Transcript
Page 1: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

การศึ�กษากระบวนการทำ�างานของ protein tyrosine phosphatase ด้�วยกระบวนการทำางเคมี�

บทคั�ดย่�อ protein tyrosine phosphatase เป็�นเอนไซม์�สำ��คั�ญในกระบวนสำ�งสำ�ญญ�ณ ซ��งท��หน��ท �เป็�นตั�วกระตั"�นก�รท��ง�นท �สำ��คั�ญในว#ถี กระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณ (signal

transcuction pathway) ก�รบกพร�องหร&อม์ ก�รท��ง�นท �ผิ#ดป็กตั#อของเอนไซม์� PTP ม์�กน��ไป็สำ)�คัว�ม์บกพร�องของกระบวนก�ร tyrosin phosphorylation (ก�รเตั#ม์หม์)�ฟอสำเฟตัให�ก�บไทโรซ น) ซ��งสำ�ม์�รถีพ�ฒน�ไป็สำ)�ก�รเก#ดโรคัหร&อคัว�ม์ผิ#ดป็กตั#ในม์น"ษย่�ได� ในป็.จจ"บ�นม์ ก�รคั�นพบและจ��แนก PTP หล�ย่ซ��งม์ บทบ�ทในแง�ก�รเป็�นเป็2�หม์�ย่ของก�รร�กษ�โรคัหร&อคัว�ม์ผิ#ดป็กตั#หล�ย่ชน#ด แตั�ด�วย่ธรรม์ช�ตั#ของ PTP ซ��งสำ�ม์�รถีท��หน��ท �สำ�งเสำร#ม์หร&อตั�อตั��นก�รท��ง�นก�รสำ�งสำ�ญญ�ณของ PTK ได� ซ��งเป็�นจ"ดสำ��คั�ญอ กจ"ดหน��งท �ตั�องคั��น�งถี�งในกระบวนก�รศึ�กษ�ก�รท��ง�นของ PTP และกระบวนก�รศึ�กษ�ก�รท��ง�นของ PTP โดย่เฉพ�ะในแง�ก�รสำ�งสำ�ญญ�ณในระด�บเซลล�ในสำภ�วะก�รท��ง�นป็กตั#และในกระบวนก�รเก#ดโรคัย่�งเป็�นป็ระเด8นท �ท��ท�ย่ของน�กว#จ�ย่หล�ย่กล"�ม์ และกระบวนก�รหน��งท �น�กว#ทย่�ศึ�สำตัร�ให�คัว�ม์สำนใจคั&อก�รศึ�กษ�ท�งเคัม์ เพ&�อคั�นห�ตั�วย่�บย่�9งก�รท��ง�นของเอนไซม์� PTP เพ&�อน��ไป็ป็ระย่"กตั�สำ��หร�บก�รคัวบคั"ม์และก�รร�กษ�โรคัท �เก#ดจ�กคัว�ม์ผิ#ดป็กตั#ของ PTP และก�รศึ�กษ�ก�รท��ง�นของ PTP ในสำภ�วะ in vivo ในก�รศึ�กษ�คัร�9งน 9ม์ ว�ตัถี"ป็ระสำงคั�เพ&�อศึ�กษ�บทบ�ทของ PTP1B ในแง�ก�รคัวบคั"ม์เอนไซม์� insulin และโป็รตั น integrin โดย่ใช�กระบวนก�ร proteomic เพ&�อศึ�กษ�บทบ�ทของ PTP ในสำภ�วะป็กตั#และระหว��งกระบวนก�รเก#ดพย่�ธ#สำภ�พของโรคั จ�กข�อม์)ลก�รเป็ล �ย่นแป็ลงอ�นเก �ย่วเน&�องก�บก�รท��ง�นของ PPT น�9นจะช�วย่ให�ม์ คัว�ม์ก��วหน��ในก�รพ�ฒน�เป็2�หม์�ย่ของก�รร�กษ�คัว�ม์ผิ#ดป็กอ�นเก �ย่วเน&�องก�บกระบวนก�รท��ง�นของ

PTP รวม์ถี�งก�รพ�ฒน� activity-based PTP probe เพ&�อก�รว#เคัร�ะห�ก�รท��ง�นของ PTP

D 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.

1. บทน��

กระบวนก�ร Protein tyrosine phosphorylation เป็�นกระบวนก�รด�ดแป็ลงโคัรงสำร��งของโป็รตั นในช�วงหล�งก�รแป็ลรห�สำ (post translation modification) ซ��งพบว��โป็รตั นด�งกล��วจะม์ motif ท �ม์ คัว�ม์สำ��คั�ญในด��นก�รเก#ดป็ฏิ#ก#ร#ย่�ระหว��งโป็รตั นก�บโป็รตั น รวม์ถี�งก�ร

Page 2: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

ก��หนดตั��แหน�งบนเซลล�ของโป็รตั น (cellular localization) ก�รคัวบคั"ม์คัว�ม์เสำถี ย่รของโป็รตั น และสำ#�งท �สำ��คั�ญท �สำ"ดคั&อก�รท��หน��ท �คัวบคั"ม์ก�รท��ง�นของเอนไซม์� ซ��งกระบวนก�ร tyrosine phophorylation ในอ�ตัร�ท �เหม์�ะสำม์จะน��ไป็สำ)�ก�รเป็ล �ย่นแป็ลงโคัรงสำร��งและก�รท��ง�นของโป็รตั นหล�ย่ชน#ด ระด�บก�รท��ง�นของเอนไซม์� PTP ท �เหม์�ะสำม์เป็�นก"ญแจสำ��คั�ญในก�รท��ง�นท �เหม์�ะสำม์ของโป็รตั นท �ม์ บทบ�ทสำ��คั�ญในสำร ระว#ทย่�ของเซลล� ซ��งกระบวนก�ร protein tyrosine phophorylation น 9จะถี)กคัวบคั"ม์โดย่เอนไซม์� protein tyrosine kinase (PTK) อ กตั�อหน��ง

ซ��งเอนไซม์�ด�งกล��วม์ หน��ท �ในก�รสำล�ย่หม์)� phosphoryl ให�ก�บ tyrosine และเอนไซม์� protein

tyrosine phosphatase (PTPs) จะม์ หน��ท �ก��จ�ดหม์)� phophoryl ซ��งกระบวนก�รท��ง�นของเอนไซม์�ท�9งสำองชน#ดน 9จะม์ ร)ป็แบบก�รท��ง�นท �สำอดคัล�องก�นในสำภ�วะป็กตั# และม์ บทบ�ทเก �ย่วข�องก�บกระบวนก�รท�งสำร ระว#ทย่�ท �สำ��คั�ญของเซลล� เช�น ก�รเจร#ญเตั#บโตัของเซลล�, ก�รพ�ฒน�ของเซลล�, กระบวนก�รเม์ตั�บอล#สำม์, และก�รด��เน#นของเซลล�ผิ��นว�ฏิจ�กรเซลล� (cell cycle), กระบวนก�รสำ&�อสำ�รระหว��งเซลล�, ก�รเคัล&�อนย่��ย่ของเซลล�, ก�รถีอดรห�สำย่ น, กระบวนก�รท��ง�นของระบบล��เล ย่งไอออน, ระบบภ)ม์#คั"�ม์ก�น

ก�รตั�ย่ของเซลล�แบบ apoptosis / ก�รอย่)�รอดขอเซลล� โดย่พบว��ป็.จจ�ย่ตั��งๆ (จ�กพ�นธ"กรรม์/สำ#�งแวดล�อม์) ล�วนสำ�ม์�รถีสำ�งผิลกระทบตั�อก�รคัวบคั"ม์ระด�บก�รท��ง�นของเอนไซม์�ชน#ดน 9ให�ม์ ระด�บก�รท��ง�นท �แป็รผิ�นและสำ�ม์�รถีท��ให�ม์ ก�รท��ง�นเก#นหร&อบกพร�องไป็จ�กเด#ม์ ซ��งคัว�ม์แตักตั��งของระด�บก�รท��ง�นของเอนไซม์� PTP

ระหว��งบ"คัคัล อ�นเป็�นเหตั"ให�เก#ดคัว�ม์ผิ#ดป็กตั#หร&อโรคับ�งโรคั เช�น ก�รท��ง�นท �ผิ#ดป็กตั#ของ PTP ในเน&9อเย่&�อบ�งชน#ด ซ��งจะสำ�งผิลแตักตั��งก�นไป็ตั�ม์ชน#ดของเน&9อเย่&�อ ก�รท �ม์ ระด�บอ�ตัร� protein tyrosin phosphorylation สำ)งเก#นกว��ป็กตั#สำ�ม์�รถีสำ�งผิลให�เก#ดม์ะเร8งได�หล�ย่ชน#ด, และก�รท��ง�นท �ตั���กว��ป็กตั#สำ�ม์�รถีก�อให�เก#ดเบ�หว�นชน#ดท � 2

ก�รให�คัว�ม์สำนใจในกระบวนก�ร protein tyrosine phosphorylation เร#�ม์ตั�นจ�กก�รศึ�กษ�กระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณระด�บเซลล�ของ PTKs รวม์ถี�งผิลท �เก#ดข�9นจ�กก�รกระตั"�นก�รท��ง�นโดย่ PTK แตั�ในก�รศึ�กษ�คัร�9งน�9นพบว��อ�ตัร�ของกระบวนก�ร protein tyrosine

phosphorylation จะถี)กคัวบคั"ม์โดย่ก�รท��ง�นของ PTK อ กทอดหน��ง ซ��งน��ไป็สำ)�ก�รพย่�ม์ย่�ม์ศึ�กษ�และท��คัว�ม์เข��ใจกระบวนก�รท �เก �ย่วข�องก�บก�รท��ง�นของ PTP เพ&�อน��องคั�คัว�ม์ร) �ด�งกล��วไป็ใช�ร�วม์ก�บคัว�ม์ร) �ท �ได�จ�กก�รศึ�กษ�ก�รท��ง�นและหน��ท �ของ

Page 3: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

PTK เพ&�อเข��ใจคัว�ม์สำ��คั�ญและหน��ท �ของเอนไซม์�สำองชน#ดน 9ในระบบสำร ระว#ทย่�ของเซลล�ตั�อไป็ แตั�ในคัว�ม์เป็�นจร#งแล�ว เอนไซม์�หร&อโป็รตั นในกล"�ม์ PTP เป็�นเอนไซม์�กล"�ม์ใหญ� (>100) ซ��งม์ คัว�ม์ซ�บซ�อนท�9งโคัรงสำร��งและก�รท��ง�นเช�นเด ย่วก�บเอนไซม์�ในกล"�ม์

kinase แตั�ข�อแตักตั��งระหว��ง PTP ก�บเอนไซม์� protein kinase คั&อ Proteinkinase จะม์ คัว�ม์จ��เพ�ะตั�อไทโรซ นและม์ ล��ด�บกรดอะม์#โนท �ม์ คัว�ม์คัล��ย่คัล�งก�บเอนไซม์� serine/threonine specific kinase แตั�สำ��หร�บ PTK จะไม์�ม์ ล��ด�บกรดอะม์#โนด�งกล��ว และไม์�พบล��ด�บกรดอะม์#โนท �ม์ คัว�ม์คัล��ย่คัล�งก�บเอนไซม์� phosphatase ท �ม์ คัว�ม์จ��เพ�ะคั�อนข��งตั��� เช�น acid หร&อ alkaline phosphatase และจ"ดเด�นของเอนไซม์�ใน PTP superfamily คั&อก�รม์ ล��ด�บกรดอะม์#โน (H/V)C(X)5R(S/T) หร&อท �เร ย่กว�� PTP signature motif ซ��งเป็�น catalytic domain

(โดเม์นท �ท��หน��ท �เร�งป็ฏิ#ก#ร#ย่�) ซ��งล��ด�บกรดอะม์#โนด�งกล��ว รวม์ถี�งคัว�ม์จ��เพ�ะตั�อสำ�รตั�9งตั�นเป็�นล�กษณะอน"ร�กษ�ท �จะพบใน PTP superfamily เท��น�9น

จ�ก�รศึ�กษ�เก �ย่วก�บบทบ�ทและก�รจ��แนกโป็รตั นในกล"�ม์ PTP ม์�กว��สำ#บห��ป็< ด�วย่คัว�ม์สำ�ม์�รถีในก�รก��จ�ดหม์)� phosphoryl จ�กสำ�วนท �เป็�น tyrosine บนโป็รตั น โดย่ PTP

สำ�ม์�รถีท��หน��ท � เป็=ด“ ” หร&อ ป็=ด“ ” สำว#ตัซ�ในกระบวนสำ�งสำ�ญญ�ณระด�บเซลล�ได� ด�งเช�นในกรณ ก�รทดลองท �ท��ให�เก#ดก�รหล�ย่ของ SHP-1 ซ��งสำ�ม์�รถีน��ไป็สำ)�ก�รบกพร�องของระบบภ)ม์#คั"�ม์ก�นอย่��งร"นแรงซ��งน��ไป็สำ)�ก�รเพ#�ม์ข�9นของฟ<โนไทป็>ชน#ด moth-eaten ในหน)ทดลอง ด�งน�9นคั�ดว�� SHP-1 จ�งม์ หน��ท �ในก�รกดก�รท��ง�นของก�รสำ�งสำ�ญญ�ณในระบบไซโตัไคัน� ซ��งก�รท��ง�นท �บกพร�องด�งกล��วท��ให�เก#ดก�รสำ)ญเสำ ย่ก�รคัวบคั"ม์ระด�บ tyrosine phosphorylation อ�นสำ�ม์�รถีน��ไป็สำ)�ก�รเพ#�ม์อ�ตัร�ก�รแบ�งตั�วเพ#�ม์จ��นวน

โดย่ FAP-1 Fas-associated phosphatase 1) ซ��งเป็�น PTP ชน#ดท �อย่)�ภ�ย่ในเซลล� จะไป็จ�บก�บก�บหม์)�คั�ร�บอกซ#ลของ Fas ผิ��น PDZ domain และสำ�ม์�รถีย่�บย่�9งก�รสำ�งสำ�ญญ�ณท �เก#ดจ�ก

Fas ซ��งจะน��ไป็สำ)�ก�รตั�ย่ของเซลล�แบบ apoptosis ได� และพบว��หน)ทดลองท �ข�ด PTP1B จะม์ คัว�ม์ไวตั�อระด�บอ#นซ)ล#นม์�กข�9นและจะท��ให�เก#ดก�รตั��นท�นตั�อคัว�ม์อ�วน จ�งสำ�ม์�รถีสำร"ป็ได�ว�� PTP1B จะท��หน��ท �ในก�รกดก�รท��ง�นของกระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณท �เก �ย่วข�องก�บระด�บของอ#นซ)ล#น และจ�กคัว�ม์สำ�ม์�รถีของผิล#ตัภ�ณฑ์�จ�กย่ น src, lck

และ neu, ซ�งเป็�น oncogen สำ�ม์�รถีกดก�รท��ง�นของ PTK ได� และด�วย่คัว�ม์สำ�ม์�รถีและก�รท��ง�นของ PTP ซ��งสำ�ม์�รถีกระตั"�นก�รสำร��งโป็รตั นท �สำ�ม์�รถีย่�บย่�9งก�รแสำดงออกของ oncoprotein ได� (หร&อท เร ย่กว�� tumor suppressor genes) และจ�กก�รทดลองในสำภ�วะท �

Page 4: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

เก#ดม์ะเร8งล��ไสำ�ใหญ�พบว��ม์ ผิลก�รทดลองหล�ย่ก�รทดลองท �บ�งช 9ว�� PTP ม์ คั"ณสำม์บ�ตั#ในก�รกดกระบวนก�รพ�ฒน�ของเซลล�ม์ะเร8งได�

นอกจ�กน�9นย่�งม์ ก�รศึ�กษ�พบว�� PTP หล�ย่ชน#ดม์ ก�รท��ง�นท �สำ�งเสำร#ม์สำ�ญญ�ณจ�กสำ�รกระตั"�นก�รแบ�งเซลล� (mitogen) ซ��งสำ�งเสำร#ม์ให�เก#ดกระบวนก�รเป็ล �ย่นแป็ลงของเซลล�ได�ง��ย่ข�9น เช�น ก�รสำน�บสำน"นก�รสำ�งสำ�ญญ�ณผิ��น CD45 และน��ไป็สำ)�ก�ร

dephosphorylation และกระตั"�น srs family PTKs ซ��งม์ คัว�ม์สำ��คั�ญในก�รกระตั"�นก�รท��ง�นและพ�ฒน�ก�รของ T และ B lymphocyte จ�กก�รศึ�กษ�โป็รตั น SHP-2 และโป็รตั นท �เป็�น

homologue ในแม์ลงหว � (Drosophila) พบว��เป็�นตั�วกระตั"�นก�รสำ�งสำ�ญญ�ณผิ��น growth

factor เม์&�อไม์�น�นม์�น 9ม์ ก�รคั�นพบว��ก�รเก#ดคัว�ม์ผิ#ดป็กตั#ของ SHP-2 (โดย่ก�รกล�ย่) จะสำ�งผิลให�เก#ดโรคัท�งพ�นธ"กรรม์ท �ม์ ช&�อว�� Noonan syndrome และก�รศึ�กษ�ล��สำ"ดพบว��

PRL-3 ม์ คัว�ม์เก �ย่วข�องก�บกระบวนก�รแพร�กระจ�ย่ (metastasis) ของม์ะเร8งล��ไสำ� (colorectal cancer)

จ�กก�รคั�นพบท �กล��วม์�ในข��งตั�นได�แสำดงให�เห8นว�� PTP ม์ บทบ�ทในกระบวนก�รท�งช วภ�พท �หล�กหล�ย่ในสำภ�วะ in vivo ด�งน�9นก�รเก#ดคัว�ม์ผิ#ดป็กตั#ของ PTP จ�งเป็�นสำ�เหตั"ของพย่�ธ#ก��เน#ดของโรคัไม์�ตั#ดเช&9อหล�ย่โรคัในม์น"ษย่� แตั�ในคัว�ม์เป็�นจร#ง จ�กข�อม์)ลจ โนม์ของม์น"ษย่�ท��ให�เร�ทร�บว��ในจ โนม์ของม์น"ษย่�ม์ ย่ นท �ก��หนดรห�สำโป็รตั นในกล"�ม์ PTP กว�� 100 ย่ น และย่�งไม์�สำ�ม์�รถีทร�บบทบ�ทของย่ นเหล��น 9อย่��งสำม์บ)รณ� ป็ระกอบก�บกระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณระด�บเซลล�เป็�นกระบวนก�รท �ม์ คัว�ม์หล�กหล�ย่และซ�บซ�อน ด�งน�9นจ�งม์ คัว�ม์เป็�นไป็ได�ว��โป็รตั น PTP หน��งตั�วอ�จม์ หน��ท �เก �ย่วข�องก�บหล�ย่กระบวนก�ร และในท�งกล�บก�นก8เป็�นไป็ได�ว��ในหน��งกระบวนก�รอ�จตั�องใช� PTP

หล�ย่ชน#ดในก�รสำ�งสำ�ญญ�ณ นอกจ�กน�9น PTP ย่�งสำ�ม์�รถีท��หน��ท �กระตั"�นรวม์ถี�งกดก�รท��ง�นของกระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณในระด�บเซลล�ได� น��นจ�งเป็�นอ"ป็สำรรคัอ กป็ระก�รหน��งในก�รศึ�กษ�บทบ�ทท�งสำร ระว#ทย่�ระด�บเซลล�ของ PTP ท�9งในสำภ�วะป็กตั#และสำภ�วะท �เก#ดโรคั

ในป็.จจ"บ�นกระบวนก�รศึ�กษ�ท �น#ย่ม์ใช�ในก�รศึ�กษ�บทบ�ทของ PTP คั&อก�รท��ให�เก#ด

gene knockout หร&อก�รท��ให�เก#ดก�ร over expression (ม์ ระด�บก�รแสำดงออกของย่ นม์�กกว��ป็กตั#) แตั�กระบวนก�รด�งกล��วก8ย่�งคังม์ ข�อจ��ก�ดหล�ย่ป็ระก�ร ด�งเช�นก�รศึ�กษ�ด�วย่ก�รท��ให�ย่ น over expression ม์�กจะเก#ดผิลข��งเคั ย่งอ�นไม์�พ�งป็ระสำงคั� และ

Page 5: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

ก�รกล�ย่แบบ gene knockout ในสำ�ตัว�ทดลองม์�กจะม์ ผิลข��งเคั ย่งท �ร"นแรงอ�นเก#ดจ�กคัว�ม์ผิ#ดป็กตั#ในกระบวนก�รพ�ฒน�ของตั�วอ�อน ด�งน�9นก�รศึ�กษ�โดย่กระบวนก�รท�งเคัม์ เช�น ก�รใช�สำ�รเคัม์ ท �ม์ อน"ภ�คัขน�ดเล8กแตั�สำ�ม์�รถีท��หน��ท �ในก�รย่�บย่�9งก�รท��ง�นของเป็2�หม์�ย่หร&อย่�บย่�9งกระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณระด�บเซลล�ท �ตั�องก�รศึ�กษ�จ�งเป็�นอ กกระบวนก�รหน��งท �น��สำนใจในป็.จจ"บ�น ซ��งก�รศึ�กษ�โดย่กระบวนก�รด�งกล��วม์ ข�อด หล�ย่ป็ระก�ร ได�แก� ท��ได�ง��ย่ไม์�ซ�บซ�อน, รวดเร8ว, สำ�ม์�รถีป็ร�บระด�บได�และย่�อนกล�บได� นอกจ�กน�9นสำ�รย่�บย่�9งขน�ดโม์เลก"ลเล8กเหล��น 9สำ�ม์�รถีก�อให�เก#ดก�รเป็ล �ย่นแป็ลงของเป็2�หม์�ย่ได�โดย่ไม์�ตั�องม์ ก�รด�ดแป็ลงท�งพ�นธ"กรรม์ของสำ�ตัว�ทดลองเป็�นสำ�เหตั"ของก�รผิ#ดพล�ดของผิลก�รทดลองด�งท �ได�กล��วม์�แล�ว และจ�กก�รพ�ฒน�ขององคั�คัว�ม์ร) �เก �ย่วก�บสำ�รในก�รย่�บย่�9งก�รท��ง�นของเอนไซม์�กล"�ม์

protein kinase ท��ให�เร�สำ�ม์�รถีท��คัว�ม์เข��ใจเก �ย่วก�บสำ�รตั�9งตั�นและคัว�ม์สำ��คั�ญท�งสำร ระว#ทย่�ของโป็รตั นในกล"�ม์น 9ได�ด ย่#�งข�9น

และตั�อไป็น 9ข��พเจ��จะกล��วโดย่สำร"ป็เก �ย่วก�บกระบวนก�รท��ง�นของสำ�รเคัม์ และก�รคั�ดเล&อกสำ�รเคัม์ ในก�รศึ�กษ�คัว�ม์สำ��คั�ญเช#งพ�นธ"ศึ�สำตัร�ของ PTP1B โดย่กระบวนก�รด�งกล��วท��ให�ก�รศึ�กษ�บทบ�ทของ PTP ในกระบวนก�รเจร#ญของเซลล�ในสำภ�วะท �แตักตั��งก�น (เซลล�ป็กตั#และผิ#ดป็กตั#หร&อเป็�นโรคั) เป็�นสำ#�งท �เป็�นไป็ได�

2. กระบวนการศึ�กษาด้�วยสารเคมี�และการศึ�กษาบทำบาทำของ PTP1B ในการส�งส�ญญาณ

PTP1B เป็�นโป็รตั นท �จ�ดอย่)�ในกล"�ม์ PTP family ซ��งม์ พบในเน&9อเย่&�อหล�ย่ชน#ด จ�กก�รศึ�กษ�ก�อนหน��พบว��ห�กหย่"ดก�รแสำดงออกของย่ นท �ก��หนดรห�สำโป็รตั น PTP1B จะสำ�งผิลให�เก#ดคัว�ม์ผิ#ดป็กตั#ของหน)ทดลอง และพบว��ก�รย่�บย่�9งก�รท��งนของ PTP1B ช�วย่ให�ก�รร�กษ�เบ�หว�นและโรคัอ�วนได�ผิลด ย่#�งข�9น โดย่จะพบว��ระด�บกล)โคัสำในเล&อดหล�งก#นอ�ห�รในหน)กล"�ม์ท �ท��ก�ร knockout ย่ นด�งกล��วจะม์ ระด�บกล)โคัสำตั���กว��หน)ป็กตั# จ�งสำ�ม์�รถีสำร"ป็ได�ว��ก�รท��ง�นของ PTP1B ม์ ผิลตั�อคัว�ม์ไวของระด�บน�9�ตั�ลในเล&อดและกระบวนก�รด&9อตั�อฮอร�โม์นอ#นซ)ล#น ซ��งคั�ดว��เก#ดจ�กกระบวนก�ร tyrosine

phosphorelation บนตั�วร�บอ#นซ)ล#นในตั�บและกล��ม์เน&9อในระย่ะเวล�ท �น�นเก#นป็กตั#

Page 6: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

จ�กก�รคั�นพบว��หน)ท �ม์ ก�รท��งน�ของ PTP1B ด�อย่กว��ป็กตั#จะม์ ระด�บไตัรกล เซอไรด�ตั���กว��หน)ป็กตั# และม์ อ�ตัร�ก�รเพ#�ม์ของน�9�หน�กตั�วน�อย่ม์�กเม์&�อได�ร�บอ�ห�รท �ม์ ไขม์�นสำ)ง

จ�กป็ร�กฏิก�รณ�ด�งกล��วสำ�ม์�รถีสำร"ป็ได�ว��ตั�วย่�บย่�9ง PTP สำ�ม์�รถีท��หน��ท �ได�ท�9งก�รลดคัว�ม์อ�วนและสำ�ม์�รถีแก�ไขก�รด&9อตั�อฮอร�โม์นอ#นซ)ล#นซ��งน�บว��เป็�นโอก�สำใหม์�ในก�รร�กษ�อ�ก�รโรคัอ�วนและเบ�หว�น ด�วย่คัว�ม์ร) �คัว�ม์เข��ใจด�งกล��วท��ให�โป็รตั น

PTP1B เป็�นท �สำนใจอย่��งกว��งขว�งในวงก�รเภสำ�ชกรรม์ในฐ�นะเป็2�หม์�ย่ในก�รร�กษ�โรคัและคัว�ม์ผิ#ดป็กตั#ท �พบม์�กท �สำ"ดในม์น"ษย่� อ�นได�แก�โรคัอ�วนและเบ�หว�น type2

น��นเอง

แตั�อย่��งไรก8ตั�ม์นอกเหน&อจ�กบทบ�ทในก�รสำ�งสำ�ญญ�ณของอ#นซ)ล#นและเลป็ตั#น (leptin) แล�ว PTP1B ย่�งม์ หน��ท �ในกระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณอ&�นๆ อ กหล�ย่ระบบ เช�น ก�รสำ�งสำ�ญญ�ณในระบบ growth factor และ integrin โดย่กระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณท �เก �ย่วเน&�องก�บ Integrin น�9นจะน��ไป็สำ)�ก�รเป็ล �ย่นแป็ลงโคัรงสำร��งของ actin ซ��งเป็�นสำ�วนท �ท��หน��ท �เป็�นโคัรงร��งคั�9�จ"นของเซลล� และม์ บทบ�ทเก �ย่วข�องก�บก�รเคัล&�อนท �, ก�รเจร#ญเตั#บโตัของเซลล� และก�รแพร�กระจ�ย่ของเซลล�ม์ะเร8ง รวม์ถี�งคัว�ม์สำ�ม์�รถีของเซลล�ในก�รหลบเล �ย่งจ�กกระบวนก�รตั�ย่แบบ apoptosis (ก�รตั�ย่ของเซลล�โดย่ไม์�ก�อให�เก#ดพย่�ธ#สำภ�พ) นอกจ�กน�9นกระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณของ growth factor ย่�งสำ�ม์�รถีท��ง�นร�วม์ก�บกลไกก�รสำ�งสำ�ญญ�ณในระบบ integrin ด�วย่ ด�งเช�นกรณ ก�รร�บสำ�ญญ�ณเพ&�อตัอบสำนองตั�ออ#นซ)ล#น, platlet-derived growth factor, epidermal growth factor,

fibroblast growth factor และ vascular endothelial growth factor แตั�จ�กก�รศึ�กษ�ก�อนหน��ท �พบว��ม์ คัว�ม์ข�ดแย่�งก�นระหว��งองคั�คัว�ม์ร) �เก �ย่วก�บหน��ท �ของ PTP1B ในแตั�ละก�รศึ�กษ� และเป็�นไป็ได�ท �ว��ก�ร knockout หร&อก�ร over expression ของย่ นท �เก �ย่วข�องก�บ

PTP1B จะให�ผิลก�รทดลองท �สำร"ป็ออกม์�ได�แตักตั��งก�น ซ��งเก#ดจ�กก�รสำ�งสำ�ญญ�ณข��ม์ระหว��งระบบ growth factor และ integrin-mediated signaling pathway ซ��งม์ คัว�ม์เก �ย่วข�องก�บกระบวนก�รคัวบคั"ม์และก�รท��ง�นของระบบสำร ระว#ทย่�ของเซลล� เช�น

ก�รเจร#ญเตั#บโตัของเซลล�, ก�รร"กร�นและก�รเคัล&�อนท �ของเซลล� ซ��งเป็�นผิลจ�กระบบก�รสำ�งสำ�ญญ�ณผิ��น integrin

เม์&�อไม์�น�นม์�น 9เร�ได�คั�นพบสำ�รเคัม์ ท �สำ�ม์�รถีย่�บย่�9งก�รท��ง�นของ PTP1B ได�อย่��งจ��เพ�ะ (compound 1, ภ�พท � 1) โดย่ม์ คั�� Ki เท��ก�บ 2.4 nM สำ��หร�บ PTP1B และพบว��สำ�ม์�รถี

Page 7: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

ย่�บย่�9ง PTP1B ได�อย่��งจ��เพ�ะเม์&�อทดสำอบเป็ร ย่บเท ย่บก�บ PTPs ชน#ดอ&�นๆ โดย่หม์)� difluorophosphonate ท �ม์ ป็ระจ"เป็�นลบ ซ��งม์ คัว�ม์จ��เพ�ะก�บ active site ของ PTP1B สำ)ง เพ&�อเพ#�ม์คัว�ม์สำ�ม์�รถีในก�รแทรกเข��สำ)�เซลล�ของสำ�รท �สำ�งเคัร�ะห�ข�9น เร�ได�ท��ก�รเพ#�ม์เตั#ม์ penetrating peptide (D) Arg8 โดย่เพ#�ม์ disulfide bridge ซ��งเร ย่กสำ�รชน#ดน 9ว�� compound II และชน#ดท �เตั#ม์ lipophilic fatty acid (compound III)

จ�กก�รทดสำอบคัว�ม์สำ�ม์�รถีในก�รแทรกตั�วผิ��นเซลล�ของ compound II และ III นอกจ�กน�9นย่�งพบว�� compound II และ III ม์ คัว�ม์สำ�ม์�รถีในก�รกระตั"�นระด�บกระบวนก�ร tyrosine phosphoerylation บนตั�วร�บอ#นซ)ล#นชน#ด h (Insulin receptor h; IRh) และ insulin receptor substrate 1 (IRS-1) ให�สำ)งข�9นเป็�น 2 เท�� และในก�รทดสำอบสำ�รท�9งสำองชน#ดในเซลล�เพ�ะเล 9ย่งท �ม์ คัว�ม์ไวตั�ออ#นซ)ล#น (insulin-sensitive cell line) พบว��ตั�วย่�บย่�9งท�9งสำองชน#ดน 9สำ�ม์�รถีกระตั"�นระด�บก�ร phosphorylation ของ IRh และ IRS-1, ก�รกระตั"�น Akt และ Erk1/2, ก�ร translocation ของ Glut4, ก�รขนสำ�งกล)โคัสำเข��สำ)�เซลล�, ก�รกระตั"�น transcription

ของ Elk1 และก�รแบ�งเซลล�ซ��งเป็�นผิลจ�กก�รกระตั"�นของอ#นซ)ล#น และสำ#�งท �สำ��คั�ญท �สำ"ดคั&อคัว�ม์สำ�ม์�รถีของตั�วย่�บย่�9งตั�อกระบวนก�รท�งสำร ระว#ทย่�ในเซลล� (เช�น ก�รเพ#�ม์�ข�9นเป็�นสำองเท��ของก�ร phosphorylation ของ IRh และ IRS-1) ซ��งสำอดคัล�องก�บผิลก�รศึ�กษ�โดย่กระบวนก�ร antisense –mediated reduction ใน PTP1B และ PTP1B knockout ในหน)ทดลอง

ซ��งพบว��ม์ คัว�ม์สำ�ม์�รถีในก�รลดอ�ตัร�ก�รเก#ดเบ�หว�นและก�รอ�วน จ�กผิลก�รทดลองด�งกล��วจ�งสำร"ป็ได�ว��ตั�วย่�บย่�9งท�9งสำองชน#ดสำ�ม์�รถีท��หน��ท �เล ย่นแบบกระบวนก�รกระตั"�นโดย่อ#นซ)ล#น และม์ แนวโน�ม์ในก�รใช�เป็�นสำ�รตั��นเบ�หว�นได� และนอกจ�กน�9นข�อม์)ลจ�กก�รศึ�กษ�ขอเร�ย่�งบ�งช 9ว��คัวรใช�ตั�วย่�บย่�9งด�งกล��วเพ&�อศึ�กษ�กระบวนก�รท��ง�นและบทบ�ทของ PTP1B ในระบบก�รสำ�งสำ�ญญ�ณระบบอ&�นเพ#�ม์เตั#ม์

Page 8: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

จ�ก�รศึ�กษ�บทบ�ทของ PTP1B ในกระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณผิ��นกระบวนก�ร Integrin-

mediated signaling pathway ด�วย่ compound II และ compound III พบว��ก�รย่�ดเก�ะระหว��ง

integrin และ fibronectin สำ�ม์�รถีกระตั"�นกระบวนก�ร focal adhesion และก�รก�อตั�วของ actin

fiber เพ&�อตัอบสำนองตั�อคัว�ม์เคัร ย่ด ซ��งสำ�งผิลให�เก#ดก�รแผิ�ขย่�ย่ของเซลล�และก�รเคัล&�อนท �ของเซลล� ก�รให� L cell ได�ร�บ compoundII และ compound III สำ�ม์�รถีย่�บย่�9งก�รเคัล&�อนท �ของเซลล�ได�ตั�ม์ระด�บคัว�ม์เข�ม์ข�นของตั�วย่�บย่�9งโดย่ก�รข�ดขว�งกระบวนก�รก�รก�อโคัรงร��งของ fibronectin จ�กผิลก�รทดสำอบด�งกล��วสำ�ม์�รถีสำร"ป็ได�ว�� PTP1B ม์ ทบ�ทในก�รคัวบคั"ม์แบบ positive regulation ในก�รสำ�งสำ�ญญ�ณผิ��น integrin ซ��งจ��เป็�นตั�องอ�ศึ�ย่ก�รท��ง�นของ PTP1B

นอกเหน&อจ�กก�รกระตั"�นผิ��น integrin แล�ว ย่�งสำ�ม์�รถีท��ให�เก#ดก�ร kinase ของโป็รตั นใน Src family และ focal adhesion kinase (FAK) ร�วม์ก�นหร&อเป็�นอ#สำระตั�อก�น ก�ร phosphorylate

ของโป็รตั น Src และ FAK ย่�งสำ�ม์�รถีกระตั"�นโป็รตั นชน#ดอ&�นๆ เช�น p130Cas (Crk associated

substrate) สำ�งผิลให�เก#ดก�รกระตั"�นของระบบสำ�งสำ�ญญ�ณท �ป็ล�ย่ท�ง เช�น extracullular

signal-regulated kinase (ERK) 1 และ 2 ด�งน�9นจ�งคัวรท��ก�รศึ�กษ�ผิลก�รย่�บย่�9งโป็รตั น PTP1B

ด�วย่ตั�วย่�บย่�9ง compound II ตั�อกระบวนก�ร phosphorylation ของ Src, FAK, p130C และ ERK

Page 9: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

ในก�รศึ�กษ�ผิลของ compound II ตั�อก�ร phosphorylation ของ Src คัร�9งแรกของพวกเร�

พบว�� Src สำ�ม์�รถีถี)กคัวบคั"ม์ระด�บก#จกรรม์ได�จ�กกระบวนก�ร phosphorylation ถี�งได� ณ tyrosine residue สำองตั��แหน�ง ได�แก� autophophorylation ของ kinase domain ของตั�ว Src เอง

และก�ร kinase บน Tyr527 ท �ป็ล�ย่ C-terminal โดย่ C-terminal Src kinase (CSK) inactive Src ซ��งก�ร phosphorylation ของ Ty527 น 9เป็�นผิลจ�กก�รศึ�กษ�กระบวนก�รย่�บย่�9งโดย่ Compound

II น��นเอง เม์&�อ Ty527 ถี)กเตั#ม์หม์)�ฟอสำเฟตัแล�วจะท��ให�เก#ดก�รท��ป็ฏิ#ก#ร#ย่�ก�บ SH2 domain

บน Src ซ��งสำ�งผิลให�โม์เลก"ลของ Src ซ��งอย่)�ในร)ป็แบบป็=ด (closed comformation) ซ��งเป็�นสำ�เหตั"ท��ให� active domain ไม์�สำ�ม์�รถีสำ�ม์ผิ�สำก�บสำ�รตั�9งตั�นได� จ�กน�9นก�รกระตั"�นของ SH2

domain โดย่ก�รเตั#ม์ฟอสำเฟตัจะสำ�งผิลให�เก#ดก�รขจ�ดฟอสำเฟตัท �ป็ล�ย่ C-terminal ของโป็รตั นโดย่เอนไซม์� PTPs ท �ม์ คัว�ม์จ��เพ�ะ ด�งแสำดงในภ�พท � 2 และก�รให�เซลล�ได�ร�บ

Compound II ในอ�ตัร� 5 nM ซ��งท��ให�ม์ คั�� Ki เป็�นสำองเท��ของ Ki ป็กตั#ของม์�น จะสำ�งผิลให�เก#ดก�ร phosphorylation ของ Tyr527 สำ)งข�9นแตั�ไม์�สำ�งผิลใดๆ ตั�อ Tyr416 แสำดงให�เห8นว��ท �อ�ตัร�คัว�ม์เข�ม์ข�นด�งกล��วจะท��ให� Compound II สำ�ม์�รถีย่�บย่�9งก�รท��ง�นของ PTPs ได�อย่��งจ��เพ�ะ และไม์�สำ�งผิลตั�อก�ร dephosphorylation ณ tyrosine ตั��แหน�งอ&�น ซ��งแสำดงให�เห8นถี�งคัว�ม์จ��เพ�ะในก�รย่�บย่�9งก�รท��ง�นของ PTPs ท �ม์ คัว�ม์จ��เพ�ะ และก�รย่�บย่�9ง

PTPs โดย่ compound II สำ�ม์�รถีรบกวนกระบวนก�รแพร�กระจ�ย่และก�รเคัล&�อนท �ของเซลล�ผิ��นก�รกระตั"�นของ Integrin ได�

หล�งจ�กน�9นเร�ได�ท��ก�รทดสำอบผิลของ compound II ในก�รย่�บย่�9ง PTP1B ตั�อระด�บ

phosphorylation ของ FAK และ 130Cas และพบว��ห�ก FAK และ/หร&อ p130Cas เป็�นสำ�รตั�9งตั�นโดย่ตัรงของ PTP1B คัวรจะพบว��ระด�บ phosphorylation ของโป็รตั นท�9งสำองชน#ดตั 9เพ#�ม์ข�9นเม์&�อเซลล�ได�ร�บ compound II และห�กโป็รตั นเหล��น 9ไม์�ได�เป็�นสำ�รตั�9งตั�นของ PTP1B

โดย่ตัรง จะสำ�ม์�รถีสำ�งผิลท �อ�จจะเก#ดข�9นได�สำองกรณ คั&อ กรณ แรก จะไม์�พบก�รเป็ล �ย่นแป็ลงในระด�บ tyrosine phosphorylation ของโป็รตั นสำองชน#ดน 9 หร&อป็ระก�รท �สำอง

จะม์ ระด�บ tyrosine phosphorylation ของโป็รตั นเหล��น 9ลดลง ซ��งก�รคั�ดก�รณ�เหล��น 9เป็�นผิลม์�จ�กก�รทดลองก�อนหน�� ซ��งพบว��ระด�บก�ร phosphorylation ของ FAK และ p130C

เพ#�ม์ข�9นจ�กก�รท��ง�นของ Src ซ��งถี)กกระตั"�นโดย่ PTP1B

ด�งน�9นก�รย่�บย่�9งก�รท��ง�นของ PTP1B โดย่ compound II จ�งคัวรสำ�งผิลให�เก#ดก�รลดลงของอ�ตัร�ก#จกรรม์ kinase ของ Src ซ��งคัวรสำ�งผิลให�เก#ดอ�ตัร�ก�ร phosphorylation ของ

Page 10: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

สำ�รตั�9งตั�นของ Src ลดลง และจ�กผิลก�รทดลองพบว��ก�รย่�บย่�9งก�รท��ง�นของ PTP1B

น�9นจะเก#ดข�9นตั�ม์ระด�บคัว�ม์เข�ม์ข�นของตั�วย่�บย่�9ง (compound II) ซ��งสำ�ม์�รถีสำ�งผิลให�อ�ตัร�ก�ร phosphorylation ของ FAK และ p130Cas ลดลงแบบ dose-dependent (ภ�พท � 2)

ซ��งสำ�ม์�รถีสำร"ป็ได�ว��ท�9ง FAK และ p130Cas น�9นไม์�ใช�สำ�รตั�9งตั�นโดย่ตัรงของ PTP1B และในข�9นตัอนตั�อไป็ เร�ได�ทดสำอบผิลของตั�วย่�บย่�9ง (compound II) ตั�อระด�บก�ร tyrosine

phosphorylation ของ ERK kinase ซ��งม์ หน��ท �ในก�รสำ�งสำ�ญญ�ณป็ล�ย่ท�งของกระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณท �ได�ร�บก�รกระตั"�นจ�ก Integrin ห�ก PTP1B ม์ คัว�ม์สำ�ม์�รถีในก�รกระตั"�นก�ร kinase ของ Src จะสำ�งผิลให�ม์ phosphor-ERK ลดลงเม์&�อได�ร�บ compound II และให�ผิลเช�นเด ย่วก�น (ภ�พท � 2) เม์&�อทดสำอบด�วย่ compound III ซ��งบ�งช 9ว�� compound II สำ�ม์�รถีย่�บย่�9งก�รท��ง�นของ PTP1B ได�แบบไม์�จ��เพ�ะ

จ�กผิลก�รทดสำอบใน compound II, III สำ�ม์�รถีสำร"ป็ได�ว�� phosphorelated Tyr527 บน Src

สำ�ม์�รถีถี)กได�ร�บก�ร phosphorylation ได�โดย่ Tyr527 ได�โดย่ตัรง ซ��งสำม์ม์ตั#ฐ�นด�งกล��วได�ร�บก�รสำน�บสำน"นจ�กก�รทดลอง “substrate-binding” ใน mutant ของ PTP1B พบว��สำ�ม์�รถีป็2องก�นก�ร phosphorylation ให�ก�บ Src ได� และสำ�ม์�รดป็2องก�นก�รเก#ด dephosphorylation

จ�ก endogenous PTP1B จ�กผิลก�รศึ�กษ�ท�9งหม์ดล�วนย่&นย่�นอย่��งหน�แน�นว�� PTP1B

Page 11: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

ม์ หน��ท �สำ�งเสำร#ม์กระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณผิ��น intergrin โดย่ก�รกระตั"�น Src ผิ��นก�รขจ�ดฟอสำเฟตับน pTyr527

กล��วโดย่สำร"ป็คั&อ จ�กก�รศึ�กษ�โดย่ตั�วย่�บย่�9งท �ม์ คัว�ม์สำ�ม์�รถีในก�รเล&อกจ�บก�บ

PTP1B น�9น จะม์ คัว�ม์สำ�ม์�รถีในก�รย่�บย่�9ง PTP1B ได�ตั�ม์สำภ�วะแวดล�อม์ของเซลล� และ PTP1B สำ�ม์�รถีท��หน��ท �เป็�นตั�วสำ�งเสำร#ม์ (positive effecter) (เช�น ในกระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณผิ��น intergrin) หร&อตั�วย่�บย่�9ง (negative modulator) (เช�น ในก�รร�บสำ�งสำ�ญญ�ณผิ��นอ#นซ)ล#น) ในกระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณระด�บเซลล� ซ��งสำ�ม์�รถีบ�งช 9ถี�งคัว�ม์สำ�ม์�รถีของสำ�รเคัม์ ในก�รคัว�ม์คั"ม์กระบวนก�รท��ง�นของ PTP ได�ในสำภ�วะ in vivo นอกจ�กน�9นตั�วย่�บย่�9ง PTP1B เช�น compound II และ compound III เป็�นเคัร&�องม์&อท �ม์ ป็ระสำ#ทธ#ภ�พสำ)งในก�รศึ�กษ�กระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณในระด�บเซลล�ในหล�ย่ๆ กระบวนก�ร ซ��งสำ�ม์�รถีพ�ฒน�ไป็สำ)�กระบวนก�รศึ�กษ�ด�วย่ isozime-specific inhibitor ชน#ดอ&�นๆ และเป็2�หม์�ย่สำ)งสำ"ดของเร�คั&อก�รพ�ฒน�ตั�วย่�บย่�9ง PTPs ท �ม์ คัว�ม์จ��เพ�ะตั�อก�รท��ง�นของ PTP ในกระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณระด�บเซลล� ซ��งสำ�ม์�รถีพ�ฒน�ไป็สำ)�แนวท�งก�รร�กษ�โรคัจ�กตั�วย่�บย่�9งท �พ�ฒน�ข�9น

Page 12: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

3. การพั�ฒนา Activity-based probes เพั!"อเป็$นเคร!"องมี!อศึ�กษาก%จกรรมีของ PTP ในเชิ%งกว�าง

จ�กคัว�ม์ร) �ท �ว�� PTP ม์ บทบ�ทสำ��คั�ญในกระบวนก�รคัวบคั"ม์ก#จกรรม์ภ�ย่ในเซลล� แตั�เน&�องจ�กคัว�ม์หล�กหล�ย่และคัว�ม์ซ�บซ�อนในก�รท��ง�นของ PTP ซ��งเป็�นอ"ป็สำรรคัสำ��คั�ญในกระบวนก�รศึ�กษ�ท �สำ��คั�ญ และด�วย่คัว�ม์ซ�บซ�อนของกระบวนก�รท�งช วภ�พในเซลล� รวม์ถี�งก�รท��ง�นก�รทดแทนของ PTP ท �ม์ อย่)�หล�ย่ชน#ดในเซลล�ท��ให�ก�รแป็ลผิลก�รทดลองเก �ย่วก�บ phenotype ท �เก#ดจ�กก�รกล�ย่ของย่ น PTP ได�ย่�ก แตั�ด�วย่เทคัน#คัท �เร�พ�ฒน�ข�9นใหม์�น 9 ท��ให�เร�สำ�ม์�รถีศึ�กษ�กระบวนก�รท��ง�นของ PTP ได�โดย่ไม์�จ��เป็�นตั�องท��ให�เก#ดก�รกล�ย่ของย่ น และม์ ข�อได�เป็ร ย่บกว��ก�รศึ�กษ�โดย่กระบวนก�รท�งพ�นธ"ศึ�สำตัร�ได�หล�ย่ป็ระก�ร และสำ�ม์�รถีแก�ไขป็.ญห�ท �เก#ดข�9นจ�กกระบวนก�รท��ง�นท �ซ�บซ�อนและก�รท��ง�นทดแทนก�นของโป็รตั นใน proteome

จ�กคัว�ม์สำ�ม์�รถีในก�รว#เคัร�ะห�ก�รเป็ล �ย่นแป็ลงของระด�บก�ร transcription ในระด�บ

genome-wide ท��ให�เร�สำ�ม์�รถีจ�ดจ��แนกกล"�ม์ของย่ นท �ท��หน��ท �ร �วม์ก�นหร&อม์ กระบวนก�รคัวบคั"ม์ร�วม์ก�นได� แตั�อย่��งไรก8ตั�ม์ ก8ย่�งไม์�สำ�ม์�รถีย่&นย่�นได�เตั8ม์ท �ว��ระด�บ mRNA ท �เป็ล �ย่นแป็ลงไป็น�9นจะม์ คัว�ม์สำ�ม์พ�นธ�โดย่ตัรงก�บก�รท��ง�นและก#จกรรม์ของโป็รตั นน�9นๆ หร&อไม์� ด�งน�9น ก�รศึ�กษ�ในระด�บ proteomic ซ��งเป็�นก�รศึ�กษ�ก�รเป็ล �ย่นแป็ลงของโป็รตั นท�9งหม์ดจ�งเป็ร ย่บเสำม์&อนเคัร&�องม์&อท �สำ�ม์�รถีเตั#ม์ช�องว��งของก�รศึ�กษ�แบบ genomic ได� แตั�อย่��งไรก8ตั�ม์ จ�กป็ระสำ#ทธ#ภ�พของกระบวนก�รศึ�กษ�ท �เก#ดข�9นใหม์�ในป็.จจ"บ�น เช�น activity – based proteomics ท��ให�สำ�ม์�รถีศึ�กษ�ระด�บก#จกรรม์ของโป็รตั นได�ในระด�บ proteome ซ��งน�บว��เป็�นเป็2�หม์�ย่สำ)งสำ"ดของก�รศึ�กษ�โป็รตั นท"กชน#ด ซ��งสำ�ม์�รถีพ�ฒน�ให�เก#ดข�9นได�โดย่ก�รคั#ดคั�น probe ท �เป็�นสำ�รเคัม์ (chemical probe) ซ��งสำ�ม์�รถีจ�บก�บ active site ของเอนไซม์�ได�ด�วย่ก�รด�ดแป็ลงพ�นธะโคัว�เลนตั�และม์ ระด�บก�รจ�บท �ข�9นก�บระด�บของก#จกรรม์ หร&อท �เร ย่กว�� activity – based probe

โดย่สำ�ม์�รถีแย่ก, และว�ดระด�บก�รจ�บของ probe ก�บโป็รตั นได�โดย่กระบวนก�รท�ง

chromatography, electrophoresis หร&อ mass spectrometry ซ��งในป็.จจ"บ�นสำ�ม์�รถีพ�ฒน� probe

สำ��หร�บว�ดก#จกรรม์ของเอนไซม์� serine และ cysteine hydrolases ซ��ง probe ด�งกล��วท��ให�น�กว#จ�ย่สำ�ม์�รถีว�ดระด�บและตั#ดตั�ม์ระด�บก�รท��ง�นของโป็รตั นในเซลล�ได�โดย่ตัรง ไม์�ว��จะเป็�นสำภ�วะใดๆ ก8ตั�ม์

Page 13: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

เป็�นท �ทร�บก�นด ว��ก�รท��ง�นของ PTP น�9นจะข�9นก�บก#จกรรม์ก�รสำล�ย่สำ�รตั�9งตั�น (catalytic activity) ห�กเร�สำ�ม์�รถีพ�ฒน� activity-based probe ท �สำ�ม์�รถีตั#ดตั�ม์ก�รท��ง�นของ PTP ได� ก8จะท��ให�เร�สำ�ม์�รถีตั#ดตั�ม์ระด�บก#จกรรม์ของ PTP ได�ในระด�บ proteome

ด�วย่คัว�ม์คั#ดด�งกล��ว เร�จ�งพ�ฒน� activity - based probe ซ��งป็ระกอบด�วย่ หน�วย่ท �ม์ คัว�ม์จ��เพ�ะตั�อ active site ของ PTP และสำ�ม์�รถีเช&�อม์ตั�อก�บ active site ได�ด�วย่พ�นธะโคัว�เลนตั� และตั#ดฉล�กสำ�รด�งกล��วด�วย่ biotin และระบบก�รร�ย่ง�นผิลอ&�นๆ เพ&�อให�สำ�ม์�รถีคั�ดแย่กและตั#ดตั�ม์ก#จกรรม์ของเอนไซม์�ได� (ภ�พท � 3) จ�กก�รศึ�กษ�พบว��

activity-based probe ท �พ�ฒน�ข�9น หร&อ a-bromobenzyl phophonate ม์ คัว�ม์สำ�ม์�รถีเป็�นตั�วย่�บย่�9ง PTP ของ Yersenis pestis (YopH) แบบไม์�ย่�อนกล�บ ซ��งสำ�รด�งกล��วป็ระกอบหน�วย่หม์)� phenyl phosphonate ซ��งสำ�ม์�รถีเล ย่นแบบ pTyr และสำ�ม์�รถีจ�บก�บ active site ของเอนไซม์�เป็2�หม์�ย่ได�ด และผิลก�รทดสำอบบ�งช 9ว�� probe ด�งกล��วจ�บก�บ PTP ด�วย่พ�นธะโคัว�เลนตั�

จ�กก�รทดลองพบว�� PTPprobe สำ�ม์�รถีย่�บย่�9งป็ฏิ#ก#ร#ย่�ของ PTP ในร)ป็แบบท �ข�9นก�บเวล�และคัว�ม์เข�ม์ข�น (time & concentration dependent manner) และสำ�ม์�รถีจ�บก�บ active site

ของ PTP ได�โดย่ตัรง ม์ กระบวนก�รย่�บย่�9งแบบแข�งข�น (competitive inhibitor) โดย่ก�รแย่�งจ�บก�บสำ�รตั�9งตั�นบน active site ด�วย่พ�นธะโคัว�เลนตั� (จ�กก�รทดสำอบด�วย่ก�รกล�ย่ของย่ น PTP) และเน&�องจ�ก probe ได�ร�บก�รตั#ดฉล�กด�วย่ biotin ท��ให�สำ�ม์�รถีตั#ดตั�ม์

probe ได�โดย่ก�รใช� anti--biotin หล�งจ�กแย่กโป็รตั นจ�กตั�วอย่��งด�วย่ SDS-PAGE ในภ�พท � 4 เป็�นผิลก�รทดลองก�บ probe ท �พ�ฒน�ข�9น พบว��สำ�ม์�รถีจ�บก�บ PTP หล�ย่ชน#ดด�วย่พ�นธะโคัว�เลนตั� และสำ�ม์�รถีตั#ดฉล�กเพ&�อตั#ดตั�ม์ระด�บก�รท��ง�นของ PTP ได� และผิลจ�ก MS ก�รสำ)ญเสำ ย่อะตัอม์โบรไม์ด�ออกจ�ก probe จะท��ให�เก#ดก�รสำร��งพ�นธะโคัว�เลนตั�ก�บหม์)� thiol ของ probe และพบว�� probe จะไม์�สำ�ม์�รถีท��ง�นได�ห�กอย่)�ในสำภ�วะท �ม์ สำ�รในกล"�ม์ nucleophilic agent เช�น DDT sodium azide และ cysteine

Page 14: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

เร�ได�ท��ก�รทดสำอบว�� probe จะไม์�เก#ดป็ฏิ#ก#ร#ย่�ก�บโป็รตั นชน#ดอ&�น พบว�� probe ไม์�ท��ป็ฏิ#ก#ร#ย่�ก�บเอนไซม์�อ&�น เช�น alkaline phosphatase, E phosphatase, PP1 และ PP2B

serine/threonine phosphatase, serine protease และ cycteine protease papain และนอกจ�กน�9นย่�งไม์�เก#ดป็ฏิ#ก#ย่�ก�บ prostatic acid phosphatase จ�กม์�นฝร��ง, SH2 domain (Grb2), PTB domain

(Shc & SNT1), Src kinase, serein protease chymotrypsin, metalloprotease thermolysin, cystein

protease calpain, glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase และ glutathione S trasferase

(เน&�องจ�กม์ คั�� pKa ตั���), bovine serum albumin และ lysozyme และทดสำอบด�วย่ก�รบ�ม์ probe

ร�วม์ก�บ alkaline lysate ของ E. coli ท �ได�ร�บก�รถี��ย่ย่ น YopH และกล"�ม์คัวบคั"ม์ (ไม์�ได�ร�บก�รถี��ย่ย่ น) และเม์&�อน��ม์�ว#เคัร�ะห�ด�วย่ Western-blot สำร"ป็ได�ว�� probe จะตั#ดเฉพ�ะเอนไซม์� YopH เท��น�9น

เม์&�อทดสำอบซ�9�ในเซลล�เพ�ะเล 9ย่งท �ได�จ�กม์น"ษย่� hTERT, MCF-7 (เป็�นเซลลท �ได�จ�กเซลล�เย่&�อบ"เตั��นม์และเซลล�ม์ะเร8งเตั��นม์ตั�ม์ล��ด�บ) พบว��เม์&�อใช� probe และน��ม์�ย่�อม์สำ จะได�ผิลด�งภ�พท � 5 โดย่พบว��ม์ PTP อย่��งน�อย่ 4 ชน#ดท �ม์ ระด�บก�รแสำดงออกท �แตักตั��งก�นในสำองสำภ�วะ (เน&9อเย่&�อป็กตั#และม์ะเร8งเตั��นม์) โดย่ PTP 2 ชน#ด (ม์วล 230 และ 100 kDa) ม์ ก�รแสำดงออกใน MCF-7 ตั���กว�� hTERT และ พบว�� PTP อ กสำองชน#ด (60, 70 kDa) ม์ ก�รแสำดงออกใน MCF-7 สำ)งกว�� hTERT หล�ย่เท��ตั�ว ซ��งก�รทดลองด�งกล��วท��ให�เร�สำ�ม์�รถีเช&�อม์โย่งคัว�ม์สำ�ม์พ�นธ�ระหว��ง PTP ก�บม์ะเร8งได�

กล��วโดย่สำร"ป็แล�ว พวกเร�สำ�ม์�รถีพ�ฒน� activity-based probe ท �สำ�ม์�รถีตัรวจว�ดระด�บก#จกรรม์ของเอนไซม์� PTP ได�ในระด�บเซลล�หร&อเน&9อเย่&�อ ซ��งสำ�ม์�รถีน��ไป็ใช�ในก�รศึ�กษ�

Page 15: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

เก �ย่วก�บระบบก�รสำ�งสำ�ญญ�ณในระด�บเซลล�ได� และสำ�ม์�รถีน��ไป็ศึ�กษ�หน��ท �ของ PTP

แตั�ละชน#ดในแง�พย่�ธ#ก��เน#ดของโรคัท �เก#ดจ�กคัว�ม์ผิ#ดป็กตั#ของ PTP ได� และสำ�ม์�รถีน��ไป็ป็ระย่"กตั�ใช�เป็�นเคัร&�องม์&อในก�รตัรวจคั�ดกรองและห�แนวโน�ม์ท �จะเก#ดโรคัได�

ป็ระก�รสำ"ดท��ย่ probe ท �พ�ฒน�ข�9นน 9เป็�นเคัร&�องม์&อท �ก�อให�เก#ดก�รเป็ล �ย่นแป็ลงของร)ป็แบบก�รตั#ดตั�ม์ก#จกรรม์ของ PTP, ก�รร�กษ�ด�วย่ย่�, ก�รศึ�กษ�คัว�ม์ผิ#ดป็กตั#ของย่ น,

หร&อกระบวนก�รเก#ดโรคั (เช�น ภ�วะด&9อตั�ออ#นซ)ล#น) ก�รศึ�กษ�ร�วม์ก�นระหว��งกระบวนก�รท�ง chemical genetics ก�บ activity-based proteomics จะช�วย่ให�น�กว#จ�ย่สำ�ม์�รถีท��คัว�ม์เข��ใจถี�งบทบ�ทของ PTPs ในกระบวนก�รท�งสำร ระว#ทย่�และพย่�ธ#ก��เน#ดของโรคัในม์น"ษย่�ได�อย่��งถี�องแท�ม์�กข�9น

ก%ตต%กรรมีป็ระกาศึ

ก�รทดลองในห�องป็ฏิ#บ�ตั#ก�รของผิ)�แตั�งได�ร�บคัว�ม์สำน�บสำน"นจ�กเง#นท"น CA69202,

DK68447, และ 1U54 AI57158 จ�ก the NIH และ ม์)ลน#ธ# G. Harold และ Leila Y. Mathers Charitable


Recommended