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José Rodolfo Lopes de Paiva Cavalcanti
OS NÚCLEOS DOPAMINÉRGICOS DO MESENCÉFALO DO MOCÓ
(Kerodon rupestris): CARACTERIZAÇÃO CITOARQUITETÔNICA E
POR IMUNOISTOQUÍMICA PARA TIROSINA-HIDROXILASE
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, como
pré-requisito para obtenção do título de
Mestre em Psicobiologia.
NATAL-RN
2011
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José Rodolfo Lopes de Paiva Cavalcanti
OS NÚCLEOS DOPAMINÉRGICOS DO MESENCÉFALO DO MOCÓ
(Kerodon rupestris): CARACTERIZAÇÃO CITOARQUITETÔNICA E
POR IMUNOISTOQUÍMICA PARA TIROSINA-HIDROXILASE
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, como pré-
requisito para obtenção do título de Mestre em
Psicobiologia.
Orientadora: Profª Drª Miriam Stela Maris de
Oliveira Costa
NATAL-RN
2011
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de
Biociências
Cavalcanti, José Rodolfo Lopes de Paiva
Os núcleos dopaminérgicos do mesencéfalo do mocó (kerodon
rupestris): caracterização citoarquitetônica e por imunoistoquímica para
tirosina-hidroxilase / José Rodolfo Lopes de Paiva Cavalcanti. – Natal,
RN, 2011.
64 f. : Il.
Orientadora: Profa. Dra. Miriam Stela Maris de Oliveira Costa.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do
Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em
Psicobiologia.
1. Roedores – Dissertação 2. Núcleos Dopaminérgicos do
Mesencéfalo – Dissertação. 3. Tirosina-hidroxilases – Dissertação. I.
Costa, Miriam Stela Maris de Oliveira. II. Universidade Federal do Rio
Grande do Norte. IV. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 599.322/.324
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TÍTULO: OS NÚCLEOS DOPAMINÉRGICOS DO MESENCÉFALO DO MOCÓ
(Kerodon rupestris): CARACTERIZAÇÃO CITOARQUITETÔNICA E POR
IMUNOISTOQUÍMICA PARA TIROSINA-HIDROXILASE.
AUTOR: José Rodolfo Lopes de Paiva Cavalcanti
DATA DA DEFESA: ____/____/______
BANCA EXAMINADORA:
Profª Drª Miriam Stela Maris de Oliveira Costa – Orientadora
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Profª Drª Belmira Lara da Silveira Andrade da Costa
Universidade Federal de Pernambuco
Prof. Dr. Expedito Silva do Nascimento Júnior
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
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AGRADECIMENTOS
A satisfação de vencer mais essa batalha e de chegar até aqui é inenarrável. Neste
processo de maturidade intelectual/pessoal, convivi com pessoas que de alguma maneira
marcaram esta caminhada. Sendo assim, não poderia deixar de expressar os meus sinceros
agradecimentos:
A Deus, sobretudo por garantir as circunstâncias favoráveis ao longo dessa
caminhada, mesmo tendo em troca as minhas frequentes negligências espirituais.
À minha esposa e amiga Dayane Pessoa. Nem que eu tivesse todo o restante das
páginas desta dissertação, eu seria capaz discorrer sobre o que representas para mim. Quem
diria que um namoro ingênuo, mergulhado no mais impressionante devaneio da inocência e
sustentado pelos imprescindíveis veículos de comunicação à distância, vingaria? Somos a
prova de que o amor vence barreiras e transcende o convencional. Por isso, costumo dizer que
na sua ausência eu sou apenas uma metade. Amo-te.
À minha família pelo amor e respeito fornecidos, em especial aos meus pais Gonçalo
Cavalcanti e Fátima Cavalcanti pelo exemplo de integridade e lisura, além de assegurarem
uma ótima criação aos seus filhos, priorizando sempre a educação, o respeito para com o
próximo e a valorização do “ser” em detrimento ao “ter”.
Ao meu irmão, Diogo Manuel, pela constante união e partilha de conhecimentos.
Às minhas tias, Socorro Medeiros e Luzia Cecília, assim como à minha prima
Juliêta Fernandes, pela garantia aqui em Natal-RN da extensão do meu lar. Certamente, na
ausência de vocês essa caminhada teria sido bem mais adversa.
À professora/orientadora Miriam Stela, por todo o ensinamento, pela paciência, pela
dedicação e, acima de tudo, pelo voto de confiança depositado em mim quando decidiu
aceitar-me como orientando, mesmo se conhecer meus princípios, meus propósitos, minha
história.
Ao grande amigo Fausto Guzen. Pessoas passam todos os dias nas nossas vidas, mas
são poucas as que permanecem. Você me estendeu a mão e me apresentou caminhos que
fortemente definiram o meu futuro. Viu em mim um profissional que jamais eu teria visto
diante do espelho e me trouxe à psicobiologia e, depois, à FACS. Por isso, considero-te como
uma extensão da minha família e saiba que diuturnamente trabalho(arei) para atestar que a sua
ajuda não foi em vão.
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À turma do LabNeuro: André, pelo companheirismo e hospitalidade que foram
cruciais ao bom andamento das coisas aqui e, acima de tudo, pelo exemplo de determinação
frente às vicissitudes da vida. Joacil e Leandro, pelos momentos de descontração, sempre
sem perder de vista o cumprimento das responsabilidades, assim como pela constante
disposição em colaborar. Gilberto, um exemplo de serenidade e dedicação aos trabalhos.
Janaína, Rovena e Twyla pelas dúvidas esclarecidas, pelas caronas ofertadas e pela elevação
significativa nas taxas de colesterol e triglicerídeos em função das dietas nada saudáveis.
Kátia e Rayane, embora nossos contatos tenham sido poucos, cada uma demonstrou ao seu
modo o comprometimento indispensável ao bom profissional. Alane, que também é colega de
formação (Enfermagem), permanecerá com você a missão de mostrar aos demais enfermeiros
que a psicobiologia também pode ser um espaço nosso. Aos alunos e iniciação científica
Nayra, Kayo, Paulo e Melquisedec por todas as ajudas nos experimentos e pela manutenção
de um ambiente descontraído no laboratório.
Aos professores Expedito, Jeferson, Judney e Ruthnaldo pelas dúvidas
esclarecidas, pelas dicas e pela disponibilidade.
Ao Departamento de Morfologia – DMOR/UFRN pela garantia da infraestrutura
necessária a plena execução deste trabalho.
À Regina, pelo preparo das soluções, pela garantia da ordem do laboratório no
tocante à execução dos experimentos e pela relação amigável.
A todos os meus colegas do mestrado pela breve, mas significativa convivência.
Aos professores da Universidade do Estado do Rio Grande do Norte – UERN e da
Faculdade de Enfermagem Nova Esperança de Mossoró – FACENE/RN pelo incentivo a
concluir o mestrado e compreensão quando me fiz ausente.
Ao Ibama, pela autorização e licença para realização deste trabalho.
Ao CNPq e a CAPES pelo apoio financeiro.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Esquema da síntese da noradrenalina;
Figura 2: Síntese da dopamina e seu armazenamento nas vesículas sinápticas;
Figura 3: Os núcleos dopaminérgicos no encéfalo do rato;
Figura 4: Corte coronal de mesencéfalo do rato, evidenciando os núcleos dopaminérgicos;
Figura 5: Famílias de receptores de dopamina;
Figura 6: O mocó em ambiente natural;
Figura 7: O mocó posicionado em aparelho estereotáxico e com alinhamento dorsoventral do
bregma e lambda;
Figura 8: O mocó posicionado em aparelho estereotáxico, após remoção da calota craniana;
Figura 9: Encéfalo do mocó em vistas dorsal e ventral;
Figura 10: Reconstrução esquemática das secções coronais do encéfalo do mocó;
Figura 11: Corte coronal do encéfalo do mocó (2,34mm p.b.) – Coloração pela técnica de
Nissl e imunorreatividade contra TH;
Figura 12: Corte coronal do encéfalo do mocó (2,70mm p.b.) – Coloração pela técnica de
Nissl e imunorreatividade contra TH;
Figura 13: Corte coronal do encéfalo do mocó (3,24mm p.b.) – Coloração pela técnica de
Nissl e imunorreatividade contra TH;
Figura 14: Corte coronal do encéfalo do mocó (3,42mm p.b.) – Coloração pela técnica de
Nissl e imunorreatividade contra TH;
Figura 15: Corte coronal do encéfalo do mocó (3,96mm p.b.) – Coloração pela técnica de
Nissl e imunorreatividade contra TH;
Figura 16: Corte coronal do encéfalo do mocó (4,14mm p.b.) – Coloração pela técnica de
Nissl e imunorreatividade contra TH;
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Figura 17: Corte coronal do encéfalo do mocó (4,68mm p.b.) – Coloração pela técnica de
Nissl e imunorreatividade contra TH;
Figura 18: Corte coronal do encéfalo do mocó (5,04mm p.b.) – N Coloração pela técnica de
issl e imunorreatividade contra TH;
Figura 19: Corte coronal do encéfalo do mocó (5,22mm p.b.) – Coloração pela técnica de
Nissl e imunorreatividade contra TH;
Figura 20: Corte coronal do encéfalo do mocó (5,76mm p.b.) – Coloração pela técnica de
Nissl e imunorreatividade contra TH;
Figura 21: Corte coronal do encéfalo do mocó (6,12mm p.b.) – Coloração pela técnica de
Nissl e imunorreatividade contra TH;
Figura 22: Corte coronal do encéfalo do mocó (6,48mm p.b.) – Coloração pela técnica de
Nissl e imunorreatividade contra TH;
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LISTA DE ABREVIATURAS
3-hidroxitiramina/dopamina – DA
Aqueduto cerebral - Aq
Área tegmental ventral – VTA/A10
Área tegmental ventral central – VTAc
Área tegmental ventral dorsal - VTAd
Área tegmental ventral dorsal caudal – VTAdc
Comissura do colículo superior - CSC
Comissura posterior - pc
Fascículo retroflexo – fr
Imunoistoquímica – IH
Lemnisco medial – ml
Núcleo das habênulas - Hb
Núcleo interpeduncular – IP
Núcleo linear caudal da rafe - Cli
Núcleo mamilar – Mn
Núcleo do n. oculomotor – 3N
Núcleo pontino - PN
Núcleo pré-comissural – Prc
Núcleo rubro - RN
Núcleo subtalâmico - STh
Núcleo supramamilar – SuM
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Pedúnculo cerebral – cp
Projeções nigro-estriatais –ns
Susbstância cinzenta periaquedutal - PAG
Substância negra pars compacta – SNc/A9
Substância negra compacta dorsal – SNcd
Substância negra lateral – SNl
Substância negra medial – SNm
Substância negra reticulada - SNr
Susbtância negra ventral – SNv
Substância negra (cauda) – cSN
Terceito ventrículo – 3V
Tirosina-hidroxilase – TH
Trato rubroespinal - rs
Zona incerta - ZI
Zona retrorubral – RRF/A8
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SUMÁRIO
Conteúdo Página
RESUMO........................................................................................................ 10
ABSTRACT.................................................................................................... 11
1. INTRODUÇÃO................................................................................... 12
2. JUSTIFICATIVA................................................................................ 23
3. OBJETIVOS........................................................................................ 24
4. METODOLOGIA................................................................................ 25
4.1Sujeitos........................................................................................... 25
4.2 Anestesia........................................................................................ 26
4.3 Perfusão......................................................................................... 26
4.4 Remoção dos encéfalos................................................................. 26
4.5 Microtomia.................................................................................... 28
4.6 Método de Nissl............................................................................. 28
4.7 Imunoistoquímica.......................................................................... 29
4.8 Obtenção das Imagens................................................................... 30
5. RESULTADOS................................................................................... 31
6. DISCUSSÃO....................................................................................... 50
7. CONCLUSÕES................................................................................... 55
8. PERSPECTIVAS................................................................................ 56
REFERÊNCIAS
ANEXOS
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RESUMO
A 3-hidroxitiramina/dopamina (DA) é uma monoamina do grupo das catecolaminas e consiste
na substância precursora da síntese de noradrenalina e adrenalina, tendo a enzima tirosina-
hidroxilase (TH) como reguladora deste processo. Os núcleos do mesencéfalo que expressam
DA são a zona retrorubral (RRF, grupo A8), a substância negra pars compacta (SNc, grupo
A9) e a área tegmental ventral (VTA, grupo A10). Tais núcleos estão envolvidos em três
complexas circuitarias, chamadas mesostriatal, mesolímbica e mesocortical, as quais estão
relacionadas diretamente com diversas manifestações comportamentais como controle da
motricidade, sinalização de recompensa na aprendizagem comportamental, motivação e nas
manifestações patológicas da Doença de Parkinson e esquizofrenia. O objetivo deste estudo
foi descrever a morfologia dos núcleos dopaminérgicos do mesencéfalo (A8, A9 e A10) do
mocó (Kerodon rupestris), um roedor pertencente à família Caviidae típico da região
Nordeste do Brasil, que está sendo adotado como modelo para estudos neuroanatômicos no
Laboratório de Neuroanatomia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Secções
coronais do encéfalo do mocó foram submetidas à coloração pelo método de Nissl e
imunoistoquímica contra tirosina-hidroxilase. A organização nuclear do sistema
dopaminérgico do mesencéfalo do mocó é muito semelhante ao que foi encontrado em outros
animais da ordem Rodentia, exceto na presença da cauda da substância negra, que foi
encontrada apenas na espécie em questão. Concluímos que os núcleos dopaminérgicos do
mesencéfalo são filogeneticamente estáveis entre as espécies, porém percebemos a
necessidade de se ampliar os estudos acerca da particularidade encontrada no mocó, seja
investigando a sua ocorrência em outras espécies de roedores, seja investigando a sua
relevância funcional.
Palavras-chave: Mesencéfalo; Dopamina; Tirosina-hidroxilase; Núcleos Dopaminérgicos do
Mesencéfalo; Mocó; Roedores.
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ABSTRACT
The 3-hydroxytyramine/dopamine (DA) is a monoamine of catecholamineric group and
consists in the progenitor substantia of synthesis of noradrenaline and adrenaline, having the
enzyme tyrosine hydroxylase as a regulator of this process. Nuclei of midbrain expressing DA
are the retrorubral field (RRF, A8 group), the substantia nigra pars compacta (SNc, A9 group)
and the ventral tegmental area (VTA, A10 group). These nuclei are involved in three complex
circuitry called mesostriatal, mesocortical and mesolimbic, which are related directly with
various behavioral manifestations such as motor control, reward signaling in behavioural
learning, motivation and pathological manifestations of Parkinson’s disease and
schizophrenia. The aim of this study was describe the morphology of midbrain dopaminergic
neurons (A8, A9 and A10) of the rock cavy (Kerodon rupestris), a rodent belonging to the
family Caviidae typical of the Brazilian Northeast, which is being adopted as a model for
neuroanatomical studies in laboratory of neuroanatomy of the Federal University of Rio
Grande do Norte. Coronal sections of brains of the rock cavies were submitted to staining by
Nissl’s method and immunohistochemistry against tyrosine hydroxylase. The nuclear
organization of the midbrain dopaminergic nuclei of the rock cavy is very similar to that
found in other animals of the order Rodentia, except by the presence of the tail of substantia
nigra, which was found only in the studied species. We concluded that the midbrain
dopaminergic nuclei are phylogenetically stable among species, but we think to be it
necessary to expand the studies about the particularity found the rock cavy, investigating its
occurrence in other species of rodents or investigating its functional relevance.
Keywords: Midbrain; Dopamine; Tyrosine Hydroxylase; Midbrain Dopaminergic Nuclei;
Rock Cavy; Rodents.
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1. INTRODUÇÃO
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS ACERCA DA DOPAMINA ENQUANTO
NEUROTRANSMISSOR
A 3-hidroxitiramina/dopamina (DA) é uma substância resultante da ação da enzima
DOPA-descarboxilase (ou aminoácido aromático descarboxilase, AADC) sobre a di-hidroxi-
fenilalanina (DOPA), a qual deriva da tirosina por ação da tirosina-hidroxilase (TH) (Marín et
al., 2005; Chen et al., 2008). O desempenho eficaz da TH só ocorre na presença de um co-
fator chamado 6-tetrahidrobiopterina (BH4), cuja síntese é modulada pela enzima GTP-
ciclohidrolase I (GTPCHI) (Nagatsu e Ichinose, 1999). Por sua vez, a dopamina é precursora
da noradrenalina, sob ação da enzima dopamina-beta-hidroxilase (Nagatsu et al.,1964) (Fig.
1).
Figura 1. Esquema de síntese da noradrenalina.
Somente em 1958, depois de uma série de estudos, Arvid Carlsson e seus
colaboradores constataram que a DA, além de ser precursora da noradrenalina e da adrenalina,
possuía a capacidade de atuar como neurotransmissor no sistema nervoso central (Björklund e
Dunnett, 2007a). Como tal, a DA é uma monoamina que se encontra no grupo das
catecolaminas, juntamente com a noradrenalina e adrenalina, e é um dos principais
neurotransmissores na modulação da função cerebral, tendo portanto desempenhado um papel
crucial na adaptação do comportamento animal ao longo da evolução (Jones e Pilowski, 2002;
Yamamoto e Vernier, 2011).
Fenilalanina Tirosina tirosina-hidroxilase
DOPA
DOPA - descarboxilase
Dopamina
dopamina-beta-hidroxilase
Noradrenalina
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Depois de sintetizada, a DA é armazenada nas vesículas sinápticas pela ação da
monoamina vesicular transportadora 2 (VMAT2) (Lowlor e During, 2004) (Fig. 2). Finalizada
a sua atuação nos receptores pós-sinápticos, cerca de 30% da DA é metabolizada na própria
fenda pela ação das enzimas catecol-O-metiltransferase (COMT) (Goole e Amighi, 2009),
enquanto a maioria, cerca de 70%, é recaptada na fenda por meio da ação do transportador
dopaminérgico (DAT), uma glicoproteína cuja ação depende diretamente da atividade elétrica
relacionada ao Na+ e Cl-, podendo então ser metabolizada por intermédio da mono-amino-
oxidase (MAO) ou mesmo rearmazenada em vesículas pela VMAT2 para utilização posterior
(Jaber et al, 1997; Ben-Jonathan e Hnasko, 2001; Marshall e Grosset, 2003; Shih et al, 2006).
Figura 2. Síntese da dopamina e seu armazenamento nas vesículas sinápticas (Modificado de
Lowlor e During, 2004)
É importante considerar que, embora inespecífica, nos últimos anos, a expressão de
TH em amostras encefálicas tem sido amplamente utilizada como marcador molecular de DA
neuronal (Prakash e Wurst, 2006).
1.2 OS NÚCLEOS DOPAMINÉRGICOS NO ENCÉFALO
14
Núcleos específicos no encéfalo produzem DA e a utilizam como neurotransmissor.
Estudos anteriores identificaram dez núcleos encefálicos que foram codificados de A8-A17,
sendo: A8 – Zona retrorrubral; A9 – Substância negra pars compacta; A10 – Área tegmental
ventral; A11 ao A14 – Grupos hipotalâmicos; A15 – Hipotálamo ventral e lateral/Área
retroquiasmática; A16 – Células periglomerulares do bulbo olfatório; A17 – Células
interplexiformes da retina (Dahlström e Fuxe, 1964; Kandel et al., 2000; Márin et al., 2005)
(Fig. 3).
Figura 3. Esquema evidenciando os núcleos dopaminérgicos no encéfalo do rato (Modificado
de Kandel et al., 2000; Björklund e Dunnett, 2007b).
Os núcleos mesencefálicos A8-A10, serão mais bem estudados no decorrer deste
trabalho. Porém, é importante comentar mesmo que resumidamente acerca das demais regiões
dopaminérgicas do encéfalo, uma vez que estas também são importantes para o
estabelecimento de alguns padrões comportamentais.
O grupo diencefálico A11, núcleos do hipotálamo posterior, envia projeções para
áreas autonômicas da porção inferior do tronco encefálico e medula espinal cujas funções não
estão bem esclarecidas. O grupo A13, zona incerta, se projeta para áreas remotas da amígdala
e de modo difuso para diferentes áreas do hipotálamo, participando essencialmente no
controle da liberação do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH). Tais núcleos
correspondem à maioria dos neurônios dopaminérgicos existentes no hipotálamo (Moore e
Lookingland, 2000; Ben-Jonathan e Hnasko, 2001; Prakash e Wurst, 2006).
15
O núcleo arqueado (A12) se projeta tanto para a zona externa da eminência mediana
(próximo aos capilares primários do plexo portal hipofisário), formando o trato túbero-
infundibular, quanto para a neurohipófise e lobo intermediário formando o trato túbero-
hipofisário. Além disso, o núcleo peri/paraventricular (A14) também se projeta para o lobo
intermediário da hipófise, originando o trato periventricular-hipofisário. Ambos os núcleos,
com suas respectivas projeções, estão diretamente voltados para o controle da secreção de
prolactina (Freeman et al., 2000).
O grupo A15 ocupa as áreas ventral e lateral do hipotálamo (Ben-Jonathan e Hnasko,
2001), embora alguns autores refiram que tal grupo ocupa a área retroquiasmática (Tillet et
al., 2000; Goodman et al., 2010) ou até mesmo o tubérculo olfatório (Kandel et al., 2000).
Apesar das divergências quanto à disposição anatômica, estudos têm demonstrado que o A15
possui uma complexa circuitaria, prova disso é a série de aferências que este núcleo possui
com destaque para os núcleos septal lateral, da estria terminal, paraventricular do tálamo,
entre outras (Tillet et al., 2000). No que se refere à sua fisiologia, acredita-se que o mesmo
esteja envolvido em diversas atividades como no controle do metabolismo da pineal (Cipolla-
Neto et al, 1999) e no comportamento reprodutivo (Goodman, 1996; Goodman et al., 2010).
Por fim, o grupo das células periglomerulares do bulbo olfatório (A16), assim como
o grupo das células interplexiformes (amácrinas) da retina (A17), consistem em grupos de
interneurônios dopaminérgicos (Prakash e Wurst, 2006). Quanto à fisiologia desses núcleos, o
A16 está envolvido no processamento primário e refinamento sensorial no epitélio olfativo
(Baltanás et al, 2011). Já o A17 participa da regulação do RNA mensageiro que controla a
síntese de melanopsina (fotopigmento produzido pelas células ganglionares intrinsecamente
fotossensíveis), assim como adaptação à luz, sensibilidade ao contraste e acuidade visual
(Besharse et al., 1988; Djamgoz et al., 1997; Iuvone et al., 2005).
1.3 OS NÚCLEOS DOPAMINÉRGICOS DO MESENCÉFALO
Dentre os núcleos dopaminérgicos, merecem destaque aqueles situados no
mesencéfalo, para os quais os estudos nas últimas décadas atestaram o seu envolvimento na
determinação comportamental do indivíduo em controle motor, motivação, cognição,
recompensa e em algumas desordens neurológicas e/ou psiquiátricas (German e Manaye,
1993; Björklund e Dunnett, 2007a). Tais núcleos localizam-se na zona retrorubral (RRF),
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substância negra pars compacta (SNc) e área tegmental ventral (VTA) (A8, A9 e A10,
respectivamente) (Dahlström e Fuxe, 1964; German e Manaye, 1993; François et al., 1999;
Smith e Kieval, 2000; Björklund e Dunnett, 2007b) (Fig. 4), os quais constituem objeto do
presente estudo.
Figura 4. Corte coronal em nível de mesencéfalo caudal, com imunoistoquímica para TH,
evidenciando os três núcleos dopaminérgicos mesencefálicos do rato (Modificado de German
e Manaye, 1993).
Os núcleos dopaminérgicos mesencefálicos estão no centro de três complexas
circuitarias denominadas mesostriatal, mesocortical e mesolímbica. Convencionalmente, se
afirma que o grupamento A9 projeta-se para o striatum (via nigroestriatal), ao passo que o
grupamento A10 projeta-se para a área límbica e cortical (vias mesolímbica e mesocortical,
respectivamente), formando vias bem definidas (Fallon e Moore, 1978). Contudo, sabe-se
hoje que a SNc possui eferências não só para o striatum, mas para áreas límbicas e corticais,
assim como a VTA não apresenta somente projeções límbicas/corticais, mas também
projeções para o striatum (Loughlin e Fallon, 1984; Björkund e Dunnett, 2007b). Quanto ao
grupamento A8, este forma uma extensão dorso-caudal do grupamento A9 e também emite
projeções para as três áreas, por exemplo como ocorre com o caso da amígdala
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especificamente em primatas que recebe projeções dos três núcleos dopaminérgicos
(Bentivoglio e Morelli, 2005; Cho e Fudge, 2010).
A via mesostriatal está envolvida no controle dos movimentos e sua degeneração
pode levar a doenças como a de Parkinson (Stochi, 2009). A via mesocortical, que inerva
diversas regiões do córtex frontal, incluindo córtex pré-frontal e córtex cingulado anterior,
parece estar envolvida em aspectos da memória e aprendizagem (Chinta e Andersen, 2005;
Walton et al., 2005; Pritchard et al., 2009). Muitos estudos têm demonstrado que alterações na
via mesocortical estão diretamente relacionadas às manifestações clínicas expressas na
esquizofrenia (Sesack e Carr, 2002; Fallon et al., 2003).
Já a via mesolímbica projeta-se para o estriado ventral (núcleo accumbens), o
tubérculo olfatório e outras partes do sistema límbico como amígdala, hipocampo, área septal
e córtex pré-frontal medial. Esta via foi implicada no comportamento motivacional (Pierce e
Kumaresan, 2006; Chen et al., 2009). Convém ressaltar que estudos hodológicos demonstram
que há certa sobreposição entre as vias mesocortical e mesolímbica, o que permite alguns
pesquisadores aglutiná-las em uma via única chamada de mesocorticolímbica (Wise, 2004).
No intuito de compreender melhor os aspectos morfofuncionais desses núcleos,
estudos de caráter citoarquitetônico e neuroquímico vem sendo conduzidos ao longo dos anos
e em diversas espécies, seja de roedores ou mesmo primatas (Liang et al., 1996; McRitchie et
al., 1998; Nemoto et al., 1999).
1.4 OS RECEPTORES DOPAMINÉRGICOS E SUA RELAÇÃO COM ALGUMAS
RESPOSTAS COMPORTAMENTAIS
Com relação aos receptores específicos onde a DA poderá realizar ligação, vale
destacar que são cinco subtipos e os mesmos estão agrupados, por critérios bioquímicos,
farmacológicos e fisiológicos, em dois grupos: D1 e D2 (Kebabian e Calne, 1979). O grupo
de receptores D1 é composto pelos subtipos D1 e D5, já o grupo D2 é constituído pelos
subtipos D2, D3 e D4 (De La Mora et al., 2009). Essa classificação se baseia no mecanismo
de transdução. O grupo D1 estimula a adenilato-ciclase, aumentando os níveis intracelulares
de AMP cíclico, enquanto o grupo D2 inibe essa enzima levando a redução intracelular do
AMP cíclico (Fig. 5) (Seeman e Vantol, 1994; Jaber et al., 1996; Missale et al., 1998; Silva,
2007).
18
Figura 5. Famílias de receptores de dopamina. Modificado de Golan, 2009.
Os receptores dopaminérgicos dos tipos D1, D2 e D5 estão localizados
principalmente no striatum, sistema límbico e bulbo olfatório, bem como nos córtices pré-
frontal, pré-motor, cingulado e entorrinal, sendo o D5 o de menor expressão nas áreas já
citadas. Já os subtipos D3 e D4 restringem-se à área límbica (Cave e Baker, 2009). Entretanto,
outro estudo, que aponta a participação direta desses receptores D4 na circuitaria dos núcleos
da base, concluiu que a dopamina tem duas ações sobre a liberação de GABA na substância
negra pars reticulada (SNr): estimulando a liberação de GABA quando ativados os receptores
D1 (terminações da via estriatonigral) e inibindo a liberação de GABA quando ativados os
receptores D4 (terminações palidonigrais) (Acosta-García et al., 2009).
Percebe-se, pois, que ambos os subtipos D1 e D2 estão presentes em altas
concentrações no striatum, onde desempenham um importante papel na regulação da
atividade motora. Além disso, os receptores D2 também são encontrados em níveis elevados
nos lactótrofos da adeno-hipofise, onde regulam a secreção de prolactina. Os receptores D3 e
D4 estão relacionados a nível estrutural quanto funcional sendo também responsáveis pela
patogenia da esquizofrenia. No sistema límbico, há uma grande quantidade de receptores D3,
enquanto no córtex frontal, diencéfalo e tronco encefálico encontram-se receptores do tipo
19
D4. Os receptores D5 encontram-se em baixos níveis, principalmente no hipocampo e
tubérculo olfatório (Sokoloff e Schwartz, 1995; Hardman et al., 2007).
Retomando a discussão, evoca-se uma das maiores relevâncias atinentes aos
receptores dopaminérgicos que se trata do envolvimento dos subtipos D1 e D2 na circuitaria
neuronal dos núcleos da base, cuja função reside na modulação da motricidade (Deongaokar e
Subramanian, 2005).
Neste caso, os efeitos da DA nos núcleos da base ocorrem mediante a interação com
os receptores D1 e D2. Os receptores D1 modulam principalmente os neurônios da via direta,
enquanto os D2 estão localizados nos neurônios estriato-palidais da via indireta. Deste modo,
a ativação de D1 ativa a via excitatória e a ativação de D2 inibe a via inibitória, o que
favorece a realização do movimento (Gerfen, 2003; Siegel, 2006).
Na doença de Parkinson, por exemplo, a degeneração dos neurônios dopaminérgicos
da SNc acarreta alteração da capacidade de elaborar movimentos automáticos, semi-
automáticos, tônus postural e habilidade de movimentos, evidenciando sinais clínicos como
tremor, bradicinesia, rigidez e instabilidade postural (Doyon, 2008).
1.5 O MODELO EXPERIMENTAL
O mocó (Kerodon rupestris) é um roedor nativo da região semi-árida, podendo ser
encontrado em vários estados do Nordeste e norte de Minas Gerais, habitando
preferencialmente a caatinga do semi-árido do Nordeste Brasileiro (Cabrera, 1961; Lacher Jr.,
1981).
Taxonomicamente é classificado como representante do filo Chordata, subfilo
Vertebrata, superclasse Gnathostomata, classe Mammalia, subclasse Theria (mamíferos
avançados), infraclasse Eutheria (mamíferos placentários), superordem Glires, ordem
Rodentia, (Storer e Usinger, 1971), subordem Hystricognathi, infraordem Caviomorpha,
superfamília Cavioidea (Carleton, 1984), família Caviidae, subfamília Caviinae, gênero
Kerodon (mocós) (Moojen, 1952).
Animais da familia Caviidea são dotados de uma grande versatilidade de adaptação
aos mais diversos tipos de ambientes, embora se caracterizem como mamíferos terrestres,
podendo ser arborícolas, rupícolas e terrícolas. Tendo a dentição desprovida de caninos, esses
20
animais costumam ser herbívoros. Além disso, possuem três dedos nos membros pélvicos e
cauda completamente atrofiada (Moojen, 1952).
A subfamilia Caviinae é composta por quatro gêneros: Kerodon, Galea, Cavia e
Microcavia. A este grupo pertencem pequenos animais já reconhecidamente domésticos,
como porquinho da índia (Cavia porcellus). Geralmente vivem em pequenas colônias feitas
em buracos na terra ou usam cavidades nas bordas das rochas. Possuem hábitos gregários e
diurnos (Crandall, 1964).
Estudos morfológicos (Silva Neto, 2000) e de biologia molecular (Rowe e
Honeycutt, 2002) firmaram o gênero Kerodon irmanado com a família Hydrochaeridae, à qual
também pertence a capivara (Hydrochaeris) e estreitamente alinhado com a subfamília
Dolichotinae.
O mocó é um animal facilmente adaptado às condições ecológicas locais como o
calor, a escassez de água e de alimentos, principalmente nos períodos das grandes secas nas
regiões do semi-árido nordestino. Habitam locais rochosos com inúmeras fendas onde se
abrigam dos predadores e passam boa parte de seu tempo. Além disso, são excelentes
saltadores e conseguem escalar rochas e galhos de árvores, de onde extraem a sua
alimentação, composta principalmente de cascas de árvores, ou na falta destas, gramíneas em
geral, sendo as árvores mais procuradas o mufumbo (Cobretum leprosum), faveleira
(Cnidoscolus phyllacanthus) e a parreira brava (Cissampelos pareira), ao contrário de outros
caviinaes que possuem hábitos terrestres e comem relva (Carvalho, 1969; Lacher, 1981;
Mendes, 1985; 1987). Já em cativeiro, aceitam bem frutas (maçã, banana, melão, melancia,
manga) e raízes.
Sua coloração é cinza clara com pelos pretos e amarelos ou esbranquiçados na região
dorsal, castanho-ferruginoso na região caudal e um pouco acastanhada nas patas e branco na
região cervical. As patas são dotadas de coxins calosos pouco excedidos pelas unhas rígidas
que lhes dão habilidades de escalar e saltar (Moojen, 1952). Tem olfato e audição muito
aguçados, podendo detectar seu predador a uma longa distância (Carvalho, 1969). Atingem a
fase adulta aos 200 dias, podendo atingir até 50 cm de comprimento e 1 quilo de peso
corporal (Moojen, 1952; Carvalho, 1969; Roberts et al., 1984).
Espécies do gênero Kerodon diferem quanto ao padrão reprodutivo observado em
outros gêneros próximos relacionados. Na história de vida dos cavinnaes, Kerodon tem a
gestação mais longa (65 ±1,34 dias), a menor média no tamanho da ninhada (1,28 ± 0,09), o
21
mais baixo peso de filhotes e o mais longo tempo para a maturidade sexual (Roberts et al.,
1984). Além disso, apresenta o peso médio da matriz pós-parto em torno de 724,73 ± 13,08 g
e 6,89% de abortos (Pinheiro et al., 1985). A reprodução ocorre durante todo o ano, não
apresentando sazonalidade, com exceção do período que vai de abril a junho. As fêmeas
apresentam um cio pós-parto, podendo acasalar poucas horas após o parto. Apesar das poucas
crias por parto, o curto período gestacional garante uma elevada produção de crias durante o
ano (Lacher, 1981).
Quanto ao padrão de atividade locomotora, tem sido relatado que nos dias mais
escuros o mocó sai para se alimentar pela manhã e à tarde, enquanto que nos dias mais claros
sua atividade se concentra no período noturno, podendo também durar o dia inteiro na
ocorrência de chuvas (Carvalho, 1969). Outras observações dão conta de que o mocó sai para
forragear ao longo do dia e da noite (Lacher, 1981). Contudo, estudos conduzidos por Sousa e
Menezes (2006), mostraram que, embora o mocó apresente atividade ao longo de 24 horas,
esta se concentra nos períodos de transição de fases claro-escuro, sugerindo um
comportamento predominantemente crepuscular.
Figura 6. O mocó (Kerodon rupestris) em ambiente natural. Fonte: LabNeuro.
Certamente as características morfofuncionais e os hábitos comportamentais dos
mocós lhes garantem singularidades quando comparados com outros animais da ordem
22
Rodentia. Por essas características, o mocó está sendo adotado como modelo para estudos
neuroanatômicos no Laboratório de Neuroanatomia da Universidade Federal do Rio Grande
do Norte – UFRN, já tendo gerado alguns produtos.
Assim, este animal foi utilizado em trabalhos de caracterização citoarquitetônica,
neuroquímica e hodológica dos principais componentes do sistema de temporização
circadiana (STC) – o núcleo supraquiasmático e o folheto intergeniculado (Nascimento Jr. et
al., 2010a). Outros trabalhos realizados no laboratório tratam da descrição das projeções
retinianas aos núcleos paraventricular e mediodorsal do tálamo, como parte integrante do
sistema não-formador de imagem (Nascimento Jr. et al., 2008; Nascimento Jr. et al., 2010b).
Além destes, foi realizado um estudo de projeções retinianas, utilizando a subunidade b da
toxina colérica – CTb, para os componentes do sistema visual primário e do sistema óptico
acessório (Silva, 2009), assim como outro estudo relacionado a identificar/caracterizar, por
meio de imunoistoquímica para serotonina (5-HT), os núcleos da rafe no encéfalo (Soares,
2010). Por fim, encontra-se em andamento uma pesquisa que objetiva a caracterização
anatômica e neuroquímica da retina do mocó e sua relação direta com o STC deste animal
(Oliveira et al. 2010). A meta a longo prazo é torná-lo um modelo para estudos experimentais
nas áreas de comportamento e fisiologia, para os quais os estudos neuroanatômicos fornecem
embasamento essencial.
23
2. JUSTIFICATIVA
As pesquisas supracitadas evidenciam a necessidade de melhor se explorar vários
outros componentes do sistema nervoso deste animal e a relevância do presente estudo
justifica-se, também, pelo incontestável papel dos núcleos dopaminérgicos do mesencéfalo
em diversas modalidades comportamentais.
Diante disso, emerge a necessidade de se explorar as bases neuroanatômicas e
neurofisiológicas envolvidas em tais processos, na perspectiva constante de contribuir para a
ampliação dos estudos já concluídos e/ou em andamento que buscam compreender muitos dos
aspectos comportamentais deste animal tão pouco explorado e tão peculiar à região Nordeste,
assim como com a construção de conhecimentos em diversos âmbitos das Neurociências.
24
3. OBJETIVOS
3.1 Geral
Caracterizar morfológica e imunoistoquimicamente os núcleos dopaminérgicos
(grupamentos A8, A9 e A10) do mesencéfalo do mocó (Kerodon rupestris).
3.2 Específicos
Identificar, mediante imunoistoquímica para TH, os núcleos dopaminérgicos do
mesencéfalo do mocó;
Descrever a configuração desses núcleos, baseado nas descrições para o rato;
Delimitar a citoarquitetura desses núcleos, a partir do método de Nissl.
25
4. METODOLOGIA
Trata-se de um trabalho vinculado ao Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia,
cujos procedimentos foram realizados, em sua totalidade, no laboratório de Neuroanatomia,
vinculado ao Departamento de Morfologia – DMOR/UFRN.
4.1 Sujeitos
Quatro animais adultos jovens, sendo dois machos e duas fêmeas, foram utilizados
no experimento. Em virtude da desativação temporária do criadouro científico desta espécie
que é o Centro de Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS), localizado na Universidade
Federal Rural do Semi-árido (UFERSA) em Mossoró-RN, assim como dos criadouros
comerciais existentes ainda não disporem da geração F2, os animais foram obtidos por meio
de captura no município de Serra Negra do Norte, RN, mediante a devida autorização do
Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e Recursos Naturais Renováveis – IBAMA (licença
SISBIO nº 22403-1). O processo de captura deu-se por meio de armadilhas e/ou contenção
química (ketamina + xilazina), para minimizar o estresse causado ao animal.
Depois de capturados, os animais foram acomodados no Centro de Biociências da
UFRN em um ambiente construído de alvenaria e telas em arame cujas dimensões são de 3,0
x 2,0 x 2,6 m, submetidos à temperatura, luminosidade e umidade naturais e comida/água ad
libitum. Somente no dia anterior ao experimento os animais foram transferidos para gaiolas,
medindo 0,90 x 0,60 x 0,75m. Os mesmos foram utilizados gradativamente, conforme as
necessidades de execução dos experimentos da pesquisa.
Convém ressaltar que os animais utilizados nesse projeto foram os mesmos de outro
projeto em andamento no laboratório, previamente aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de
Animais (CEUA), voltado para a caracterização anatômica e neuroquímica da retina do mocó
e sua relação direta com o STC. Por tal motivo, este trabalho foi aprovado pelo CEUA como
uma extensão do Protocolo 015/2009.
Todos os cuidados foram tomados no sentido de evitar dor e sofrimento aos animais
durante os procedimentos experimentais, seguindo estritamente as normas estabelecidas pela
National Research Council of the National Academy publicadas no livro “Guidelines for the
Care and Use of Mammals in Neuroscience and Behavioral Research”. Visitando o site da
Sociedade Brasileira de Neurociência e Comportamento – SBNeC
(http://www.sbnec.gov.br/links) é possível encontrar uma versão no formato pdf.
26
4.2 Procedimentos
4.2.1 Anestesia
Foram administrados por via intramuscular, os medicamentos cloridrato de tramadol
e xilazina, ambos na dose de 5 (cinco) mg/Kg, como medida pré-anestésica. O tramadol é um
opióide necessário para potencializar o efeito da analgesia adequada ao procedimento e a
xilazina é um relaxante muscular. Decorridos 10 minutos da conduta pré-anestésica, o animal
é induzido e mantido em anestesia inalatória com isoflurano e oxigênio 100% administrado
através de máscara, até que o animal atinja o plano anestésico, ou seja, 3º. plano do 3º. estágio
de Guedel (Massone, 2008).
4.2.2 Perfusão
Atingido o plano anestésico, cada animal foi submetido à perfusão transcardíaca, que
compreende os seguintes passos:
1. Posicionamento do animal em decúbito dorsal sobre tela de arame e sob ponto de água.
2. Toracotomia, com incisão de pele, músculos e arco costal, sendo estes removidos em
bloco, para exposição do coração.
3. Cardiopunção no ventrículo esquerdo, utilizando uma agulha de dimensões 17mm x 1,5
mm, a qual é direcionada para o cone arterioso, seguindo-se uma incisão no átrio direito. A
agulha foi conectada a uma bomba peristáltica (Cole-Parmer), passando-se 300 ml de solução
salina a 0,9% em tampão fostato 0,1M, pH 7,4 com heparina (Parinex, Hipolabor, 2ml/1000
ml de solução salina) durante um tempo estimado de seis minutos. Em seguida, foram
infundidos 700 ml de solução fixadora composta por paraformaldeido 4%, glutaraldeído
0,05% e ácido pícrico 0,2% em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4 (Zamboni e Di Martino, 1967),
passando-se metade desta solução a um fluxo de 6,0 ml por minuto e a outra metade a 3,0 ml
por minuto, durando todo procedimento em torno de três horas.
4.2.3 Remoção dos Encéfalos
Finalizada a etapa de perfusão, os animais foram posicionados no aparelho
estereotáxico para roedores. Depois de se fazer uma incisão longitudinal na pele e rebatê-la
lateralmente, fez-se a limpeza da superfície óssea, facilitando a visualização do bregma e do
27
lambda, os quais ficaram nivelados na mesma altura dorsoventral, ajustando-se a barra dos
incisivos, padronizando assim o plano de corte coronal para todos os animais (Fig. 7). Após
anotação das coordenadas do bregma e do lambda, o osso da calota craniana foi removido
com o uso de broca e trocater, expondo-se o encéfalo. Ainda no aparelho estereotáxico, o
encéfalo foi seccionado em três blocos através de duas secções coronais: uma no nível do
bregma e a outra no nível do lambda (Fig. 8).
Figura 7. Mocó posicionado em aparelho estereotáxico e com alinhamento dorsoventral do
bregma e lambda.
Figura 8. Mocó posicionado em aparelho estereotáxico, após remoção da calota craniana e
consequente exposição do encéfalo. Realização dos cortes coronais em nível de bregma e
lambda para formação dos blocos padronizados.
28
Os encéfalos foram retirados delicadamente para evitar danos, preservando os olhos
e nervos ópticos (uma vez que estes animais foram também utilizados em outra pesquisa) e
em seguida medidos (da extremidade anterior do bulbo olfatório ao limite bulbo-espinal) e
fotografados. Logo após esta etapa, os três blocos foram armazenados, por um período entre
24 e 48 horas, em uma solução de contendo sacarose a 30% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4,
a 4 ºC, para então serem submetidos à microtomia (cortes coronais).
4.2.4 Microtomia
Os encéfalos foram submetidos à microtomia cuja espessura dos cortes foi
padronizada em 30 µm.
Os encéfalos foram congelados por gelo seco e seccionados em micrótomo de
deslizamento, obtendo-se secções coronais. Estas foram coletadas em um meio líquido de
tampão fostato 0,1M, pH 7,4, distribuídas seqüencialmente em seis compartimentos, de
maneira cíclica e seqüenciada, de modo a manter a distância entre uma secção e a outra
imediatamente seguinte de um mesmo compartimento de aproximadamente 180 µm.
Os cortes de um compartimento foram imediatamente montados em lâminas de vidro
gelatinizadas e submetidas à coloração pelo método de Nissl para permitir uma melhor
demarcação das estruturas. Os cortes dos demais compartimentos foram transferidos para
solução anticongelante e conservados a -20 ºC para utilização posterior em procedimentos de
imunoistoquímica.
4.2.5 Método de Nissl
A coloração pelo método de Nissl é constituída por uma série de etapas que se
iniciam com a desidratação do tecido passando-o em concentrações crescentes de alcoóis
etílicos (70% - 1 vez, por 1 h, 95% - 2 vezes, 3 minutos cada, 100% - 2 vezes, 3 minutos
cada). Posteriormente são deslipidificados em dois recipientes com xilol, por 3 e 30 minutos,
nessa ordem. Na seqüência, o tecido é reidratado em concentrações decrescentes de álcoois
(mesmo processo anterior, mas no sentido inverso), submergido em água destilada por 2
minutos, colocado 30 a 40 segundos na solução de tionina a 0,25%. Por fim os cortes foram
rapidamente submergidos e emergidos 10 vezes em água destilada e novamente desidratados
e deslipidificados como descrito anteriormente, sendo acrescentada apenas uma etapa (antes
da desidratação em álcool 100%) de imersão do tecido numa solução contendo álcool a 95%
29
e ácido acético a 1%, por 3 segundos. Os cortes foram deslipidificados em xilol em dois
recipientes (2 e 4 minutos, respectivamente) e finalmente cobertos com lamínula utilizando
como meio demontagem o DPX.
4.2.6 Imunoistoquímica
Devido a grande concentração de aldeídos contidos no fixador (Zamboni e De
Martino, 1967) utilizado na perfusão do animal, precedendo a técnica de imunoistoquímica,
os cortes foram submetidos a um pré-tratamento para recuperação da antigenicidade, sendo
colocados em solução de boridreto de sódio a 1% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, durante
15 minutos, a qual tem a propriedade de retirar o excesso de aldeídos dos tecidos. O pré-
tratamento também incluiu uma etapa de incubação em peróxido de hidrogênio (H2O2) a 0,3%
em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 por cinco minutos, com a finalidade de abolir artefatos
causados pela liberação de peroxidases endógenas. No início, entre as soluções e ao final
desta fase, os cortes foram submetidos a seis lavagens de cinco minutos cada em tampão
fosfato 0,1 M, pH 7,4.
O próximo passo consistiu na incubação dos cortes em anticorpo primário, isto é,
uma solução formada pelo anticorpo anti-TH obtido em camundongo (Sigma) em diluição de
1:10.000, acrescido de soro normal de asno a 2% em Triton X-100 a 0,4% permanecendo em
incubação por 12 a 72 horas em rotor com rotação lenta.
Ao fim deste período, os cortes passaram por seis lavagens em tampão fosfato 0,1 M
pH 7,4, em agitador orbital e em seguida colocados em contato com o anticorpo secundário
anti-camundongo obtido em asno (Jackson) diluído a 1:1000 no mesmo veículo anterior, por
120 minutos à temperatura ambiente, sob agitação lenta, em rotor.
Em seguida, os cortes passaram por seis lavagens em tampão fosfato 0,1 M em
agitador orbital e depois colocados na solução do complexo avidina-biotina-HRP (Protocolo
ABC, Kit elite da Vector), numa diluição de 1:100 em Triton X-100 a 0,4%, contendo NaCl ,
por 120 minutos à temperatura ambiente, sob agitação lenta, em rotor. Terminada esta fase, as
secções foram novamente submetidas a seis lavagens em tampão fosfato 0,1 M em agitador
orbital.
Para visualização da reação, as secções foram postas em meio contendo H2O2 como
substrato e a 3,3’,4,4’tetrahidrocloreto-diaminobenzidina (DAB), utilizada como cromógeno.
30
A H2O2 foi oferecida indiretamente, colocando-se na solução glicose oxidase e D-glicose,
provocando uma reação em que a primeira agindo sobre a segunda libera H2O2 (Itoh et al.,
1979). Esta reação dura em torno de 15 minutos e após esta, os cortes foram submetidos a
mais seis lavagens em tampão fosfato 0,1 M em agitador orbital.
Os cortes foram então montados em lâminas gelatinizadas, que após secas foram
imersas em solução de tetróxido de ósmio a 0,05% com o intuito de intensificar a reação.
Após as etapas de desidratação, em baterias de álcool de graduação crescente até o álcool
absoluto, e diafanização em xilol, as lamínulas foram montadas sobre os cortes com o uso de
DPX.
Como controle, algumas secções foram submetidas ao protocolo específico de
imunoistoquímica, com a omissão do anticorpo primário.
4.2.7 Obtenção das imagens
As secções do mesencéfalo, coradas pelo método de Nissl e/ou submetidas à
imunoistoquímica para TH foram examinadas ao microscópio óptico (Olympus BX41) em
campo claro. Imagens digitais foram obtidas de secções representativas usando uma
videocâmara digital (Nikon DXM1200). As imagens foram analisadas, corrigidas
minimamente para brilho e contraste, montadas usando o programa Adobe Photoshop CS5®
e os desenhos esquemáticos foram montados no software Adobe Illustrator CS5®. Os
resultados foram documentados em fotomicrografias e esquemas construídos a partir das
mesmas.
31
5. RESULTADOS
O comprimento rostro-caudal do encéfalo, da extremidade anterior do bulbo olfatório
ao limite bulbo-espinal, foi em média 3,63 cm (Fig. 9).
Com base na imunoistoquímica para TH, aliada à técnica de Nissl, foi possível
estabelecer os limites anatômicos, assim como a citoarquitetura e possíveis subdivisões, dos
três núcleos dopaminérgicos do mesencéfalo. Para facilitar a compreensão, foram feitos
esquemas ilustrativos que demonstram as estruturas encefálicas sequenciadamente (Fig. 10).
Figura 9. Encéfalo do mocó em vistas dorsal (a) e ventral (b). Barra: 0,54 cm.
No sentido rostro-caudal, os primeiros neurônios dopaminérgicos a aparecerem
fazem parte da SNc e estão no nível da transição die-mesencefálica, coincidindo com
estruturas do hipotálamo posterior, a aproximadamente 2,34 mm pós-bregma (p.b.) e se
estendem até o nível 6,48 mm p.b., coincidindo com estruturas dos níveis rostrais e médios do
mesencéfalo, pertencendo à RRF e a uma das subdivisões da VTA (VTA dorsal caudal).
5.1 Substância Negra pars compacta (SNc/A9):
Com base na densidade de distribuição dos seus neurônios, ao longo da maior
extensão da SNc é possível identificar subunidades neste núcleo. Assim, a SNc foi então
dividida em substância negra compacta dorsal (SNcd ou A9d), substância negra lateral (SNl
ou A9l), substância negra medial (SNm ou A9m), cauda da substância negra (cSN) e
substância negra ventral (SNv ou A9v).
Como mencionado, os primeiros neurônios dopaminérgicos nigrais surgem na porção
ventrolateral do tegmento mesencefálico no nível 2,34 mm p.b. e são pertencentes à SNm,
a b
32
localizando-se lateralmente aos núcleos mamilares (Mn) e supramamilar (SuM), medialmente
ao núcleo subtalâmico (STh), ventralmente ao lemnisco medial, zona incerta (ZI) e às
projeções nigro-estriatais TH+ e dorsalmente ao pedúnculo cerebral e à substância negra
reticulada (SNr) (Figs. 10A e 11A-C). Os neurônios atribuídos à constituição da SNm foram
encontrados até o nível 5,22 mm p.b. (Fig. 10M). Foi visto que estes neurônios são bipolares e
multipolares, apresentando formato ovóide e, com menor freqüência, triangular. Com relação
à orientação dendrítica, os neurônios rostrais apresentavam uma organização dendrítica
paralela às bordas do pedúnculo cerebral e SNr (Fig. 11C). Porém, nos níveis mais caudais,
esse padrão foi sendo substituído por uma arborização aleatória (Figs. 12D e 13D).
No nível de aproximadamente 2,70 mm p.b. (Fig. 10B), lateralmente à SNm,
aparecem os primeiros neurônios TH+ referentes à SNcd. Basicamente, em toda a sua
extensão a SNcd encontra-se ventralmente ao lemnisco medial e dorsalmente à SNr, sendo
seu limite caudal identificado em cortes nos níveis de 6,12 mm p.b. (Fig. 10O). Assim como
na SNm, na SNcd constatou-se a presença de neurônios TH+ bipolares e multipolares com
corpo celular em formatos ovóide e triangular. No tocante à arborização dendrítica, foi
possível constatar a predominância de uma orientação em sentido medial-lateral (paralelo ao
lemnisco medial) e, em menor expressão, em sentido dorso-ventral (na área correspondente à
SNr) (Figs. 12C e 13C).
Em 3,42 mm p.b. (Fig. 10E), lateralmente à SNcd, foi possível visualizar neurônios
referentes à SNl. Este grupamento de baixa densidade neuronal foi identificado nas porções
mais laterais do tegmento mesencefálico, estando dorsalmente à SNr. Seus limites caudais se
encontram no nível 5,76 mm p.b., onde a SNl se encontra ventralmente à RRF (Fig. 10N). Os
neurônios pertencentes a esta subunidade nigral são multipolares e, em menor expressão,
bipolares. Além disso, apresentam formato ovóide e, frequentemente, piriforme. Com relação
à organização dendrítica, não há um padrão específico (Figs. 14C e 15C).
Por volta do nível 4,14 mm p.b. (Fig. 10H), neurônios TH+ surgem bilateralmente
em uma região dorsal às porções mais laterais da SNcd e recebem o nome cSN. Prosseguindo
a visualização das secções mais caudais, é possível perceber que estes grupamentos coexistem
com a SNc até o nível de 5,22 mm p.b. (Fig. 10M). É um grupo de baixa densidade celular,
formado basicamente por neurônios bipolares fusiformes e, raramente, ovóides. Grande parte
dos dendritos está disposta em um sentido dorso-ventral (Figs. 16D e 17C).
33
No nível 4,32 mm p.b. (Fig. 10I), foram identificados neurônios TH+ bilateralmente
em uma região ventral às porções intermediárias da SNcd e dorsal ao pedúnculo cerebral,
inseridos na SNr. Estes grupamentos recebem o nome de SNv ou A9v e seus neurônios
coexistem com as demais porções da SNc até o nível 6,12mm p.b. (Fig. 10O). Trata-se de um
subgrupo de baixa densidade neuronal, formado por neurônios ovóides e multipolares com
orientação dendrítica dorso-ventral (Figs. 17D e 18C).
5.2 Área Tegmental Ventral (VTA/A10):
Assim como a SNc, foi possível subdividir o complexo da VTA em sub-regiões:
VTA propriamente dita, VTA central (VTAc ou A10c), VTA dorsal (VTAd ou A10d) e VTA
dorsal caudal (VTAdc ou A10dc).
Os primeiros neurônios TH+ referentes à VTA começaram a aparecer no nível 2,70
mm p.b., na região mais medial do tegmento mesencefálico. Neste ponto, localiza-se
lateralmente aos núcleos mamilares e supramamilar, medialmente à SNm e SNr e
ventralmente aos lemnisco medial, ZI e às projeções nigro-estriatais (Fig. 10B). Analisando
níveis mais caudais, foi possível identificar mais relações entre a VTA e outras estruturas
mesencefálicas, como por exemplo o núcleo interpeduncular e o fascículo retroflexo, que se
encontram em uma posição ventromedial em relação à VTA (Figs. 10H e 10M). De um modo
geral, os neurônios da VTA são multipolares arredondados e, em menor quantidade,
triangulares. Além disso, não apresentam um padrão de organização dendrítica (Figs. 14D e
16C). Nas amostras estudadas, os últimos neurônios da VTA são identificados no nível
6,12mm p.b. (Fig. 10O).
No nível 3,96 mm p.b. (Fig. 10G) foi possível identificar com clareza a formação
neuronal TH+ que recebe o nome VTAc. Neste nível ela se encontra medialmente à VTA e
dorsalmente ao fascículo retroflexo. Já, em níveis mais caudais, a VTAc se encontra
dorsalmente ao núcleo interpeduncular (Fig. 10L). Trata-se de um núcleo pouco denso
constituído de neurônios multipolares, com formato arredondado e sem um padrão específico
de organização dendrítica (Figs. 14E e 19E). Seus limites caudais se dão no nível 5,76 mm
p.b. (Fig. 10N) onde este núcleo se entrelaça com o linear caudal da rafe (Cli).
A partir do nível 3,42 mm p.b. (Fig. 10E) até o 6,12 mm p.b. (Fig. 10O), foi possível
identificar a VTAd. Uma moderada densidade de neurônios TH+ ovóides, bipolares e, em
menor freqüência, multipolares situados na linha média encefálica, dorsalmente à VTAc
34
(descrita a seguir) e ventralmente à substância cinzenta periaquedutal (PAG) e, nos níveis
mais caudais, ao núcleo do nervo oculomotor (3N). Trata-se de um grupo neuronal que esboça
um padrão de organização dendrítica dorsoventral (Fig. 15C e 19D).
A VTAdc, contém neurônios TH+ em baixa densidade, presentes desde os níveis
mais rostrais (3,24 mm p.b. – Fig. 10D), até os níveis em que não mais existem neurônios da
VTA no tegmento mesencefálico (6,48 mm p.b. – Fig. 10P). Trata-se de um grupo existente
na PAG, especificamente na metade ventral do aqueduto cerebral (Aq). Seus neurônios
basicamente são ovóides, bipolares e, em menor freqüência, multipolares com orientação
dendrítica paralela às bordas do aqueduto cerebral (Figs. 14E e 22C).
5.3 Zona Retrorubral (RRF/A8):
Os neurônios TH+ retrorubrais surgem no nível 5,76 mm p.b. (Fig. 10N) em uma
área ventral às porções mais caudais do núcleo rubro (RN) e dorsal ao lemnisco medial. Neste
nível, é possível ainda se perceber a coexistência da SNcd e SNl que se encontram
ventrolateralmente e a VTA que está ventromedialmente à RRF.
Tal núcleo, comparado com demais estudados, é formado por um grupo reduzido e
disperso de neurônios multipolares ovóides e, raramente, fusiformes, sem padrão de
organização dendrítrica. Seus últimos neurônios são vistos no nível 6,48 mm p.b. (Figs. 10P e
20C-D, 21C-D e 22D).
2,34mm p.b.
HbHb
frfr
3V
mlml
ZIZI
nsns
Mn
SuMSNR
PrCPrC
2,70mm p.b.
Mn
SuM
ZI ZI
ml ml
ns ns
SNR SNR
PrCPrC
HbHb
frfr
3V
VTA
3,06mm p.b.
Mn
3V
PrCPrC
fr fr
ml mlZIZI
VTA
SNR
nsns
3,24mm p.b.
PrC PrC
3V
fr fr
ZI ZI
VTA
ml ml
SNR SNR
Mn
PAG
VTAd
c
A
B
C
D
Figura 10. Reconstrução esquemática das secções coronais do encéfalo do mocó, ilustrando a morfologia dos núcleos dopaminégicos do mesencéfalo. Representação do nível mais rostralem (A) e do nível mais caudal em (P). Barra 1mm. Ver lista de abreviações.
PO
NML
KJI
HGFEDCB
A
SNR
SNm SNm
STh STh
VTA
SNcdSNm
SNcdSNm
VTASNcd
SNmSNcd
SNRSNm
VTA
SNcd
SNmSNm
SNcd
cp cp
cp cp
cpcp
cp cp
35
3,96mm p.b.
pc
Aq
PAG
RN RNmlml
MT MTSNR SNRfr fr
VTAd
c
VTAd
4,14mm p.b.
pc
Aq
PAG
RN RN
VTA VTA SNRSNRfrfr
ml ml
MTMT
cSN cSN
VTAd
c
VTAd
4,32mm p.b.
pc
Aq
PAG
RN RN
VTA VTASNRSNR
frfr
ml ml
cSNcSN
VTAd
c
VTAd
4,50mm p.b.
SNRSNR
mlmlRNRN
VTAVTA
PAG
Aq
csc
cSN cSN
SN
v
SN
v
VTAdc
VTAd
G
H
I
J
3,42mm p.b.
ml ml
VTAVTASNRSNR
frfr
PAG
Aq
pc
VTAd
c
VTAd
VTAc
3,60mm p.b.
pc
Aq
PAG
frfrVTASNR SNR
mlml
RNRN
MT
VTAd
c
VTAd
E
F
Figura 10. Continuação.
SNl SNcd SNlSNcd
SNmSNm
MT
VTAc VTAc
SNlSNcd
SNm
SNlSNcd
SNm
VTA VTA
VTA
VTAc
VTA
SNlSNcd
SNm
MT
SNm
SNlSNcd
VTAcSNl SNcd
SNm
MT
SNlSNcd
SNmcp cp
cp cp
cp cp
cp cp
cp cp
VTAc
SNv
SNl SNcd
SNm
SNlSNcd
SNv
SNm
cp cp
VTAc
SNlSNcd
SNm
SNcdSNl
SNm
36
5,22mm p.b.
csc
3N 3N
PAG
Aq
RN RN
VTAVTA
ml ml
SNR SNRIP
VTAd
c
cSN cSN
SNv SNv
VTAd
Cli
5,76mm p.b.
csc
Aq
PAG
3N 3N
RN RN
VTA VTA
IP
ml ml
SNRSNR
RRF RRF
Cli
VTAd
VTAd
c
4,68mm p.b.
csc
Aq
PAG
RN RN
ml ml
VTAVTA
SNR SNR
VTAd
c
VTAd
cSN cSN
SNv SNv
5,04mm p.b.
csc
PAG
Aq
RNRN
VTAVTA
mlml
SNRSNR
3N3N
IP
VTAdc
cSNcSN
VTAd
SNvSNv
K
L
M
N
6,12mm p.b.
csc
Aq
PAG
3N 3N
VTA VTA
IPml ml
SNRSNR
RRF RRF
rs rs
VTAdc
VTAd
O
6,48mm p.b.
csc
Aq
PAG
3N 3N
RRF RRF
IP
PN
VTAdc
P
Figura 10. Continuação.
SNlSNcd
SNm SNm
cp cp
SNcdSNl
VTAc
cp cp
SNl SNlSNcdSNcd
SNm SNm
VTAc
VTAc
SNl SNcd SNlSNcd
SNm SNmcp cp
SNl SNlSNcd SNcd
cp cpSNv SNv
VTAc
SNcdSNcd
cpcpSNv SNv
37
A
C
B
C
Figura 11. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó, ao
nível de aproximadamente 2,34 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de Nissl;
(B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondente à SNm. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C.
Hb
fr
3V ml
Mn
ns ZI
cp SNm
38
A
C
D B
C D
Figura 12. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó, ao
nível de aproximadamente 2,70 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de Nissl;
(B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondente à SNcd; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área correspondente a
SNm. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D.
Hb 3V
3V
fr
Mn
ml
ns VTA
cp
ZI SNcd
SNm
39
A
C D
C
D
E
B
E
Figura 13. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó, ao
nível de aproximadamente 3,24 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de Nissl;
(B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondente à SNcd; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área correspondente a
SNm; (E) Ampliação da caixa homônima em B, em área correspondente a VTAdc. Barra: 2
mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C, D e E.
3V PrC
Mn
fr
ZI
VTA
cp
SNcd
SNm
PAG
40
D
B A
E
C
Figura 14. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó, ao
nível de aproximadamente 3,42 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de Nissl;
(B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondente à SNl; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área correspondente a
VTA; (E) Ampliação da caixa homônima em B, em área correspondente a VTAc. Barra: 2
mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C, D e E.
C
D
E
pc
Aq PAG
cp
fr VTAc
VTA SNm SNcd
SNl
41
A
D
C
B
C D
Figura 15. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó, ao
nível de aproximadamente 3,96 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de Nissl;
(B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondente à VTAd; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área correspondente
a SNl. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D.
pc
Aq PAG
RN
cp
VTAd
VTAc VTA fr
SNm
SNcd SNl
42
D
C
D
B A
C
Figura 16. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó, ao
nível de aproximadamente 4,14 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de Nissl;
(B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondente à VTA; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área correspondente a
cSN. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D .
pc Aq
PAG
RN VTAd
fr
cp
VTAc VTA
SNm SNcd
SNl cSN
43
C
D
B A
C D
Figura 17. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó, ao
nível de aproximadamente 4,68 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de Nissl;
(B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondente a cSN; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área correspondente a
SNv. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D .
CSC
Aq
PAG
RN
VTA VTAc
VTAd
cp SNv SNm
SNcd
SNl
cSN
44
C
B
A
C
Figura 18. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó, ao
nível de aproximadamente 5,04 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de Nissl;
(B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondente a cSN; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área correspondente a
SNv. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C .
CSC
Aq PAG
3N
RN
IP SNv
cp
cSN
SNcd
45
Figura 19. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó, ao
nível de aproximadamente 5,22 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de Nissl;
(B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondente a VTAdc; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área correspondente
a VTAd; (E) Ampliação da caixa homônima em B, em área correspondente a VTAc. Barra:
2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C, D e E .
C
D
E A
C D
E
B
CSC
3N
RN VTAd
VTAc
IP cp
Aq
46
C D
C D
B A
Figura 20. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó, ao
nível de aproximadamente 5,76 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de Nissl;
(B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondente a VTAdc; (D) e (E) Ampliações das caixas homônimas em B, em áreas
correspondentes a RRF. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D.
CSC
PAG
3N
RN RRF
Aq
IP cp
SNcd
47
C D
C D
B A
Figura 21. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó, ao
nível de aproximadamente 6,12 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de Nissl;
(B) Imunoistoquímica para TH; (C) e (D) Ampliações das caixas homônimas em B, em
áreas correspondentes a RRF. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D .
Aq
PN
IP
VTAd
3N
PAG
RRF
rs
SNcd
48
C D
C
D B A
Figura 22. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó, ao
nível de aproximadamente 6,48 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de Nissl;
(B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondente a VTAdc e (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondentes a RRF. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D.
Aq PAG
3N
PN
IP
RRF
49
50
6. DISCUSSÃO
6.1 Considerações técnicas
Como mencionado anteriormente, a TH é uma enzima comum à síntese de todas as
catecolaminas, podendo a sua expressão imunoistoquímica evidenciar tanto neurônios
dopaminérgicos, como noradrenérgicos ou adrenérgicos. Entretanto, evidências provenientes
de estudos com ferramentas fisiológicas, farmacológicas, hodológicas, clínicas e de biologia
molecular, permitem assegurar que os grupamentos neuronais imunorreativos a TH no
mesencéfalo, diencéfalo, telencéfalo e retina são constituídos por neurônios produtores de
dopamina e, portanto, a imunorreatividade a TH pode ser considerada um marcador molecular
confiável para identificação de grupamentos dopaminérgicos no mesencéfalo (Grimm et al.,
2004; Prakash e Hurst, 2006; Margolis et al., 2010).
Portanto, a imunoistoquímica para TH, aliada à técnica de Nissl, permitiu-nos
delimitar os grupamentos dopaminérgicos do mesencéfalo do mocó, bem como caracterizar a
morfologia dos neurônios.
No mesencéfalo do mocó foram identificados os núcleos A8, A9 e A10,
semelhantemente aos que foram encontrados anteriormente no rato (Rattus norvegicus)
(German e Manaye, 1993), hamster (Mesocricettus auratus) (Vincent, 1988), gerbil (Tatera
brantsii) (Moon et.al., 2007), rato-cão (Thryonomys swinderianus) (Dwarika et al., 2008),
porco-espinho do Cabo (Hystrix africaeaustralis) (Limacher et al., 2008) entre outros
roedores.
Convém ressaltar que resultados semelhantes foram obtidos em estudos de
caracterização morfológica desses núcleos em animais de diferentes ordens, como por
exemplo, o babuíno Chacma (Papio ursinus) (McRitchie et.al., 1998), damão-do-cabo
(Procavia capensis) (Gravett et al., 2009), rock musaranho elefante (Elephantulus myurus)
(Pieters et al., 2010), girafa (Giraffa camelopardalis) (Bux et al., 2010), morcegos das
subordens Microchiropteria e Megachiropteria (Dell et al., 2010; Kruger et al., 2010) entre
outros.
Segue-se uma discussão sobre a organização nuclear dos grupos A8, A9 e A10,
comparativamente às descrições prévias em outras espécies.
51
6.2 Zona retrorubral (A8)
Em estudo com duas espécies de roedores, o highveld mole-rat (Cryptomys
hottentotus pretoriaie) e o Cape dune mole-rat (Bathyergus suillus), demonstrou-se que os
neurônios que formam a RRF são do tipo ovóide, bipolar e/ou multipolar e não apresentam
uma orientação dendrítica (Bhagwandin et al., 2008). No highveld gerbil (Tatera brantsii),
evidenciou-se que, além dos neurônios ovóides, encontram-se neurônios fusiformes, podendo
ambos os tipos apresentarem um padrão de organização dendrítica nos sentidos ventrolateral e
dorsolateral (Moon et al., 2007). No presente estudo no mocó, não foi identificada a presença
de neurônios bipolares nesta região. Porém, constatou-se a existência de neurônios com
formato ovóide e, em menor freqüência, fusiforme cujos dendritos não apresentam padrão
organizacional específico.
6.3 Substância Negra pars compacta (A9)
As propriedades eletrofisiológicas dos neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo
foram primeiramente caracterizadas na SNc, onde cerca de 90% dos neurônios são
imunorreativos a TH (Margolis et.al., 2006). Com relação a esta área, todos os estudos
propõem a sua subdivisão em: SNcd, SCl, SNm e SNv. Contudo, apenas um estudo
evidenciou a existência da cSN como sendo um dos componentes dos núcleos
dopaminérgicos (Nielsen et al., 2009). De acordo com o atlas do rato (Paxinos e Watson,
2007), a área referente à cSN seria pertencente à RRF. Todavia, a análise microscópica das
secções do mocó permitiu sugerir que se trata de áreas distintas, uma vez que os neurônios da
cSN são basicamente fusiformes e com padrão de organização dendrítica dorso-ventral o que,
de certo modo, diverge dos neurônios relativos à RRF.
Certamente, surge a necessidade de se ampliar os estudos acerca da existência dessa
subunidade nigral, incluindo a análise de outras amostras do próprio mocó, assim como
estudos em outros animais da ordem Rodentia e, principalmente, da família Caviidae. Afinal,
os estudos anteriores trataram de roedores de outras famílias e, sobretudo, discrepantes em
termos de fenótipo, hábitos de vida, dimensões encefálicas, entre outros aspectos.
Quanto à SNm, estudos prévios relataram a existência de neurônios ovóides,
bipolares e sem organização dendrítica em mole-rat africano (Bhagwandin et al.; 2008); rock
hyrax (Gravett et al., 2009), sendo possível também encontrar neurônios multipolares com
formato triangular como no rock elephant shrew (Pieters et.al., 2010), ou apresentando
52
organização dendrítica paralela ao pedúnculo cerebral, como no highveld gerbil (Moon et.al.,
2007). Na SNm do mocó foram encontrados neurônios bipolares e multipolares, apresentando
um formato ovóide e, com menor freqüência, triangular. Com relação à orientação dendrítica,
os primeiros neurônios apresentavam uma organização paralela às bordas do pedúnculo
cerebral e SNr. Porém, nos cortes mais caudais, esse padrão foi sendo substituído por uma
arborização aleatória.
No mocó a SNcd é formada por neurônios bipolares e multipolares com corpo celular
em dois aspectos, ovóide e triangular, e a arborização dendrítica apresenta a predominância de
uma orientação em sentido medial-lateral (paralelo ao lemnisco medial) e, em menor
expressão, em sentido dorso-ventral (na área correspondente à SNr). De fato, esta subunidade
nigral não apresenta divergências significativas quando comparadas com outros estudos (Bux
et al., 2010; Limacher et al., 2008).
Já a SNv, no highveld gerbil (Tatera branstsii) é formada por neurônios triangulares,
multipolares e não apresentam orientação dendrítica (Moon et al., 2007). No caso do highveld
mole-rat (Cryptomys hottentotus pretoriaie) e do Cape dune mole-rat (Bathyergus suillus),
esses neurônios são ovóides, bipolares e não apresentam orientação dendrítica (Bhagwandin
et.al, 2008). No mocó apresenta-se como um grupo de baixa densidade neuronal, formado por
neurônios ovóides e multipolares com orientação dendrítica dorso-ventral.
No tocante à SNl, ficou constatado que esta é formada por uma baixa densidade
neuronal e se encontra nas porções mais laterais do tegmento mesencefálico. Seus neurônios
são multipolares e, em menor expressão, bipolares. Além disso, apresentam formato ovóide e,
frequentemente, piriforme. Com relação à organização dendrítica, não há um padrão
específico. Em outros estudos, foram encontrados neurônios poligonais e, frequentemente,
triangulares no rock hyrax (Gravett et al., 2009) e no rock elephant shrew (Pieters et.al.,
2010).
6.4 Área Tegmental Ventral (A10)
Com relação à morfologia do complexo da VTA, vários estudos destacaram a sua
divisão em: VTA, VTAc, VTAd e VTAdc (Smeets e González, 2000).
Alguns estudos apontaram que a subunidade chamada VTA é constituída por
neurônios ovóides, bipolares e com orientação dorsoventral, como no greater canerat
(Dwarika et al., 2008) e highveld gerbil (Moon et al., 2007). Contudo, algumas diferenças
53
foram identificadas no mocó, no qual os neurônios são multipolares, arredondados e, em
menor quantidade, triangulares. Além disso, não apresentam um padrão de organização
dendrítica.
A VTAc, uma região pouco densa, foi delimitada e seus neurônios classificados em
multipolares, com formato arredondado e sem um padrão específico de organização
dendrítica. Já no caso de outro roedor estudado, o cape porcupine (Hystrix africaeaustralis),
contatou-se a presença de neurônios ovóides, bipolares e com orientação dorsolateral dos
dendrítos (Limacher et al., 2008).
No mocó, a localização da VTAd, na linha média encefálica, dorsalmente à VTAc,
bem como a citoarquitetura constituída por um aglomerado de neurônios ovóides, bipolares e,
em menor freqüência, multipolares, com organização dendrítica dorsoventral, está de acordo
com o padrão encontrado nas diversas espécies estudadas previamente.
O último componente do complexo VTA é a VTAdc. No mocó trata-se de um grupo
situado na substância cinzenta periaqueduta, com neurônios ovóides, bipolares e, em menor
freqüência, multipolares com orientação dendrítica paralela às bordas do aqueduto
mesencefálico. Este padrão foi encontrado nas diversas espécies estudadas. Todavia, em
estudo com morcegos (Schreiber’s long-fingered bat, Miniopterus schreibersii) estes
neurônios não foram identificados (Maseko e Manger, 2007).
6.5 Considerações evolutivas
Com base nos estudos realizados em outros animais, principalmente reportando-se
aos diversos da ordem Rodentia, foi possível deduzir que, embora se perceba diferenças
fenotípicas acentuadas, a complexidade nuclear dos centros dopaminérgicos no mesencéfalo
parece ser capaz de mudar entre as diferentes ordens, mas não dentro dela mesma (Maseko et
al, 2007). Deste modo, autores sugeriram que para a ordem Rodentia as variações fenotípicas,
de hábitos de vida e características evolutivas não conduzem à variação dos núcleos
dopaminérgicos (Manger, 2005; Da Silva et al., 2006; Bhagwandin et al, 2008).
Os resultados revelaram que os núcleos dopaminérgicos do mesencéfalo do mocó
são, de um modo geral, similares ao que já foi descrito em outras espécies de mamíferos,
sugerindo que os núcleos A8, A9 e A10 têm se mostrado filogeneticamente estáveis entre as
espécies. Uma ressalva deve ser feita com relação à presença da cSN, a qual foi descrita
54
apenas em uma espécie não Rodentia, o gottingen minipig (Sus scrofa domesticus), um
ungulado desenvolvido laboratorialmente a partir do porco doméstico (Nielsen et al., 2009).
Considerando que na maioria das espécies estudadas os núcleos dopaminérgicos
mesencefálicos apresentam uma distribuição semelhante, e no caso do mocó se tenha
encontrado uma diferença relacionada à organização da substância negra, surge a necessidade
de maiores detalhamentos de estudos desta natureza. Um dos caminhos seria a ampliação da
análise comparativa de amostras encefálicas de animais de mesma ordem (tanto de mesma
família, quanto de famílias diferentes), no que se refere à consistência das divisões nucleares.
Além disso, estudos paralelos poderão ser desenvolvidos no sentido de comparar animais de
ordens diferentes (Moon et al., 2007; Maseko et al, 2007).
55
7. CONCLUSÕES
A partir dos resultados deste trabalho, com relação aos núcleos dopaminérgicos do
mesencéfalo do mocó, é possível concluir que:
1. A imunoistoquímica para TH, juntamente com a técnica de Nissl, são eficientes
no que se refere à delimitação dos neurônios dopaminérgicos presentes no
mesencéfalo, assim como na delimitação dos núcleos e na caracterização
citoarquitetônica;
2. Os núcleos dopaminérgicos do mesencéfalo são: zona retrorubral (RRF/A8),
substância negra pars compacta (SNc/A9) e área tegmental ventral (VTA/A10);
3. A SNc foi dividida em: SNm, SNcd, SNl, SNv e cSN. Já a VTA se divide em:
VTA, VTAc, VTAd e VTAdc;
4. Os núcleos dopaminérgicos do mesencéfalo do mocó se apresentam
semelhantemente aos núcleos estudados em outras espécies de roedores.
Todavia, destaca-se a exceção da cSN que não foi identificada em nenhum dos
roedores estudados.
56
8. PERSPECTIVAS
O mocó (Kerodon rupestris) vem sendo utilizado como modelo experimental no
Programa de pós graduação em Psicobiologia da UFRN desde 2003 e, no Laboratório de
Neuranatomia, desde 2004. Conforme mencionado, algumas trabalhos já foram desenvolvidos
com este animal e, atualmente, encontra-se em andamento uma pesquisa de doutorado cujo
objetivo consiste em abordar aspectos anatômicos do olho e neuroquímicos da retina do
animal, relacionando-os com o sistema de temporização circadiana. No que tange ao
mapeamento de centros cerebrais desta espécie, esta pesquisa é a segunda que trabalha nesta
perspectiva, tendo sido recentemente concluído um trabalho de mestrado que fez a descrição
dos núcleos serotoninérgicos da rafe.
Este trabalho mostrou a proximidade existente entre os núcleos dopaminérgicos do
mesencéfalo do mocó (Kerodon rupestris) e de outros animais (roedores ou não) estudados.
Porém, lançou a perspectiva de aprofundamento de estudos, no sentido de esclarecer ainda
mais algumas divergências existentes, assim como algumas lacunas que surgem no decorrer
dos estudos.
Diante do exposto, é eminente a necessidade de continuidade de pesquisas referentes
ao sistema dopaminérgico deste animal. Eis algumas possibilidades:
1. Caracterização neuroquímica dos núcleos dopaminérgicos;
2. Estudo morfométrico e/ou estereológico desses núcleos;
3. Estudo de caráter funcional que busque evidenciar a importância das subdivisões
nucleares encontradas e relacioná-las com respostas
biológicas/comportamentais;
4. Estudos hodológicos;
5. Estudos filogenéticos que busquem comparar a apresentação destes núcleos
entre indivíduos da mesma família (Caviidae);
6. Aprimoramento das descrições anatômicas destes núcleos ou de outros, na
perspectiva de contribuir para a construção do atlas do mocó (Kerodon
rupestris).
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ANEXO – Artigo a ser submetido a Journal of Chemical Neuroanatomy (ISSN: 0891-
0618) – Versão em Português.
Nuclear organization of the midbrain dopaminergic system of the rock cavy
(Kerodon rupestris)
José R L P Cavalcanti, Joacil G soares, Francisco G Oliveira, Fausto P Guzen, André L
B Pontes, Twyla B Sousa, Jeferson S Cavalcante, Expedito S Nascimento Jr, Judney C
Cavalcante, Miriam S M O Costa*.
Departments of Morphology and Physiology, Laboratory of Neuroanatomy, Bioscience
Center, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil
Whit XX pages and YY figures
*Corresponding autor:
Miriam Stela Maris de Oliveira Costa
Department of Morphology/Laboratory of Chronobiology, Bioscience Center, Federal
University of Rio Grande do Norte, 59072-970, Natal, RN, Brazil.
Telephone number: 55 84 32153431
Fax: 55 84 32119207
E-mail address: [email protected]
ABSTRACT
The 3-hydroxytyramine / dopamine (DA) is a monoamine of catecholamineric group
and consists in the progenitor substantia of synthesis of noradrenaline and adrenaline,
having the enzyme tyrosine hydroxylase as a regulator of this process. Nuclei of
midbrain expressing DA are the retrorubral field (RRF, A8 group), the substantia nigra
pars compacta (SNc, A9 group) and the ventral tegmental area (VTA, A10 group).
These nuclei are involved in three complex circuitry called mesostriatal, mesocortical
and mesolimbic, which are related directly with various behavioral manifestations such
as motor control, reward signaling in behavioural learning, motivation and pathological
manifestations of Parkinson’s disease and schizophrenia. The aim of this study was
describe the morphology of midbrain dopaminergic neurons (A8, A9 and A10) of the
rock cavy (Kerodon rupestris), a rodent belonging to the family Caviidae typical of the
Brazilian Northeast. Coronal sections of brains of the rock cavies were submitted to
Nissl’s staining and immunohistochemistry against tyrosine hydroxylase. The nuclear
organization of the midbrain dopaminergic nuclei of rock cavy is very similar to that
found in other animals of the order Rodentia, except by the presence of the tail of
substantia nigra, which was found only in the studied species. We concluded that the
midbrain dopaminergic nuclei are phylogenetically stable among species, but we think
to be it necessary to expand the studies about the particularity found the rock cavy,
investigating its occurrence in other species of rodents and investigating its functional
relevance.
Keywords: Midbrain; Dopamine; Tyrosine Hydroxylase; Midbrain Dopaminergic
Nuclei; Rock Cavy; Rodents.
INTRODUÇÃO
Em meados da década de 1950, constatou-se que além de ser precursora da
noradrenalina e da adrenalina, a 3-hidroxitiramina/dopamina (DA) possuía a capacidade
de atuar como neurotransmissor no sistema nervoso central, (Carlsson et. al., 1958;
Björklund e Dunnett, 2007a). Como tal, a DA é uma monoamina que se encontra no
grupo das catecolaminas e é um dos principais neurotransmissores na modulação da
função cerebral, desempenhando um papel crucial na adaptação do comportamento
animal ao longo da evolução (Jones e Pilowski, 2002; Yamamoto e Vernier, 2011).
Estudos anteriores identificaram dez núcleos dopaminérgicos encefálicos que
foram codificados de A8-A17, sendo: A8 – Zona retrorrubral; A9 – Substância negra
pars compacta; A10 – Área tegmental ventral; A11 ao A14 – Grupos hipotalâmicos;
A15 – Hipotálamo ventral e lateral/Área retroquiasmática; A16 – Células
periglomerulares do bulbo olfatório; A17 – Células interplexiformes da retina
(Dahlström e Fuxe, 1964; Márin et al., 2005).
Dentre os núcleos dopaminérgicos, destacam-se os situados no mesencéfalo
(A8, A9 e A10). Estes participam de três complexas circuitarias denominadas
mesostriatal, mesocortical e mesolímbica (Dahlström e Fuxe, 1964; German e Manaye,
1993; François et al., 1999; Smith e Kieval, 2000; Björklund e Dunnett, 2007b) que
estão envolvidas em controle motor, motivação, cognição, recompensa e em algumas
desordens neurológicas e/ou psiquiátricas, como por exemplo, a doença de Parkinson e
a esquizofrenia (Chudasama e Robbins, 2004; Nicola et al., 2005; Fields et al., 2007).
Considerando as relevâncias funcionais, surge a necessidade de se ampliar os
estudos acerca dessas estruturas, inclusive tomando como referência um animal
genuinamente brasileiro. O mocó (Kerodon rupestris) é um roedor nativo da região
semi-árida e pode ser encontrado no Nordeste Brasileiro. De acordo com a taxonomia
tradicional, baseada em critérios morfológicos e comportamentais, o mocó é
classificado na superfamília Cavioidea, família Caviidae, subfamília Caviinae e gênero
Kerodon (Cabrera, 1961; Lacher Jr., 1981). Estudos morfológicos (Silva Neto, 2000) e
de biologia molecular (Rowe e Honeycutt, 2002) firmaram o gênero Kerodon irmanado
com a família Hydrochaeridae, à qual também pertence a capivara (Hydrochaeris) e
estreitamente alinhado com a subfamília Dolichotinae.
O mocó é um animal facilmente adaptado às condições ecológicas locais como
o calor, a escassez de água e de alimentos, principalmente nos períodos das grandes
secas nas regiões do semi-árido. Habitam locais rochosos com inúmeras fendas onde se
abrigam dos predadores e passam boa parte de seu tempo. Além disso, são excelentes
saltadores e conseguem escalar rochas e galhos de árvores, de onde extraem a sua
alimentação, composta principalmente de cascas de árvores, ou na falta destas,
gramíneas em geral, ao contrário de outros caviinaes que possuem hábitos terrestres e
comem relva (Carvalho, 1969; Lacher, 1981; Mendes, 1985).
Com isso, o estudo objetivou descrever a morfologia dos núcleos
dopaminérgicos do mesencéfalo do mocó, mediante caracterização citoarquitetônica
pelo método de Nissl e por imunoistoquímica contra tirosina-hidroxilase. Pretende-se
com isso formular bases para pesquisas de aspectos hodológicos e funcionais dos
grupos dopaminérgicos deste animal.
MATERIAIS E MÉTODOS
Quatro animais adultos jovens, machos (n=2) e fêmeas (n=2), pesando entre
300 e 400 gramas foram utilizados no experimento. Os animais foram obtidos por
captura após permissão do Instituto Brasileiro do Meio ambiente (IBAMA – Licença nº
21440-1) e o trabalho foi iniciado após aprovação pelo Comitê de Ética no Uso de
Animais (CEUA), mediante protocolo nº 015/2009. É importante ressaltar que todos os
cuidados foram tomados no sentido de evitar dor e sofrimento aos animais durante os
procedimentos experimentais, seguindo-se estritamente as normas estabelecidas pela
National Research Council of the National Academy.
Foram administrados por via intramuscular, os medicamentos cloridrato de
tramadol e xilazina, ambos na dose de 5 (cinco) mg/Kg, como medida pré-anestésica.
Decorridos 10 minutos, os animais foram mantidos em anestesia inalatória com
isoflurano e oxigênio 100% administrados através de máscara. Os animais foram
submetidos à perfusão transcardíaca e a agulha foi conectada a uma bomba peristáltica
(Cole-Parmer), passando-se 300 ml de solução salina a 0,9% em tampão fostato 0,1M,
pH 7,4 com heparina (Parinex, Hipolabor, 2ml/1000 ml de solução salina) durante seis
minutos. Em seguida, foram infundidos 700 ml de solução fixadora composta por
paraformaldeido 4%, glutaraldeído 0,05% e ácido pícrico 0,2% em tampão fosfato 0,1
M, pH 7,4 (Zamboni e Di Martino, 1967), passando-se metade desta solução a um fluxo
de 6,0 ml por minuto e a outra metade a 3,0 ml por minuto, durando todo procedimento
em torno de 30 minutos.
Finalizada a etapa de perfusão, os animais foram posicionados no aparelho
estereotáxico para roedores. Após anotação das coordenadas do bregma e do lambda, o
osso da calota craniana foi removido com o uso de broca e trocater, expondo-se o
encéfalo. Ainda no aparelho estereotáxico, os encéfalos foram seccionados em três
blocos através de duas secções coronais: uma no nível do bregma e a outra no nível do
lambda. Logo após esta etapa, os três blocos foram armazenados em uma solução
contendo sacarose a 30% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, a 4 ºC, até serem submetidos
à microtomia (cortes coronais).
Os encéfalos foram congelados por gelo seco e seccionados em micrótomo de
deslizamento, obtendo-se secções coronais com espessura de 30 µm. Estas foram
coletadas em um meio líquido de tampão fostato 0,1M, pH 7,4, distribuídas
seqüencialmente em seis compartimentos, de maneira cíclica e seqüenciada, de modo a
manter a distância entre uma secção e a outra imediatamente seguinte de um mesmo
compartimento de aproximadamente 180 µm.
Os cortes de um compartimento foram imediatamente montados em lâminas de
vidro gelatinizadas e submetidas à coloração pelo método de Nissl para permitir uma
melhor demarcação das estruturas. Os cortes dos demais compartimentos foram
transferidos para solução anticongelante e conservados a -20 ºC para utilização posterior
em procedimentos de imunoistoquímica.
Precedendo a técnica de imunoistoquímica, os cortes foram submetidos a um
pré-tratamento para recuperação da antigenicidade, sendo colocados em solução de
boridreto de sódio a 1% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, durante 15 minutos. O pré-
tratamento também incluiu uma etapa de incubação em peróxido de hidrogênio (H2O2) a
0,3% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 por cinco minutos. No início, entre as soluções e
ao final, os cortes foram submetidos a seis lavagens de cinco minutos cada em tampão
fosfato 0,1 M, pH 7,4.
O próximo passo consistiu na incubação dos cortes em anticorpo primário, isto
é, uma solução formada pelo anticorpo anti-TH obtido em camundongo (Sigma) em
diluição de 1:10.000, acrescido de soro normal de asno a 2% em Triton X-100 a 0,4%
permanecendo em incubação por 12 a 72 horas em rotor com rotação lenta.
Ao fim deste período, os cortes passaram por seis lavagens em tampão fosfato
0,1 M pH 7,4, em agitador orbital e em seguida colocados em contato com o anticorpo
secundário anti-camundongo obtido em asno (Jackson) diluído a 1:1000 no mesmo
veículo anterior, por 120 minutos à temperatura ambiente, sob agitação lenta, em rotor.
Em seguida, os cortes passaram por seis lavagens em tampão fosfato 0,1 M em
agitador orbital e depois colocados na solução do complexo avidina-biotina-HRP
(Protocolo ABC, Kit elite da Vector), numa diluição de 1:100 em Triton X-100 a 0,4%,
contendo NaCl , por 120 minutos à temperatura ambiente, sob agitação lenta, em rotor.
Terminada esta fase, as secções foram novamente submetidas a seis lavagens em
tampão fosfato 0,1 M em agitador orbital.
Para visualização da reação, as secções foram postas em meio contendo H2O2
como substrato e a 3,3’,4,4’tetrahidrocloreto-diaminobenzidina (DAB), utilizada como
cromógeno. A H2O2 foi oferecida indiretamente, colocando-se na solução glicose
oxidase e D-glicose, provocando uma reação em que a primeira agindo sobre a
segunda libera H2O2 (Itoh et al., 1979). Esta reação dura em torno de 15 minutos e após
esta, os cortes foram submetidos a mais seis lavagens em tampão fosfato 0,1 M em
agitador orbital.
Os cortes foram montados em lâminas gelatinizadas, que após secas foram
imersas em solução de tetróxido de ósmio a 0,05% com o intuito de intensificar a
reação. Após as etapas de desidratação, em baterias de álcool de graduação crescente até
o álcool absoluto, e diafanização em xilol, as lamínulas foram montadas sobre os cortes
com o uso de DPX.
As secções do mesencéfalo, coradas pelo método de Nissl e/ou submetidas à
imunoistoquímica para TH foram examinadas ao microscópio óptico (Olympus BX41)
em campo claro. Imagens digitais foram obtidas de secções representativas usando
uma videocâmara digital (Nikon DXM1200). As imagens foram analisadas, corrigidas
minimamente para brilho e contraste, montadas usando o programa Adobe Photoshop
CS5® e os desenhos esquemáticos foram montados no software Adobe Illustrator
CS5®. Os resultados foram documentados em fotomicrografias e esquemas
construídos a partir das mesmas.
RESULTADOS
O comprimento rostro-caudal médio, do bulbo olfatório à transição bulbo-
espinal, foi da ordem de 3,63 cm (Fig. 1).
Com base na imunoistoquímica para TH, aliada à técnica de Nissl, foi possível
estabelecer os limites anatômicos, assim como a citoarquitetura e possíveis subdivisões,
dos três núcleos dopaminérgicos do mesencéfalo. Para facilitar a compreensão, foram
feitos esquemas ilustrativos que demonstram as estruturas encefálicas sequenciadamente
(Fig. 2).
No sentido rostro-caudal, os primeiros neurônios dopaminérgicos a aparecerem
fazem parte da SNc e estão no nível da transição die-mesencefálica, coincidindo com
estruturas do hipotálamo posterior, a aproximadamente 2,34 mm pós-bregma (p.b.) e se
estendem até o nível 6,48 mm p.b., coincidindo com estruturas dos níveis rostrais e
médios do mesencéfalo, pertencendo à RRF e a uma das subdivisões da VTA (VTAdc).
Substância Negra pars compacta (SNc/A9):
Com base na densidade de distribuição dos seus neurônios, ao longo da maior
extensão da SNc é possível identificar subunidades neste núcleo. Assim, a SNc foi então
dividida em substância negra compacta dorsal (SNcd ou A9d), substância negra lateral
(SNl ou A9l), substância negra medial (SNm ou A9m), cauda da substância negra (cSN)
e substância negra ventral (SNv ou A9v).
Como mencionado, os primeiros neurônios dopaminérgicos nigrais surgem na
porção ventrolateral do tegmento mesencefálico e são pertencentes à SNm, localizando-
se lateralmente aos núcleos mamilar (Mn) e supramamilar (SuM), medialmente ao
núcleo subtalâmico (STh), ventralmente ao lemnisco medial, zona incerta (ZI) e às
projeções nigro-estriatais TH+ e dorsalmente ao pedúnculo cerebral (cp) e à substância
negra reticulada (SNr) (Figs. 2A e 3A-C). Foi visto que estes neurônios são bipolares e
multipolares, apresentando formato ovóide e, com menor freqüência, triangular. Com
relação à orientação dendrítica, os neurônios rostrais apresentavam uma organização
dendrítica paralela às bordas do pedúnculo cerebral e SNr (Fig. 3C). Porém, nos níveis
mais caudais, esse padrão foi sendo substituído por uma arborização aleatória (Figs. 4D
e 5D).
Lateralmente à SNm, aparecem os primeiros neurônios TH+ referentes à SNcd
(Fig. 2B). Basicamente, em toda a sua extensão a SNcd encontra-se ventralmente ao
lemnisco medial e dorsalmente à SNr. Assim como na SNm, na SNcd constatou-se a
presença de neurônios TH+ bipolares e multipolares com corpo celular em formatos
ovóide e triangular. No tocante à arborização dendrítica, foi possível constatar a
predominância de uma orientação em sentido medial-lateral (paralelo ao lemnisco
medial) e, em menor expressão, em sentido dorso-ventral (na área correspondente à
SNr) (Figs. 4C e 5C).
Lateralmente à SNcd (Fig 2E), foi possível visualizar neurônios referentes à
SNl. Este grupamento de baixa densidade neuronal foi identificado nas porções mais
laterais do tegmento mesencefálico, estando dorsalmente à SNr. Seus limites caudais se
encontram ventralmente à RRF (Fig. 2N). Os neurônios pertencentes a esta subunidade
nigral são multipolares e, em menor expressão, bipolares. Além disso, apresentam
formato ovóide e, frequentemente, piriforme. Com relação à organização dendrítica, não
há um padrão especifico (Figs. 6C e 7C).
Por volta do nível 4,14 mm p.b. (Fig. 2H), neurônios TH+ surgem
bilateralmente em uma região dorsal às porções mais laterais da SNcd e recebem o
nome cSN. Prosseguindo a visualização das secções mais caudais, é possível perceber
que estes grupamentos coexistem com a SNc até o nível de 5,22 mm p.b. (Fig. 2M). É
um grupo de baixa densidade celular, formado basicamente por neurônios bipolares
fusiformes e, raramente, ovóides. Grande parte dos dendritos está disposta em um
sentido dorso-ventral (Figs. 8D e 9C).
No nível 4,32 mm p.b. (Fig. 2I), foram identificados neurônios TH+
bilateralmente em uma região ventral às porções intermediárias da SNcd e dorsal ao
pedúnculo cerebral, inseridos na SNr. Estes grupamentos recebem o nome de SNv ou
A9v e seus neurônios coexistem com as demais porções da SNc até o nível 6,12mm p.b.
(Fig. 2O). Trata-se de um subgrupo de baixa densidade neuronal, formado por
neurônios ovóides e multipolares com orientação dendrítica dorso-ventral (Figs. 9D e
10C).
Área Tegmental Ventral (VTA/A10):
Assim como a SNc, foi possível subdividir o complexo da VTA em sub-
regiões: VTA propriamente dita, VTA central (VTAc ou A10c), VTA dorsal (VTAd ou
A10d) e VTA dorsal caudal (VTAdc ou A10dc).
Os primeiros neurônios TH+ referentes à VTA começaram a aparecer no nível
2,70 mm p.b., na região mais medial do tegmento mesencefálico. Neste ponto, localiza-
se lateralmente aos núcleos mamilares e supramamilar, medialmente à SNm e SNr e
ventralmente aos lemnisco medial, ZI e às projeções nigro-estriatais (Fig. 2B).
Analisando níveis mais caudais, foi possível identificar mais relações entre a VTA e
outras estruturas mesencefálicas, como por exemplo o núcleo interpeduncular e o
fascículo retroflexo, que se encontram em uma posição ventromedial em relação à VTA
(Figs. 2H e 2M). De um modo geral, os neurônios da VTA são multipolares
arredondados e, em menor quantidade, triangulares. Além disso, não apresentam um
padrão de organização dendrítica (Figs. 6D e 8C).
No nível 3,96 mm p.b. (Fig. 2G) foi possível identificar com clareza a
formação neuronal TH+ que recebe o nome VTAc. Neste nível ela se encontra
medialmente à VTA e dorsalmente ao fascículo retroflexo. Já, em níveis mais caudais, a
VTAc se encontra dorsalmente ao núcleo interpeduncular (Fig.2L). Trata-se de um
núcleo pouco denso constituído de neurônios multipolares, com formato arredondado e
sem um padrão específico de organização dendrítica (Figs. 6E e 11E) e nos seus limites
caudais este núcleo se entrelaça com o linear caudal da rafe (Cli).
Com relação à VTAd, esta é formada por uma moderada densidade de
neurônios TH+ ovóides, bipolares e, em menor freqüência, multipolares situados na
linha média encefálica, dorsalmente à VTAc (descrita a seguir) e ventralmente à
substância cinzenta periaquedutal (PAG) e, nos níveis mais caudais, ao núcleo do nervo
oculomotor (3N). Trata-se de um grupo neuronal que esboça um padrão de organização
dendrítica dorsoventral (Fig. 7C e 11D).
A VTAdc, contém neurônios TH+ em baixa densidade, presentes desde os
níveis mais rostrais (Fig. 2D), até os níveis em que não mais existem neurônios da VTA
no tegmento mesencefálico (Fig. 2P). Trata-se de um grupo existente na PAG,
especificamente na metade ventral do aqueduto cerebral (Aq). Seus neurônios
basicamente são ovóides, bipolares e, em menor freqüência, multipolares com
orientação dendrítica paralela às bordas do aqueduto cerebral (Figs. 6E e 14C).
Zona Retrorubral (RRF/A8):
Os neurônios TH+ retrorubrais surgem em uma área ventral às porções mais
caudais do núcleo rubro (RN) e dorsal ao lemnisco medial (Fig. 2N). Neste nível, é
possível ainda se perceber a coexistência da SNcd e SNl que se encontram
ventrolateralmente e a VTA que está ventromedialmente à RRF.
Tal núcleo, comparado com demais estudados, é formado por um grupo
reduzido e disperso de neurônios multipolares ovóides e, raramente, fusiformes, sem
padrão de organização dendítrica. Seus últimos neurônios são vistos no nível 6,48 mm
p.b. (Figs. 2P e 12C-D, 13C-D e 14D).
DISCUSSÃO
Considerações técnicas
Como mencionado anteriormente, a TH é uma enzima comum à síntese de
todas as catecolaminas, podendo a sua expressão imunoistoquímica evidenciar tanto
neurônios dopaminérgicos, como noradrenérgicos ou adrenérgicos. Entretanto,
evidências provenientes de estudos com ferramentas fisiológicas, farmacológicas,
hodológicas, clínicas e de biologia molecular, permitem assegurar que os grupamentos
neuronais imunorreativos a TH no mesencéfalo, diencéfalo, telencéfalo e retina são
constituídos por neurônios produtores de dopamina e, portanto, a imunorreatividade a
TH pode ser considerada um marcador molecular confiável para identificação de
grupamentos dopaminérgicos no mesencéfalo (Grimm et al., 2004; Prakash e Hurst,
2006; Margolis et al., 2010).
Portanto, a imunoistoquímica para TH, aliada à técnica de Nissl, permitiu-nos
delimitar os grupamentos dopaminérgicos do mesencéfalo do mocó, bem como
caracterizar a morfologia dos neurônios.
No mesencéfalo do mocó foram identificados os núcleos A8, A9 e A10,
semelhantemente aos que foram encontrados anteriormente no rato (Rattus norvegicus)
(German e Manaye, 1993), hamster (Mesocricettus auratus) (Vincent, 1988), highveld
gerbil (Tatera brantsii) (Moon et.al., 2007), greater canerat (Thryonomys swinderianus)
(Dwarika et al., 2008), cape porcupine (Hystrix africaeaustralis) (Limacher et al., 2008)
entre outros roedores.
Convém ressaltar que resultados semelhantes foram obtidos em estudos de
caracterização morfológica desses núcleos em animais de diferentes ordens, como por
exemplo, o chacma baboon (Papio ursinus) (McRitchie et.al., 1998), rock hyrax
(Procavia capensis) (Gravett et al., 2009), rock elephant shrew (Elephantulus myurus)
(Pieters et al., 2010), giraffe (Giraffa camelopardalis) (Bux et al., 2010), morcegos das
subordens Microchiropteria e Megachiropteria (Dell et al., 2010; Kruger et al., 2010)
entre outros.
Segue-se uma discussão sobre a organização nuclear dos grupos A8, A9 e A10,
comparativamente às descrições prévias em outras espécies.
Zona retrorubral (A8)
Em estudo com duas espécies de roedores, o highveld mole-rat (Cryptomys
hottentotus pretoriaie) e o Cape dune mole-rat (Bathyergus suillus), demonstrou-se que
os neurônios que formam a RRF são do tipo ovóide, bipolar e/ou multipolar e não
apresentam uma orientação dendrítica (Bhagwandin et al., 2008). No highveld gerbil
(Tatera brantsii), evidenciou-se que, além dos neurônios ovóides, encontram-se
neurônios fusiformes, podendo ambos os tipos apresentarem um padrão de organização
dendrítica nos sentidos ventrolateral e dorsolateral (Moon et al., 2007). No presente
estudo no mocó, não foi identificada a presença de neurônios bipolares nesta região.
Porém, constatou-se a existência de neurônios com formato ovóide e, em menor
freqüência, fusiforme cujos dendritos não apresentam padrão organizacional específico.
Substância Negra pars compacta (A9)
As propriedades eletrofisiológicas dos neurônios dopaminérgicos do
mesencéfalo foram primeiramente caracterizadas na SNc, onde cerca de 90% dos
neurônios são imunorreativos a TH (Margolis et.al., 2006). Com relação a esta área,
todos os estudos propõem a sua subdivisão em: SNcd, SCl, SNm e SNv. Contudo,
apenas um estudo evidenciou a existência da cSN como sendo um dos componentes dos
núcleos dopaminérgicos (Nielsen et al., 2009). De acordo com o atlas do rato (Paxinos e
Watson, 2007), a área referente à cSN é apontada seria pertencente à RRF. Todavia, a
análise microscópica das secções do mocó permitiu sugerir que se trata de áreas
distintas, uma vez que os neurônios da cSN são basicamente fusiformes e com padrão
de organização dendrítica dorso-ventral o que, de certo modo, diverge dos neurônios
relativos à RRF.
Certamente, surge a necessidade de se ampliar os estudos acerca da existência
dessa subunidade nigral, incluindo a análise de outras amostras do próprio mocó, assim
como estudos em outros animais da ordem Rodentia e, principalmente, da família
Caviidae. Afinal, os estudos anteriores trataram de roedores de outras famílias e,
sobretudo, discrepantes em termos de fenótipo, hábitos de vida, dimensões encefalicas,
entre outros aspectos.
Quanto à SNm, estudos prévios relataram a existência de neurônios ovóides,
bipolares e sem organização dendrítica em mole-rat africano (Bhagwandin et al.; 2008);
rock hyrax (Gravett et al., 2009), sendo possível também encontrar neurônios
multipolares com formato triangular como no rock elephant shrew (Pieters et.al., 2010),
ou apresentando organização dendrítica paralela ao pedúnculo cerebral, como no
highveld gerbil (Moon et.al., 2007). Na SNm do mocó foram encontrados neurônios
bipolares e multipolares, apresentando um formato ovóide e, com menor freqüência,
triangular. Com relação à orientação dendrítica, os primeiros neurônios apresentavam
uma organização paralela às bordas do pedúnculo cerebral e SNr. Porém, nos cortes
mais caudais, esse padrão foi sendo substituído por uma arborização aleatória.
No mocó a SNcd é formada por neurônios bipolares e multipolares com corpo
celular em dois aspectos, ovóide e triangular, e a arborização dendrítica apresenta a
predominância de uma orientação em sentido medial-lateral (paralelo ao lemnisco
medial) e, em menor expressão, em sentido dorso-ventral (na área correspondente à
SNr). De fato, esta subunidade nigral não apresenta divergências significativas quando
comparadas com outros estudos (Bux et al., 2010; Limacher et al., 2008).
Já a SNv, no highveld gerbil (Tatera branstsii) é formada por neurônios
triangulares, multipolares e não apresentam orientação dendrítica (Moon et al., 2007).
No caso do highveld mole-rat (Cryptomys hottentotus pretoriaie) e do Cape dune mole-
rat (Bathyergus suillus), esses neurônios são ovóides, bipolares e não apresentam
orientação dendrítica (Bhagwandin et.al, 2008). No mocó apresenta-se como um grupo
de baixa densidade neuronal, formado por neurônios ovóides e multipolares com
orientação dendrítica dorso-ventral.
No tocante à SNl, ficou constatado que esta é formada por uma baixa
densidade neuronal se encontra nas porções mais laterais do tegmento mesencefálico.
Seus neurônios são multipolares e, em menor expressão, bipolares. Além disso,
apresentam formato ovóide e, frequentemente, piriforme. Com relação à organização
dendrítica, não há um padrão específico. Em outros estudos, foram encontrados
neurônios poligonais e, frequentemente, triangulares no rock hyrax (Gravett et al., 2009)
e no rock elephant shrew (Pieters et.al., 2010).
Área Tegmental Ventral (A10)
Com relação à morfologia do complexo da VTA, vários estudos destacaram a
sua divisão em: VTA, VTAc, VTAd e VTAdc (Smeets e González, 2000).
Alguns estudos apontaram que a subunidade chamada VTA é constituída por
neurônios ovóides, bipolares e com orientação dorsoventral, como no greater canerat
(Dwarika et al., 2008) e highveld gerbil (Moon et al., 2007). Contudo, algumas
diferenças foram identificadas no mocó, no qual os neurônios são multipolares,
arredondados e, em menor quantidade, triangulares. Além disso, não apresentam um
padrão de organização dendrítica.
A VTAc, uma região pouco densa, foi delimitada e seus neurônios
classificados em multipolares, com formato arredondado e sem um padrão específico de
organização dendrítica. Já no caso de outro roedor estudado, o cape porcupine (Hystrix
africaeaustralis), contatou-se a presença de neurônios ovóides, bipolares e com
orientação dorsolateral dos dendrítos (Limacher et al., 2008).
No mocó, a localização da VTAd, na linha média encefálica, dorsalmente à
VTAc, bem como a citoarquitetura constituída por um aglomerado de neurônios
ovóides, bipolares e, em menor freqüência, multipolares, com organização dendrítica
dorsoventral, está de acordo com o padrão encontrado nas diversas espécies estudadas
previamente.
O último componente do complexo VTA é a VTAdc. No mocó trata-se de um
grupo situado na substância cinzenta periaqueduta, com neurônios ovóides, bipolares e,
em menor freqüência, multipolares com orientação dendrítica paralela às bordas do
aqueduto cerebral. Este padrão foi encontrado nas diversas espécies estudadas. Todavia,
em estudo com morcegos (Schreiber’s long-fingered bat, Miniopterus schreibersii) estes
neurônios não foram identificados (Maseko e Manger, 2007).
Considerações evolutivas
Com base nos estudos realizados em outros animais, principalmente
reportando-se aos diversos da ordem Rodentia, foi possível deduzir que, embora se
perceba diferenças fenotípicas acentuadas, a complexidade nuclear dos centros
dopaminérgicos no mesencéfalo parece ser capaz de mudar entre as diferentes ordens,
mas não dentro dela mesma (Maseko et al, 2007). Deste modo, autores sugeriram que
para a ordem Rodentia as variações fenotípicas, de hábitos de vida e características
evolutivas não conduzem à variação dos núcleos dopaminérgicos (Bhagwandin et al,
2008; Da Silva et al., 2006; Manger, 2005).
Os resultados revelaram que os núcleos dopaminérgicos do mesencéfalo do
mocó são, de um modo geral, similares ao que já foi descrito em outras espécies de
mamíferos, sugerindo que os núcleos A8, A9 e A10 têm se mostrado filogeneticamente
estáveis entre as espécies. Uma ressalva deve ser feita com relação à presença da CSN,
a qual foi descrita apenas em uma espécie não Rodentia, o gottingen minipig (Sus scrofa
domesticus), um ungulado desenvolvido laboratorialmente a partir do porco doméstico
(Nielsen et al., 2009).
Considerando que na maioria das espécies estudadas os núcleos
dopaminérgicos mesencefálicos apresentam uma distribuição semelhante, e no caso do
mocó se tenha encontrado uma diferença relacionada à organização da substância negra,
surge a necessidade de maiores detalhamentos de estudos desta natureza. Um dos
caminhos seria a ampliação da análise comparativa de amostras encefálicas de animais
de mesma ordem (tanto de mesma família, quanto de famílias diferentes), no que se
refere à consistência das divisões nucleares. Além disso, estudos paralelos poderão ser
desenvolvidos no sentido de comparar animais de ordens diferentes (Moon et al., 2007;
Maseko et al, 2007).
Portanto, este trabalho mostrou a proximidade existente entre os núcleos
dopaminérgicos do mesencéfalo do mocó (Kerodon rupestris) e de outros animais
(roedores ou não) estudados. Porém, lançou a perspectiva de aprofundamento de
estudos, no sentido de esclarecer ainda mais algumas divergências existentes, assim
como de avançar no sentido de compreender as mais diversas funções do sistema
dopaminérgico.
ACKNOWLEDGMENTS
This study was financially supported by the National Council for Scientific and
Technological Development (CNPq), Coordination for High Level Staff Improvement
(CAPES) and Research and Projects Financing (FINEP), Brazil.
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LEGENDAS DAS FIGURAS
Figura 1. Encéfalo do mocó em vistas dorsal (a) e ventral (b). Barra: 0,54 cm.
Figura 2. Reconstrução esquemática das secções coronais do encéfalo do mocó,
ilustrando a morfologia dos núcleos dopaminégicos do mesencéfalo. Representação do
nível mais rostral em (A) e do nível mais caudal em (P). Barra 1mm. Ver lista de
abreviações.
Figura 3. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
ao nível de aproximadamente 2,34 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de
Nissl; (B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em
área correspondente à SNm. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C.
Figura 4. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
ao nível de aproximadamente 2,70 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de
Nissl; (B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em
área correspondente à SNcd; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondente a SNm. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D.
Figura 5. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
ao nível de aproximadamente 3,24 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de
Nissl; (B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em
área correspondente à SNcd; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondente a SNm; (E) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondente a VTAdc. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C, D e E.
Figura 6. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
ao nível de aproximadamente 3,42 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de
Nissl; (B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em
área correspondente à SNl; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondente a VTA; (E) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondente a VTAc. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C, D e E.
Figura 7. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
ao nível de aproximadamente 3,96 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de
Nissl; (B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em
área correspondente à VTAd; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondente a SNl. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D.
Figura 8. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
ao nível de aproximadamente 4,14 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de
Nissl; (B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em
área correspondente à VTA; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondente a cSN. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D .
Figura 9. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
ao nível de aproximadamente 4,68 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de
Nissl; (B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em
área correspondente a cSN; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondente a SNv. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D .
Figura 10. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
ao nível de aproximadamente 5,04 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de
Nissl; (B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em
área correspondente a cSN; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondente a SNv. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C .
Figura 11. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
ao nível de aproximadamente 5,22 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de
Nissl; (B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em
área correspondente a VTAdc; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondente a VTAd; (E) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondente a VTAc. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C, D e E .
Figura 12. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
ao nível de aproximadamente 5,76 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de
Nissl; (B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em
área correspondente a VTAdc; (D) e (E) Ampliações das caixas homônimas em B, em
áreas correspondentes a RRF. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D.
Figura 13. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
ao nível de aproximadamente 6,12 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de
Nissl; (B) Imunoistoquímica para TH; (C) e (D) Ampliações das caixas homônimas em
B, em áreas correspondentes a RRF. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e
D.
Figura 14. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
ao nível de aproximadamente 6,48 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de
Nissl; (B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em
área correspondente a VTAdc e (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área
correspondentes a RRF. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D.
ABREVIAÇÕES
3-hidroxitiramina/dopamina – DA
Aqueduto cerebral - Aq
Área tegmental ventral – VTA/A10
Área tegmental ventral central – VTAc
Área tegmental ventral dorsal - VTAd
Área tegmental ventral dorsal caudal – VTAdc
Comissura do colículo superior - CSC
Comissura posterior - pc
Fascículo retroflexo – fr
Imunoistoquímica – IH
Lemnisco medial – ml
Núcleo das habênulas - Hb
Núcleo interpeduncular – IP
Núcleo linear caudal da rafe - Cli
Núcleo mamilar – Mn
Núcleo do n. oculomotor – 3N
Núcleo pontino - PN
Núcleo pré-comissural – Prc
Núcleo rubro - RN
Núcleo subtalâmico - STh
Núcleo supramamilar – SuM
Pedúnculo cerebral – cp
Projeções nigro-estriatais –ns
Susbstância cinzenta periaquedutal - PAG
Substância negra pars compacta – SNc/A9
Substância negra compacta dorsal – SNcd
Substância negra lateral – SNl
Substância negra medial – SNm
Substância negra reticulada - SNr
Susbtância negra ventral – SNv
Substância negra (cauda) – cSN
Terceito ventrículo – 3V
Tirosina-hidroxilase – TH
Trato rubroespinal - rs