1
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Jeruk selain memiliki nilai ekonomi yang tinggi juga memiliki nilai gizi yang
cukup tinggi, banyak mengandung vitamin C untuk mencegah sariawan dan juga
untuk meningkatkan selera makan. Selain vitamin C, buah jeruk juga mengandung
mineral-mineral yang baik untuk kesehatan (Pracaya, 1985).
Kebutuhan akan jeruk di masa yang akan datang diperkirakan semakin
meningkat seiring dengan peningkatan jumlah penduduk dan permintaan pasar
internasional. Menurut Supriyanto et al. (2003), dari Data Pusat Penelitian Dan
Pengembangan Hortikultura menyebutkan bahwa impor buah jeruk segar Indonesia
pada tahun 1997 mencapai 67.117 ton dengan nilai setara 240 milyar rupiah dan pada
akhir tahun 2002 telah mencapai 76.595 ton dengan nilai 434 milyar rupiah. Hal ini
mengindikasikan adanya segmen pasar khusus yang menghendaki buah jeruk
bermutu prima yang belum mampu dipenuhi oleh produsen jeruk dalam negeri.
Kultur jaringan merupakan salah satu metode perbanyakan tanaman secara
vegetatif. Kultur jaringan tertua dilakukan pada biji jeruk dengan tujuan untuk
mengecambahkannya dalam media yang kaya nutrisi karena biji dari jeruk tidak
mempunyai cadangan makanan. Kultur jaringan terus berkembang dari
mengkulturkan biji berkembang dengan mengkulturkan jaringan dan terus
berkembang hingga mampu mengkulturkan satu sel dari tanaman.
Penggunaan kultur jaringan mempunyai kelebihan yaitu mampu
memproduksi bibit yang seragam dalam jumlah banyak dan dalam waktu yang
relatifr singkat. Oleh karena itu kultur jaringan sering dijadikan solusi sebagai
2
metode perbanyakana tanaman dan juga dapat digunakan sebagai suatu metode
penyimpanan plasma nutfah yang tidak membutuhkan temapat yang besar.
Keberhasilan dari kultur jaringan sangat bergantung dari ketepatan
konsentrasi nutrisi yang berada di dalam media kultur. Ketepatan konsentrasi ini
menyangkut pada ketersediaan nutrisi bagi eksplan tanaman. Kelebihan nutrisi dari
tanaman akan menyebabkan tanaman mengalami keracunan unsur hara. Oleh karena
itu, pembuatan larutan stock dan sterilisasi media dianggap penting untuk diketahui
sebagai sarana penenunjang kebutuhan informasi akan kultur jaringan.
B. Tujuan
1. Untuk Mengetahui Alat-Alat Laboratorium
2. Untuk Mengetahui Cara Sterilisasi Alat-Alat Kultur Jaringan
3. Untuk Mengetahui Cara Pembuatan Media
4. Untuk Mengetahui Cara Sterilisasi Bahan Kultur
5. Untuk Mengetahui Cara Pengkulturan
6. Untuk Mengetahui Cara Subkultur
7. Untuk Mengetahui Cara Aklimatisasi
3
II. TINJAUAN PUSTAKA
Kultur jaringan adalah mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas
serta menumbuhkanbagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang
kaya nutrisi dan at pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya
sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi
tanaman lengkap. Keuntungankultur jaringan adalah menghasilkan bibit dalam
jumlah banyak bermutu, seragam, dalam waktu singkat, sifat tanaman sama dengan
tanaman induknya, kesehatan bibit lebih terjamin dan kecepatan tumbuh lebih cepat
dibandingkan konvensional (Anonimous, 2002).
Teknik kultur jaringan menuntut syarat-syarat tertentu yang harus dipenuhi
dalam pelaksanaannya. Syarat pokok pelaksanaan kultur jaringan, adalah
laboratorium dengan segala fasilitasnya. Laboratoruim harus menyediakan alat-alat
kerja, sarana pendukung terciptanya kondisi aseptik terkendali, dan fasilitas dasar
seperti air, listrik, dan bahan bakar (Gunawan, 1988).
Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.
Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan
diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin,
dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-
lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya
maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan.
Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media
yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf
(Anonim, 2008).
4
Pelaksanaan teknik ini memerlukan berbagai prasyarat untuk mendukung
kehidupan jaringan yang dibiakkan. Yang paling esensial adalah wadah dan media
tumbuh yang steril. Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh dan mengambil
nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan. Media tumbuh menyediakan berbagai
bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya (Hendra,
2007).
Tujuan kegiatan kultur jaringan adalah perbanyakan massal tanaman yang
biasanya sangat lambat dengan metoda konvensional dalam jumlah yang besar dalam
waktu yang singkat, selain itu diperoleh tanaman yang bebas virus, membantu
pemulian tanaman untuk mempercepat pencapaian tujuan penelitian pada tanaman
yang biasa diperbanyak secara vegetatif (Anonim, 2008).
Apabila kita melakukan gerakan-gerakan selama bekerja di dalam
laboratorium, akan megakibatkan timbulnya suatu awan debu yang hampir tidak
tampak. Debu tersebut mengandung spora yang sangat besar jumlahnya. Bila spora
ini kontak dengan media kultur yang digunakan dalam pekerjaan tersebut, spora kan
tumbuh dengan cepat. Dalam beberapa hari spora akan tumbuh menjadi koloni yang
terlihat oleh mata biasa (Wetherel, 1982).
Untuk membuat media dengan jumlah zat seperti yang ditentukan,
diperlukan penimbangan dan penakaran bahan secara tepat. Ketidaktepatan ukuran
dapat menyebabkan terjadinya proses yang dikehendaki. Pada umumnya untuk suatu
keperluan, media yang telah dirumuskan dapat diubah atau diperbarui, dengan
mengganti zat-zat tertentu, atau menambah zat lain. Untuk melakukan perubahan ini
diperlukan acuan yang mantap atau pengalaman (Rahardja, 1988).
Dalam perbanyakan tanaman secara kultur jaringan, eksplan merupakan
faktor penting penentu keberhasilan. Umur fisiologis, umur ontogenetik, ukuran
5
eksplan, serta bagian tanaman yang diambil merupakan hal-hal yang harus
dipertimbangkan dalam memilih eksplan yang akan digunakan sebagai bahan awal
kultur. Umumnya, bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan adalah jaringan
muda yang sedang tumbuh aktif. Jaringan tanaman yang masih muda mempunyai
daya regenerasi lebih tinggi, sel-sel masih aktif membelah diri, dan relatif lebih
bersih (mengandung lebih sedikit kontaminan) (Yusnita, 2003).
Sebelum membuat medium, maka terlebih dahulu kita harus menentukan
medium apa yang akan kita buat. Jenis medium dengan komposisi unsur kimia yang
berbeda dapat digunakan untuk media tumbuh dari jaringan tanaman yang berbeda
pula (Hendaryono dan Wijayani, 1994).
Medium MS yang direvisi (Murashige dan Skoog, 1962) adalah yang paling
luas penggunaannya dibandingkan dengan media dasar lainnya. Medium MS yang
direvisi-selanjutya disebut MS-banyak digunakan, terutama pada mikropropagasi
tanaman dikotil dengan hasil yang memuaskan. Hal itu dikarenakan medium MS
memiliki kandungan garam-garam yang lebih tinggi daripada media lain, disamping
kandungan nitratnya juga tinggi (Zulkarnain, 2009).
Kondisi lingkungan yang menentukan keberhasilan pembiakan tanaman
dengan kultur jaringan meliputi cahaya, suhu, dan komponen atmosfer. Cahaya
dibutuhkan untuk mengatur proses morfogenetik tertentu. Dalam teknik kultur
jaringan tanaman, cahaya dinyatakan dengan dimensi lama penyinaran, intensitas,
dan kualitasnya. Prof. Murashige menyarankan untuk mengasumsikan kebutuhan
lama penyinaran pada kultur jaringan tanaman merupakan pencerminan dari
kebutuhan periodisitas tanaman yang bersangkutan di lapangan. Kualitas cahaya
mempengaruhi arah diferensiasi jaringan (Yusnita, 2003).
6
Suhu juga berpengaruh terhadap kesehatan tanaman yang dikulturkan. Suhu
yang umum digunakan untuk pengkulturan berbagai jenis tanaman adalah 26 + 2 0C.
Untuk kebanyakan tanaman, suhu yang terlalu rendah (kurang dari 20 0C) dapat
menghambat pertumbuhan, dan suhu yang terlalu tinggi (lebih dari 32 0C)
menyebabkan tanaman merana. Namun, pada kultur tanaman yang biasanya
memerlukan suhu rendah untuk pertumbuhan terbaiknya, seperti stroberi, suhu yang
diperlukan juga lebih rendah (Yusnita, 2003).
Jeruk (Citrus sp.) merupakan komoditas buah yang memiliki nilai ekonomi
tinggi karena dikonsumsi oleh masyarakat dari berbagai lapisan. Sejak ratusan tahun
yang lalu, jeruk sudah tumbuh di Indonesia baik secara alami atau dibudidayakan.
Jeruk merupakan tanaman tahunan yang berasal dari Asia Tenggara (Soelarso, 1996)
Pada umumnya jeruk Kuok diperbanyak dengan cara vegetatif dengan
okulasi. Tanaman yang berasal dari perbanyakan vegetatif ini memiliki sifat sama
dengan induknya, namun teknik ini sangat lambat oleh karena itu perlu
dikembangkan dengan teknik kultur jaringan, untuk tanaman jeruk. Pelestarian
secara in vitro memiliki banyak keuntungan antara lain mudah pengelolaannya, tidak
memerlukan ruangan yang luas, dan mencegah penularan penyakit sistemik yang
dapat menurunkan mutu hasil maupun degenerasi tanaman induk (Wattimena, 1992).
Keberhasilan dalam penggunaan metode in vitro sangat tergantung pada
media yang digunakan. Kultur media jaringan tanaman tidak hanya menyediakan
unsur hara makro dan mikro saja tetapi juga vitamin, karbohidrat, dan zat pengatur
tumbuh (Pierik, 1987). Sel-sel memerlukan zat pengatur tumbuh untuk inisiasi dalam
media kultur jaringan. Pembentukkan kalus ditentukan oleh penggunaan yang tepat
dari zat pengatur tumbuh tersebut.
7
Kultur jaringan jeruk telah banyak dilakukan seperti yang dilakukan oleh
Silalahi (2006) menggunakan MS (Murashige & Skoog) (1/4 MS, 1/2 MS, MS
penuh) dengan kombinasi 2,4-D (1mg/l) pada kultur biji jeruk, ternyata media MS
penuh yang dapat memberikan hasil paling baik bagi pertumbuhan pembentukan
kalus. Menurut Heinz dan Mee (1969 dalam Reinert & Bajaj, 1989), media yang
paling baik untuk diferensiasi kalus dan perkembangan planlet adalah media
Murashige dan Skoog (1962) atau modifikasinya. Media ini kaya akan makroelemen,
nitrogen, sukrosa dan vitamin tertentu (Hartman & Kester, 1983). Sementara zat
tambahan yang biasa digunakan adalah zat pengatur tumbuh. Auksin dan sitokinin
dapat diberikan bersama-sama atau auksin saja ataupun sitokinin saja, tergantung
dari tujuan (Hendaryono & Wijayani, 1994).
Dalam budidaya in vitro (kultur jaringan), menginduksi kalus merupakan
salah satu langkah penting, setelah itu diusahakan agar terjadi diferensiasi akar dan
tunas. Proses terjadinya kalus sampai diferensiasi berbeda–beda, tergantung pada
bagian tanaman yang dipakai sebagai eksplan, metode budidaya in vitro, juga zat–zat
tanaman yang di bubuhkan pada media dasar. Untuk mendapatkan kalus penggunaan
eksplan dari daun umumnya lebih menguntungkan dari pada eksplan batang.
Masalah yang perlu diantipasi adalah generasi kalus menjadi planlet. Untuk
mendapatkan kalus, zat pengatur tumbuh yang biasa digunakan adalah 2,4–D dari
golongan auksin dan BAP dari golongan sitokinin (Ibrahim et al, 2004).
Proses pemberian hormon harus memperhatikan jumlah dan konsentrasinya
agar didapatkan sistim perakaran yang baik dalam waktu relatif singkat. Konsentrasi
dan jumlah hormon ini sangat tergant ung pada faktor-faktor sepert umur bahan stek,
waktu/lamanya pemberian hormon, cara pemberian hormon, jenis tanaman dan
sistim stek yang digunakan (Yasman dan Smits, 1988). Berdasarkan pengalaman
8
kelompok auksin yang baik untuk perakaran terutama untuk tanaman kehutanan
Dipterocarpaceae adalah dari kelompok IBA (Indole Butyric Acid) (Irwanto, 2001).
Zat pengatur tumbuh dari golongan auksin berperan antara lain dalam
pembentukan kalus, morfogenesis akar dan tunas serta embriogenesis. Pemilihan
konsentrasi dan jenis auksin ditentukan antara lain oleh tipe pertumbuhan dan
perkembangan eksplan yang dikehendaki. Penggunaan auksin dengan daya aktivitas
kuat (antara lain 2,4-D, NAA atau dikombinasikan dengan sitokinin dengan
konsentrasi rendah) umumnya digunakan untuk induksi kalus embriogenik. Selain
itu, jenis dan konsentrasi hormon, jenis asam amino serta rasio auksin dan sitokinin
sangat menentukan dalam menginduksi pembentukan kalus ( Purnamaningsih, 2006).
Sitokinin juga mempunyai dua peran yang penting untuk propagasi seara in
vitro yaitu merupakan perangsang pembelahan sel dalam jaringan yang dibuat
eksplan dan merangsang pertumbuhan tunas daun, namun demikian, kadar sitokinin
yang optimal untuk pertumbuhan tunas, dapat menghambat pertumbuhan dan
pembentukan akar. Karena itu, konsentrasi dari sitokinin yang dipakai harus sesuai
sehingga tidak menghambat pertumbuhan dari eksplan (Wetherel, 1988).
Jumlah kadar auksin yang terdapat pada organ stek bervariasi. Pada stek yang
memiliki kadar auksin lebih tinggi, lebih mampu menumbuhkan akar dan
menghasilkan persen hidup stek lebih tinggi dari pada stek yang memiliki kadar yang
rendah. Sebagaimana diketahui bahwa auksin adalah jenis hormon penumbuh yang
dibuat oleh tanaman dan berfungsi sebagai katalisator dalam metabolisme dan
berperan sebagai penyebab perpanjangan sel. Ada beberapa macam hormon dari
kelompok auksin ini, antara lain adalah IAA (Indole Acetic Acid), NAA (Napthalen
Acetic Acid) dan IBA (Indole Butyric Acid) (Irwanto, 2001).
9
Eksplan yang digunakan adalah jaringan yang masih muda. Jaringan muda ini
tersusun atas sel-sel yang masih muda dan aktif membelah sehingga diharapkan bisa
menghasilkan tanaman yang sempurna (Purwanto, 2008).
Struktur kalus dari berbagai varietas yang digunakan berbeda-beda
tergantung kepada formulasi yang digunakan. Biasanya struktur kalus
menggambarkan daya regenerasinya membentuk tunas dan akar. Kalus yang
berbentuk globular (nodul-nodul) dan berwarna bening biasanya mempunyai
kemampuan lebih tinggi untuk membentuk tunas daripada kalus yang bersifat
kompak dan berwarna coklat-kehitaman. Dalam hal ini media yang digunakan untuk
memacu regenerasi kalus akan sangat menentukan. Keseimbangan nutrisi dalam
media tumbuh sangat mempengaruhi pertumbuhan kalus maupun diferensiasinya
membentuk tunas (Purnamaningsih, 2006).
Kontaminasi dari eksplanlah yang paling sulit diatasi karena dalam hal ini
metode sterilisasi harus selektif. Walaupun sterilisasi telah dilakukan dengan
berbagai cara, namun kadang-kadang kontaminasi tetap saja terjadi. Dalam hal ini
dikarenakan pada eksplan telah terjadi kontaminasi internal. Cara penggulangannya
dilakukan treatment pada tanaman yang akan dijadikan sebagai sumber eksplan.
Treatment-nya adalah dengan mengisolasi eksplan, disemprot dengan bakterisida,
fungisida selama 3 bulan setiap hari dengan konsentrasi 150-200 mg/l (Anonim,
2008).
10
III. BAHAN DAN METODE
A. Waktu dan Tempat
Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Fakultas Pertanian
Universitas Islam Riau, Jalan Kaharuddin Nasution KM 11 No. 113 Marpoyan
Kelurahan Simpang Tiga, Kecamatan Bukit Raya, Pekanbaru. Praktikum ini
dilaksanakan sebanyak 3 kali pertemuan, mulai 23 februari – 08 maret 2016
(lampiran I).
B. Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam pratikum ini adalah NH4NO3, KNO3,
CaCl2.2H2O, Mgso4.7H2O, KH2PO4, KI, H3BO3, MnSO4.4H2O,ZnSO.7H2O,
Na2MoO4.5H2O, CuCl2.6H2O, FeSO4.7H2O, Na2.EDTA.2H2O, Asid Nikotinik,
Piridoksin-HCl, Tiamin-HCl, Glisin, Sukrosa, Myo-inositol, Agar bacto-Difco,
Aquades, Arang aktif, Spiritus, Twin-20, Bayclin, Detergen, Plastik, Karet Gelang,
Alumunium Foil, Tissue dan Label.
Alat yang digunakan dalam pratikum ini adalah Autoclap, Oven, Destilator,
Kulkas, Lemari bahan, Laminar air flow, Troli, Rak kultur, Kompor gas, Panci,
Timbangan analitik, Ph meter, Magnetik stir, Erlenmeyer, Gelas ukur, Gelas piala,
Tbaung reaksi,Petridish, Pipet, Spatula, Botol kultur, Botol, Labu ukur, Bunsen,
Gunting, Skarpel, Hand sprayer, Mata pisau, Keranjang dan Spon.
C. Pelaksanaan Pratikum
1. Pengenalan Alat-alat Pratikum
A. Alat-alat
- Autoclave
- Oven
11
- Destilator
- Kulkas
- Lemari bahan
- Laminar Air flow
- Troli
- Rak Kultur
- Kompor Gas
- Panci
- Timbangan Analitik
- pH Meter
- Magnetik stir
- Erlemeyer
- Gelas Ukur
- Gelas piala
- Tabung Reaksi
- Petridish
- Pipet
- Spatula
- Botol Kultur
- Botol
- Labu Ukur
- Bunsen
- Gunting
- Skarpel
- Hand sprayer
12
- Mata Pisau
- Keranjang
- Spoon
B. Bahan-bahan
- NH4NO3
- KNO3
- CaCl2.2H2O
- MgSO4.7H2O
- KH2PO4
- KI
- H3BO3
- MnSO4.4H2O
- ZnSO4.7H2O
- Na2MoO4.5H2O
- CuSO4.5H2O
- CoCl2.6H2O
- FeSO4.7H2O
- Na2.EDTA.2H2O
- Asid Nikotinik
- Piridoksin-HCl
- Glisin
- Sukrosa
- Myo-inositol
- Agar bacto-Difco
- Aquades
13
- Arang Aktif
- Spritus
- Twin-20
- Bayclin
- Detergen
- Plastik
- Karet Gelang
- Alumunium Foil
- Tissue
- Label
C. Prosedur Kerja
- Siapkan Alat dan Bahan
- Perkenalan Alat dan Bahan
- Sebutkan Fungsi dan Alat Bahan
- Jelaskan Cara Penggunaan Alat
2. Sterelisasi Alat Kultur
A. Alat-alat
- Autoclap
- Botol kultur
- Petridish
- Gunting
- Skarpel
- Pengaduk kaca
- Pinset
- Spatula
14
B. Bahan-bahan
- Aquades
- Tissue
- Alumunium foil
C. Prosedur Kerja
- Cuci botol, petridish, dan pengaduk kaca
- Bungkus spatula, skarpel, pinset, gunting dan petridish dengan
alumunium foil kemudian masukkan kedalam plastik
- Masukkan dalam autoclave
- On kan autoclave dan atur pada suhu 1210 C selama 20 menit
- Keluarkan alat-alat dari autoclave dan simpan dalam ruangan
penyimpanan
3. Pembuatan Media
A. Alat-alat
- Autoclave
- Kompor gas
- Panci
- Timbangan Analitik
- pH Meter
- Magnetik stir
- Erlemeyer
- Gelas Ukur
- Pipet
- Spatula
- Botol Kultur
15
- Hand sprayer
- Wadah 1000 ml
B. Bahan-bahan
- NH4NO3
- KNO3
- CaCl2.2H2O
- MgSO4.7H2O
- KH2PO4
- KI
- H3BO3
- MnSO4.4H2O
- ZnSO4.7H2O
- Na2MoO4.5H2O
- CuSO4.5H2O
- CoCl2.6H2O
- FeSO4.7H2O
- Na2.EDTA.2H2O
- Asid Nikotinik
- Piridoksin-HCl
- Tiamin-HCl
- Glisin
- Sukrosa
- Myo-inositol
- Agar-agar
- Aquades
16
- Arang Aktif
- Plastik
- Karet gelang
- Alumunium foil
- Tissue
- Label
- Kertas
C. Prosedur Kerja
- Campurkan larutan Fe, larutan mikro, larutan vitamin, larutan hormon,
tambahkan unsur makro, tambahkan ZPT, tambhakan glukosa 30 gr
kemudian masukkan kedalam tabung reaksi tambahkan aquades
sebanyak 500ml.
- Selanjutnya tambahkan aquades 1000 ml
- Ukur pH Larutan 5,6-5,8
- Masukkan agar 7 gr dan panaskan hingga larutan mendidih sambil
diaduk dengan pengaduk kaca
- Tuangkan larutan kedalam botol kultur 25 ml/botol (1 ¼ botol)
- Berilah label botol sesuai perlakuan
- Tutup botol dengan plastik dan diikat dengan menggunakan karet gelang
kemudian letakkan di autoclave
- Selanjutnya simpan diruangan penyimpanan
4. Sterilisasi Bahan Kultur
A. Alat-alat
- Wadah
- Bikar 1000 ml
17
- Gelas Ukur
- Pinset
- Botol Skru
B. Bahan-bahan
- Eksplan
- Twin-20
- Bayclin
- Air kran
- Air aquades
- Air aquades sterill
- Kertas turas
C. Prosedur Kerja
- Tahap 1
- Biji tanpa testa
- Cuci dengan air mengalir
- Bilas dengan air aquades
- Tambahkan air aquades dan 2-3 tetes twin-20 kemudian aduk selama 10
menit
- Biladengan air aquades 3-4 kali(sampai bersih)
- Bawa kelaminar air flow untuk sterilisasi tahap ke 2
Tahap 2
- Biji dimasukkan kedalam botol skru
- Cuci dengan air aquades steril 1 kali
- Rendam dalam larutan bayclin 30 %
- Aduk selama 20 menit
18
- Tuangkan larutan bayclin pada gelas penampung
- Bilas eksplan dengan air aquades steril 3-4 kali(sampai bersih)
- Masukkan alkohol 96% sampai terendam eksplan
- Aduk selama 2 menit
- Bilas dengan air aquades steril 3-4 kali (sampai bersih)
- Pindahkan pada petridish yang dialas sengan kertas turas
- Eksplan siap untuk dikulturkan
5. Pengkulturan
A. Alat-alat
- Laminar air flow
- Lampu bunsen
- Petridish
- Spatula
- Gunting
- Pinset
- Skarpel
- Mata pisau
- Hand sprayer (alkohol 70 %)
- Alumunium penyangga
B. Bahan-bahan
- Eksplan
- Media kultur
- Karet gelang
- Tissue
- Alkohol murni (96%)
19
C. Perlengkapan
- Baju labor
- Masker
- Sarung tangan
D. Prosedur Kerja
- Bersihkan laminar dengan alkohol 70 % kemudian lap dengan tissue
- Masukka alat-alat kultur kedalam laminar yang sebelumnya juga
disemprot dengan alkohol 70 %
- UV selama 45 menit
- Matikan UV dan langsung hidupkan blower serta lampu TL
- Hidupka bunsen
- Alat-alat seperti pinset, gunting, skarpel dicelupkan ke alkohol kemudian
ujungnya dibakar ke api bunsen letakan pada bantalan alumunium
- Sediakan eksplan
- Masukkan media kultur kedalam laminar yang sebelumnya disemprot
dengan alkohol 70%
- Buka tutup media dan plem ke api
- Masukkan eksplan kedalam botol media dengan menggunakan pinset
- Plem permukaan botol dan tutup kembali
- Disimpan di rak kultur
6. Sub-kultur
A. Alat-alat
- Laminar air flow
- Lampu bunsen
- Petridish
20
- Spatula
- Gunting
- Pinset
- Skarpel
- Mata pisau
- Hand sprayer (alkohol 70%)
- Alumunium penyangga
B. Bahan-bahan
- Eksplan
- Media Kultur
- Karet gelang
- Tissue
- Alkohol murni (96%)
C. Perlengkapan
- Baju labor
- Sarung tangan
- Masker
D. Prosedur kerja
- Bersihkan laminar dengan alkohol 70% dan lap dengan tissue
- Masukkan alat-alat kultur kedalam laminar yang sebelumnya juga
disemprot dengan alkohol 70%
- UV selama 45 menit
- Matikan UV dan langsung hidup blower serta lampu TL
- Hidupkan bunsen
21
- Alat-alat seperti pinset, gunting, skarpel dicelup ke alkohol dan ujungnya
dibakar ke api bunsen dan letakkan pada bantalan alumunium
- Siapkan media kultur dan eksplan yang akan disubkulturkan
- Masukkan media kultur kedalam laminar yang sebelumnya disemprot
dengan alkohol 70%
- Buka tutup media yang telah dikulturkan dan cabut eksplan
menggunakan pinset
- Eksplan diletakkan dipetridish dan dipotong-potong sesuai ukuran
menggunakan skarpel
- Buka tutup media dan plemke api
- Masukkan eksplan yang telah dipotong-potong kedalam botol media
dengan menggunakan pinset
- Plem permukaan botol dan tutup kembali
- Disimpan di rak kultur
7. Aklimatisasi
A. Alat-alat
- Wadah plastik
- Wadah/bak plastik media aklim
- Plastik bening
- Pinset
B. Bahan-bahan
- Plantlet
- Air
- Fungisida
- Bakterisida
22
- Kertas koran
- Poly bag
- Media aklim
C. Prosedur Kerja
- Hardening selama 1 minggu
- Buka tutup botol isi dengan aquades, untuk melunakkan media supaya
agar yang menempel dapat sedikit longgar dan dibuang dari akar plantlet
- Plantlet dikeluarkan satu persatu dengan menggunakan pinset
- Pisahkan setiap plantlet dengan cara memotong akar plantlet yang bertaut
satu sama lain dan kemudian masukkankedalam baskom kecil yang berisi
air agarmedia yang menempel pda akar dapat tercuci
- Plantlet direndam dalam larutan fungisida 1,5 gr/liter selama 30 menit
- Plantlet dikering anginkan selama 15 menit diatas kertas koran
- Diatanam pada wadah/ bak plastik ukuran 40 cm x 50 cm
- Sungkup dengan plastik bening (agar kelembaban media tetap terjaga)
selama 1 bulan
- Tanam pada pot yang telah terisi diisi media aklimatisasi
23
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pengenalan Alat-alat Laboratorium
No Nama alat Gambar Fungsi1. Autoclave
Berfungsi untuk mensterilkan alat dan bahan agar tidak terkontaminasi oleh bakteri maupun virus
2. Oven
Untuk memanaskan ataupun mengeringkan.Biasanya digunakan untuk mengeringkan peralatan gelas laboratorium, zat-zat kimia maupun pelarut organik.
3. Destilator
Alat laboratorium yang berfungsi untuk membuat air yang murni (mendestilasi air mineral agar menjadi air yang murni) melalui proses penguapan dan pengembunan.
4. Kulkas Untuk menyimpan isolat mikroba dan lain-lain.
5. Lemari Bahan
Berfungsi sebagai tempat penyimpanan alat dan bahan yang
sudah dibersihkan dan sterilisasi atau perlengkapan yang dibutuhkan saat praktikum
24
6. Laminar Air flow
Fungsinya sebagai tempat persiapan bahan tanaman,penanaman dan pemindahan tanaman dari suatu botol ke botol yang lain dalam kultur in vitro.
7. Rak kultur Fungsinya ialah sebagai tempat penyimpanan media hasil penanaman tanaman yang telah dibuat dan disusun sedemikian rapi an teratur.
8. Kompor Gas
Fungsi kompor gas sebagai pemanas media atau pembakar bahan yang akan di uji yang dihasilkan dari energy panas tersebut.
9. Panci Berfungsi sebgai tempat pemanasan dan perebusan.
10. TimbanganAnalitik
Menimbang bahan yang akan digunakan dalam praktikum dengan tingkat ketelitian yang tinggi.
11. PH Meter Berfungsi untuk mengukur / mengetahui pH suatu larutan Hal ini sangat penting dalam pembuatan media karena pH pada media berpengaruh terhadap petumbuhan mikroba. Kertas pH indikator dicelupkan sampai tidak ada perubahan warna kemudian strip warna dicocokkan dengan skala warna acuan.
25
12. Magnetik Stir Berfungsi sebagai pengaduk cairan,
ang menggunakan putaran medan magnet untuk memutar stir bars.
13. ErlemeyerErlenmeyer berfungsi untuk menampung larutan atau cairan. Labu Erlenmeyer dapat digunakan untuk meracik dan menghomogenkan bahan-bahan komposisi media, menampung akuades, kultivasi mikroba dalam kultur cair, dan lain-lain.
14. Gelas UkurGelas ukur berfungsi untuk mengukur volume suatu cairan.
15. Gelas PialaBerfungsi sebagai Tempat melarutkan bahan-bahan untuk membuat medium.melalui beberapa ukuran volume yang di butuhkan.
16. Tabung Reaksi Digunakan untuk menyimpan
mikroorganisme dalam medium cair (broth) maupun padat. Agar tabung reaksi tetap steril, maka dalam penggunannya dapat digunakan sumbat atau penutup. Macam-macam sumbat, antara lain sumbat kapas, sumbat ulir, sumbat logam (stainless steel), dan sumbat plastik
26
17. Petridish Sebagai wadah penyimpanan dan pembuatan kultur media.
18. Pipet Berfungsi untuk mengambil larutan dan suspensi mikroba
19. Spatula Adalah alat untuk mengambil obyek. Spatula yang sering digunakan di laboratorium biologi atau kimia berbentuk sendok kecil, pipih dan bertangkai.
20. Botol Kultur
Berfungsi sebagai media tumbuh tanaman kultur jaringan dalam jangka waktu tertentu.
21. Botol Berfungsi juga sebagai proses endapan dari larutan seperti agar-agar dan larutan lainnya.yang disimpan beberapa lama.
27
22. Labu Ukur Sebagai tempat pencampuran larutan lain kedalam labu ukur.
23. Bunsen Bunsen berfungsi untuk menciptakan kondisi yang steril.
24. Gunting Fungsinya memotong sampel tanaman yang akan di masukan kedalam botol kultur jaringan.serta merapikan penutup plastic botol kultur.
25. Skarpel Fungsinya mengambil dan memindahkan objek ketempat lain.
Berdasarkan hasil pengamatan dapat disimpulkan alat-alat yang digunakan
dalam praktikum kultur jaringan terdiri dari 25 jenis alat yang memiliki fungsi serta
kegunaan yang berbeda-beda.
28
B. Sterilisasi Alat Kultur
a. Sistematika Pensterilan alat
Pertama dilakukan sterilisasi terhadap alat dan bahan. Untuk botol kultur,
dicuci bersih dan direndam dalam larutan disenfektan selama 24 jam dan
dikeringkan. Setelah itu dimasukkan ke dalam oven selama 24 jam dan siap
digunakan.
b. Cara Menggunakan Autoclave
Pastikan air dalam autoclave cukup (tinggi air + 2 cm dibawah dasar
keranjang) atau sebanyak 3 – 5 liter. Atur alat – alat yang akan disterilkan ke dalam
keranjang autoklaf dalam posisi dimana kira – kira seluruh permukaan alat dapat
terjangkau oleh uap dalam autoclave. Tutup autoclave, kemudian atur waktu 20
menit dan pastikan pengontrol exhaust dalam keadaan terbuka dan pengontrol drain
dalam keadaan tertutup. Setelah uap naik, yang ditandai dengan keluarnya uap dari
selang pembuangan dan disertai dengan bunyi mendesis, maka saat itulah lubang
exhaust ditutup. Setelah autoclave bekerja selama + 20 menit dan terdengar alarm
tanda selesai, kita menunggu terlebih dahulu sampai jarum pada tekanan menunjuk
angka nol, setelah itu barulah autoclave dibuka.
c. Tempat Penyimpanan Alat Setelah Dikultur
Tempat penyimpanan alat setelah di kultur adalah di kletakan di rak alat, di
susun dengan rapi sehingga apa bila kita ingin menggunakan alat tersebut, dapat di
temukan dengan mudah.
C. Pembuatan Media
Dari hasil pratikum yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan tekstur
media yang terbentuk adalah madia padat. Penyebabnya pada saat proses pemasakan
media yaitu (gula dan agar) proses pemasakannya tepat, apinya merata serta volume
29
larutan tepat. Jika media terlalu encer maka kita harus melakukan proses pemasakan
ulang untuk mendapatkan media yang padat
D. Sterilisasi Bahan Kultur (Eksplan)
Dari hasil pratikum yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa ciri-
ciri eksplan yang terkontaminasi adalah adanya mikrooganisme seperti jamur,
bakteri, serangga atau virus. Namun, sumber utama kontaminasi adalah spora jamur
dan bakteri yang membentuk bagian alami dari atmosfer.
E. Pengkulturan
Tabel 1. Pengamatan Persentase Hidup EksplanFaktor
BUlangan Faktor N Jumlah Rerata
N0 N1 N2 N3
B3
1 (A)
2(B)
3(C) 100%
4(D) 100%
Jumlah
Rerata
Dari tabel pengamatan diatas dapat dilihat bahwa persentase hidup dari
eksplan hasil kultur biji jeruk pada setiap perlakuan mencapai 100%. Hal ini
menunjukkan eksplan memiliki kemampuan regenerasi yang tinggi sehingga dengan
menumbuhkan pada media yang terdiri dari mineral, air dan gula eksplan mampu
untuk hidup. Persentase hidup eksplan yang mencapai 100% ini sangat ditentukan
oleh kondisi eksplan pada saat menanam dan media yang digunakan dalam kultur biji
jeruk ini.
30
Tabel 2. Pengamatan Umur Muncul TunasFaktor
BUlangan Faktor N Jumlah Rerata
N0 N1 N2 N3
B3
1 (A)
2(B)
3(C) 23 hari
4(D) 23 hari
Jumlah
Rerata
Dari hasil pratikum maka dapat disimpulkan bahwa keberhasilan dari kultur
biji jeruk ini dalam hal muncul tunas dibutuhkan waktu 23 hari, Selain itu
pertumbuhan umur muncul tunas dipengaruhi oleh sifatnya yang poliembrioni. Poli
embrio pada biji jeruk ini berasal dari jaringan integument dan nusellus.
Tabel 3. Pengamatan Jumlah Tunas Per EksplanFaktor
BUlangan Faktor N Jumlah Rerata
N0 N1 N2 N3
B3
1 (A)
2(B)
3(C) 3
4(D) 3
Jumlah
Rerata
Dari hasil pratikum maka dapat disimpulkan bahwa keberhasilan jumlah
tunas yang muncul sebanyak 3 tunas per eksplan dari kultur biji jeruk .
31
Tabel 4. Pengamatan Tinggi TunasFaktor
BUlangan Faktor N Jumlah Rerata
N0 N1 N2 N3
B3
1 (A)
2(B)
3(C) 4 cm
4(D) 4 cm
Jumlah
Rerata
Dari hasil pratikum maka dapat disimpulkan bahwa tinggi tunas yang
tumbuh 4 cm per eksplan.
Tabel 5. Pengamatan Umur Muncul AkarFaktor
BUlangan Faktor N Jumlah Rerata
N0 N1 N2 N3
B3
1 (A)
2(B)
3(C) 14 hari
4(D) 28 hari
Jumlah
Rerata
Dari hasil pratikum maka dapat disimpulkan bahwa umur muncul akar
masing-masing eksplan 14 hari dan 28 hari. Hal ini disebabkan karena adanya
perbedaan tumbuh pada eksplan biji jeruk.
32
Tabel 6. Pengamatan Jumlah AkarFaktor
B UlanganFaktor N Jumlah Rerata
N0 N1 N2 N3
B3
1 (A)
2(B)
3(C) 8
4(D) 4
Jumlah
Rerata
Dari hasil pratikum maka dapat disimpulkan bahwa jumlah akar masing-
masing eksplan 8 dan 4.
Tabel 7. Pengamatan Panjang AkarFaktor
BUlangan Faktor N Jumlah Rerata
N0 N1 N2 N3
B3
1 (A)
2(B)
3(C) 3,5 cm
4(D) 3 cm
Jumlah
Rerata
Dari hasil pratikum maka dapat disimpulkan bahwa panjang akar masing-
masing eksplan 3,5 dan 3 cm.
F. Sub-Kultur
Dari hasil pratikum serta dilakukan pengamatan maka dapat disimpulkan
bahwa persentase hidup dari eksplan hasil kultur biji jeruk pada setiap perlakuan
mencapai 100%. Keberhasilan dari kultur biji jeruk ini dalam hal muncul tunas
dibutuhkan waktu 23 hari, jumlah tunas yang muncul sebanyak 3 tunas per eksplan
dari kultur biji jeruk, tinggi tunas yang tumbuh 4 cm per eksplan, umur muncul akar
33
masing-masing eksplan 14 hari dan 28 hari, jumlah akar masing-masing eksplan 8
dan 4 dan panjang akar masing-masing eksplan 3,5 dan 3 cm.
G. Aklimatisasi
Aklimatisasi adalah masa adaptasi tanaman hasil kultur jaringan yang semula
kondisinya terkendali menjadi lingkungan yang tidak terkendali (mengubah pola
hidupnya dari tanaman heterotrof ke tanaman autotrof ).
34
LAMPIRAN
Lampiran 1. Jadwal Pratikum Bioteknologi Pertanian kelas C kelompok III
2016/1017
No Hari, Tgl/Bln/Tahun Kegiatan Praktikum
1 Senin, 23 februari 2016 - Pengenalan alat-alat
laboratorium
2 Senin, 01 maret 2016 - Sterelisasi alat kultur jaringan
- Prmbuatan media
3 Senin, 07 maret 2016 - Sterelisasi bahan kultur
- Pengkulturan
35
Lampiran 2. Dokumentasi Pratikum Bioteknologi Pertanian kelas C kelompok
3
Gambar 1. Timbagan Analitik Gambar 2. Botol Kultur
Gambar 3. Glisin Gambar 4. Pinset
Gambar 5. Jeruk eksplan Gambar 6. Pemanasan di autoclave
36
Gambar 7. Botol disusun di autoclave Gambar 8. Penutupan plastikdengan karet
Gambar 9. Pemberian aquades Gambar 10. Pemasakan Agar-agar
Gambar 11. Agar-agar Gambar 12. Gula
37
Gambar 13. Karet gelang Gambar 14. Pencucian eksplan jeruk
Gambar 15.Penutupan autoclave Gambar 16. Pemberian Agar ke botol
Gambar 17. Tissu Gambar 18. Hand sprayer
38
Gambar 19. pengkulturan Gambar 20. penambahan perlakuan
Gambar 21. pengadukan larutan Gambar 22. Ph larutan
Gambar 19. umur 1 minggu Gambar 20. umur 6 minggu
39
V. PENUTUP
A. Kesimpulan
Kultur jaringan merupakan salah satu metode perbanyakan tanaman secara
vegetatif. Kultur jaringan tertua dilakukan pada biji jeruk dengan tujuan untuk
mengecambahkannya dalam media yang kaya nutrisi karena biji dari jeruk tidak
mempunyai cadangan makanan. Kultur jaringan terus berkembang dari
mengkulturkan biji berkembang dengan mengkulturkan jaringan dan terus
berkembang hingga mampu mengkulturkan satu sel dari tanaman.
B. Saran
Diharapkan kepada mahasiswa agar lebih serius dalam mengikuti pratikum
serta agar lebih hati – hati dalam melakukan penanaman. Usahkan pada saat akan
melakukan penanaman sesuai dengan petunujuk agar tidak terjadi kontaminansi yang
dapat mengakibatkan kegagalan dari praktikum.
40
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2008. Kontaminasi pada kultur jaringan.http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/26055/5/Chapter%20I.pdf
Anonim. 2008. Media pada kultur jaringan.http://hamdan-motor.blogspot.co.id/2008/07/kultur-jaringan.html
Anonimous. 2002. Pengertian kultur jaringan.http://menarailmuku.blogspot.co.id/2012/11/klasifikasi-citrus-sp-jeruk.html
Gunawan. 1988. Teknik kultur jaringan. http://triamegumi.blogspot.co.id/2012/10/laporan-pengenalan-alat-sterilisasi.html
Hendra. 2007. Syarat teknik kultur jaringan.http://blogku-agroteknologi.blogspot.co.id/2013/01/kuljar-dan-variasi-didalamnya.html
Purnamaningsih. 2006. Zat pengatur tumbuh pada kultur jaringan.http://marufah.blog.uns.ac.id/files/2010/05/laporan-praktikum-kultur-jaringan-dewi.pdf
Purnamaningsih. 2006.Struktur kalus pada kultur jaringan.http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/29787/4/Chapter%20I.pdf
Purwanto. 2008. Eksplan pada kultur jaringan.http://www.damandiri.or.id/file/anisuryaniipbbab1.pdf
Rahardja. 1988. Takaran untuk membuat media pada kultur jaringan.http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/27314/5/Chapter%20I.pdf
Wattimena. 1992. Perbanyakan jeruk kuok.http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/18682/4/Chapter%20II.pdf
Wetherel. 1982. Hal yang menyebabkan kultur jaringan terkontaminasi.http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/27314/4/Chapter%20II.pdf
Yusnita. 2003. Faktor pendukung keberhasilan kultur jaringan.http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/18682/4/Chapter%20II.pdf
Yusnita. 2003. Faktor penting dalam kultur jaringan.http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/26055/5/Chapter%20I.pdf
Zulkarnain. 2009. Pengertian medium MS.http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/20283/3/Chapter%20II.pdf
41
Lampiran 3. Biodata Diri
Nama :Mirna Wati
Kelas : 4 c agroteknologi
Kelompok : 3
Tempat/tanggal lahir : Paya mahei, 14 desember 1995
Asal Sekolah :
SD : SD N 104336 Guntingan, kec :Deli serdang kab : Serdang bedagai
SMP : SMPN 3 Tapung, kec : Tapung kab : Kampar
SMA : SMAN 1 Simpang kanan, kec :Simpang kanan kab : Rokan Hilir