoksičnost u kulturi B103 stanica. Tri azijatikozidna derivata pokazuju
inhibiciju apoptoze uzrokovane beta-amiloidima i slobodnim radikalima (Gohil i sur. 2010).
1.4.4 Borovnica
Borovnica (Vaccinium myrtillus) je nisko rastući grm čiji plodovi su bogati antocijaninima i
daju im karakterističnu plavu boju. Apsorpcija antocijana je brza, ali imaju slabu
biodostupnost (11-22 %).
Antocijani su se, mehanizmima vezanja slobodnih radikala i keliranjem metalnih iona,
pokazali kao dobri antioksidansi. Štakori tretirani ekstraktom plodova borovnica su pokazali
smanjenu lipidnu peroksidaciju u serumu i povećanu razinu glutationa u stanicama srčanog
mišića (Chu i sur. 2011).
1.4.5 Vulkan
Vulkan je dodatak prehrani za poboljšanje muške potencije. Sastav vulkana, po navodima
proizvođača, trebalibi biti samo biljni ekstrakti: ekstrakt lista ginka, matičnjaka (Melissa
officinalis), hmelja (Humulus lupulus) i origana (Origanum vulgare). Ekstrakt matičnjaka je
pokazao niz neuroprotektivnih i antioksidativnih učinaka mehanizmima inhibicije MAO-A i
vezanja vodikovog peroksida (López i sur. 2009). Ekstrakt hmelja sadrţi brojne polifenole
koji sprječavaju oksidativna oštećenja DNA vezanjem hidroksilnih radikala i superoksidnih
radikala (Wang i sur. 2014). Fenoli nađeni u ekstraktu origana pokazuju antioksidativan
učinak vezanjem slobodnih radikala i u studijama su pokazali značajan učinak u smanjenju
lipidne peroksidacije (Aranha i Jorge. 2012).
1.5 Interakcije klasičnih lijekova i biljnih pripravaka
Rastuća globalna popularnost alternativne medicine rezultirala je povećanim interesom za
posljedice interakcije biljnih pripravaka i klasičnih lijekova, osobito za lijekove uskog
sigurnosnog raspona doze.
Studija provedena 2007. je pokazala kako 15% pacijenata tretiranih klasičnom
farmakoterapijom uzima biljne pripravke. Kod njih 40% su primijećene moguće interakcije
klasičnih lijekova s biljnim suplementima, ali je često teško odrediti točan uzrok interakcije,
osobito kod onih čija terapija uključuje više lijekova (Dulger, 2012.).
1.5.1 Ginko i varfarin
Studije rađene in vitro i na štakorima su pokazale da ginko utječe na enzime CYP2C9,
CYP2D6 i CYP2E1, dok su rezultati utjecaja na CYP3A4 nejasni ili su pokazali da utjecaj
ginka nije klinički značajan. Farmakološke studije na pacijentima i zdravim volonterima nisu
pokazale interakciju između ginka i varfarina. Prijavljena su krvarenja kod zajedničkog
uzimanja, ali nema dokaza koji bi objasnio mehanizam ni pokazao da je to rezultat interakcije
(Beikang i sur. 2014).
1.5.2 Ginko i acetilsalicilna kiselina
Zabiljeţena su krvarenja kod pacijenata koji su uzimali ekstrakt lista ginka uz acetilsalicilnu
kiselinu, što bi moglo biti rezultat interakcije inhibicijskog utjecaja flavonoida i terpenoida
prisutnih u ekstraktu lista ginka na zgrušavanje krvi. (Abebe, 2002)
1.6 Cilj istraţivanja
Cilj ovog rada je istraţiti kakva je interakcija između lijekova (čiji su učinci na oksidativni
stres dobro poznati) i biljnih pripravaka na oksidativni stres mozga. Mjerenjem markera
oksidativnog stresa kod grupa koje primaju pojedinačne supstance i grupa koje dobivaju
kombinacije supstanci usporedit će se razina oksidativnog stresa na tri regije mozga.
2. Materijali i metode
2.1 Materijali
Priloţen je tablični prikaz otopina korištenih u istraţivanju.
Tablica 1. Priprema pokusnih otopina
Otopina Priprema otopine
Otopina D (određivanje proteina
prema Lowryu)
Pomiješati otopine u omjeru A:B:C=48:1:1
A: 2% (w/v) Na2CO3 u 0,1 mM NaOH
B: 1% (w/v) natrij-kalij tartarat u dH2O
C: 0,5% (w/v) CuSO4× 5H2O u dH2O
Otopina E (određivanje proteina
prema Lowryu)
Pomiješati Folin & Ciocalteu's phenol reagent i
dH2O u omjeru 2:1
0,81% TBA (određivanje MDA)
Otopiti 0,8 g TBA u 40 mL dH2O uz lagano
zagrijavanje. Dodati 500 μL 5M NaOH te nadopuniti
s dH2O do 100 mL.
Reagens A (određivanje MDA) Pomiješati 100 μL 8,1% SDS sa 750 μL 20% octene
kiseline namještene na pH=3,5 i 750 μL 0,81% TBA
0,5 M pufer PBS (Phosphate
Buffered Saline) - određivanje GSH
Pomiješati 17 mL 1 M Na2HPO4× 2 H2O (otopiti 3 g
Na2HPO4 × 2H2O u dH2O i nadoliti dH2O do 17 mL)
i 183 mL 1 M Na2HPO4× 12 H2O (otopiti 65,5 g
Na2HPO4×12 H2O u dH2O i nadoliti dH2O do 183
mL)
0,5 M EDTA (određivanje GSH) Otopiti 37,2 g EDTA u dH2O i nadoliti dH2O do 200
mL
0,25 M pufer PBS s 0,25 M EDTA
(određivanje GSH)
Pomiješati 200 mL 0,5 M pufer PBS i 200 mL 0,5 M
EDTA
0,035 M HCl (određivanje GSH) Pomiješati 7 mL 0,1M HCl s 193 mL dH2O
Ellmanov reagens (određivanje
GSH)
Otopiti 20 mg DTNB (ditionitrobenzoična kiselina) u
5 mL 0,5M pufer PBS s 0,25 M EDTA
0,8 mM NADPH (određivanje GSH) Otopiti 6,67 mg NADPH s 10 mL 0,5M pufer PBS s
0,25 M EDTA
50 mM PBS (određivanje SOD) Pomiješati 17 mL (otopiti 1,56 g NaH2PO4× 2H2O u
50 mL dH2O) i 183 mL ( otopiti 5,678 g Na2HPO4 u
200 mL dH2O), namjestiti pH=7,8 te nadopuniti do
800 mL s d H2O
50 mM PBS s 0,1 mM EDTA
(određivanje SOD)
Otopiti 3,72 mg EDTA u 100 mL 50 mM PBS
Reakcijska otopina A (određivanje
SOD)
Pomiješati 190 mL 0,05 mM citokroma c (otopiti 29
mg citokroma c u 190 mL 50 mM PBS s 0,1 mM
EDTA ) i 19 mL 1 mM ksantina ( uz lagano
zagrijavanje otopiti 3 mg ksantina u 19,74 mL 1 mM
NaOH)
10 mM H2O2 (određivanje katalaze) 100 μL 30% H2O2 pomiješati sa 100 ml dH2O
Otopina B enzima ksantin oksidaze
(aktivnost 0,8 U/mL) (određivanje
SOD)
Pomiješati 40 μL ksantin oksidaze i 960 μL dH2O
2.2 Metode
2.2.1 Tretman ţivotinja
Za potrebe istraţivanja korišteno je 48 štakora soja Y59, podijeljenih u osam grupa po pet
štakora i dvije grupe po četiri štakora (Tablica 2.). Devet grupa je bilo dnevno tretirano
odgovarajućim preporučenim dozama (mg/kg) od strane proizvođača (referentne doze od
strane proizvođača, korekcija na bazi mase ţivotinja) acetilsalicilne kiseline, ginka, varfarina,
vulkana, goji bobica, gotu kole i borovnica i njihovim kombinacijama, dok je kontrolna grupa
bila tretirana fiziološkom otopinom. Tretiranje se provodilo 15 dana po standardnom OECD
protokolu 407 za ispitivanje subkronične toksičnosti.
Tablica 2. Pokusne skupine i doziranje preparata
Oznaka skupine Sastav pokusne otopine Doziranje
0.KONTROLA Fiziološka otopina 2 mL svaki dan
1.GINKO Komercijalni pripravak ginka Ginkgo
biloba (GINKOCEL Dietpharm)- 400
mg preparata sadrţi 120 mg ginka
5,71 mg preparata/kg
svaki dan
2.VULKAN Komercijalni pripravak mješavine
različitih biljaka: hmelj, matičnjak,
ekstrakt origana i Ginkgo biloba
(VULKAN Avala pharma)- 1650 mg
preparata sadrţi 150 mg ginka
23,5 mg preparata/kg
svaki dan
3.ACETILSALICILNA
KISELINA
Otopina 0,86 mg acetilsalicilne
kiseline na 1 mL vode
4,2 mg/kg svaki dan
4.VARFARIN Otopina varfarina Kroz 12 dana fiziološka
otopina,a zadnja 3 dana
varfarin u dozi 0,4
mg/mL
5.VULKAN+VARFARIN Kombinacija otopina skupina 2.
Vulkan i 4. varfarin
Kroz 12 dana otopina
2.Vulkan, nakon 13.
dana u tretiranje je
uključena i otopina
4.Varfarin
6.VULKAN+ACETILSA
LICILNA KISELINA
Kombinacija otopina skupina 2.
Vulkana i 3. Acetilsalicilna kiselina
Kroz 12 dana otopina
2.Vulkan, nakon 13.
dana u tretiranje je
uključena i otopina 3.
Acetilsalicilna kiselina
7.GINKO+VARFARIN Kombinacija otopina skupina 1.
Ginko i 4.Varfarin
Kroz 12 dana otopina 1.
Ginko, nakon 13. dana u
tretiranje je uključena i
otopina 4. Varfarin
8.GINKO+ACETILSALI Kombinacija otopina skupina 1. Kroz 12 dana otopina 1.
CILNA KISELINA Ginko i 3. Acetilsalicilna kiselina Ginko, nakon 13. dana u
tretiranje uključena i
otopina 3. Acetilsalicilna
kiselina
9.GINKALERT Komercijalni pripravak Ginko biloba
i mješavine biljnih pripravaka: Gota
Kola (Centella asiatica) s 10%
triterpena i borovnica s 36%
antocijanozida (GINKALERT
Solaray) – 720 mg preparata sadrţi
120 mg ginka
10,2 mg preparata/kg
2.2.2 Izolacija organa i obrada tkiva
Nakon 15 dana tretmana, ţivotinje su anestezirane mješavinom Xilapana i Narketana, i.p. 25
mg/kg) i ţrtvovane, zatim su im izolirani mozgovi. Sa svakog mozga je izoliran i izvagan dio
korteksa, prefrontalnog korteksa i malog mozga te stavljen u Eppendorf-epruvetu s fosfatnim
puferom u volumenu 10× većim od mase uzorka. Uzorci su homogenizirani ultrazvučnim
homogenizatorom i zatim centrifugirani 15 minuta na 15 000 g i pri 60C. Nakon
centrifugiranja je odvojen supernatant i pohranjen u hladnjaku na -200C do početka testiranja.
2.2.3 Određivanje proteina metodom po Lowryju
Metoda određivanja proteina po Lowryju (1951.) je biokemijski test za određivanje ukupne
koncentracije proteina u otopini, a temelji se na biuretskoj reakciji, promjeni boje otopine
zbog oksidacije aromatskih aminokiselina u njoj. U biuretskoj reakciji ioni bakra reagiraju s
peptidnim vezama proteina u luţnatom mediju, pri čemu dolazi do njihove redukcije u Cu+.
Nakon toga se u reakcijsku smjesu dodaje fenolni reagens koji reagira sa Cu+–proteinskim
kompleksom i bočnim ograncima aromatskih aminokiselina, prilikom čega uzrokuje njihovu
oksidaciju i svoju redukciju, što dovodi do nastanka plavog obojenja. Promjena apsorbancije
uslijed obojenja mjeri se pomoću spektrofotometra.
Metodom po Lowryju određene su razine proteini u štakorima. Uzorci mozgova razrijeđeni su
10 puta u PBS-u. U epruvete je dodano po 100 μL razrijeđenog uzorka i 2 mL otopine D
(Tablica 1) i inkubirano 10 min na sobnoj temperaturi. Sve je rađeno u duplikatima. Zatim je
dodano 200 μL otopine E (Tablica 1), nakon čega je snaţno vorteksirano i inkubirano 30 min
na sobnoj temperaturi. Količina proteina određena je na spektrofotometru mjerenjem
apsorbancije na valnoj duljini od 600 nm. Kao standard, upotrijebljen je albumin goveđeg
seruma (eng. Bovine serum albumin, BSA) u koncentracijama od 2 mg/mL prema manjim
koncentracijama (2; 1; 0,25; 0,125 i 0 mg/mL). Iz standardne krivulje ovisnosti apsorbancije o
koncentraciji BSA, određen je nagib pravca. Preko nagiba pravca izračunata je koncentracija
proteina u uzorcima. Koncentracija proteina izraţena je kao mg/mL.
2.2.4 Količina ukupnog glutationa (GSH)
Koncentracija ukupnog glutationa u mozgu štakora određena je prema modificiranoj metodi
koju je opisao Tietze (1969). Metoda se temelji na reakciji tiolnog reagensa 5,5-ditiobis-2-
nitrobenzoične kiseline (DTNB, Ellmanov reagens) s GSH, pri čemu se stvara kromofor 5-
tionitrobenzoična kiselina (TNB) koja se moţe fotometrijski očitati na 412 nm. Uz TNB,
stvara se i GS-TNB koji se reducira pomoću GSH reduktaze (GR) i NADPH, pri čemu se
otpušta druga molekula TNB i reciklira GSH. Brzina nastanka TNB proporcionalna je
recilirajućoj reakciji, koja je proporcionalna koncentraciji glutationa u uzorku. Pri ovoj
metodi, sav oksidirani GSH (disulfid GSSG) prisutan u reakcijskoj smjesi ili nastao iz
miješanog disulfida GSH s GS-TNB, brzo se reducira do GSH. Konačan rezultat koji se
dobije odgovara ukupnoj koncentraciji reduciranog i oksidiranog GSH u uzorku.
Koncentracija ukupnog GSH mjeri se u mikrotitarskoj pločici. U jednu jaţicu dodaje se 20 μL
uzorka, 40 μL 0,035 M HCl i 40 μL 10 mM DTNB te se mjeri apsorbancija na valnoj duljini
od 415 nm. Zatim se dodaje 100 μL otopina GR i NADPH i mjeri se apsorbancija tijekom 5
min. Priprema navedenih otopina prikazana je u Tablici 2. Kao slijepa proba korišten je PBS u
reakcijskoj smjesi. Za standard korištene su koncentracije reduciranog GSH (5-100 μM).
Nacrtani su pravci za sve standarde, kao promjena apsorbancije u vremenu. Očitani su nagibi
pravaca, nacrtan je pravac kao ovisnost nagiba pravca o koncentraciji GSH. Konačno, taj
dobiveni pravac korišten je za dobivanje koncentracije ukupnog GSH u uzorku prema formuli
(nagib pravcauzorak – nagib pravcaslijepa proba)/nagib pravcastandard. Koncentracija ukupnog GSH
prikazuje se kao μg GSH po mg proteina.
2.2.5 Mjerenje enzimske aktivnosti superoksid dismutaze (SOD)
Određivanje aktivnosti superoksid dismutaze provedeno je prema posrednoj metodi po Flohé i
Ötting (1984.) koja se temelji na inhibiciji redukcije citokroma C u sustavu ksantin/ksantin
oksidaza.
U ovoj metodi korištene su dvije slijepe probe. Prva slijepa proba sastojala se samo od
otopine A (Tablica 1) te je apsorbancija u spektrofotometru mjerena na 550 nm tijekom 3
min. Druga slijepa proba sluţila je za namještanje aktivnosti ksantin oksidaze (XOD). U
epruvetu Eppendorf- je stavljeno 1,45 mL otopine A, 25 μL dH2O i 20-30 μL XOD (0,8
U/mL) (Tablica 1). Odmah nakon dodavanja enzima i brzog miješanja, reakcijska smjesa
prelivena je u kivetu i mjerena je promjena apsorbancije, odnosno aktivnost enzima ksantin
oksidaze tijekom 3 min na 550 nm. Aktivnost XOD mora biti oko 0,025 U/min. U ovom
slučaju, odgovarajući volumen XOD bio je 25 μL. Nakon što se postigla optimalna aktivnost
SOD, analizirani su uzorci. U svaku reakcijsku smjesu, umjesto dH2O, dodano je 25 μL
uzorka te odgovarajući volumen XOD (30 μL) i odmah nakon toga mjerena je apsorbancija u
spektrofotometru. Enzimska aktivnost mjerena je kao postotak inhibicije aktivnosti XOD te
izraţena kao %inhibicije=100-(ΔAuzorka/ΔAslijepa proba)×100.
2.2.6 Mjerenje enzimske aktivnosti katalaze
Aktivnost katalaze određena je spektrofotometrijskom metodom po Aebiju (1984). Prema toj
metodi, aktivnost katalaze određuje se kao količina potrošenog H2O2. U reakcijsku smjesu u
kivetu dodano je 980 μL10 mM H2O2 (Tablica 1), a ostatak do ukupnog volumena od 1 mL
bio je nerazrijeđeni uzorak. Nakon toga je na spektrofotometru mjereno smanjenje količine
H2O2 pri 240 nm tijekom jedne minute. Aktivnost katalaze izraţena je preko ekstinkcijskog
koeficijenta H2O2 (ε= 39,4 mM–1
cm–1
) kao U/mg proteina, što odgovara μmol razgrađenog
H2O2 po minuti po miligramu proteina.
2.2.7 Mjerenje količine lipidne peroksidacije
Količina lipidne peroksidacije određivana je modificiranom metodom koju su opisali Lamsal i
sur. 2007. Metoda nalaţe mjerenje koncentracije malondialdehida (MDA), jednog od glavnih
produkata lipidne peroksidacije. Temelji se na reakciji MDA s tiobarbiturnom kiselinom, pri
čemu se stvara kromogen koji je moguće mjeriti spektrofotometrijski.
U eppendorf-epruvetu je dodano 100 μL 8,1%-tni SDS, 750 μL 20%-tne octene kiseline
(pH=3,5), 750 μL 0,8%-tne TBA (Tablica 1) i 100 μL homogenog uzorka. Otopina je zatim
stavljena u vodenu kupelj na 100 °C na 60 minuta. Nakon toga je naglo ohlađena na ledu i
zatim centrifugirana 15 min na 5000 rpm pri 4–6 °C. Supernatant je odvojen i izmjerena je
apsorbancija pri 532 nm iz koje je putem Beer-Lambertovog zakona izračunata ukupna
koncentracija MDA, izraţena kao nmol MDA po mg proteina.
2.2.8 Statistička analiza podataka
Softverski program "Statistica" korišten je za statističku analizu istraţivanjem dobivenih
podataka. Provedena je analiza varijance (ANOVA) koja je dala pregled u podudarnostima i
razlikama između pojedinih pokusnih grupa, a razlike između grupa potvrđene su LSD post
hoc testom. Određena je vrijednost medijana i standardne devijacije pokusnih ţivotinja u
grupama. Dobiveni podatci korišteni su u daljnjoj analizi podudarnosti i razlika između
pojedinih varijabli koje su mjerene u ovome istraţivanju.
3. Rezultati
3.1 Aktivnost katalaze
Mjerenje aktivnosti katalaze u prefrontalnoj regiji mozga pokazalo je da grupe tretirane
ginkom, varfarinom, vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom te
ginkalertom pokazuju smanjenu stopu aktivnosti u usporedbi s kontrolnom grupom, grupa
tretirana vulkanom pokazuje višu stopu aktivnosti, a grupe tretirane acetilsalicilnom
kiselinom, ginkom i varfarinom te ginkom i acetilsalicilnom kiselinom imaju sličnu stopu
aktivnosti kao kontrolna grupa. Niti jedna promjena nije bila statistički značajna. (Slika 11.)
Slika 11. Aktivnost katalaze u prefrontalnoj regiji mozga (P CAT). C: kontrolna grupa, G:
grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana
acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i
varfarinom, v+S: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana
ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom
kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.
srednja vrijednost
standardna devijacija
vrijednosti koje
odskaču
ekstremi
Mjerenje aktivnosti katalaze u kortikalnoj regiji je pokazalo da grupe tretirane ginkom,
varfarinom, vulkanom i varfarinom te vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom pokazuju niţu
stopu aktivnosti od kontrolne grupe, dok grupe tretirane vulkanom, acetilsalicilnom
kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom imaju
sličnu stopu aktivnosti kao kontrolna grupa. Niti jedna promjena nije bila statistički značajna.
(Slika 12.)
Slika 12. Aktivnost katalaze u kortikalnoj regiji mozga (C CAT). C: kontrolna grupa, G:
grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana
acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i
varfarinom, v+S: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana
ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom
kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.
srednja vrijednost
standardna devijacija
vrijednosti koje
odskaču
ekstremi
Mjerenje aktivnosti katalaze u regiji malog mozga je pokazalo da grupe tretirane ginkom,
vulkanom, acetilsalicilnom kiselinom, vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom
kiselinom, ginkom i varfarinom te ginkalertom imaju manju stopu aktivnosti od kontrolne
grupe, grupa tretirana ginkom i acetilsalicilnom kiselinom ima povećanu stopu aktivnosti u
odnosu na kontrolnu grupu, dok grupa tretirana varfarinom ima sličnu stopu aktivnosti kao
kontrolna grupa. Niti jedna promjena nije bila statistički značajna. (Slika 13.)
Slika 13. Aktivnost katalaze u regiji malog mozga (CI CAT). C: kontrolna grupa, G: grupa
tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana acetilsalicilnom
kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i varfarinom, v+S:
grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana ekstraktom ginka
i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom kiselinom, GOI: grupa
tretirana ginkalertom.
srednja vrijednost
standardna devijacija
vrijednosti koje
odskaču
ekstremi
3.2 Aktivnost SOD
Mjerenje aktivnosti SOD-a u prefrontalnoj regiji mozga pokazalo je da grupe tretirane
vulkanom, acetilsalicilnom kiselinom, varfarinom, vulkanom i varfarinom, vulkanom i
acetilsalicilnom kiselinom te ginkom i acetilsalicilnom kiselinom imaju višu stopu aktivnosti
od kontrolne grupe, grupa tretirana ginkalertom ima manju stopu aktivnosti, a grupe tretirane
ginkom te ginkom i varfarinom imaju stopu aktivnosti poput kontrolne grupe. Porast
aktivnosti je statistički značajan kod grupe tretirane vulkanom i varfarinom.(Slika 14.)
Slika 14. Aktivnost SOD-a u prefrontalnoj regiji mozga (P SOD). C: kontrolna grupa, G:
grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana
acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i
varfarinom, v+S: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana
ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom
kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.
srednja vrijednost
standardna devijacija
vrijednosti koje
odskaču
ekstremi
Mjerenje aktivnosti SOD-a u kortikalnoj regiji mozga pokazalo je da grupe tretirane ginkom,
acetilsalicilnom kiselinom, varfarinom, ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom
kiselinom te ginkalertom imaju manju stopu aktivnosti u odnosu na kontrolnu grupu, dok
grupe tretirane vulkanom, vulkanom i varfarinom te vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom
imaju stopu aktivnosti poput kontrolne grupe. Pad aktivnosti je statistički značajan kod grupe
tretirane ginkalertom. (Slika 15.)
Slika 15. Aktivnost SOD-a u kortikalnoj regiji mozga (C SOD). C: kontrolna grupa, G: grupa
tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana acetilsalicilnom
kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i varfarinom, v+S:
grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana ekstraktom ginka
i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom kiselinom, GOI: grupa
tretirana ginkalertom.
srednja vrijednost
standardna devijacija
vrijednosti koje
odskaču
ekstremi
Mjerenje aktivnosti SOD-a u regiji malog mozga pokazalo je da grupe tretirane
acetilsalicilnom kiselinom, varfarinom, vulkanom i varfarinom, ginkom i varfarinom te
ginkalertom imaju manju stopu aktivnosti u odnosu na kontrolnu grupu, dok grupe tretirane
ginkom, vulkanom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkom i acetilsalicilnom
kiselinom imaju stopu aktivnosti poput kontrolne grupe. Pad aktivnosti je statistički značajan
kod grupe tretirane acetilsalicilnom kiselinom. (Slika 16.)
Slika 16. Aktivnost SOD-a u regiji malog mozga ( CI SOD). C: kontrolna grupa, G: grupa
tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana acetilsalicilnom
kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i varfarinom, v+S:
grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana ekstraktom ginka
i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom kiselinom, GOI: grupa
tretirana ginkalertom.
srednja vrijednost
standardna devijacija
vrijednosti koje
odskaču
ekstremi
3.3 Koncentracija GSH
Mjernje koncentracije GSH u prefrontalnoj regiji pokazalo je da grupe tretirane vulkanom i
varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom i
acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom imaju višu stopu koncentracije GSH u odnosu na
kontrolnu grupu, dok grupe tretirane ginkom, vulkanom, acetilsalicilnom kiselinom i
varfarinom imaju koncentraciju GSH poput kontrolne grupe. Porast koncentracije je statistički
značajan kod grupa tretiranih vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom,
ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom. (Slika 17.)
Slika 17. Koncentracija glutationa u prefrontalnoj regiji mozga (PGSH). C: kontrolna grupa,
G: grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana
acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i
varfarinom, v+S: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana
ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom
kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.
srednja vrijednost
standardna devijacija
vrijednosti koje
odskaču
ekstremi
Mjerenje koncentracije GSH u kortikalnoj regiji pokazalo je da grupe tretirane vulkanom i
varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom i
acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom imaju višu stopu koncentracije GSH u odnosu na
kontrolnu grupu, dok grupe tretirane ginkom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom imaju
manju koncentraciju GSH u odnosu na kontrolnu grupu. Porast koncentracije je statistički
značajan kod grupa tretiranih vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom,
ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom. (Slika 18.)
Slika 18. Koncentracija glutationa u kortikalnoj regiji mozga (C GSH). C: kontrolna grupa, G:
grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana
acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i
varfarinom, v+S: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana
ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom
kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.
srednja vrijednost
standardna devijacija
vrijednosti koje
odskaču
Mjerenje koncentracije GSH u regiji malog mozga pokazalo je da grupe tretirane vulkanom,
vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom
i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom imaju višu koncentracije GSH u odnosu na
kontrolnu grupu, dok grupe tretirane ginkom, acetilsalicilnom kiselinom i varfarinom imaju
koncentraciju GSH poput kontrolne grupe. Porast koncentracije je statistički značajan kod
grupa tretiranih vulkanom i varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i
varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom. (Slika 19.)
Slika 19. Koncentracija glutationa u regiji malog mozga (CI GSH). C: kontrolna grupa, G:
grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana
acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i
varfarinom, v+S: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana
ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom
kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.
srednja vrijednost
standardna devijacija
vrijednosti koje
odskaču
ekstremi
3.4 Koncentracija MDA (malondialdehid)
Mjerenje koncentracije MDA u prefrontalnoj regiji pokazalo je da grupe tretirane
acetilsalicilnom kiselinom, varfarinom, vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i
varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom kiselinom te ginkalertom imaju manju koncentraciju
MDA u odnosu na kontrolnu grupu, dok grupe tretirane ginkom, vulkanom te vulkanom i
varfarinom imaju koncentraciju MDA poput kontrolne grupe. Pad koncentracije MDA je
statistički značajan kod grupa tretiranih varfarinom, ginkom i varfarinom te ginkom i
acetilsalicilnom kiselinom. (Slika 20.)
Slika 20. Koncentracija malondialdehida u prefrontalnoj regiji mozga (P MDA). C: kontrolna
grupa, G: grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana
acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i
varfarinom, v+S: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana
ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom
kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.
srednja vrijednost
standardna devijacija
vrijednosti koje
odskaču
ekstremi
Mjerenje koncentracije MDA u kortikalnoj regiji pokazalo je da sve grupe imaju manju
koncentraciju MDA od kontrolne grupe. Pad koncentracije MDA je statistčki značajan kod
grupa tretiranih s acetilsalicilnom kiselinom te vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom. (Slika
21.)
Slika 21. Koncentracija MDA u kortikalnoj regiji mozga (C MDA). C: kontrolna grupa, G:
grupa tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana
acetilsalicilnom kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i
varfarinom, v+S: grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana
ekstraktom ginka i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom
kiselinom, GOI: grupa tretirana ginkalertom.
srednja vrijednost
standardna devijacija
vrijednosti koje
odskaču
ekstremi
Mjerenje koncentracije MDA u regiji malog mozga pokazalo je da grupe tretirane ginkom i
vulkanom imaju višu koncentraciju MDA od kontrolne grupe, dok grupe tretirane varfarinom,
vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, ginkom i varfarinom, ginkom i acetilsalicilnom
kiselinom te ginkalertom imaju manju koncentraciju MDA od kontrolne grupe, a grupe
tretirane acetilsalicilnom kiselinom te vulkanom i varfarinom imaju koncentraciju MDA
poput kontrolne grupe. Niti jedna promjena nije bila statistički značajna. (Slika 22.)
Slika 22. Koncentracija MDA u regiji malog mozga (CI MDA). C: kontrolna grupa, G: grupa
tretirana ekstraktom ginka, V: grupa tretirana vulkanom, S: grupa tretirana acetilsalicilnom
kiselinom, W: grupa tretirana varfarinom, v+W: grupa tretirana vulkanom i varfarinom, v+S:
grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom, G+W: grupa tretirana ekstraktom ginka
i varfarinom, G+S: grupa tretirana ekstraktom ginka i acetilsalicilnom kiselinom, GOI: grupa
tretirana ginkalertom.
srednja vrijednost
standardna devijacija
vrijednosti koje
odskaču
ekstremi
3.5 Saţeti prikaz promjena u uzorcima
Priloţeni su tablični prikazi statistički značajnih promjena po regiji mozga i po markerima
oksidativnog stresa. (Tablice 3. i 4.)
Tablica 3. Prikaz statistički značajnih promjena po regiji mozga. P cat: aktivnost katalaze u prefrontalnoj regiji mozga, P SOD: aktivnost SOD-a u prefrontalnoj regiji, P GSH:
koncentracija GSH u prefrontalnoj regiji, P MDA: koncentracija MDA u prefrontalnoj regiji, C cat: aktivnost
katalaze u kortikalnoj regiji mozga, C SOD: aktivnost SOD-a u kortikalnoj regiji,
C GSH: koncentracija GSH u kortikalnoj regiji, , C MDA: koncentracija MDA u kortikalnoj regiji, Cl cat:
aktivnost katalaze u regiji malog mozga, Cl SOD: aktivnost SOD-a u regiji malog mozga, Cl GSH: koncentracija
GSH u regiji malog mozga, Cl MDA: koncentracija MDA u regiji malog mozga
0: nema statistički značajne promjene
Regija
mozga
Ginko Vulkan Acetilsalicilna
kiselina
Varfarin Vulkan
+
Varfarin
Vulkan
+
Acetilsalicilna
kiselina
Ginko
+
Varfarin
Ginko
+
Acetilsalicilna
kiselina
Ginkalert
P cat 0 0 0 0 0 0 0 0 0
P SOD 0 0 0 0 porast 0 0 0 0
P GSH 0 0 0 0 porast porast porast porast porast
P MDA 0 0 0 pad 0 0 pad pad 0
C cat 0 0 0 0 0 0 0 0 0
C SOD 0 0 0 0 0 0 0 0 pad
C GSH 0 0 0 0 porast porast porast porast porast
C MDA 0 0 pad 0 0 pad 0 0 0
Cl cat 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Cl SOD 0 0 pad 0 0 0 0 0 0
Cl GSH 0 0 0 0 porast porast porast porast porast
Cl MDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Tablica 4. Prikaz statistički značajnih promjena po markerima oksidativnog stresa. P cat: aktivnost katalaze u prefrontalnoj regiji mozga, P SOD: aktivnost SOD-a u prefrontalnoj regiji, P GSH:
koncentracija GSH u prefrontalnoj regiji, P MDA: koncentracija MDA u prefrontalnoj regiji, C cat: aktivnost
katalaze u kortikalnoj regiji mozga, C SOD: aktivnost SOD-a u kortikalnoj regiji,
C GSH: koncentracija GSH u kortikalnoj regiji, , C MDA: koncentracija MDA u kortikalnoj regiji, Cl cat:
aktivnost katalaze u regiji malog mozga, Cl SOD: aktivnost SOD-a u regiji malog mozga, Cl GSH: koncentracija
GSH u regiji malog mozga, Cl MDA: koncentracija MDA u regiji malog mozga.
0: nema statistički značajne promjene
Markeri Ginko Vulkan Acetilsalicilna
kiselina
Varfarin Vulkan
+
Varfarin
Vulkan
+
Acetilsalicilna
kiselina
Ginko
+
Varfarin
Ginko
+
Acetilsalicilna
kiselina
Ginkalert
P cat 0 0 0 0 0 0 0 0 0
C cat 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Cl cat 0 0 0 0 0 0 0 0 0
P SOD 0 0 0 0 porast 0 0 0 0
C SOD 0 0 0 0 0 0 0 0 pad
Cl SOD 0 0 pad 0 0 0 0 0 0
P GSH 0 0 0 0 porast porast porast porast porast
C GSH 0 0 0 0 porast porast porast porast porast
Cl GSH 0 0 0 0 porast porast porast porast porast
P MDA 0 0 0 pad 0 0 pad pad 0
C MDA 0 0 pad 0 0 pad 0 0 0
Cl MDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0
4. Rasprava
Rastuća popularnost biljnih pripravaka, praćena njihovom lakom dostupnosti, dovodi do
njihovih sve češćih uzimanja uz klasične farmakoterapije. Iako se reklamiraju kao sigurni i
bez nuspojava u kombinaciji s klasičnim lijekovima su primijećene interakcije u djelovanju. U
ovom istraţivanju smo pratili učinke nekih popularnih biljnih pripravaka i klasičnih lijekova
na markere oksidativnog stresa na tri različite regije mozga štakora. Kako su za korištene
biljne pripravke studije pokazale moguć antioksidativni utjecaj i kako se smatra da imaju
utjecaj na kognitivne sposobnosti, zanimalo nas je mijenjaju li u interakciji s klasičnim
lijekovima oksidativnu ravnoteţu u mozgu. Tretirali smo deset grupa ţivotinja s tri biljna
pripravka (tabletama ginka, vulkanom i ginkalertom), dva klasična lijeka (varfarinom i
acetilsalicilnom kiselinom), njihovim kombinacijama i fiziološkom otopinom. Ţivotinje su
bile tretirane oralnim putem tako da bi supstance prošle jednak metabolički put kao kod ljudi
koji ih uzimaju. Razine markera oksidativnog stresa su praćene u tri regije mozga:
prefrontalnoj regiji, kortikalnoj regiji i regiji malog mozga, kako bi pokrili što veći dio mozga
i regije odgovorne za kognitivne sposobnosti. Dobiveni rezultati su uspoređivani s grupom
tretiranom fiziološkom otopinom koja je bila kontrolna grupa.
Tretirane grupe su pokazale brojna odstupanja u razinama markera oksidativnog stresa u
odnosu na kontrolnu grupu. Grupa tretirana acetilsalicilnom kiselinom je pokazala smanjenu
aktivnost SOD-a u regiji malog mozga i manju koncentraciju MDA u kortikalnoj regiji
mozga. Ti rezultati se poklapaju s pretpostavljenim antioksidativnim učincima acetilsalicilne
kiseline. Smanjena aktivnost SOD-a bi mogla biti rezultat aspirinom smanjene razine
vaskularne produkcije O2-
inhibicijom NAD(P)H oksidazne aktivnosti (Tauseef i sur. 2008),
odnosno aspirinom posredovane inhibicije NOS-II i inhibicije COX enzima. Acetilsalicilna
kiselina moţe dovesti do acetilacijelizinskih nastavaka proteina, koji igraju ulogu u njihovoj
zaštiti od slobodnih radikala (Awtry i Loscalzo, 2000), što bi, zajedno s manjom stopom
produkcije slobodnih radikala, moglo objasniti niţu koncentraciju MDA.
Grupa tretirana varfarinom je pokazala manju koncentraciju MDA u prefrontalnoj regiji
mozga. Smanjena koncentracija MDA kod tretmana varfarinom bi mogla biti rezultat
djelovanja varfarina, koji moţe dovesti do smanjene pokretljivosti i veće gustoće lipidne
membrane, što oteţava pristup slobodnim radikalima i smanjuje stopu lipidne peroksidacije.
(Amin i sur. 1986)
Grupa tretirana vulkanom i varfarinom je pokazala veću aktivnost SOD-a i koncentraciju
GSH u sve tri regije mozga. Povećana aktivnost SOD-a bi mogla biti rezultat sinergije
antikoagulacijskog djelovanja varfarina i vazodilatatorskog djelovanja ginka prisutnog u
vulkanu (Beikang i sur. 2014), što moţe dovesti do krvarenja i veće razine oksidativnog
stresa. Kako grupe tretirane samo varfarinom ili samo vulkanom nisu pokazale slične
promjene aktivnosti, čini se da je povećana aktivnost rezultat međudjelovanja. Povećana
koncentracija GSH bi mogla biti odgovor organizma na opisano krvarenje uzrokovano
interakcijom vulkana i varfarina, potpomognuto antioksidativnim učinkom biljnih ekstrakata
koji se nalaze u vulkanu (López i sur. 2009; Wang i sur. 2014; Aranha i Jorge. 2012).
Grupa tretirana ginkom i varfarinom je pokazala veću koncentraciju GSH u sve tri regije
mozga i smanjenu koncentraciju MDA u prefrontalnoj regiji mozga. Povećana koncentracija
GSH moţe biti objašnjena indirektnim antioksidativnim djelovanjem ekstrakta lista ginka.
Indirektan antioksidativan učinak ekstrakta lista ginka djeluje preko terpenoida prisutnih u
ekstraktu lista ginka (Mahadevan i Park, 2008), koji mogu povećavati aktivnost
antioksidativnih enzima, i flavonoida koji inhibiraju enzim COX2 i smanjuju razinu slobodnih
radikala u organizmu. Smanjena koncentracija MDA bi mogla biti objašnjena već navedenim
djelovanjem varfarina te direktnim i indirektnim antioksidativnim učincima ekstrakta lista
ginka. Spojevi prisutni u ekstraktu lista ginka mogu vezati slobodne radikale i tako smanjiti
stopu lipidne peroksidacije (Mahadevan i Park, 2008). Moguća je interakcija između
inhibicije COX2, povećane aktivnosti antioksidativnih enzima, vezanja radikala i veće
gustoće lipidnih membrana.
Grupa tretirana ginkom i acetilsalicilnom kiselinom je pokazala povećanu koncentraciju GSH
u sve tri regije mozga i smanjenu koncentraciju MDA u prefrontalnoj regiji mozga. Povećana
koncentracija GSH bi mogla biti rezultat već opisanih antioksidativnih učinaka ginka, dok bi
niţa koncentracija MDA mogla biti rezultat sinergističkog učinka s acetilsalicilnom kiselinom
koja acetiliralipidne proteinske nastavke i smanjuje produkciju O2-
i spojeva prisutnih u
ekstraktu lista ginka koji veţu slobodne radikale.
Grupa tretirana vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom je pokazala veću koncentraciju GSH u
sve tri regije mozga i smanjenu koncentraciju MDA u kortikalnoj regiji mozga. Povećana
koncentracija GSH bi se mogla objasniti antioksidativnim učincima ekstrakta biljaka nađenih
u vulkanu, osobito ginku. Niţa koncentracija MDA bi mogla biti objašnjena interakcijom već
navedenih mehanizama acetilsalicilne kiseline (acetilacijalizinskih nastavaka proteina i
smanjene stopa produkcije slobodnih radikala) i brojnih polifenola prisutnih u vulkanu, koji
mogu vezati slobodne radikale i tako smanjiti stopu lipidne peroksidacije (López i sur. 2009;
Wang i sur. 2014; Aranha i Jorge. 2012).
Grupa tretirana ginkalertom je pokazala smanjenu aktivnost SOD-a u kortikalnoj regiji mozga
i povećanu koncentraciju GSH u prefrontalnoj regiji mozga i regiji malog mozga. Smanjena
aktivnost SOD-a bi mogla biti objašnjena interakcijom ekstrakta lista ginka, koji moţe vezati
slobodne radikale i inhibira COX 2 enzim time smanjujući produkciju slobodnih radikala, sa
ekstraktom gotu kole i antocijana prisutnih u ekstraktu borovnice (Chu i sur. 2011) koji mogu
vezati slobodne radikale i kelirati metale te tako smanjiti sveukupni oksidativni stres, jer
grupa tretirana samo ginkom nema smanjenu stopu aktivnosti SOD što navodi da je to rezultat
interakcije. Povećana koncentracija GSH se moţe objasniti već navedenim antioksidativnim
učinkom ekstrakta lista ginka, gotu kola također moţe povećati aktivnost antioksidativnih
enzima, a antocijani prisutni u ekstraktu borovnice mogu dovesti do povećanja razine GSH
(Chu i sur. 2011).
Dobiveni rezultati pokazuju najveće promjene kod grupa koje su uzimale kombinacije biljnih
pripravaka i klasičnih lijekova, što upućuje na zaključak da su promjene u razini oksidativnog
stresa rezultat interakcije, obzirom na to da se grupe tretirane ginkom i vulkanom ne razlikuju
od kontrolne grupe, a promjene kod grupa s kombinacijama su drukčije od grupa tretiranih
acetilsalicilnom kiselinom i varfarinom. Promjene su zabiljeţene kod aktivnosti SOD i
koncentracija GSH i MDA, dok aktivnost katalaze nije odstupala od vrijednosti kontrole.
Najveća odstupanja koncentracije GSH, prisutna su kod grupa tretiranih kombinacijama
biljnih pripravaka i klasičnih lijekova. Zabiljeţen je porast koncentracije GSH u sve tri regije
mozga i smanjena koncentracija MDA. Povećana koncentracija GSH vjerojatno nije samo
rezultat antioksidativnog djelovanja biljnih suplemenata jer nije zabiljeţena kod grupa
tretiranih samo biljnim suplementima pa je vjerojatno da dolazi do povećane produkcije
oksidativnih radikala. Smanjena koncentracija MDA je zapaţena i kod grupa tretiranih samo
klasičnim lijekovima i moţe se objasniti njihovim djelovanjem. Grupa tretirana vulkanom i
varfarinom pokazuje porast aktivnosti SOD-a i koncentracije GSH i jednaku razinu MDA kao
i kontrolna grupa, dok je grupa tretirana s varfarinom imala smanjenu koncentraciju MDA. To
sugerira da je interakcija biljnih ekstrakata u vulkanu s varfarinom dovela do povećanja
oksidativnog stresa u mozgu, koji je poništio zaštitni učinak varfarina na lipidne membrane.
Suprotno tome, grupa tretirana ginkalertom, koji je mješavina biljnih ekstrakata, pokazuje pad
razine SOD-a, porast koncentracije GSH i koncentraciju MDA u razini kontrolne grupe i
grupa tretiranih samo biljnim suplementima, što moţe upućivati na sinergistički učinak
antioksidansa u toj kombinaciji biljnih ekstrakata, koja bi mogla djelovati neuroprotektivno
ali bi i mogla narušavati biološke procese regulirane slobodnim radikalima.
5. Zaključak
Iako se sluţbeno reklamiraju kao pripravci koji nemaju nuspojave i kontraindikacije, ovo
istraţivanje je potvrdilo da postoji interakcija između klasičnih lijekova i biljnih suplemenata.
Razine aktivnosti i koncentracije markera oksidativnog stresa kod grupa tretiranih
kombinacijama biljnih pripravaka i klasičnih lijekova bile su značajno promijenjene u odnosu
na kontrolnu grupu.
Koncentracija GSH je bila značajno povećana u svim regijama mozga kod grupa tretiranih
kombinacijama biljnih pripravaka i klasičnih lijekova što bi moglo biti indikator potencijalne
toksičnosti. Koncentracija MDA je bila smanjena u regiji prefrontalnog korteksa kod grupa
tretiranih ginkom i varfarinom te ginkom i acetilsalicilnom kiselinom i u kortikalnoj regiji kod
grupe tretirane vulkanom i acetilsalicilnom kiselinom. Aktivnost SOD-a je povećana u
prefrontalnoj regiji kod grupe tretirane vulkanom i varfarinom.
Grupa tretirana vulkanom i varfarinom koja uz povećane koncentracije GSH ima i povećanu
aktivnost SOD-a i višu koncentraciju MDA od drugih grupa tretiranih kombinacijama
predstavlja najveću promjenu razina oksidativnog stresa.
Laka dostupnost klasičnih lijekova i biljnih suplemenata, uz njihovu sve veću popularnost,
nuţno dovodi do sve češćih zajedničkih uzimanja, stoga su potrebna daljnja istraţivanja da bi
se razjasnile posljedice njihovog zajedničkog uzimanja.
6. Popis literature
Abebe W. (2002): Herbal medication: Potential for adverse interactions with analgesic drugs.
Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics, 27:391-401
Awtry E. H.,Loscalzo J. (2000): Aspirin. Circulation 101:1206–1218
Beikang G., Zhen Z., Zhong Z. (2014): Updates on the Clinical Evidenced Herb-Warfarin
Interactions. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2014, 18 str.
Bilia A. R. (2002): Ginkgo biloba Fitoterapia 73:276–9
Birben E., Sahiner U. M., Sackesen C., Erzurum S., Kalayci O. (2012): Oxidative stress and
antioxidant defense. World Allergy Organization Journal 5:9–19
Browne S. E., Ferrante R. J., Beal M. F. (1999): Oxidative stress in Huntington’s disease.
Brain Pathology 9:147–163
Chu W., Cheung S. C. M., Raw L., et al. (2011): Bilberry (Vaccinium myrtillus) U: Benzie
IFF, Wachtel-Galor S, editors. Herbal Medicine: Biomolecular and Clinical Aspects.
2.izdanje. Boca Raton (FL): CRC Press; Chapter 4.
DIRECTIVE 2001/83/EC OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL
of 6 November (2001): on the Community code relating to medicinal products for human use.
OJ L 311, p. 67
Droy-Lefaix M. T. (1997): Effect of the antioxidant action of Ginko biloba extract (EGb 761)
on aging and oxidative stress, AGE, 3: 141
Dülger G. (2012): Herbal drugs and drug interactions. Marmara Pharmaceutical Journal 16:
9-22
Flohé L, Otting F. (1984) Superoxide dismutase assays. Methods in Enzymology 105:93–104.
Gohil K. J., Patel J. A., Gajjar A. K. (2010): Pharmacological Review on Centella asiatica: A
Potential Herbal Cure-all. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences,72, 546–556.
Hirsh J., Fuster V., Ansell J., Halperin J. (2003): American Heart Association/American
College of Cardiology Foundation guide to warfarin therapy. Journal of the American College
of Cardiology 41:1633-1652
Huang X. (1999): Cu(II) potentiation of Alzheimer Abeta neurotoxicity. Correlation with cell-
free hydrogen peroxide production and metal reduction. Journal of Biological Chemistry
274:37111–37116
Hussin M., Abdul-Hamid A., Mohamad S., Saari N., Ismail M., Bejo M. H. (2007): Protective
effect of Centella asiatica extract and powder on oxidative stress in rats. Food Chemistry 100:
535–541.
Ischiropoulos H., Beckman J. S. (2003): Oxidative stress and nitration in neurodegeneration:
Cause, effect, or association? Journal of Clinical Investigation111: 163–169
Kandel E. R., Schwartz J. H., Jessell T. M. (2000): Principles of neural science. McGraw-
Hill, New York
Kunwar A., Priyadarsini K. I. (2011): Free radicals, oxidative stress and importance of
antioxidants in human health. Journal of Medical and Allied Sciences 1: 53–60
López V., Martín S., Gómez-Serranillos M. P., Carretero M. E., Jäger A. K., Calvo M. I.
(2009): Neuroprotective and neurological properties of Melissa officinalis. Neurochemical
Research 11: 1955-1961
Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J (1951) Protein Measurement with
the Folin Phenol Reagent. Journal of Biological Chemistry 193, 265–275
Mahadevan, S.. Park, Y. (2008): Multifaceted Therapeutic Benefits of Ginkgo biloba:
Chemistry, Efficacy, Safety, and Uses. Journal of Food Science 73: R14–R19.
Matés J.M., Pérez-Gómez C., Núñez de Castro I. (1999): Antioxidant enzymes and human
diseases.Clinical Biochemistry 32: 595-603
McKenna D. J., Jones K., Hughes K. (2001):Efficacy, safety, and use of Ginkgo biloba in
clinical and preclinical applications. Alternative therapies in health and medicine 7:70, 86,
88–90
Noori S. (2012): An Overview of Oxidative Stress and Antioxidant Defensive System 1:413
Pereira M. A. C., Jorge N. (2012): Antioxidant potential of oregano extract (Origanum
vulgare), British Food Journal 7: 954 - 965
Raza H., John A., Benedict S. (2011): Acetylsalicylic acid-induced oxidative stress, cell cycle
arrest, apoptosis and mitochondrial dysfunction in human hepatoma HepG2 cells. European
Journal of Pharmacology 668:15–24
Sies H. (1997.): Physiological Society Symposium: Impaired Endothelial and Smooth Muscle
Cell Function in Oxidative Stress: Oxidative Stress: Oxidants and Antioxidants. Experimental
Physiology 82: 291-295
Srivastava R., Shukla Y. N., Kumar S. (1997): Chemistry and pharmacology of Centella
asiatica: a review.Journal of Medicinal and Aromatic Plant Sciences 19:1049–56
Lamsal M., Gautam N., Toora B. D., Bhattacharya S. K., Baral N. (2007): Evaluation of lipid
peroxidation product, nitrite and antioxidant levels in newly diagnosed and two months
follow-up patients with pulmonary tuberculosis. Southeast Asian Journal of Tropical
Medicine and Public Health 38:695-703
Tammariello S. P., Quinn M. T., Estus S. (2000): NADPH oxidase contributes directly to
oxidative stress and apoptosis in nerve growth factor-deprived sympathetic neurons. Journal
of Neuroscience 20:RC53.
Tauseef M., Shahid M., Sharma K. K, Fahim M. (2008): Antioxidative action of aspirin on
endothelial function in hypercholesterolaemic rats. Basic and Clinical Pharmacology and
Toxicology 4: 314–321
Teles J. S., Fukuda E. Y., Feder D. (2012): Warfarin: pharmacological profile and drug
interactions with antidepressants. Einstein (São Paulo). São Paulo1: 110-115
Vane J. R., Botting R. M. (2003): The mechanism of action of aspirin. Thrombosis Research
6: 255–258
Wang X., Yang L., Yang X. Tian Y. (2014): In vitro and in vivo antioxidant and
antimutagenic activities of polyphenols extracted from hops (Humulus lupulus). Journal of
the Science of Food and Agriculture 94: 1693–1700
Yoshikawa T, Naito Y (2002): What is oxidative stress? Japan Medical Association Journal
45:271-276
7. Životopis
Rođen sam u Zagrebu 19.12.1988. godine, gdje sam s odličnim uspjehom završio osnovnu školu Grofa
Janka Draškovića i Nadbiskupsku klasičnu gimnaziju. Na Prirodoslovno-matematičkom fakultetu
Sveučilišta u Zagrebu završio sam preddiplomski studij molekularne biologije te sam upisao diplomski
studij eksperimentalne biologije, modul fiziologija i imunobiologija.