OS NÚCLEOS DOPAMINÉRGICOS DO MESENCÉFALO DO MOCÓ · 2017-11-04 · Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências Cavalcanti, José

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José Rodolfo Lopes de Paiva Cavalcanti

OS NÚCLEOS DOPAMINÉRGICOS DO MESENCÉFALO DO MOCÓ

(Kerodon rupestris): CARACTERIZAÇÃO CITOARQUITETÔNICA E

POR IMUNOISTOQUÍMICA PARA TIROSINA-HIDROXILASE

Dissertação apresentada à Universidade

Federal do Rio Grande do Norte, como

pré-requisito para obtenção do título de

Mestre em Psicobiologia.

NATAL-RN

2011

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José Rodolfo Lopes de Paiva Cavalcanti

OS NÚCLEOS DOPAMINÉRGICOS DO MESENCÉFALO DO MOCÓ

(Kerodon rupestris): CARACTERIZAÇÃO CITOARQUITETÔNICA E

POR IMUNOISTOQUÍMICA PARA TIROSINA-HIDROXILASE

Dissertação apresentada à Universidade

Federal do Rio Grande do Norte, como pré-

requisito para obtenção do título de Mestre em

Psicobiologia.

Orientadora: Profª Drª Miriam Stela Maris de

Oliveira Costa

NATAL-RN

2011

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de

Biociências

Cavalcanti, José Rodolfo Lopes de Paiva

Os núcleos dopaminérgicos do mesencéfalo do mocó (kerodon

rupestris): caracterização citoarquitetônica e por imunoistoquímica para

tirosina-hidroxilase / José Rodolfo Lopes de Paiva Cavalcanti. – Natal,

RN, 2011.

64 f. : Il.

Orientadora: Profa. Dra. Miriam Stela Maris de Oliveira Costa.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do

Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em

Psicobiologia.

1. Roedores – Dissertação 2. Núcleos Dopaminérgicos do

Mesencéfalo – Dissertação. 3. Tirosina-hidroxilases – Dissertação. I.

Costa, Miriam Stela Maris de Oliveira. II. Universidade Federal do Rio

Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 599.322/.324

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TÍTULO: OS NÚCLEOS DOPAMINÉRGICOS DO MESENCÉFALO DO MOCÓ

(Kerodon rupestris): CARACTERIZAÇÃO CITOARQUITETÔNICA E POR

IMUNOISTOQUÍMICA PARA TIROSINA-HIDROXILASE.

AUTOR: José Rodolfo Lopes de Paiva Cavalcanti

DATA DA DEFESA: ____/____/______

BANCA EXAMINADORA:

Profª Drª Miriam Stela Maris de Oliveira Costa – Orientadora

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Profª Drª Belmira Lara da Silveira Andrade da Costa

Universidade Federal de Pernambuco

Prof. Dr. Expedito Silva do Nascimento Júnior

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

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AGRADECIMENTOS

A satisfação de vencer mais essa batalha e de chegar até aqui é inenarrável. Neste

processo de maturidade intelectual/pessoal, convivi com pessoas que de alguma maneira

marcaram esta caminhada. Sendo assim, não poderia deixar de expressar os meus sinceros

agradecimentos:

A Deus, sobretudo por garantir as circunstâncias favoráveis ao longo dessa

caminhada, mesmo tendo em troca as minhas frequentes negligências espirituais.

À minha esposa e amiga Dayane Pessoa. Nem que eu tivesse todo o restante das

páginas desta dissertação, eu seria capaz discorrer sobre o que representas para mim. Quem

diria que um namoro ingênuo, mergulhado no mais impressionante devaneio da inocência e

sustentado pelos imprescindíveis veículos de comunicação à distância, vingaria? Somos a

prova de que o amor vence barreiras e transcende o convencional. Por isso, costumo dizer que

na sua ausência eu sou apenas uma metade. Amo-te.

À minha família pelo amor e respeito fornecidos, em especial aos meus pais Gonçalo

Cavalcanti e Fátima Cavalcanti pelo exemplo de integridade e lisura, além de assegurarem

uma ótima criação aos seus filhos, priorizando sempre a educação, o respeito para com o

próximo e a valorização do “ser” em detrimento ao “ter”.

Ao meu irmão, Diogo Manuel, pela constante união e partilha de conhecimentos.

Às minhas tias, Socorro Medeiros e Luzia Cecília, assim como à minha prima

Juliêta Fernandes, pela garantia aqui em Natal-RN da extensão do meu lar. Certamente, na

ausência de vocês essa caminhada teria sido bem mais adversa.

À professora/orientadora Miriam Stela, por todo o ensinamento, pela paciência, pela

dedicação e, acima de tudo, pelo voto de confiança depositado em mim quando decidiu

aceitar-me como orientando, mesmo se conhecer meus princípios, meus propósitos, minha

história.

Ao grande amigo Fausto Guzen. Pessoas passam todos os dias nas nossas vidas, mas

são poucas as que permanecem. Você me estendeu a mão e me apresentou caminhos que

fortemente definiram o meu futuro. Viu em mim um profissional que jamais eu teria visto

diante do espelho e me trouxe à psicobiologia e, depois, à FACS. Por isso, considero-te como

uma extensão da minha família e saiba que diuturnamente trabalho(arei) para atestar que a sua

ajuda não foi em vão.

4

À turma do LabNeuro: André, pelo companheirismo e hospitalidade que foram

cruciais ao bom andamento das coisas aqui e, acima de tudo, pelo exemplo de determinação

frente às vicissitudes da vida. Joacil e Leandro, pelos momentos de descontração, sempre

sem perder de vista o cumprimento das responsabilidades, assim como pela constante

disposição em colaborar. Gilberto, um exemplo de serenidade e dedicação aos trabalhos.

Janaína, Rovena e Twyla pelas dúvidas esclarecidas, pelas caronas ofertadas e pela elevação

significativa nas taxas de colesterol e triglicerídeos em função das dietas nada saudáveis.

Kátia e Rayane, embora nossos contatos tenham sido poucos, cada uma demonstrou ao seu

modo o comprometimento indispensável ao bom profissional. Alane, que também é colega de

formação (Enfermagem), permanecerá com você a missão de mostrar aos demais enfermeiros

que a psicobiologia também pode ser um espaço nosso. Aos alunos e iniciação científica

Nayra, Kayo, Paulo e Melquisedec por todas as ajudas nos experimentos e pela manutenção

de um ambiente descontraído no laboratório.

Aos professores Expedito, Jeferson, Judney e Ruthnaldo pelas dúvidas

esclarecidas, pelas dicas e pela disponibilidade.

Ao Departamento de Morfologia – DMOR/UFRN pela garantia da infraestrutura

necessária a plena execução deste trabalho.

À Regina, pelo preparo das soluções, pela garantia da ordem do laboratório no

tocante à execução dos experimentos e pela relação amigável.

A todos os meus colegas do mestrado pela breve, mas significativa convivência.

Aos professores da Universidade do Estado do Rio Grande do Norte – UERN e da

Faculdade de Enfermagem Nova Esperança de Mossoró – FACENE/RN pelo incentivo a

concluir o mestrado e compreensão quando me fiz ausente.

Ao Ibama, pela autorização e licença para realização deste trabalho.

Ao CNPq e a CAPES pelo apoio financeiro.

5

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Esquema da síntese da noradrenalina;

Figura 2: Síntese da dopamina e seu armazenamento nas vesículas sinápticas;

Figura 3: Os núcleos dopaminérgicos no encéfalo do rato;

Figura 4: Corte coronal de mesencéfalo do rato, evidenciando os núcleos dopaminérgicos;

Figura 5: Famílias de receptores de dopamina;

Figura 6: O mocó em ambiente natural;

Figura 7: O mocó posicionado em aparelho estereotáxico e com alinhamento dorsoventral do

bregma e lambda;

Figura 8: O mocó posicionado em aparelho estereotáxico, após remoção da calota craniana;

Figura 9: Encéfalo do mocó em vistas dorsal e ventral;

Figura 10: Reconstrução esquemática das secções coronais do encéfalo do mocó;

Figura 11: Corte coronal do encéfalo do mocó (2,34mm p.b.) – Coloração pela técnica de

Nissl e imunorreatividade contra TH;











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Figura 18: Corte coronal do encéfalo do mocó (5,04mm p.b.) – N Coloração pela técnica de

issl e imunorreatividade contra TH;









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LISTA DE ABREVIATURAS

3-hidroxitiramina/dopamina – DA

Aqueduto cerebral - Aq

Área tegmental ventral – VTA/A10

Área tegmental ventral central – VTAc

Área tegmental ventral dorsal - VTAd

Área tegmental ventral dorsal caudal – VTAdc

Comissura do colículo superior - CSC

Comissura posterior - pc

Fascículo retroflexo – fr

Imunoistoquímica – IH

Lemnisco medial – ml

Núcleo das habênulas - Hb

Núcleo interpeduncular – IP

Núcleo linear caudal da rafe - Cli

Núcleo mamilar – Mn

Núcleo do n. oculomotor – 3N

Núcleo pontino - PN

Núcleo pré-comissural – Prc

Núcleo rubro - RN

Núcleo subtalâmico - STh

Núcleo supramamilar – SuM

8

Pedúnculo cerebral – cp

Projeções nigro-estriatais –ns

Susbstância cinzenta periaquedutal - PAG

Substância negra pars compacta – SNc/A9

Substância negra compacta dorsal – SNcd

Substância negra lateral – SNl

Substância negra medial – SNm

Substância negra reticulada - SNr

Susbtância negra ventral – SNv

Substância negra (cauda) – cSN

Terceito ventrículo – 3V

Tirosina-hidroxilase – TH

Trato rubroespinal - rs

Zona incerta - ZI

Zona retrorubral – RRF/A8

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SUMÁRIO

Conteúdo Página

RESUMO........................................................................................................ 10

ABSTRACT.................................................................................................... 11

1. INTRODUÇÃO................................................................................... 12

2. JUSTIFICATIVA................................................................................ 23

3. OBJETIVOS........................................................................................ 24

4. METODOLOGIA................................................................................ 25

4.1Sujeitos........................................................................................... 25

4.2 Anestesia........................................................................................ 26

4.3 Perfusão......................................................................................... 26

4.4 Remoção dos encéfalos................................................................. 26

4.5 Microtomia.................................................................................... 28

4.6 Método de Nissl............................................................................. 28

4.7 Imunoistoquímica.......................................................................... 29

4.8 Obtenção das Imagens................................................................... 30

5. RESULTADOS................................................................................... 31

6. DISCUSSÃO....................................................................................... 50

7. CONCLUSÕES................................................................................... 55

8. PERSPECTIVAS................................................................................ 56

REFERÊNCIAS

ANEXOS

10

RESUMO

A 3-hidroxitiramina/dopamina (DA) é uma monoamina do grupo das catecolaminas e consiste

na substância precursora da síntese de noradrenalina e adrenalina, tendo a enzima tirosina-

hidroxilase (TH) como reguladora deste processo. Os núcleos do mesencéfalo que expressam

DA são a zona retrorubral (RRF, grupo A8), a substância negra pars compacta (SNc, grupo

A9) e a área tegmental ventral (VTA, grupo A10). Tais núcleos estão envolvidos em três

complexas circuitarias, chamadas mesostriatal, mesolímbica e mesocortical, as quais estão

relacionadas diretamente com diversas manifestações comportamentais como controle da

motricidade, sinalização de recompensa na aprendizagem comportamental, motivação e nas

manifestações patológicas da Doença de Parkinson e esquizofrenia. O objetivo deste estudo

foi descrever a morfologia dos núcleos dopaminérgicos do mesencéfalo (A8, A9 e A10) do

mocó (Kerodon rupestris), um roedor pertencente à família Caviidae típico da região

Nordeste do Brasil, que está sendo adotado como modelo para estudos neuroanatômicos no

Laboratório de Neuroanatomia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Secções

coronais do encéfalo do mocó foram submetidas à coloração pelo método de Nissl e

imunoistoquímica contra tirosina-hidroxilase. A organização nuclear do sistema

dopaminérgico do mesencéfalo do mocó é muito semelhante ao que foi encontrado em outros

animais da ordem Rodentia, exceto na presença da cauda da substância negra, que foi

encontrada apenas na espécie em questão. Concluímos que os núcleos dopaminérgicos do

mesencéfalo são filogeneticamente estáveis entre as espécies, porém percebemos a

necessidade de se ampliar os estudos acerca da particularidade encontrada no mocó, seja

investigando a sua ocorrência em outras espécies de roedores, seja investigando a sua

relevância funcional.

Palavras-chave: Mesencéfalo; Dopamina; Tirosina-hidroxilase; Núcleos Dopaminérgicos do

Mesencéfalo; Mocó; Roedores.

11

ABSTRACT

The 3-hydroxytyramine/dopamine (DA) is a monoamine of catecholamineric group and

consists in the progenitor substantia of synthesis of noradrenaline and adrenaline, having the

enzyme tyrosine hydroxylase as a regulator of this process. Nuclei of midbrain expressing DA

are the retrorubral field (RRF, A8 group), the substantia nigra pars compacta (SNc, A9 group)

and the ventral tegmental area (VTA, A10 group). These nuclei are involved in three complex

circuitry called mesostriatal, mesocortical and mesolimbic, which are related directly with

various behavioral manifestations such as motor control, reward signaling in behavioural

learning, motivation and pathological manifestations of Parkinson’s disease and

schizophrenia. The aim of this study was describe the morphology of midbrain dopaminergic

neurons (A8, A9 and A10) of the rock cavy (Kerodon rupestris), a rodent belonging to the

family Caviidae typical of the Brazilian Northeast, which is being adopted as a model for

neuroanatomical studies in laboratory of neuroanatomy of the Federal University of Rio

Grande do Norte. Coronal sections of brains of the rock cavies were submitted to staining by

Nissl’s method and immunohistochemistry against tyrosine hydroxylase. The nuclear

organization of the midbrain dopaminergic nuclei of the rock cavy is very similar to that

found in other animals of the order Rodentia, except by the presence of the tail of substantia

nigra, which was found only in the studied species. We concluded that the midbrain

dopaminergic nuclei are phylogenetically stable among species, but we think to be it

necessary to expand the studies about the particularity found the rock cavy, investigating its

occurrence in other species of rodents or investigating its functional relevance.

Keywords: Midbrain; Dopamine; Tyrosine Hydroxylase; Midbrain Dopaminergic Nuclei;

Rock Cavy; Rodents.

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1. INTRODUÇÃO

1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS ACERCA DA DOPAMINA ENQUANTO

NEUROTRANSMISSOR

A 3-hidroxitiramina/dopamina (DA) é uma substância resultante da ação da enzima

DOPA-descarboxilase (ou aminoácido aromático descarboxilase, AADC) sobre a di-hidroxi-

fenilalanina (DOPA), a qual deriva da tirosina por ação da tirosina-hidroxilase (TH) (Marín et

al., 2005; Chen et al., 2008). O desempenho eficaz da TH só ocorre na presença de um co-

fator chamado 6-tetrahidrobiopterina (BH4), cuja síntese é modulada pela enzima GTP-

ciclohidrolase I (GTPCHI) (Nagatsu e Ichinose, 1999). Por sua vez, a dopamina é precursora

da noradrenalina, sob ação da enzima dopamina-beta-hidroxilase (Nagatsu et al.,1964) (Fig.

1).

Figura 1. Esquema de síntese da noradrenalina.

Somente em 1958, depois de uma série de estudos, Arvid Carlsson e seus

colaboradores constataram que a DA, além de ser precursora da noradrenalina e da adrenalina,

possuía a capacidade de atuar como neurotransmissor no sistema nervoso central (Björklund e

Dunnett, 2007a). Como tal, a DA é uma monoamina que se encontra no grupo das

catecolaminas, juntamente com a noradrenalina e adrenalina, e é um dos principais

neurotransmissores na modulação da função cerebral, tendo portanto desempenhado um papel

crucial na adaptação do comportamento animal ao longo da evolução (Jones e Pilowski, 2002;

Yamamoto e Vernier, 2011).

Fenilalanina Tirosina tirosina-hidroxilase

DOPA

DOPA - descarboxilase

Dopamina

dopamina-beta-hidroxilase

Noradrenalina

13

Depois de sintetizada, a DA é armazenada nas vesículas sinápticas pela ação da

monoamina vesicular transportadora 2 (VMAT2) (Lowlor e During, 2004) (Fig. 2). Finalizada

a sua atuação nos receptores pós-sinápticos, cerca de 30% da DA é metabolizada na própria

fenda pela ação das enzimas catecol-O-metiltransferase (COMT) (Goole e Amighi, 2009),

enquanto a maioria, cerca de 70%, é recaptada na fenda por meio da ação do transportador

dopaminérgico (DAT), uma glicoproteína cuja ação depende diretamente da atividade elétrica

relacionada ao Na+ e Cl-, podendo então ser metabolizada por intermédio da mono-amino-

oxidase (MAO) ou mesmo rearmazenada em vesículas pela VMAT2 para utilização posterior

(Jaber et al, 1997; Ben-Jonathan e Hnasko, 2001; Marshall e Grosset, 2003; Shih et al, 2006).

Figura 2. Síntese da dopamina e seu armazenamento nas vesículas sinápticas (Modificado de

Lowlor e During, 2004)

É importante considerar que, embora inespecífica, nos últimos anos, a expressão de

TH em amostras encefálicas tem sido amplamente utilizada como marcador molecular de DA

neuronal (Prakash e Wurst, 2006).

1.2 OS NÚCLEOS DOPAMINÉRGICOS NO ENCÉFALO

14

Núcleos específicos no encéfalo produzem DA e a utilizam como neurotransmissor.

Estudos anteriores identificaram dez núcleos encefálicos que foram codificados de A8-A17,

sendo: A8 – Zona retrorrubral; A9 – Substância negra pars compacta; A10 – Área tegmental

ventral; A11 ao A14 – Grupos hipotalâmicos; A15 – Hipotálamo ventral e lateral/Área

retroquiasmática; A16 – Células periglomerulares do bulbo olfatório; A17 – Células

interplexiformes da retina (Dahlström e Fuxe, 1964; Kandel et al., 2000; Márin et al., 2005)

(Fig. 3).

Figura 3. Esquema evidenciando os núcleos dopaminérgicos no encéfalo do rato (Modificado

de Kandel et al., 2000; Björklund e Dunnett, 2007b).

Os núcleos mesencefálicos A8-A10, serão mais bem estudados no decorrer deste

trabalho. Porém, é importante comentar mesmo que resumidamente acerca das demais regiões

dopaminérgicas do encéfalo, uma vez que estas também são importantes para o

estabelecimento de alguns padrões comportamentais.

O grupo diencefálico A11, núcleos do hipotálamo posterior, envia projeções para

áreas autonômicas da porção inferior do tronco encefálico e medula espinal cujas funções não

estão bem esclarecidas. O grupo A13, zona incerta, se projeta para áreas remotas da amígdala

e de modo difuso para diferentes áreas do hipotálamo, participando essencialmente no

controle da liberação do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH). Tais núcleos

correspondem à maioria dos neurônios dopaminérgicos existentes no hipotálamo (Moore e

Lookingland, 2000; Ben-Jonathan e Hnasko, 2001; Prakash e Wurst, 2006).

15

O núcleo arqueado (A12) se projeta tanto para a zona externa da eminência mediana

(próximo aos capilares primários do plexo portal hipofisário), formando o trato túbero-

infundibular, quanto para a neurohipófise e lobo intermediário formando o trato túbero-

hipofisário. Além disso, o núcleo peri/paraventricular (A14) também se projeta para o lobo

intermediário da hipófise, originando o trato periventricular-hipofisário. Ambos os núcleos,

com suas respectivas projeções, estão diretamente voltados para o controle da secreção de

prolactina (Freeman et al., 2000).

O grupo A15 ocupa as áreas ventral e lateral do hipotálamo (Ben-Jonathan e Hnasko,

2001), embora alguns autores refiram que tal grupo ocupa a área retroquiasmática (Tillet et

al., 2000; Goodman et al., 2010) ou até mesmo o tubérculo olfatório (Kandel et al., 2000).

Apesar das divergências quanto à disposição anatômica, estudos têm demonstrado que o A15

possui uma complexa circuitaria, prova disso é a série de aferências que este núcleo possui

com destaque para os núcleos septal lateral, da estria terminal, paraventricular do tálamo,

entre outras (Tillet et al., 2000). No que se refere à sua fisiologia, acredita-se que o mesmo

esteja envolvido em diversas atividades como no controle do metabolismo da pineal (Cipolla-

Neto et al, 1999) e no comportamento reprodutivo (Goodman, 1996; Goodman et al., 2010).

Por fim, o grupo das células periglomerulares do bulbo olfatório (A16), assim como

o grupo das células interplexiformes (amácrinas) da retina (A17), consistem em grupos de

interneurônios dopaminérgicos (Prakash e Wurst, 2006). Quanto à fisiologia desses núcleos, o

A16 está envolvido no processamento primário e refinamento sensorial no epitélio olfativo

(Baltanás et al, 2011). Já o A17 participa da regulação do RNA mensageiro que controla a

síntese de melanopsina (fotopigmento produzido pelas células ganglionares intrinsecamente

fotossensíveis), assim como adaptação à luz, sensibilidade ao contraste e acuidade visual

(Besharse et al., 1988; Djamgoz et al., 1997; Iuvone et al., 2005).

1.3 OS NÚCLEOS DOPAMINÉRGICOS DO MESENCÉFALO

Dentre os núcleos dopaminérgicos, merecem destaque aqueles situados no

mesencéfalo, para os quais os estudos nas últimas décadas atestaram o seu envolvimento na

determinação comportamental do indivíduo em controle motor, motivação, cognição,

recompensa e em algumas desordens neurológicas e/ou psiquiátricas (German e Manaye,

1993; Björklund e Dunnett, 2007a). Tais núcleos localizam-se na zona retrorubral (RRF),

16

substância negra pars compacta (SNc) e área tegmental ventral (VTA) (A8, A9 e A10,

respectivamente) (Dahlström e Fuxe, 1964; German e Manaye, 1993; François et al., 1999;

Smith e Kieval, 2000; Björklund e Dunnett, 2007b) (Fig. 4), os quais constituem objeto do

presente estudo.

Figura 4. Corte coronal em nível de mesencéfalo caudal, com imunoistoquímica para TH,

evidenciando os três núcleos dopaminérgicos mesencefálicos do rato (Modificado de German

e Manaye, 1993).

Os núcleos dopaminérgicos mesencefálicos estão no centro de três complexas

circuitarias denominadas mesostriatal, mesocortical e mesolímbica. Convencionalmente, se

afirma que o grupamento A9 projeta-se para o striatum (via nigroestriatal), ao passo que o

grupamento A10 projeta-se para a área límbica e cortical (vias mesolímbica e mesocortical,

respectivamente), formando vias bem definidas (Fallon e Moore, 1978). Contudo, sabe-se

hoje que a SNc possui eferências não só para o striatum, mas para áreas límbicas e corticais,

assim como a VTA não apresenta somente projeções límbicas/corticais, mas também

projeções para o striatum (Loughlin e Fallon, 1984; Björkund e Dunnett, 2007b). Quanto ao

grupamento A8, este forma uma extensão dorso-caudal do grupamento A9 e também emite

projeções para as três áreas, por exemplo como ocorre com o caso da amígdala

17

especificamente em primatas que recebe projeções dos três núcleos dopaminérgicos

(Bentivoglio e Morelli, 2005; Cho e Fudge, 2010).

A via mesostriatal está envolvida no controle dos movimentos e sua degeneração

pode levar a doenças como a de Parkinson (Stochi, 2009). A via mesocortical, que inerva

diversas regiões do córtex frontal, incluindo córtex pré-frontal e córtex cingulado anterior,

parece estar envolvida em aspectos da memória e aprendizagem (Chinta e Andersen, 2005;

Walton et al., 2005; Pritchard et al., 2009). Muitos estudos têm demonstrado que alterações na

via mesocortical estão diretamente relacionadas às manifestações clínicas expressas na

esquizofrenia (Sesack e Carr, 2002; Fallon et al., 2003).

Já a via mesolímbica projeta-se para o estriado ventral (núcleo accumbens), o

tubérculo olfatório e outras partes do sistema límbico como amígdala, hipocampo, área septal

e córtex pré-frontal medial. Esta via foi implicada no comportamento motivacional (Pierce e

Kumaresan, 2006; Chen et al., 2009). Convém ressaltar que estudos hodológicos demonstram

que há certa sobreposição entre as vias mesocortical e mesolímbica, o que permite alguns

pesquisadores aglutiná-las em uma via única chamada de mesocorticolímbica (Wise, 2004).

No intuito de compreender melhor os aspectos morfofuncionais desses núcleos,

estudos de caráter citoarquitetônico e neuroquímico vem sendo conduzidos ao longo dos anos

e em diversas espécies, seja de roedores ou mesmo primatas (Liang et al., 1996; McRitchie et

al., 1998; Nemoto et al., 1999).

1.4 OS RECEPTORES DOPAMINÉRGICOS E SUA RELAÇÃO COM ALGUMAS

RESPOSTAS COMPORTAMENTAIS

Com relação aos receptores específicos onde a DA poderá realizar ligação, vale

destacar que são cinco subtipos e os mesmos estão agrupados, por critérios bioquímicos,

farmacológicos e fisiológicos, em dois grupos: D1 e D2 (Kebabian e Calne, 1979). O grupo

de receptores D1 é composto pelos subtipos D1 e D5, já o grupo D2 é constituído pelos

subtipos D2, D3 e D4 (De La Mora et al., 2009). Essa classificação se baseia no mecanismo

de transdução. O grupo D1 estimula a adenilato-ciclase, aumentando os níveis intracelulares

de AMP cíclico, enquanto o grupo D2 inibe essa enzima levando a redução intracelular do

AMP cíclico (Fig. 5) (Seeman e Vantol, 1994; Jaber et al., 1996; Missale et al., 1998; Silva,

2007).

18

Figura 5. Famílias de receptores de dopamina. Modificado de Golan, 2009.

Os receptores dopaminérgicos dos tipos D1, D2 e D5 estão localizados

principalmente no striatum, sistema límbico e bulbo olfatório, bem como nos córtices pré-

frontal, pré-motor, cingulado e entorrinal, sendo o D5 o de menor expressão nas áreas já

citadas. Já os subtipos D3 e D4 restringem-se à área límbica (Cave e Baker, 2009). Entretanto,

outro estudo, que aponta a participação direta desses receptores D4 na circuitaria dos núcleos

da base, concluiu que a dopamina tem duas ações sobre a liberação de GABA na substância

negra pars reticulada (SNr): estimulando a liberação de GABA quando ativados os receptores

D1 (terminações da via estriatonigral) e inibindo a liberação de GABA quando ativados os

receptores D4 (terminações palidonigrais) (Acosta-García et al., 2009).

Percebe-se, pois, que ambos os subtipos D1 e D2 estão presentes em altas

concentrações no striatum, onde desempenham um importante papel na regulação da

atividade motora. Além disso, os receptores D2 também são encontrados em níveis elevados

nos lactótrofos da adeno-hipofise, onde regulam a secreção de prolactina. Os receptores D3 e

D4 estão relacionados a nível estrutural quanto funcional sendo também responsáveis pela

patogenia da esquizofrenia. No sistema límbico, há uma grande quantidade de receptores D3,

enquanto no córtex frontal, diencéfalo e tronco encefálico encontram-se receptores do tipo

19

D4. Os receptores D5 encontram-se em baixos níveis, principalmente no hipocampo e

tubérculo olfatório (Sokoloff e Schwartz, 1995; Hardman et al., 2007).

Retomando a discussão, evoca-se uma das maiores relevâncias atinentes aos

receptores dopaminérgicos que se trata do envolvimento dos subtipos D1 e D2 na circuitaria

neuronal dos núcleos da base, cuja função reside na modulação da motricidade (Deongaokar e

Subramanian, 2005).

Neste caso, os efeitos da DA nos núcleos da base ocorrem mediante a interação com

os receptores D1 e D2. Os receptores D1 modulam principalmente os neurônios da via direta,

enquanto os D2 estão localizados nos neurônios estriato-palidais da via indireta. Deste modo,

a ativação de D1 ativa a via excitatória e a ativação de D2 inibe a via inibitória, o que

favorece a realização do movimento (Gerfen, 2003; Siegel, 2006).

Na doença de Parkinson, por exemplo, a degeneração dos neurônios dopaminérgicos

da SNc acarreta alteração da capacidade de elaborar movimentos automáticos, semi-

automáticos, tônus postural e habilidade de movimentos, evidenciando sinais clínicos como

tremor, bradicinesia, rigidez e instabilidade postural (Doyon, 2008).

1.5 O MODELO EXPERIMENTAL

O mocó (Kerodon rupestris) é um roedor nativo da região semi-árida, podendo ser

encontrado em vários estados do Nordeste e norte de Minas Gerais, habitando

preferencialmente a caatinga do semi-árido do Nordeste Brasileiro (Cabrera, 1961; Lacher Jr.,

1981).

Taxonomicamente é classificado como representante do filo Chordata, subfilo

Vertebrata, superclasse Gnathostomata, classe Mammalia, subclasse Theria (mamíferos

avançados), infraclasse Eutheria (mamíferos placentários), superordem Glires, ordem

Rodentia, (Storer e Usinger, 1971), subordem Hystricognathi, infraordem Caviomorpha,

superfamília Cavioidea (Carleton, 1984), família Caviidae, subfamília Caviinae, gênero

Kerodon (mocós) (Moojen, 1952).

Animais da familia Caviidea são dotados de uma grande versatilidade de adaptação

aos mais diversos tipos de ambientes, embora se caracterizem como mamíferos terrestres,

podendo ser arborícolas, rupícolas e terrícolas. Tendo a dentição desprovida de caninos, esses

20

animais costumam ser herbívoros. Além disso, possuem três dedos nos membros pélvicos e

cauda completamente atrofiada (Moojen, 1952).

A subfamilia Caviinae é composta por quatro gêneros: Kerodon, Galea, Cavia e

Microcavia. A este grupo pertencem pequenos animais já reconhecidamente domésticos,

como porquinho da índia (Cavia porcellus). Geralmente vivem em pequenas colônias feitas

em buracos na terra ou usam cavidades nas bordas das rochas. Possuem hábitos gregários e

diurnos (Crandall, 1964).

Estudos morfológicos (Silva Neto, 2000) e de biologia molecular (Rowe e

Honeycutt, 2002) firmaram o gênero Kerodon irmanado com a família Hydrochaeridae, à qual

também pertence a capivara (Hydrochaeris) e estreitamente alinhado com a subfamília

Dolichotinae.

O mocó é um animal facilmente adaptado às condições ecológicas locais como o

calor, a escassez de água e de alimentos, principalmente nos períodos das grandes secas nas

regiões do semi-árido nordestino. Habitam locais rochosos com inúmeras fendas onde se

abrigam dos predadores e passam boa parte de seu tempo. Além disso, são excelentes

saltadores e conseguem escalar rochas e galhos de árvores, de onde extraem a sua

alimentação, composta principalmente de cascas de árvores, ou na falta destas, gramíneas em

geral, sendo as árvores mais procuradas o mufumbo (Cobretum leprosum), faveleira

(Cnidoscolus phyllacanthus) e a parreira brava (Cissampelos pareira), ao contrário de outros

caviinaes que possuem hábitos terrestres e comem relva (Carvalho, 1969; Lacher, 1981;

Mendes, 1985; 1987). Já em cativeiro, aceitam bem frutas (maçã, banana, melão, melancia,

manga) e raízes.

Sua coloração é cinza clara com pelos pretos e amarelos ou esbranquiçados na região

dorsal, castanho-ferruginoso na região caudal e um pouco acastanhada nas patas e branco na

região cervical. As patas são dotadas de coxins calosos pouco excedidos pelas unhas rígidas

que lhes dão habilidades de escalar e saltar (Moojen, 1952). Tem olfato e audição muito

aguçados, podendo detectar seu predador a uma longa distância (Carvalho, 1969). Atingem a

fase adulta aos 200 dias, podendo atingir até 50 cm de comprimento e 1 quilo de peso

corporal (Moojen, 1952; Carvalho, 1969; Roberts et al., 1984).

Espécies do gênero Kerodon diferem quanto ao padrão reprodutivo observado em

outros gêneros próximos relacionados. Na história de vida dos cavinnaes, Kerodon tem a

gestação mais longa (65 ±1,34 dias), a menor média no tamanho da ninhada (1,28 ± 0,09), o

21

mais baixo peso de filhotes e o mais longo tempo para a maturidade sexual (Roberts et al.,

1984). Além disso, apresenta o peso médio da matriz pós-parto em torno de 724,73 ± 13,08 g

e 6,89% de abortos (Pinheiro et al., 1985). A reprodução ocorre durante todo o ano, não

apresentando sazonalidade, com exceção do período que vai de abril a junho. As fêmeas

apresentam um cio pós-parto, podendo acasalar poucas horas após o parto. Apesar das poucas

crias por parto, o curto período gestacional garante uma elevada produção de crias durante o

ano (Lacher, 1981).

Quanto ao padrão de atividade locomotora, tem sido relatado que nos dias mais

escuros o mocó sai para se alimentar pela manhã e à tarde, enquanto que nos dias mais claros

sua atividade se concentra no período noturno, podendo também durar o dia inteiro na

ocorrência de chuvas (Carvalho, 1969). Outras observações dão conta de que o mocó sai para

forragear ao longo do dia e da noite (Lacher, 1981). Contudo, estudos conduzidos por Sousa e

Menezes (2006), mostraram que, embora o mocó apresente atividade ao longo de 24 horas,

esta se concentra nos períodos de transição de fases claro-escuro, sugerindo um

comportamento predominantemente crepuscular.

Figura 6. O mocó (Kerodon rupestris) em ambiente natural. Fonte: LabNeuro.

Certamente as características morfofuncionais e os hábitos comportamentais dos

mocós lhes garantem singularidades quando comparados com outros animais da ordem

22

Rodentia. Por essas características, o mocó está sendo adotado como modelo para estudos

neuroanatômicos no Laboratório de Neuroanatomia da Universidade Federal do Rio Grande

do Norte – UFRN, já tendo gerado alguns produtos.

Assim, este animal foi utilizado em trabalhos de caracterização citoarquitetônica,

neuroquímica e hodológica dos principais componentes do sistema de temporização

circadiana (STC) – o núcleo supraquiasmático e o folheto intergeniculado (Nascimento Jr. et

al., 2010a). Outros trabalhos realizados no laboratório tratam da descrição das projeções

retinianas aos núcleos paraventricular e mediodorsal do tálamo, como parte integrante do

sistema não-formador de imagem (Nascimento Jr. et al., 2008; Nascimento Jr. et al., 2010b).

Além destes, foi realizado um estudo de projeções retinianas, utilizando a subunidade b da

toxina colérica – CTb, para os componentes do sistema visual primário e do sistema óptico

acessório (Silva, 2009), assim como outro estudo relacionado a identificar/caracterizar, por

meio de imunoistoquímica para serotonina (5-HT), os núcleos da rafe no encéfalo (Soares,

2010). Por fim, encontra-se em andamento uma pesquisa que objetiva a caracterização

anatômica e neuroquímica da retina do mocó e sua relação direta com o STC deste animal

(Oliveira et al. 2010). A meta a longo prazo é torná-lo um modelo para estudos experimentais

nas áreas de comportamento e fisiologia, para os quais os estudos neuroanatômicos fornecem

embasamento essencial.

23

2. JUSTIFICATIVA

As pesquisas supracitadas evidenciam a necessidade de melhor se explorar vários

outros componentes do sistema nervoso deste animal e a relevância do presente estudo

justifica-se, também, pelo incontestável papel dos núcleos dopaminérgicos do mesencéfalo

em diversas modalidades comportamentais.

Diante disso, emerge a necessidade de se explorar as bases neuroanatômicas e

neurofisiológicas envolvidas em tais processos, na perspectiva constante de contribuir para a

ampliação dos estudos já concluídos e/ou em andamento que buscam compreender muitos dos

aspectos comportamentais deste animal tão pouco explorado e tão peculiar à região Nordeste,

assim como com a construção de conhecimentos em diversos âmbitos das Neurociências.

24

3. OBJETIVOS

3.1 Geral

Caracterizar morfológica e imunoistoquimicamente os núcleos dopaminérgicos

(grupamentos A8, A9 e A10) do mesencéfalo do mocó (Kerodon rupestris).

3.2 Específicos

Identificar, mediante imunoistoquímica para TH, os núcleos dopaminérgicos do

mesencéfalo do mocó;

Descrever a configuração desses núcleos, baseado nas descrições para o rato;

Delimitar a citoarquitetura desses núcleos, a partir do método de Nissl.

25

4. METODOLOGIA

Trata-se de um trabalho vinculado ao Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia,

cujos procedimentos foram realizados, em sua totalidade, no laboratório de Neuroanatomia,

vinculado ao Departamento de Morfologia – DMOR/UFRN.

4.1 Sujeitos

Quatro animais adultos jovens, sendo dois machos e duas fêmeas, foram utilizados

no experimento. Em virtude da desativação temporária do criadouro científico desta espécie

que é o Centro de Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS), localizado na Universidade

Federal Rural do Semi-árido (UFERSA) em Mossoró-RN, assim como dos criadouros

comerciais existentes ainda não disporem da geração F2, os animais foram obtidos por meio

de captura no município de Serra Negra do Norte, RN, mediante a devida autorização do

Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e Recursos Naturais Renováveis – IBAMA (licença

SISBIO nº 22403-1). O processo de captura deu-se por meio de armadilhas e/ou contenção

química (ketamina + xilazina), para minimizar o estresse causado ao animal.

Depois de capturados, os animais foram acomodados no Centro de Biociências da

UFRN em um ambiente construído de alvenaria e telas em arame cujas dimensões são de 3,0

x 2,0 x 2,6 m, submetidos à temperatura, luminosidade e umidade naturais e comida/água ad

libitum. Somente no dia anterior ao experimento os animais foram transferidos para gaiolas,

medindo 0,90 x 0,60 x 0,75m. Os mesmos foram utilizados gradativamente, conforme as

necessidades de execução dos experimentos da pesquisa.

Convém ressaltar que os animais utilizados nesse projeto foram os mesmos de outro

projeto em andamento no laboratório, previamente aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de

Animais (CEUA), voltado para a caracterização anatômica e neuroquímica da retina do mocó

e sua relação direta com o STC. Por tal motivo, este trabalho foi aprovado pelo CEUA como

uma extensão do Protocolo 015/2009.

Todos os cuidados foram tomados no sentido de evitar dor e sofrimento aos animais

durante os procedimentos experimentais, seguindo estritamente as normas estabelecidas pela

National Research Council of the National Academy publicadas no livro “Guidelines for the

Care and Use of Mammals in Neuroscience and Behavioral Research”. Visitando o site da

Sociedade Brasileira de Neurociência e Comportamento – SBNeC

(http://www.sbnec.gov.br/links) é possível encontrar uma versão no formato pdf.

http://www.sbnec.gov.br/links

26

4.2 Procedimentos

4.2.1 Anestesia

Foram administrados por via intramuscular, os medicamentos cloridrato de tramadol

e xilazina, ambos na dose de 5 (cinco) mg/Kg, como medida pré-anestésica. O tramadol é um

opióide necessário para potencializar o efeito da analgesia adequada ao procedimento e a

xilazina é um relaxante muscular. Decorridos 10 minutos da conduta pré-anestésica, o animal

é induzido e mantido em anestesia inalatória com isoflurano e oxigênio 100% administrado

através de máscara, até que o animal atinja o plano anestésico, ou seja, 3º. plano do 3º. estágio

de Guedel (Massone, 2008).

4.2.2 Perfusão

Atingido o plano anestésico, cada animal foi submetido à perfusão transcardíaca, que

compreende os seguintes passos:

1. Posicionamento do animal em decúbito dorsal sobre tela de arame e sob ponto de água.

2. Toracotomia, com incisão de pele, músculos e arco costal, sendo estes removidos em

bloco, para exposição do coração.

3. Cardiopunção no ventrículo esquerdo, utilizando uma agulha de dimensões 17mm x 1,5

mm, a qual é direcionada para o cone arterioso, seguindo-se uma incisão no átrio direito. A

agulha foi conectada a uma bomba peristáltica (Cole-Parmer), passando-se 300 ml de solução

salina a 0,9% em tampão fostato 0,1M, pH 7,4 com heparina (Parinex, Hipolabor, 2ml/1000

ml de solução salina) durante um tempo estimado de seis minutos. Em seguida, foram

infundidos 700 ml de solução fixadora composta por paraformaldeido 4%, glutaraldeído

0,05% e ácido pícrico 0,2% em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4 (Zamboni e Di Martino, 1967),

passando-se metade desta solução a um fluxo de 6,0 ml por minuto e a outra metade a 3,0 ml

por minuto, durando todo procedimento em torno de três horas.

4.2.3 Remoção dos Encéfalos

Finalizada a etapa de perfusão, os animais foram posicionados no aparelho

estereotáxico para roedores. Depois de se fazer uma incisão longitudinal na pele e rebatê-la

lateralmente, fez-se a limpeza da superfície óssea, facilitando a visualização do bregma e do

27

lambda, os quais ficaram nivelados na mesma altura dorsoventral, ajustando-se a barra dos

incisivos, padronizando assim o plano de corte coronal para todos os animais (Fig. 7). Após

anotação das coordenadas do bregma e do lambda, o osso da calota craniana foi removido

com o uso de broca e trocater, expondo-se o encéfalo. Ainda no aparelho estereotáxico, o

encéfalo foi seccionado em três blocos através de duas secções coronais: uma no nível do

bregma e a outra no nível do lambda (Fig. 8).

Figura 7. Mocó posicionado em aparelho estereotáxico e com alinhamento dorsoventral do

bregma e lambda.

Figura 8. Mocó posicionado em aparelho estereotáxico, após remoção da calota craniana e

consequente exposição do encéfalo. Realização dos cortes coronais em nível de bregma e

lambda para formação dos blocos padronizados.

28

Os encéfalos foram retirados delicadamente para evitar danos, preservando os olhos

e nervos ópticos (uma vez que estes animais foram também utilizados em outra pesquisa) e

em seguida medidos (da extremidade anterior do bulbo olfatório ao limite bulbo-espinal) e

fotografados. Logo após esta etapa, os três blocos foram armazenados, por um período entre

24 e 48 horas, em uma solução de contendo sacarose a 30% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4,

a 4 ºC, para então serem submetidos à microtomia (cortes coronais).

4.2.4 Microtomia

Os encéfalos foram submetidos à microtomia cuja espessura dos cortes foi

padronizada em 30 µm.

Os encéfalos foram congelados por gelo seco e seccionados em micrótomo de

deslizamento, obtendo-se secções coronais. Estas foram coletadas em um meio líquido de

tampão fostato 0,1M, pH 7,4, distribuídas seqüencialmente em seis compartimentos, de

maneira cíclica e seqüenciada, de modo a manter a distância entre uma secção e a outra

imediatamente seguinte de um mesmo compartimento de aproximadamente 180 µm.

Os cortes de um compartimento foram imediatamente montados em lâminas de vidro

gelatinizadas e submetidas à coloração pelo método de Nissl para permitir uma melhor

demarcação das estruturas. Os cortes dos demais compartimentos foram transferidos para

solução anticongelante e conservados a -20 ºC para utilização posterior em procedimentos de

imunoistoquímica.

4.2.5 Método de Nissl

A coloração pelo método de Nissl é constituída por uma série de etapas que se

iniciam com a desidratação do tecido passando-o em concentrações crescentes de alcoóis

etílicos (70% - 1 vez, por 1 h, 95% - 2 vezes, 3 minutos cada, 100% - 2 vezes, 3 minutos

cada). Posteriormente são deslipidificados em dois recipientes com xilol, por 3 e 30 minutos,

nessa ordem. Na seqüência, o tecido é reidratado em concentrações decrescentes de álcoois

(mesmo processo anterior, mas no sentido inverso), submergido em água destilada por 2

minutos, colocado 30 a 40 segundos na solução de tionina a 0,25%. Por fim os cortes foram

rapidamente submergidos e emergidos 10 vezes em água destilada e novamente desidratados

e deslipidificados como descrito anteriormente, sendo acrescentada apenas uma etapa (antes

da desidratação em álcool 100%) de imersão do tecido numa solução contendo álcool a 95%

29

e ácido acético a 1%, por 3 segundos. Os cortes foram deslipidificados em xilol em dois

recipientes (2 e 4 minutos, respectivamente) e finalmente cobertos com lamínula utilizando

como meio demontagem o DPX.

4.2.6 Imunoistoquímica

Devido a grande concentração de aldeídos contidos no fixador (Zamboni e De

Martino, 1967) utilizado na perfusão do animal, precedendo a técnica de imunoistoquímica,

os cortes foram submetidos a um pré-tratamento para recuperação da antigenicidade, sendo

colocados em solução de boridreto de sódio a 1% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, durante

15 minutos, a qual tem a propriedade de retirar o excesso de aldeídos dos tecidos. O pré-

tratamento também incluiu uma etapa de incubação em peróxido de hidrogênio (H2O2) a 0,3%

em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 por cinco minutos, com a finalidade de abolir artefatos

causados pela liberação de peroxidases endógenas. No início, entre as soluções e ao final

desta fase, os cortes foram submetidos a seis lavagens de cinco minutos cada em tampão

fosfato 0,1 M, pH 7,4.

O próximo passo consistiu na incubação dos cortes em anticorpo primário, isto é,

uma solução formada pelo anticorpo anti-TH obtido em camundongo (Sigma) em diluição de

1:10.000, acrescido de soro normal de asno a 2% em Triton X-100 a 0,4% permanecendo em

incubação por 12 a 72 horas em rotor com rotação lenta.

Ao fim deste período, os cortes passaram por seis lavagens em tampão fosfato 0,1 M

pH 7,4, em agitador orbital e em seguida colocados em contato com o anticorpo secundário

anti-camundongo obtido em asno (Jackson) diluído a 1:1000 no mesmo veículo anterior, por

120 minutos à temperatura ambiente, sob agitação lenta, em rotor.

Em seguida, os cortes passaram por seis lavagens em tampão fosfato 0,1 M em

agitador orbital e depois colocados na solução do complexo avidina-biotina-HRP (Protocolo

ABC, Kit elite da Vector), numa diluição de 1:100 em Triton X-100 a 0,4%, contendo NaCl ,

por 120 minutos à temperatura ambiente, sob agitação lenta, em rotor. Terminada esta fase, as

secções foram novamente submetidas a seis lavagens em tampão fosfato 0,1 M em agitador

orbital.

Para visualização da reação, as secções foram postas em meio contendo H2O2 como

substrato e a 3,3’,4,4’tetrahidrocloreto-diaminobenzidina (DAB), utilizada como cromógeno.

30

A H2O2 foi oferecida indiretamente, colocando-se na solução glicose oxidase e D-glicose,

provocando uma reação em que a primeira agindo sobre a segunda libera H2O2 (Itoh et al.,

1979). Esta reação dura em torno de 15 minutos e após esta, os cortes foram submetidos a

mais seis lavagens em tampão fosfato 0,1 M em agitador orbital.

Os cortes foram então montados em lâminas gelatinizadas, que após secas foram

imersas em solução de tetróxido de ósmio a 0,05% com o intuito de intensificar a reação.

Após as etapas de desidratação, em baterias de álcool de graduação crescente até o álcool

absoluto, e diafanização em xilol, as lamínulas foram montadas sobre os cortes com o uso de

DPX.

Como controle, algumas secções foram submetidas ao protocolo específico de

imunoistoquímica, com a omissão do anticorpo primário.

4.2.7 Obtenção das imagens

As secções do mesencéfalo, coradas pelo método de Nissl e/ou submetidas à

imunoistoquímica para TH foram examinadas ao microscópio óptico (Olympus BX41) em

campo claro. Imagens digitais foram obtidas de secções representativas usando uma

videocâmara digital (Nikon DXM1200). As imagens foram analisadas, corrigidas

minimamente para brilho e contraste, montadas usando o programa Adobe Photoshop CS5®

e os desenhos esquemáticos foram montados no software Adobe Illustrator CS5®. Os

resultados foram documentados em fotomicrografias e esquemas construídos a partir das

mesmas.

31

5. RESULTADOS

O comprimento rostro-caudal do encéfalo, da extremidade anterior do bulbo olfatório

ao limite bulbo-espinal, foi em média 3,63 cm (Fig. 9).

Com base na imunoistoquímica para TH, aliada à técnica de Nissl, foi possível

estabelecer os limites anatômicos, assim como a citoarquitetura e possíveis subdivisões, dos

três núcleos dopaminérgicos do mesencéfalo. Para facilitar a compreensão, foram feitos

esquemas ilustrativos que demonstram as estruturas encefálicas sequenciadamente (Fig. 10).

Figura 9. Encéfalo do mocó em vistas dorsal (a) e ventral (b). Barra: 0,54 cm.

No sentido rostro-caudal, os primeiros neurônios dopaminérgicos a aparecerem

fazem parte da SNc e estão no nível da transição die-mesencefálica, coincidindo com

estruturas do hipotálamo posterior, a aproximadamente 2,34 mm pós-bregma (p.b.) e se

estendem até o nível 6,48 mm p.b., coincidindo com estruturas dos níveis rostrais e médios do

mesencéfalo, pertencendo à RRF e a uma das subdivisões da VTA (VTA dorsal caudal).

5.1 Substância Negra pars compacta (SNc/A9):

Com base na densidade de distribuição dos seus neurônios, ao longo da maior

extensão da SNc é possível identificar subunidades neste núcleo. Assim, a SNc foi então

dividida em substância negra compacta dorsal (SNcd ou A9d), substância negra lateral (SNl

ou A9l), substância negra medial (SNm ou A9m), cauda da substância negra (cSN) e

substância negra ventral (SNv ou A9v).

Como mencionado, os primeiros neurônios dopaminérgicos nigrais surgem na porção

ventrolateral do tegmento mesencefálico no nível 2,34 mm p.b. e são pertencentes à SNm,

a b

32

localizando-se lateralmente aos núcleos mamilares (Mn) e supramamilar (SuM), medialmente

ao núcleo subtalâmico (STh), ventralmente ao lemnisco medial, zona incerta (ZI) e às

projeções nigro-estriatais TH+ e dorsalmente ao pedúnculo cerebral e à substância negra

reticulada (SNr) (Figs. 10A e 11A-C). Os neurônios atribuídos à constituição da SNm foram

encontrados até o nível 5,22 mm p.b. (Fig. 10M). Foi visto que estes neurônios são bipolares e

multipolares, apresentando formato ovóide e, com menor freqüência, triangular. Com relação

à orientação dendrítica, os neurônios rostrais apresentavam uma organização dendrítica

paralela às bordas do pedúnculo cerebral e SNr (Fig. 11C). Porém, nos níveis mais caudais,

esse padrão foi sendo substituído por uma arborização aleatória (Figs. 12D e 13D).

No nível de aproximadamente 2,70 mm p.b. (Fig. 10B), lateralmente à SNm,

aparecem os primeiros neurônios TH+ referentes à SNcd. Basicamente, em toda a sua

extensão a SNcd encontra-se ventralmente ao lemnisco medial e dorsalmente à SNr, sendo

seu limite caudal identificado em cortes nos níveis de 6,12 mm p.b. (Fig. 10O). Assim como

na SNm, na SNcd constatou-se a presença de neurônios TH+ bipolares e multipolares com

corpo celular em formatos ovóide e triangular. No tocante à arborização dendrítica, foi

possível constatar a predominância de uma orientação em sentido medial-lateral (paralelo ao

lemnisco medial) e, em menor expressão, em sentido dorso-ventral (na área correspondente à

SNr) (Figs. 12C e 13C).

Em 3,42 mm p.b. (Fig. 10E), lateralmente à SNcd, foi possível visualizar neurônios

referentes à SNl. Este grupamento de baixa densidade neuronal foi identificado nas porções

mais laterais do tegmento mesencefálico, estando dorsalmente à SNr. Seus limites caudais se

encontram no nível 5,76 mm p.b., onde a SNl se encontra ventralmente à RRF (Fig. 10N). Os

neurônios pertencentes a esta subunidade nigral são multipolares e, em menor expressão,

bipolares. Além disso, apresentam formato ovóide e, frequentemente, piriforme. Com relação

à organização dendrítica, não há um padrão específico (Figs. 14C e 15C).

Por volta do nível 4,14 mm p.b. (Fig. 10H), neurônios TH+ surgem bilateralmente

em uma região dorsal às porções mais laterais da SNcd e recebem o nome cSN. Prosseguindo

a visualização das secções mais caudais, é possível perceber que estes grupamentos coexistem

com a SNc até o nível de 5,22 mm p.b. (Fig. 10M). É um grupo de baixa densidade celular,

formado basicamente por neurônios bipolares fusiformes e, raramente, ovóides. Grande parte

dos dendritos está disposta em um sentido dorso-ventral (Figs. 16D e 17C).

33

No nível 4,32 mm p.b. (Fig. 10I), foram identificados neurônios TH+ bilateralmente

em uma região ventral às porções intermediárias da SNcd e dorsal ao pedúnculo cerebral,

inseridos na SNr. Estes grupamentos recebem o nome de SNv ou A9v e seus neurônios

coexistem com as demais porções da SNc até o nível 6,12mm p.b. (Fig. 10O). Trata-se de um

subgrupo de baixa densidade neuronal, formado por neurônios ovóides e multipolares com

orientação dendrítica dorso-ventral (Figs. 17D e 18C).

5.2 Área Tegmental Ventral (VTA/A10):

Assim como a SNc, foi possível subdividir o complexo da VTA em sub-regiões:

VTA propriamente dita, VTA central (VTAc ou A10c), VTA dorsal (VTAd ou A10d) e VTA

dorsal caudal (VTAdc ou A10dc).

Os primeiros neurônios TH+ referentes à VTA começaram a aparecer no nível 2,70

mm p.b., na região mais medial do tegmento mesencefálico. Neste ponto, localiza-se

lateralmente aos núcleos mamilares e supramamilar, medialmente à SNm e SNr e

ventralmente aos lemnisco medial, ZI e às projeções nigro-estriatais (Fig. 10B). Analisando

níveis mais caudais, foi possível identificar mais relações entre a VTA e outras estruturas

mesencefálicas, como por exemplo o núcleo interpeduncular e o fascículo retroflexo, que se

encontram em uma posição ventromedial em relação à VTA (Figs. 10H e 10M). De um modo

geral, os neurônios da VTA são multipolares arredondados e, em menor quantidade,

triangulares. Além disso, não apresentam um padrão de organização dendrítica (Figs. 14D e

16C). Nas amostras estudadas, os últimos neurônios da VTA são identificados no nível

6,12mm p.b. (Fig. 10O).

No nível 3,96 mm p.b. (Fig. 10G) foi possível identificar com clareza a formação

neuronal TH+ que recebe o nome VTAc. Neste nível ela se encontra medialmente à VTA e

dorsalmente ao fascículo retroflexo. Já, em níveis mais caudais, a VTAc se encontra

dorsalmente ao núcleo interpeduncular (Fig. 10L). Trata-se de um núcleo pouco denso

constituído de neurônios multipolares, com formato arredondado e sem um padrão específico

de organização dendrítica (Figs. 14E e 19E). Seus limites caudais se dão no nível 5,76 mm

p.b. (Fig. 10N) onde este núcleo se entrelaça com o linear caudal da rafe (Cli).

A partir do nível 3,42 mm p.b. (Fig. 10E) até o 6,12 mm p.b. (Fig. 10O), foi possível

identificar a VTAd. Uma moderada densidade de neurônios TH+ ovóides, bipolares e, em

menor freqüência, multipolares situados na linha média encefálica, dorsalmente à VTAc

34

(descrita a seguir) e ventralmente à substância cinzenta periaquedutal (PAG) e, nos níveis

mais caudais, ao núcleo do nervo oculomotor (3N). Trata-se de um grupo neuronal que esboça

um padrão de organização dendrítica dorsoventral (Fig. 15C e 19D).

A VTAdc, contém neurônios TH+ em baixa densidade, presentes desde os níveis

mais rostrais (3,24 mm p.b. – Fig. 10D), até os níveis em que não mais existem neurônios da

VTA no tegmento mesencefálico (6,48 mm p.b. – Fig. 10P). Trata-se de um grupo existente

na PAG, especificamente na metade ventral do aqueduto cerebral (Aq). Seus neurônios

basicamente são ovóides, bipolares e, em menor freqüência, multipolares com orientação

dendrítica paralela às bordas do aqueduto cerebral (Figs. 14E e 22C).

5.3 Zona Retrorubral (RRF/A8):

Os neurônios TH+ retrorubrais surgem no nível 5,76 mm p.b. (Fig. 10N) em uma

área ventral às porções mais caudais do núcleo rubro (RN) e dorsal ao lemnisco medial. Neste

nível, é possível ainda se perceber a coexistência da SNcd e SNl que se encontram

ventrolateralmente e a VTA que está ventromedialmente à RRF.

Tal núcleo, comparado com demais estudados, é formado por um grupo reduzido e

disperso de neurônios multipolares ovóides e, raramente, fusiformes, sem padrão de

organização dendrítrica. Seus últimos neurônios são vistos no nível 6,48 mm p.b. (Figs. 10P e

20C-D, 21C-D e 22D).

2,34mm p.b.

HbHb

frfr

3V

mlml

ZIZI

nsns

Mn

SuMSNR

PrCPrC

2,70mm p.b.

Mn

SuM

ZI ZI

ml ml

ns ns

SNR SNR

PrCPrC

HbHb

frfr

3V

VTA

3,06mm p.b.

Mn

3V

PrCPrC

fr fr

ml mlZIZI

VTA

SNR

nsns

3,24mm p.b.

PrC PrC

3V

fr fr

ZI ZI

VTA

ml ml

SNR SNR

Mn

PAG

VTAd

c

A

B

C

D

Figura 10. Reconstrução esquemática das secções coronais do encéfalo do mocó, ilustrando a morfologia dos núcleos dopaminégicos do mesencéfalo. Representação do nível mais rostralem (A) e do nível mais caudal em (P). Barra 1mm. Ver lista de abreviações.

PO

NML

KJI

HGFEDCB

A

SNR

SNm SNm

STh STh

VTA

SNcdSNm

SNcdSNm

VTASNcd

SNmSNcd

SNRSNm

VTA

SNcd

SNmSNm

SNcd

cp cp

cp cp

cpcp

cp cp

35

3,96mm p.b.

pc

Aq

PAG

RN RNmlml

MT MTSNR SNRfr fr

VTAd

c

VTAd

4,14mm p.b.

pc

Aq

PAG

RN RN

VTA VTA SNRSNRfrfr

ml ml

MTMT

cSN cSN

VTAd

c

VTAd

4,32mm p.b.

pc

Aq

PAG

RN RN

VTA VTASNRSNR

frfr

ml ml

cSNcSN

VTAd

c

VTAd

4,50mm p.b.

SNRSNR

mlmlRNRN

VTAVTA

PAG

Aq

csc

cSN cSN

SN

v

SN

v

VTAdc

VTAd

G

H

I

J

3,42mm p.b.

ml ml

VTAVTASNRSNR

frfr

PAG

Aq

pc

VTAd

c

VTAd

VTAc

3,60mm p.b.

pc

Aq

PAG

frfrVTASNR SNR

mlml

RNRN

MT

VTAd

c

VTAd

E

F

Figura 10. Continuação.

SNl SNcd SNlSNcd

SNmSNm

MT

VTAc VTAc

SNlSNcd

SNm

SNlSNcd

SNm

VTA VTA

VTA

VTAc

VTA

SNlSNcd

SNm

MT

SNm

SNlSNcd

VTAcSNl SNcd

SNm

MT

SNlSNcd

SNmcp cp

cp cp

cp cp

cp cp

cp cp

VTAc

SNv

SNl SNcd

SNm

SNlSNcd

SNv

SNm

cp cp

VTAc

SNlSNcd

SNm

SNcdSNl

SNm

36

5,22mm p.b.

csc

3N 3N

PAG

Aq

RN RN

VTAVTA

ml ml

SNR SNRIP

VTAd

c

cSN cSN

SNv SNv

VTAd

Cli

5,76mm p.b.

csc

Aq

PAG

3N 3N

RN RN

VTA VTA

IP

ml ml

SNRSNR

RRF RRF

Cli

VTAd

VTAd

c

4,68mm p.b.

csc

Aq

PAG

RN RN

ml ml

VTAVTA

SNR SNR

VTAd

c

VTAd

cSN cSN

SNv SNv

5,04mm p.b.

csc

PAG

Aq

RNRN

VTAVTA

mlml

SNRSNR

3N3N

IP

VTAdc

cSNcSN

VTAd

SNvSNv

K

L

M

N

6,12mm p.b.

csc

Aq

PAG

3N 3N

VTA VTA

IPml ml

SNRSNR

RRF RRF

rs rs

VTAdc

VTAd

O

6,48mm p.b.

csc

Aq

PAG

3N 3N

RRF RRF

IP

PN

VTAdc

P

Figura 10. Continuação.

SNlSNcd

SNm SNm

cp cp

SNcdSNl

VTAc

cp cp

SNl SNlSNcdSNcd

SNm SNm

VTAc

VTAc

SNl SNcd SNlSNcd

SNm SNmcp cp

SNl SNlSNcd SNcd

cp cpSNv SNv

VTAc

SNcdSNcd

cpcpSNv SNv

37

A

C

B

C

Figura 11. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó, ao

nível de aproximadamente 2,34 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de Nissl;

(B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em área

correspondente à SNm. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C.

Hb

fr

3V ml

Mn

ns ZI

cp SNm

38

A

C

D B

C D




correspondente à SNcd; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área correspondente a

SNm. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D.

Hb 3V

3V

fr

Mn

ml

ns VTA

cp

ZI SNcd

SNm

39

A

C D

C

D

E

B

E




correspondente à SNcd; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área correspondente a

SNm; (E) Ampliação da caixa homônima em B, em área correspondente a VTAdc. Barra: 2

mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C, D e E.

3V PrC

Mn

fr

ZI

VTA

cp

SNcd

SNm

PAG

40

D

B A

E

C




correspondente à SNl; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área correspondente a

VTA; (E) Ampliação da caixa homônima em B, em área correspondente a VTAc. Barra: 2

mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C, D e E.

C

D

E

pc

Aq PAG

cp

fr VTAc

VTA SNm SNcd

SNl

41

A

D

C

B

C D




correspondente à VTAd; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área correspondente

a SNl. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D.

pc

Aq PAG

RN

cp

VTAd

VTAc VTA fr

SNm

SNcd SNl

42

D

C

D

B A

C




correspondente à VTA; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área correspondente a

cSN. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D .

pc Aq

PAG

RN VTAd

fr

cp

VTAc VTA

SNm SNcd

SNl cSN

43

C

D

B A

C D




correspondente a cSN; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área correspondente a

SNv. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D .

CSC

Aq

PAG

RN

VTA VTAc

VTAd

cp SNv SNm

SNcd

SNl

cSN

44

C

B

A

C




correspondente a cSN; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área correspondente a

SNv. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C .

CSC

Aq PAG

3N

RN

IP SNv

cp

cSN

SNcd

45




correspondente a VTAdc; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área correspondente

a VTAd; (E) Ampliação da caixa homônima em B, em área correspondente a VTAc. Barra:

2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C, D e E .

C

D

E A

C D

E

B

CSC

3N

RN VTAd

VTAc

IP cp

Aq

46

C D

C D

B A




correspondente a VTAdc; (D) e (E) Ampliações das caixas homônimas em B, em áreas

correspondentes a RRF. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D.

CSC

PAG

3N

RN RRF

Aq

IP cp

SNcd

47

C D

C D

B A



(B) Imunoistoquímica para TH; (C) e (D) Ampliações das caixas homônimas em B, em

áreas correspondentes a RRF. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D .

Aq

PN

IP

VTAd

3N

PAG

RRF

rs

SNcd

48

C D

C

D B A




correspondente a VTAdc e (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área


Aq PAG

3N

PN

IP

RRF

49

50

6. DISCUSSÃO

6.1 Considerações técnicas

Como mencionado anteriormente, a TH é uma enzima comum à síntese de todas as

catecolaminas, podendo a sua expressão imunoistoquímica evidenciar tanto neurônios

dopaminérgicos, como noradrenérgicos ou adrenérgicos. Entretanto, evidências provenientes

de estudos com ferramentas fisiológicas, farmacológicas, hodológicas, clínicas e de biologia

molecular, permitem assegurar que os grupamentos neuronais imunorreativos a TH no

mesencéfalo, diencéfalo, telencéfalo e retina são constituídos por neurônios produtores de

dopamina e, portanto, a imunorreatividade a TH pode ser considerada um marcador molecular

confiável para identificação de grupamentos dopaminérgicos no mesencéfalo (Grimm et al.,

2004; Prakash e Hurst, 2006; Margolis et al., 2010).

Portanto, a imunoistoquímica para TH, aliada à técnica de Nissl, permitiu-nos

delimitar os grupamentos dopaminérgicos do mesencéfalo do mocó, bem como caracterizar a

morfologia dos neurônios.

No mesencéfalo do mocó foram identificados os núcleos A8, A9 e A10,

semelhantemente aos que foram encontrados anteriormente no rato (Rattus norvegicus)

(German e Manaye, 1993), hamster (Mesocricettus auratus) (Vincent, 1988), gerbil (Tatera

brantsii) (Moon et.al., 2007), rato-cão (Thryonomys swinderianus) (Dwarika et al., 2008),

porco-espinho do Cabo (Hystrix africaeaustralis) (Limacher et al., 2008) entre outros

roedores.

Convém ressaltar que resultados semelhantes foram obtidos em estudos de

caracterização morfológica desses núcleos em animais de diferentes ordens, como por

exemplo, o babuíno Chacma (Papio ursinus) (McRitchie et.al., 1998), damão-do-cabo

(Procavia capensis) (Gravett et al., 2009), rock musaranho elefante (Elephantulus myurus)

(Pieters et al., 2010), girafa (Giraffa camelopardalis) (Bux et al., 2010), morcegos das

subordens Microchiropteria e Megachiropteria (Dell et al., 2010; Kruger et al., 2010) entre

outros.

Segue-se uma discussão sobre a organização nuclear dos grupos A8, A9 e A10,

comparativamente às descrições prévias em outras espécies.

51

6.2 Zona retrorubral (A8)

Em estudo com duas espécies de roedores, o highveld mole-rat (Cryptomys

hottentotus pretoriaie) e o Cape dune mole-rat (Bathyergus suillus), demonstrou-se que os

neurônios que formam a RRF são do tipo ovóide, bipolar e/ou multipolar e não apresentam

uma orientação dendrítica (Bhagwandin et al., 2008). No highveld gerbil (Tatera brantsii),

evidenciou-se que, além dos neurônios ovóides, encontram-se neurônios fusiformes, podendo

ambos os tipos apresentarem um padrão de organização dendrítica nos sentidos ventrolateral e

dorsolateral (Moon et al., 2007). No presente estudo no mocó, não foi identificada a presença

de neurônios bipolares nesta região. Porém, constatou-se a existência de neurônios com

formato ovóide e, em menor freqüência, fusiforme cujos dendritos não apresentam padrão

organizacional específico.

6.3 Substância Negra pars compacta (A9)

As propriedades eletrofisiológicas dos neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo

foram primeiramente caracterizadas na SNc, onde cerca de 90% dos neurônios são

imunorreativos a TH (Margolis et.al., 2006). Com relação a esta área, todos os estudos

propõem a sua subdivisão em: SNcd, SCl, SNm e SNv. Contudo, apenas um estudo

evidenciou a existência da cSN como sendo um dos componentes dos núcleos

dopaminérgicos (Nielsen et al., 2009). De acordo com o atlas do rato (Paxinos e Watson,

2007), a área referente à cSN seria pertencente à RRF. Todavia, a análise microscópica das

secções do mocó permitiu sugerir que se trata de áreas distintas, uma vez que os neurônios da

cSN são basicamente fusiformes e com padrão de organização dendrítica dorso-ventral o que,

de certo modo, diverge dos neurônios relativos à RRF.

Certamente, surge a necessidade de se ampliar os estudos acerca da existência dessa

subunidade nigral, incluindo a análise de outras amostras do próprio mocó, assim como

estudos em outros animais da ordem Rodentia e, principalmente, da família Caviidae. Afinal,

os estudos anteriores trataram de roedores de outras famílias e, sobretudo, discrepantes em

termos de fenótipo, hábitos de vida, dimensões encefálicas, entre outros aspectos.

Quanto à SNm, estudos prévios relataram a existência de neurônios ovóides,

bipolares e sem organização dendrítica em mole-rat africano (Bhagwandin et al.; 2008); rock

hyrax (Gravett et al., 2009), sendo possível também encontrar neurônios multipolares com

formato triangular como no rock elephant shrew (Pieters et.al., 2010), ou apresentando

52

organização dendrítica paralela ao pedúnculo cerebral, como no highveld gerbil (Moon et.al.,

2007). Na SNm do mocó foram encontrados neurônios bipolares e multipolares, apresentando

um formato ovóide e, com menor freqüência, triangular. Com relação à orientação dendrítica,

os primeiros neurônios apresentavam uma organização paralela às bordas do pedúnculo

cerebral e SNr. Porém, nos cortes mais caudais, esse padrão foi sendo substituído por uma

arborização aleatória.

No mocó a SNcd é formada por neurônios bipolares e multipolares com corpo celular

em dois aspectos, ovóide e triangular, e a arborização dendrítica apresenta a predominância de

uma orientação em sentido medial-lateral (paralelo ao lemnisco medial) e, em menor

expressão, em sentido dorso-ventral (na área correspondente à SNr). De fato, esta subunidade

nigral não apresenta divergências significativas quando comparadas com outros estudos (Bux

et al., 2010; Limacher et al., 2008).

Já a SNv, no highveld gerbil (Tatera branstsii) é formada por neurônios triangulares,

multipolares e não apresentam orientação dendrítica (Moon et al., 2007). No caso do highveld

mole-rat (Cryptomys hottentotus pretoriaie) e do Cape dune mole-rat (Bathyergus suillus),

esses neurônios são ovóides, bipolares e não apresentam orientação dendrítica (Bhagwandin

et.al, 2008). No mocó apresenta-se como um grupo de baixa densidade neuronal, formado por

neurônios ovóides e multipolares com orientação dendrítica dorso-ventral.

No tocante à SNl, ficou constatado que esta é formada por uma baixa densidade

neuronal e se encontra nas porções mais laterais do tegmento mesencefálico. Seus neurônios

são multipolares e, em menor expressão, bipolares. Além disso, apresentam formato ovóide e,

frequentemente, piriforme. Com relação à organização dendrítica, não há um padrão

específico. Em outros estudos, foram encontrados neurônios poligonais e, frequentemente,

triangulares no rock hyrax (Gravett et al., 2009) e no rock elephant shrew (Pieters et.al.,

2010).

6.4 Área Tegmental Ventral (A10)

Com relação à morfologia do complexo da VTA, vários estudos destacaram a sua

divisão em: VTA, VTAc, VTAd e VTAdc (Smeets e González, 2000).

Alguns estudos apontaram que a subunidade chamada VTA é constituída por

neurônios ovóides, bipolares e com orientação dorsoventral, como no greater canerat

(Dwarika et al., 2008) e highveld gerbil (Moon et al., 2007). Contudo, algumas diferenças

53

foram identificadas no mocó, no qual os neurônios são multipolares, arredondados e, em

menor quantidade, triangulares. Além disso, não apresentam um padrão de organização

dendrítica.

A VTAc, uma região pouco densa, foi delimitada e seus neurônios classificados em

multipolares, com formato arredondado e sem um padrão específico de organização

dendrítica. Já no caso de outro roedor estudado, o cape porcupine (Hystrix africaeaustralis),

contatou-se a presença de neurônios ovóides, bipolares e com orientação dorsolateral dos

dendrítos (Limacher et al., 2008).

No mocó, a localização da VTAd, na linha média encefálica, dorsalmente à VTAc,

bem como a citoarquitetura constituída por um aglomerado de neurônios ovóides, bipolares e,

em menor freqüência, multipolares, com organização dendrítica dorsoventral, está de acordo

com o padrão encontrado nas diversas espécies estudadas previamente.

O último componente do complexo VTA é a VTAdc. No mocó trata-se de um grupo

situado na substância cinzenta periaqueduta, com neurônios ovóides, bipolares e, em menor

freqüência, multipolares com orientação dendrítica paralela às bordas do aqueduto

mesencefálico. Este padrão foi encontrado nas diversas espécies estudadas. Todavia, em

estudo com morcegos (Schreiber’s long-fingered bat, Miniopterus schreibersii) estes

neurônios não foram identificados (Maseko e Manger, 2007).

6.5 Considerações evolutivas

Com base nos estudos realizados em outros animais, principalmente reportando-se

aos diversos da ordem Rodentia, foi possível deduzir que, embora se perceba diferenças

fenotípicas acentuadas, a complexidade nuclear dos centros dopaminérgicos no mesencéfalo

parece ser capaz de mudar entre as diferentes ordens, mas não dentro dela mesma (Maseko et

al, 2007). Deste modo, autores sugeriram que para a ordem Rodentia as variações fenotípicas,

de hábitos de vida e características evolutivas não conduzem à variação dos núcleos

dopaminérgicos (Manger, 2005; Da Silva et al., 2006; Bhagwandin et al, 2008).

Os resultados revelaram que os núcleos dopaminérgicos do mesencéfalo do mocó

são, de um modo geral, similares ao que já foi descrito em outras espécies de mamíferos,

sugerindo que os núcleos A8, A9 e A10 têm se mostrado filogeneticamente estáveis entre as

espécies. Uma ressalva deve ser feita com relação à presença da cSN, a qual foi descrita

54

apenas em uma espécie não Rodentia, o gottingen minipig (Sus scrofa domesticus), um

ungulado desenvolvido laboratorialmente a partir do porco doméstico (Nielsen et al., 2009).

Considerando que na maioria das espécies estudadas os núcleos dopaminérgicos

mesencefálicos apresentam uma distribuição semelhante, e no caso do mocó se tenha

encontrado uma diferença relacionada à organização da substância negra, surge a necessidade

de maiores detalhamentos de estudos desta natureza. Um dos caminhos seria a ampliação da

análise comparativa de amostras encefálicas de animais de mesma ordem (tanto de mesma

família, quanto de famílias diferentes), no que se refere à consistência das divisões nucleares.

Além disso, estudos paralelos poderão ser desenvolvidos no sentido de comparar animais de

ordens diferentes (Moon et al., 2007; Maseko et al, 2007).

55

7. CONCLUSÕES

A partir dos resultados deste trabalho, com relação aos núcleos dopaminérgicos do

mesencéfalo do mocó, é possível concluir que:

1. A imunoistoquímica para TH, juntamente com a técnica de Nissl, são eficientes

no que se refere à delimitação dos neurônios dopaminérgicos presentes no

mesencéfalo, assim como na delimitação dos núcleos e na caracterização

citoarquitetônica;

2. Os núcleos dopaminérgicos do mesencéfalo são: zona retrorubral (RRF/A8),

substância negra pars compacta (SNc/A9) e área tegmental ventral (VTA/A10);

3. A SNc foi dividida em: SNm, SNcd, SNl, SNv e cSN. Já a VTA se divide em:

VTA, VTAc, VTAd e VTAdc;

4. Os núcleos dopaminérgicos do mesencéfalo do mocó se apresentam

semelhantemente aos núcleos estudados em outras espécies de roedores.

Todavia, destaca-se a exceção da cSN que não foi identificada em nenhum dos

roedores estudados.

56

8. PERSPECTIVAS

O mocó (Kerodon rupestris) vem sendo utilizado como modelo experimental no

Programa de pós graduação em Psicobiologia da UFRN desde 2003 e, no Laboratório de

Neuranatomia, desde 2004. Conforme mencionado, algumas trabalhos já foram desenvolvidos

com este animal e, atualmente, encontra-se em andamento uma pesquisa de doutorado cujo

objetivo consiste em abordar aspectos anatômicos do olho e neuroquímicos da retina do

animal, relacionando-os com o sistema de temporização circadiana. No que tange ao

mapeamento de centros cerebrais desta espécie, esta pesquisa é a segunda que trabalha nesta

perspectiva, tendo sido recentemente concluído um trabalho de mestrado que fez a descrição

dos núcleos serotoninérgicos da rafe.

Este trabalho mostrou a proximidade existente entre os núcleos dopaminérgicos do

mesencéfalo do mocó (Kerodon rupestris) e de outros animais (roedores ou não) estudados.

Porém, lançou a perspectiva de aprofundamento de estudos, no sentido de esclarecer ainda

mais algumas divergências existentes, assim como algumas lacunas que surgem no decorrer

dos estudos.

Diante do exposto, é eminente a necessidade de continuidade de pesquisas referentes

ao sistema dopaminérgico deste animal. Eis algumas possibilidades:

1. Caracterização neuroquímica dos núcleos dopaminérgicos;

2. Estudo morfométrico e/ou estereológico desses núcleos;

3. Estudo de caráter funcional que busque evidenciar a importância das subdivisões

nucleares encontradas e relacioná-las com respostas

biológicas/comportamentais;

4. Estudos hodológicos;

5. Estudos filogenéticos que busquem comparar a apresentação destes núcleos

entre indivíduos da mesma família (Caviidae);

6. Aprimoramento das descrições anatômicas destes núcleos ou de outros, na

perspectiva de contribuir para a construção do atlas do mocó (Kerodon

rupestris).

57

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ANEXO – Artigo a ser submetido a Journal of Chemical Neuroanatomy (ISSN: 0891-

0618) – Versão em Português.

Nuclear organization of the midbrain dopaminergic system of the rock cavy

(Kerodon rupestris)

José R L P Cavalcanti, Joacil G soares, Francisco G Oliveira, Fausto P Guzen, André L

B Pontes, Twyla B Sousa, Jeferson S Cavalcante, Expedito S Nascimento Jr, Judney C

Cavalcante, Miriam S M O Costa*.

Departments of Morphology and Physiology, Laboratory of Neuroanatomy, Bioscience

Center, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil

Whit XX pages and YY figures

*Corresponding autor:

Miriam Stela Maris de Oliveira Costa

Department of Morphology/Laboratory of Chronobiology, Bioscience Center, Federal

University of Rio Grande do Norte, 59072-970, Natal, RN, Brazil.

Telephone number: 55 84 32153431

Fax: 55 84 32119207

E-mail address: [email protected]

mailto:[email protected]

ABSTRACT

The 3-hydroxytyramine / dopamine (DA) is a monoamine of catecholamineric group

and consists in the progenitor substantia of synthesis of noradrenaline and adrenaline,

having the enzyme tyrosine hydroxylase as a regulator of this process. Nuclei of

midbrain expressing DA are the retrorubral field (RRF, A8 group), the substantia nigra

pars compacta (SNc, A9 group) and the ventral tegmental area (VTA, A10 group).

These nuclei are involved in three complex circuitry called mesostriatal, mesocortical

and mesolimbic, which are related directly with various behavioral manifestations such

as motor control, reward signaling in behavioural learning, motivation and pathological

manifestations of Parkinson’s disease and schizophrenia. The aim of this study was

describe the morphology of midbrain dopaminergic neurons (A8, A9 and A10) of the

rock cavy (Kerodon rupestris), a rodent belonging to the family Caviidae typical of the

Brazilian Northeast. Coronal sections of brains of the rock cavies were submitted to

Nissl’s staining and immunohistochemistry against tyrosine hydroxylase. The nuclear

organization of the midbrain dopaminergic nuclei of rock cavy is very similar to that

found in other animals of the order Rodentia, except by the presence of the tail of

substantia nigra, which was found only in the studied species. We concluded that the

midbrain dopaminergic nuclei are phylogenetically stable among species, but we think

to be it necessary to expand the studies about the particularity found the rock cavy,

investigating its occurrence in other species of rodents and investigating its functional

relevance.

Keywords: Midbrain; Dopamine; Tyrosine Hydroxylase; Midbrain Dopaminergic

Nuclei; Rock Cavy; Rodents.

INTRODUÇÃO

Em meados da década de 1950, constatou-se que além de ser precursora da

noradrenalina e da adrenalina, a 3-hidroxitiramina/dopamina (DA) possuía a capacidade

de atuar como neurotransmissor no sistema nervoso central, (Carlsson et. al., 1958;

Björklund e Dunnett, 2007a). Como tal, a DA é uma monoamina que se encontra no

grupo das catecolaminas e é um dos principais neurotransmissores na modulação da

função cerebral, desempenhando um papel crucial na adaptação do comportamento

animal ao longo da evolução (Jones e Pilowski, 2002; Yamamoto e Vernier, 2011).

Estudos anteriores identificaram dez núcleos dopaminérgicos encefálicos que

foram codificados de A8-A17, sendo: A8 – Zona retrorrubral; A9 – Substância negra

pars compacta; A10 – Área tegmental ventral; A11 ao A14 – Grupos hipotalâmicos;

A15 – Hipotálamo ventral e lateral/Área retroquiasmática; A16 – Células

periglomerulares do bulbo olfatório; A17 – Células interplexiformes da retina

(Dahlström e Fuxe, 1964; Márin et al., 2005).

Dentre os núcleos dopaminérgicos, destacam-se os situados no mesencéfalo

(A8, A9 e A10). Estes participam de três complexas circuitarias denominadas

mesostriatal, mesocortical e mesolímbica (Dahlström e Fuxe, 1964; German e Manaye,

1993; François et al., 1999; Smith e Kieval, 2000; Björklund e Dunnett, 2007b) que

estão envolvidas em controle motor, motivação, cognição, recompensa e em algumas

desordens neurológicas e/ou psiquiátricas, como por exemplo, a doença de Parkinson e

a esquizofrenia (Chudasama e Robbins, 2004; Nicola et al., 2005; Fields et al., 2007).

Considerando as relevâncias funcionais, surge a necessidade de se ampliar os

estudos acerca dessas estruturas, inclusive tomando como referência um animal

genuinamente brasileiro. O mocó (Kerodon rupestris) é um roedor nativo da região

semi-árida e pode ser encontrado no Nordeste Brasileiro. De acordo com a taxonomia

tradicional, baseada em critérios morfológicos e comportamentais, o mocó é

classificado na superfamília Cavioidea, família Caviidae, subfamília Caviinae e gênero

Kerodon (Cabrera, 1961; Lacher Jr., 1981). Estudos morfológicos (Silva Neto, 2000) e

de biologia molecular (Rowe e Honeycutt, 2002) firmaram o gênero Kerodon irmanado

com a família Hydrochaeridae, à qual também pertence a capivara (Hydrochaeris) e

estreitamente alinhado com a subfamília Dolichotinae.

O mocó é um animal facilmente adaptado às condições ecológicas locais como

o calor, a escassez de água e de alimentos, principalmente nos períodos das grandes

secas nas regiões do semi-árido. Habitam locais rochosos com inúmeras fendas onde se

abrigam dos predadores e passam boa parte de seu tempo. Além disso, são excelentes

saltadores e conseguem escalar rochas e galhos de árvores, de onde extraem a sua

alimentação, composta principalmente de cascas de árvores, ou na falta destas,

gramíneas em geral, ao contrário de outros caviinaes que possuem hábitos terrestres e

comem relva (Carvalho, 1969; Lacher, 1981; Mendes, 1985).

Com isso, o estudo objetivou descrever a morfologia dos núcleos

dopaminérgicos do mesencéfalo do mocó, mediante caracterização citoarquitetônica

pelo método de Nissl e por imunoistoquímica contra tirosina-hidroxilase. Pretende-se

com isso formular bases para pesquisas de aspectos hodológicos e funcionais dos

grupos dopaminérgicos deste animal.

MATERIAIS E MÉTODOS

Quatro animais adultos jovens, machos (n=2) e fêmeas (n=2), pesando entre

300 e 400 gramas foram utilizados no experimento. Os animais foram obtidos por

captura após permissão do Instituto Brasileiro do Meio ambiente (IBAMA – Licença nº

21440-1) e o trabalho foi iniciado após aprovação pelo Comitê de Ética no Uso de

Animais (CEUA), mediante protocolo nº 015/2009. É importante ressaltar que todos os

cuidados foram tomados no sentido de evitar dor e sofrimento aos animais durante os

procedimentos experimentais, seguindo-se estritamente as normas estabelecidas pela

National Research Council of the National Academy.

Foram administrados por via intramuscular, os medicamentos cloridrato de

tramadol e xilazina, ambos na dose de 5 (cinco) mg/Kg, como medida pré-anestésica.

Decorridos 10 minutos, os animais foram mantidos em anestesia inalatória com

isoflurano e oxigênio 100% administrados através de máscara. Os animais foram

submetidos à perfusão transcardíaca e a agulha foi conectada a uma bomba peristáltica

(Cole-Parmer), passando-se 300 ml de solução salina a 0,9% em tampão fostato 0,1M,

pH 7,4 com heparina (Parinex, Hipolabor, 2ml/1000 ml de solução salina) durante seis

minutos. Em seguida, foram infundidos 700 ml de solução fixadora composta por

paraformaldeido 4%, glutaraldeído 0,05% e ácido pícrico 0,2% em tampão fosfato 0,1

M, pH 7,4 (Zamboni e Di Martino, 1967), passando-se metade desta solução a um fluxo

de 6,0 ml por minuto e a outra metade a 3,0 ml por minuto, durando todo procedimento

em torno de 30 minutos.

Finalizada a etapa de perfusão, os animais foram posicionados no aparelho

estereotáxico para roedores. Após anotação das coordenadas do bregma e do lambda, o

osso da calota craniana foi removido com o uso de broca e trocater, expondo-se o

encéfalo. Ainda no aparelho estereotáxico, os encéfalos foram seccionados em três

blocos através de duas secções coronais: uma no nível do bregma e a outra no nível do

lambda. Logo após esta etapa, os três blocos foram armazenados em uma solução

contendo sacarose a 30% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, a 4 ºC, até serem submetidos

à microtomia (cortes coronais).

Os encéfalos foram congelados por gelo seco e seccionados em micrótomo de

deslizamento, obtendo-se secções coronais com espessura de 30 µm. Estas foram

coletadas em um meio líquido de tampão fostato 0,1M, pH 7,4, distribuídas

seqüencialmente em seis compartimentos, de maneira cíclica e seqüenciada, de modo a

manter a distância entre uma secção e a outra imediatamente seguinte de um mesmo

compartimento de aproximadamente 180 µm.

Os cortes de um compartimento foram imediatamente montados em lâminas de

vidro gelatinizadas e submetidas à coloração pelo método de Nissl para permitir uma

melhor demarcação das estruturas. Os cortes dos demais compartimentos foram

transferidos para solução anticongelante e conservados a -20 ºC para utilização posterior

em procedimentos de imunoistoquímica.

Precedendo a técnica de imunoistoquímica, os cortes foram submetidos a um

pré-tratamento para recuperação da antigenicidade, sendo colocados em solução de

boridreto de sódio a 1% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, durante 15 minutos. O pré-

tratamento também incluiu uma etapa de incubação em peróxido de hidrogênio (H2O2) a

0,3% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 por cinco minutos. No início, entre as soluções e

ao final, os cortes foram submetidos a seis lavagens de cinco minutos cada em tampão

fosfato 0,1 M, pH 7,4.

O próximo passo consistiu na incubação dos cortes em anticorpo primário, isto

é, uma solução formada pelo anticorpo anti-TH obtido em camundongo (Sigma) em

diluição de 1:10.000, acrescido de soro normal de asno a 2% em Triton X-100 a 0,4%

permanecendo em incubação por 12 a 72 horas em rotor com rotação lenta.

Ao fim deste período, os cortes passaram por seis lavagens em tampão fosfato

0,1 M pH 7,4, em agitador orbital e em seguida colocados em contato com o anticorpo

secundário anti-camundongo obtido em asno (Jackson) diluído a 1:1000 no mesmo

veículo anterior, por 120 minutos à temperatura ambiente, sob agitação lenta, em rotor.

Em seguida, os cortes passaram por seis lavagens em tampão fosfato 0,1 M em

agitador orbital e depois colocados na solução do complexo avidina-biotina-HRP

(Protocolo ABC, Kit elite da Vector), numa diluição de 1:100 em Triton X-100 a 0,4%,

contendo NaCl , por 120 minutos à temperatura ambiente, sob agitação lenta, em rotor.

Terminada esta fase, as secções foram novamente submetidas a seis lavagens em

tampão fosfato 0,1 M em agitador orbital.

Para visualização da reação, as secções foram postas em meio contendo H2O2

como substrato e a 3,3’,4,4’tetrahidrocloreto-diaminobenzidina (DAB), utilizada como

cromógeno. A H2O2 foi oferecida indiretamente, colocando-se na solução glicose

oxidase e D-glicose, provocando uma reação em que a primeira agindo sobre a

segunda libera H2O2 (Itoh et al., 1979). Esta reação dura em torno de 15 minutos e após

esta, os cortes foram submetidos a mais seis lavagens em tampão fosfato 0,1 M em

agitador orbital.

Os cortes foram montados em lâminas gelatinizadas, que após secas foram

imersas em solução de tetróxido de ósmio a 0,05% com o intuito de intensificar a

reação. Após as etapas de desidratação, em baterias de álcool de graduação crescente até

o álcool absoluto, e diafanização em xilol, as lamínulas foram montadas sobre os cortes

com o uso de DPX.

As secções do mesencéfalo, coradas pelo método de Nissl e/ou submetidas à

imunoistoquímica para TH foram examinadas ao microscópio óptico (Olympus BX41)

em campo claro. Imagens digitais foram obtidas de secções representativas usando

uma videocâmara digital (Nikon DXM1200). As imagens foram analisadas, corrigidas

minimamente para brilho e contraste, montadas usando o programa Adobe Photoshop

CS5® e os desenhos esquemáticos foram montados no software Adobe Illustrator

CS5®. Os resultados foram documentados em fotomicrografias e esquemas

construídos a partir das mesmas.

RESULTADOS

O comprimento rostro-caudal médio, do bulbo olfatório à transição bulbo-

espinal, foi da ordem de 3,63 cm (Fig. 1).

Com base na imunoistoquímica para TH, aliada à técnica de Nissl, foi possível

estabelecer os limites anatômicos, assim como a citoarquitetura e possíveis subdivisões,

dos três núcleos dopaminérgicos do mesencéfalo. Para facilitar a compreensão, foram

feitos esquemas ilustrativos que demonstram as estruturas encefálicas sequenciadamente

(Fig. 2).

No sentido rostro-caudal, os primeiros neurônios dopaminérgicos a aparecerem

fazem parte da SNc e estão no nível da transição die-mesencefálica, coincidindo com

estruturas do hipotálamo posterior, a aproximadamente 2,34 mm pós-bregma (p.b.) e se

estendem até o nível 6,48 mm p.b., coincidindo com estruturas dos níveis rostrais e

médios do mesencéfalo, pertencendo à RRF e a uma das subdivisões da VTA (VTAdc).

Substância Negra pars compacta (SNc/A9):

Com base na densidade de distribuição dos seus neurônios, ao longo da maior

extensão da SNc é possível identificar subunidades neste núcleo. Assim, a SNc foi então

dividida em substância negra compacta dorsal (SNcd ou A9d), substância negra lateral

(SNl ou A9l), substância negra medial (SNm ou A9m), cauda da substância negra (cSN)

e substância negra ventral (SNv ou A9v).

Como mencionado, os primeiros neurônios dopaminérgicos nigrais surgem na

porção ventrolateral do tegmento mesencefálico e são pertencentes à SNm, localizando-

se lateralmente aos núcleos mamilar (Mn) e supramamilar (SuM), medialmente ao

núcleo subtalâmico (STh), ventralmente ao lemnisco medial, zona incerta (ZI) e às

projeções nigro-estriatais TH+ e dorsalmente ao pedúnculo cerebral (cp) e à substância

negra reticulada (SNr) (Figs. 2A e 3A-C). Foi visto que estes neurônios são bipolares e

multipolares, apresentando formato ovóide e, com menor freqüência, triangular. Com

relação à orientação dendrítica, os neurônios rostrais apresentavam uma organização

dendrítica paralela às bordas do pedúnculo cerebral e SNr (Fig. 3C). Porém, nos níveis

mais caudais, esse padrão foi sendo substituído por uma arborização aleatória (Figs. 4D

e 5D).

Lateralmente à SNm, aparecem os primeiros neurônios TH+ referentes à SNcd

(Fig. 2B). Basicamente, em toda a sua extensão a SNcd encontra-se ventralmente ao

lemnisco medial e dorsalmente à SNr. Assim como na SNm, na SNcd constatou-se a

presença de neurônios TH+ bipolares e multipolares com corpo celular em formatos

ovóide e triangular. No tocante à arborização dendrítica, foi possível constatar a

predominância de uma orientação em sentido medial-lateral (paralelo ao lemnisco

medial) e, em menor expressão, em sentido dorso-ventral (na área correspondente à

SNr) (Figs. 4C e 5C).

Lateralmente à SNcd (Fig 2E), foi possível visualizar neurônios referentes à

SNl. Este grupamento de baixa densidade neuronal foi identificado nas porções mais

laterais do tegmento mesencefálico, estando dorsalmente à SNr. Seus limites caudais se

encontram ventralmente à RRF (Fig. 2N). Os neurônios pertencentes a esta subunidade

nigral são multipolares e, em menor expressão, bipolares. Além disso, apresentam

formato ovóide e, frequentemente, piriforme. Com relação à organização dendrítica, não

há um padrão especifico (Figs. 6C e 7C).

Por volta do nível 4,14 mm p.b. (Fig. 2H), neurônios TH+ surgem

bilateralmente em uma região dorsal às porções mais laterais da SNcd e recebem o

nome cSN. Prosseguindo a visualização das secções mais caudais, é possível perceber

que estes grupamentos coexistem com a SNc até o nível de 5,22 mm p.b. (Fig. 2M). É

um grupo de baixa densidade celular, formado basicamente por neurônios bipolares

fusiformes e, raramente, ovóides. Grande parte dos dendritos está disposta em um

sentido dorso-ventral (Figs. 8D e 9C).

No nível 4,32 mm p.b. (Fig. 2I), foram identificados neurônios TH+

bilateralmente em uma região ventral às porções intermediárias da SNcd e dorsal ao

pedúnculo cerebral, inseridos na SNr. Estes grupamentos recebem o nome de SNv ou

A9v e seus neurônios coexistem com as demais porções da SNc até o nível 6,12mm p.b.

(Fig. 2O). Trata-se de um subgrupo de baixa densidade neuronal, formado por

neurônios ovóides e multipolares com orientação dendrítica dorso-ventral (Figs. 9D e

10C).

Área Tegmental Ventral (VTA/A10):

Assim como a SNc, foi possível subdividir o complexo da VTA em sub-

regiões: VTA propriamente dita, VTA central (VTAc ou A10c), VTA dorsal (VTAd ou

A10d) e VTA dorsal caudal (VTAdc ou A10dc).

Os primeiros neurônios TH+ referentes à VTA começaram a aparecer no nível

2,70 mm p.b., na região mais medial do tegmento mesencefálico. Neste ponto, localiza-

se lateralmente aos núcleos mamilares e supramamilar, medialmente à SNm e SNr e

ventralmente aos lemnisco medial, ZI e às projeções nigro-estriatais (Fig. 2B).

Analisando níveis mais caudais, foi possível identificar mais relações entre a VTA e

outras estruturas mesencefálicas, como por exemplo o núcleo interpeduncular e o

fascículo retroflexo, que se encontram em uma posição ventromedial em relação à VTA

(Figs. 2H e 2M). De um modo geral, os neurônios da VTA são multipolares

arredondados e, em menor quantidade, triangulares. Além disso, não apresentam um

padrão de organização dendrítica (Figs. 6D e 8C).

No nível 3,96 mm p.b. (Fig. 2G) foi possível identificar com clareza a

formação neuronal TH+ que recebe o nome VTAc. Neste nível ela se encontra

medialmente à VTA e dorsalmente ao fascículo retroflexo. Já, em níveis mais caudais, a

VTAc se encontra dorsalmente ao núcleo interpeduncular (Fig.2L). Trata-se de um

núcleo pouco denso constituído de neurônios multipolares, com formato arredondado e

sem um padrão específico de organização dendrítica (Figs. 6E e 11E) e nos seus limites

caudais este núcleo se entrelaça com o linear caudal da rafe (Cli).

Com relação à VTAd, esta é formada por uma moderada densidade de

neurônios TH+ ovóides, bipolares e, em menor freqüência, multipolares situados na

linha média encefálica, dorsalmente à VTAc (descrita a seguir) e ventralmente à

substância cinzenta periaquedutal (PAG) e, nos níveis mais caudais, ao núcleo do nervo

oculomotor (3N). Trata-se de um grupo neuronal que esboça um padrão de organização

dendrítica dorsoventral (Fig. 7C e 11D).

A VTAdc, contém neurônios TH+ em baixa densidade, presentes desde os

níveis mais rostrais (Fig. 2D), até os níveis em que não mais existem neurônios da VTA

no tegmento mesencefálico (Fig. 2P). Trata-se de um grupo existente na PAG,

especificamente na metade ventral do aqueduto cerebral (Aq). Seus neurônios

basicamente são ovóides, bipolares e, em menor freqüência, multipolares com

orientação dendrítica paralela às bordas do aqueduto cerebral (Figs. 6E e 14C).

Zona Retrorubral (RRF/A8):

Os neurônios TH+ retrorubrais surgem em uma área ventral às porções mais

caudais do núcleo rubro (RN) e dorsal ao lemnisco medial (Fig. 2N). Neste nível, é

possível ainda se perceber a coexistência da SNcd e SNl que se encontram

ventrolateralmente e a VTA que está ventromedialmente à RRF.

Tal núcleo, comparado com demais estudados, é formado por um grupo

reduzido e disperso de neurônios multipolares ovóides e, raramente, fusiformes, sem

padrão de organização dendítrica. Seus últimos neurônios são vistos no nível 6,48 mm

p.b. (Figs. 2P e 12C-D, 13C-D e 14D).

DISCUSSÃO

Considerações técnicas

Como mencionado anteriormente, a TH é uma enzima comum à síntese de

todas as catecolaminas, podendo a sua expressão imunoistoquímica evidenciar tanto

neurônios dopaminérgicos, como noradrenérgicos ou adrenérgicos. Entretanto,

evidências provenientes de estudos com ferramentas fisiológicas, farmacológicas,

hodológicas, clínicas e de biologia molecular, permitem assegurar que os grupamentos

neuronais imunorreativos a TH no mesencéfalo, diencéfalo, telencéfalo e retina são

constituídos por neurônios produtores de dopamina e, portanto, a imunorreatividade a

TH pode ser considerada um marcador molecular confiável para identificação de

grupamentos dopaminérgicos no mesencéfalo (Grimm et al., 2004; Prakash e Hurst,

2006; Margolis et al., 2010).

Portanto, a imunoistoquímica para TH, aliada à técnica de Nissl, permitiu-nos

delimitar os grupamentos dopaminérgicos do mesencéfalo do mocó, bem como

caracterizar a morfologia dos neurônios.

No mesencéfalo do mocó foram identificados os núcleos A8, A9 e A10,

semelhantemente aos que foram encontrados anteriormente no rato (Rattus norvegicus)

(German e Manaye, 1993), hamster (Mesocricettus auratus) (Vincent, 1988), highveld

gerbil (Tatera brantsii) (Moon et.al., 2007), greater canerat (Thryonomys swinderianus)

(Dwarika et al., 2008), cape porcupine (Hystrix africaeaustralis) (Limacher et al., 2008)

entre outros roedores.

Convém ressaltar que resultados semelhantes foram obtidos em estudos de

caracterização morfológica desses núcleos em animais de diferentes ordens, como por

exemplo, o chacma baboon (Papio ursinus) (McRitchie et.al., 1998), rock hyrax

(Procavia capensis) (Gravett et al., 2009), rock elephant shrew (Elephantulus myurus)

(Pieters et al., 2010), giraffe (Giraffa camelopardalis) (Bux et al., 2010), morcegos das

subordens Microchiropteria e Megachiropteria (Dell et al., 2010; Kruger et al., 2010)

entre outros.

Segue-se uma discussão sobre a organização nuclear dos grupos A8, A9 e A10,

comparativamente às descrições prévias em outras espécies.

Zona retrorubral (A8)

Em estudo com duas espécies de roedores, o highveld mole-rat (Cryptomys

hottentotus pretoriaie) e o Cape dune mole-rat (Bathyergus suillus), demonstrou-se que

os neurônios que formam a RRF são do tipo ovóide, bipolar e/ou multipolar e não

apresentam uma orientação dendrítica (Bhagwandin et al., 2008). No highveld gerbil

(Tatera brantsii), evidenciou-se que, além dos neurônios ovóides, encontram-se

neurônios fusiformes, podendo ambos os tipos apresentarem um padrão de organização

dendrítica nos sentidos ventrolateral e dorsolateral (Moon et al., 2007). No presente

estudo no mocó, não foi identificada a presença de neurônios bipolares nesta região.

Porém, constatou-se a existência de neurônios com formato ovóide e, em menor

freqüência, fusiforme cujos dendritos não apresentam padrão organizacional específico.

Substância Negra pars compacta (A9)

As propriedades eletrofisiológicas dos neurônios dopaminérgicos do

mesencéfalo foram primeiramente caracterizadas na SNc, onde cerca de 90% dos

neurônios são imunorreativos a TH (Margolis et.al., 2006). Com relação a esta área,

todos os estudos propõem a sua subdivisão em: SNcd, SCl, SNm e SNv. Contudo,

apenas um estudo evidenciou a existência da cSN como sendo um dos componentes dos

núcleos dopaminérgicos (Nielsen et al., 2009). De acordo com o atlas do rato (Paxinos e

Watson, 2007), a área referente à cSN é apontada seria pertencente à RRF. Todavia, a

análise microscópica das secções do mocó permitiu sugerir que se trata de áreas

distintas, uma vez que os neurônios da cSN são basicamente fusiformes e com padrão

de organização dendrítica dorso-ventral o que, de certo modo, diverge dos neurônios

relativos à RRF.

Certamente, surge a necessidade de se ampliar os estudos acerca da existência

dessa subunidade nigral, incluindo a análise de outras amostras do próprio mocó, assim

como estudos em outros animais da ordem Rodentia e, principalmente, da família

Caviidae. Afinal, os estudos anteriores trataram de roedores de outras famílias e,

sobretudo, discrepantes em termos de fenótipo, hábitos de vida, dimensões encefalicas,

entre outros aspectos.

Quanto à SNm, estudos prévios relataram a existência de neurônios ovóides,

bipolares e sem organização dendrítica em mole-rat africano (Bhagwandin et al.; 2008);

rock hyrax (Gravett et al., 2009), sendo possível também encontrar neurônios

multipolares com formato triangular como no rock elephant shrew (Pieters et.al., 2010),

ou apresentando organização dendrítica paralela ao pedúnculo cerebral, como no

highveld gerbil (Moon et.al., 2007). Na SNm do mocó foram encontrados neurônios

bipolares e multipolares, apresentando um formato ovóide e, com menor freqüência,

triangular. Com relação à orientação dendrítica, os primeiros neurônios apresentavam

uma organização paralela às bordas do pedúnculo cerebral e SNr. Porém, nos cortes

mais caudais, esse padrão foi sendo substituído por uma arborização aleatória.

No mocó a SNcd é formada por neurônios bipolares e multipolares com corpo

celular em dois aspectos, ovóide e triangular, e a arborização dendrítica apresenta a

predominância de uma orientação em sentido medial-lateral (paralelo ao lemnisco

medial) e, em menor expressão, em sentido dorso-ventral (na área correspondente à

SNr). De fato, esta subunidade nigral não apresenta divergências significativas quando

comparadas com outros estudos (Bux et al., 2010; Limacher et al., 2008).

Já a SNv, no highveld gerbil (Tatera branstsii) é formada por neurônios

triangulares, multipolares e não apresentam orientação dendrítica (Moon et al., 2007).

No caso do highveld mole-rat (Cryptomys hottentotus pretoriaie) e do Cape dune mole-

rat (Bathyergus suillus), esses neurônios são ovóides, bipolares e não apresentam

orientação dendrítica (Bhagwandin et.al, 2008). No mocó apresenta-se como um grupo

de baixa densidade neuronal, formado por neurônios ovóides e multipolares com

orientação dendrítica dorso-ventral.

No tocante à SNl, ficou constatado que esta é formada por uma baixa

densidade neuronal se encontra nas porções mais laterais do tegmento mesencefálico.

Seus neurônios são multipolares e, em menor expressão, bipolares. Além disso,

apresentam formato ovóide e, frequentemente, piriforme. Com relação à organização

dendrítica, não há um padrão específico. Em outros estudos, foram encontrados

neurônios poligonais e, frequentemente, triangulares no rock hyrax (Gravett et al., 2009)

e no rock elephant shrew (Pieters et.al., 2010).

Área Tegmental Ventral (A10)

Com relação à morfologia do complexo da VTA, vários estudos destacaram a

sua divisão em: VTA, VTAc, VTAd e VTAdc (Smeets e González, 2000).

Alguns estudos apontaram que a subunidade chamada VTA é constituída por

neurônios ovóides, bipolares e com orientação dorsoventral, como no greater canerat

(Dwarika et al., 2008) e highveld gerbil (Moon et al., 2007). Contudo, algumas

diferenças foram identificadas no mocó, no qual os neurônios são multipolares,

arredondados e, em menor quantidade, triangulares. Além disso, não apresentam um

padrão de organização dendrítica.

A VTAc, uma região pouco densa, foi delimitada e seus neurônios

classificados em multipolares, com formato arredondado e sem um padrão específico de

organização dendrítica. Já no caso de outro roedor estudado, o cape porcupine (Hystrix

africaeaustralis), contatou-se a presença de neurônios ovóides, bipolares e com

orientação dorsolateral dos dendrítos (Limacher et al., 2008).

No mocó, a localização da VTAd, na linha média encefálica, dorsalmente à

VTAc, bem como a citoarquitetura constituída por um aglomerado de neurônios

ovóides, bipolares e, em menor freqüência, multipolares, com organização dendrítica

dorsoventral, está de acordo com o padrão encontrado nas diversas espécies estudadas

previamente.

O último componente do complexo VTA é a VTAdc. No mocó trata-se de um

grupo situado na substância cinzenta periaqueduta, com neurônios ovóides, bipolares e,

em menor freqüência, multipolares com orientação dendrítica paralela às bordas do

aqueduto cerebral. Este padrão foi encontrado nas diversas espécies estudadas. Todavia,

em estudo com morcegos (Schreiber’s long-fingered bat, Miniopterus schreibersii) estes

neurônios não foram identificados (Maseko e Manger, 2007).

Considerações evolutivas

Com base nos estudos realizados em outros animais, principalmente

reportando-se aos diversos da ordem Rodentia, foi possível deduzir que, embora se

perceba diferenças fenotípicas acentuadas, a complexidade nuclear dos centros

dopaminérgicos no mesencéfalo parece ser capaz de mudar entre as diferentes ordens,

mas não dentro dela mesma (Maseko et al, 2007). Deste modo, autores sugeriram que

para a ordem Rodentia as variações fenotípicas, de hábitos de vida e características

evolutivas não conduzem à variação dos núcleos dopaminérgicos (Bhagwandin et al,

2008; Da Silva et al., 2006; Manger, 2005).

Os resultados revelaram que os núcleos dopaminérgicos do mesencéfalo do

mocó são, de um modo geral, similares ao que já foi descrito em outras espécies de

mamíferos, sugerindo que os núcleos A8, A9 e A10 têm se mostrado filogeneticamente

estáveis entre as espécies. Uma ressalva deve ser feita com relação à presença da CSN,

a qual foi descrita apenas em uma espécie não Rodentia, o gottingen minipig (Sus scrofa

domesticus), um ungulado desenvolvido laboratorialmente a partir do porco doméstico

(Nielsen et al., 2009).

Considerando que na maioria das espécies estudadas os núcleos

dopaminérgicos mesencefálicos apresentam uma distribuição semelhante, e no caso do

mocó se tenha encontrado uma diferença relacionada à organização da substância negra,

surge a necessidade de maiores detalhamentos de estudos desta natureza. Um dos

caminhos seria a ampliação da análise comparativa de amostras encefálicas de animais

de mesma ordem (tanto de mesma família, quanto de famílias diferentes), no que se

refere à consistência das divisões nucleares. Além disso, estudos paralelos poderão ser

desenvolvidos no sentido de comparar animais de ordens diferentes (Moon et al., 2007;

Maseko et al, 2007).

Portanto, este trabalho mostrou a proximidade existente entre os núcleos

dopaminérgicos do mesencéfalo do mocó (Kerodon rupestris) e de outros animais

(roedores ou não) estudados. Porém, lançou a perspectiva de aprofundamento de

estudos, no sentido de esclarecer ainda mais algumas divergências existentes, assim

como de avançar no sentido de compreender as mais diversas funções do sistema

dopaminérgico.

ACKNOWLEDGMENTS

This study was financially supported by the National Council for Scientific and

Technological Development (CNPq), Coordination for High Level Staff Improvement

(CAPES) and Research and Projects Financing (FINEP), Brazil.

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LEGENDAS DAS FIGURAS

Figura 1. Encéfalo do mocó em vistas dorsal (a) e ventral (b). Barra: 0,54 cm.

Figura 2. Reconstrução esquemática das secções coronais do encéfalo do mocó,

ilustrando a morfologia dos núcleos dopaminégicos do mesencéfalo. Representação do

nível mais rostral em (A) e do nível mais caudal em (P). Barra 1mm. Ver lista de

abreviações.

Figura 3. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,

ao nível de aproximadamente 2,34 mm p.b. submetidas a (A) Coloração pela técnica de

Nissl; (B) Imunoistoquímica para TH; (C) Ampliação da caixa homônima em B, em

área correspondente à SNm. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C.




área correspondente à SNcd; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área

correspondente a SNm. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D.




área correspondente à SNcd; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área

correspondente a SNm; (E) Ampliação da caixa homônima em B, em área

correspondente a VTAdc. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C, D e E.




área correspondente à SNl; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área

correspondente a VTA; (E) Ampliação da caixa homônima em B, em área

correspondente a VTAc. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C, D e E.




área correspondente à VTAd; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área

correspondente a SNl. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D.




área correspondente à VTA; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área

correspondente a cSN. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D .




área correspondente a cSN; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área

correspondente a SNv. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D .




área correspondente a cSN; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área

correspondente a SNv. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C .




área correspondente a VTAdc; (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área

correspondente a VTAd; (E) Ampliação da caixa homônima em B, em área

correspondente a VTAc. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C, D e E .




área correspondente a VTAdc; (D) e (E) Ampliações das caixas homônimas em B, em

áreas correspondentes a RRF. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e D.



Nissl; (B) Imunoistoquímica para TH; (C) e (D) Ampliações das caixas homônimas em

B, em áreas correspondentes a RRF. Barra: 2 mm em A, 1 mm em B, 100 µm em C e

D.




área correspondente a VTAdc e (D) Ampliação da caixa homônima em B, em área


ABREVIAÇÕES

3-hidroxitiramina/dopamina – DA

Aqueduto cerebral - Aq

Área tegmental ventral – VTA/A10

Área tegmental ventral central – VTAc

Área tegmental ventral dorsal - VTAd

Área tegmental ventral dorsal caudal – VTAdc

Comissura do colículo superior - CSC

Comissura posterior - pc

Fascículo retroflexo – fr

Imunoistoquímica – IH

Lemnisco medial – ml

Núcleo das habênulas - Hb

Núcleo interpeduncular – IP

Núcleo linear caudal da rafe - Cli

Núcleo mamilar – Mn

Núcleo do n. oculomotor – 3N

Núcleo pontino - PN

Núcleo pré-comissural – Prc

Núcleo rubro - RN

Núcleo subtalâmico - STh

Núcleo supramamilar – SuM

Pedúnculo cerebral – cp

Projeções nigro-estriatais –ns

Susbstância cinzenta periaquedutal - PAG

Substância negra pars compacta – SNc/A9

Substância negra compacta dorsal – SNcd

Substância negra lateral – SNl

Substância negra medial – SNm

Substância negra reticulada - SNr

Susbtância negra ventral – SNv

Substância negra (cauda) – cSN

Terceito ventrículo – 3V

Tirosina-hidroxilase – TH

Trato rubroespinal - rs

Zona incerta - ZI

Zona retrorubral – RRF/A8

a b

FIGURAS

A

C

B

C

Hb

fr

3V ml

Mn

ns ZI

cp SNm

A

C

D B

C D

Hb 3V

3V

fr

Mn

ml

ns VTA

cp

ZI SNcd

SNm

A

C D

C

D

E

B

E

3V PrC

Mn

fr

ZI

VTA

cp

SNcd

SNm

PAG

D

B A

E

C

C

D

E

pc

Aq PAG

cp

fr VTAc

VTA SNm SNcd

SNl

A

D

C

B

C D

pc

Aq PAG

RN

cp

VTAd

VTAc VTA fr

SNm

SNcd SNl

D

C

D

B A

C

pc Aq

PAG

RN VTAd

fr

cp

VTAc VTA

SNm SNcd

SNl cSN

C

D

B A

C D

CSC

Aq

PAG

RN

VTA VTAc

VTAd

cp SNv SNm

SNcd

SNl

cSN

C

B

A

C

CSC

Aq PAG

3N

RN

IP SNv

cp

cSN

SNcd

C

D

E A

C D

E

B

CSC

3N

RN VTAd

VTAc

IP cp

Aq

C D

C D

B A

CSC

PAG

3N

RN RRF

Aq

IP cp

SNcd

C D

C D

B A

Aq

PN

IP

VTAd

3N

PAG

RRF

rs

SNcd

C D

C

D B A

Aq PAG

3N

PN

IP

RRF

Documents

OS NÚCLEOS DOPAMINÉRGICOS DO MESENCÉFALO DO MOCÓ · 2017-11-04 · Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências Cavalcanti, José