UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica
Preparo e caracterização de micelas poliméricas de Pluronic F127
contendo miltefosina
Vinicius Cordeiro de Almeida
Trabalho de Conclusão do Curso de
Farmácia-Bioquímica da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas da
Universidade de São Paulo.
Orientador(a):
Prof.(a). Dr(a) Carlota O. Rangel Yagui
São Paulo
2020
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SUMÁRIO
Pág.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS
RESUMO
1. INTRODUÇÃO
2. OBJETIVOS
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. MICELAS POLIMÉRICAS COMO SISTEMA CARREADOR DE FÁRMACOS
3.2. FORMAÇÃO DE MICELAS POLIMÉRICAS
3.3. ENSAIOS DE HEMÓLISE
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. MICELAS POLIMÉRICAS COMO SISTEMA CARREADOR DE
FÁRMACOS: ESTADO DA ARTE
4.2. FORMULAÇÃO E OTIMIZAÇÃO DE MICELAS POLIMÉRICAS
4.3. REDUÇÃO DO POTENCIAL HEMOLÍTICO DA MILTEFOSINA APÓS
INCORPORAÇÃO EM MICELAS DE PLURONIC® F127
5. CONCLUSÃO
7. REFERÊNCIAS
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Estrutura química da MTF
Figura 2 – Mecanismos de ação da MTF
Figura 3 – Formação de micela a partir de copolímero tribloco PEO-PPO-PEO
Figura 4 – Estrutura Geral de Pluronics®
Figura 5 – Mecanismo de formação de micelas poliméricas
Figura 6 – Técnicas de formulação de micelas poliméricas
Figura 7 – Caracterização de micelas poliméricas de Pluronic® F127 preparadas por
diferentes métodos
Figura 8 – Curva de hemólise de sangue de carneiro desfibrilado com concentrações
crescentes de MTF
Figura 9 – Curva de hemólise de sangue de carneiro desfibrilado com 60 µg/mL de MTF
com concentrações crescentes de Pluronic® F127
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Caracterização de micelas poliméricas de Pluronic® F127 preparadas pelos
métodos de hidratação de filme e dissolução direta, com suas respectivas variações nos
métodos
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LISTA DE ABREVIATURAS
DLS Dynamic Light Scattering - Espalhamento Dinâmico de Luz
MTF Miltefosina
MAPK Mitogen Activated Protein Kinases
PLA poli(ácido lático)
PCL poli(caprolactona)
PEG poli(etilenoglicol)
PEO poli(óxido de etileno)
PPO poli(óxido de propileno)
CMC concentração micelar crítica
Dh Diâmetro Hidrodinâmico
PDI Polydispersity index - índice de polidispersão
HC50 concentração de fármaco responsável pela lise de 50% de hemácias
FDA Food and Drug Administration
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RESUMO ALMEIDA, V. C. Preparo e caracterização de micelas poliméricas de Pluronic F127 contendo miltefosina. 2020. no. 28p. Trabalho de Conclusão de Curso de
Farmácia-Bioquímica – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade de
São Paulo, São Paulo, 2020.
Palavras-chave: miltefosina, câncer, nanoestruturas, micelas poliméricas
INTRODUÇÃO: A miltefosina é um fármaco alquilfosfolipídico utilizado para o tratamento da leishmaniose. Estudos também demonstram sua eficácia como agente antitumoral, sendo um composto anfifílico que a membrana plasmática da célula tumoral. A administração desse fármaco por via intravenosa é inviabilizada por conta de sua atividade altamente hemolítica, restringindo o seu uso como antitumoral aos casos de metástases cutâneas de câncer de mama (uso tópico). No entanto, nanotransportadores como micelas poliméricas podem ser uma alternativa para o uso intravenoso do fármaco. OBJETIVOS: Busca na literatura do estado atual do desenvolvimento de micelas poliméricas de Pluronics® como nanotransportadores de fármacos; preparo e a avaliação das características físico-químicas de micelas poliméricas de Pluronic F127 + miltefosina e o impacto da formação dessas micelas na atividade hemolítica do fármaco. MATERIAIS E MÉTODOS: Busca de artigos científicos, de publicação dos últimos 15 anos em bases de dados como Pubmed, Web of Knowledge e LILACs, utilizando como palavras-chave: “polymeric”, “micelles”, “intravenous”, “drug delivery”, “Pluronics” e “polaxamers”, de modo isolado ou combinado; formulação e otimização de micelas poliméricas de Pluronic F127 contendo miltefosina a fim de investigar o efeito da encapsulação de miltefosina em seu potencial hemolítico. RESULTADOS E CONCLUSÃO: As micelas poliméricas de Pluronic F127 possuem potencial importante como carreadores de fármacos, com potencial de aumentar a solubilidade, biodisponibilidade, tempo de meia-vida de fármacos menos hidrossolúveis aumentando a sua especificidade em relação ao alvo terapêutico, com ganhos em termos de eficácia e redução de eventos adversos, principalmente em tratamentos de câncer. A encapsulação de miltefosina em concentração de 0,2% em micelas de Pluronic F127, com o polímero em concentração de até 1% resultou em micelas com diâmetro de 31 nm (±10 nm) que demonstraram 100% de redução do potencial hemolítico da miltefosina, ressaltando a importância do estudo dessa forma de carreamento de fármacos para o desenvolvimento de novas terapias ou aprimoramento de terapias já existentes.
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1. INTRODUÇÃO
Em decorrência do envelhecimento populacional, a incidência do câncer e a
mortalidade associada ao conjunto de doenças classificadas como câncer
encontram-se em ascensão. Atualmente, o câncer é classificado em primeiro ou
em segundo lugar como principal causa de morte prematura (em idades de 30 a
69 anos) em 134 de 183 países. Estima-se que após 2040, ocorrerão mais de 27
milhões novos casos de câncer por ano mundialmente, um aumento de 50%
comparado com a incidência de 18,1 milhões de casos estimada em 2018, o que
evidencia a necessidade do desenvolvimento terapêutico nessa área (Wild et al,
2020).
Na atualidade, os tratamentos disponíveis para o câncer são cirúrgicos,
quimioterápicos, radioterápicos e mais recentemente imunoterápicos. Na
quimioterapia, uma combinação de diferentes moléculas é utilizada para destruir
células tumorais ou reduzir sua atividade proliferativa, atuando em diversos
mecanismos celulares de sobrevivência e proliferação. Porém, devido a atividade
não seletiva dos fármacos antitumorais, uma série de eventos adversos é
observada nos pacientes com câncer, em geral com baixa eficácia do tratamento
(Shewach et al, 2009). A imunoterapia também apresenta-se como uma
alternativa mais recente para o tratamento do câncer, sendo alvo-direcionada e,
portanto, com menor incidência de eventos adversos quando comparada à
quimioterapia (Arruebo et al, 2011). No entanto, apesar da eficácia dessa nova
modalidade terapêutica, há preocupação em relação aos custos associados ao
tratamento com imunoterapia, com potencial de ameaçar a sustentabilidade dos
sistemas de saúde (Ventola, 2017). Adicionalmente, a eficácia desse tipo de
terapia pode ser limitada dependendo do paciente, visto que dependente da
presença ou ausência de determinados biomarcadores, dependendo do tipo de
câncer e da resposta imunológica do organismo do paciente (Ventola, 2017).
Dentro desse panorama, destaca-se a importância da exploração de novos alvos
terapêuticos para prevenção e tratamento do câncer, considerando a maior
eficácia atingida em estratégias terapêuticas de combinação (Mokhtari et al, 2017),
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o desenvolvimento de terapias mais seletivas, seja por imunoterapia ou com a
aplicação de terapia baseada em nanoestruturas (Arruebo et al, 2011) e o
reposicionamento de agentes terapêuticos já aprovados para outras doenças
(Mokhtari et al, 2017).
A hexadecilfosfocolina (miltefosina: Figura 1) é molécula estruturalmente
derivada da estrutura de fosfatidilcolinas e pertencente à classe de
alquilfosfolipídios, sendo um composto anfifílico, ou seja, possui uma região
hidrofílica e uma região hidrofóbica (Agresta et al, 2003; Mollinedo, 2014).
Atualmente, é utilizada para tratamento de leishmaniose (Jha et al. 1999), mas
também há estudos que comprovam sua eficácia como antitumoral agindo em vias
de sinalização envolvendo proteínas na membrana plasmática da célula tumoral,
induzindo a mesma a apoptose, por exemplo através da inibição da via MAPK
(Mitogen Activated Protein Kinases) por anular a atividade de proteínas Ras,
localizadas na membrana (Mollinedo, 2014). Testes in vitro comprovam
pronunciada atividade antitumoral (Chakrabandhu et al, 2008), porém a
administração in vivo deste fármaco é inviabilizada devido a alta atividade
hemolítica (Agresta et al, 2003), restringindo seu uso no câncer, então, à
administração cutânea (Terwogt et al, 1999). Alta toxicidade gastrointestinal
também é observada durante a administração de miltefosina (MTF) a pacientes
nas doses necessárias para o efeito antineoplásico, ficando essa via restrita ao
tratamento de leishmanioses (Jha et al, 1999).
Figura 1: Estrutura química da miltefosina (MTF).
A atividade hemolítica da MTF se deve à capacidade deste composto de
formar micelas mesmo em baixas concentrações. Essas micelas tem a
capacidade de interagir com a membrana plasmática de eritrócitos, que é
altamente proteica (~52%), e interagir com porções hidrofóbicas das proteínas
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presentes na membrana ou lipídios, resultando na solubilização e ruptura da
membrana, ou seja, sua lise (Moreira et al, 2013).
Figura 2: Mecanismos de ação da miltefosina (MTF). Elaborado pelo autor, adaptado de Pachioni
et al, 2013.
Para alcançar a redução dos efeitos adversos de hemólise e toxicidade
gastrointestinal, uma alternativa é a incorporação da MTF em nanoestruturas.
Sistemas nanoestruturados vêm sendo amplamente estudados pois oferecem
diversas vantagens como aplicação alvo-direcionada de fármacos em um
organismo, aprimoramento da solubilidade de moléculas, diminuição de
toxicidade, aumento de eficácia e ação prolongada do efeito farmacológico (Wang
et al, 2012).
Dentre os nanotransportadores estudados na literatura, as micelas poliméricas se
destacam devido a possibilidade de copolímeros anfifílico se auto-agregarem em
soluções aquosas, resultado de sua baixa concentração micelar crítica (CMC)
(Torchilin, 2007). Polímeros como poli(óxido de etileno)-poli(ácido lático) (PEO-
PLA), poli(óxido de etileno)-poli(caprolactona) (PEO-PCL) e poloxâmeros
(Pluronics®) são biocompatíveis e não geram resíduos nocivos ao meio ambiente
(Mora-Huertas et al, 2010). Esses copolímeros, quando a fração do segmento
hidrofílico é superior a 40%, se agregam formando micelas com núcleo hidrofóbico
e uma coroa hidrofílica (Rijn P et al, 2013). Dependendo das características
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moleculares e da massa molecular dos polímeros, as micelas poliméricas têm um
tamanho entre 10 a 100 nm. O núcleo hidrofóbico dessa formação micelar pode
acomodar fármacos menos hidrossolúveis aumentando a sua solubilidade
significativamente e a biodisponibilidade dos mesmos em um organismo (Sant et
al, 2005).
No caso de Pluronics®, copolímeros tribloco formados por poli(óxido de
etileno)-poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno) (PEO-PPO-PEO),
nanoestruturas podem se formar a partir do arranjo em micelas, onde a porção
hidrofílica (PEO) se volta para a água, enquanto a porção hidrofóbica (PPO)
compõe a parte interna da estrutura, tendo o contato com a água minimizado
(Figura 3). Essa formação micelar por Pluronics® é vantajosa, já que ocorre
mesmo com o polímero em baixa concentração, por conta de sua baixa CMC, de
~0,15% (Mora-Huertas et al., 2010; Valenzuela-Oses et al, 2017). A formação de
micelas com um interior hidrofóbico favorece a incorporação de compostos
lipossolúveis ou anfifílicos em sua matriz, como representado na Figura 3,
possibilitando o carreamento ao alvo molecular pretendido, otimizando a
biodisponibilidade do fármaco no organismo, e, consequentemente, diminuindo
sua dosagem e efeitos adversos e aumentando a eficácia (Movassaghian et al.,
2015).
Figura 3: Formação de micela a partir de copolímero tribloco PEO-PPO-PEO. Adaptado de Feitosa
et al, 2019.
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2. OBJETIVO(S)
Esse estudo teve como principais objetivos a busca na literatura do estado
atual do desenvolvimento de micelas poliméricas de Pluronics® como
transportador para o carreamento de fármacos, bem como o desenvolvimento e
avaliação das características físico-químicas de micelas poliméricas de Pluronic®
F127 + MTF e o impacto da formação dessas micelas na atividade hemolítica da
MTF.
3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. REVISÃO DA LITERATURA
Os termos “polymeric micelles”, “micelas poliméricas”, “intravenous”,
“intravenoso”, “intravenosa”, “drug delivery”, “carrea*”, “fármacos”, “drogas”,
“Pluronic”. “polaxamers” e “polaxâmeros” foram usados como palavras chaves
para busca nas bases de dados US National Library of Medicine – National
Institutes of Health (PubMed), Web of Knowledge, Biblioteca Virtual em Saúde
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciências da Saúde – LILACS) e no
Google Scholar.
Duas etapas de exclusão de artigos foram realizadas conforme os critérios
descritos a seguir: (a) foram selecionados estudos publicados entre os anos de
2005 e 2020, em língua portuguesa ou inglesa, que tenham como objeto o estudo
in vivo e/ou in vitro de encapsulação de substâncias em micelas poliméricas com
Pluronics® e sua influência em características como biodisponibilidade, tempo de
meia-vida, efetividade e impacto em eventos adversos; (b) foi levado em
consideração o conteúdo do estudo a partir da análise do título, do abstract e da
conclusão. Os estudos que se adequaram à proposta desse trabalho foram lidos
na íntegra, para sua estruturação. Os estudos que não possuíam o texto na
íntegra disponível para leitura foram excluídos desse trabalho.
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3.2. PREPARO DAS MICELAS POLIMÉRICAS
A miltefosina, com grau de pureza >99%, foi adquirida via Avant Polar
Lipids (USA). O sangue de carneiro desfibrilado foi comprado da NewProv (Brasil).
O copolímero Pluronic® F127 grau farmacêutico, o qual denominamos daqui para
frente Pluronic F127, foi gentilmente cedido pela BASF (Brasil). Todos os materiais
foram utilizados sem purificação adicional. A estrutura do Pluronic® utilizado pode
ser visualizada na Figura 4 e na Tabela 1.
Figura 4: Estrutura Geral dos copolímeros tribloco do tipo Pluronics®. O Pluronic F127 possui
massa molecular de 12.500 Da, sendo que a porção a possui 101 repetições e a porção b possui
56 repetições. Adaptado de Cagel et al, 2017.
As micelas do Pluronic F127 foram obtidas a partir dos métodos de
dissolução direta e hidratação de filme polimérico. No caso de formulação por
dissolução direta, o copolímero foi solubilizado em solução aquosa de cloreto de
sódio (0,9% m/v) para atingir concentração de 9% e a solução foi submetida a
agitação magnética. Na formulação por hidratação de filme polimérico, o
copolímero foi solubilizado em solvente (clorofórmio ou etanol), seguido de
formação de filme polimérico em frasco após remoção do solvente sob pressão
reduzida. Esse filme polimérico foi hidratado com solução aquosa de cloreto de
sódio (0,9% m/v), também resultando em sistema com concentração de 9% de
Pluronic F127. Algumas variações nas etapas de preparo foram realizadas:
variação na forma de remoção de solvente, temperatura de agitação, e emprego
de ultrassom para homogeneização da amostra, no intuito de encontrar
formulação mais adequada.
Após preparo, as amostras foram analisadas e caracterizadas por meio da
técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) por equipamento Zetasizer ZS
Nano (Malvern) com ângulo de dispersão de 90º com a amostra em temperatura
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ambiente (25 ºC), sendo que os parâmetros de diâmetro hidrodinâmico (Dh) e
índice de polidispersão (PDI) foram determinados.
Por fim, após definição do método ótimo para formação de micelas, a
mesma formulação foi realizada com a adição de MTF (0,2 µg/mL) para verificar
interferência da adição do fármaco na formação de micelas, seguida de
caracterização por DLS para obtenção do Dh e PDI médio. Todas as amostras
foram analisadas em triplicata e a média entre as medidas foi calculada.
3.3. ENSAIOS DE HEMÓLISE
O perfil hemolítico da MTF pura foi investigado através do preparo de
soluções com concentrações crescentes de MTF e sangue de carneiro desfibrilado
(5%), que foram levadas a agitação a 37 ºC por 1 hora e centrifugadas a 3.000
rpm por 5 minutos. A solução sobrenadante foi analisada por espectrofotometria
no comprimento de onda de 540 nm (absamostra), para determinação do HC50
(concentração de fármaco responsável pela lise de 50% das hemácias). A
absorbância das amostras foi comparada a solução salina (abssalina) como controle
negativo (0% de hemólise) e a água destilada (abságua) como controle positivo
(100% de hemólise). Os resultados de hemólise foram demonstrados em % do
total de hemólise atingida, conforme equação abaixo:
% ℎ𝑒𝑚ó𝑙𝑖𝑠𝑒 = 100𝑎𝑏𝑠!"#$%&! − 𝑎𝑏𝑠!"#$%"𝑎𝑏𝑠á!"# − 𝑎𝑏𝑠!"#$%"
Em seguida o efeito da incorporação da MTF nas micelas poliméricas de
Pluronic® e seu impacto no potencial hemolítico foram estudados. A análise
estatística foi feita a partir do software Prism 7 (Graphpad).
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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. MICELAS POLIMÉRICAS COMO SISTEMA CARREADOR DE FÁRMACOS: ESTADO DA ARTE
Nos últimos anos, um dos sistemas de carreamento de fármacos para
farmacoterapia de diversos tipos de doenças estudados foi o de micelas
poliméricas. Micelas poliméricas são nanoestruturas coloidais constituídas de
copolímeros anfifílicos em bloco que, devido à sua baixa CMC, se auto agregam
em soluções aquosas (Croy et al, 2006; Rangel-Yagui et al, 2005). Esse sistema
traz otimizações no carreamento de fármacos, aumentando a solubilidade e a
estabilidade de fármacos hidrofóbicos (Chiappetta et al, 2007). Seu tamanho no
intervalo da escala nanométrica de 10 a 80 nm aumenta o tempo de residência no
organismo por previnir a filtração glomerular e excreção renal e diminuir a
fagocitose por macrófagos observada com nanoestruturas maiores (Movassaghian
et al, 2015). O efeito de permeabilidade e retenção melhorada, característica
favorecida pela encapsulação em micelas poliméricas, permite o direcionamento e
acúmulo do fármaco em tecidos cancerosos versus a ação generalizada do
fármaco livre em outros tecidos, diminuindo a ocorrência de eventos adversos
(Shin et al, 2016).
Quando uma solução aquosa constituída por esses copolímeros anfifílicos
encontra-se em concentração superior à CMC, ocorre uma associação das
cadeias poliméricas que minimiza o contato das porções hidrofóbicas da estrutura
com o meio aquoso externo, levando à formação da estrutura micelar (Figura 5),
composta por um núcleo hidrofóbico, onde fármacos de baixa solubilidade em
água podem se alojar, e um envoltório hidrofílico, que determina a solubilidade da
estrutura e também pode sofrer modificações para promover especificidade ao
alvo terapêutico, além de proteger o fármaco encapsulado do meio externo
(Yokoyama et al, 2010). Uma série de parâmetros devem ser considerados na
utilização de micelas poliméricas como carreadores de fármacos, como
estabilidade da micela, a distribuição de tamanho dessas micelas e sua
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capacidade de encapsular fármacos (Yokoyama et al, 2010). A estabilidade de
micelas é desejada, visto que essas podem passar por diversas mudanças de
ambiente com variação de fatores como pH, força iônica, interação com proteínas
e células e diluição. Um dos principais fatores que influenciam na estabilidade da
micela é a CMC, sendo que valores mais baixos indicam maior estabilidade. A
CMC de micelas poliméricas é geralmente mais baixa quando comparada à CMC
de micelas de tensoativos clássicos, por exemplo, já que essa é influenciada pelo
tamanho da cadeia hidrofóbica do polímero, sendo que uma cadeia maior indica
maior estabilidade, promovida por uma maior coesão do núcleo hidrofóbico.
Partindo desse princípio, também é possível que a encapsulação de um fármaco
pode estabilizar ainda mais a micela, aumentando a quantidade de interações
hidrofóbicas no núcleo das micelas. A porção hidrofílica das micelas poliméricas
também influencia na estabilidade da micela, já que essa porção tem interações
hidrofílicas com o meio aquoso externo. O aumento da cadeia hidrofílica pode
tornar a micela mais rígida, enquanto uma cadeia menor e menos densa promove
a exposição do núcleo hidrofóbico da micela com o meio aquoso, levando a sua
desestabilização (Shawn et al, 2012).
Figura 5: Mecanismo de formação de micelas poliméricas, adaptado de Movassaghian et al, 2015.
Um polímero ideal para o carreamento de fármacos formaria uma micela
com as seguintes características: biodegradável, biocompatível, direcionável, com
baixa toxicidade, com protetor estérico eficiente (para furtividade), que provoca a
estabilização do sistema, que previne agregação promovendo estabilidade
coloidal, que previne adesão de proteínas plasmáticas e permite solubilidade em
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água (Movassaghian et al, 2015). Considerando essas características, Pluronics®
se mostram como uma família de polímeros promissora para o carreamento de
fármacos. Os diferentes tipos de Pluronics® disponíveis possuem variação no
comprimento das cadeias PEO e PPO, resultando em compostos de diferentes
massas moleculares, e, consequentemente, perfis de solubilidade e CMC. Esses
polímeros são biocompatíveis e aprovados para uso pelo FDA (Food and Drug
Administration), com aplicação em diversos medicamentos e cosméticos (Talelli et
al, 2011), e por já existir extensa literatura utilizando esse polímero para
encapsulação de fármacos em micelas (Cagel at al, 2017), foram escolhidos como
objeto deste estudo.
As técnicas de formulação dessas micelas e encapsulamento de fármacos
podem ser divididas em duas categorias (Figura 6): (a) de polímeros solúveis em
solução aquosa, com adição do fármaco em solvente ou não e (b) de polímeros
que não são imediatamente solúveis em solução aquosa e emprega-se solventes
orgânicos para solubilizar esses polímeros juntamente com o fármaco. As técnicas
da categoria (a) (Figura 6, A-C) são: método auto agregação de micelas com o
fármaco, sob agitação e aquecimento ou não; método de evaporação de solvente,
com incorporação gota-a-gota de fármaco dissolvido em solvente em um sistema
micelar, seguido de evaporação da fase orgânica, e método de emulsão do tipo
óleo em água. As vantagens dos métodos da categoria (a) consistem de sua
simplicidade de formulação e por evitar o uso de solventes orgânicos (ou
minimizar), tornando o processo escalonável e em geral com boa eficiência de
encapsulação. Em contrapartida, essa categoria não é viável para fármacos ou
polímeros altamente hidrofóbicos, resultando em formulações com baixas taxas de
encapsulação. No caso dos métodos da categoria (b) (Figura 6, D e E), as
técnicas são: método de diálise, com remoção do solvente miscível em água
através de diálise e subsequente formação de micelas; e o método de hidratação
de filme, em que a fase orgânica não miscível em água é evaporada, formando um
filme composto por polímero e fármaco, que é hidratado com fase aquosa,
favorecendo a formação de micelas. As vantagens desses métodos são a alta taxa
de encapsulação de fármacos, otimização da interação fármaco e polímero, já que
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ambos os constituintes são solubilizados na mesma fase. No entanto, esses
métodos são mais complexos e menos escalonáveis e há uso proeminente de
solventes orgânicos, que devem ser totalmente removidos para se obter o produto
final (Cagel et al, 2017).
Figura 6: Técnicas de formulação de micelas poliméricas, adaptado de Cagel et al, 2017.
O uso de micelas poliméricas para carreamento de fármacos vem
ganhando relevância em diversas áreas terapêuticas, já que possui uma série de
vantagens como aumento de biodisponibilidade e solubilidade do fármaco
utilizado. Um estudo que utilizou micelas mistas de Pluronic® P123 e lecitina
contendo trans-resveratrol demonstrou, após administração intravenosa em ratos,
um aumento de 40% na biodisponibilidade do fármaco, tornando o seu uso
terapêutico viável, já que a sua biodisponibilidade sem carreador é limitada (Li et
al, 2017). Outro estudo, utilizando micelas de Pluronic® L121, P123 e F127
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contendo vinpocetina demonstrou maiores tempos de meia-vida e de residência in
vivo em coelhos, comparado ao fármaco sem carreador (El-Dahmy et al, 2014).
Essas características são vantajosas para otimizar o tratamento
quimioterápico de câncer, já que a maioria dos agentes quimioterápicos utilizados
atualmente possui baixa solubilidade em água, além de serem inespecíficos,
causando uma série de eventos adversos e toxicidade por conta de sua ação
sistêmica (Narvekar et al, 2014). A doxorubicina é um dos agentes quimioterápicos
estudados para encapsulação em micelas poliméricas de Pluronics®, sendo um
agente com eficácia significativa contra diferentes tipos de câncer. Apresenta,
entretanto, uma série de eventos adversos como náusea e vômito, alopécia,
mielosupressão e cardiotoxicidade (Barenholz, 2012). Os estudos que incluem a
doxorubicina demonstram maior acúmulo do fármaco no tecido tumoral in vitro e in
vivo, com eficácia antitumoral mais alta, além de apresentarem uma redução de
toxicidade (Cagel et al, 2017; Chen et al, 2016; Hong et al, 2017; Huang et al,
2016; Liu et al, 2017), sendo que um estudo chegou a apresentar menor acúmulo
de doxorubicina no tecido cardíaco de ratos, diminuindo o efeito de
cardiotoxicidade (Liu et al, 2017). A formulação de micelas poliméricas de
Pluronics® contendo doxorubicina foi a primeira a ser avaliada em estudos clínicos
para o tratamento de câncer (Alakhova et al, 2013; Armstrong et al, 2006; Valle et
al, 2011; Pito-Barry et al, 2014).
Uma formulação de micelas poliméricas contendo trans-resveratrol, um
fármaco com baixa biodisponibilidade e distribuição cerebral, conseguiu
demonstrar acúmulo do fármaco atravessando a barreira hematoencefálica em um
estudo in vivo via intravenosa em ratos, indicando biocompatibilidade e segurança
considerando baixa atividade hemolítica da formulação (Katekar et al, 2019). Outro
estudo, de micelas poliméricas de Pluronic® P105 contendo docetaxel com adição
de transportador de glicose e ácido fólico demonstrou a capacidade da formulação
atravessar a barreira hematoencefálica, em um modelo in vitro, no intuito de tratar
tumores cerebrais (Niu et al, 2014), o que mostra que é possível aprimorar ainda
mais a seletividade de micelas poliméricas com a adição de agentes seletivos que
se alojam na coroa de PEO das micelas. Esse aprimoramento na seletividade
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também foi demonstrado com micelas poliméricas de Pluronics® contendo
lamotrigina, um antiepilético, também utilizando o transportador de glicose
acoplado as micelas, com penetração in vivo da barreira hematoencefálica (Liu et
al, 2014).
O paclitaxel é outro agente quimioterápico estudado para encapsulação em
micelas poliméricas de Pluronics®; é um fármaco importante no tratamento de
vários tipos de câncer, também com baixa solubilidade em água e eventos
adversos consideráveis como neutropenia, neuropatias periféricas, vômito, náusea
e mialgia. Os estudos com esse fármaco demonstraram um maior tempo de
circulação sistêmica das micelas poliméricas e tempo de meia-vida, com maior
biodisponibilidade, maior atividade antitumoral, maior acúmulo do fármaco no
tecido tumoral e redução de eventos adversos (Chen et al, 2016; Han et al, 2006;
Huang et al, 2016; Wang et al, 2008; Yoncheva et al, 2012; Zhang et al, 2011). Um
estudo clínico de fase 3 de não-inferioridade de paclitaxel encapsulado em micelas
poliméricas versus paclitaxel no tratamento de pacientes com câncer de mama
recorrente ou metastático foi publicado, e, apesar do objetivo primário do estudo
não ter sido atingido, uma menor incidência de neuropatia periférica sensorial, um
dos eventos adversos do paclitaxel, foi observada (Fujiwara et al, 2019). Outro
estudo de fase 3, com formulação de micela polimérica contendo paclitaxel em
combinação com carboplatina demonstrou não inferioridade versus paclitaxel livre
no tratamento de pacientes com câncer de ovário, demonstrando também uma
menor incidência de neuropatia periférica sensorial, sendo que essa formulação
está comercialmente disponível na europa, aprovada com o nome de Apealea®
(Heldring et al, 2018).
As micelas poliméricas de Pluronics® também podem ser utilizadas para
transportar agentes de detecção de tumores, como corantes. Dois estudos
demonstram sucesso ao utilizar indocianina verde encapsulada em micelas de
Pluronics® para a detecção de tumores em ratos (Kim et al, 2010; Kim et al,
2012), tornando o emprego de micelas poliméricas importantes não apenas para
tratamento, mas também para diagnóstico de diferentes tipos de câncer. Nesse
panorama, temos também os chamados “teranósticos”, que consistem em
19
formulações que contêm o agente terapêutico e também o agente diagnóstico.
Portanto, permite a visualização em forma de imagem de um tumor, por exemplo,
antes, durante e após o tratamento, proporcionando maior personalização da
terapia com base nos resultados de imagem (Xie et al, 2010). Um estudo
demonstrou que é possível acompanhar a evolução do tratamento de tumores in
vivo em um sistema de micelas poliméricas contendo paclitaxel e nanopartículas
de óxido de ferro, sendo possível a visualização da diminuição do tumor com
scanner de imagem de ressonância magnética, através da vibração das partículas
de ferro presentes no tumor, provocada pelo scanner (Upponi et al, 2018).
4.2. FORMULAÇÃO DAS MICELAS POLIMÉRICAS
A Tabela 2 apresenta as formulações de Pluronic F127 desenvolvidas neste
trabalho e, como pode ser observado, todas resultaram na formação de micelas,
com variação do Dh de 31 (± 10 nm) a 36 nm (± 16 nm). Embora não tenhamos
realizado análise de microscopia, as micelas de Pluronic F127 foram previamente
visualizadas e apresentam tamanho compatível com o apresentado neste trabalho
(Valenzuela-Oses et al., 2017)
20
Tabela 1: Caracterização de micelas poliméricas de Pluronic F127 preparadas
pelos métodos de hidratação de filme e dissolução direta, com as respectivas
variações nos métodos.
Amostra Método Variação do Método Dh (± Desvio Padrão) (nm)
PDI
A Hidratação de filme
Solvente: etanol remoção de solvente residual por pressão
reduzida
34 (10) 0,481
B Hidratação de filme
Solvente: clorofórmio; remoção de solvente residual por pressão
reduzida
33 (13) 0,480
C Hidratação de filme
Solvente: clorofórmio; remoção de solvente residual por agitação
magnética
35 (17) 0,501
D Dissolução direta
Aquecimento à 25 oC por 5 min
36 (16) 0,473
E Dissolução direta
Aquecimento à 50 oC por 5 min
35 (18) 0,487
F Dissolução direta
Sonicação por 5 min 36 (14) 0,646
Observando a Figura 7, a qual traz as curvas de DLS para os sistemas,
quando a preparação foi realizada por método de hidratação de filme (A-C), não
há diferença significativa entre o preparo de micelas utilizando etanol ou
clorofórmio como solvente, entretanto é visível a formação de picos não micelares
proeminentes (6 e 2631 nm) quando a remoção do solvente residual é realizada
utilizando bomba de vácuo. No caso da remoção de solvente residual por
evaporação sob agitação magnética (D-F), uma redução significativa do pico não
micelar de maior diâmetro foi observada. A formação desse pico se deve a
possível precipitação de polímero ou à formação de agregados durante a remoção
do solvente residual utilizando bomba de vácuo. No preparo das amostras por
dissolução direta, foram aplicados três protocolos de transferência de energia para
as amostras: através de aquecimento a 25 e 50 ºC ou sonicação. Essa variação
não apresentou diferença significativa na formação de micelas, no entanto, a
amostra sonicada apresentou um aumento de estruturas intermediárias entre os
21
picos micelares (de 35 a 36 nm) e os picos monoméricos (6 nm), resultado de um
possível rompimento das micelas em agregados menores, causado pela
sonicação. Observando as amostras que passaram por aquecimento, nota-se que
a amostra que foi aquecida a 50 ºC apresentou resultado semelhante a amostra
sonicada, o que indica a organização de estruturas intermediárias entre os picos
micelares e os picos monoméricos nessa formulação.
Comparando os resultados obtidos para otimização dos métodos de
hidratação de filme (Dh = 33±13 nm e PDI = 0,480) e dissolução direta (Dh =
36±16 nm e PDI = 0,473), é visível que não há diferença significativa na formação
de micelas de Pluronic F127, já que as amostras possuem um Dh e PDI
semelhantes, entretanto a concentração de Pluronic em todas as amostras foi
considerada inadequada devido a formação proeminente de picos não micelares.
Considerando a equivalência entre as amostras seguindo esses métodos de
preparo, foi tomada a decisão de realizar a encapsulação de MTF (20 µg/mL) em
micelas de Pluronic F127 utilizando o método de hidratação de filme com remoção
de solvente por agitação magnética overnight. No intuito de minimizar a formação
de estruturas não micelares/polímero precipitado, essa amostra foi preparada em
concentração de 5% de Pluronic F127 (Figura 7 – G).
22
A
B
C
D
E
F
G
Figura 7: Curvas de espalhamento de luz (DLS) para os sistemas de micelas poliméricas de
Pluronic F127 preparadas por diferentes métodos (distribuição de diâmetro, em nanômetros, por
intensidade, em %). A: hidratação de filme de F127 a 9% (m/v), preparado com etanol, distribuição
de tamanho por intensidade; B: hidratação de filme de F127 a 9% (m/v), preparado com
clorofórmio, com remoção de solvente residual por bomba de vácuo; C: hidratação de filme de
F127 a 9% (m/v), com remoção de solvente residual por agitação magnética overnight; D:
dissolução direta de F127 a 9% (m/v), aquecimento a 25 ºC por 5 minutos; E: dissolução direta de
F127 a 9% (m/v), aquecimento a 50 ºC por 5 minutos; F: dissolução direta de F127 a 9% (m/v),
sonicação por 5 minutos; G: hidratação de filme F127 a 5% (m/v) com adição de MTF (20 µg/mL).
Remoção de solvente residual por agitação magnética overnight. Linhas coloridas representam
medidas individuais e as linhas pretas representam a média entre as medidas.
23
Na Figura 7, é observado em G que ao encapsular MTF em micelas de
Pluronic F127 há formação de um pico único em 31 nm (Dh = 31 ± 10 nm, PDI =
0,145), que corresponde a um pico micelar. A diminuição na concentração do
Pluronic eliminou a formação de estruturas não micelares na amostra, quando
comparada a amostras preparadas com maior concentração. Também é possível
que a MTF tenha ação na estabilização na formação de micelas, por ser um
composto anfifílico, aumentando o número de interações hidrofóbicas com a
cadeia hidrofóbica do Pluronic, conforme descrito Feitosa et al (2019). A formação
desse pico único sugere que ocorreu uma coagregação do fármaco com as
estruturas coloidais de Pluronic F127, formando micelas mistas. Esse resultado se
deve à baixa CMC do Pluronic F127 e também do próprio fármaco, que são de
~0,15% e ~0,20%, respectivamente (Barioni, 2015; Valenzuela-Oses et al., 2017).
4.3. REDUÇÃO DO POTENCIAL HEMOLÍTICO DA MILTEFOSINA APÓS INCORPORAÇÃO EM MICELAS DE PLURONIC F127
Hemólise é a ruptura de células vermelhas do sangue e a dispersão do seu
conteúdo no fluído em que essas células se encontram, e pode acontecer in vivo e
in vitro. Quando as células vermelhas do sangue entram em contato com
compostos anfifílicos, a hemólise pode acontecer por diferentes caminhos, como
desestabilização da estrutura dessas células, ocasionando a dispersão de seu
conteúdo ou a partir da solubilização dos lipídios presentes na membrana
plasmática, também resultando em sua ruptura (Schreier et al, 2000). Na Figura 8
é observada a curva de hemólise causada pela MTF, com um HC50 de 40 µg/mL.
No tratamento da leishmaniose t com MTF, a dose estabelecida para adultos é de
2,5 mg/kg/dia, com uma dosagem máxima de 150 mg/dia por via oral, durante 28
dias (Machado et al, 2010), sendo que sua dosagem máxima é limitada por estar
associada a toxicidade gastrointestinal cumulativa (Sindermann et al, 2006). Os
monômeros de MTF se auto-agregam em micelas quando solubilizados em
solução aquosa, tendo uma CMC de 20,35 µg/mL ou 0,20% (Barioni et al, 2015).
Na Figura 8 é observado que o efeito hemolítico da MTF começa a partir de cerca
24
de 20 µg/mL, o que sugere que esse efeito hemolítico está associado à presença
de micelas de MTF, que interagem com a membrana plasmática causando sua
ruptura, mecanismo já descrito por Blitterswijk et al, 2008. No entanto, deve-se
notar que o efeito hemolítico da MTF também é dependente da concentração de
células vermelhas do sangue, que afeta a taxa de acúmulo da MTF na membrana
plasmática dos eritrócitos (Alonso e Alonso, 2016).
Figura 8: Curva de hemólise de sangue de carneiro desfibrilado em presença de concentrações
crescentes de miltefosina (MTF).
Para reduzir o efeito hemolítico da MTF, foi estudada a incorporação desse
fármaco em micelas de Pluronic F127, a partir de sua formulação utilizando o
método de hidratação de filme com remoção de solvente por agitação magnética
overnight. Para determinar a redução do potencial hemolítico da MTF, foi realizado
ensaio com MTF em concentração de 60 µg/mL, que tem efeito de 100% de
hemólise, com concentrações crescentes de Pluronic F127. O resultado
observado na Figura 9 mostra que com o polímero em concentração de 0,5% já é
obtida redução quase completa do efeito hemolítico da MTF. O aumento da
concentração de Pluronic a partir desse ponto continuou demonstrando redução
de ~100% do efeito hemolítico, portanto o ensaio foi realizado até uma
concentração máxima de 1% de Pluronic. Esse efeito protetor se deve à interação
entre a MTF e as micelas de Pluronic F127, sendo que a formação de micelas por
esse copolímero é resultado da cadeia PPO (hidrofóbica) mais longa do F127,
quando comparado a outros Pluronics (Li et al, 2011), permitindo maior interação
0 50 100 1500
50
100
MTF (µg/mL)
Hem
ólis
e (%
)Hemólise MTF
0.0 0.5 1.0 1.50
50
100
F127 (%)
Hem
ólis
e (%
)
Hemólise com F127
25
da MTF com essa porção e facilitando a auto-agregação do fármaco e do
polímero, que resulta na formação de micelas mistas de MTF e Pluronic F127,
discutidas anteriormente. Desse modo, os eritrócitos ficam protegidos da
hemólise, já que o fármaco interage menos com a membrana plasmática dessas
células. No estudo de Feitosa et al (2019) foi demonstrado que é possível reduzir
o efeito de hemólise da MTF em maiores concentrações, sendo esse feito protetor
mantido ao aumentar também a concentração de Pluronic F127. Essa proteção
não foi observada com outros Pluronics (F108, F68, L44 e L64), que possuem
cadeias PPO de menor tamanho, visto que essas não permitem uma interação
hidrofóbica tão pronunciada e podem formar agregados que ocasionam a
disrupção das micelas de MTF, tornando esta mais disponível para interação com
os eritrócitos e resultando em sua hemólise (Feitosa et al., 2019 e Li et al., 2011).
Figura 9: Curva de hemólise de sangue de carneiro desfibrilado com 60 µg/mL de MTF com
concentrações crescentes de Pluronic F127.
0 50 100 1500
50
100
MTF (µg/mL)
Hem
ólis
e (%
)
Hemólise MTF
0.0 0.5 1.0 1.50
50
100
F127 (%)
Hem
ólis
e (%
)
Hemólise com F127
26
5. CONCLUSÃO
Formulações de micelas poliméricas de Pluronics® vêm ganhando bastante
atenção, principalmente como carreadores de fármacos com ação antitumoral.
Sua capacidade de aprimorar as características de solubilidade, biodisponibilidade
e tempo de meia-vida de fármacos menos hidrossolúveis são interessantes para
aplicação em agentes quimioterápicos e fármacos que precisem atravessar a
barreira hematoencefálica. Essa forma de carreamento também possibilita a
detecção de tumores a partir de marcação com pigmentos, sendo importante
também para desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico. A MTF é um
exemplo de fármaco hidrofóbico que possui atividade antitumoral, mas com um
alto potencial hemolítico, inviabilizando sua administração intravenosa. Esse
trabalho demonstrou que o emprego de micelas poliméricas de Pluronic F127 para
encapsulação de miltefosina permite redução do efeito hemolítico do fármaco,
viabilizando seu uso via parenteral para o tratamento antitumoral. Conclui-se que a
utilização dessa forma de carreamento de fármacos tem grande potencial no
desenvolvimento de novas terapias e otimização de terapias já existentes, em
especial para o emprego de fármacos anfifílicos.
27
6. REFERÊNCIAS
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26/06/2020