Análise quantitativa em Cromatografia Líquida (LC)
Análise quantitativa
Compreende os métodos e técnicas usados para quantificar os componentes de uma amostra.
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Relembrando conceitos...
Cromatografia Líquida
Método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição destes componentes entre duas fases: móvel e estacionária (ambas líquidas). Cada um dos componentes é seletivamente retido pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais destes.
Cromatografia em Coluna (CC)
Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Cromatografia em Papel (CP)
Cromatografia Líquida de alta Eficiência (CLAE)
Entre outros...
Injeção Migração Eluição3
Relembrando conceitos...
Análise qualitativa
Compreende os métodos e técnicas usados para identificação dos componentes de uma amostra.
CLAE� Identificação pelo tempo de retenção (tR).
Tempo (min)Tempo (min)
Res
po
sta
do
det
ecto
r
Res
po
sta
do
det
ecto
r
Amostra Padrão 4
Análise quantitativa
Conhecimento do problema
Conhecimento do universo
Escolha do método
Amostragem
Homogeneização
Eliminação de interferentes
Análise
Expressão dos resultados
Tratamento prévio
Tratamento de dados
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Métodos de quantificação
�Normalização Interna;
�Normalização de área;
�Padronização Externa;
�Padronização Interna;
�Superposição de matriz;
�Adição de padrão.6
Normalização Interna
% A = (Área de A / Área total ) x 100
Indica a quantidade de um componente em relação aos outros componentes na amostra.
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Tempo (min)
Res
po
sta
do
de
tect
or
� Vantagens
• É simples e prática, sendo ideal para análises de rotina em que a exatidão não é um fator importante;
• Independe do volume injetado;• Independe da estabilidade do aparelho;• Não é necessária a utilização de padrões.
� Desvantagens
• Não se aplica a amostras complexas• Exige o registro de todos os componentes• Não é adequada para análise de traços• Assume que todos os componentes injetados na coluna são
eluídos;• Assume que o detector apresenta a mesma resposta para
todos os componentes da mistura.
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_____________________________________Normalização interna
Exemplo
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Figura. Cromatograma em CLAE-DAD de mistura
flavonoídica. Condições cromatográficas: coluna Inertsil
Prep-ODS (250 x 6 mm, 10 µm); Temp. de 30°C; 1,4
mL.min-1. 265 nm.
� Perkin Elmer (Séries 200):
• TotalChrom Software
•LaPNaT (Lab. 627 – IQ/UFRJ)
Normalização de áreas
• Preparam-se diferentes soluções padrão com massas conhecidas (m);
• Obtem-se a área de cada um dos picos;
• Calcula-se a razão A/m (fator de resposta).
% A = [(Área de A / F) / (∑ Áreas / ∑ F )] x 100
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Tempo (min)
Res
po
sta
do
de
tect
or
�Vantagens
• As mesmas que a normalização interna, atrelado ao fato de que nesse caso o resultado é mais exato;
�Desvantagens
• não se aplica a amostras complexas;• exige o registro de todos os componentes;• não é adequada para análise de traços;• utiliza vários padrões;
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_____________________________________Normalização de área
• Preparam-se uma série de soluções padrão contendo a substância de interesse;
• Os padrões são injetados no sistema cromatográfico;
• A partir das áreas dos padrões constrói-se gráfico: área x concentração;
• Injeta-se a amostra com o analito de concentração desconhecida;
• A concentração da substância de interesse pode ser determinada por interpolação gráfica ou através da equação da reta determinada por regressão linear.
Padronização externa
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Padronização externa
Padronização externa
Padronização externa
Padronização externa
Padronização externa
Padronização externa
Padronização externa
Padronização externa
Curva analítica
Em técnicas instrumentais, a relação linear simples, descrita pelo modelo:
f(x) = b0 + b1x
geralmente, é válida em um determinado intervalo de massa ou concentração da espécie medida.
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22
Curva analítica
Atenção:
Faixa linear
dinâmica.
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Limite de detecção (LD)
O limite de detecção representa a menor concentração da substância em análise que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, utilizando um determinado procedimento experimental.
Importante: O LD pode ser calculado com base na relação sinal/ruído (3:1).
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Limite de quantificação (LQ)
O limite de quantificação representa a menor concentração da substância em exame que pode ser medida, utilizando um determinado procedimento experimental.
Importante: LQ pode ser calculado utilizando a relação sinal-ruído (10:1).
�Vantagens:
• Pode ser usada de maneira pontual, relacionando a área da substância de interesse na amostra com a área de apenas um padrão, independe da detecção dos demais picos;
• Utilizada para amostras complexas;• Pode ser utilizada na análise de traços.
�Desvantagens
• Depende da estabilidade do sistema cromatográfico;• É afetado por erros durante a introdução da amostra no
sistema cromatográfico;• Não considera efeito de matriz.
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_____________________________________Padronização externa
Exemplo
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54321A5 – solução padrão
Maior concentração
2-4 –solução padrãoConcentrações intermediárias
1 – solução padrão Menor concentração
A - amostra
Legenda:
Densitometria computacional: quantificação em CCD
Aplicação da amostra
Marta Olech, Łukasz Komsta, Renata Nowak, Łukasz Cies´la, Monika Waksmundzka-Hajnos. Investigation of antiradical activity of plant material by thin-layer chromatography with image processing. Food Chemistry 132,549–553, 2012.
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54321A
Após eluição
ExemploDensitometria computacional: quantificação em CCD
Densitograma
Olech, M.; Komsta, Ł.; Nowak, R.; Cies´la, Ł.; Waksmundzka-Hajnos, M. Investigation of antiradical activity of plant material by thin-layer chromatography with image processing. Food Chemistry, 132, 549–553, 2012.
Padronização interna
A padronização interna é uma técnica na qual um padrão é injetado concomitantemente à amostra desconhecida, isto é, ele é dissolvido na própria amostra e servirá de base para os cálculos quantitativos do alvo analítico a partir de uma relação de áreas.
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Da escolha do padrão interno:
• Não pode estar presente na amostra;
• Deve estar disponível em elevado grau de pureza;
• Deve ter comportamento cromatográfico similar ao da substância a ser analisada;
• Deve estar numa concentração próxima a da substância de interesse na amostra (devendo esta ser previamente estimada);
• estável, não-reativo;
• Deve ser bem resolvido dos outros picos.
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Um analista deseja determinar a concentração da substância A em uma amostra de água por cromatografia líquida de alta eficiência. Para isso, escolheu um padrão interno (PI) adequado e preparou vários padrões contendo o PI e a substância A em água destilada, obtendo os seguintes resultados:
Exercício
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Qual a concentração da substância A na amostra de água?
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�Vantagens:
• O volume de injeção não influi no resultado;
• útil, especialmente pelo fato de que independe de pequenas mudanças em variáveis experimentais, como temperatura da coluna e tamanho da amostra.
�Desvantagens
• Dificuldade de encontrar uma substância candidata a padrão interno para o sistema em análise.
_____________________________________Padronização interna
Superposição de matriz
O método de superposição de matriz consiste na adição do padrão da substância em diversas concentrações em uma matriz similar à da amostra, isenta da substância, e construção do gráfico de calibração relacionando as áreas obtidas com as concentrações do padrões.
� Vantagens• Compensa o efeito da matriz ou de possíveis interferentes;• Sua principal vantagem sobre o método de padronização externa é que fornece
uma melhor correspondência com a composição da amostra.
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� Desvantagem• Não Proporciona a magnitude do efeito de co-extratos e aumenta o custo e
o tempo das análises.
Adição padrão
• É o método utilizado nos casos em que não é possível a mimetização da matriz sem a presença da substância de interesse;
• Consiste na adição de diferentes concentrações de padrão da substância de interesse à matriz, que já contém determinada quantidade da substância de interesse;
• A matriz permanece quase inalterada após cada adição, a única diferença é concentração da substância de interesse.
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Adição padrão
Adição padrão
Adição padrão
Adição padrão
Adição padrão
Adição padrão
Comparação entre métodos
Queiroz, S. C. N.; Collins, C. H.; Jardim, I. C. S. F. MÉTODOS DE EXTRAÇÃO E/OU CONCENTRAÇÃO DE COMPOSTOS ENCONTRADOS EM FLUIDOS BIOLÓGICOS PARA POSTERIOR DETERMINAÇÃO CROMATOGRÁFICA. Quim. Nova, Vol. 24, No. 1, 68-76, 2001. 40
Figura. Interrelação entre os diferentes métodos de construção da curva analítica.