RNDr.Radek Trojanec, Ph.D.
CYTOGENETICKÁ LABORATOŘ
Chromozómy a jejich aberace
Laboratoř experimentální medicíny (LEM)
www.LEM-Olomouc.cz
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
ZÁKLADNÍ TYPY CYTOGENETICKÝCH
ABERACÍ
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
Změny (aberace, mutace)Numerické: aneusomie, polysomie: Pataův syndrom (trisomie 13, viz obr.), Downův sy. (trisomie 21), Edwardsův sy. (trisomie 18), aneusomie gonosomů (Klinfelterův sy. 47,XXY; Turnerův sy. 45,X atd.), onkologická onemocnění apod.
Strukturální: delece, translokace, amplifikace, inverze apod.: Cri du chat sy.(sy.kočičího křiku; 5p-), retinoblastom,onkologická onemocnění apod.
Jiné poruchy: uniparentální disomie (Prader-Willi sy.), syndromy chromosomální instability (xeroderma pigmentosum, ataxia telangiectasia) apod.
http://www.rodina.cz
Downův syndrom• incidence 1: 600-800• Trizomie chromozómu 21• při narození: hypotonie, šikmé
oční štěrbiny, anomálie uší, ploché záhlaví, opičí rýha, epikantus (vnitřní koutek), srdeční vady, vady dalších orgánů
• fenotyp starších jedinců: mentální retardace, hypogenitalismus ♂, porucha dentice, krátké, široké ruce, brachydaktylie, poruchy imunity, vyšší riziko nádorových onemocnění (leukémie)
EPICANTUS
www.vscht.cz/kot/resources/studijni-materialy/bc-p-004/prezentace.pdf
http://www.rodina.cz/g/deti/postizeni/dite_down_syndrom.jpg
Klinefelterův syndrom 47, XXY
• incidence: 1: 1000
vysoká postava, průměrná inteligence, psychosexuální orientace mužská, hypoplázie testes, kryptorchismus, sterilita – azoospermie, gynekomastie
www.vscht.cz/kot/resources/studijni-materialy/bc-p-004/prezentace.pdf
Supermale 47, XYYY
• mohutnější vzrůst, vysoká postava, průměrná inteligence, pohlavní vývoj normální, plodnost normální, neuvádí se vyšší riziko chromosomálních aberací pro potomstvo, neprokázán narušený psychosociální vývoj
dvojčata, vyšší 47, XYYwww.vscht.cz/kot/resources/studijni-materialy/bc-p-004/prezentace.pdf
Turnerův syndrom 45, X
• incidence 1: 5000 – 10000malý vzrůst – možnost hormonální terapie, gonadální dysgeneze, primární amenorea, normální inteligence, krátký, široký krk (pterygium colli), nízká vlasová hranice, štítovitý hrudník, edémy na HK i DK (novorozenci)
www.vscht.cz/kot/resources/studijni-materialy/bc-p-004/prezentace.pdf
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
Balancované změny: „obsah“ DNA v buňce se nezmění
Nebalancované změny: v „obsahu“ DNA přebývají či chybí sekvence
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
Delece: znamená ztrátu genetického materiálu. Může se jednat o deleci celých částí chromozomů, či například jen určitého genu
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
Inzerce, duplikace : přidání genetického materiálu (párů bází) do DNA v chromozomu
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
Amplifikace: specifický způsob přidání DNA sekvencí: Jedná se o zmnožení konkrétního genu v rámci chromozomu či určitého úseku v chromozomu
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
Inverze: vzniká po dvojnásobném zlomu v témž chromozomu. Příslušný úsek vymezený zlomy se z chromozomu odštěpí a připojí převrácený o 180°. Důsledkem je juxtapozice (přiblížení) určitého genu k jinému, což může způsobit tvorbu chimerického proteinu či kontrolu genu jiným promotorem.
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
Translokace: vzniká výměnou úseků mezi různými chromozomy. Její důsledky jsou podobné, jako u inverze
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
Ring chromozom: Je-li chromozom porušen 2 zlomy a následně spojen, vzniká kruhová struktura. Je-li v tomto útvaru zachována centromera, může být ring chromozom i mitoticky aktivní.
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
Genomický imprinting je proces, kdy je aktivita určitého genu regulována v závislosti na tom, od kterého rodiče byl gen zděděn. Ve většině případů to znamená, že pouze maternální nebo paternální alela je exprimována (je aktivní), kdežto druhá je utlumena.Uniparentální disomie - oba chromozómy v páru původem od jednoho rodiče)Angelmanův syndrom: absence mateřské kopie části chromosomu 15Prader-Williho syndrom: Absence otcovské kopie části chromosomu 15
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
problémy s pohybem, koordinací chůze a stabilitou nonverbální komunikační schopnosti jsou mnohem lepší než verbální mávání a vyvažování horními končetinami, vibrující paže zvláštní chování, velmi často se usmívá, obvykle má šťastnou náladu, v excitaci mává a tleská rukama
Angelmanův syndrom: „Happy puppet“, „Syndrom šťastného dítěte“ Nejčastěji:neschopnost mluvit, pouze minimum slov, komunikují nonverbálně, nonverbální komunikace převyšuje verbální opoždění psychomotorického vývoje, těžký zpomalený vývoj
www.vscht.cz/kot/resources/studijni-materialy/bc-p-004/prezentace.pdf
Prader- Williho syndrom -
NOVOROZENCI, KOJENCI:těžká hypotonie, neprospívání, opoždění vývoje, faciální dysmorfie
POZDNĚJŠÍ VĚK:mentální retardace, polyfagie – těžká obezita, hypogenitalismus, poruchy chování
www.vscht.cz/kot/resources/studijni-materialy/bc-p-004/prezentace.pdf
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
CYTOGENETICKÝ ZÁPIS
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
ISCN (2005): An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Shaffer LG., Tommerup N. (eds); Karger S., Basel 2005
add = Addition material of unknown origindel = Deletionde novo = A chromosome abnormality which has not been inheritedder = Derivative Chromosomedic Dicentricdup = Duplicationfra = Fragile Siteidic = Isodicentric chromosomeins = Insertioninv = Inversioni or iso = Isochromosomemar = Marker chromosomemat = Maternal originMinus sign (-) = Lossmos = Mosaicp = Short arm of chromosomepat = Paternal origin Plus sign (+) = Gain
q = Long arm of chromosomer = Ring chromosomercp = Reciprocalrea = Rearrangementrec Recombinant chromosomerob = Robertsonian translocationt = translocationtel = Telomere (end of chromosome arm)ter = Terminal end of chromosomeupd = Uniparental disomy
46,XX - Normal Female Karyotype46,XY - Normal Male Karyotype
These descriptions say there are 46 chromosomes and that it is a male or female.
46,XX,del(14)(q23)
Female with 46 chromosomes with a deletion of chromosome 14 on the long arm (q) at band 23.
46,XY,dup(14)(q22q25)
Male with 46 chromosomes with a duplication of chromosome 14 on the long arm (q) involving bands 22 to 25.
46,XX,r(7)(p22q36)
Female with 46 chromosomes with a 7 chromosome ring. The end of the short arm (p22) has fused to the end of the long arm (q36) forming a circle or 'ring'
47,XY,+21
Male with 47 instead of 46 chromosomes and the extra chromosome is a 21. (Down Syndrome)
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
• VYŠETŘOVACÍ METODY
• PŘÍKLADY VYŠETŘENÍ
ONKOGENETICKÝCH
MARKERŮ
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
Význam v prenatální dg. i v onkologii: RFC gen
(Reduced Folate Carrier Gene)
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
Fluorescenční in situ hybridizace
(FISH)Metodou fluorescenční in situ hybridizace lze lokalizovat cílové nukleotidové sekvence přímo v buňkách (in situ). Metoda FISH je založena na schopnosti jednořetězcové DNA sondy vázat komplementární úsek cílové DNA fixované na mikroskopickém skle.
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
Fluorescenční in situ hybridizace
(FISH)
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
E.Kočárek et al.:Vybrané kapitoly z lékařské cytogenetiky a genetického poradenství; Ústav biologie a lékařské genetiky FN Motol a UK 2.LF (2004)
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
WCP –Whole Chromosome Painting
(celochromozómové sondy)
CEP 17Her-2/neu
Jádro s normálním počtem kopií genu a chromozomu
Nepravá amplifikace (polyzomie)
Amplifikace
LABORATOŘ EXPERIMENTÁLNÍ MEDICÍNY
LABORATOŘ EXPERIMENTÁLNÍ MEDICÍNY
CEP 17Her-2/neu
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
t(9;22)(q34;q11) Philadelphia (Ph) chromozom (Nowell, Hungerford,1962) BCR-ABL CML, ALL, AML, ST STI-571 (Glivec)
t(15;17)(q22;q11-21) PML-RARA AML M3 (PML) ATRA
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
CGH (Kallioniemi, 1992)
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
Mnohobarevná FISH
(M-FISH)
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
Mnohobarevná FISH
(M-FISH)
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
Multicolor banding
Microarrays
Her-2/neu (c-erbB-2)
•Receptor EGF
•Nejčastěji amplifikovaný onkogen u ca prsu (10-15%)
•Protein p185HER-2 – souvisí s maligní transformací a agresivitou choroby
•Pacientky s overexpresí proteinu a/nebo amplifikací genu indikovány k terapii monoklonální protilátkou trastuzumab (Herceptin)
•Různé metody vyšetření
LABORATOŘ EXPERIMENTÁLNÍ MEDICÍNY
Vyšetření Her-2/neu (c-erbB-2): IHC x FISH
IHC fotografie byly získány ve spolupráci s Ústavem patologie LF UP
IHC:0 FISH: normální
IHC: 1+ až 2+FISH: normální nepravá amp. amplifikace
IHC: 3+FISH: amplifikace
CEP 17
Her-2/neu
CEP 17 LSI Her-2/neu
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
Her-/neu (c-erbB-2): amplifikované případy: senzitivita na antracykliny aplikace Herceptinu
TOP2A: Topoizomeráza II = cíl pro některé typy cytostatik: inhibitory topoizomeráz II
tj. senzitivita na antracykliny
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
EGFR1 (Her-1)• ca.plic
• FISH & sekvenace
• aplikace inhibitorů: Cetuximab (Erbitux). Gefitinib (Iressa),
erlotinib (Tarceva)…
Common Approaches to Targeting HER1/EGFR
Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, et al. N Engl J Med. 2001;344:783-792; Mendelsohn J, Baselga J. Oncogene. 2000;19:6550-6565; Noonberg SB, Benz CC. Drugs. 2000;59:753-767; Raymond E, Faivre S, Armann JP. Drugs. 2000;60(Suppl 1):15-23; Arteaga C. J Clin Oncol. 2001;19:32s-40s; Pedersen MW, Meltom M, Damstrup L, et al. Ann Oncol. 2001;12:745-760.
Anti-HER1/EGFR-blocking antibodies
Anti-ligand-blocking
antibodies
TKinhibitors Ligand–
toxinconjugates
Antibody–toxin
conjugates
PP P
P
Sekvenace DNA
A T C C A C G G C T G
A T C C A C G G C T G
Priklad praktickeho vystupu analyzy DNA - detekce bodovych mutaci v sekvenci
CEP 17 LSI Her-2/neu
LASEROVÁ MIKRODISEKCE (LCM)LASEROVÁ MIKRODISEKCE (LCM) LCM je metoda která umožňuje isolaci buněk z komplexu tkáně.
Přístroj VERITAS pro LCM od firmy ARCTURUS.
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
TECHNIKA LASEROVÉTECHNIKA LASEROVÉ MIKRODISEKCEMIKRODISEKCE
Cytospin, buněčná linie K562
Cytologický preparát adenokarcinomu plic
Parafinový/kryořez nádorové tkáně
LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE
• Protoonkogeny rodiny MYC (c-myc, n-myc, l-myc aj.)
• Geny účastnící se regulace buněčného cyklu a n apotózy (geny pro CDK, CDK-I, cykliny)
• Tumor-supresorové geny (TP53, RB1)
• Protoonkogeny rodiny RAS
• BCL-2 a příbuzné protoonkogeny
• TOP2A, RARA a jiné
Některé další geny, účastnící se maligní transformace buňky