CHERRY SIREGAR, dr, MKes
PEMBIAKAN BAKTERI DARI SPESIMEN KLINIK
TERIMA
baik ( prima) Jenis bahan sesuai dgn lembar
permintaan Jenis permintaan
mikrobiologik ( aerob,anaerob ,microaerofilik)
2. Pengolahan bahan
Dilakukan pengolahan sebelum ditanam
ke media perbenihan.
Tujuan : hasil baik dan tepat
Metoda :
- Sentrifugasi : jk jumlah kuman sedikit
- Pengenceran : jk jumlah kuman banyak
- Pemanasan : kuman berspora
kec.C.perfringens
- zat kimia : meniadakan kuman yang
tidak diinginkan ( kuman TBC)
- Penghancuran :
bahan padat tinja, jar tubuh,
Isolasi & identifikasi kuman
Alur kerja:
Kuman Aerob
Anaerob SAMA
Microaerofilik
Perbedaan :
lingkungan pertumbuhan
jenis perbenihan
Lingkungan pertumbuhan
Mikroaerofilik
Candle jar
Anaerob
Anaerobic jar
Kuman aerob tumbuh di alam
bebas
Kuman anarob bebas O2
Mikroaerofilik O2 rendah dan CO2
tinggi
Suhu : 37 0 C
Waktu pengeraman : anaerob lebih
lama
Langkah-langkah isolasi kuman ( aerob/anaerob)
1.Bahan pemeriksaan
a.Pengamatan mikroskopis :
sediaan hapusan yang diwarnai dgn
pewarnaan Gram
tujuan
morfologi dan sifat gram kuman (kasus
infeksi) c/ C.tetani, N.gonorrhoeae,
S.pneumonia, H.influenzae)
Infeksi : polimicrobial atau
monomicrobial
Pemilihan perbenihan
Cara isolasi
b. Penanaman kuman pada media
perbenihanSpesimen
ose
Media perbenihan
SolidBroth
Selektif yang solid
1-2% agar
Culture Media
Blood agar MacConkey agar Chocolate agar Incubate 35-37°C up to 48 ;CO2 microaerofilik
Lowenstein Jensen medium
U isolasi kuman BTA ( mycobacterium) 8 minggu
Media isolasi untuk spesimen feses
Selective-Differentiating Plating Media MacConkey agar (MAC) Salmonella Shigella agar (SSA) Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar
(TCBS)
MEDIA UNTUK ISOLASI KUMAN ANAEROB
Media padat : Nonselektif :
Agar Brucella diperkaya dengan :Darah domba defibrinated 55, Vitamin K, Hemin
Selektif :
Agar Brucella + antibiotik (kanamisin, vankomisin)
Media cair antara lain : Kaldu thioglycolate Kaldu Cook Meat Medium (CMM)
Kaldu Brain Heart Infusion (BHI)
Media semi solid : Media Cary Blair Media Stuart
Digunakan sebagai media transportasi spesimen (bahan pemeriksaan) anaerob.
Penyemaian bakteri pada permukaan medium padat dengan cara goresan (menstreak) secara berulang-ulang
Isolated colony
SOLID
Bakteri dari sediaan ose atau kapas lidi steril medium cair ,digoyang-goyangkan
BROTH
1: Obligate aerobic (oxygen-needing) bacteria gather at the top of the test tube in order to absorb maximal amount of oxygen.2: Obligate anaerobic bacteria gather at the bottom to avoid oxygen.3: Facultative bacteria gather mostly at the top, since aerobic respiration is the most beneficial one; but as lack of oxygen does not hurt them, they can be found all along the test tube.4: Microaerophiles gather at the upper part of the test tube but not at the top. They require oxygen but at a low concentration.5: Aerotolerant bacteria are not affected at all by oxygen, and they are evenly spread along the test tube.
2. Pengeraman
Spesimen yang telah ditanam dieramkan pada inkubator
suasana lingkungan, suhu pengeraman, lama pengeraman disesuaikan kebutuhan kuman ( aerob/anaerob/milroaerofilik)
3. Pengamatan Lakukan pengamatan koloni
Klebsiella
Mc Conkey
E coliMc
ConkeyPPp
E coliMc
Conkey
E coliEMB
PseudomonasMac Conkey
E coliMc
Conkey
pewarnaan Gram
gram positif coccus gram positif bacilli Staphylococcus Spp E.coli
Identifikasi kuman
identifikasi
CEPATEntero-tube
API-20RAPIDIANA
KONVENSIONALReaksi karbohidrat
Reaksi biokimia
Uji kepekaan antimikroba
Identifikasi kuman
CONVENTIONAL METHODE
Beda Staphylococcus dengan streptococcus
1.Gram Stain gram positif :
Staphylococcus : penataan : btk coccus,
anggur
Streptococcus : bentuk coccus rantai
2. Uji katalase
Staphylococcus : (+)
Streptococcus: (-)
3. Pertumbuhan
Staphylococcus :koloni besar, bbrapa hemolitic
Streptococcus: koloni kecil, byk hemolitic α,β
N
o
Organisme Ferme
ntasiM
annitol
Koagula
se
DNAse Novobio
cin
Hemoli
sa
1
2
3
.
Staphylococcus aureus
Staphylococcus
epidermidis
Staphylococcus
saprophyticus
+
-
-
+
-
-
+
-
-
S
S
R
Beta
Beta / O
O
Staphylococcus
Streptococcus sp
Berdasarkan tipe hemolisa”:agar darah
Streptococcus alpha hemolyticus
hemolisa yang tidak sempurna, warna kehijau-
hijauan di sekeliling koloni (green hemolysis)
Streptococcus beta hemolyticus.
Hemolisis sempurnazona bersih di sekeliling
koloni (clear zone)
Streptococcus anhemolyticus (gamma hemolyticus)
-->tidak menunjukkan hemolisa
IDENTIFIKASI Streptococcus sp
Morfologi koloni, hemolisa pada Agar
Darah.
Morfologi bakteri secara mikroskopis
dari sediaan usap yang diwarnai
dengan Gram.
Uji kepekaan terhadap basitrasin
(bacitracin susceptibility test).
Streptococcus
Streptococci On blood agar Growth inhibition disc
S. pyogenes (group A) -hemolytic Sensitive to bacitracin
S. agalactiae (group B) -hemolytic Resistant to bacitracin
S. pneumoniae (pneumococcus) -hemolytic Sensitive to optochin
Viridans -hemolytic Resistant to optochin
Resistensi antibiotik
PENTING !!! morbiditas dan mortalitas Perawatan di rumah sakitPeningkatan penggunanan : uji lab
dan Dx, prosedur u m’kontrol infeksi, AB mahal, memperpanjang lama rawatan di RS
04/12/23 34
1. Metode Uji Kepekaan Antibakteri secara langsung
a. Uji kepekaan antibakteri konvensional
→metode dilusi tabung, dilusi agar, difusi cakram
b. Uji kepekaan antibakteri komersial
→metode mikrodilusi, Tes E, spiral gradient endpoint system
c. Uji kepekaan antibakteri secara otomatisasi
→Sistem vitek, sistem walkaway
Tes kepekaan (susceptibility test) atau uji kepekaan atau tes resistensi
bakteri peka (susceptible) kurang peka (intermidiate)
antimikrobatidak peka (resistant)
Tes Kepekaan : 1. Cara Difusi (Difusion Methods) 2. Cara Pengenceran (Dilution
Methods)
Cara difusi - memakai cakram antibiotik lebih mudah
pengerjaannya• Cara dilusi KHM ( kadar hambat minimal )
kadar atau pengenceran tertinggi dimana pada kadar tersebut antimikroba masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri.
KBM/Konsentrasi Bunuh Minimum (MBC) adalah kadar atau pengenceran tertinggi dimana pada kadar tersebut antimikroba dapat mematikan bakteri
1. Tes Kepekaan Cara Difusi : (Kwalitatip)
Metode Kirby-Bauer, paling banyak dipakai di laboratorium
Mueller Hinton ; ketebalan 4 mm ; pH 7,2 – 7,4; Media harus dapat ditumbuhi oleh bakteri yang akan di uji.
CARA PENGERJAAN”1 Beberapa koloni bakteri medium cair (eramkan 2-5
jam pada 36o-37oC ) 0’5 Mac Farland2 . Cara penyemaian bakteri : Kapas lidi steril dicelupkan
kedalam medium cair yang berisi bakteri (ad.2) lalu disemaikan kepermukaan Lempeng Agar (ad.1) sehingga tersebar merata. Biarkan 3-5 menit (jangan lebih dari 15 menit)
4.Cakram antimikroba diletakkan pada permukaan lempeng agar dengan bantuan pinset steril. Eramkan pada suhu 37 C selama 18-24 jam.
5. HASIL: Mengukur daerah hambatan : zona hambatan di sekitar cakram antimikroba diukur diameternya dengan jangka sorong (kaliper) atau penggaris, lalu disesuaikan dengan tabel. Pengukuran daerah hambatan dalam mm
04/12/23 42
2 Metode Dilusi pada Lempeng Agar
Prinsip : penghambatan pertumbuhan bakteri pada permukaan agar terhadap antibiotik yang dicampurkan ke dalam lempeng agar 2ml Antibiotika + 18ml Medium Mueller Hinton → tuangkan pada lempeng petri(Satu konsentrasi antibiotika, pada 1 lempeng agar)
↓ Pengenceran Antibiotikamemerlukan 1 seri lempeng agar (biasanya 10 agar)Dianggap kurang praktis
04/12/23 43
1.2 Metode Dilusi pada Lempeng Agar
Dapat menentukan nilai MIC terhadap lebih dari 1 isolat bakteri (sampai 32 jenis bakteri)Dianjurkan untuk pemeriksaan N. gonorrhoeae dan N. meningitidisPembacaan Hasil : didapatkan nilai MIC, pada konsentrasi yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri
04/12/23 44
3. Metode Dilusi Cairan / Broth
Prinsip : Menentukan penghambatan pertumbuhan bakteri secara kuantitatif →penentuan nilai Minimal Inhibitory Concentration (MIC)Medium perbenihan : Mueller-Hintonharus optimum untuk pertumbuhan bakteri, kadang-kadang dibutuhkan suplementasiSuspensi Bakteri ≈ larutan Mc Farland 0,5 →diencerkan hingga diperoleh konsentrasi akhir 5x105CFU/ml
Methode Pengenceran Cara Makro dalam seri 12 tabung (Standard Test)Prinsip : Menggunakan 12 tabung reaksi ( 2 tabung terakhir sebagai kontrol).1.Masukkan media cair 1 cc Mueller Hinton Broth.
2.Buatlah larutan antimikroba yang diinginkan konsentrasinya. (misalnya 2 ug/cc)
3.Masukkan 1 cc larutan tersebut ke dalam tabung pertama 4.Pindahkan 1 cc larutan dari tabung ke-2 ke tabung ke-3 dst-nya sedemikian
sehingga sampai ke tabung ke 11. 5.Jadi tabung 1 s/d dengan tabung ke 11 berisi antimikroba dengan
konsentrasi kelipatan 2.6.Lalu buanglah 1 cc dari tabung ke 117.Tabung 11 ditambahkan beberapa tetes formalin (F) , sebagai kontrol
negatip (K -).8.Tabung 12 sebagai kontrol pertumbuhan (K +)9. ditambahkan 1 cc suspensi bakteri yang akan di uji kepekaannya10.Eramkan rak berisi tabung-tabung tersebut dlm inkubator pada suhu 37oC
selama11.Setelah 24 jam keluarkan rak dan perhatikan pada tabung keberapakah cairan
media menjadi keruh (ada pertumbuhan).
04/12/23 46
Pembacaan HasilPembacaan Hasil
MIC adalah nilai konsentrasi antibiotik terendah (μg/ml) yang tidak menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri secara mikroskopis
↓tidak adanya kekeruhan pada tabung, larutan jernih
bandingkan dengan larutan kontrol
04/12/23 49
2. Uji Kepekaan Antibakteri Komersial2. Uji Kepekaan Antibakteri Komersial- Perkembangan metode konvensional- Lebih mudah,cepat, akurat
2.1 Metode Mikrodilusi- Prinsip : mirip metode dilusi cairan (Menentukan nilai MIC)- Volume yang digunakan sedikit (0,05-0,1ml)- Panel polistyrene, 80-100 kompartemen → dapat memeriksa
hingga 12-15 antibiotika
Panel polistyrenePenentuan nilai MIC
04/12/23 50
04/12/23 51
04/12/23 52