„Molekulare Biophysik“
NMR-Spektroskopie
(Teil 3)
DasNMR-Spektrometer
Peter SchmiederFMP
3/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Magnet
Hardware-SchrankProbenkopf
Probenwechsler
Peter SchmiederFMP
4/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Magnet
B0 [Tesla] 0 [MHz]
1.4 60
5.9 250
9.4 400
14.1 600
21.2 900
Das Erdmagnetfeld hat eine Stärke
von 30-60 T (0.3 –0.6 Gauss)
Peter SchmiederFMP
5/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Magnet
flüssiger Stickstoff
Supraleitende Spule
Bohrung des Magneten:54 mm „narrow bore“89 mm „wide bore“
flüssiges Helium
Peter SchmiederFMP
6/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Magneten sind faszinierend aber auch gefährlich
Peter SchmiederFMP
7/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Peter SchmiederFMP
8/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
RT-Probenkopf
Cryo-Probenkopf
ATM-Probenkopf
Peter SchmiederFMP
9/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Der Probenkopf
Peter SchmiederFMP
10/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Die Probe im Probenkopf
Helmholtz-Spule
Peter SchmiederFMP
11/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Der Shim, das Problem der Homogenität
abcd
a,b,c,d
a,b,c,da,b,c,d
a,b,c,d
a
b
c
d
d
c
b
a
t
Peter SchmiederFMP
12/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Die Hardware, d.h. die Elektronik
Peter SchmiederFMP
13/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Hardware
Peter SchmiederFMP
14/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Hardware
Peter SchmiederFMP
15/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
;zgdc;avance-version (03/04/17);1D sequence with decoupling
#include <Avance.incl>
"d11=30m"
1 zed11 pl12:f2
2 30m do:f2d11 cpd2:f2d1p1 ph1go=2 ph3130m do:f2 mc #0 to 2 F0(zd)
exit
ph1=0 2 2 0 1 3 3 1ph31=0 2 2 0 1 3 3 1
Software
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Peter SchmiederFMP
17/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Ein Problem der eindimensionalen NMR-Spektroskopie ist, dass selbst recht einfach
Moleküle oft nicht oder nur mit hohem Aufwand eindeutig zugeordnet werden können
Zimtsäureethylester
Ethyl-3-phenylprop-2-enoat (IUPAC)
O
O
Peter SchmiederFMP
18/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Ein Zuordnung mit Datenbanken ist oft nicht sicher genug
O
OH
H
7.21
7.14
7.21
7.30
7.30 4.19
1.30
7.64
6.39
01234567PPM
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm
3.0
2
2.0
7
1.0
0
2.9
9
3.1
2
Peter SchmiederFMP
19/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Mit 13C oft noch besser als mit 1H
O
O
128.7
128.0
128.7
126.4
135.2
126.4 145.2
116.3
166.561.4
14.2
020406080100120140160180PPM
160 140 120 100 80 60 40 20 ppm
Peter SchmiederFMP
20/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Der entscheidende Vorteil dermehrdimensionalen NMR-Spektroskopie ist:
MagnetisierungstransferEs entstehen Signale, die auf eine Wechselwirkung zwischen den Kernen hinweisen. Das können WW
durch die Bindung (via J-Kopplung) oder durch den Raum (via NOE) sein.
Diese Signale werden auf einer Fläche oder in einem mehrdimensionalen Raum verteilt, was eine gute
Auflösung ermöglicht.
Peter SchmiederFMP
21/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
1D-NMR2 Achsen:
Intensität vs. Frequenz
2D-NMR3 Achsen:
Intensität vs. Frequenz (1)vs. Frequenz (2)
Peter SchmiederFMP
22/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
1D-NMR schematisch
Preparation Detektion
Peter SchmiederFMP
23/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
1D-1H-Spektrum
C11H13N2O3Br
N
NHBr
O
O
O
OH
OH
Peter SchmiederFMP
24/90
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Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
2D-NMR Sequenzen enthaltenzwei neue Elemente:
Evolutionszeit und Mischzeit
Preparation Evolution Mischung Detektion
Evolution:Erzeugen einer weiterenFrequenzachse durch indirekte Detektion
Mischung:Transfer von Magnetisierung von
Spin zu Spin über Wechsel-Wirkungen zwischen Spins
(t1) (t2)
Peter SchmiederFMP
25/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Mit der Evolutionszeit wird
eine indirekte Dimension
erzeugt, man bewerkstelligt
das durch die systematische
Veränderung einer
Zeitspanne in einer Sequenz
von Pulsen, man braucht also
mindestens zwei Pulse.
Die Evolutionszeit
Peter SchmiederFMP
26/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Die Aufzeichnung des FIDs
haben wir uns schon im Detail
angeschaut, sie wird jetzt für
jeden neuen Zeitwert
wiederholt. Auch in der
indirekten Dimension müssen die
Zeiten ganzzahlige Vielfache
eines Intervalls t sein
Die Evolutionszeit
Peter SchmiederFMP
27/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Das schauen wir uns wieder näher an und nutzen die gleichen
drei Linien wie beim 1D
z
x
y 90°-x
z
x
y 2000 Hz-500 Hz
-1500 Hz
90Y90-x
kt1kt2
Peter SchmiederFMP
28/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Man erkennt dass die Anfangsintensität in t2
von der Frequenz abhängt
(kt1 = t1)
Peter SchmiederFMP
29/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
3000 2000 1000 0 -1000 -2000 -3000
10 8.33 6.66 5 3.33 1.66 0
[Hz]
[ppm]
x
y
t1 = 166 sec
x
y
x
y
t1 = 0 sec
x
y
t1 = 332 sec t1 = 498 sec
t1 = 0 sec
t1 = 166 sec
t1 = 332 sec
t1 = 498 sec
Peter SchmiederFMP
30/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
3000 2000 1000 0 -1000 -2000 -3000
10 8.33 6.66 5 3.33 1.66 0
[Hz]
[ppm]
t1 = 0 sec
t1 = 166 sec
t1 = 332 sec
t1 = 498 sec
t [msec]
0.1
0.2 0.3
0.4
0.5Iy0
1
-1
Entlang der indirekten Zeitachse entsteht das gleiche Bild wie entlang der direkten
Peter SchmiederFMP
31/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Insgesamt also ein zweidimensionaler FID
Peter SchmiederFMP
32/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Eine erste FT ergibt ein „Interferogram“.
Peter SchmiederFMP
33/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Eine zweite FT ergibt ein zweidimensionales Spektrum.
Peter SchmiederFMP
34/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Zur Auswertung
betrachtet man
Contour-Plots, die
Peakintensität als
Höhenlinien
darstellen.
Peter SchmiederFMP
35/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
In mehrdimensionalen Experimenten wird gute Auflösung
durch mehr Werte für kt1 erreicht.
Daher ist in mehrdimensionalen Experimenten die
Auflösung in den indirekten Dimensionen immer begrenzt.
Die Zeit für die Messung ist
aber der Anzahl der
aufgezeichneten FIDs direkt
proportional, gute Auflösung
bedeutet also lange Messzeit.
Peter SchmiederFMP
36/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Gäbe es nur Evolution und Detektion dann würde in
beiden Zeitdimensionen immer die gleichen Frequenzen
detektiert, ganz entscheidend ist also die Mischzeit, in
der es zur Übertragung von Magnetisierung von einem
Kern zum nächsten kommt.
Preparation Evolution Mischung Detektion
(t1) (t2)
Peter SchmiederFMP
37/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Diese Übertragung von Magnetisierung während der Mischzeit kann durch verschiedene Mechanismen
geschehen. Der am meisten verwendete Mechanismus ist die J-Kopplung, von großer Bedeutung ist aber auch
der NOE-Effekt, die Übertragung durch den Raum.
Peter SchmiederFMP
38/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Wichtig ist auch ob die Übertragung zwischen gleichen Spins der gleichen Kernsorte oder
andersartigen Spins erfolgt.Man unterscheidet daher homonukleare und
heteronukleare Experimente.
Peter SchmiederFMP
39/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
homonukleare Experimente Transfer von Magnetisierung findet zwischen gleichartigen Kernen statt. Beide Frequenzachsen zeigen die chemischen Verschiebungen des gleichen Kerns. Findet Transfer statt, ergibt sich in beiden Dimensionen eine unterschiedliche Verschiebung: KreuzsignalFindet kein Transfer statt, dann ergibt sich in beiden Dimensionen die gleiche Verschiebung:Diagonalsignal
Peter SchmiederFMP
40/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
heteronukleare Experimente Transfer von Magnetisierung findet zwischen unterschiedlichen Kernsorten statt. Beide Frequenzachsen zeigen die chemischen Verschiebungen unterschiedlicher Kerne. Findet Transfer statt, ergibt sich ein Signal am Schnittpunkt der chemischen Verschiebungen der involvierten Kerne. Findet kein Transfer statt, dann ergibt sich kein Signal.
Peter SchmiederFMP
41/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
3D-NMR
Preparation
Preparation
Evolution
Evolution
Mischung
Mischung
Detektion
Detektion
Preparation Evolution (1) Mischung (1) Evolution (2) Mischung (2) Detektion
Ein dreidimensionales Experiment entsteht formal durch
Kombination von zwei zweidimensionalen Experimenten,
solche Experimente sind vor allem bei Proteinen wichtig.
Peter SchmiederFMP
42/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Das Spektrum ist dann keine Fläche mit
Signalen mehr sondern ein Würfel, mit drei
Achsen mit chemischer Verschiebung.
Intensität zeigt sich als „vierte Dimension“
Peter SchmiederFMP
43/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Mit einem Satz homo- und heteronuklearer 2D-Experimente sollte eine Zuordnung aller Resonanzen von kleinen Molekülen möglich sein, oft braucht man
nur ein COSY, ein HMQC und ein HMBC
Zimtsäureethylester
Ethyl-3-phenylprop-2-enoat (IUPAC)
O
O
Das COSY-Experiment
Peter SchmiederFMP
45/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
COSY
Die einfachste denkbare zweidimensionale
Sequenz besteht aus zwei Pulsen, das ist das
homonukleare COSY:
90Y90x
t1
Preparation Evolution Mischung Detektion
t2
Peter SchmiederFMP
46/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
COSY
Wir haben mit derEvolutionszeit eine zweiteDimension erzeugt aber
das 2D Spektrumhat nur eine Diagonale.
Wenn wir nur die Evolution betrachten haben wir aber auf beiden Achsen die gleiche Information.
1 2
1
2
H1 H2H (ppm)
H (ppm)
Peter SchmiederFMP
47/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
COSY
Wenn wir in der Mischzeit aber Transfer haben dann
ist etwas neues entstanden:
Es gibt Signale, die in den
beiden Dimensionen mit
unterschiedlichen
chemischen Verschiebungen
„markiert“ worden sind:
die Kreuzsignale. 1 2
1
2
H1 H2H (ppm)
H (ppm)
Transfer
Peter SchmiederFMP
48/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
COSY
Ein Anwendungsbeispiel:
H H H H
?J12 J34
J12 ~ J34
Eine Zuordnung ist im 1Dnicht möglich...
Peter SchmiederFMP
49/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
COSY
....aber im 2D ganz leicht.
Peter SchmiederFMP
50/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Im COSY ist die Ethylgruppe leicht, Aromat und Olefin nicht komplett zuzuordnen
O
O
ppm
8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
8
7
6
5
4
3
2
1
ppm
7.07.5 ppm
7.0
7.5
H
HH
H
H
H
H
O
OH
H
7.21
7.14
7.21
7.30
7.30 4.19
1.30
7.64
6.39
Das HMQC/HMBC-Experiment
Peter SchmiederFMP
52/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
HMQC/HMBC
Bislang haben wir ein homonukleares Experiment betrachtet, man kann aber auch in natürlicher
Häufigkeit heteronuklearen Experimente machen, entweder basierend auf der direkten 1H-X-
Kopplung (HMQC) oder der Weitbereichskopplungen (HMBC).
X nX
1H
nX X X
1H HMQCHMBC
X
Peter SchmiederFMP
53/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
HMQC/HMBC
Ob ein Transfer stattfindet hängt von der Größe
der Kopplungskonstanten ab und kann auch durch die
Pulssequenz beeinflusst werden.
Mit Kopplungen < 1 Hz ist kein Transfer möglich.
Kopplungen über eine Bindung sind größer als über
mehrere Bindungen.
1JHH = 276 Hz
2JHH = 0 .. 30 Hz3JHH = 0 .. 20 Hz4JHH = 0 .. 3 Hz
1JHC = 125 .. 200 Hz
2JHC = 0 .. 20 Hz3JHC = 0 .. 15 Hz4JHC = 0 .. 2 Hz
1JHN = 60 .. 100 Hz
2JHN = 0 .. 15 Hz3JHN = 0 .. 8 Hz4JHN = 0 .. 1 Hz
Peter SchmiederFMP
54/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
HMQC/HMBC
Man kann sich zwei Varianten von heteronuklearen
zweidimensionalen Experimenten überlegen, je
nachdem welchen Kern man detektiert und welchen
man in der indirekten Dimension hält.
Das hat Einfluss auf die Auflösung, die erreichbar
ist, und auf die Empfindlichkeit der Messung.
In der indirekten Dimension erfordert doppelte
Auflösung doppelte Zeit, in der direkten Dimension
ist das kein Problem.
Peter SchmiederFMP
55/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
HMQC/HMBC
Die Empfindlichkeit der Messung hängt von mehreren Faktoren ab:
MagneticMoment
Spin AngularMomentum
Bd 0S/N ~ (pB0) (d)( )
H ~ 4 C, die Detektion auf Protonen bringtalso einen Faktor 8 !!
Peter SchmiederFMP
56/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
HMQC/HMBC
X
H
HMQC = Heteronuclear MultipleQuantum Correlation
Ein Signal zeigt die direkte Bindung
zwischen H und X an.
Die Kopplung zwischen H und X ist nicht zu sehen, während der Evolution
und der Acquisition wird „entkoppelt“.
Peter SchmiederFMP
57/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
O
O
Im HMQC unseres kleinen Moleküls bekommen wir 5 Korrelationen von Wasserstoffen zu Kohlenstoff im Aromaten / Olefin-Bereich
ppm
8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
140
120
100
80
60
40
20
ppm
7.07.58.0 ppm
130
140
H
HH
H
H
H
H
O
O
128.7
128.0
128.7
126.4
135.2
126.4 145.2
116.3
166.561.4
14.2
100% Zuordnung haben wir aber noch nicht
Peter SchmiederFMP
58/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
HMQC/HMBC
Um die Spektren ganz zweifelsfrei zuzuordnen brauchen wir dann das HMBC in dem Signale durch die
kleinen, über mehrere Bindungen reichenden Kopplungen erzeugt werden.
Im allgemeinen sind 2J und 3J Kopplungen groß genug um eine Korrelation zu ergeben, in bestimmten Situationen können aber auch Kopplungen über mehrere Bindungen
Signal ergeben.Signale durch direkte Kopplung versucht man zu unterdrücken um das Spektrum zu vereinfachen.
Peter SchmiederFMP
59/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
HMQC/HMBC
= via 1JHX
Transfer via 1JHX Transfer via nJHXX
H H
HMBC = Heteronuclear MultipleBond Correlation
HMQC HMBC
Es bleiben nicht unterdrückte Signale von den 1JHC übrig als kleine Doubletts, andere Signale zeigen
Weitbereichskopplung an.
Peter SchmiederFMP
60/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Im HMBC sind die Signale der Ethylgruppe wieder eindeutig und man findet auch leicht das CO der Säuregruppe
O
O
128.7
128.0
128.7
126.4
135.2
126.4 145.2
116.3
166.561.4
14.2
O
OH
HH
H
H
H
H
CH3
H Hppm
8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
40
60
80
100
120
140
160
Peter SchmiederFMP
61/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
O
O
Um mit Aromaten und Olefinen klar zu kommen muss man sehr genau hinschauen
O
O
128.7
128.0
128.7
126.4
135.2
126.4 145.2
116.3
166.561.4
14.2
H
HH
H
H
H
H
CH3
H H
grün = HMQC, rot = nicht unterdrückte Signale
ppm
6.66.87.07.27.47.67.88.0 ppm
120
125
130
135
140
145
Ein Beispiel
Peter SchmiederFMP
63/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
C11H13N2O3Br Desoxythymidin
Das Molekül: Brivudin
Brivudin wird bei Herpes zoster angewendet
N
NHBr
O
O
O
OH
OH
N
NHCH3
O
O
O
OH
OH
Peter SchmiederFMP
64/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
Die Experimente
1D-1H 1 min
1D-13C 1 h
DEPT 10 min
COSY 10 min
13C-HMQC 10 min
13C-HMBC 50 min
15N-HMQC 3 h
15N-HMBC 35 h
Peter SchmiederFMP
65/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
1D-1H-Spektrum
C11H13N2O3Br
DMSO
H/D
H/D
H2O
1 1 11 1 1 1 1 1 2 2
N
NHBr
O
O
O
OH
OH
1
1'
2'3'
4'
5'
2
34 5
6
7
8
Peter SchmiederFMP
66/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
C11H13N2O3Br
1D-13C-Spektrum
N
NHBr
O
O
O
OH
OH
Peter SchmiederFMP
67/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
C11H13N2O3Br
DEPT-Spektrum
1D-13C-Spektrum
N
NHBr
O
O
O
OH
OH
Peter SchmiederFMP
68/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
Zuckerbereich
Korrelation von Frequenzen via 1H-1H-Kopplung, i.a. nur zwei oder drei Bindungen.
COSY
6
3
7 oder 8,nicht unterscheidbar
N
NHBr
O
O
O
OH
OH
1
1'
2'3'
4'
5'
2
34 5
6
7
8
Peter SchmiederFMP
69/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
DMSO
H2O
H/D
COSY
3‘OH
5‘OH
1‘
2‘
4‘5‘
3‘
1'
2'3'
4'
5' O
OH
OH
Peter SchmiederFMP
70/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
13C-HMQCZuckerbereich
Basenbereich
1‘
2‘
4‘
5‘3‘
6Korrelation von Frequenzen
via 1H-13C-Kopplung, man korreliert nur direkt
aneinander gebundene Kerne.
7/8
N
NHBr
O
O
O
OH
OH
1
1'
2'3'
4'
5'
2
34 5
6
7
8
Peter SchmiederFMP
71/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
2‘
1‘4‘ 5‘3‘6 7/8 7/8
1D-13C-Spektrum
Peter SchmiederFMP
72/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
13C-HMBC
1‘
Zuckerbereich
Basenbereich
Korrelation von Frequenzen via 1H-13C-Kopplung, man korreliert über bis zu 4
Bindungen (2JHC bis 4JHC), 1JHC gibt ein Dublett.
N
NHBr
O
O
O
OH
OH
1
1'
2'3'
4'
5'
2
34 5
6
7
8
Peter SchmiederFMP
73/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
13C-HMBC(Basenbereich)
1‘
6
4‘
2
5
Korrelation ausgehend von H1‘ Korrelation zu 5 ist
schwach und 5 ist von 7/8 aus zu sehen.
= via 1JHC
6
7/8
7/8 N
NHBr
O
O
H
HH
H
1
1'
2
34 5
6
7
8
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
13C-HMBC(Basenbereich)
6
3
1‘
2
5
Korrelation ausgehend von H3
C2 fehlt !!
7
4
Hier muss 7 sein N
NHBr
O
O
H
HH
H
1
1'
2
34 5
6
7
8
6 1‘
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Ein Beispiel: Brivudin
13C-HMBC(Basenbereich)
6
7
5
Korrelation ausgehend von H7, das via H3 zugeordnet ist.
4
8
N
NHBr
O
O
H
HH
H
1
1'
2
34 5
6
7
8
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Ein Beispiel: Brivudin
13C-HMBC(Basenbereich)
6
8
5
Korrelation ausgehend von H8, das via H3/H7 zugeordnet ist.
7 N
NHBr
O
O
H
HH
H
1
1'
2
34 5
6
7
8
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Ein Beispiel: Brivudin
13C-HMBC(Basenbereich)
6
61‘
2
5
Korrelation ausgehend von H6, alles ist zu sehen, das hilft nicht beim Zuordnen,
es passt aber alles.
7
4
8
N
NHBr
O
O
H
HH
H
1
1'
2
34 5
6
7
8
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Ein Beispiel: Brivudin
ppm
13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
142
144
146
148
150
152
154
156
158
160
162
164
166
168
170
15N-HMQC
3 N
NHBr
O
O
H
HH
H
1
1'
2
34 5
6
7
8
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Ein Beispiel: Brivudin
ppm
13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
142
144
146
148
150
152
154
156
158
160
162
164
166
168
170
15N-HMBC
3
1
3 6 1‘ 2‘
N
NHBr
O
O
H
HH
H
1
1'
2
34 5
6
7
8
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Ein Beispiel: Brivudin
Zuordnung1H [ppm] 13C [ppm] 15N [ppm]
1' 6,16 84,5 -
2' 2,17 39,8 -
3' 4,27 69,9 -
4' 3,79 87,5 -
5' 3,62 61 -
1 - - 149,7
2 - 149,2 -
3 11,92 - 157,7
4 - 161,6 -
5 - 109,7 -
6 8,09 139,4 -
7 6,87 129,9 -
8 7,25 106,5 -
13C [ppm] 13C [ppm] 15N [ppm]
predicted dT dT
1' 77,8 ± 8,2 85,1 -
2' 39,9 ± 5,1 40,4 -
3' 68,7 ± 1,6 71,7 -
4' 74,8 ± 9,2 88,4 -
5' 63,8 ± 0,3 62,4 -
1 - - 142,7
2 156,8 ± 10,6 151,6 -
3 - - 153,5
4 135,7 ± 6,9 137,3 -
5 117,5 ± 3,1 110,5 -
6 135,7 ± 11,4 164,9 -
7 132,6 ± 6,9 - -
8 89,4 ± 15,8 - -
DOSY
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82/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
DOSY
Das DOSY (Diffusion Ordered SpectrocopY) ist eine besondere Art von Spektroskopie, da es zweidimensionale
Spektren erzeugt, die auf einer Achse die Diffusionrate des Moleküls anzeigen.
Die Diffusionsrate kann für unterschiedliche Untersuchungen von Bedeutung sein, z.B. für eine Bestimmung von Größe oder
Aggregation. Sie kann aber auch zur Untersuchung von Stoffgemischen eingesetzt werden, wobei die Spektren der im Gemisch enthaltenen Stoff nach deren Größe getrennt
aufgetragen werden.Das Experiment nutzt die Tatsache dass die Diffusion die
Moleküle durch das Probenvolumen bewegt, dessen Magnetfeld durch Gradienten beeinflusst werden kann.
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83/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
DOSY
Ohne Diffusion können zwei Gradienten durch einen 180°-Puls aufgehoben werden. Den 180°-Puls kann man auch in zwei Hälften teilen und dazwischen einfach warten das Diffusion passiert, z-
Magnetisierung ist langlebiger als x,y-Magnetisierung
180 18090 90 90
G z
H1
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DOSYDas Experiment wird nun mehrfach durchgeführt und dabei die Gradientenstärke zwischen 0 und maximal variiert. Man erzeugt also eine indirekte Dimension mit Gradientenstärke statt Zeit.
Die Zeit für die Diffusion bleibt dabei konstant.
180 18090 90 90
G z
H1
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85/90
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DOSY
I
g [T/m]
Die zu erwartenden Intensitäten ergeben sich aus den
Diffusionsgleichungen: I = Io exp [- D 2 g2 2 ( - /3 - /2)]
Das ist eine Gauss-Kurve: I = Io exp – x g2
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86/90
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DOSY
Die kann linearisiert werden: I = Io exp [- D 2 g2 2 ( - /3 - /2)]
T = 2 ( - /3 - /2) - ln (I/Io) = D 2 T * g2
g2 [T2/m2]
- ln (I/Io)
y = -0,0051203 + 14,129x R= 0,99998
Damit kann die
Diffusionskonstante
aus der Steigung
ermittelt werden
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DOSY
% Gradient
0
100
80
60
40
20
Ein praktisches Beispiel ist die Untersuchung zweier
Komplexbildner in D2O, es sollte festgestellt werden ob die beiden
eine Komplex miteinander bilden
1H-1D-Spektrum
pseudo-2D-Spektrum
Gauss-Kurve
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Zur Auswertung wurde neben der linearisierten Gausskurve….
auch eine andere Art der Darstellung gewählt
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DOSY
Man kann die Gausskurven durch eine inverse Laplace-
Transformation in ein Spektrum mit Diffusionskonstante auf der
indirekten Achse verwandeln.
HDO
CB6CS
log(m2/s)
log(m2/s)
Diffusionskonstante
Diffusionskonstante
Fragen: [email protected]
Scripte: schmieder.fmp-berlin.info/teaching/vorlesung_mbph.htm