PMP5-1
การวเคราะหปรมาณสารกาจดวชพชกลมคลอโรฟนอกซอะซตกแอซด
โดยแคปลลารอเลกโทรโฟรซส
Determination of Chlorophenoxyacetic Acid Herbicide by Capillary Electrophoresis
สรตดา ศรสวรรณ (Suratda Srisuwan)* ดร.จนทรเพญ อนทรประเสรฐ (Dr. Janpen Intaraprasert)**
บทคดยอ
การวเคราะหหาปรมาณสารกาจดวชพชกลมคลอโรฟนอกซอะซตกแอซด ไดแก 2,4-dichlorophenoxyacetic
acid (2,4-D), 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T), 4-chloro-2-methyphenoxyacetic acid (MCPA) และ 2-(2,4-
dichlorophenoxy)-propinic acid (dichloroprop.) ดวยเทคนคแคปลลารอเลกโทรโฟรซส โดยศกษาปจจยทมผลตอการ
วเคราะหปรมาณ ไดแก ชนดของสารละลายอเลกโทรไลต ความเขมขนของสารละลายอเลกโทรไลต พเอช(pH)
สารเตมแตง ศกยไฟฟาทใชในการแยกสาร และเวลาในการฉดสาร เพอหาสภาวะทเหมาะสมในการวเคราะห ซงพบวา
สภาวะทใหผลดทสดในการทดลองคอ การใช fused-silica capillary 50 µm i.d. x 64.5 cm (56 cm effective length) 50
mM phosphate buffer และ 100 mM sodium lauryl sulfate ท pH 7.0 เวลาทใชในการฉดสารตวอยาง 5 วนาท ศกยไฟฟา
+30 kV อณหภม 25 ๐C ตรวจวดสญญาณดวย UV-Visible detector ทความยาวคลน 214 นาโนเมตร และความยาวคลน
อางอง 280 นาโนเมตร โดยคา limit of detection (LOD) ของสารกาจดวชพชทง 4 ชนด คอ 0.5 มลลกรมตอลตร
ABSTRACT
Determination of chlorophenoxyacetic acid herbicide such as 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D),
2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T), 4-chloro-2-methyphenoxyacetic acid (MCPA) and 2-(2,4-
dichlorophenoxy)-propionic acid (dichloroprop.) were studied using capillary electrophoresis (CE). The optimum
analytical conditions were involved type of buffer solution, concentration of buffer solution, pH, buffer additive,
separation voltage and sample injection time. The experiment results indicated that the optimum condition were
fused-silica capillary 50 µm i.d. x 64.5 cm (56 cm effective length), 50 mM phosphate buffer solution and 100 mM
sodium lauryl sulfate, pH 7.0, sample injection times 5 sec., separation voltage +30 kV, temperature at 25 ๐C, UV-
Visible detector, signal wavelength at 214 nm and reference wavelength at 280 nm.The limit of detection for these
herbicides were 0.5 mg/l.
คาสาคญ: แคปลลารอเลกโทรโฟรซส สารกาจดวชพช คลอโรฟนอกซอะซตกแอซด
Key Words: Capillary Electrophoresis, Herbicide, Chlorophenoxyacitic Acid
* นกศกษา หลกสตรวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาเทคโนโลยสงแวดลอม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยอบลราชธาน
** ผชวยศาสตราจารย ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยอบลราชธาน
367
PMP5-2
บทนา
การทาเกษตรกรรมในประเทศไทย มการใชยา
ฆาแมลง (pesticides) และสารกาจดวชพช (herbicides)
อยางกวางขวาง ขอมลทแสดงใหเหนถงการใชสาร
กาจดวชพชทมปรมาณมากในประเทศไทย พบวามการ
นาเขาสารกาจดวชพช ใน ป พ.ศ.2552 ปรมาณ 85,821
ตน คดเปนมลคา 9,338 ลานบาท และมแนวโนมเพมขน
ทกป (สานกงานเศรษฐกจการเกษตร, 2554) การใช
สารเคมประเภทตางๆ เหลาน โดยทไมไดรบคาแนะนา
ทถกตอง เชน การใชในปรมาณทมากเกนพอเพอทจะ
เรงใหไดผลผลตทด มคณภาพ และมจานวนมาก ซง
บางครงเกษตรกรไมไดทงระยะเวลาใหนานพอกอนการ
เกบเกยว และจาหนายตอผบรโภค ซงอาจทาใหสารเคม
เหลานตกคางอยในผลผลต ในดน และบางสวนถกชะ
ลงสแหลงน า เปนสาเหตใหเกดผลกระทบตอผบรโภค
และสงแวดลอม ดงนนจงตองมการตรวจสอบปรมาณ
การตกคางของสารกาจดว ชพช ท งในผลผลตทาง
การเกษตรและสงแวดลอม
การตรวจหาปรมาณสารกาจดวชพชทตกคาง
ในผลผลตทางการเกษตร หรอในสงแวดลอม ทมระดบ
ความเขมขนต า (ppm) สวนใหญใชเครองมอ high
performance liquid chromatography (HPLC) และ gas
chromatography (GC) แตอยางไรกตาม HPLC และ GC
มขอจากดหลายดาน เชน เทคนคการวเคราะหดวย
HPLC นน ตองใชตวทาละลายอนทรย ในปรมาณทมาก
ใชเวลาในการวเคราะหนาน และการเสอมสภาพของ
HPLC คอลมน ซงมราคาสง และไมสามารถใชเทคนค
HPLC ในการวเคราะหยาฆาแมลงทไมม chromophore
หรอ fluorophore บางชนดได สวนในการวเคราะหสาร
ฆาแมลงและสารกาจดวชพชบางชนดดวย GC นน ม
ขนตอนทยงยากมากขนในข นตอนของการเตรยม
ตวอยาง คอ การทาใหเกดสารอนพนธ (derivatization)
เพอเพมความสามารถในการระเหยของสารตวอยาง ทา
ใหใชเวลาในการวเคราะหนาน และสารรเอเจนตทใช
ทาปฏกรยา สวนใหญมราคาสงและเปนพษ
ขอดของ CE เมอเปรยบเทยบกบ HPLC คอ
CE เปนวธทมประสทธภาพการแยกสงกวา HPLC (Yu
et al., 2005) ในการวเคราะหโดยใช CE จะใชสารเคม
สารละลาย และตวทาละลายในปรมาณทนอยมาก
(ระดบ µL) ทาใหปรมาณของเสยจากหองปฏบตการ
นอย นอกจากนแลว CE ยงเปนวธทสะดวก ใชงาย เวลา
ทใชในการวเคราะหสน ตนทนการวเคราะหตอหนวย
ตา CE ประกอบดวยชนดของการแยก (separation
mode) หลายชนด เชน capillary zone electrophoresis
(CZE) ซงเปนวธทงายทสด เหมาะสาหรบการแยก และ
ว เ ค ร า ะ ห ส า ร ท ม ป ร ะ จ ข น า ด เ ล ก แ ล ะ micellar
electrokinetic chromatography (MEKC) สามารถใช
แยกสารไดทงทมประจและเปนกลางทางไฟฟาได (Zhu
et al., 2002) โดยการเตมสารลดแรงตงผว (surfactant)
ลงในสารละลายอเลกโทรไลตเพอใหเกดเปนไมเซลล
(micelle) กลไกการแยกสารทเปนกลางทางไฟฟาเกด
จากอนตรกรยาระหวางสารกบไมเซลล เปนตน
จากขอดของ CE ทาให CE เปนเทคนคท
ไดรบความนยมในการแยกและวเคราะหหาปรมาณสาร
กาจดวชพช (Silva et al., 2003; Zerbinati et al., 2000)
ซงดจากมรายงานการใช CE ในการวเคราะหหาปรมาณ
สารกาจดวชพชอยางมากมาย อาทเชน จากรายงานการ
วจยของ Mechref et al. (1997) ไดศกษาการแยกและ
วเคราะหสารกาจดวชพชทเปน enantiomeric โดยการ
เตมสารลดแรงตงผว (surfactants) เพอชวยในการแยก
สารอยางสมบรณโดยใช CE นอกจากนมรายงานการใช
CE ในการวเคราะหหาสารตกคางในสงแวดลอม เชน
Fu et al. (2009) ไดใช CE ในการวเคราะหหาสภาวะท
เหมาะสมในการวเคราะหหาปรมาณสารทปนเปอนใน
ดน เพอดอตราการยอยสลายของสาร 2,4-D และ
MCPA-sodium ในดน Dinelli et al. (1995) ไดศกษาหา
ปรมาณการปนเปอนซลโฟนลยเรย(sulfonylurea) ใน
ดนโดยใชเทคนค MEKC ซงสามารถวเคราะหสารทม
ความเขมขนตาๆไดถง10 ppb. เปนตน
368
PMP5-3
วตถประสงคของงานวจย
เพอศกษาหาสภาวะทเหมาะสมในการวเคราะห
ปรมาณสารกาจดวชพช กลมคลอโรฟนอกซอะซตแอซด
4 ชนดไดแก 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)
2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) 4-chloro-
2-methyphenoxyacetic acid (MCPA) 2-(2,4-dichloro
phenoxy) - propionic acid (dichloroprop.)
เครองมอ และสารเคม
เครองมอ 3D Capillary electrophoresis
Instrument (Agilent Thechnologies,Deutshland, Germany)
equipped with a UV detector, Fused silica capillary 50 um
i.d. x 64 cm (Polymicro Technologies, Arizona, USA)
สารเคม 2 ,4-dichlorophenoxyacetic acid
(2,4-D) 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T)
4-chloro-2-methyphenoxyacetic acid (MCPA) 2-(2,4-
dichlorophenoxy) -propionic acid (dichloroprop.)
Acitic acid glacial (CH3COOH) Sodium acetate
(CH3COONa) Boric acid (H3BO3) Sodium tetraborate
(Na2B4O7) Sodium di-hydrogen phosphate
(NaH2PO4) Di-sodium hydrogen phosphate anhydrous
(Na2HPO4) Sodium lauryl sulfate
(CH3(CH2)11OSO3Na,(SDS)) Sodium hydroxide
anhydrous pellets(NaOH) Methanol (CH3OH)
Orthophosphoric acid 85% (H3PO4)
การเตรยมสารละลายมาตรฐานทใชในการ
ทดลองเตรยมสารละลาย stock standard แตละชนดให
มความเขมขน 1000 ppm โดยใช methanol เปนตวทา
ละลาย รกษาไวทอณหภม 4 ๐C เตรยมสารละลาย
working ทเปนสารละลายผสมของ standard แตละชนด
ใหมความเขมขนชนดละ 20 ppm โดยการนาสารละลาย
stock standard แตละชนดมา 1 ml ผสมกนและปรบ
ปรมาตรดวยสารละลายอเลกโทรไลตใหเปน 10 ml เมอ
จะนาเขาเครอง CE จะตองกรองดวย 0.45 µm nylon
filter membrane ใสใน CE Vials จากนนนาไปเขา
เครอง ultrasonic เพอไลฟองอากาศ
การเตรยมสารละลาย stock buffer ใหมความ
เขมขน 200 mM เตรยมสารละลายอเลกโทรไลตใหม
ความเขมขนชนดละ 50 mM โดยปเปตสารละลาย stock
buffer มา 6.25 ml ลงในบกเกอรขนาด 50 ml เตมน า DI
ลงไปประมาณ 10 ml ปรบ pH ใหได 7.00 ดวย 1 M
NaOH จากนนเทสารละลายลงในขวดวดปรมาตรขนาด
25 ml ปรบปรมาตรดวยน า DI จนครบปรมาตร เมอจะ
นา เขา เค รองCE จะตองกรองและไลฟองอากาศ
เชนเดยวกบตวอยาง
วธการวจย
วธวเคราะหสารกาจดวชพชโดยใชเครอง CE
กอนทาการวเคราะหจะตองลางแคปลลารคอลมนใหม
ดวยสารละลาย 1 M NaOH เปนเวลา 30 นาท เพอเปน
การ regenerate SiO- groups บนผวภายในของแคปลลา
รคอลมน เพอให EOF คงทภายหลงการลางดวย
สารละลาย แลวลางดวยน า DI เปนเวลา 1 ชวโมง เพอ
ลางเบสออก จากน นทาการ equilibrate แคปลลาร
คอลมนใหมดวยสารละลายอเลกโทรไลตเปนเวลา 20
นาท โดยใชความตางศกย +25 kV อณหภม 25 ๐C
เพอใหมสารละลายอเลกโทรไลตอยในแคปลลาร และ
ทาใหเกดสมดลบนผวภายในของแคปลลาร เกดเปน
double layer เพอใหได EOF ทคงท หลงการวเคราะห
ครงสดทายในแตละวน จะตองลางดวยน า DI เปนเวลา
5 นาท และผานอากาศเขาไปในแคปลลารเปนเวลา 3
นาท การเกบแบบนจะชวยใหแคปลลารมอายการใช
งานทยาวนาน และใหผลการทดลองทแมนยา
การทดลองหาสภาวะท เหมาะสมในการ
วเคราะหสารกาจดวชพช กลม คลอโรฟนอกซอะซตก
แอซด 4 ชนด ดงน
ศกษาผลของชนด พเอช ของสารละลายอเลก
โทรไลต ศกษาสารละลายอเลกโทรไลต 3 ชนด ไดแก
Acetate buffer Borate buffer และ Phosphate buffer
369
PMP5-4
โดยใชความเขมขน 50 mM ความตางศกยทใช +30 kV
อณหภม 25 ºC ท pH ตางๆ ดงน acetate buffer pH 3.5
4.0 4.5 5.0 borate buffer pH 7.5 8.0 8.5 9.0 phosphate
buffer pH 2.5 6.0 7.0 8.0
ศกษาผลของความเขมขนของสารละลาย
phosphate buffer คอ 25 50 และ75 mM
ศกษาผลของความเขมขนของสารเตมแตง
(SDS) คอ 25 50 75 และ100 mM
การระบตาแหนงพคของสารกาจดวชพช โดย
ทาการ spiking สารละลายมาตรฐานผสม คอ การเตม
สารละลายมาตรฐานลงในสารละลายมาตรฐานผสมท
ละตว
ศกษาผลของเวลาในการฉดสารตวอยาง คอ 5
10 และ 20 วนาท
ศกษาผลของความตางศกยไฟฟาทใช คอ +10
+20 และ +30 kV
หาคา Limit of detection
ผลการวจยและการอภปรายผล
ผลของชนดของสารละลายอเลกโทรไลต
การเลอกสารละลายอเลกโทรไลตเปนสงท
สาคญอยางยงตอการวเคราะหดวยเทคนคแคปลลารอ
เลกโทรโฟรซส โดยจะตองพจารณาถงพเอช ความ
เขมขนหรอความแรงไอออนของสารละลายอเลกโทร
ไลตและสารเตมแตงทเตมในสารละลายอเลกโทรไลต
เ น อ ง จ า ก อ ง คป ร ะ ก อ บ เ ห ล า น ม ผ ล โ ด ย ต ร ง ต อ
ประสทธภาพการแยกสาร และความเฉพาะตอสาร
(selectivity) สารละลายอเลกโทรไลตทดควรใหผลการ
แยกทดและไมรบกวนการแยกสาร มความจบฟเฟอรสง
(buffer capacity) ในชวงพเอชทกวาง ไมเปลยนแปลงพ
เอชเมออณหภมเปลยนแปลง ไมรบกวนการตรวจหา ม
ความสามารถในการเคลอนทภายใตสนามไฟฟา
ใกลเคยงกบสาร และสามารถละลายสารตวอยางไดด
(ลณา, 2550)
ในการทดลองไดทาการทดลองโดยใช
สารละลายอเลกโทรไลต 3 ชนด ไดแก Phosphate
buffer, Borate buffer และ Acetate buffer ผลการ
ทดลองพบวาเมอใช Acetate buffer สามารถแยกสารได
ทงหมด แตใชเวลาในการแยกนานและรปรางของพคจะ
มฐานกวาง Borate buffer สามารถแยกสารได 3 พค
และลกษณะของพคจะซอนทบกนอยไมสามารถแยกได
อยางชดเจน สวน Phosphate buffer สามารถแยกสารทง
4 ชนดได แตพคของ 2,4-D และ 2,4,5-T ยงซอนทบกน
อยเนองจากมโครงสรางทใกลเคยงกนจงแยกไดยาก แต
ม migration time ทสน และฐานพคแคบ แสดงดงรปท
1 ดงนนจงเลอก phosphate buffer เปนสารละลายอเลก
โทรไลต ทจะใชในการทดลองตอไป
0 10 20 30 40 50 60
0
10
20(a)
2
43
21
Migration time (min)
0 5 10
0
10
20(b)3+41+2
0 5 10
0
10
20(c)1
3+4
Res
pons
e (m
AU
)
รปท 1 Electropherograms แสดงการผลการแยกของ
สารละลายมาตรฐานในสารละลายอเลกโทร
ไลตทง 3 ชนด
Condition: buffer composition; (a) 50 mM acetate
buffer ; pH 4.5 (b) 50 mM borate buffer ; pH 9.0 (c)
50 mM phosphate buffer ; pH 7.0 , separation
voltage +30kV, temperature 25 ๐C, sample injection
time (50mbar) 5 sec. ,capillary length 64.5 cm X 50
µm i.d., effective length 56 cm, Peak
identification: 1 = Dichloroprop, 2 = MCPA, 3 =
2,4-D, 4 = 2,4,5-T
ผลของพเอช (pH) ของสารละลายอเลกโทรไลต
370
PMP5-5
พเอชของสารละลายอเลกโทรไลตมผลตอการ
แตกตวเปนไอออนของสาร เนองจากสารจะแตกตวให
ประจไมเทากนทพเอชแตกตางกน จงทาใหผลรวมของ
ประจแตกตางกนทแตละพเอช ซงมผลตอความสามารถ
ในการเคลอนทภายใตสนามไฟฟาของสาร การเพมพเอช
ของสารอเลกโทรไลตทาใหการไหลอเลกโทรออสโมตก
เพมขน ในทางตรงกนขามหากลดพเอชของสารละลายอ
เลกโทรไลต การไหลของอเลกโทรออสโมตกจะลดลง
จากการทดลองสารละลายอเลกโทรไลตทพเอช 2.5 6.0
7.0 และ8.0 อธบายผลการทดลองดงรปท 2
0 10 20 300
10
20
Res
pons
e (m
AU
)
Migration time (min)
0 10 20 300
10
20
43
1
0 100
10
20 (c)
(b)
(a)
3+42
3+42
2
1
1
0 100
10
20(d)
รปท 2 Electropherograms แสดงการแยกของ
ส า ร ล ะ ล า ย ม า ต ร ฐ า น ใ น ส า ร ล ะ ล า ย
phosphate buffer ทพเอชตางๆ
Condition: buffer composition; (a) 50 mM phosphate
buffer ; p H (a) 2.5 , (b) 6.0 , (c) 7.0 , (d) 8.0 ,separation
voltage +30kV, temperature 25 ๐C, sample injection
time (50mbar) 5 sec. ,capillary length 64.5 cm X 50 µm
i.d., effective length 56 cm, Peak identification :
1 = Dichloroprop,2 = MCPA,3 = 2,4-D, 4 = 2,4,5-T
จากรปท 2 พบวา ท pH 6.0 พคของสารเกดการ
แยกอยางชดเจน แตม migration time ของสารทนาน
เกนไป สวนท pH 7.0 และ 8.0 จะเกดการแยกทคลายกน
และม migration time ทใกลเคยงกน แตพค 2,4-D และ
2,4,5-T จะซอนทบกนและรวมเปนพคเดยวกนท pH 8.0
ดงน นจงเลอกสารละลายอเลกโทรไลตทม pH 7.0
เนองจากมฐานพคทแคบ ม migration time ทไมนาน
เกนไป และเกดการแยกใหเหนทง 4 พค แตกยงมบางสวน
ทซอนทบกน ซงจะทาการทดลองในขนตอไปเพอทาให
เกดการแยกอยางชดเจน
ผลของความเขมขนหรอความแรงไอออนของ
สารละลายอเลกโทรไลต
ความแรงไอออนของสารละลายอเลกโทรไลตม
ผลตอประสทธภาพในการแยกสาร การแยกชด และสภาพ
ไวของวธวเคราะห การเปลยนความแรงไอออนของ
สารละลายอเลกโทรไลตทาไดโดยการเปลยนความเขมขน
หรอชนดของสารละลายอเลกโทรไลต ซงมผลตอการ
ไหลอเลกโทรออสโมตกและความสามารถในการ
เคลอนทภายใตสนามไฟฟาตามลาดบ
0 100
10
20
304
32
1 (a)
Res
pons
e (m
AU
)
migration time (min)
0 100
10
20
30 4
32
1 (b)
0 150
10
20
30
432
1
(c)
รปท 3 Electropherograms แสดงการแยกของ
ส า ร ล ะ ล า ย ม า ต ร ฐ า น ใ น ส า ร ล ะ ล า ย
phosphate buffer ทความเขมขนตางๆ
Condition: buffer composition; phosphate buffer ; p H
7.0 : (a) 25 mM , (b) 50 mM , (c) 75 mM, separation
voltage +30kV, temperature 25 ๐C, sample injection
time (50mbar) 5 sec. ,capillary length 64.5 cm X 50
µm i.d., effective length 56 cm, Peak identification:1
= Dichloroprop,2 = MCPA,3 = 2,4-D, 4 = 2,4,5-T
รปท 3 แสดงผลการทดลองทไดศกษาผลของ
ความเขมขนของสารละลาย Phosphate buffer ทความ
371
PMP5-6
เขมขน 25 50 และ 75 mM พบวาคาความเขมขนท
เหมาะสมคอ 50 mM ทใหผลการทดลองทดทสด คอ
สามารถแยกไดอยางชดเจน พคมฐานแคบ และใชเวลาใน
การวเคราะหสนหรอม migration time ทไมนานเกนไป
เมอเทยบกบความเขมขนท 25 และ 75 mM ซงทงสอง
ความเขมขนกสามารถแยกสารไดทง 4 ชนดเชนกน แตท
25 mM พคท 2,3 เกดการซอนทบกนบางสวน สวนท 75
mM ใชเวลาในการวเคราะหนาน และมฐานพคทกวาง
ผลของความเขมขนของสารเตมแตง (Buffer
Additive (Sodium lauryl sulfate; SDS))
0 100
102030
3+421(a)
Res
pons
e (m
AU
)
Migration time (min)
0 100
102030 2+3+4
1
(c)
(b)0 100
102030
4321
0 10
0102030
321
432
1 (d)0 10
0
104 (e)
รปท 4 Electropherograms แสดงการแยกของ
สารละลายมาตรฐาน โดยเตมสาร buffer
additive (SDS) ลงในสารละลาย phosphate
buffer ทความเขมขนตางๆ
Condition: buffer composition; 50 mM phosphate buffer
; p H 7.0 : add SDS (a) 25 mM , (b) 50 mM , (c) 75 mM
,(d) 100 mM and (e) 125 mM ,separation voltage +30kV,
temperature 25 ๐C, sample injection time (50mbar) 5 sec.
,capillary length 64.5 cm X 50 µm i.d., effective length 56
cm, Peak identification:1 = Dichloroprop,2 = MCPA,3 =
2,4-D, 4 = 2,4,5-T
การเตม SDS ลงในสารละลาย phosphate buffer
เ พ อ ค วบ ค ม ก าร ไ ห ล อ เ ล ก โ ท ร อ อ ส โ ม ต ก เ พ ม
ประสทธภาพและความเฉพาะตอสาร ลดอนตรกรยา
ระหวางสารและผนงดานในแคปลลาร ชวยเพมการละลาย
ของสารตวอยางและเพมการแยกชด จากการทดลองทผาน
มาพบวา 2,4-D กบ MCPA จะแยกจากกนไดยาก ดงนนจง
ตองเตมสารเตมแตงลงไปในสารละลายอเลกโทรไลตเพอ
ชวยใหเกดการแยกไดอยางชดเจน ซงในการทดลองนได
ศกษาผลของสารเตมแตงทความเขมขน 25 50 75 100 และ
125 mM ดงรปท 4 พบวาทความเขมขนของ SDS ท
100 mM จะสามารถแยกสารตวอยางทง 4 พค ไดอยาง
ชดเจน พคฐานแคบ และใชเวลาในการวเคราะหสน
การระบ (identify) ตาแหนงของสารตวอยาง
การระบตาแหนงของสารตวอยางทาได 2 วธ
คอการเปรยบเทยบเวลาของการเคลอนทของสาร
(migration time) และการทา spiking ซงในการทดลองนได
ระบดวย การทา spiking เนองจากสามารถระบตาแหนงท
แนนอน และใหความแมนยาของขอมลทมากกวาการ
เปรยบเทยบเวลาของการเคลอนทของสาร (migration
time) การทา spiking สารตวอยางผสม ดวยการเตม stock
standard solution ของสารแตละชนดลงในสารละลาย
ตวอยางผสม แลวนาไปวเคราะหดวยเครองแคปลลารอ
เลกโทรโฟรซส พคจะมขนาดใหญขนซงหมายถงปรมาณ
สารทมากขน แตไมมผลตอพคตาแหนงอน
8 102
4
6
8
3
4
2
1
Resp
onse
(mAU
)
Migration time (min)
รปท 5 Electropherograms แสดงการแยกของ
สารละลายมาตรฐานระบตาแหนงของสาร
แตละชนด
372
PMP5-7
Condition: buffer composition; 50 mM phosphate
buffer + 100 mM SDS ; p H 7.0 , separation voltage
+30kV, temperature 25 ๐C, sample injection time
(50mbar) 5 sec. ,capillary length 64.5 cm X 50 µm i.d.,
effective length 56 cm, Peak identification:
1 = Dichloroprop,2 = MCPA,3 = 2,4-D, 4 = 2,4,5-T
จากการทา spiking สามารถทราบตาแหนงของสารทง 4
ชนด คอ Dichloroprop(1) MCPA(2) 2,4-D(3) และ 2,4,5-T
(4) ตามลาดบ แสดงดงรปท 5
ผลของเวลาในการฉดสาร (Injection time)
ผลของเวลาในการฉดสาร มผลตอการกระจาย
ของพค และประสทธภาพของการวเคราะห หากเวลาใน
การฉดสารเพมขนจะกระจายมากขนและประสทธภาพใน
การแยกลดลง ในการทดลองนไดศกษาผลของการฉดสาร
ทเวลา 5 10 และ 20 นาท พบวาทเวลา 5 วนาท สาร
ตวอยางจะแยกกนไดอยางชดเจน เมอเพมเวลาการฉดสาร
นานขน จะทาใหสารท 2,3 เรมซอนทบกน และจะ
ซอนทบกนไดอยางชดเจนเมอฉดสารเปนเวลา 20 วนาท
ดงนนจงเลอกเวลาการฉดสารท 5 วนาท แสดงดงรปท 6
0 5 100
5
104
32
1(a)
Res
pone
s (m
AU)
Migration time (min)
0 5 100
5
1043
21 (b)
0 5 100
5
10 42+31 (c)
รปท 6 Electropherograms แสดงการแยกของ
สารละลายมาตรฐาน ทใชเวลาในการฉดสาร
ตวอยางตางกน
Condition: sample injection time (50mbar) : (a) 5 sec. (b)
10 sec. and (c) 20 sec.; buffer composition: 50 mM
phosphate buffer + 100 mM SDS ; p H 7.0 , separation
voltage +30kV, temperature 25 ๐C, ,capillary length 64.5
cm X 50 µm i.d., effective length 56 cm,
Peak identification:1 = Dichloroprop,2 = MCPA,3 = 2,4-
D, 4 = 2,4,5-T
ผลของความตางศกยไฟฟา (Applied Voltage)
ความตางศกยไฟฟามผลตอประสทธภาพใน
การแยกสาร เ มอ เ พมความตางศกยไฟฟาสารจะ
เคลอนทออกจากแคปลลารเรวขน เนองจากความเรวใน
การไหลอเลกโทรออสโมตกและความเรวอเลกโทรโฟร
ตกเปนปฏภาคโดยตรงกบความแรงของสนามไฟฟา
รวมท งทาใหการแพรของสารลดลง ใชเวลาในการ
วเคราะหสน จากการศกษาผลของศกยไฟฟาทใชตงแต
+10 +20 และ+30 kV แสดงดงรปท 7 พบวา ทงสาม
ความตางศกยไฟฟาสามารถแยกสารไดอยางชดเจน แต
ท+30 kV จะใชเวลาในการเคลอนทของสารนอยกวา
และพคฐานแคบ ดงนนจงเลอกความตางศกยไฟฟาท
+30 kV
0 10 20 30
0
10
20 43
21 (a)
Res
pons
e (m
AU
)
Migration time (min)
0 5 10 15
0
10
20 4
32
1 (b)
0 5 10
0
10
204
32
1(c)
รปท 7 Electropherograms แสดงการแยกของ
สารละลายมาตรฐาน ทคาความตาง
ศกยไฟฟาตางๆ
Condition separation voltage (a) +10 kV (b) +20 kV (c)
+30 kV ; buffer composition: 50 mM phosphate buffer
+ 100 mM SDS ; p H 7.0 , sample injection time
(50mbar) 5 sec. , temperature 25 ๐C, ,capillary length
64.5 cm X 50 µm i.d., effective length 56 cm,
Peak identification:1 = Dichloroprop,2 = MCPA,
3 = 2,4-D, 4 = 2,4,5-T
373
PMP5-8
ผลการหาคา Limit of detection (LOD)
การหาคา Limit of detection (LOD) หาจาก
สภาวะการทดลองทดทสด โดยทาการลดความเขมขน
ของสารตวอยางลงเรอยๆ เพอหาขดจากดตาสดทเครอง
สามารถวเคราะหได ผลการศกษาทไดจากการทดลองน
คอ 0.5 mg/l
สรปผลการวจย
จากผลการทดลองสภาวะทเหมาะสมทสดใน
การวเคราะหหาสารกาจดวชพช ประเภท คลอโรฟนอก
ซอะซตกแอดซด ไดแก 2 ,4-dichlorophenoxyacetic
acid (2,4-D) 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T)
4-chloro-2-methyphenoxyacetic acid (MCPA) 2-(2,4-
dichlorophenoxy)-propinic acid (dichloroprop.) คอ
fused-silica capillary 50 µm i.d. x 64.5 cm (56 cm
effective length) สารละลาย 50 mM phosphate buffer
ผสมกบ 100 mM sodium lauryl sulfate pH 7.0 เวลาใน
การฉดสารตวอยาง 5 วนาท ความตางศกยไฟฟา +30
kV อณหภม 25 ๐C ตรวจวดสญญาณดวย UV-Visible
detector ทความยาวคลน 214 นาโนเมตร และความยาว
คลนอางอง 280 นาโนเมตร คา Limit of detection คอ
0.5 mg/l
การวเคราะหโดยแคปลลารอเลกโทรโฟรซส
สามารถทาการทดลองไดสะดวก มความรวดเรวเนองจาก
สามารถวเคราะหสารไดภายใน 10 นาท และนอกจากนยง
ใชปรมาณสารตวอยางและสารละลายอเลกโทรไลตใน
ปรมาณทนอย ทาใหคาใชจายในการวเคราะหตา และ
กอใหเกดของเสยนอย และไมเพมปญหาดานสงแวดลอม
ดงนนแคปลลารอเลกโทรโฟรซสจงเปนอกเทคนคหนงท
เหมาะสมในการนามาประยกตใชวเคราะหสารตวอยาง
ขอเสนอแนะ
ผลการทดลองทไดจะนาไปใชเปนสภาวะ
เรมตนในการพฒนาเทคนคการเพมความเขมขนของ
สารตวอยาง เชน sample stacking, field-amplified
sample injection (FASI) และ anion selective
exhaustive injection (ASEI) และนาผลการทดลองทได
ไปประยกตใชกบตวอยางจรงตอไป
กตตกรรมประกาศ
ขาพเจาขอขอบพระคณ ผศ.ดร.จนทรเพญ
อนทรประเสรฐ อาจารยทปรกษา อาจารยประจา
หลกสตรเทคโนโลยสงแวดลอม อาจารย เจาหนาท รนพ
คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยอบลราชธาน ทคอย
ชวยเหลอ ใหคาปรกษาและคาแนะนาในการวางแผน
งานวจยในครงน ตลอดจนใหคาปรกษาตรวจสอบแกไข
ขอบกพรองตางๆ
เอกสารอางอง
ลณา สนทรสข. 2550. ตาราแคปลลารอเลกโทรโฟรซส.
กรงเทพฯ: คณะเภสชศาสตร
มหาวทยาลยมหดล.
สานกงานเศรษฐกจการเกษตร.2545. ปรมาณและมลคา
การนาเขาสารกาจดศตรพชป 2545-2552. คนเมอ
10 กมภาพนธ 2554, จาก http://www.oae.go.th
Dinelli, G., Vicari, A., Brandolini,V. 1955. Detection
and quantitation of sulfonylurea herbicides in soil
at the ppb level by capillary electrophoresis.
Journal of Chromatography A.700: 201-207.
Fu,F.,Xiao,L.,Wang,W.,Xu,X.,Xu,L.,Qi,G.,Chen,G.
2009. Study on the Degradation of 2,4-
dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 2-
methyl-4-chloro-phenoxyacetic sodium (MCPA -
sodium) in natural agriculture-soils of Fuzhou,
China using capillary electrophoresis. Science of
the Total Environment. 407:1998-2003.
Mechref,Y.,Rassi,Z.E. 1997.Capillary electrophoresis
of herbicides II. Evaluation of alkylglucoside
chiral surfactants in the enatiomeric separation of
phenoxy acid herbicides. Journal of
Chromatography A. 757: 263-273.
374
PMP5-9
Silva, C.L.D., Lima, E.C.D., Tavares, M.F.M. 2003.
Investigation of Preconcentration strategies for
the trace analysis of multi-residue pesticides in
real by capillary electrophoresis. Journal of
Chromatography A. 1014: 109-116.
Yu, L., Qin, W., Li, S.F.Y. 2005. Ionic liquids as
additives for separation of benzoic acid and
chlorophenoxy acid herbicides by capillary
electrophoresis. Analytical Chimica Acta. 547:
165-171.
Zerbinati, O., Trotta, F., Giovannoli, C. 2000.
Optimization of the cyclodextrin-assisted
capillary electrophoresis separation of the
enantiomers of phenoxy acid herbicide.
Journal of Chromatography A. 875:
423-430.
Zhu,L.,Tu,C., Lee,H.K. 2002. On-Line Concentration
of Acidic Compounds by Anion-selective
Exhaustive Injection- Sweeping – Micellar
Electrokinetic Chromatography.
Analytical Chemistry. 74: 5820-5825.
375