Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sainsdan Tekrwlogi MenuJu Era Tinggal Landas
Bat~dung, 8- 10 Oktobel' 1991PPTN - BATAN
RADIOIODINASI SERTA UJI KUALITAS ANTIBODIMONOKLONAL UNTUK DIAGNOSIS IN VIVO
.Nurlaila B. SetiawanPusat Penelitian Teknik Nuklir - Badan Tenaga Atom Nasional
AUSTRAKRADIOIODINASI SERTAUJI KUALITASANTIBODI MONOKLONALUNTUK DIAG
NOSIS IN VIVO. Telah dilakukan radioiodinasi antibodi monoklonal (AbM) anti carcinoembryonic antigen (CEA) F(ab'}2dan 19.9 F(ab'}2dengan iodium-131 menggunakan iodogen(1,3,4,6 tetra khloro 3,6 difenil glikouril) sebagai oksidator. Rendemen yang diperoleh daribeberapa kali penandaan untuk AbM anti CEAF(ab')z dan AbM 19.9 F(ab')2 masing-masing89,75 ± 2,25% dan 93,85 ± 0,90%. Kemurnian radiokimia ditentukan dengan metode elektroforesa menggunakan kertas whatman 3MMsebagai fase diam dan dapar barbital 0,07 M, pH= 8,6 sebagai fase gerak. Kemurnian radiokimia yang diperoleh untuk kedua senyawabertanda adalah di atas 95%. Immunoreaktivitas senyawa bertanda AbM anti CEA F(ab')2_1131 dan AbM 19.9 F(ab')2 _1131 masing-masing 79,0 ± 0,8% dan 84,8 ± 3,0% serta senyawabertanda yang diperoleh dinyatakan steril, tidak toksik dan bebas pirogen.
ABSTRACTRADIOIODINATION AND QUALITY CONTROL OF MONOCLONAL ANTIBODIES
FOR IN VIVO DIAGNOSIS. Radioiodination of monoclonal antibodies anti carcino embryonicantigen (CEA) F(ab'}2 and 19.9 F(ab'}2 with iodine-131 using iodogen (1,3,4,6 tetra chloro3,6-diphenyl glycoluril) as an oxidator has been carried out. Labeling yield of monoclonalantibodies anti CEA F(ab'}2and 19.9 F(ab')z after several iodination were 89,75 ± 2,25% and93,85 ± 0,90%, respectively. The radiochemical purity was determined by electrophoresemethod using whatman 3MMas a stationary phase and buffer of barbital 0,07M, pH = 8,6 asa mobile phase. More than 95% radiochemical purity was obtained for both of the labeled
compound. Immunoreactivity of monoclonal antibodies anti CEAF(ab')z _1131 and 19.9 F(ab')z_113 were 79,0 ± 0,8% and 84,8 ± 3,0%, respectively and the labeled compounds were steril,non toxic and pyrogen free.
PENDAHULUANDewasa ini, penyakit kanker merupakan
salah satu penyebab kematian manusia. Salahsatu usaha di bidang kesehatan pada saat iniadalah mencari suatu metode untuk mendeteksiseeara dini serta cara pengobatan yang tepatuntuk penyakit tersebut.
Makin berkembangnya teknik seluler fusidalam bidang immunologi, maka memungkinkan dapat diproduksinya sejumlah antibodi monoklonal baik yang berasal dari suatu antigenyang da~at larut maupun yang berupa suatujaringan atau sel-sel.
Berdasarkan teknik fusi seluler ini, telahdikembangkan pula pembuatan antibodi antisel-sel kanker. Besarnya afinitas serta kesp'~sifikansuatu antibodi monoklonal untuk terfiksasi pada site antigenik dari sel-sel kankermEJmungkinkandapat diproduksinya suatu antibodi monoklonal bertanda radioaktifyang berfungsi sebagai tracer untuk maksud diagnosisataupun terapi.
Di bidang Kedokteran Nuklir, diagnosissecara in vivo menggunakan antibodi bertandaradioaktif ini dikenal dengan nama Immunoscintigraphy dimana dilakukan visualisasi dengan menggunakan gamma kamera pada suatudaerah hiperfiksasi yang disebabkan oleh akumulasi antibodi monoklonal bertanda radioaktifyang spesifik pada sel-sel tumor tertentu.
Pemilihan radioisotop untuk pemakaianimunodeteksi terutama didasarkan pada waktuparuh, metabolismenya di dalam tubuh, stabilitas ikatan antara radionuklida dan antibodiserta tersedianya radioisotop tersebut denganharga yang relatif murah (1).
Penandaan antibodi dengan iodium radioaktif untuk maksud diagnosis pertama kali dikembangkan oleh Ghose T. dkk (2) pada tahun1975. Beberapa metode dapat digunakan untukmaksud tersebut, akan tetapi yang lebih seringdigunakan adalah penandaan dengan bantuan
332
Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sainsdan Teknologi MenuJu Era Tinggal Landas
oksidator (kloramin-T, iodogen) (3,4) serta metode enzimatik (laktoperoksidase) (5).
Dalam tulisan ini dilakukan penandaanantibodi monoklonal anti CEA F(ab')2 dan 19,9F(ab')2dengan iodium-131secara steril yang dilakukan menurut metode Fraker dan Speck (4)oksidator iodogen. Di samping itu dilakukanpula uji kualitas hasil penandaan meliputi kemurnian radiokimia, immunoreaktivitas, toksisitas, sterilitas dan lain-lain.
Iodogen adalah suatu pereaksi yang seringdigunakan sebagai oksidator dalam iodinasiprotein serta membran seluler yang menyebabkan terjadinya substitusi ionhidrogen oleh atomiodium (substitusi elektrofil) pada grup tirosindari protein (6). Dengan metode ini kemungkinan terjadinya denaturasi antibodi sangat kecil. Hal ini disebabkan karena kelarutan iodogen dalam larutan yang mengandung antibodisangat kecil sehingga kontak antara antibodidan iodogen pada saat penandaan dapat dieliminir (7).Disampingitu untukmenghentikanreaksi iodinasi cukup dengan memindahkan larutan dari tabung yang mengandung iodogensehingga tidak perlu ditambahkan suatu reduktor.
Dalam aplikasi klinik, kombinasi antaraAbManti CEAF(ab')2dan 19,9 F(ab')2bertandaiodium-131 digunakan untuk immunodeteksikanker colorectum.
BAHAN DAN PERALATAN
Bahan yang digunakan adalah AbM antiCEA dan 19,9 dalam bentuk fragmen F(ab')2produksi Centocor. Antigen CEA diperoleh dariProf.Burtin, Kremlin Bicetre - Paris, Prancisdan antigen 19,9 berupa monosialil gangliosid.
Iodogen buatan Pierce, diklorometan, dinatriumhidrogen fosfat (Na2HP04.2H20), natrium dihidrogen fosfat (NaH2P04H20), humanserum albumin (HSA),natrium azid (NaN3) danlain-lain dengan kualitas untuk analisis buatanE.Merck.
Air steril untuk injeksi, larutan fisiologisNaCI 0,9%,limulus lisat amubosit (LAL)buatanWittaker, sepharose, resin anion dowex 100-200mesh produksi Sigma. Kolom plastik buatanAmicomserta penyaring bakteri 0,22 11mbuatanSwinnex.
Alat yang digunakan antara lain LaminarAir Flow, pH-meter Beckman, alat pencacahsaluran tunggal, pengaduk rotasi serta alat-alatpenunjang lainnya.
Bandung, 8 - 10 Oktober 1991PPTN - BATAN
TATAKERJA
Penyalutan tabung gelas dengan iodogenSejumlah tertentu iodogen dilarutkan du
lam pelarut organik diklorometan. Beberapa mldari larutan ini dimasukkan ke dalam tabunggelas steril dan diuapkan pada temperatur kumar di atas pengaduk yang berputar.
Penandaan antibodi monoklonal denganiodium-131
Antibodi monoklonal yang digunakan adnlah AbM anti CEA F(ab')2 dan 19,9 F(ab')2' P,~nandaan dilakukan secara steril didalam boxmenggunakan oksidator iodogen.
Sebanyak 1mg antibodi monoklonal dalamlarutan dapar fosfat 0,1M, pH = 7,4dimasukkandalam tabung gelas bersalut iodogen.Kemudia nditambahkan 5-6 mCi iodium-131 dan diinkubasi pada temperatur kamar selama 15 menitsambil diputar di atas pengaduk rotasi.
Pemurnian hasi/ penandaan
Senyawa bertanda yang diperoleh, dimurnikan dengan menggunakan kolom resinanion dowex 100-200 mesh ukuran 0,5 x 10 emyang telah dijenuhkan dengan dapar fosfat 0,1M, pH = 7, NaCI 0,15 M dan HSA 5%. Sebagaieluen digunakan dapar fosfat 0,1 M, pH = 7,4.Hasil pemurnian disterilkan dengan penyaringbakteri swinnex 0,22 11m(Gambar 1).
6131
AbM anti CEA F (ab' )2-I5
4
3
2
.. ,.~.2 4 6 8 10 12 14 16
N,).Tabung
Gambar 1. Hasil pemurnian AbM anti CJ~AF(ab')2 bertanda iodium-131 menggunakankolom resin anion dowex 100-200 mesh ( 0,15x10 em ).
333
Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam PenelitiaJ£ Sainsdan Tekrwlogi Menuju Era Tinggal Landas
Pemeriksaan kemurnian radiokimiaKemurnian radiokimia sediaan antibodi
monoklonal bertanda iodium-131 ditentukandengan metode elektroforesis menggunakan dapar barbital 0,07 M , pH = 8,6 sebagai elektrolit(fase gerak) serta kertas whatman 3 MM sebagai fase diam. Elektroforesis ini dilakukanseJ.amalebih kurang 20 menit dengan tegangansebesar 15 volt/em. Strip kertas elektroforesisdikeringkan kemudian radioaktivitasnya diukur dengan menggunakan detektor radioaktivitaf3linier tipe Berthold.Pemeriksaan sterilitas.
Sterilitas antibodi monoklonal bertandaiodium-131 diperiksa dengan metode yang terdapat di dalam farmakope eropa menggunakandua jenis media yang berbeda yaitu tioglikolatdan triptikas soja.
Cuplikan senyawa bertanda yang akan diperiksa, dimasukkan ke dalam tabung yang berisi media diatas secara aseptis. Kedua media inikemudian diinkubasi selama 14 hari pada temperatur 37°C dan dilihat kemungkinan terjadinya pertumbuhan mikroba.
Pemeriksaan pirogenPemeriksaan pirogen dilakukan dengan
menggunakan lisat amubositdari limulus (LAL)sebagai pereaksi. Cuplikan senyawa bertandaya.ng akan diperiksa diencerkan dengan pengenceran tertentu, kemudian dicampurkan dengan pereaksi. Campuran ini diinkubasi padapenangas air dengan temperatur 37 ± 0,5°Cselama satu jam. Sebagai pembanding positifdigunakan standar endotoksin.Pemeriksaan toksisitas
Antibodi monoklonal bertanda iodium-131disuntikkan pada 5 mencit putih secara intravena dengan dosis yang sarna dengan pemak.aian pada manusia. Senyawa bertanda tersebut dinyatakan tidak toksik bila tidak satupun dari mencit putih tersebut mati selama 7hari pengamatan.lmmunoreaktivitas
Antibodi monoklonal anti CEA F(ab')2 bertandaiodium-131
Penentuan immunoreaktivitas antibodi
monoklonal anti CEA F(ab')2 bertanda iodium1:31dilakukan dengan metode kromatografi afinitas menggunakan suatu tabung yang berisisephadex 4B-CNBr yang berikatan dengan antigen carcino embryonic sebagai fase padat.
Sejumlah antibodi bertanda iodium-131yang telah diketahui radioaktivitasnya, dima-
Baudung, 8 - 10 Oktober 1991PPTN - BA1'AN
sukkan ke dalam tabung yang berisi fase padatdalam keadaan berlebih. Campuran ini kemudian diinkubasi pada temperatur kamar selamaminimal satujam sambil digoyang di atas pengaduk yang berputar. Selanjutnya fase padat tersebut dicuci beberapa kali dengan dapar fosfat0,05M, pH = 7,4, HSA 5%, kemudian radioaktivitas yang terdapat pada fase padat diukur.Besarnya radioaktivitas yang terfiksasi padafase padat dibandingkan dengan radioaktivitasyang digunakan mula-mula dinyatakan sebagaiim- munoreaktivitas antibodi monoklonal anti
CEA F(ab')2bertanda iodium-131.Antibodi monoklonal19.9 F(ab')2 bertandaiodium-131.
Penentuan immunoreaktivitas antibodimonoklonal 19,9 F(ab')2 bertanda iodium-131dilakukan dengan menggunakan kolom kromatografi afinitas berisi sephadex 4B-CNBr yangberikatan dengan monosialil gangliosid (antigendari AbM 19.9).
Sejumlah antibodi bertanda iodium-131yang telah diketahui radioaktivitasnya, diinkubasi didalam kolom khromatografi afinitasdi atas pada temperatur kamar selama minimum 2 jam sambil digoyang di atas pengadukyang berputar. Fiksasi non spesifik dieliminirdengan suatu pengelusi menggunakan daparsitrat 0,1 M, pH = 5,9, HSA 1,5% dan antibodibertanda iodium-131 yang terfiksasi pada antigen dielusi dengan menggunakan larutanamonium tiosianat 5 M.
Perbandingan radioaktivitas antibodi bertanda iodium-131 yang terfiksasi pada antigendengan radioaktivitas total yang digunakan, dinyatakan sebagai immunor~~ktivitas antibodimonoklonal19,9 F(ab')2bertanda iodium-131.
HASILDAN PEMBAHASAN
Penandaan antibodi monoklonal anti CEA
F(ab')2 dan 19,9 F(ab')2 dengan iodium-131 dilakukan dengan menggunakan pereaksi iodogen (1,3,4,6 tetrakhloro 3,6 difenil glikoluril).
Pada penandaan antibodi monoklonal19.9F(ab')2 dengan iodium-131, pemakaian iodogenlebih besar dad 10 fAgtidak menaikkan hasilpenandaan sedangkan untuk antibodi anti CEAF(ab')2 ' pemakaian iodogen sebesar 30 fAgmemberikan hasil penandaan sekitar 93% (Tabel1).
Dari beberapa kali percobaan, rendemenpenandaan yang diperoleh untuk antibodi monoklonal anti CEA F(ab')2 adalah sebesar 89,75± 2,25%sedangkan untuk antibodi monoklonal19.9 F(ab')2 adalah 93,85 ± 0,9% (Tabel 2).
334
Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sainsdan Tekrwlogi MenuJu Era Tinggal Landas
Tabel 1. Pengaruh iodogen terhadap penandaan antibodi monoklonal dengan iodium-131.
lodogenRendemen penandaan (%)
(Ilg)AbM anti CEAAbM 19,9
F(ab')'JF(ab')9.
5
74,090,010
83,594,020
92,095,030
93,594,5
Tabel 2. Hasil pemeriksaan antibodi monoklonal bertanda 1-131
Bandung, 8 - 10 Oktober 1991PPTN - BAT AN
I I II II I II III
I I' I I, '(I '\1 I II II
I " I I.L I II 11/11.
I 111111 I I I
IIIIUIII"!' I'"
j I' / lit/II I',",'#.J II \,'I' I'1/'..1~\T'I
I I I 1111"~ H~UIIII' '" ,,,'W, I
, I .I I I '~IIt.II1JJI
f II 1111&'.'I I I I II I Ii UI
, I 'I' I m Jj~~1I l'I'l"II,~L,j I I I I I/ I 'I I I I
I I II II II
Untuk mengetahui bahwa hasil penandaansuatu antibodi memenuhi persyaratan untukpemakaian in vivo maka perlu dilakukan ujikualitas sediaan jadi antara lain kemurnianradiokimia, sterilitas, toksisitas, immunoreaktivitas, dU.
2I
~ ~'2 16---;-_(em)Gambar 2. Hasil pemeriksaan kemurnianradiokimia AbM anti CEA F(ab')2 bertandaiodium-131.
JenisAbM antiAbM 19,9
pemeriksaanCEA F(ab')'JF(ab')9.
Rendemen penandaan (%)89,75±2,2593,85±0,90
pH7,0±0,57,0±0,5
Kemurnian radiokimia (%)98,92±0,2498,98±0,10
Sterilitassterilsteril
Toksisitasnon-toksisnon-toksis
Pirogenitasbebas pirogenbebas pirogen
1065( cis )
t
o
131AbM anti CEA F ( ab' )2 - I
=8
Gambar 3. Hasil penyidikan 1311_AbMantiCEA F(ab')2 pada mencit gundul yang telahditransplantasi dengan sel kanker colorectummanUSla
Menurut Farmakope, suatu s,enyawa bertanda radioaktif dapat memenuhi persyaratanbila mempunyai kemurnian radiokimia lebihbesar atau sarna dengan 95%. Kemurnian l'adiokimia yang diperoleh untuk antibodi monoklonal anti CEA F(ab')2 _1131adalah 98,92 :t0,24%dan untuk 19,9 F(ab')2_1131adalah 98,98± 0,10% (Tabel 2).
Dari hasil pemeriksaan sterilitas menunjukkan bahwa setelah diinkubasi selama 14 hari, tidak terjadi pertumbuhan mikroba atau jamul' pada ke dua jenis biakan yang digunakan.Demikian pula untuk uji toksisitas dan pirogenitas menunjukkan bahwa hasil yang diperoleh adalah negatif.
Hal lain yang sangat penting untuk suatuantibodi apabila antibodi tersebut mengalamisuatu modifikasi kimia adalah pemeriksaan immunoreaktivitasnya untuk mengetahui afinitasantibodi tersebut terhadap antigen yang bel'sangkutan. Untuk antibodi monoklonal ant.iCEA F(ab')2 ' antibodi tersebut masih mempunyai aktivitas biologis yang baik apabilamempunyai immunoreaktivitas >60% sedangkan untuk antibodi monoklonal19,9 F(ab')2bilamempunyai immmunoreaktivitas >70% (8).
Immunoreaktivitas yang diperoleh untukantibodi monoklonal anti CEA F(ab')2 _1131ada.lah 79 ± 0,8% dan untuk antibodi monoklonELI19,9 F(ab')2 _1131adalah 84 ± 3,0% (Tabel 2).
Untuk pemakaian in vivo, antibodi yangdigunakan umumnya berupa fragmen F(ab')2
335
Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sains00'" Tekrwlogi Menuju Era Tinggal Landas
karena bentuk ini kurang immmunogen sertate:rdifusi lebih cepat pada daerah site antigenikdibandingkan dengan immunoglobulin (lgG) total. Selain itu fragmen F (ab')2 ini dapat tereliminasi dengan cepat dari sirkulasi di dalamtubuh (1) sehingga dapat meningkatkan hasilkontras antara aktivitas terfiksasi pada tumorterhadap latar belakang.
Dalam aplikasi klinik, untuk meningkatka.n sensibilitas diagnosis, digunakan kombinasi beberapa antibodi monoklonal yang mem-
DAFTAR PUSTAKA
Bandung, 8 -10 Oktober 1991PPTN - BATAN
punyai beberapa spesiflsitas tambahan (9) misalnya kombinasi antara anti CEA dan 19,9.
KESIMPULAN
Penandaan AbM anti CEA F(ab')2 dan 19,9F(ab')2 dengan iodium-131 dapat dilakukan dengan menggunakan iodogen sebagai oksidator.Dari beberapa kali penandaan diperoleh rendemen hasil yang mempunyai kedapatulanganyang tinggi dengan kemurnian radiokimia>95%. Setelah penandaan dengan iodium-131,AbM anti CEA F(ab')2 dan 19,9 F(ab')2 masihmempunyai aktivitas biologis yang tinggi.
1. Bogard, W.C., Dean Jr.R.T., Deo, J., Fuchs, R., Mattis, J.A., McLean, A.A., Berger, H.J.,Practical consideration in the production, purification and formulation of monoclonal antibodies for immunoscintigraphy and immunotherapy, Seminar in Nuclear Medicine (19 Juli1989) 202 - 220.
2. Ghose, T., et. al., Antibody as a carrier of 1311 in cancer diagnosis and treatment, Cancer 36(1975) 1646 - 1659.
3. Hunter, W. M., Greenwood, F.C., Preparation of 1311 labeled human growth hormones at highspecific activity, Nature 194 (1962) 495 - 496.
4. Fraker, P.J., Speck J.C., Protein and cell membran iodination with a sparingly solublechloramide 1,3,4,6 tetrachloro-3,6 diphenylglycoluril, Biochem. Biophys. Res. Comm. 80(1978) 849 - 857.
5. Marchaloins, J.J., An enzymatic method for the tracer iodination of immunoglobulins andother proteins, Biochem. J., 113, 299 - 305, (1969).
6. Britton, K., Grownoska, M., Experience with iodine-123 labeled antibodies, Proceeding of theNATO Advanced Study Institute on Radiolabeled Monoclonal Antibodies for Imaging andTherapy, Castelvecchio Pascoli (Barba), Italy-Plenum Publishing Corporation (1987) 77 - 191.
7. Gopal B. Saha, Radioiodination of Antibodies for Tumor Imaging, Radioimmunoimaging andRadioimmunotherapy, Scot W. Burchiel & Buck A. Rhodes Editor, Elsevier Science Publishing Co. Inc (1983) 171 -184.
8. Saccavini, J. C., Bohi, J., Bruneau, J., Gestin, J. F., Pharmacological selection of antibodiesfor immunoscintigraphy, Med. Nucl. 1 (1989) 149 -156.
9. Chatal, J. F., Saccavini, J. C., Douillard, J.,Y., Kremer, M., Curtet, C., Aubry, J., Le Mevel, B.,Diagnostique immunoscintigraphyque des recurrences des cancer colorectaux resultats compares avec ceux de 1Echotomographie et de la Tomodensitometrie, Journal de Biophysique etMedecine Nucleaire 2, (1984) 183 - 185.
336